CN113151206A

CN113151206A - 一种3α-羟基类固醇脱氢酶、编码基因及其应用

Info

Publication number: CN113151206A
Application number: CN202110428414.4A
Authority: CN
Inventors: 娄德帅; 张小丽; 李强; 谭君
Original assignee: Chongqing University of Education
Current assignee: Chongqing University of Education
Priority date: 2021-04-21
Filing date: 2021-04-21
Publication date: 2021-07-23

Abstract

本发明提供一种3α‑羟基类固醇脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因如SEQ ID NO.2所示。本发明3α‑羟基类固醇脱氢酶能够催化胆汁酸C3位α‑羟基的氧化反应，活性比绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)3α‑羟基类固醇脱氢酶更高，在临床检验中具有巨大的应用价值。

Description

一种3α-羟基类固醇脱氢酶、编码基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种3α-羟基类固醇脱氢酶、编码基因及其应用。

背景技术

胆汁酸作为胆汁的重要成分，其在代谢中起重要作用。肝脏病变会导致血清中胆汁酸含量的增加，因而胆汁酸含量的测定成为肝脏功能检查的常用指标。目前临床检测中通常使用3α-羟基类固醇脱氢酶催化待检测样品中的胆汁酸C3羟基进行氧化反应，该反应同时将氧化型辅酶I或II还原为还原性辅酶I或II，通过测定340nm处的光吸收变化值计算得到待测样品中总胆汁酸的含量。该检测过程中，具有较高催化活性和稳定性的新酶挖掘和发现是研究的热点之一。发现活性更高的3α-羟基类固醇脱氢酶有助于试剂盒检测能力的提升和更加广泛的应用。

发明内容

根据本发明的第一方面，本发明提供一种NADP(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶，该酶能够催化牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)C3位α羟基氧化，催化活性远高于绿脓杆菌3α-羟基类固醇脱氢酶，具有巨大的实际应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种3α-羟基类固醇脱氢酶，其序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明的第二方面，本发明提供上述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。

上述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因，其序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三方面，提供一种表达载体，其含有上述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。

一种表达载体，其含有上述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。进一步的，本发明还提供一种重组菌，其被上述的表达载体转化。更进一步，经表达载体转化的重组菌选自重组大肠杆菌。

本发明的第四方面，本发明还提供一种酶蛋白表达盒，其包含上述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。进一步，本发明还提供一种重组细胞，其包含上述酶蛋白表达盒。

本发明的第五方面，提供上述3α-羟基类固醇脱氢酶或3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因在总胆汁酸含量的检测中的应用。上述3α-羟基类固醇脱氢酶或3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因在催化胆汁酸C3位α-羟基的氧化反应中的应用。

本发明的第六方面，提供一种催化剂，其有效成分包含上述3α-羟基类固醇脱氢酶。

本发明的第七方面，提供一种催化胆汁酸C3位α-羟基氧化反应的方法，其特征在于：所述催化剂包含上述3α-羟基类固醇脱氢酶。进一步，本发明所述催化胆汁酸C3位α-羟基氧化反应为催化TCDCA的C3位α-羟基氧化生成Tauro-3-dehydro-CDCA或催化TUDCA的C3位α-羟基氧化生成Tauro-3-dehydro-UDCA。

有益效果：

本发明提供一种新的NADP(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶(命名为G013)，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过全基因合成的方式获得了一个新的3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。本发明3α-羟基类固醇脱氢酶能够催化胆汁酸C3位α-羟基的氧化反应，如催化牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)C3位α羟基氧化，活性是绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)3α-羟基类固醇脱氢酶的1.26倍和1.11倍。本发明为总胆汁酸含量的检测提供了检测效率更高的3α-羟基类固醇脱氢酶，在临床检验中具有巨大的应用价值。

附图说明

图1是本发明所述的3α-羟基类固醇脱氢酶G013的SDS-PAGE分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。要说明的是：以下实施例只用于对本发明进行进一步的说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制。本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

实施例1新3α-羟基类固醇脱氢酶(G013)的基因获取。

本发明新的3α-羟基类固醇脱氢酶G013的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。以黑熊肠道菌落宏基因组DNA为模板PCR扩增3α-羟基类固醇脱氢酶(G013)的引物为：上游引物：5’-CGCGGATCCATGAGATTAAAGGACAAGGTAGCAATTATTAC-3’，下游引物：5’-CCGCTCGAGTTATACTTCGAAACCACCATCTACTTTAATTA-3’PCR体系及操作步骤为：PCR反应体系：ddH2O 28μL；PCRbuffer 10μL；dNTP 5μL；Primer F 2μL；Primer R 2μL；模板2μL；Taq酶1μL。总体积50μL。

PCR反应条件：94℃5min→[94℃1min→60℃40s→72℃1min]30cycles→72℃10min。

G013重组pEGX-6p-1载体，酶切位点为BamH I/Xho I，并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21。操作如下：-80℃中取出大肠杆菌BL21感受态细胞冰上放置；加入pEGX-6p-1/G013重组质粒2μL，冰上放置30min；热休克42℃，90秒；冰上放置2分钟；复苏，加入600μL LB培养基，37℃，150rpm，45min；吸取200μL培养基涂布于含有氨苄青霉素的LB平板培养基中；37℃培养过夜；挑取单菌落进行扩大培养并保种。

实施例2.新3α-羟基类固醇脱氢酶(G013)的在大肠杆菌BL21中的表达。

接种pEGX-6p-1/G013/BL21菌种入无菌LB培养基中，37℃，180rpm培养；待OD600≈0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃诱导12小时。8000rpm，5min收集菌体；按1L培养体系加30mL Lysis buffer的比例重悬菌体，超声破菌至澄清。

12000rpm，20min。取上清；上清与Glutathione Sepharose 4B结合，4℃结合2h。轻轻垂直颠倒混悬；结合完毕后，5000rpm，5min沉淀填料。填料用4℃预冷PBS冲洗3-5个柱体积；加入PreScission Protease酶切缓冲液，加入PreScissionProtease酶，4℃酶切过夜。酶切完毕后，将上清从层析柱中放出。

本发明新的NADP(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶G013氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的3α-羟基类固醇脱氢酶G013的SDS-PAGE分析如图1所示。

实施例3.新3α-羟基类固醇脱氢酶(G013)的活性检测。

配置pH7.550mM Tris-HCl缓冲液测试酶活性。具体操作如下：在2mL比色皿中依次加入反应缓冲液、NADP⁺、酶，凋零后加入底物，在340nm处记录光吸收变化。根据NADPH的标准曲线计算产物的生成量，计算酶活。酶活单位定义为：相应条件下，每分钟转化1μmol底物所需的酶量，定义为一个酶活单位U。

按上述方法对绿脓杆菌3α-羟基类固醇脱氢酶进行异源表达和活性检测。

表1.本发明所述3α-羟基类固醇脱氢酶与绿脓杆菌3α-羟基类固醇脱氢酶的比活力

从检测结果来看，本发明3α-羟基类固醇脱氢酶催化牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)C3位α羟基氧化，活性是绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)3α-羟基类固醇脱氢酶的1.26倍和1.11倍。本发明3α-羟基类固醇脱氢酶活性比绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)3α-羟基类固醇脱氢酶更高，在临床检验中具有巨大的应用价值。

序列表

<110> 重庆第二师范学院

<120> 一种3α-羟基类固醇脱氢酶、编码基因及其应用

<130> 20210420

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 246

<212> PRT

<213> Gut microbiota of Ursus thibetanus

<400> 1

Met Arg Leu Lys Asp Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Ala Thr Ser Gly

1 5 10 15

Met Gly Arg Ala Thr Ala Glu Leu Phe Gly Ala Glu Gly Ala Lys Val

20 25 30

Val Val Val Gly Arg Asn Glu Glu Arg Ala Lys Glu Val Val Glu Gly

35 40 45

Ile Lys Ala Lys Gly Gly Glu Ala Ile Tyr Val Leu Ala Asp Ser Asn

50 55 60

Lys Val Glu Asp Asn Gln Lys Ile Phe Asp Glu Thr Met Lys Ala Tyr

65 70 75 80

Gly Thr Val Asp Val Leu Phe Asn Asn Ala Gly Met Leu Ser Met Thr

85 90 95

Ser Ile Leu Asp Leu Thr Glu Glu Glu Phe Asp Lys Met Trp Asn Val

100 105 110

Asn Val Lys Ala Ala Leu Val Leu Thr Gln Leu Val Ala Pro Val Met

115 120 125

Lys Glu Lys Gly Lys Gly Ala Ile Ile Asn Thr Ser Ser Val Ala Gly

130 135 140

Leu Tyr Gly His His Gly Phe Ala Ala Tyr Val Thr Thr Lys His Ala

145 150 155 160

Met Ala Gly Leu Thr Lys Ser Met Ala Phe Glu Leu Gly Pro Glu Ile

165 170 175

Arg Ala Asn Ala Ile Ala Pro Gly Ala Ile His Thr Gly Met Val Asp

180 185 190

Ser Ile Gly Gly Pro Ala Val Leu Thr Gly Met Ile Glu Gly Ser Ala

195 200 205

Leu Lys Arg Ile Gly Glu Gly Lys Asp Ile Ala Ser Val Val Leu Phe

210 215 220

Leu Ala Thr Asp Glu Ser Ser Phe Met Thr Gly Gln Ile Ile Lys Val

225 230 235 240

Asp Gly Gly Phe Glu Val

245

<210> 2

<211> 741

<212> DNA

<213> Gut microbiota of Ursus thibetanus

<400> 2

atgagattaa aggacaaggt agcaattatt acaggtgcaa catcgggaat gggtagagct 60

actgctgaat tatttggcgc agaaggtgca aaagtagtag tggttggcag aaacgaagaa 120

agagctaagg aagtagtcga aggcattaaa gctaagggtg gagaagcaat ttacgtatta 180

gctgattcaa acaaagtgga agacaaccaa aaaatattcg atgaaaccat gaaggcatat 240

ggcactgtgg atgtattatt taacaatgca ggtatgttaa gcatgacttc aatattggat 300

ttaaccgaag aagagttcga caaaatgtgg aatgtcaacg taaaagctgc tttagtttta 360

acccaacttg tagcaccagt tatgaaagaa aagggtaaag gcgctattat taatacgagt 420

tcagttgcag gactatatgg tcaccacggg tttgctgcat atgtaacaac aaagcatgca 480

atggctggtt taacaaaatc aatggctttt gaacttggac ctgaaatcag agcaaatgca 540

atagctccag gcgcgattca tacgggcatg gttgacagca taggcggacc tgctgtgtta 600

actggtatga ttgaaggctc agctcttaag agaatcggag aaggtaagga tatagcaagt 660

gtagtattgt tcttagctac tgatgaatca tccttcatga caggacaaat aattaaagta 720

gatggtggtt tcgaagtata a 741

Claims

1.一种3α-羟基类固醇脱氢酶，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因，其序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种表达载体，其含有如权利要求2所述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。

4.一种重组菌，其被如权利要求3所述的表达载体转化；优选的，经表达载体转化的重组菌选自重组大肠杆菌。

5.一种酶蛋白表达盒，其包含如权利要求2所述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。

6.一种重组细胞，其包含如权利要求5所述酶蛋白表达盒。

7.如权利要求1所述3α-羟基类固醇脱氢酶或如权利要求2所述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因在总胆汁酸含量检测中的应用。

8.如权利要求1所述3α-羟基类固醇脱氢酶或如权利要求2所述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因在催化胆汁酸C3位α-羟基的氧化反应中的应用。

9.一种催化剂，其有效成分包含如权利要求1所述3α-羟基类固醇脱氢酶。

10.一种催化胆汁酸C3位α-羟基氧化反应的方法，其特征在于：所述催化剂包含如权利要求1所述3α-羟基类固醇脱氢酶；优选的，所述催化胆汁酸C3位α-羟基氧化反应为催化TCDCA的C3位α-羟基氧化生成Tauro-3-dehydro-CDCA或催化TUDCA的C3位α-羟基氧化生成Tauro-3-dehydro-UDCA。