CN113151207B - NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因 - Google Patents

NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种新的NAD(H)依赖型3α‑羟基类固醇脱氢酶，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明通过全基因合成的方式获得了一个新的3α‑羟基类固醇脱氢酶的编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。本发明为总胆汁酸含量的检测提供了检测效率更高的3α‑羟基类固醇脱氢酶，在临床检验中具有巨大的应用价值。

Description

NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因。
背景技术
胆汁酸作为胆汁的重要成分，其在代谢中起重要作用。肝脏病变会导致血清中胆汁酸含量的增加，因而胆汁酸含量的测定成为肝脏功能检查的常用指标。目前临床检测中通常使用3α-羟基类固醇脱氢酶催化待检测样品中的胆汁酸C3羟基进行氧化反应，该反应同时将氧化型辅酶I或II还原为还原性辅酶I或II，通过测定340nm处的光吸收变化值计算得到待测样品中总胆汁酸的含量。该检测过程中，具有较高催化活性和稳定性的新酶挖掘和发现是研究的热点之一。发现活性更高的3α-羟基类固醇脱氢酶有助于试剂盒检测能力的提升和更加广泛的应用。
发明内容
根据本发明的第一方面，本发明提供一种NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶，该酶能够催化牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)C3位α羟基氧化，催化活性远高于绿脓杆菌3α-羟基类固醇脱氢酶，具有巨大的实际应用价值。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种3α-羟基类固醇脱氢酶，其序列如SEQ ID NO.1所示。
Figure GDA0004093672630000011
/>
Figure GDA0004093672630000021
根据本发明的第二方面，本发明提供上述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。
上述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因，其序列如SEQ ID NO.2所示。
Figure GDA0004093672630000022
/>
Figure GDA0004093672630000031
本发明的第三方面，提供一种表达载体，其含有上述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。
一种表达载体，其含有上述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。进一步的，本发明还提供一种重组菌，其被上述的表达载体转化。更进一步，经表达载体转化的重组菌选自重组大肠杆菌。
本发明的第四方面，本发明还提供一种酶蛋白表达盒，其包含上述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。进一步，本发明还提供一种重组细胞，其包含上述酶蛋白表达盒。
本发明的第五方面，提供上述3α-羟基类固醇脱氢酶或3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因在总胆汁酸含量的检测中的应用,所述应用用于非疾病的诊断和治疗。上述3α-羟基类固醇脱氢酶或3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因在催化胆汁酸C3位α-羟基的氧化反应中的应用,所述应用用于非疾病的诊断和治疗。
本发明的第六方面，提供一种催化剂，其有效成分包含上述3α-羟基类固醇脱氢酶。
本发明的第七方面，提供一种催化胆汁酸C3位α-羟基氧化反应的方法，其特征在于：所述催化剂包含上述3α-羟基类固醇脱氢酶,所述方法用于非疾病的诊断和治疗。进一步，本发明所述催化胆汁酸C3位α-羟基氧化反应为催化TCDCA的C3位α-羟基氧化生成Tauro-3-dehydro-CDCA或催化TUDCA的C3位α-羟基氧化生成Tauro-3-dehydro-UDCA。
有益效果：
本发明提供一种新的NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶(命名为G009)，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过全基因合成的方式获得了一个新的3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。本发明新的NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶能够催化胆汁酸C3位α-羟基的氧化反应，如催化牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)以及牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)C3位α羟基氧化，催化活性是绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)3α-羟基类固醇脱氢酶的4.75倍和6.25倍。本发明为总胆汁酸含量的检测提供了检测效率更高的3α-羟基类固醇脱氢酶，在临床检验中具有巨大的应用价值。
附图说明
图1是本发明所述的3α-羟基类固醇脱氢酶G009的SDS-PAGE分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。要说明的是：以下实施例只用于对本发明进行进一步的说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制。本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
实施例1新3α-羟基类固醇脱氢酶(G009)的基因设计和获取。
通过对现已报道的3α-羟基类固醇脱氢酶的序列进行比对分析，综合SDR超家族基因序列结构的特征，设计了本发明所述的3α-羟基类固醇脱氢酶(G009)的基因序列，序列如SEQ ID NO.2所示，并交由上海生工生物科技有限公司进行全基因合成，并克隆入pEGX-6p-1载体，酶切位点为BamH I/Xho I，并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21。操作如下：-80℃中取出大肠杆菌BL21感受态细胞冰上放置；加入pEGX-6p-1/G009重组质粒2μL，冰上放置30min；热休克42℃，90秒；冰上放置2分钟；复苏，加入600μL LB培养基，37℃，150rpm，45min；吸取200μL培养基涂布于含有氨苄青霉素的LB平板培养基中；37℃培养过夜；挑取单菌落进行扩大培养并保种。
实施例2新3α-羟基类固醇脱氢酶(G009)的在大肠杆菌BL21中的表达。
接种pEGX-6p-1/G009/BL21菌种入无菌LB培养基中，37℃，180rpm培养；待OD600≈0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃诱导12小时。8000rpm，5min收集菌体；按1L培养体系加30mL Lysis buffer的比例重悬菌体，超声破菌至澄清。12000rpm，20min。取上清；上清与Glutathione Sepharose 4B结合，4℃结合2h。轻轻垂直颠倒混悬；结合完毕后，5000rpm，5min沉淀填料。填料用4℃预冷PBS冲洗3-5个柱体积；加入PreScission Protease酶切缓冲液，加入PreScission Protease酶，4℃酶切过夜。酶切完毕后，将上清从层析柱中放出。
本发明新的NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶G009氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的3α-羟基类固醇脱氢酶G009的SDS-PAGE分析如图1所示。
实施例3新3α-羟基类固醇脱氢酶(G009)的活性检测。
配置pH7.550mM Tris-HCl缓冲液测试酶活性。具体操作如下：在2mL比色皿中依次加入反应缓冲液、NAD+、酶，凋零后加入底物。在340nm处记录光吸收变化。根据NADH的标准曲线计算产物的生成量。计算酶活。酶活单位定义为：相应条件下，每分钟转化1μmol底物所需的酶量，定义为一个酶活单位U。
按上述方法对绿脓杆菌3α-羟基类固醇脱氢酶进行异源表达和活性检测。
表1.本发明所述3α-羟基类固醇脱氢酶与绿脓杆菌3α-羟基类固醇脱氢酶的比活力
Figure GDA0004093672630000041
/>
从检测结果来看，本发明新的3α-羟基类固醇脱氢酶催化TCDCA、TUDCA的C3位α-羟基氧化分别生成Tauro-3-dehydro-CDCA与Tauro-3-dehydro-UDCA，活性是绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)3α-羟基类固醇脱氢酶(Accession NO.WP_003109865.1)的4.75倍和6.25倍，催化活性远高于绿脓杆菌3α-羟基类固醇脱氢酶，具有巨大的实际应用价值。
序列表
<110> 重庆第二师范学院
<120> NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因
<130> 20210420
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 254
<212> PRT
<213> synthetic construct
<400> 1
Met Gly Thr Tyr Val Val Thr Gly Ala Ala Ser Gly Ile Gly Lys Ala
1 5 10 15
Val Ala Glu Gln Ile Ser Glu Glu Gly His Arg Val Val Ala Val Asp
20 25 30
Leu Arg Asn Thr Glu Leu Thr Ala Asp Leu Ser Asp Arg Glu Ser Cys
35 40 45
Lys Lys Val Ile Glu Gln Ile Leu Glu Arg Ala Pro Glu Gly Leu Asp
50 55 60
Gly Leu Val Pro Cys Ala Gly Val Gly Pro Asp Val Ala Arg Arg Glu
65 70 75 80
Leu Ile Pro Leu Val Asn Tyr Phe Ala Val Val Asp Leu Val Glu Gly
85 90 95
Leu Leu Ala Ala Leu Gln Gln Arg Lys Gly Ser Ile Val Leu Ile Ser
100 105 110
Ser Asn Ser Ser Gln Met Met Glu Tyr Asn Ala Ser Phe Met Asp Ala
115 120 125
Met Leu Asp Asp Asp Arg Glu Arg Ala Leu Glu Val Ala Ala Asp Ile
130 135 140
Gly Gly Gln Asp Ala Tyr Gly Gly Ser Lys Gln Ala Leu Ala Arg Trp
145 150 155 160
Met Arg Arg Asn Asn Gln Asn Ile Ser Arg Ser Gly Val Arg Met Asn
165 170 175
Ala Ile Ala Pro Gly His Thr Glu Thr Gly Met Thr Ala Ala Gly Ser
180 185 190
Ala Ser Pro Glu Tyr Ala Asp Ala Ile Lys Gln Phe Val Glu Ser Ile
195 200 205
Pro Ile Gly Tyr Ser Ala Met Pro Glu Asp Gln Ala Asn Ala Val Ser
210 215 220
Phe Leu Leu Ser Asp Lys Ala Arg Phe Ile Ser Gly Ala Val Leu Phe
225 230 235 240
Val Asp Gly Gly His Asp Ala Met Phe Arg Pro Asp Gln Tyr
245 250
<210> 2
<211> 765
<212> DNA
<213> synthetic construct
<400> 2
atgggtacct acgttgttac cggcgcggcg agcggcatcg gtaaagcggt tgcggaacag 60
atctctgaag aaggtcaccg tgttgttgcg gttgatctgc gtaacaccga actgaccgcg 120
gatctgtctg atcgtgaaag ctgcaaaaaa gttatcgaac agatcctgga acgtgcgccg 180
gaaggcctgg atggtctggt tccgtgcgcg ggcgttggcc cggatgttgc gcgtcgtgaa 240
ctgatcccgc tggttaacta cttcgcggtt gttgatctgg ttgaaggtct gctggcggcg 300
ctgcagcagc gtaaaggttc tatcgttctg atcagctcta actcttctca gatgatggaa 360
tacaacgcgt ccttcatgga tgcgatgctg gatgatgatc gtgaacgtgc gctggaagtt 420
gcggcggata tcggtggcca ggatgcgtac ggtggtagca aacaggcgct ggcgcgttgg 480
atgcgtcgta acaaccagaa catcagccgt agcggtgttc gtatgaacgc gatcgcgccg 540
ggccacaccg aaaccggtat gaccgcggcg ggtagcgcat ctccggaata cgcggatgct 600
atcaaacagt tcgttgaatc tatcccgatc ggttacagcg cgatgccgga agatcaggcg 660
aacgcggttt ctttcctgct gagcgataaa gcgcgtttca tctctggcgc ggttctgttc 720
gttgatggtg gtcacgatgc gatgttccgt ccggatcagt actaa 765

Claims (10)

1.一种3α-羟基类固醇脱氢酶，其序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因，其序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种表达载体，其含有如权利要求2所述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。
4.一种重组菌，其被如权利要求3所述的表达载体转化；经表达载体转化的重组菌选自重组大肠杆菌。
5.一种酶蛋白表达盒，其包含如权利要求2所述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。
6.一种重组细胞，其包含如权利要求5所述酶蛋白表达盒。
7.如权利要求1所述3α-羟基类固醇脱氢酶或如权利要求2所述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因在总胆汁酸含量检测中的应用,所述应用用于非疾病的诊断和治疗；所述3α-羟基类固醇脱氢酶或3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因在催化胆汁酸C3位α-羟基的氧化反应中的应用,所述应用用于非疾病的诊断和治疗。
8.一种催化剂，其有效成分包含如权利要求1所述3α-羟基类固醇脱氢酶。
9.一种催化胆汁酸C3位α-羟基氧化反应的方法，其特征在于：催化剂包含如权利要求1所述3α-羟基类固醇脱氢酶,所述方法用于非疾病的诊断和治疗。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述催化胆汁酸C3位α-羟基氧化反应为催化TCDCA的C3位α-羟基氧化生成Tauro-3-dehydro-CDCA或催化TUDCA的C3位α-羟基氧化生成Tauro-3-dehydro-UDCA。
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