CN104388440A - 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中表达3α-羟基类固醇脱氢酶的DNA序列 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-hydroxysterioddehydrogenase，3α-HSD）活性的多肽链的DNA序列，包括其互补链序列。其特征在于，该DNA序列的表达产物具有3α-羟基类固醇脱氢酶活性，是一种新型的铜绿假单胞菌（ Pseudomonasaeruginosa ）3α-羟基类固醇脱氢酶。内容包括利用生物信息学分析获得的铜绿假单胞菌3α-羟基类固醇脱氢酶基因序列；含有铜绿假单胞菌3α-羟基类固醇脱氢酶3-hsdA基因序列的重组表达载体；表达3α-羟基类固醇脱氢酶3-hsdA的基因工程菌；3α-羟基类固醇脱氢酶的酶促动力学参数。

Description

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中表达3α-羟基类固醇脱氢酶的DNA序列

技术领域

本发明涉及一种具有3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-hydroxysteriod dehydrogenase，3α-HSD）活性的多肽链的DNA序列，包括其互补链序列。其特征在于，该DNA序列的表达产物具有3α-羟基类固醇脱氢酶活性，是一种新型的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶。该蛋白的酶学性质为首次鉴定，具有应用于磺酸化胆汁酸临床检测的实用性，属于生物工程领域。

背景技术

3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-hydroxysteriod dehydrogenase，3α-HSD）是广泛存在于哺乳动物细胞和原核细胞中的一类氧化还原酶。细菌3α-HSD是胆汁酸（bile acids，BAs）、磺酸化胆汁酸（sulfated bile acids，SBAs）和雄甾酮等物质定量分析中不可缺少的酶试剂，具有较高的实用价值。

磺酸化胆汁酸（sulfated bile acids，SBAs）是体内胆固醇代谢产物胆汁酸（bile acids，BAs）的主要排泄形式之一。在正常生理情况下，体内95%的BAs经肠肝循环（enterohepatic circulation）回到肝胆系统中，少量BAs会随粪便和尿液排出体外。BAs在体内会发生磺酸化作用形成SBAs，这是机体减低BAs的毒性作用和增加BAs溶解性，以利于BAs排泄的一种机制。研究表明，尿中的BAs主要是以磺酸化的形式存在。通常，健康人尿液中SBAs的含量极低。当发生肝胆病变时，由于肝胆结构的破坏，大量BAs便会从肝胆系统中漏出，从而造成尿中SBAs含量异常增高。目前，尿液中SBAs已经被建议作为肝胆疾病早期诊断和治疗监测的重要指标。在日本，尿中SBAs 的含量已经成为肝胆功能评估、肝癌（liver cancer）和肝硬化（hepatocirrhosis）诊断的重要指标。SBAs的定量检测具有很高的临床应用价值。

在SBAs的各种测定方法中，酶-比色测定法具有操作简单、准确性较高、测试时间短和设备成本较低等特点，是一种有潜在临床应用价值的检测方法。近年来，本实验室一直致力于开发满足临床应用需求的SBAs测定方法，先后将流动注射分析技术（flow injection analysis，FIA）、固定化酶技术（immobilized enzyme）和化学发光法（chemiluminescence）引入SBAs的酶法测定中，实现了对SBAs的自动分析测定，提高了测定的灵敏度，并建立了一种新型的SBAs生物传感器，开发了尿中SBAs测定试剂盒。这些分析测定技术具有极大的临床应用前景。但是，这些测定方法都需要昂贵的3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-hydroxysteriod dehydrogenase，3α-HSD）。昂贵的酶试剂是影响这些SBAs检测技术推广应用的主要因素。

发明内容

本发明的目的是开发一种新型3α-羟基类固醇脱氢酶，发明内容如下：

1. 提供能产生一种新型铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶的基因序列信息（SEQ ID NO:1）。

2. 提供一种根据基因信息得到的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列信息。

3. 含有铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶基因的DNA序列的重组表达载体。

4. 携带含有铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶基因的DNA序列的重组表达载体的大肠杆菌菌株。

5. 得到重组3α-羟基类固醇脱氢酶的酶促反应动力学参数。

本发明的各种特征如下：

1. 通过生物信息学分析发现铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1基因组中第2356713 bp到2357573 bp碱基基因序列（SEQ ID NO:1）与已知的睾丸酮假单胞菌（P. testosteroni）3-HSD (WP_020684122.1)序列的比对，发现具有51%的同源性，但是功能未知。本研究通过基因工程技术克隆了该段基因；构建了含有该段基因的克隆载体和表达载体；在原核大肠杆菌中进行了诱导表达，并对其酶学性质进行了研究，确认了该基因序列表达的产物具有3α-羟基类固醇脱氢酶活性。

2. 通过基因重组技术构建了包含特征1所述的基因序列的重组表达载体，方法为：

A. 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），其3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA原始克隆的大小为1134bp，其聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ，PCR）体系如下：

混匀后，按照下列反应条件进行PCR反应。

于1%琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的片段。

 

B. 克隆载体pUC19的单酶切

3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA使用的克隆载体pUC19大小为2686 bp，用SmaⅠ对pUC19进行单酶切，其酶切反应体系如下：

混匀后30°C酶切5 h，1%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收pUC19线性片段。

C. pUC19线性片段与3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA的 PCR产物的连接

将3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA PCR产物与pUC19片段以1∶3的摩尔比混合，进行连接反应，其连接反应体系如下：

混匀后4℃连接过夜，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养于含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基中，培养16-20小时。挑取阳性克隆提取质粒鉴定，获得重组克隆载体pUC19-hsdA。

D. 重组克隆载体pUC19-hsdA双酶切

用NcoⅠ和EcoRⅠ对重组克隆载体pUC19-hsdA进行双酶切，其酶切反应体系如下： 

混匀后，37°C水浴酶切5 h。1%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA片段。

 

E. pET30b(+)大片段与3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA的连接

将3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA与pET30b(+)大片段以1∶3的摩尔比混合，进行连接反应，其连接反应体系如下： 

混匀后4℃连接过夜，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养于含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基中，培养16-20小时。

3. 通过基因工程技术构建的含有特征2所述的重组表达载体的大肠杆菌工程菌，其方法为：取经卡那霉素筛选，pET30b(+)-hsdA重组载体转化后的大肠杆菌BL21(DE3)在培养基中形成的单菌落，接种于含50μg/ml卡那霉素的5mlLB培养液中，37℃下振荡培养过夜；分别取1ml培养液，按天根生化科技（北京）有限公司《质粒小量抽取试剂盒说明书》进行操作提取质粒；.取10μl质粒DNA，加入4μl蒸馏水、2μl缓冲液、2μl 0.1%BSA以及1μl NcoⅠ、1μl EcoRⅠ酶混匀后置于37℃水浴中，保温5小时；将重组DNA和酶切后质粒DNA同时进行电泳，紫外光下检测外源3-hsdA基因片段，片段大小为1134bp，初步确定该菌落为转化成功的工程菌；取卡那霉素筛选，pET30b(+)-hsdA重组载体转化后的大肠杆菌BL21(DE3)在培养基中形成的单菌落扩大培养后提取的质粒DNA送华大公司测序，进一步鉴定为该菌落为转化成功的工程菌。

4. 通过诱导培养特征3中所述的基因工程菌，获得重组铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶，其方法为：

A.取pET30b(+)-hsdA转化成功的工程菌1~2个菌落，接种到含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养过夜，取200μl过夜培养物于含50μg/ml卡那霉素的200 ml LB液体培养基中，37℃，200 rpm振荡培养2~3h，至A600约为0.6~0.8时，加IPTG至终浓度1 mmol/L，37℃，200 rpm振荡培养，诱导表达4h；取200ml经IPTG诱导表达的菌液，于4℃，5,000rpm离心15min，弃液体，用0.1mol/L pH7.0的磷酸缓冲液洗涤细菌2~3次，称取菌体湿重；按照8 mL/g菌体的量加入0.1 mol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.0），重悬菌体。将此细菌悬浮液置于冰浴中，采用超声破碎的方法使细菌裂解。于4°C条件下，以6,000 rpm转速离心10 min，收集上清液。SDS-PAGE电泳，鉴定3α-羟基类固醇脱氢酶的表达量和亚基分子量，检测酶活性和温度、pH、金属离子的影响，测定3α-羟基类固醇脱氢酶的Km值；pET30b(+)-hsdA转化成功的工程菌、BL21(DE3)、转化pET30b(+)空质粒的BL21(DE3)活性分别是1232U/L、27U/L和51 U/L，锌离子为激活剂；酶催化的最适反应温度为30℃；最适pH是8.0；Km值是1.06 mmol/L。

本发明的优点和积极效果为：从铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）基因组中获得了3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因序列，并通过基因工程技术实现了这种新型3α-羟基类固醇脱氢酶的异源表达，这种以生物信息学分析和基因工程技术相结合的方法能够实现快速获得新型工具酶。本发明获得的3α-羟基类固醇脱氢酶活性高，酶催化反应活性的pH范围分别为6.0-11.0，温度范围分别是20-45℃，km值是1.06mmol/L,广范围的pH和温度尤为适合作为磺酸化胆汁酸检测试剂盒的原料，可大幅度降低磺酸化胆汁酸临床检测的成本，将为磺酸化胆汁酸临床检测的推广应用提供有力的技术保障。

 

附图说明

图1实施例2重组载体pET30b(+)-hsdA结构图

图2实施例3 pET30b(+)-hsdA重组载体酶切鉴定

图中M为DNA Marker，1为未酶切的pET30b(+)-hsdA，2为经酶切后的pET30b(+)-hsdA；

图3实施例4 3α-羟基类固醇脱氢酶3-HSDA的SDS-PAGE电泳图

图中M：DNA marker；1：BL21(DE3)；2：pET30b(+)转化的BL21(DE3)菌；3，4：转化pET30b(+)-hsdA的重组菌；

图4实施例6温度对3α-羟基类固醇脱氢酶3-HSDA的影响

图5实施例7 pH对3α-羟基类固醇脱氢酶3-HSDA的影响

图6实施例8金属离子对3α-羟基类固醇脱氢酶3-HSDA的影响

图7实施例9 3α-羟基类固醇脱氢酶3-HSDA的Km值

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做详细说明：

实施例1

本实施例是克隆铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶3-HSDA基因片段，克隆的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶3-HSDA基因片断经测序鉴定长度是1134 bp。

实施例2

本实施例是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶3-HSDA基因片段与pET30b(+)表达载体重组，构成pET30b(+)-hsdA重组载体的步骤如下：

A. 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），其3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA原始克隆的大小为1134bp，其聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ，PCR）体系如下：

混匀后，按照下列反应条件进行PCR反应。

于1%琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的片段。

 

B. 克隆载体pUC19的单酶切

3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA使用的克隆载体pUC19大小为2686 bp，用SmaⅠ对pUC19进行单酶切，其酶切反应体系如下：

混匀后30°C酶切5 h，1%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收pUC19线性片段。

C. pUC19线性片段与3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA PCR产物的连接

将3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA 的PCR产物与pUC19片段以1∶3的摩尔比混合，进行连接反应，其连接反应体系如下：

混匀后4℃连接过夜，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养于含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基中，培养16-20小时。挑取阳性克隆提取质粒鉴定，获得重组克隆载体pUC19-hsdA。

D. 重组克隆载体pUC19-hsdA双酶切

用NcoⅠ和EcoRⅠ对重组克隆载体pUC19-hsdA进行双酶切，其酶切反应体系如下： 

混匀后，37°C水浴酶切5 h。1%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA片段。

 

E. pET30b(+)大片段与3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA的连接

将3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA与pET30b(+)大片段以1∶3的摩尔比混合，进行连接反应，其连接反应体系如下：

混匀后4℃连接过夜，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养于含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基中，培养16-20小时，构成的pET30 b(+)-hsdA结构如图1所示。

 

实施例3

本实施例是pET30b(+)-hsdA重组体转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经卡那霉素筛选，获得3α-羟基类固醇脱氢酶的BL21(DE3)工程菌的实验步骤如下：

取经卡那霉素筛选，pET30b(+)-hsdA重组载体转化后的大肠杆菌BL21(DE3)在培养基中形成的单菌落，接种于含50μg/ml卡那霉素的5mlLB培养液中，37℃下振荡培养过夜；分别取1ml培养液，按天根生化科技（北京）有限公司《质粒小量抽取试剂盒说明书》进行操作提取质粒；.取10μl质粒DNA，加入4μl蒸馏水、2μl缓冲液、2μl 0.1%BSA以及1μl  NcoⅠ、1μl  EcoRⅠ酶混匀后置于37℃水浴中，保温5小时；将重组DNA和酶切后质粒DNA同时进行电泳，紫外光下检测外源3-hsdA基因片段，片段大小为1134bp，初步确定该菌落为转化成功的工程菌；取卡那霉素筛选，pET30b(+)-hsdA重组载体转化后的大肠杆菌BL21(DE3)在培养基中形成的单菌落扩大培养后提取的质粒DNA送华大公司测序，进一步鉴定为该菌落为转化成功的工程菌。

实施例4

本实施例是表达3α-羟基类固醇脱氢酶的BL21(DE3)工程菌在LB培养基培养，经种子及发酵扩大培养，从发酵液提取、分离得到3α-羟基类固醇脱氢酶粗酶液的方法：

取pET30b(+)-hsdA转化成功的工程菌1~2个菌落，接种到含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养过夜，取200μl过夜培养物于含50μg/ml卡那霉素的200 ml LB液体培养基中，37℃，200 rpm振荡培养2~3h，至A₆₀₀约为0.6~0.8时，加IPTG至终浓度1 mmol/L，37℃，200 rpm振荡培养，诱导表达4h；取200ml经IPTG诱导表达的菌液，于4℃，5,000rpm离心15min，弃液体，用0.1mol/L pH7.0的磷酸缓冲液洗涤细菌2~3次，称取菌体湿重；按照8 mL/g菌体的量加入0.1 mol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.0），重悬菌体。将此细菌悬浮液置于冰浴中，采用超声破碎的方法使细菌裂解。于4°C条件下，以6,000 rpm转速离心10 min，收集上清液。电泳鉴定酶表达量，鉴定结果如图3所示，工程菌在35KD分子量附近区带明显强于作为对照的BL21(DE3)、转化pET30b(+)空质粒的BL21(DE3)。

实施例5 

   本实施例是考察基因工程产物3α-羟基类固醇脱氢酶3-HSDA的活性。表达3α-羟基类固醇脱氢酶的酶活性测定体系总体积为100 μl包括0.05 mol/L磷酸钠缓冲液（pH8.0）缓冲液、2 mmol/L NAD⁺ 和1 mmol/L 胆汁酸钠。将溶液混合后，于30°C孵育5 min后，加入待测的酶液5-10 μL， 30°C恒温反应，测定酶活力。

pET30b(+)-hsdA转化成功的工程菌、BL21(DE3)、转化pET30b(+)空质粒的BL21(DE3) 的酶活性测定结果分别是1232U/L、27U/L和51 U/L，锌离子为激活剂；工程菌的粗酶活性明显高于作为对照的BL21(DE3)、转化pET30b(+)空质粒的BL21(DE3)。

实施例6 

本实施例是考察温度对本发明的基因工程产物3α-羟基类固醇脱氢酶3-HSDA的影响。酶活性测定体系同实施例5，在15℃-45℃范围内改变温度，进行酶促反应, 恒温反应5 min后，测定不同温度下的酶活力。其结果如图4所示，3-HSDA的酶催化反应最适温度为30℃。

实施例7

本实施例是考察pH对本发明的基因工程产物3α-羟基类固醇脱氢酶3-HSDA的影响。固定反应体系温度为30℃，酶活性测定体系同实施例5。配制pH4.0，5.0，6.0，7.0，8.0， 9.0，10.0和11.0的磷酸钠缓冲液，恒温反应5 min后，分析不同pH值对酶活性的影响。其结果如图5所示，3-HSDA的最适pH是8.0。

实施例8

本实施例是考察金属离子对本发明的基因工程产物基因工程产物3α-羟基类固醇脱氢酶3-HSDA的影响。固定反应体系温度为30℃、pH8.0，酶活性测定体系同实施例5。在酶促反应体系中分别添加终浓度为0.5 mmol/L的MgSO₄、ZnSO₄·7H₂O、MnSO₄·H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoSO₄·7H₂O、NiSO₄·6H₂O 、CaCl₂和终浓度为0.25 mmol/L的(Na)₂SO₄、K₂SO₄、、Fe₂ (SO₄)₃、 Al₂ (SO₄)₃·12H₂O，分别与酶液充分混合，恒温反应5min后，测定酶活性。其结果如图6所示。3α-羟基类固醇脱氢酶3-HSDA在锌离子存在下活性最高。

实施例9

本实施例是考察本发明的基因工程产物3α-羟基类固醇脱氢酶3-HSDA的Km值。酶活性测定体系同实施例5，测定3α-羟基类固醇脱氢酶在胆汁酸钠浓度分别为0.25 mmol/L，0.40 mmol/L，0.60 mmol/L，0.80 mmol/L，1.00 mmol/L时的酶促反应速度V。根据利用林-贝氏（Lineweaver-Burk）作图法，以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标作图，由直线的横轴截距求出Km。其结果如图7所示，3α-羟基类固醇脱氢酶3-HSDA的Km值为1.06 mmol/L。

<110>四川大学

<120>铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中表达3α-羟基类固醇脱氢酶的DNA序列

<160>1

<210>1

<211>861

<212>DNA

<213>铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）

<400>1

atgagcgaac agcgacagac cctgccggcg cagcaccagg accaacgtcc cggccacgaa 60

agccagatgc agccgaagcc ggagttcgtt tccgccgatt accgtccggc ggccaagctg 120

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ttcggcgcgg atacgccgat gggccggccc ggccagccgg aagagctggc cgccagctac 780

gtctacctgg cctgtaacga ctcgtcctac gtcagcggcc aggtgctgca cgtcaacggc 840

ggtacggtag tcaacggctg a 861

Claims (5)

1.具有3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-hydroxysteriod dehydrogenase，3α-HSD）活性的多肽链的DNA序列（SEQ ID NO:1），包括其互补链序列；其特征在于，该DNA序列的表达产物具有3α-羟基类固醇脱氢酶活性，是一种新型的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶。

2.含有权利要求1所述的DNA序列的原核或真核细胞表达载体；其特征在于，是一种通过DNA重组技术获得的含有权利要求1所述的DNA序列的原核或真核细胞表达载体。

3.含有权利要求2所述的重组表达载体的宿主细胞；其特征在于，是一种通过基因工程技术获得的含有权利要求2所述的表达载体的宿主细胞。

4.通过基因工程技术生产的由权利要求1所述的DNA序列编码的具有3α-羟基类固醇脱氢酶活性的蛋白产物。

5.权利要求4所述的新型3α-羟基类固醇脱氢酶在磺酸化胆汁酸检测试剂盒等临床诊断产品中的应用开发。