CN101974603A - 一种生产D-α-羟基丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产D-α-羟基丁酸的方法，步骤包括：(1)以假单胞菌制备含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液或其粗酶液；(2)热变性步骤(1)制备的完整细胞悬液或其粗酶液，使NAD非依赖性D-羟酸脱氢酶失活，得到仅含有NAD非依赖性L-羟酸脱氢酶活力的生物催化剂；(3)以步骤(2)制得到的生物催化剂拆分外消旋α-羟基丁酸，得含D-α-羟基丁酸钠和α-酮基丁酸钠的转化液；(4)转化液预处理；(5)预处理后的转化液酸化；(6)D-α-羟基丁酸和α-酮基丁酸的分离；(7)D-α-羟基丁酸精制。本发明具有培养基成分简单、生长周期短，成本低，后续分离提取简单，以及产物D-α-羟基丁酸对映体过量值高等特点，奠定了高效生产D-α-羟基丁酸的基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产D-α-羟基丁酸及α-酮基丁酸的方法，具体地说，涉及利用含NAD(烟酰胺腺嘌呤双核苷酸)非依赖性L-羟酸脱氢酶的微生物完整细胞或粗酶液拆分外消旋α-羟基丁酸生成D-α-羟基丁酸及α-酮基丁酸的方法。
背景技术
α-羟基丁酸是合成异亮氨酸和某些药物的中间体。高纯度手性α-羟基丁酸单体可以用来合成高聚物聚α-羟基丁酸[P(2HB)]。此高聚物可生物降解，并可应用于生物医学、制药以及环境方面【1】。另外，D-α-羟基丁酸可用来制备azinothricin家族抗癌抗生素【2】【3】。
文献报道高纯度D-α-羟基丁酸的生产有两种，一是酶法还原α-酮基丁酸生成D-α-羟基丁酸，如利用D-乳酸脱氢酶还原α-酮基丁酸为α-羟基丁酸，但此方法需要添加昂贵的电子受体NADH，难以实现产业化规模【4】；二是酶法立体选择性拆分外消旋α-羟基丁酸，如利用脂肪酶催化的立体选择性乙酰化α-羟酸生成R-α-羟酸，其对映体过量率达99％以上，所用底物浓度在1毫摩尔/升左右【5】；通过乙醇酸氧化酶立体选择性氧化外消旋α-羟酸生成R-α-羟酸和α-酮酸，随后D-乳酸脱氢酶还原α-酮酸为R-α-羟酸，所用底物浓度不超过1毫摩尔/升【6】。由于外消旋α-羟基丁酸较α-酮基丁酸便宜，且反应过程不需添加共底物，所以此途径较为可行。但上述制备方法存在D-α-羟基丁酸产量低的问题，其应用受到限制。
NAD非依赖性羟酸脱氢酶分为L-羟酸脱氢酶和D-羟酸脱氢酶，可分别催化L-α-羟基丁酸与D-α-羟基丁酸生成α-酮基丁酸，含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的生物催化剂可高效率催化高浓度的外消旋α-羟基丁酸生成α-酮基丁酸【7】。针对性的保留生物催化剂中L-羟酸脱氢酶，失活D-羟酸脱氢酶，则可以实现外消旋α-羟基丁酸的拆分，生成两种重要的中间体α-酮基丁酸与D-α-羟基丁酸。
经检索，利用含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的微生物完整细胞或粗酶液拆分外消旋α-羟基丁酸生产D-α-羟基丁酸以及α-酮基丁酸的方法未见报道。
参考文献
【1】Tsuji，H.，Okumura，A.，2009.Stereocomplex formation between enantiomeric substitutedpoly(lactide)s：blends of poly[(S)-2-hydroxybutyrate]and poly[(R)-2-hydroxybutyrate].Macromolecules 42，7263-7266.
【2】Karl，J.，Jia，C.，Soraya，M.，Andrew，P.，1995.Synthetic studies on the azinothricin familyof antibiotics.4.enantioselective synthesis of the northern half of antitumour antibioticsA83586C and citropeptin.Tetrahedron Lett.36，6965-6968.
【3】Nakagawa，A.，Kato，K.，Shinmyo，A.，Suzuki，T.，2007.Asymmetric hydrolysis of2-hydroxy-carboxylic esters using recombinant Escherichia coli.Tetrahedron：Asymmetry18，2394-2398.
【4】Simon，E.S.，Plante，R.，Whitesides，G.M.，1989.D-lactate dehydrogenase.Substratespecificity and use as a catalyst in the synthesis of homochiral 2-hydroxy acids.Appl.Biochem.Biotechnol.22，169-179.
【5】Adam，W.，Lazarus，M.，Schmerder，A.，Humpf，H-U.，Saha-
C.R.，Schreier，P.，1998.Synthesis of optically active α-hydroxy acids by kinetic resolution through lipase-catalyzedenantioselective acetylation.Eur.J.Org.Chem.9，2013-2018.
【6】Adam，W.，Lazarus，M.，Saha-Moller，C.R.，Schreier，P.，1998.Quantitative transformationof racemic 2-hydroxy acids into(R)-2-hydroxy acids by enantioselective oxidation withglycolate oxidase and subsequent reduction of 2-keto acids with D-lactate dehydrogenase.Tetrahedron：Asymmetry 9，351-355.
【7】Gao，C.，Zhang，W.，Lv，C.J.，Li，L.X.，Ma，C.Q.，Hu，C.H.，Xu，P.，2010.Efficientproduction of 2-oxobutyrate from 2-hydroxybutyrate using whole cells of Pseudomonasstutzeri strain SDM.Appl.Envrion.Microbiol.76，1679-1682.
发明内容
针对已报道制备方法中产物D-α-羟基丁酸产量和对映体过量率值低的问题，本发明要解决的问题是利用含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的微生物完整细胞或粗酶液拆分外消旋α-羟基丁酸生产D-α-羟基丁酸。本发明方法具有底物利用率高、产物浓度高、光学纯度高以及后提取简便等优点。
本发明的生产D-α-羟基丁酸的方法，其步骤如下：
(1)微生物完整细胞或粗酶液的制备：选取含NAD非依赖性羟酸脱氢酶活力的假单胞菌，常规培养，期间以高效液相色谱(HPLC)法检测细胞NAD非依赖性羟酸脱氢酶活力，至其活力达到120～200单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用pH 7.2～7.5磷酸钾缓冲液洗涤菌体2～4次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液，或者将完整细胞悬液用超声波破碎得粗酶液，4℃储存备用；
其中：在上述步骤中，NAD非依赖性羟酸脱氢酶酶活单位U定义为：37℃，每分钟催化底物α-羟基丁酸钠转化生成1微摩尔α-酮基丁酸钠所需的酶量；
(2)热变性使NAD非依赖性D-羟酸脱氢酶失活：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液或粗酶液置于45～65℃水浴中处理5～50分钟，得到仅含有NAD非依赖性L-羟酸脱氢酶活力的生物催化剂，4℃储存，备用；
(3)拆分外消旋α-羟基丁酸：以浓度为5～120克湿细胞/升的步骤(2)所述生物催化剂与浓度为100～800毫摩尔/升外消旋α-羟基丁酸钠水溶液混合；在5～40℃，pH 5.0～10.0条件下，以50～180转/分钟振荡5～30小时，使底物外消旋α-羟基丁酸钠、生物催化剂与氧气充分混合，得含D-α-羟基丁酸钠以及α-酮基丁酸钠的转化液；HPLC法检测D-α-羟基丁酸钠的浓度，计算对映体过量率；
其中：在上述步骤中，对映体过量率的计算公式为：
(4)转化液预处理：以步骤(3)转化液体积量计，加入其0.1～0.5％体积量的1％壳聚糖溶液，搅拌絮凝0.5～2小时，以5,000～10,000转/分离心5～25分钟，或者用200～400目滤布过滤，得预处理转化液；
(5)预处理转化液的酸化：按常规方法将122(II型)或732或724或D152阳离子交换树脂处理为H型，装入玻璃层析柱；预处理转化液以0.5～4柱体积/小时的流速过柱，收集流出液；用10摩尔/升的NaOH调节pH至2.3～5.5；得酸化后转化液；
(6)D-α-羟基丁酸和α-酮基丁酸的分离：将D301树脂或330树脂或D345树脂或335树脂按常规方法处理成氯型，装入玻璃层析柱；酸化后转化液以0.5～3柱体积/小时的流速上样；收集流出的含D-α-羟基丁酸的液体至上样结束，得收集液A；上样结束后以0.5～3柱体积/小时的流速用去离子水淋洗，收集1～4柱床体积的流出液，得收集液B；
(7)D-α-羟基丁酸的精制：合并收集液A、B，用1摩尔/升的NaOH调节pH至7，在真空度0.075～0.095兆帕，温度45～70℃的条件下减压蒸馏浓缩得到D-α-羟基丁酸钠；
利用高效液相色谱(HPLC)测定D-α-羟基丁酸含量的方法：采用Agilent1100色谱系统，色谱柱为Aminex HPX-87H；分析条件为以10毫摩尔/升硫酸为流动相，柱温55℃，流速为0.4毫升/分钟，进样量5微升，采用示差折光检测器。D-α-羟基丁酸对映体过量值测定采用Agilent1100色谱系统，色谱柱为手性柱(50×4.6毫米，MCIGEL CRS10W，日本三菱化学)，以2毫摩尔/升硫酸铜水溶液作为流动相，柱温25℃，流速为0.5毫升/分钟，进样量5微升，紫外检测器波长为254纳米。待测样品用两倍体积的高氯酸(5％)酸化，4℃静置2小时后，12000转/分钟离心15分钟，离心上清用0.22微米的水相滤膜过滤，然后HPLC分析样品。
上述拆分外消旋-α-羟基丁酸生产D-α-羟基丁酸的方法中：
步骤(1)所述的假单胞菌优选恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC 12633、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 10145、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)ATCC17588。
步骤(2)所述完整细胞悬液或者粗酶液热处理温度优选为50～60℃。
步骤(2)所述完整细胞悬液或者粗酶液热处理时间优选为10～30分钟。
步骤(3)所述外消旋-α-羟基丁酸钠的浓度优选为200～600毫摩尔/升。
步骤(3)所述生物催化剂完整细胞或粗酶液来源的完整细胞悬液细胞浓度优选为20～80克湿细胞/升。
步骤(3)所述温度优选为30～37℃，所述pH值优选为6.5～7.5，所述振荡转速优选为180转/分钟，震荡时间优选为14～24小时。
步骤(4)所述离心转速优选为8,000～12,000转/分，离心时间优选为7～10分钟。
步骤(5)所用树脂优选122(II型)弱酸性或732强酸性或D152弱酸性等阳离子交换树脂。
步骤(5)所述pH范围优选为2.3～4.5。
步骤(5)中流速优选为0.5～2柱体积/小时。
步骤(6)所述树脂优选D301或330阴离子交换树脂
步骤(6)所述上样流速优选为0.5～2柱体积/小时，上样体积优选为2～3倍柱体积，去离子水淋洗流速优选为1～2倍柱体积/小时，去离子水淋洗体积优选为2～4倍柱体积。
步骤(7)所述真空度优选为0.075～0.09兆帕，温度优选为55～65℃。
本发明是一种利用热变性使NAD非依赖性D-羟酸脱氢酶失活，获得仅有NAD非依赖性L-羟酸脱氢酶活力的生物催化剂，使外消旋乳酸中的L-α-羟基丁酸被选择性的转化为α-酮基丁酸，从而制备D-α-羟基丁酸的方法。本发明具有以下特点：
(1)菌株要求的培养基简单、生长周期短、成本低。
(2)能拆分价格低的外消旋α-羟基丁酸，生产D-α-羟基丁酸，底物成本低。
(3)可作用的底物浓度高。
(4)拆分所得另外一种产物α-酮基丁酸同样具很高经济价值。
(5)底物转化率高，产物稳定。
(6)生物催化剂可以用过滤法或离心法去除，后续分离提取费用低廉。
(7)两种产物可以简单分离，高纯度产物容易得到。
(8)产物D-α-羟基丁酸对映体过量值高(高于99.5％)。
附图说明
图1D-α-羟基丁酸标准品的HPLC检测结果。
图2L-α-羟基丁酸钠标准品的HPLC检测结果。
图3α-酮基丁酸钠标准品的HPLC检测结果。
图4D-α-羟基丁酸产品的HPLC检测结果。
具体实施方式
实施例1：
(1)含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的微生物完整细胞的制备：选取恶臭假单胞菌ATCC12633，常规培养，期间以高效液相色谱(HPLC)法检测细胞NAD非依赖性羟酸脱氢酶活力，至其活力达到140单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用pH 7.4磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液，4℃储存备用；
(2)热变性使NAD非依赖性D-羟酸脱氢酶失活：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液置于60℃水浴中处理10分钟，4℃储存，备用；
(3)拆分外消旋α-羟基丁酸：将步骤(2)中制得的完整细胞悬液与外消旋α-羟基丁酸钠水溶液混合，并使混合物中α-羟基丁酸钠的浓度为400毫摩尔/升、完整细胞浓度为80克湿细胞/升；在37℃，pH 6.5条件下，以180转/分钟振荡18小时，使底物外消旋α-羟基丁酸钠、生物催化剂与氧气充分混合，得含D-α-羟基丁酸钠以及α-酮基丁酸钠的转化液；
经HPLC法检测，D-α-羟基丁酸钠的浓度为185毫摩尔/升，α-酮基丁酸的浓度为206毫摩尔/升，计算对映体过量率为90.7％。
(4)转化液预处理：以转化液体积量计，加入其0.5％体积量的1％壳聚糖溶液，搅拌絮凝1小时，以10,000转/分离心9分钟，得预处理转化液；
(5)预处理转化液的酸化：按常规方法将732强酸性阳离子树脂处理为H型，装入玻璃层析柱；以1.5柱体积/小时的流速过柱，收集流出液；用10摩尔/升的NaOH调节pH至2.37，HPLC法检测D-α-羟基丁酸的浓度为174毫摩尔/升，α-酮基丁酸的浓度为192毫摩尔/升；得酸化的预处理转化液；
(6)D-α-羟基丁酸和α-酮基丁酸的分离：按常规方法将D301树脂处理成氯型，装入玻璃层析柱，以1柱体积/小时的流速上样50毫升；收集流出的含D-α-羟基丁酸的液体至上样结束，此为收集液A；上样结束后以1.5柱体积/小时的流速用去离子水淋洗，收集60毫升的流出液，此为收集液B；
(7)D-α-羟基丁酸的精制：合并收集液A、B，用1摩尔/升的NaOH调节pH至7，旋转蒸发在真空度0.075兆帕，温度60℃的条件下减压蒸馏浓缩得到样品，纯度为82.4％，纯化阶段D-α-羟基丁酸的回收率为72.5％。
实施例2：
(1)含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的微生物完整细胞的制备：选取铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 10145，常规培养，期间以高效液相色谱(HPLC)法检测细胞NAD非依赖性羟酸脱氢酶活力，至其活力达到160单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用pH 7.4磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液，4℃储存备用；
(2)热变性使NAD非依赖性D-羟酸脱氢酶失活：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液置于55℃水浴中处理15分钟，4℃储存，备用；
(3)拆分外消旋α-羟基丁酸：将步骤(2)中制得的完整细胞悬液与外消旋α-羟基丁酸钠水溶液混合，并使混合物中α-羟基丁酸钠的浓度为200毫摩尔/升、完整细胞浓度为20克湿细胞/升；在37℃，pH 7条件下，以180转/分钟振荡18小时，使底物外消旋α-羟基丁酸钠、生物催化剂与氧气充分混合，得含D-α-羟基丁酸钠以及α-酮基丁酸钠的转化液；
经HPLC法检测，D-α-羟基丁酸钠的浓度为96毫摩尔/升，α-酮基丁酸的浓度为97毫摩尔/升，计算对映体过量率为86.4％。
(4)转化液预处理：以转化液体积量计，加入其0.6％体积量的1％壳聚糖溶液，搅拌絮凝1小时，以8000转/分离心10分钟，得预处理转化液；
(5)预处理转化液的酸化：按常规方法将724弱酸性阳离子树脂处理为H型，装入玻璃层析柱；以1柱体积/小时的流速过柱，收集流出液；用10摩尔/升的NaOH调节pH至3.45，HPLC法检测D-α-羟基丁酸的浓度为89毫摩尔/升，α-酮基丁酸的浓度为94毫摩尔/升；得酸化的预处理转化液；
(6)D-α-羟基丁酸和α-酮基丁酸的分离：按常规方法将330树脂处理成氯型，装入玻璃层析柱，以0.5柱体积/小时的流速上样60毫升；收集流出的含D-α-羟基丁酸的液体至上样结束，此为收集液A；上样结束后以1.0柱体积/小时的流速用去离子水淋洗，收集60毫升的流出液，此为收集液B；
(7)D-α-羟基丁酸的精制：合并收集液A、B，用1摩尔/升的NaOH调节pH至7，旋转蒸发在真空度0.080兆帕，温度60℃的条件下减压蒸馏浓缩得到样品，纯度为94.7％，纯化阶段D-α-羟基丁酸的回收率为70.1％。
实施例3：
(1)含NAD非依赖性L-羟酸脱氢酶粗酶液的制备：选取施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)ATCC 17588，常规培养，期间以高效液相色谱(HPLC)法检测细胞NAD非依赖性L-羟酸脱氢酶活力，至其活力达到170单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用pH 7.4磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含NAD非依赖性L-羟酸脱氢酶的完整细胞悬液，将完整细胞悬液用超声波破碎得粗酶液，4℃储存备用；
(2)热变性使NAD非依赖性D-羟酸脱氢酶失活：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的粗酶液置于50℃水浴中处理30分钟，4℃储存，备用；
(3)拆分外消旋α-羟基丁酸：将步骤(2)中制得的粗酶液与外消旋α-羟基丁酸钠水溶液混合，并使混合物中α-羟基丁酸钠的浓度为600毫摩尔/升、生物催化剂粗酶液来源于浓度为60克湿细胞/升的完整细胞悬液；在30℃，pH 7.5条件下，以180转/分钟振荡14小时，使底物外消旋α-羟基丁酸钠、生物催化剂与氧气充分混合，得含D-α-羟基丁酸钠以及α-酮基丁酸钠的转化液；
经HPLC法检测，D-α-羟基丁酸钠的浓度为292毫摩尔/升，α-酮基丁酸的浓度为218毫摩尔/升，对映体过量率为57.4％。
(4)转化液预处理：以转化液体积量计，加入其0.8％体积量的1％壳聚糖溶液，搅拌絮凝1.5小时，以12,000转/分离心10分钟，得预处理转化液；
(5)预处理转化液的酸化：按常规方法将D152弱酸性阳离子树脂处理为H型，装入玻璃层析柱；以2柱体积/小时的流速过柱，收集流出液；用10摩尔/升的NaOH调节pH至3.45，HPLC法检测D-α-羟基丁酸的浓度为281毫摩尔/升，α-酮基丁酸的浓度为206毫摩尔/升；得酸化的预处理转化液；
(6)D-α-羟基丁酸和α-酮基丁酸的分离：按常规方法将335树脂处理成氯型，装入玻璃层析柱，以2柱体积/小时的流速上样30毫升；收集流出的含D-α-羟基丁酸的液体至上样结束，此为收集液A；上样结束后以2柱体积/小时的流速用去离子水淋洗，收集30毫升的流出液，此为收集液B；
(7)D-α-羟基丁酸的精制：合并收集液A、B，用1摩尔/升的NaOH调节pH至7，旋转蒸发在真空度0.090兆帕，温度55℃的条件下减压蒸馏浓缩得到样品，纯度为62.3％，纯化阶段D-α-羟基丁酸的回收率为62.5％。
实施例4：
(1)含NAD非依赖性L-羟酸脱氢酶的微生物完整细胞的制备：选取施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)ATCC 17588，常规培养，期间以高效液相色谱(HPLC)法检测细胞NAD非依赖性羟酸脱氢酶活力，至其活力达到140单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用pH 7.4磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含NAD非依赖性L-羟酸脱氢酶的完整细胞悬液，4℃储存备用；
(2)热变性使NAD非依赖性D-羟酸脱氢酶失活：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液置于55℃水浴中处理20分钟，4℃储存，备用；
(3)拆分外消旋α-羟基丁酸：将步骤(2)中制得的完整细胞悬液与外消旋α-羟基丁酸钠水溶液混合，并使混合物中α-羟基丁酸钠的浓度为300毫摩尔/升、完整细胞浓度为60克湿细胞/升；在30℃，pH 6.5条件下，以180转/分钟振荡24小时，使底物外消旋α-羟基丁酸钠、生物催化剂与氧气充分混合，得含D-α-羟基丁酸钠以及α-酮基丁酸钠的转化液；
经HPLC法检测，D-α-羟基丁酸钠的浓度为148毫摩尔/升，α-酮基丁酸的浓度为147毫摩尔/升，计算对映体过量率为98.1％。
(4)转化液预处理：以转化液体积量计，加入其0.5％体积量的1％壳聚糖溶液，搅拌絮凝1小时，以8000转/分离心20分钟，得预处理转化液；
(5)预处理转化液的酸化：按常规方法将122(II型)弱酸性阳离子交换树脂处理为H型，装入玻璃层析柱；以0.7柱体积/小时的流速过柱，收集流出液；用10摩尔/升的NaOH调节pH至4.53，HPLC法检测D-α-羟基丁酸的浓度为139毫摩尔/升，α-酮基丁酸的浓度为141毫摩尔/升；得酸化后的预处理转化液；
(6)D-α-羟基丁酸和α-酮基丁酸的分离：按常规方法将D301树脂处理成氯型，装入玻璃层析柱，以1柱体积/小时的流速上样50毫升；从开始流出D-α-羟基丁酸开始收集至上样结束，此为收集液A；上样结束后以1.5柱体积/小时的流速用去离子水淋洗，收集50毫升的流出液，此为收集液B；
(7)D-α-羟基丁酸的精制：合并收集液A、B，用1摩尔/升的NaOH调节pH至7，旋转蒸发在真空度0.075兆帕，温度60℃的条件下减压蒸馏浓缩得到样品，纯度为97.7％，纯化阶段D-α-羟基丁酸的回收率为71.6％。
实施例5：
(1)含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的微生物完整细胞的制备：选取铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 10145，常规培养，期间以高效液相色谱(HPLC)法检测细胞NAD非依赖性羟酸脱氢酶活力，至其活力达到170单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用pH 7.4磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液，4℃储存备用；
(2)热变性使NAD非依赖性D-羟酸脱氢酶失活：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液置于55℃水浴中处理20分钟，4℃储存，备用；
(3)拆分外消旋α-羟基丁酸：将步骤(2)中制得的完整细胞悬液与外消旋α-羟基丁酸钠水溶液混合，并使混合物中α-羟基丁酸钠的浓度为400毫摩尔/升、完整细胞浓度为80克湿细胞/升；在30℃，pH 7条件下，以180转/分钟振荡22小时，使底物外消旋α-羟基丁酸钠、生物催化剂与氧气充分混合，得含D-α-羟基丁酸钠以及α-酮基丁酸钠的转化液；
经HPLC法检测，D-α-羟基丁酸钠的浓度为197毫摩尔/升，α-酮基丁酸的浓度为200毫摩尔/升，计算对映体过量率为99.6％。
(4)转化液预处理：以转化液体积量计，加入其0.5％体积量的1％壳聚糖溶液，搅拌絮凝1小时，以10,000转/分离心10分钟，得预处理转化液；
(5)预处理转化液的酸化：按常规方法将732强酸性阳离子交换树脂处理为H型，装入玻璃层析柱；以1柱体积/小时的流速过柱，收集流出液；用10摩尔/升的NaOH调节pH至3.47，HPLC法检测D-α-羟基丁酸的浓度为188毫摩尔/升，α-酮基丁酸的浓度为192毫摩尔/升；得酸化的预处理转化液；
(6)D-α-羟基丁酸和α-酮基丁酸的分离：按常规方法将D301树脂处理成氯型，装入玻璃层析柱，以1柱体积/小时的流速上样40毫升；从开始流出D-α-羟基丁酸开始收集至上样结束，此为收集液A；上样结束后以1.0柱体积/小时的流速用去离子水淋洗，收集60毫升的流出液，此为收集液B；
(7)D-α-羟基丁酸的精制：合并收集液A、B，用1摩尔/升的NaOH调节pH至7，旋转蒸发在真空度0.080兆帕，温度60℃的条件下减压蒸馏浓缩得到样品，纯度为99.3％，纯化阶段D-α-羟基丁酸的回收率为76.8％。
本发明实施例中所述NAD非依赖性羟酸脱氢酶酶活单位U定义为：37℃，每分钟催化底物α-羟基丁酸钠转化生成1微摩尔α-酮基丁酸钠所需的酶量。
本发明实施例中所用菌株均为菌种目录中登载的市售菌株，公众均可购得。
本发明实施例中所述阳离子交换树脂或离子交换树脂均为市售产品(如蚌埠市天星树脂有限责任公司、安徽三星树脂科技有限公司)，公众均可购得。
Claims (8)
1.一种生产D-α-羟基丁酸的方法，步骤包括：(1)以假单胞菌制备含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液或其粗酶液；(2)热变性步骤(1)制备的完整细胞悬液或其粗酶液，使NAD非依赖性D-羟酸脱氢酶失活，得到仅含有NAD非依赖性L-羟酸脱氢酶活力的生物催化剂；(3)以步骤(2)制得到的生物催化剂拆分外消旋α-羟基丁酸，得含D-α-羟基丁酸钠和α-酮基丁酸钠的转化液；(4)转化液预处理；(5)预处理后的转化液酸化；(6)D-α-羟基丁酸和α-酮基丁酸的分离；(7)D-α-羟基丁酸精制；其特征在于：
步骤(1)所述假单胞菌选恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC 12633、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 10145或施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)ATCC17588；
步骤(2)所述热变性步骤(1)制备的完整细胞悬液或其粗酶液的方法是：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液或粗酶液置于45～65℃水浴中处理5～50分钟，得到仅含有NAD非依赖性L-羟酸脱氢酶活力的生物催化剂；
步骤(3)所述生物催化剂拆分外消旋α-羟基丁酸的方法是：以浓度为5～120克湿细胞/升的生物催化剂与浓度为100～800毫摩尔/升外消旋α-羟基丁酸钠水溶液混合，在5～40℃，pH 5.0～10.0条件下，以50～180转/分钟振荡5～30小时；
步骤(6)所述D-α-羟基丁酸和α-酮基丁酸的分离的方法是：将阴离子交换树脂D301树脂、330树脂、D345树脂或335树脂按通用方式处理成氯型，装入玻璃层析柱，然后将步骤(5)所述酸化后的转化液以0.5～3柱体积/小时的流速上样，收集流出的含D-α-羟基丁酸的液体至上样结束，得收集液A；上样结束后再以0.5～3柱体积/小时的流速用去离子水淋洗，收集1～4柱床体积的流出液，得收集液B；
步骤(7)所述D-α-羟基丁酸精制的方法是：合并步骤(6)所述收集液A和B，用1摩尔/升的NaOH调节pH至7，在真空度0.075～0.095兆帕，温度45～70℃的条件下减压蒸馏浓缩，得D-α-羟基丁酸钠。
2.如权利要求1所述生产D-α-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(2)所述热变性步骤(1)制备的完整细胞悬液或其粗酶液的热处理温度为50～60℃，热处理时间为10～30分钟。
3.如权利要求1所述生产D-α-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述生物催化剂以完整细胞悬液的细胞浓度计为20～80克湿细胞/升。
4.如权利要求1所述生产D-α-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述外消旋α-羟基丁酸钠的浓度为200～600毫摩尔/升。
5.如权利要求1所述生产D-α-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述温度为30～37℃，所述pH值为6.5～7.5，所述振荡转速为180转/分钟，震荡时间为14～24小时。
6.如权利要求1所述生产D-α-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(6)所述阴离子交换树脂是D301或330阴离子交换树脂。
7.如权利要求1所述生产D-α-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(6)所述上样流速为0.5～2柱体积/小时，上样体积为2～3倍柱体积，去离子水淋洗流速为1～2倍柱体积/小时，去离子水淋洗体积为2～4倍柱体积。
8.如权利要求1所述生产D-α-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(7)所述真空度为0.075～0.09兆帕，温度为55～65℃。
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