CN103074400A - 一种棕榈酸辅酶a的制备方法 - Google Patents
一种棕榈酸辅酶a的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种制备棕榈酸辅酶A的方法，该方法包括（1）克隆编码乙酰辅酶A合成酶的基因并将其转化到大肠杆菌细胞中进行表达，获得表达乙酰辅酶A合成酶的基因工程菌株；（2）将基因工程菌株种子接入发酵初始培养基进行初始培养；（3）初始培养结束后，加入诱导补料培养基进行诱导培养产生乙酰辅酶A合成酶；（4）诱导培养结束后加入SDS进行预转化培养；流加转化补料培养基继续进行转化培养，得到棕榈酸辅酶A。本发明使用乙酰辅酶A合成酶重组菌，在温和的条件下，利用生物体本身所能够产生的ATP、辅酶A等物质，转化生产高附加值的棕榈酰辅酶A，其成本远低于现有的制备棕榈酸辅酶A的酶转化方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶的制备方法,尤其涉及一种采用发酵方式制备棕榈酸辅酶A的方法,属于棕榈酸辅酶A的制备领域。
背景技术
棕榈酸辅酶A是棕榈酸与辅酶A合成的产物，可以用于生物化学等多重领域。现有的棕榈酸辅酶A的生产方法主要有化学合成法与酶转化法。化学合成法存在合成步骤多收率低等缺点，酶转化法需要用到辅酶A（CoA）、ATP，因为辅酶A（CoA）、ATP价格昂贵，故棕榈酸辅酶A的酶转化法的成本很高，有待改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有酶转化法制备棕榈酸辅酶A的所存在的成本高的缺陷，提供一种成本较低的制备棕榈酸辅酶A的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种制备棕榈酸辅酶A的方法，包括以下步骤：
（1）克隆编码乙酰辅酶A合成酶的基因并将其转化到大肠杆菌细胞中进行表达，获得表达乙酰辅酶A合成酶的基因工程菌株；
（2）将步骤（1）的基因工程菌株种子接入发酵初始培养基进行初始培养直至初始培养基中营养耗尽，溶氧上升至50%以上；
（3）初始培养结束后，加入诱导补料培养基进行诱导培养产生乙酰辅酶A合成酶；
（4）诱导培养结束后加入十二烷基磺酸钠(SDS)至其终浓度为0.05～0.15g/L，进行预转化培养；预转化培养完成后流加转化补料培养基继续进行转化培养，得到棕榈酸辅酶A。
其中，步骤（1）中从施氏假单胞菌（ATCC 17588）中克隆得到编码乙酰辅酶A合成酶的基因，将此基因在大肠杆菌BL21（DE3）进行表达，获得表达乙酰辅酶A合成酶的基因工程菌株；所述的编码乙酰辅酶A合成酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
步骤（2）中所述的发酵初始培养基组成包括：磷酸氢二铵6-12g/L、磷酸二氢钾3-6g/L、一水柠檬酸0.2-1g/L、硫酸镁 0.3-2 g/L、微量元素母液1-3ml/L、葡萄糖10-20g/L、硫酸卡那霉素50mg/L；2M硫酸与氨水做为酸碱调节pH值为6.5-7.3；
所述微量元素的母液的按照以下方法配制得到：（1）按以下用量称取各成分：10g FeSO4．7H2O，2.25g ZnSO4.7H2O，1g CuSO4.5H2O，0.5gMnSO4.5H2O, 0.23g Na2B4O7.10H2O，2g CaCl2.2H2O，0.1g(NH4)6Mo7O24；（2）将上述各成分溶于1L 5M盐酸中，即得。
步骤（3）中初始培养结束后降温至28℃，加入诱导补料培养基进行诱导培养产生乙酰辅酶A合成酶；
所述的诱导补料培养基的组成为：甘油200-400g/L 、乳糖70 -130g/L，硫酸铵100-200g/L；pH值为4.5。
步骤（3）中当菌液OD600的值为40-50，酶活为20KU/L时停止诱导培养转入转化培养阶段。
步骤（4）中所述的预转化培养的培养条件包括：通气量为0.5L/L发酵液/min，转速为200～300rpm，温度保持在28℃；使用2M硫酸和氢氧化钠调节pH值为6.1～6.3；
步骤（4）中预转化培养30min后开始流加转化补料培养基；
所述的转化补料培养基的组成成分包括：甘油50-150 g/L，棕榈酸钠100-300g/L；
所述的流加转化补料培养基的方式包括：流加速度初始时设定为1ml/h/L发酵液，1h后调整为3ml/h/L发酵液，1.5h后调整为5ml/h/L发酵液，2h后调整为7ml/h/L发酵液，保持此流速。
步骤（4）的补料过程中，通过调整通气量将溶解氧含量控制在30%左右。
本发明是利用基因工程手段从施氏假单胞菌（ATCC 17588）中克隆得到编码乙酰辅酶A合成酶的基因、构建基因工程菌株，通过菌体培养、乙酰辅酶A合成酶诱导、棕榈酸辅酶A转化三步实现棕榈酸辅酶A的高效表达，从而摒除了ATP与辅酶A的使用，降低了成本。本发明使用乙酰辅酶A合成酶重组菌，在比较温和的条件下，利用生物体本身所能够产生的ATP、辅酶A等物质（而不是额外添加），转化生产高附加值的棕榈酰辅酶A，其成本远低于现有的制备棕榈酸辅酶A的酶转化方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
一、乙酰辅酶A合成酶酶活测定方法
（1）酶活定义
1个酶活单位等于在以下反应条件下1分钟内转化1μmole棕榈酸所需要的酶量。
（2）试剂配制
试剂A的配制
配制0.05M，pH 7.5的磷酸钾缓冲液。
在800毫升去离子水中，加入11.34克HEPES，搅拌溶解，用氢氧化钠在25度下调节pH=7.9，加入0.526克甘油、0.228克苯酚、0.468克氯化镁、1克叠氮钠、6.24KU过氧化物酶搅拌溶解，用氢氧化钠调pH值到7.90（25℃），严格控制温度和pH。定容至1升。
试剂B的配制
在800ml试剂A中依次加入0.6053克ATP·Na2，0.2033克六水氯化镁，0.8216克辅酶A，调整pH7.5，用试剂A定容到1升。（可按比例配制，辅酶A不稳定，可现用现加）
试剂C的配制
在800ml水中加入50克Triton X-100和2mM的棕榈酸，加热使棕榈酸完全溶解，冷却到室温，用氢氧化钠调节pH至7.5（可按比例配制）
试剂D的配制
在800ml试剂A中依次加入0.1251克NEM（氮乙酰马来酰亚胺），0.505克4-氨基安替吡啉，8KU过氧化物酶，0.25克叠氮钠，调整pH7.5，用试剂A定容到1升。（可按比例配制）
试剂E的配制
在800ml水中加入20克苯酚。（可按比例配制）
试剂F的配制
ACS稀释液：在1L的pH7.5的10mM磷酸钾缓冲液中加入2mM ATP和1gTriton X-100。（可按比例配制）
试剂G的配制
ACOD稀释液：在1L的pH7.5的25mM磷酸钾缓冲液中加入0.02mM FAD和0.2g 牛血清蛋白。（可按比例配制）
试剂H的配制
用试剂G配制240KU/L的ACOD（乙酰辅酶A氧化酶）酶液。
（3）待测样品的配制
检测前用卧氏称量管称量所需酶，酶称量时，应至少称量10mg的酶，以保证称量的准确性。用酶稀释液（试剂F）溶解，定容到配制体积。
（4）酶活检测步骤
1、320μl试剂B与80μl试剂C在37℃保温1分钟。
2、加入20μl稀释好的ACS酶液，37℃反应10分钟。
3、加入800μl试剂E，37℃温浴两分钟；加入20μl试剂H，37℃反应5分钟。记录吸光值As。
4、重复第1、2、3步骤，用20μlACS稀释液代替20μl试剂ACS酶液。记录空白吸光值Ab。
注意：△A=As-Ab≤0.300
此法酶的最适线性为100-200 U /L。
（5）酶活力计算公式
二、棕榈酸辅酶A浓度的测定方法
（1）试剂配制
试剂A的配制
配制0.05M，pH 7.5的磷酸钾缓冲液。
在800毫升去离子水中，加入11.34克HEPES，搅拌溶解，用氢氧化钠在25度下调节pH=7.9，加入0.526克甘油、0.228克苯酚、0.468克氯化镁、1克叠氮钠、6.24KU过氧化物酶搅拌溶解，用氢氧化钠调pH值到7.90（25℃），严格控制温度和pH。定容至1升。
试剂B的配制
在800ml试剂A中依次加入0.1251克NEM（N-乙酰马来酰亚胺），0.505克4-氨基安替吡啉，8KU过氧化物酶，0.25克叠氮钠，调整pH7.5，用试剂A定容到1升。（可按比例配制）
试剂C的配制
在800ml水中加入20克苯酚。（可按比例配制）
试剂D的配制
ACOD稀释液：在1L的pH7.5的25mM磷酸钾缓冲液中加入0.02mM FAD和0.2g 牛血清蛋白。（可按比例配制）
试剂E的配制
用试剂G配制240KU/L的ACOD（乙酰辅酶A氧化酶）酶液。
（2）待测样品的稀释
使用去离子水将样品稀释至。
（3）酶活检测步骤
1、900μl试剂B、20μl试剂C与20μl试剂E在37℃保温5分钟。
2、加入20μl稀释好的样品，37℃反应10分钟，记录吸光值As。
3、重复第1、2、3步骤，用20μl去离子水代替20μl试剂样品。记录空白吸光值Ab。
注意：△A=As-Ab≤0.9
此法酶的最适线性为0-8mmol /L。
（4）样品浓度计算公式
实施例1 棕榈酸辅酶A的制备
1)实验菌种构建
① 基因来源菌株：施氏假单胞菌（ATCC 17588），从ATCC购买得到。
② 培养基
施氏假单胞菌培养的固体培养基：葡萄糖：2％，蛋白胨：1％，酵母膏：0.5％，琼脂：2％，121℃ 20min灭菌。
施氏假单胞菌培养的液体培养基:葡萄糖：2％，蛋白胨：1％，酵母膏：0.5％，121℃20min灭菌。
③ 活化
施氏假单胞菌活化在30℃培养箱中培养36小时，然后将菌落接种到YPD液体培养基中；30℃条件下培养24小时。
④ 基因组DNA的提取
挑取单菌落的施氏假单胞菌细胞，接种于5ml YPD培养基中30℃振荡培养过夜。将过夜培养物转移到1.5ml EP管中，10000rpm离心5min。弃上清。将细胞重悬于400μl的STES溶液中，加入100ul（与细胞体积相当即可）酸洗玻璃珠，每管加入400ul TE和400ul 酚/氯仿。冰浴，剧烈振动5×30s。离心10min，将上清转移到新的EP管中。加0.6倍体积异丙醇或2倍体积乙醇，颠倒混匀，室温放置10min。10000rpm离心10min，弃上清。加入500μl 75％乙醇，涡旋，10000rpm离心2min，弃上清。将沉淀在空气中干燥10min，加入50μl TE 溶解。加1μl的10mg/ml的RNase，37℃下消化30min。琼脂糖电泳检测DNA浓度。
⑤ 表达载体的构建
设计引物克隆乙酰辅酶A合成酶基因
ACSF: ATCGCATATGACCGATAACTTCTGGAAGG；引物上附加有NdeI酶切位点。
ACSR：ATCGCTCGAGTTACTTCTTGTGGCCCAGC；引物上附加有XhoI酶切位点。
PCR扩增条件为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2 mM MgSO4、0.1%Triton X-100、50μM dATP、50μM dGTP、50μM dTTP、50μM dCTP、400 nM引物ACSF、400nM引物ACSR、1.5U Pfu DNA聚合酶（Promega，USA），20ng基因组DNA加入反应体系，用无菌水调至反应体积达50μL。
扩增反应程序为：将上述反应体系在95℃下反应5分钟，然后进行30个循环的“95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 2分钟”，最后在72℃下保持10分钟。将得到的PCR扩增基因产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，并用QIAGEN快速提取凝胶试剂盒回收1700bp左右单一条带的DNA片段。
将得到的乙酰辅酶A合成酶基因（SEQ ID No.1）经NdeI和XhoI双酶切4h，与同样经NdeI和XhoI双酶切4h的pET28b载体连接。构建成为乙酰辅酶A合成酶表达载体。
将此表达载体转化至BL21（DE3）细胞中获得乙酰辅酶A合成酶基因工程菌株。
2)发酵及转化培养基
（1）平板培养基
胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L，121℃20min灭菌, 灭菌冷却后加入硫酸卡那霉素至终浓度50mg/L。
（2）种子培养基
胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，121℃20min灭菌，灭菌冷却后加入硫酸卡那霉素至终浓度50mg/L。
（3）发酵初始培养基（5L罐，3L培养基）
磷酸氢二铵8g/L、磷酸二氢钾4g/L、一水柠檬酸0.6g/L、硫酸镁1.2g/L、微量元素母液2ml/L，用氨水调pH至7.0，121℃灭菌20分钟。接种前加入灭菌的葡萄糖至终浓度15g/L，使用氨水调pH至7.1。加入硫酸卡那霉素至终浓度50mg/L。
微量元素的配方为：10g FeSO4.7H2O，2.25g ZnSO4.7H2O，1g CuSO4.5H2O，0.5gMnSO4.5H2O,0.23g Na2B4O7.10H2O，2g CaCl2.2H2O，0.1g (NH4)6Mo7O24，溶于1L 5M盐酸中。
（4）诱导补料培养基：
甘油300g/L 、乳糖100g/L，硫酸铵150g/L，共三瓶，每瓶100ml，调pH至4.5，121℃灭菌20min。
（5）转化补料培养基2：
甘油100 g/L，棕榈酸钠 200g/L，116℃灭菌20min。
3）发酵及转化工艺
(1)平板培养
取甘油菌在平板培养基上划线，37℃培养8h至长出单菌落。
(2)种子培养
挑取单菌落接入20ml种子培养基， 37℃培养8h，至菌浓度OD600>2。按照1/10的比例接入二级种子培养基（300ml），37℃培养至菌浓度OD600>2。
(3)发酵初始培养
按照1/5的比例将种子接入发酵初始培养基，于37℃溶氧大于20%的条件下自然生长，使用氨水、硫酸调节pH7.3，直至初始培养基中营养耗尽，溶氧快速上升至50%以上，此时菌浓度OD600为16。
(4)诱导补料培养
初始培养结束后，降温至28℃，加入一瓶诱导培养基，转速800rpm发酵，使用氨水、硫酸调节pH至7.3。当溶氧上升至50%时，再加入一瓶诱导补料培养基，继续诱导。当溶氧再次升至50%时取样测定菌浓（OD600），破菌、测定酶活。此时OD为45，酶活为20KU/L。如果不足，再次加入一瓶诱导补料培养基，继续发酵，如果达到此标准则进入转化阶段。
(5)转化补料培养
当诱导酶活达到要求后加入SDS至终浓度为0.15g/L，通气量降至0.5L/L发酵液/min，转速降至300rpm，温度保持在28℃。使用硫酸、氢氧化钠调pH至6.3。
30min后开始流加转化补料培养基。流加速度初始时设定为1ml/h/L发酵液，1h后调整为3ml/h/L发酵液，1.5h后调整为5ml/h/L发酵液，2h后调整为7ml/h/L发酵液，保持此流速。补料过程中，通过调整通气量将溶解氧含量控制在30%左右（断电标定溶氧0%，500rpm, 1L/L发酵液/min的通气量500rpm下标定溶氧100%）。
开始流加转化补料培养基8h后开始测定发酵液中棕榈酸辅酶A的含量为9g/L，酶活为25000 U /L(25KU/L)。
实施例2 棕榈酸辅酶A的制备
1）实验菌种构建
① 基因来源菌株：施氏假单胞菌（ATCC 17588），从ATCC购买得到。
② 培养基
施氏假单胞菌培养的固体培养基：葡萄糖：2％，蛋白胨：1％，酵母膏：0.5％，琼脂：2％，121℃ 20min灭菌。
施氏假单胞菌培养的液体培养基:葡萄糖：2％，蛋白胨：1％，酵母膏：0.5％，121℃20min灭菌。
③ 活化
施氏假单胞菌活化在30℃培养箱中培养36小时，然后将菌落接种到YPD液体培养基中；30℃条件下培养24小时。
④ 基因组DNA的提取
挑取单菌落的施氏假单胞菌细胞，接种于5ml YPD培养基中30℃振荡培养过夜。将过夜培养物转移到1.5ml EP管中，10000rpm离心5min。弃上清。将细胞重悬于400μl的STES溶液中，加入100ul（与细胞体积相当即可）酸洗玻璃珠，每管加入400ul TE和400ul 酚/氯仿。冰浴，剧烈振动5×30s。离心10min，将上清转移到新的EP管中。加0.6倍体积异丙醇或2倍体积乙醇，颠倒混匀，室温放置10min。10000rpm离心10min，弃上清。加入500μl 75％乙醇，涡旋，10000rpm离心2min，弃上清。将沉淀在空气中干燥10min，加入50μl TE 溶解。加1μl的10mg/ml的RNase，37℃下消化30min。琼脂糖电泳检测DNA浓度。
⑤ 表达载体的构建
设计引物克隆乙酰辅酶A合成酶基因
ACSF: ATCGCATATGACCGATAACTTCTGGAAGG；引物上附加有NdeI酶切位点。
ACSR：ATCGCTCGAGTTACTTCTTGTGGCCCAGC；引物上附加有XhoI酶切位点。
PCR扩增条件为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2 mM MgSO4、0.1%Triton X-100、50μM dATP、50μM dGTP、50μM dTTP、50μM dCTP、400 nM引物ACSF、400nM引物ACSR、1.5U Pfu DNA聚合酶（Promega，USA），20ng基因组DNA加入反应体系，用无菌水调至反应体积达50μL。
扩增反应程序为：将上述反应体系在95℃下反应5分钟，然后进行30个循环的“95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 2分钟”，最后在72℃下保持10分钟。将得到的PCR扩增基因产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，并用QIAGEN快速提取凝胶试剂盒回收1700bp左右单一条带的DNA片段。
将得到的乙酰辅酶A合成酶基因（SEQ ID No.1）经NdeI和XhoI双酶切4h，与同样经NdeI和XhoI双酶切4h的pET28b载体连接。构建成为乙酰辅酶A合成酶表达载体。
将此表达载体转化至BL21（DE3）细胞中获得乙酰辅酶A合成酶基因工程菌株。
2)发酵及转化培养基
（1）平板培养基
胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L，121℃20min灭菌, 灭菌冷却后加入硫酸卡那霉素至终浓度50mg/L。
（2）种子培养基
胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，121℃20min灭菌，灭菌冷却后加入硫酸卡那霉素至终浓度50mg/L。
（3）发酵初始培养基（5L罐，3L培养基）
磷酸氢二铵10g/L、磷酸二氢钾5g/L、一水柠檬酸1.5g/L、硫酸镁 1.6 g/L、微量元素母液2.5ml/L，用氨水调pH至7.0，121℃灭菌20分钟。接种前加入灭菌的葡萄糖至终浓度15g/L，使用氨水调pH至7.0。加入硫酸卡那霉素至终浓度50mg/L。
微量元素的配方为：10g FeSO4.7H2O，2.25g ZnSO4.7H2O，1g CuSO4.5H2O，0.5gMnSO4.5H2O,0.23g Na2B4O7.10H2O，2g CaCl2.2H2O，0.1g (NH4)6Mo7O24，溶于1L 5M盐酸中。
（4）诱导补料培养基：
甘油240g/L 、乳糖80g/L，硫酸铵120 g/L，共三瓶，每瓶100ml，调pH至4.5，121℃灭菌20min。
（5）转化补料培养基2：
甘油80 g/L，棕榈酸钠160g/L，116℃灭菌20min。
3）发酵及转化工艺
(1)平板培养
取甘油菌在平板培养基上划线，37℃培养8h至长出单菌落。
(2)种子培养
挑取单菌落接入20ml种子培养基，30℃培养16h，至菌浓度OD600>2。按照1/1000的比例接入二级种子培养基（300ml），30℃培养至菌浓度OD600>2。
(3)发酵初始培养
按照1/20的比例将种子接入发酵初始培养基，于37℃溶氧大于20%的条件下自然生长，使用氨水、硫酸调节pH6.5，直至初始培养基中营养耗尽，溶氧快速上升至50%以上，此时菌浓度OD600为15。
(4)诱导补料培养
初始培养结束后，降温至28℃，加入一瓶诱导培养基，转速300rpm发酵，使用氨水、硫酸调节pH至6.5。当溶氧上升至50%时，再加入一瓶诱导补料培养基，继续诱导。当溶氧再次升至50%时取样测定菌浓（OD600），破菌、测定酶活。此时OD为43，酶活约为18KU/L。如果不足，再次加入一瓶诱导补料培养基，继续发酵，如果达到此标准则进入转化阶段。
(5)转化补料培养
当诱导酶活达到要求后加入SDS至终浓度为0.05g/L，通气量降至0.5L/L发酵液/min，转速降至200rpm，温度保持在28℃。使用硫酸、氢氧化钠调pH至6.1。
30min后开始流加转化补料培养基。流加速度初始时设定为1ml/h/L发酵液，1h后调整为3ml/h/L发酵液，1.5h后调整为5ml/h/L发酵液，2h后调整为7ml/h/L发酵液，保持此流速。补料过程中，通过调整通气量将溶解氧含量控制在30%左右（断电标定溶氧0%，500rpm, 1L/L发酵液/min的通气量500rpm下标定溶氧100%）。
开始流加转化补料培养基8h后开始测定发酵液中棕榈酸辅酶A的含量为8.6g/L，酶活为22000 U /L(22KU/L)。
实施例3 棕榈酸辅酶A的制备
1）实验菌种构建
① 基因来源菌株：施氏假单胞菌（ATCC 17588），从ATCC购买得到。
② 培养基
施氏假单胞菌培养的固体培养基：葡萄糖：2％，蛋白胨：1％，酵母膏：0.5％，琼脂：2％，121℃ 20min灭菌。
施氏假单胞菌培养的液体培养基:葡萄糖：2％，蛋白胨：1％，酵母膏：0.5％，121℃ 20min灭菌。
③ 活化
施氏假单胞菌活化在30℃培养箱中培养36小时，然后将菌落接种到YPD液体培养基中；30℃条件下培养24小时。
④ 基因组DNA的提取
挑取单菌落的施氏假单胞菌细胞，接种于5ml YPD培养基中30℃振荡培养过夜。将过夜培养物转移到1.5ml EP管中，10000rpm离心5min。弃上清。将细胞重悬于400μl的STES溶液中，加入100ul（与细胞体积相当即可）酸洗玻璃珠，每管加入400ul TE和400ul 酚/氯仿。冰浴，剧烈振动5×30s。离心10min，将上清转移到新的EP管中。加0.6倍体积异丙醇或2倍体积乙醇，颠倒混匀，室温放置10min。10000rpm离心10min，弃上清。加入500μl 75％乙醇，涡旋，10000rpm离心2min，弃上清。将沉淀在空气中干燥10min，加入50μl TE 溶解。加1μl的10mg/ml的RNase，37℃下消化30min。琼脂糖电泳检测DNA浓度。
⑤ 表达载体的构建
设计引物克隆乙酰辅酶A合成酶基因
ACSF: ATCGCATATGACCGATAACTTCTGGAAGG；引物上附加有NdeI酶切位点。
ACSR：ATCGCTCGAGTTACTTCTTGTGGCCCAGC；引物上附加有XhoI酶切位点。
PCR扩增条件为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2 mM MgSO4、0.1%Triton X-100、50μM dATP、50μM dGTP、50μM dTTP、50μM dCTP、400 nM引物ACSF、400nM引物ACSR、1.5U Pfu DNA聚合酶（Promega，USA），20ng基因组DNA加入反应体系，用无菌水调至反应体积达50μL。
扩增反应程序为：将上述反应体系在95℃下反应5分钟，然后进行30个循环的“95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 2分钟”，最后在72℃下保持10分钟。将得到的PCR扩增基因产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，并用QIAGEN快速提取凝胶试剂盒回收1700bp左右单一条带的DNA片段。
将得到的乙酰辅酶A合成酶基因（SEQ ID No.1）经NdeI和XhoI双酶切4h，与同样经NdeI和XhoI双酶切4h的pET28b载体连接。构建成为乙酰辅酶A合成酶表达载体。
将此表达载体转化至BL21（DE3）细胞中获得乙酰辅酶A合成酶基因工程菌株。
2)发酵及转化培养基
（1）平板培养基
胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L，121℃20min灭菌, 灭菌冷却后加入硫酸卡那霉素至终浓度50mg/L。
（2）种子培养基
胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，121℃20min灭菌，灭菌冷却后加入硫酸卡那霉素至终浓度50mg/L。
（3）发酵初始培养基（5L罐，3L培养基）
磷酸氢二铵10g/L、磷酸二氢钾5g/L、一水柠檬酸1.5g/L、硫酸镁1.6g/L、微量元素母液2.5ml/L，用氨水调pH至7.0，121℃灭菌20分钟。接种前加入灭菌的葡萄糖至终浓度20g/L，使用氨水调pH至7.0。加入硫酸卡那霉素至终浓度50mg/L。
微量元素的配方为：10g FeSO4.7H2O，2.25g ZnSO4.7H2O，1g CuSO4.5H2O，0.5gMnSO4.5H2O,0.23g Na2B4O7.10H2O，2g CaCl2.2H2O，0.1g (NH4)6Mo7O24，溶于1L 5M盐酸中。
（4）诱导补料培养基：
甘油350g/L 、乳糖115 g/L，硫酸铵175g/L，共三瓶，每瓶100ml，调pH至4.5，121℃灭菌20min。
（5）转化补料培养基：
甘油125g/L，棕榈酸钠250g/L，116℃灭菌20min。
3）发酵及转化工艺
(1)平板培养
取甘油菌在平板培养基上划线，37℃培养8h至长出单菌落。
(2)种子培养
挑取单菌落接入20ml种子培养基，35℃培养12h，至菌浓度OD600>2。按照1/100的比例接入二级种子培养基（300ml），35℃培养至菌浓度OD600>2。
(3)发酵初始培养
按照1/15的比例将种子接入发酵初始培养基，于37℃溶氧大于20%的条件下自然生长，使用氨水、硫酸调节pH7.0，直至初始培养基中营养耗尽，溶氧快速上升至50%以上，此时菌浓度OD600约为17。
(4)诱导补料培养
初始培养结束后，降温至28℃，加入一瓶诱导培养基，转速500rpm发酵，使用氨水、硫酸调节pH至7.0。当溶氧上升至50%时，再加入一瓶诱导补料培养基，继续诱导。当溶氧再次升至50%时取样测定菌浓（OD600），破菌、测定酶活。此时OD约为47，酶活约为22KU/L。如果不足，再次加入一瓶诱导补料培养基，继续发酵，如果达到此标准则进入转化阶段。
(5)转化补料培养
当诱导酶活达到要求后加入转化补料培养基1至SDS含量为0.10g/L，通气量降至0.5L/L发酵液/min，转速降至250rpm，温度保持在28℃。使用硫酸、氢氧化钠调pH至6.2。
30min后开始流加转化补料培养基。流加速度初始时设定为1ml/h/L发酵液，1h后调整为3ml/h/L发酵液，1.5h后调整为5ml/h/L发酵液，2h后调整为7ml/h/L发酵液，保持此流速。补料过程中，通过调整通气量将溶解氧含量控制在30%左右（断电标定溶氧0%，500rpm, 1L/L发酵液/min的通气量500rpm下标定溶氧100%）。
开始流加转化补料培养基8h后开始测定发酵液中棕榈酸辅酶A的含量为9.5g/L，酶活为28000 U /L(28KU/L)。
Claims (10)
1.一种制备棕榈酸辅酶A的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）克隆编码乙酰辅酶A合成酶的基因并将其转化到大肠杆菌细胞中进行表达，获得表达乙酰辅酶A合成酶的基因工程菌株；
（2）将步骤（1）的基因工程菌株种子接入发酵初始培养基进行初始培养；
（3）初始培养结束后，加入诱导补料培养基进行诱导培养产生乙酰辅酶A合成酶；
（4）诱导培养结束后加入十二烷基磺酸钠至其终浓度为0.05～0.15g/L进行预转化培养；预转化培养完成后流加转化补料培养基继续进行转化培养，得到棕榈酸辅酶A。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的编码乙酰辅酶A合成酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的发酵初始培养基组成包括：磷酸氢二铵6-12g/L、磷酸二氢钾3-6g/L、一水柠檬酸0.2-1g/L、硫酸镁 0.3-2 g/L、微量元素母液1-3ml/L、葡萄糖10-20g/L、硫酸卡那霉素50mg/L；pH值为6.5-7.3;
所述微量元素的母液的按照以下方法配制得到：
（1）按以下用量称取各成分：10g FeSO4．7H2O，2.25g ZnSO4.7H2O，1g CuSO4.5H2O，0.5gMnSO4.5H2O, 0.23g Na2B4O7.10H2O，2g CaCl2.2H2O，0.1g (NH4)6Mo7O24；（2）将上述各成分溶于1L 5M盐酸中，即得。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中初始培养结束后降温至28℃，加入诱导补料培养基进行诱导培养产生乙酰辅酶A合成酶；当菌液OD600的值为40-50，酶活为20KU/L时停止诱导培养转入转化培养阶段。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的诱导补料培养基的组成为：甘油200-400g/L 、乳糖70 -130g/L，硫酸铵100-200g/L；pH值为4.5。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的预转化培养的培养条件包括：通气量为0.5L/L发酵液/min，转速为200～300rpm，温度保持在28℃；pH值为6.1～6.3。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中预转化培养30min后开始流加转化补料培养基。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的转化补料培养基的组成成分包括：甘油50-150 g/L，棕榈酸钠 100-300g/L。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的流加转化补料培养基的方式包括：流加速度初始时设定为1ml/h/L发酵液，1h后调整为3ml/h/L发酵液，1.5h后调整为5ml/h/L发酵液，2h后调整为7ml/h/L发酵液，保持7ml/h/L的流速。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）的补料过程中，通过调整通气量将溶解氧含量控制在30%左右。
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