CN104726477B - 一种脂肪酶编码基因及其工程菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种脂肪酶编码基因及其工程菌株，所述基因序列如SEQ ID NO：1所示，所述菌株含有表达所述脂肪酶的质粒，所述菌株为巴斯德毕赤酵母（CGMCC NO.8569），该菌株表达得到的脂肪酶，在5升发酵罐的发酵活力达到299U/mL，最适催化温度为45℃，最适pH值为8.2，该脂肪酶为油脂精深加工、生物能源、生物医药等方面工业脂肪酶源的开发提供条件。

Description

一种脂肪酶编码基因及其工程菌株

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地涉及一种脂肪酶编码基因及其工程菌株。

背景技术

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)即三酰基甘油水解酶，能够在油水界面发挥活性，可催化水解、酯化、酯交换、酸解、醇解、氨解等多种反应。脂肪酶来源十分广泛，动物、植物和微生物都可产生脂肪酶。其中微生物脂肪酶产量最高，基因操作简单，相对于动植物脂肪酶更加稳定。而且微生物脂肪酶以其酶活力高、选择性强和底物广泛等优点在工业应用中得到极大地推广。

脂肪酶作为生物催化剂可催化由不同底物出发的水解和合成反应，且反应不需要辅酶，反应条件温和，副产物少。因此，脂肪酶的应用十分广泛，如食品工业、医药卫生、化学化工、环境保护、能源开发等领域，已成为在生物技术和有机合成方面应用最广泛的一类酶。

随着细胞工程、基因工程、固定化酶技术以及界面酶促反应等技术的快速发展，对脂肪酶的研究进一步深入，特别是对产脂肪酶的菌株进行诱变育种及分子改造等方面取得了长足进展。然而，脂肪酶在应用中需要克服几个瓶颈：酶成本高、活性低、稳定性低和低反应产率。因此，为了进一步提高脂肪酶在工业领域中的应用，筛选和开发出具有新型催化活性和高稳定性的微生物脂肪酶将成为脂肪酶研究的热点和重点，新型脂肪酶的深入开发研究可以采取新的生物技术手段来实现，本试验根据巴斯德毕赤酵母密码子偏好性，优化白地霉脂肪酶的基因序列，以期获得高活性、高产量、高稳定性的脂肪酶，从而为油脂精深加工、生物能源、生物医药等方面工业脂肪酶源的开发提供条件。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种脂肪酶编码基因。

本发明还有一个目的在于，提供所述脂肪酶基因编码的脂肪酶。

本发明还有一个目的在于，提供一种转化有所述脂肪酶编码基因的工程菌株。

本发明提供的脂肪酶编码基因，所述基因序列如SEQ ID NO：1所示，具体地根据巴斯德毕赤酵母密码子偏好性，重新设计白地霉脂肪酶基因，以高使用频率的密码子替代低使用频率密码子，保持成熟蛋白的氨基酸序列不变。

本发明的脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的工程菌株转化有所述脂肪酶编码基因，工程菌为巴斯德毕赤酵母；具体地，通过将所述脂肪酶编码基因构建重组表达质粒，然后转化巴斯德毕赤酵母而获得。

一种工程菌株，含有上述脂肪酶的质粒。

所述工程菌株为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），该菌株已于2013年12月12日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.8569。

所述工程菌株应用于工业化生产脂肪酶中。

本发明通过基因工程技术，利用白地霉（Geotrichum candidum）的脂肪酶基因序列（GenBank:JX074060.11，如SEQ ID NO：3）和巴斯德毕赤酵母密码子偏好性，合成了脂肪酶编码基因，并将其转入巴斯德毕赤酵母中，从而能获得高活性、高产量、高稳定性的脂肪酶。5升发酵罐的发酵活力达到299U/mL，该脂肪酶的最适催化温度为45℃，最适pH值为8.2，为油脂精深加工、生物能源、生物医药等方面工业脂肪酶源的开发提供条件。

附图说明

图1脂肪酶的最适pH值分析图；

图2脂肪酶的最适催化温度分析图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1、白地霉脂肪酶基因克隆与序列分析

白地霉（Geotrichum candidum）由本实验室保存。接种至YPD液体培养基，28℃振荡培养过夜，12000rpm离心收集菌体。用总DNA提取试剂盒提取总DNA。根据GenBank报道的脂肪酶酶基因序列设计引物（Lip-F：5’–CGGAATTCCAGGCCCCCACGGCCGTT-3’和Lip-R：5’–GCTCTAGATTAACCGTAGAGATTAAGG-3’)。以白地霉总DNA为模板，PCR扩增lipase基因序列，扩增条件为：95℃3min，40个循环（94℃30s，58℃30s，72℃1min），最后70℃延伸5min。PCR产物经过序列测定后，序列用DNAMAN4.0软件分析。

实施例2、脂肪酶基因序列优化设计

根据巴斯德毕赤酵母密码子偏好性，重新设计白地霉脂肪酶基因，以高使用频率的密码子替代低使用频率密码子，保持成熟蛋白的氨基酸序列不变。设计好的序列由北京擎科生物技术有限公司进行全合成。为了方便克隆，在序列的5’、3’末端分别设计EcoRI和XbaI酶切位点。

实施例3、巴斯德毕赤酵母表达载体的构建和转化

用限制性内切EcoRI和XbaI对实施例2合成的基因进行双酶切后，将其连入经相同酶切的载体pPICZαA（Invitrogen，USA）中α因子序列的下游，将连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，用含有25μg/mL抗生素Zeocin的LB抗性平板筛选出阳性克隆，提取质粒，获得脂肪酶的巴斯德毕赤酵母表达载体，命名为X-33／pPIC-lip-opt。

取10μL巴斯德毕赤酵母表达载体X-33／pPIC-lip-opt，将其用限制性内切酶Sac I在37℃下酶切24h。加入80μL巴斯德毕赤酵母X-33感受态细胞，混匀，置于0.2cm电击杯中，冰浴5min，在2000伏电压（25μF）条件下电击，迅速加入1mL1mol/L山梨醇，置于28℃静止培养2h。然后将培养物涂布于含抗生素Zeocin（100μg/mL）的YPDS（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂，其余为水）平板上，在28℃下培养3-4d，直至长出清晰的菌落。

实施例4、高效分泌表达脂肪酶巴斯德毕赤酵母工程菌株的筛选

挑取阳性重组子，将其接种于含30mL BMGY（1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％biotin，1％甘油，100mM pH6.0磷酸盐缓冲液，其余为水）培养基的250mL摇瓶中，于28℃、250-300rpm培养至OD600为2-6，然后室温下离心收集菌体，用BMMY（1%酵母提取物，2%蛋白胨，0.1mol/L磷酸缓冲液pH6.0,1.34%YNB,4×10-5%生物素）重悬菌体，使OD600为1.0，再用终浓度为0.5％（V/V）的甲醇为唯一碳源进行诱导培养。结果筛到1株酶活较高的重组菌，命名为X-33／pPIC-lip-opt。

橄榄油乳化液底物5ml和Tris-HCl4ml缓冲液溶液混合于40℃预热5min，然后再吸取适当稀释的酶液和煮沸的酶液各1ml加入底物中充分混合，于40℃恒温水浴10min加入15ml无水乙醇溶液,振荡混匀，终止酶反应。于空白和样品溶液中各加酚酞指示剂两滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不褪色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。酶活定义：在一定温度和pH条件下，每分钟内底物降解释放1μmol的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位（U）。

实施例5、脂肪酶巴斯德毕赤酵母工程菌株在5L发酵罐中的发酵

挑取实施例4获得的重组巴斯德毕赤酵母菌株X-33／pPIC-lip-opt，将其接种于装有200mL BMGY培养基的3L摇瓶中，在28-30℃、250rpm下振摇12-24h，得到OD600约为3.0的种子液。然后配制2L BMGY培养基，装入5L自动控制发酵罐中，在121℃下灭菌后，冷却至28.5℃，加入上述种子液，用氨水和磷酸调节pH至5.0，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于30％。经测定，接入种子液30h后，甘油消耗完全（溶氧标记为100％），进入流加50％（W/V）甘油阶段，流速为60mL/h。流加4h后，甘油消耗完全（溶氧标记为100％），进入甲醇流加阶段，流速为12mL/h，同时控制溶氧为20％以上（如不能使溶氧保持在20％以上，停止添加甲醇，直至溶氧回升）。3h后，将甲醇流速调到24mL/h，再过2h，将流速调到30mL/h，并保持到发酵最后，同时，分别于诱导表达96h后收集发酵液，测酶活。酶活分析结果表明，诱导到第108h发酵活力达到299U/mL。

实施例6：本试验说明脂肪酶酶学性质分析程序

（1）最适pH值

最适pH值的确定：分别用pH值为2.2、3.2、4.2、5.2、6.2、7.2、8.2、9.2、10.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液及Tris-HCl配制底物，于40℃反应温度下测定酶活力，确定该酶的最适pH值（参见图1）。

（2）最适温度

最适温度的确定：用40mM Tris-HCl缓冲液配制橄榄油乳化液底物，分别在30-60℃测定酶活力，确定其最适反应温度（参见图2）。

Claims (2)

1.一种工程菌株，其特征在于，所述菌株含有表达如SEQ ID NO：1所示序列脂肪酶编码基因的质粒，所述菌株为巴斯德毕赤酵母，保藏编号为CGMCC NO.8569，保藏日期为2013年12月12日。

2.根据权利要求1所述的工程菌株在工业化生产脂肪酶中的应用。