CN105132301B - 一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母及其应用，有效解决现有甲醇蛋白生产中存在的产品单一，发酵工艺陈旧，成本高而效益低的难题，一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母，分类命名为巴斯德毕赤酵母zfwx‑208菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2013518，保藏日期为：2013年10月30日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心；本发明通过脂肪酶与甲醇蛋白联合发酵生产，实现了装置多用，降低了生产成本，提高了生产效益，并且简化了生产工艺，降低原料消耗，节约能源使用，减轻环境污染。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别是一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母及其应用。
背景技术
脂肪酶是一类主要水解由甘油和水不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯的酯键水解酶，广泛应用于食品加工、新型生物材料、生物医学、手性药物拆分等领域。在焙烤食品中应用脂肪酶具有强筋、改善面团结构纹理及面包品质的作用。脂肪酶的乳脂水解作用可改善乳品品质，可于增强奶酪和奶粉风味、奶酪熟化、奶油及冰淇淋的酯解改性等；脂肪酶在药业中主要用于助消化、降血脂，亦可用于临床诊断脂血病、胰腺炎等疾病。
甲醇蛋白是以工业甲醇为原料生产的单细胞蛋白，被称为第二代单细胞蛋白。它是通过微生物以甲醇为主要营养源进行生长、繁殖而得到的菌体蛋白。与天然蛋白相比，单细胞甲醇蛋白的粗蛋白含量比鱼粉和大豆都要高，含有丰富的必需氨基酸、矿物质和维生素，营养价值极高，可用于部分代替鱼粉、大豆、骨粉、肉类和脱脂奶粉而应用于畜禽饲料或其他化工领域。相对于其他方法生产的单细胞蛋白来讲，甲醇蛋白具有资源丰富、生产不受气候条件影响、合成速度快、质量稳定等特点。
我国蛋白饲料供需缺口每年达几千万吨，随着人民生活水平的提高及养殖业的发展，饲料蛋白的供需矛盾进一步加剧。单细胞甲醇蛋白中的粗蛋白含量比鱼粉和大豆都要高，含有丰富的必需氨基酸、矿物质和维生素，营养价值极高，是一个十分重要且具有发展前景的产品。而目前的甲醇蛋白生产中存在的产品单一，发酵工艺陈旧，成本高而效益低的难题；脂肪酶作为生物酶制剂，反应条件温和，催化效率高，被广泛用于食品、发酵、制革、医药、日化、饲料等工业，两者如能同时生产，不但简化了生产工艺，还可以降低原料消耗，节约能源使用，减轻环境污染，但是，目前尚未见同时联合发酵生产脂肪酶与甲醇蛋白的有关报道。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的就是提供一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母及其应用，可有效解决现有甲醇蛋白生产中存在的产品单一，发酵工艺陈旧，成本高而效益低的难题。
本发明解决的技术方案是，一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母，分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）zfwx-208 菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2013518，保藏日期为：2013 年10 月30 日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心；
一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母的应用，具体步骤如下：
（1）一级种子的培养：取试管斜面保藏的菌株zfwx-208（即巴斯德毕赤酵母zfwx-208菌株），接入至一级种子培养基上，在30℃摇床中振荡培养22-26 小时，摇床转速为200-300rpm，获得一级摇瓶种子；
（2）二级种子的培养：每升无机盐培养基中加入4mL 的微量元素溶液后，再调整pH值到5.0，将一级摇瓶种子接种到加入微量元素溶液后的无机盐培养基上，在30-32℃，pH5.0，通气量0.5-1.2 v/(v×min)（每分钟气液比），搅拌转速400-650rpm，培养时间22-26h ；
（3）高密度发酵：
A、在发酵罐中装入发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为7500 ：1，对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌30 分钟，灭菌结束后，对发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当发酵培养基温度降至35℃时，向发酵罐中补加微量元素溶液，并调pH 至5.0，微量元素溶液和发酵培养基的体积比为1 ：25 ；所述的发酵培养基为无机盐培养基；
B、将培养好的二级种子接入到A 步骤发酵罐中的发酵培养基上，在温度30-32℃，通气量为0.6 ～ 0.8 v/(v×min)，搅拌转速为60-80rpm 的条件下进行培养，每隔4 小时取样测定发酵液中菌体湿重，当湿重达到60g/L 以上后，通气量加大至1.0 ～ 1.5 v/(v×min)，搅拌转速提高到85-100rpm，保持发酵液pH5.0，16-20 小时后，开始以20-30Kg/h 的速度流加甘油，当发酵液中菌体湿重达到140g/L 时，停止甘油流加，当甘油利用完后，发酵罐上溶氧电极显示溶氧上升，开始流加甲醇，发酵液中甲醇体积浓度控制在0.8% ～ 1.2%，同时开大发酵罐进气阀门，保证发酵液中溶氧达到30% 以上（以搅拌转速为100rpm，进气量为2m3/min 定义为溶氧100%）；
（4）诱导产酶：甲醇流加24-30h 后，降低发酵温度至25℃，降低发酵液pH 至4.0-4.5，每隔3-4 小时流加发酵液体积的0.5-0.6‰的微量元素溶液，当发酵液中菌体湿重达到400-450g/L 时，酶活性达到20000U/mL 且不再增长（其中，不再增长的判断标准是，当酶活性比前一次酶活性增长量低于5% 时，即为不再增长），收集发酵液；
（5）酶的提取：
a、利用蝶片离心机对上述（4）步骤收集的发酵液进行分离，蝶片离心机转速12000rpm，进液量500L/h，分别收集轻相（即上清液，又称酶液）和重相（即单细胞甲醇蛋白菌体）；
b、重相加重相体积1 倍的清水，搅拌均匀，再次进行离心分离，分别收集上清液和重相，上清液与上述a 步骤收集的上清液合并；经截留分子量5000Ku 的超滤膜浓缩，获得脂肪酶浓缩液，收集到酶液储存罐中，投加玉米淀粉，玉米淀粉投加量（g）= 脂肪酶浓缩液总酶活（U）/ 计划固体酶活性（U/g）；其中，脂肪酶浓缩液总酶活指单位体积（mL）脂肪酶浓缩液的酶活性与脂肪酶浓缩液总体积的乘积，计划固体酶活性指准备生产得到的固体酶活性，搅拌均匀，输送到喷雾干燥机中进行干燥，重相备用；
（6）酶液喷雾干燥：调节喷雾干燥机进风口温度至135 ～ 155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为500L/h，喷雾干燥结束后，收集干粉即为脂肪酶；
（7）单细胞甲醇蛋白的获得：将上述（5）中b 步骤收集的重相即单细胞甲醇蛋白悬液，加入清水，悬液中菌体为700-750g/L，送入喷雾干燥机，调节喷雾干燥机进风口温度至135 ～ 155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为400-500L/h，进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后，收集的干粉即为单细胞甲醇蛋白；
所述的一级种子培养基为YPD 培养基，是由重量百分比计的酵母浸膏1%（Oxiod公司产品，公知技术，以下同）、胰蛋白胨2%、葡萄糖2% 和余量的水混合在一起组成；所述的无机盐培养基是由磷酸氢二铵5.16g、石膏粉0.22g、硫酸钾8.12g、硫酸亚铁0.42g，七水硫酸镁6.5g、氯化钾1.68g、甘油40g 和质量浓度98% 的硫酸5mL 加水至1L 制成，用氨水调pH值至5.0 ；
所述的微量元素溶液是由五水硫酸铜2.2g，碘化钾0.08g，一水硫酸锰4.5g，二水钼酸钠0.3g，硼酸0.02g，六水合氯化钴0.1g，氯化锌8g，七水合硫酸亚铁32g，质量浓度98%的浓硫酸3mL 和生物素0.2g 加水至1L 制成。
本发明将菌株zfwx-208 在发酵培养基中分别以甲醇和氨水作为主要碳源和氮源进行生长和产酶，通过脂肪酶与甲醇蛋白（即单细胞甲醇蛋白）联合发酵生产，实现了装置多用，降低了生产成本，提高了生产效益，并且简化了生产工艺，降低原料消耗，节约能源使用，减轻环境污染。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例
（1）一级种子的培养：一级种子培养基采用YPD 培养基，用2000mL 三角瓶分装，每瓶装液量为500mL，瓶口用8 层纱布包裹，121℃灭菌30min 后冷却备用，取3-5 支试管斜面保藏的菌株zfwx-208（又称试管斜面），用接种环刮下并接入至有500mL 一级种子培养基的三角瓶中，每支试管斜面接种两瓶，接种后在30℃摇床中振荡培养22-26 小时，摇床转速为200-300rpm，获得一级摇瓶种子；
（2）二级种子的培养：二级种子培养基采用无机盐培养基，121℃灭菌30min 后冷却，再在每升无机盐培养基中加入4mL 经0.22μm 微孔滤膜过滤除菌的微量元素溶液，得培养液，先在发酵罐中放入60L 培养液，进行实罐灭菌，冷却后用磷酸或氨水调整培养液pH值到5.0，取样镜检一级摇瓶种子生长情况，将个体较大，发芽2-3 个，无杂菌感染的一级摇瓶种子3-4L 接入到发酵罐中的培养液上，在30-32℃，pH5.0，通气量0.5-1.2 v/(v×min)（每分钟气液比），搅拌转速400-650rpm，培养时间22-26h，得二级种子；
（3）高密度发酵：在5m3发酵罐装1.5m 3的发酵培养基和200mL 聚醚改性硅消泡剂，打开发酵罐上的盘管的进出口蒸汽阀门，使蒸汽进入盘管并对发酵培养基加热，待温度升至80℃时，打开蒸汽阀门，使蒸汽分别从发酵罐的底部放料口、空气进口、取样口进入到发酵罐内，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌30min，同时，用蒸汽依次对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，待发酵培养基冷却后，向发酵罐中补加经过滤除菌的微量元素溶液60L，并用氨水调节pH 至5.0 ；将上述培养好的二级种子60L 接入到上述5m3发酵罐中的发酵培养基上进行培养，在30-32℃，通气量为0.6 ～ 0.8 v/(v×min)，搅拌转速为60-80rpm 的条件下开始培养，每隔4 小时取样测定发酵液中菌体湿重，当湿重达到65g/L 以上后，通气量加大至1.0 ～ 1.5 v/(v×min)，提高搅拌转速到85-100rpm，保持发酵液pH5.0，16-20 小时后，发酵培养基中甘油消耗完，溶氧开始上升，此时，开始以20-30Kg/h 的速度流加甘油，当发酵液中菌体湿重达到140g/L时，开始停止甘油流加，当甘油利用完后，发酵罐上溶氧电极显示溶氧上升，开始流加甲醇，发酵液中甲醇体积浓度控制在0.8% ～ 1.2%，同时加大发酵罐通气量，即保证发酵液中溶氧达到30% 以上（以搅拌转速为100rpm，进气量为2m3/min 定义为溶氧100%）；
（4）诱导产酶：甲醇流加24-30h 后，发酵液中菌体，即单细胞甲醇蛋白已完成营养转型，湿重持续升高，酵母细胞开始形成酶蛋白，此时开始诱导脂肪酶生产，即降低发酵温度至25℃，降低发酵液pH 至4.0-4.5，每隔3-4 小时流加2-3L 微量元素溶液，诱导产酶60-70小时后，发酵液中菌体湿重达到400-450g/L，酶活性达到20000U/mL 以上，随后每隔3 小时取样测定酶活性，当酶活比上次酶活增长量低于5% 时，收集发酵液；
（5）酶的提取：利用蝶片离心机对上述（4）步骤所得的发酵液中单细胞甲醇蛋白菌体进行分离，方法是：
A、蝶片离心机转速12000rpm，进液量500L/h，分别收集轻相和重相，轻相即上清液，重相即单细胞甲醇蛋白菌体；
B、取重相，加重相体积1 倍的清水，搅拌均匀，让沾附在细胞表面的酶及无机盐洗脱下来，然后再次进行离心分离，分别收集上清液和重相，上清液与上述A 步骤收集的上清液合并，两次离心收集的上清液再经截留分子量5000Ku 的超滤膜浓缩，获得脂肪酶浓缩液，取样测定酶活性，将脂肪酶浓缩液收集到2m3的酶液储存罐中，投加玉米淀粉，玉米淀粉投加量（g）= 脂肪酶浓缩液总酶活（U）/ 计划固体酶活性（U/g）（脂肪酶浓缩液总酶活= 测定的单位体积酶活性（U/mL）× 脂肪酶浓缩液总体积；如测定的单位体积酶活性60000U/mL，脂肪酶浓缩液总体积2m3，则：脂肪酶浓缩液总酶活 = 60000U/mL×2×106 mL= 12×1010（U），如计划生产的固体酶的活性为10 万单位/ 克，则需投加的玉米淀粉量大约为：12×1010 U÷10万(U /g)=1.2×106克，即1.2 吨。），并搅拌均匀，通过出料泵输送到喷雾干燥机中进行干燥，重相备用；
（6）酶液喷雾干燥：调节喷雾干燥机进风口温度至135 ～ 155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为500L/h，进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后收集干粉即为脂肪酶；
（7）单细胞甲醇蛋白的获得：将上述（5）中B 步骤收集的重相即单细胞甲醇蛋白菌体（固液比85-90%），加入清水，得悬液，悬液中菌体湿重达到700-750g/L，然后通过输送泵送入喷雾干燥机，调节喷雾干燥机进风口温度至135 ～ 155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为400-500L/h，进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后，收集的干粉即为单细胞甲醇蛋白。
本发明是根据巴斯德毕赤酵母zfwx-208 菌株营养需求及发酵生理特性，将该菌株以无机盐、氨水、微量元素等为混合基质，以甘油及甲醇为碳源，通过液体深层通风搅拌的好氧培养方法进行高密度发酵生产，生产工艺采用变温发酵，在菌体增殖阶段采用菌体最适生长温度进行培养，当菌体达到一定湿重时，开始流加甲醇作为主要营养物质，同时采用降温发酵培养，诱导菌体产生脂肪酶并分泌胞外，产脂肪酶过程中其菌体湿重还保持增长，实现脂肪酶与甲醇蛋白的共同发酵生产，发酵结束时，发酵液中菌体浓度达到400-450g/L，脂肪酶酶活性达到20000U/mL，该菌株zfwx-208 所产生的单细胞甲醇蛋白中粗蛋白含量不低于50%，氨基酸总量不低于48%，灰分不高于8%，发酵获得的脂肪酶最适pH值为7.5，最适作用温度为40℃。
本发明和现有技术相比，具有以下优点：
1、本发明的菌株性能稳定，能够实现高密度发酵，最终菌体浓度高，达到400-450g/L，同时联产脂肪酶产品，放罐时酶活达到20000U/mL，生产效率高。
2、发酵装置利用率高，高产甲醇蛋白的同时，联产脂肪酶产品，降低了生产成本。
4、生产工艺特殊，发酵过程中采用变温发酵控制工艺，主要营养物质为无机盐和甲醇，原料来源充足。本工艺中甲醇和脂肪酶的发酵生产效率较高，甲醇转化效率高，甲醇蛋白生产效率对数期达到不低于3Kg/h/m3，甲醇蛋白单耗甲醇在2.0-2.2 ：1。
经高效液相色谱对照法检测证明，本发明制备的脂肪酶为酯键水解酶，可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。在焙烤食品中应用脂肪酶具有强筋、改善面团结构纹理及面包品质的作用。脂肪酶的乳脂水解作用可改善乳品品质，可于增强奶酪和奶粉风味、奶酪熟化、奶油及冰淇淋的酯解改性等。
Claims (3)
1.一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母，其特征在于，分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）zfwx-208 菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2013518，保藏日期为：2013 年10 月30 日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心。
2.根据权利要求1 所述的一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母的应用，其特征在于，具体步骤如下：（1）一级种子的培养：取试管斜面保藏的菌株zfwx-208，接入至一级种子培养基上，在30℃摇床中振荡培养22-26 小时，摇床转速为200-300rpm，获得一级摇瓶种子；
（2）二级种子的培养：每升无机盐培养基中加入4mL 的微量元素溶液后，再调整pH 值到5.0，将一级摇瓶种子接种到加入微量元素溶液后的无机盐培养基上，在30-32℃，pH5.0，通气量0.5-1.2v/(v×min)，搅拌转速400-650rpm，培养时间22-26h ；（3）高密度发酵：
A、在发酵罐中装入发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为7500 ：1，对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌30 分钟，灭菌结束后，对发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当发酵培养基温度降至35℃时，向发酵罐中补加微量元素溶液，并调pH 至5.0，微量元素溶液和发酵培养基的体积比为1 ：25 ；所述的发酵培养基为无机盐培养基；
B、将培养好的二级种子接入到A 步骤发酵罐中的发酵培养基上，在温度30-32℃，通气量为0.6 ～ 0. 8v/(v×min)，搅拌转速为60-80rpm 的条件下进行培养，每隔4 小时取样测定发酵液中菌体湿重，当湿重达到60g/L 以上后，通气量加大至1.0 ～ 1.5 v/(v×min)，搅拌转速提高到85-100rpm，保持发酵液pH5.0，16-20 小时后，开始以20-30k g/h 的速度流加甘油，当发酵液中菌体湿重达到140g/L 时，停止甘油流加，当甘油利用完后，发酵罐上溶氧电极显示溶氧上升，开始流加甲醇，发酵液中甲醇体积浓度控制在0.8% ～ 1.2%，同时开大发酵罐进气阀门，保证发酵液中溶氧达到30% 以上；
（4）诱导产酶：甲醇流加24-30h 后，降低发酵温度至25℃，降低发酵液pH 至4.0-4.5，每隔3-4 小时流加发酵液体积的0.5-0.6‰的微量元素溶液，当发酵液中菌体湿重达到400-450g/L 时，酶活性达到20000U/mL 且不再增长，收集发酵液；
（5）酶的提取：
a、利用蝶片离心机对上述（4）步骤收集的发酵液进行分离，蝶片离心机转速12000rpm，进液量500L/h，分别收集上清液和重相；
b、重相加重相体积1 倍的清水，搅拌均匀，再次进行离心分离，分别收集上清液和重相，上清液与上述a 步骤收集的上清液合并；经截留分子量5000Ku 的超滤膜浓缩，获得脂肪酶浓缩液，收集到酶液储存罐中，投加玉米淀粉，玉米淀粉投加量= 脂肪酶浓缩液总酶活/计划固体酶活性；其中，脂肪酶浓缩液总酶活指单位体积脂肪酶浓缩液的酶活性与脂肪酶浓缩液总体积的乘积，计划固体酶活性指准备生产得到的固体酶活性，搅拌均匀，输送到喷雾干燥机中进行干燥，重相备用；
（6）酶液喷雾干燥：调节喷雾干燥机进风口温度至135 ～ 155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为500L/h，喷雾干燥结束后，收集干粉即为脂肪酶；
（7）单细胞甲醇蛋白的获得：将上述（5）中b 步骤收集的重相即单细胞甲醇蛋白悬液，加入清水，悬液中菌体湿重为700-750g/L，送入喷雾干燥机，调节喷雾干燥机进风口温度至135 ～ 155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为400-500L/h，进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后，收集的干粉即为单细胞甲醇蛋白；
所述的一级种子培养基为YPD 培养基，是由重量百分比计的酵母浸膏1%、胰蛋白胨2%、葡萄糖2% 和余量的水混合在一起组成；
所述的无机盐培养基是由磷酸氢二铵5.16g、石膏粉0.22g、硫酸钾8.12g、硫酸亚铁0.42g，七水硫酸镁6.5g、氯化钾1.68g、甘油40g 和质量浓度98% 的硫酸5mL 加水至1L 制成，用氨水调pH 值至5.0 ；
所述的微量元素溶液是由五水硫酸铜2.2g，碘化钾0.08g，一水硫酸锰4.5g，二水钼酸钠0.3g，硼酸0.02g，六水合氯化钴0.1g，氯化锌8g，七水合硫酸亚铁32g，质量浓度98% 的浓硫酸3mL 和生物素0.2g 加水至1L 制成。
3.根据权利要求1 所述的一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母的应用，其特征在于，具体步骤如下：
（1）一级种子的培养：一级种子培养基采用YPD 培养基，用2000mL 三角瓶分装，每瓶装液量为500mL，瓶口用8 层纱布包裹，121℃灭菌30min 后冷却备用，取3-5 支试管斜面保藏的菌株zfwx-208，用接种环刮下并接入至有500mL 一级种子培养基的三角瓶中，每支试管斜面接种两瓶，接种后在30℃摇床中振荡培养22-26 小时，摇床转速为200-300rpm，获得一级摇瓶种子；
（2）二级种子的培养：二级种子培养基采用无机盐培养基，121℃灭菌30min 后冷却，再在每升无机盐培养基中加入4mL 经0.22μm 微孔滤膜过滤除菌的微量元素溶液，得培养液，先在发酵罐中放入60L 培养液，进行实罐灭菌，冷却后用磷酸或氨水调整培养液pH 值到5.0，取样镜检一级摇瓶种子生长情况，将个体较大，发芽2-3 个，无杂菌感染的一级摇瓶种子3-4L 接入到发酵罐中的培养液上，在30-32℃，pH5.0，通气量0.5-1.2 v/(v×min)，搅拌转速400-650rpm，培养时间22-26h，得二级种子；
（3）高密度发酵：在5m3 发酵罐装1.5m3 的发酵培养基和200mL 聚醚改性硅消泡剂，打开发酵罐上的盘管的进出口蒸汽阀门，使蒸汽进入盘管并对发酵培养基加热，待温度升至80℃时，打开蒸汽阀门，使蒸汽分别从发酵罐的底部放料口、空气进口、取样口进入到发酵罐内，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌30min，同时，用蒸汽依次对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，灭菌结束后，对发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当发酵培养基温度降至35℃时，向发酵罐中补加经过滤除菌的微量元素溶液60L，并用氨水调节pH 至5.0 ；将上述培养好的二级种子60L 接入到上述5m3 发酵罐中的发酵培养基上进行培养，在30-32℃，通气量为0.6 ～ 0.8 v/(v×min)，搅拌转速为60-80rpm 的条件下开始培养，每隔4 小时取样测定发酵液中菌体湿重，当湿重达到65g/L 以上后，通气量加大至1.0 ～ 1.5 v/(v×min)，提高搅拌转速到85-100rpm，保持发酵液pH5.0，16-20 小时后，发酵培养基中甘油消耗完，溶氧开始上升，此时，开始以20-30k g/h 的速度流加甘油，当发酵液中菌体湿重达到140g/L时，开始停止甘油流加，当甘油利用完后，发酵罐上溶氧电极显示溶氧上升，开始流加甲醇，发酵液中甲醇体积浓度控制在0.8% ～ 1.2%，同时加大发酵罐通气量，即保证发酵液中溶氧达到30% 以上；
（4）诱导产酶：甲醇流加24-30h 后，发酵液中菌体，即单细胞甲醇蛋白已完成营养转型，湿重持续升高，酵母细胞开始形成酶蛋白，此时开始诱导脂肪酶生产，即降低发酵温度至25℃，降低发酵液pH 至4.0-4.5，每隔3-4 小时流加2-3L 微量元素溶液，诱导产酶60-70小时后，发酵液中菌体湿重达到400-450g/L，酶活性达到20000U/mL 以上，随后每隔3 小时取样测定酶活性，当酶活比上次酶活增长量低于5% 时，收集发酵液；
（5）酶的提取：利用蝶片离心机对上述（4）步骤所得的发酵液中单细胞甲醇蛋白菌体进行分离，方法是：
A、蝶片离心机转速12000rpm，进液量500L/h，分别收集轻相和重相，轻相即上清液，重相即单细胞甲醇蛋白菌体；
B、取重相，加重相体积1 倍的清水，搅拌均匀，让沾附在细胞表面的酶及无机盐洗脱下来，然后再次进行离心分离，分别收集上清液和重相，上清液与上述A 步骤收集的上清液合并，两次离心收集的上清液再经截留分子量5000Ku 的超滤膜浓缩，获得脂肪酶浓缩液，取样测定酶活性，将脂肪酶浓缩液收集到2m3 的酶液储存罐中，投加玉米淀粉，玉米淀粉投加量（g）= 脂肪酶浓缩液总酶活/ 计划固体酶活性，并搅拌均匀，通过出料泵输送到喷雾干燥机中进行干燥，重相备用；
（6）酶液喷雾干燥：调节喷雾干燥机进风口温度至135 ～ 155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为500L/h，进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后收集干粉即为脂肪酶；
（7）单细胞甲醇蛋白的获得：将上述（5）中B 步骤收集的重相即单细胞甲醇蛋白菌体，加入清水，得悬液，悬液中菌体湿重达到700-750g/L，然后通过输送泵送入喷雾干燥机，调节喷雾干燥机进风口温度至135 ～ 155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为400-500L/h，进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后，收集的干粉即为单细胞甲醇蛋白。
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Application publication date: 20151209 Assignee: Qinghai Yihai Biotechnology Co., Ltd. Assignor: Coal Biochemistry High Technology Engineering Co., Ltd. of Yima Mining Group Contract record no.: 2019410000005 Denomination of invention: Pichia pastoris for producing methanol protein and lipase at same time and application thereof Granted publication date: 20180323 License type: Common License Record date: 20190618 |