CN112725201B - 一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法 - Google Patents

一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法，包括如下步骤：1)将产酸性蛋白酶的毕赤酵母菌种接入固体平板培养基中进行培养，分离出单菌落并进行种子培养，将得到的种子培养液进行保藏；2)将保藏的种子培养液进行活化培养；3)将活化培养后的培养液进行扩大培养；4)将扩大培养后的培养液接入底料培养基中进行液体深层发酵，当溶氧开始上升时流加甘油料，调节补料速度控制溶氧在10～30％，控制甘油料补完后湿重在25～35％；饥饿半小时后流加甲醇料进行诱导，调节补料速度控制溶氧在10～30％；在发酵100～120h后恒速流加酵母膏至发酵结束，得到含酸性蛋白酶的发酵液。本发明通过对培养基成分、发酵条件优化，使得从发酵液中获得较高活力的酸性蛋白酶。

Description

一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法。
背景技术
酸性蛋白酶(AcidProtease)是一类在酸性条件下水解蛋白质的酶，广泛应用于酿酒、饲料、皮革等生产中。其中酸性蛋白酶作为一种动物饲料添加剂，能有效地提高动物胃部对氨基酸和小肽的吸收，从而促进幼年动物的消化吸收和生长发育，增强抗病能力，提高饲料的吸收率，降低饲料成本。
微生物发酵产酸性蛋白酶，由于其培养简单、价格低廉、来源广、产量高等优点而被广泛应用于工业化生产。近年来，采用微生物发酵产酸性蛋白酶研究的比较多，产酸性蛋白酶的微生物中毕赤酵母是一种安全的蛋白酶生产菌，但是菌体表达量没有得到明显的提升，酸性蛋白酶活力上不去。因此，有必要设计一种新的产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法，提高微生物产酸性蛋白酶的表达量。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法，能够从发酵液中获得较高活力的酸性蛋白酶。
为实现上述目的，本发明的技术方案为一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法，包括如下步骤：
1)将产酸性蛋白酶的毕赤酵母菌种接入固体平板培养基中进行培养，分离得到单菌落；将单菌落接入种子培养基中进行种子培养，得到种子培养液，并进行保藏；
2)将保藏的种子培养液接入活化培养基中进行活化培养；
3)将活化培养后的培养液接入种子扩大培养基中进行扩大培养；
4)将扩大培养后的培养液接入底料培养基中进行液体深层发酵，当底料甘油耗尽，此时溶氧降至最低后反弹，开始流加甘油料，调节补料速度控制溶氧在10～30％，控制甘油料补完后湿重在25～35％之间；饥饿半小时后流加甲醇料进行诱导，调节补料速度控制溶氧在10～30％；在发酵100～120h后恒速流加酵母膏，直至发酵结束，得到含酸性蛋白酶的发酵液。
进一步地，步骤4)中的甘油料包括甘油、水和PTM1，步骤4)中的甲醇料包括甲醇和PTM1。其中，甘油料中甘油的浓度为25-50％，PTM1的浓度为0.8-1.4％；甲醇料中PTM1的浓度为0.8-1.4％；酵母膏的浓度为1.0-10％。
进一步地，步骤4)中进行液体深层发酵时，分段控制罐内的pH值，在生长期控制pH在4.5～5.0，在诱导期控制pH在5.0～5.8。
进一步地，步骤4)中在25-32℃下进行液体深层发酵，搅拌转速为200-600r/min，通气量为1.0-2.5m3/h，全程氨水控制pH在4.5-5.8。发酵终止条件：放罐前两次测定活力上升缓慢。
进一步地，步骤4)中底料培养基包括以下组分：磷酸0.8-3.0％，硫酸铵1.0-4.0％，硫酸钙0.03-0.1％，硫酸钾1.0-2.5％，硫酸镁0.5-2.0％，氢氧化钾0.4-1.0％，甘油2-6％，PTM10.2-0.8％，余量为水。
进一步地，步骤1)中的固体平板培养基包括以下组分：葡萄糖1.5～3.0％，蛋白胨1.0～2.5％，酵母粉0.25～2.0％，琼脂粉0.5～2.0％，余量为水；步骤1)中的种子培养基包括以下组分：葡萄糖1.5～3.0％，蛋白胨1.0～2.5％，酵母粉0.25～2.0％，余量为水。
进一步地，步骤1)中的种子培养液的保藏方法为：在种子培养液中加入10～30％的甘油，混合后接入甘油管中，置于-50～-80℃冷藏。
进一步地，步骤2)中的活化培养基包括如下组分：葡萄糖1.5～3.0％，蛋白胨1.0～2.5％，酵母粉0.25～2.0％，琼脂粉0.5～2.0％，余量为水。
进一步地，步骤3)中的种子扩大培养基包括如下组分：葡萄糖1.5～3.0％，蛋白胨1.0～2.5％，酵母粉0.25～2.0％，余量为水。
进一步地，步骤2)中的活化培养和步骤3)中的扩大培养的培养条件均为：25～32℃、150～200r/min震荡培养。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明在液体深层发酵时通过增加碳源用量，以提高诱导前的湿重，将其控到25-35％之间，保证了在诱导期得到最佳的酶活增幅和甲醇得率；同时在诱导3-4天左右恒速流加酵母膏，通过外加氮源，有效减少了目的蛋白被降解，保证酶活持续增加；
(2)本发明在液体深层发酵时采取pH分段控制，在流加甲醇料之前的生长期控制pH在4.5～5.0，维持菌体正常生长所需的pH；在流加甲醇料的诱导期控制pH在5.0～5.8，确保了目的蛋白的稳定；
(3)本发明通过对培养基成分、发酵条件优化，使得从发酵液中获得较高活力的酸性蛋白酶，在发酵160h，酸性蛋白酶酶活可达38000U/mL以上，较优化前提高40％。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法，该方法包括如下步骤：
1)将产酸性蛋白酶的毕赤酵母菌种接入固体平板培养基中进行培养，分离得到单菌落；将单菌落接入种子培养基中进行种子培养，得到种子培养液，并进行保藏；其中，固体平板培养包括葡萄糖2.0％、蛋白胨2％、酵母粉1.0％、琼脂粉1.5％，加余量水溶解后115℃灭菌30min；种子培养基包括葡萄糖2.0％、蛋白胨2.0％、酵母粉1.0％，加余量水溶解后115℃灭菌30min；种子培养液的保藏方法为：在种子培养液中加入重量百分比为20％的甘油，混合后接入甘油管中，1.5mL/支，置于-80℃冷藏。
2)用灭过菌的竹签蘸取-80℃保藏的甘油管菌种少许，划斜面接种于装有60mL活化培养基的250mL茄子瓶中，30℃条件下生化培养箱培养60h左右，至斜面长出清晰的菌落；其中，活化培养基包括葡萄糖2.0％、蛋白胨2.0％、酵母粉1.0％、琼脂粉1.5％，加余量水溶解后115℃灭菌30min，冷却、形成斜面；
3)无菌条件下挑取上述活化斜面中的单菌落接到灭过菌的装有150mL种子扩大培养基的500mL三角瓶中，30℃条件下200r/min震荡培养24h左右至瓶内液体呈现一定的浑浊度；其中，种子扩大培养基包括葡萄糖2.0％、蛋白胨2.0％、酵母粉1.0％，加余量水溶解后115℃灭菌30min；
4)在30L发酵罐中装入16L底料培养基，底料培养基包括磷酸1.9％、硫酸铵2.6％、硫酸钙0.06％、硫酸钾1.4％、硫酸镁1.3％、氢氧化钾0.4％、甘油4％、PTM10.5％，加水定至设定体积；121℃灭菌30min结束后，降温至30℃，接入一瓶扩大培养后的三角瓶种子，30℃恒温发酵；当底料甘油耗尽(约发酵20h)，此时溶氧降至最低后反弹，开始流加40％甘油料(2000g甘油，60mL PTM1加水定至5L)，调节补料速度控制溶氧在20％，维持10h补料，控制甘油料补完后(即诱导前)湿重达到32％左右；饥饿半小时后流加甲醇料(20L甲醇，含240mLPTM1)，进入甲醇诱导期，调节补料速度控制溶氧在20％；在发酵100h后以110g/h的恒定速率流加浓度为4％酵母膏(240g酵母膏溶于6L水)，直至发酵160h放罐；发酵过程中采用20％氨水(工业氨水)并分段控制罐内的pH值，在流加甲醇料前的生长期控制pH在4.8，在流加甲醇料后的诱导期控制pH在5.3；发酵初始通气量1.0m3/h，搅拌转速200rpm/min；溶氧低于70％开始升风升转，直至发酵条件最大通气量2.5m3/h，搅拌转速600rpm/min。
采用本实施例提供的发酵方法连续发酵三批，从发酵88h开始，之后每24h取发酵样，离心取上清进行酶活检测，酸性蛋白酶活力的测定采用《中华人民共和国轻工业标准》QB/T1805.3-93工业酶制剂通用实验方法，即福林(Folin)法，检测结果如表1所示。从表1可以看出，采用本实施例的发酵方法，88h酸性蛋白酶大量合成，到达136h后产酶速率变慢，发酵至160h放罐，测定发酵液中酸性蛋白酶活力可达38193U/mL以上。
表1酸性蛋白酶活力检测结果
Figure BDA0002905842150000051
对比例1
对比例1提供一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法，该方法的步骤1)-3)与实施例1的步骤1)-3)完全一样，不同之处在于方法的步骤4)为：在30L发酵罐中装入16L底料培养基，底料培养基包括磷酸1.9％、硫酸铵2.6％、硫酸钙0.06％、硫酸钾1.4％、硫酸镁1.3％、氢氧化钾0.4％、甘油4％、PTM10.5％，加水定至设定体积；121℃灭菌30min结束后，降温至30℃，接入一瓶扩大培养后的三角瓶种子，30℃恒温发酵；当底料甘油耗尽(约发酵20h)，此时溶氧降至最低后反弹，开始流加40％甘油料(2000g甘油，60mL PTM1加水定至5L)，调节补料速度控制溶氧在20％，维持10h补料，控制甘油料补完后(即诱导前)湿重达到25％左右；饥饿半小时后流加甲醇料(20L甲醇，含240mLPTM1)，进入甲醇诱导期，调节补料速度控制溶氧在20％；发酵过程中采用20％氨水并分段控制罐内的pH值，在流加甲醇料前的生长期控制pH在4.8，在流加甲醇料后的诱导期控制pH在5.3；发酵初始通气量1.0m3/h，搅拌转速200rpm/min；溶氧低于70％开始升风升转，直至发酵条件最大通气量2.5m3/h，搅拌转速600rpm/min。
采用本对比例提供的发酵方法连续发酵三批，从发酵88h开始，之后每24h取发酵样，离心取上清进行酶活检测，酸性蛋白酶活力的测定采用《中华人民共和国轻工业标准》QB/T1805.3-93工业酶制剂通用实验方法，即福林(Folin)法，检测结果如表2所示。从表2可以看出，采用本对比例的发酵方法，88h酸性蛋白酶大量合成，到达112h后产酶速率变慢，发酵至160h放罐，测定发酵液中酸性蛋白酶活力仅可达32511U/mL。
表2酸性蛋白酶活力检测结果
Figure BDA0002905842150000061
Figure BDA0002905842150000071
对比例2
对比例1提供一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法，该方法的步骤1)-3)与实施例1的步骤1)-3)完全一样，不同之处在于方法的步骤4)为：在30L发酵罐中装入16L底料培养基，底料培养基包括磷酸1.9％、硫酸铵2.6％、硫酸钙0.06％、硫酸钾1.4％、硫酸镁1.3％、氢氧化钾0.4％、甘油4％、PTM10.5％，加水定至设定体积；121℃灭菌30min结束后，降温至30℃，接入一瓶扩大培养后的三角瓶种子，30℃恒温发酵；当底料甘油耗尽(约发酵20h)，此时溶氧降至最低后反弹，开始流加40％甘油料(2000g甘油，60mL PTM1加水定至5L)，调节补料速度控制溶氧在20％，维持10h补料，控制甘油料补完后(即诱导前)湿重达到32％左右；饥饿半小时后流加甲醇料(20L甲醇，含240mLPTM1)，进入甲醇诱导期，调节补料速度控制溶氧在20％；在发酵100h后以110g/h的恒定速率流加浓度为4％酵母膏(240g酵母膏溶于6L水)，直至发酵160h放罐；发酵过程中采用20％氨水并恒定控制罐内的pH值，生长期和诱导期均控制pH在4.8；发酵初始通气量1.0m3/h，搅拌转速200rpm/min；溶氧低于70％开始升风升转，直至发酵条件最大通气量2.5m3/h，搅拌转速600rpm/min。
采用本对比例提供的发酵方法连续发酵三批，从发酵88h开始，之后每24h取发酵样，离心取上清进行酶活检测，酸性蛋白酶活力的测定采用《中华人民共和国轻工业标准》QB/T1805.3-93工业酶制剂通用实验方法，即福林(Folin)法，检测结果如表3所示。从表3可以看出，采用本对比例的发酵方法，88h酸性蛋白酶大量合成，到达112h后产酶速率变慢，发酵至160h放罐，测定发酵液中酸性蛋白酶活力仅可达27280U/mL。
表3酸性蛋白酶活力检测结果
Figure BDA0002905842150000081
实施例2
本实施例提供一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法，该方法包括如下步骤：
1)将产酸性蛋白酶的毕赤酵母菌种接入固体平板培养基中进行培养，分离得到单菌落；将单菌落接入种子培养基中进行种子培养，得到种子培养液，并进行保藏；其中，固体平板培养包括葡萄糖1.5％、蛋白胨2.5％、酵母粉0.25％、琼脂粉1％，加余量水溶解后115℃灭菌30min；种子培养基包括葡萄糖1.5％、蛋白胨2.5％、酵母粉0.25％，加余量水溶解后115℃灭菌30min；种子培养液的保藏方法为：在种子培养液中加入重量百分比为20％的甘油，混合后接入甘油管中，1.5mL/支，置于-50℃冷藏。
2)用灭过菌的竹签蘸取-50℃保藏的甘油管菌种少许，划斜面接种于装有60mL活化培养基的250mL茄子瓶中，30℃条件下生化培养箱培养60h左右，至斜面长出清晰的菌落；其中，活化培养基包括葡萄糖1.5％、蛋白胨2.5％、酵母粉0.25％、琼脂粉1％，加余量水溶解后115℃灭菌30min，冷却、形成斜面；
3)无菌条件下挑取上述活化斜面中的单菌落接到灭过菌的装有150mL种子扩大培养基的500mL三角瓶中，30℃条件下200r/min震荡培养24h左右至瓶内液体呈现一定的浑浊度；其中，种子扩大培养基包括葡萄糖1.5％、蛋白胨2.5％、酵母粉0.25％，加余量水溶解后115℃灭菌30min；
4)在30L发酵罐中装入16L底料培养基，底料培养基包括磷酸0.8％、硫酸铵1.0％、硫酸钙0.03％、硫酸钾1.0％、硫酸镁0.5％、氢氧化钾0.4％、甘油2％、PTM10.2％，加水定至设定体积。121℃灭菌30min结束后，降温至28℃，接入一瓶扩大培养后的三角瓶种子，28℃恒温发酵；当底料甘油耗尽(约发酵16h)，此时溶氧降至最低后反弹，开始流加50％甘油料(2500g甘油，40mL PTM1加水定至5L)，调节补料速度控制溶氧在30％，维持10h补料，控制甘油料补完后(即诱导前)湿重达到25％左右；饥饿半小时后流加甲醇料(20L甲醇，含160mLPTM1)，进入甲醇诱导期，调节补料速度控制溶氧在30％；在发酵100h后以110g/h的恒定速率流加浓度为10％酵母膏(600g酵母膏溶于6L水)，直至发酵160h放罐；发酵过程中采用20％氨水(工业氨水)并分段控制罐内的pH值，在流加甲醇料前的生长期控制pH在4.8，在流加甲醇料后的诱导期控制pH在5.3；发酵初始通气量1.0m3/h，搅拌转速200rpm/min；溶氧低于70％开始升风升转，直至发酵条件最大通气量2.5m3/h，搅拌转速600rpm/min。
采用本实施例提供的发酵方法连续发酵三批，从发酵88h开始，之后每24h取发酵样，离心取上清进行酶活检测，酸性蛋白酶活力的测定采用《中华人民共和国轻工业标准》QB/T1805.3-93工业酶制剂通用实验方法，即福林(Folin)法，检测结果如表4所示。从表4可以看出，采用本实施例的发酵方法，88h酸性蛋白酶大量合成，到达136h后产酶速率变慢，发酵至160h放罐，测定发酵液中酸性蛋白酶活力可达35193U/mL以上。
表4酸性蛋白酶活力检测结果
Figure BDA0002905842150000091
Figure BDA0002905842150000101
实施例3
本实施例提供一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法，该方法包括如下步骤：
1)将产酸性蛋白酶的毕赤酵母菌种接入固体平板培养基中进行培养，分离得到单菌落；将单菌落接入种子培养基中进行种子培养，得到种子培养液，并进行保藏；其中，固体平板培养包括葡萄糖3.0％、蛋白胨1.0％、酵母粉2.0％、琼脂粉2.0％，加余量水溶解后115℃灭菌30min；种子培养基包括葡萄糖3.0％、蛋白胨1.0％、酵母粉2.0％，加余量水溶解后115℃灭菌30min；种子培养液的保藏方法为：在种子培养液中加入重量百分比为20％的甘油，混合后接入甘油管中，1.5mL/支，置于-70℃冷藏。
2)用灭过菌的竹签蘸取-70℃保藏的甘油管菌种少许，划斜面接种于装有60mL活化培养基的250mL茄子瓶中，30℃条件下生化培养箱培养60h左右，至斜面长出清晰的菌落；其中，活化培养基包括葡萄糖3.0％、蛋白胨1.0％、酵母粉2.0％、琼脂粉2.0％，加余量水溶解后115℃灭菌30min，冷却、形成斜面；
3)无菌条件下挑取上述活化斜面中的单菌落接到灭过菌的装有150mL种子扩大培养基的500mL三角瓶中，30℃条件下200r/min震荡培养24h左右至瓶内液体呈现一定的浑浊度；其中，种子扩大培养基包括葡萄糖3.0％、蛋白胨1.0％、酵母粉2.0％，加余量水溶解后115℃灭菌30min；
4)在30L发酵罐中装入16L底料培养基，底料培养基包括磷酸3.0％、硫酸铵4.0％、硫酸钙0.1％、硫酸钾2.5％、硫酸镁2.0％、氢氧化钾1.0％、甘油6％、PTM10.8％，加水定至设定体积。121℃灭菌30min结束后，降温至32℃，接入一瓶扩大培养后的三角瓶种子，32℃恒温发酵；当底料甘油耗尽(约发酵24h)，此时溶氧降至最低后反弹，开始流加25％甘油料(1250g甘油，70mLPTM1加水定至5L)，调节补料速度控制溶氧在10％，维持10h补料，控制甘油料补完后(即诱导前)湿重达到35％左右；饥饿半小时后流加甲醇料(20L甲醇，含280mLPTM1)，进入甲醇诱导期，调节补料速度控制溶氧在10％；在发酵120h后以110g/h的恒定速率流加浓度为10％酵母膏(600g酵母膏溶于6L水)，直至发酵160h放罐；发酵过程中采用20％氨水(工业氨水)并分段控制罐内的pH值，在流加甲醇料前的生长期控制pH在4.8，在流加甲醇料后的诱导期控制pH在5.3；发酵初始通气量1.0m3/h，搅拌转速200rpm/min；溶氧低于70％开始升风升转，直至发酵条件最大通气量2.5m3/h，搅拌转速600rpm/min。
采用本实施例提供的发酵方法连续发酵三批，从发酵88h开始，之后每24h取发酵样，离心取上清进行酶活检测，酸性蛋白酶活力的测定采用《中华人民共和国轻工业标准》QB/T1805.3-93工业酶制剂通用实验方法，即福林(Folin)法，检测结果如表5所示。从表5可以看出，采用本实施例的发酵方法，88h酸性蛋白酶大量合成，到达136h后产酶速率变慢，发酵至160h放罐，测定发酵液中酸性蛋白酶活力可达38005U/mL以上。
表5酸性蛋白酶活力检测结果
Figure BDA0002905842150000111
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将产酸性蛋白酶的毕赤酵母菌种接入固体平板培养基中进行培养，分离得到单菌落；将单菌落接入种子培养基中进行种子培养，得到种子培养液，并进行保藏；
2）将保藏的种子培养液接入活化培养基中进行活化培养；
3）将活化培养后的培养液接入种子扩大培养基中进行扩大培养；
4）将扩大培养后的培养液接入底料培养基中进行液体深层发酵，当底料甘油耗尽，此时溶氧降至最低后反弹，开始流加甘油料，调节补料速度控制溶氧在10~30%，控制甘油料补完后湿重在25~35%之间；饥饿半小时后流加甲醇料进行诱导，调节补料速度控制溶氧在10~30%；发酵过程中采用20%氨水分段控制罐内的pH值，在流加甲醇料前的生长期控制pH在4.5~4.8，在流加甲醇料后的诱导期控制pH在5.0~5.3；在发酵100-120h后恒速流加酵母膏，直至发酵结束，得到含酸性蛋白酶的发酵液；
步骤4）中在25-32℃下进行液体深层发酵，搅拌转速为200-600r/min，通气量为1.0-2.5m3/h，全程氨水控制pH在4.5-5.8；
步骤4）中底料培养基包括以下组分：磷酸 0.8-3.0%，硫酸铵1.0-4.0%，硫酸钙 0.03-0.1%，硫酸钾 1.0-2.5%，硫酸镁0.5-2%，氢氧化钾0.4-1.0%，甘油2-6%，PTM1 0.2-0.8%，余量为水。
2.如权利要求1所述的一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法，其特征在于：步骤4）中的甘油料包括甘油和PTM1，步骤4）中的甲醇料包括甲醇和PTM1。
3. 如权利要求1所述的一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法，其特征在于：步骤1）中的固体平板培养基包括以下组分：葡萄糖1.5~3.0%，蛋白胨1.0~2.5%，酵母粉0. 25~2.0%，琼脂粉0.5~2.0%，余量为水；步骤1）中的种子培养基包括以下组分：葡萄糖1.5~3.0%，蛋白胨1.0~2.5%，酵母粉0. 25~2.0%，余量为水。
4. 如权利要求1所述的一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法，其特征在于：步骤2）中的活化培养基包括如下组分：葡萄糖1.5~3.0%，蛋白胨1.0~2.5%，酵母粉0. 25~2.0%，琼脂粉0.5~2.0%，余量为水。
5. 如权利要求1所述的一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法，其特征在于：步骤3）中的种子扩大培养基包括如下组分：葡萄糖1.5~3.0%，蛋白胨1.0~2.5%，酵母粉0. 25~2.0%，余量为水。
6.如权利要求1所述的一种产酸性蛋白酶的毕赤酵母的液体深层发酵方法，其特征在于：步骤2）中的活化培养和步骤3）中的扩大培养的培养条件均为：25~32℃、150~200r/min震荡培养。
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