CN102776163A - 一种重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶的方法 - Google Patents

一种重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶的方法，具体步骤如下：重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母GS115接种于种子培养基培养，再接种于发酵培养基BSM中发酵；待发酵培养基甘油耗尽，补加补料培养液；当细胞湿重达到350g/L以上，停止补加补料培养液；待甘油耗尽，流加诱导培养液，流加量为1-3ml/L.h，控制培养温度为22-26℃，诱导培养；离心，得到含有脂肪酶的上清液。本发明通过采用缺失了AOX1基因的重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶，该菌株对甲醇的消耗和溶氧的需求较小，能够减轻动力负荷，能耗少，节省原材料成本，便于控制，利于工业生产。

Description

一种重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶的方法
技术领域
本发明涉及一种重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应。除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等，具有高度的化学选择性和立体异构性。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换，广泛应用于食品、轻纺、皮革、香料、化妆品、洗涤剂、有机合成、医药等领域。脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中，但以微生物种类最多，目前发现的微生物中有近60个种属产脂肪酶，工业化生产的就有近20种。微生物脂肪酶按其晶体结构可分为根毛霉脂肪酶家族、褶皱假丝酵母脂肪酶家族、洋葱假单胞菌脂肪酶家族、葡萄球菌脂肪酶家族以及黑曲霉脂肪酶、荧光假单胞菌脂肪酶、莓实假单胞菌脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶等。微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，而且在理论研究方面也具有重要的意义。
我国在20世纪60年代就开展了微生物脂肪酶的研究，工业化生产解脂假丝酵母脂肪酶已有40多年的历史，但是自然菌株产酶量低，难以满足工业生产的需要，而脂肪酶基因在重组甲醇营养型毕赤酵母中的表达取得了较大成功，使得人们把注意力集中到脂肪酶的克隆和基因表达调控上。
甲醇营养型毕赤酵母作为真核表达系统的宿主菌不仅具有真核表达系统所特有的特点，而且营养要求低、生长快、培养基廉价，使得其在学术和工业上的应用越来越广泛。甲醇营养型毕赤酵母含有两个醇氧化酶编码基因—AOX1和AOX2，当菌株同时含有AOX1和AOX2基因，菌株表型为Mut+型，当菌株缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生表型为Muts型的菌株。Mut+型菌株甲醇代谢能力强，多数情况下外源蛋白的表达量比Muts型菌株高，所以一直以来重组甲醇营养型毕赤酵母多采用Mut+型菌株，但是该型菌株发酵时，甲醇消耗大、溶氧要求高，进而导致电能、冷却水等能耗消耗大，不仅成本高，设备要求高，而且也不易于控制。同时甲醇易挥发易燃，大量存放存在潜在危险。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶的方法，以减少甲醇用量，降低能耗，从而节省工业成本。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是一种重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶的方法，具体步骤如下：
1）重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母GS115接种于种子培养基中培养，再接种于发酵培养基BSM中培养；
2）通气搅拌发酵，发酵过程中溶氧控制在20-40%，加入氨水调节pH5-6；
3）发酵培养基甘油耗尽，补加补料培养液，维持溶氧20-35%；
4）细胞湿重达到350g/L以上，停止补加补料培养液；
5）待甘油耗尽，流加诱导培养液，流加量为1-3ml/L.h，控制培养温度为22-26℃，氨水调节pH6，诱导培养；
6）6000rpm离心10min，得到含有脂肪酶的上清液。
所述的补料生长液为含12ml/LPTM1的50%甘油。
所述的诱导培养液为含12ml/L PTM1的100%甲醇。
本发明通过采用缺失了AOX1基因的重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶，该菌株对甲醇的消耗和溶氧的需求较小，能够减轻动力负荷，能耗少，节省原材料成本，便于控制。依据国家标准GBT23535-2009，对本发明生产的脂肪酶进行酶活测定，脂肪酶酶活可达9000U/ml，部分生产工艺条件下，脂肪酶产量甚至可以提高到10000U/ml，所以更利于脂肪酶的工业化生产。
具体实施方式
重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母购自郑州大学化工与能源学院应用化学研究所。
培养基及培养液的制备：
1）种子培养基
酵母粉10g/ml，蛋白胨20g/ml，甘油10g/ml，100mM pH6.0磷酸盐缓冲液100ml/L。
2）发酵培养基BSM
85%H3PO426.7ml/L，CaSO40.93g/L，K2SO418.2g/L，MgSO4·7H2O14.9g/L，KOH4.13g/L，甘油40g/L，PTM14.00ml/L，25%氨水调节pH5-6。
3）PTM1
CuSO4·5H2O6g/L，NaI0.08g/L，MnSO4·H2O3g/L，Na2MoO4·2H2O0.2g/L，H3BO30.02g/L，CoCl20.5g/L，ZnCl220g/L，FeSO4·7H2O65g/L，H2SO45ml/L，生物素0.2g/L。
4）补料生长液
含12ml/LPTM1的50%甘油。
5）诱导培养液
含12ml/L PTM1的100%甲醇。
实施例1
本实施例重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶的方法，具体步骤如下：
1）挑取重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母GS115单菌落接种于种子培养基中，28℃200rpm培养20h，再接种于灭菌的发酵培养基BSM中，接种量为5%；
2）通气搅拌发酵，发酵过程中溶氧控制在40%，自动流加25%工业氨水调节pH6，温度控制在28℃；
3）待发酵培养基甘油耗尽，补加含12ml/L PTM1的50%甘油，继续维持溶氧在35%；
4）待细胞湿重达到350g/L以上，停止补加甘油，维持饥饿状态；
5）待甘油耗尽，流加含12ml/L PTM1的100%甲醇，控制培养温度为22℃，流加量1-6h为1ml/L.h，6h后增加至2ml/L.h，25%工业氨水调节pH6，诱导培养80h；
6）6000rpm离心10min，得到含有脂肪酶的上清液。依据国家标准GBT23535-2009，测定本实施例生产的脂肪酶酶活。测试结果为80h发酵上清中脂肪酶酶活为9000U/ml。
实施例2
本实施例重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶的方法，具体步骤如下：
1）挑取重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母GS115单菌落接种于种子培养基中，28℃200rpm培养20h，再接种于灭菌的发酵培养基BSM中，接种量为10%；
2）通气搅拌发酵，发酵过程中溶氧控制在30%，自动流加25%工业氨水调节pH5，温度控制在28℃；
3）待发酵培养基甘油耗尽，补加含12ml/L PTM1的50%甘油，继续维持溶氧在30%；
4）待细胞湿重达到350g/L以上，停止补加甘油，维持饥饿状态；
5）待甘油耗尽，流加含12ml/L PTM1的100%甲醇，控制培养温度为26℃，流加量1-6h为1ml/L.h，6h后增加至2ml/L.h，25%工业氨水调节pH6，诱导培养80h；
6）6000rpm离心10min，得到含有脂肪酶的上清液。依据国家标准GBT23535-2009，测定本实施例生产的脂肪酶酶活。测试结果为80h发酵上清中脂肪酶酶活为9700U/ml。
实施例3
本实施例重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶的方法，具体步骤如下：
1）挑取重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母GS115单菌落接种于种子培养基中，28℃200rpm培养20h，再接种于灭菌的发酵培养基BSM中，接种量为8%；
2）通气搅拌发酵，发酵过程中溶氧控制在20%，自动流加25%工业氨水调节pH6，温度控制在28℃；
3）待发酵培养基甘油耗尽，补加含12ml/L PTM1的50%甘油，继续维持溶氧在20%；
4）待细胞湿重达到350g/L以上，停止补加甘油，维持饥饿状态；
5）待甘油耗尽，流加含12ml/L PTM1的100%甲醇，控制培养温度为24℃，流加量1-6h为1ml/L.h，6h后增加至2ml/L.h，25%工业氨水调节pH6，诱导培养80h；
6）6000rpm离心10min，得到含有脂肪酶的上清液。依据国家标准GBT23535-2009，测定本实施例生产的脂肪酶酶活。测试结果为80h发酵上清中脂肪酶酶活为9300U/ml。
实施例4
本实施例重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶的方法，具体步骤如下：
1）挑取重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母GS115单菌落接种于种子培养基中，28℃200rpm培养20h，再接种于灭菌的发酵培养基BSM中，接种量为10%；
2）通气搅拌发酵，发酵过程中溶氧控制在30%，自动流加25%工业氨水控制pH5，温度控制在28℃；
3）待发酵培养基甘油耗尽，补加含12ml/L PTM1的50%甘油，继续维持溶氧在30%；
4）待细胞湿重达到350g/L以上，停止补加甘油，维持饥饿状态；
5）待甘油耗尽，流加含12ml/L PTM1的100%甲醇，控制培养温度为26℃，流加量1-6h为1ml/L.h，6h后增加至2ml/L.h，30h后甲醇流加速度增加至3ml/L.h，25%工业氨水调节pH6，诱导培养80h；
6）6000rpm离心10min，得到含有脂肪酶的上清液。依据国家标准GBT23535-2009，测定本实施例生产的脂肪酶酶活。测试结果为80h发酵上清中脂肪酶酶活为9500U/ml。
实施例5
本实施例重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶的方法，具体步骤如下：
1）挑取重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母GS115单菌落接种于种子培养基中，28℃200rpm培养20h，再接种于灭菌的发酵培养基BSM中，接种量为10%；
2）通气搅拌发酵，发酵过程中溶氧控制在30%，自动流加25%工业氨水控制pH5，温度控制在28℃；
3）待发酵培养基甘油耗尽，补加含12ml/L PTM1的50%甘油，继续维持溶氧在30%；
4）待细胞湿重达到350g/L以上，停止补加甘油，维持饥饿状态；
5）待甘油耗尽，流加含12ml/L PTM1的100%甲醇，控制培养温度为26℃，流加量1-6h为1ml/L.h，6h后增加至2ml/L.h，30h后甲醇流加速度增加至3ml/L.h，50h后甲醇流加速度降低至2ml/L.h，25%工业氨水调节pH6，诱导培养80h；
6）6000rpm离心10min，得到含有脂肪酶的上清液。依据国家标准GBT23535-2009，测定本实施例生产的脂肪酶酶活。测试结果为80h发酵上清中脂肪酶酶活为10700U/ml。

Claims (3)

1.一种重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶的方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母GS115接种于种子培养基中培养，再接种于发酵培养基BSM中；
2）通气搅拌发酵，发酵过程中溶氧控制在20-40%，加入氨水调节pH5-6；
3）发酵培养基甘油耗尽，补加补料培养液，维持溶氧20-35%；
4）细胞湿重达到350g/L以上，停止补加补料培养液；
5）待甘油耗尽，流加诱导培养液，流加量为1-3ml/L.h，控制培养温度为22-26℃，氨水调节pH6，诱导培养；
6）6000rpm离心10min，得到含有脂肪酶的上清液。
2.根据权利要求1所述的一种重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶的方法，其特征在于，所述的补料生长液为含12ml/LPTM1的50%甘油。
3.根据权利要求1所述的一种重组Muts型甲醇营养型毕赤酵母生产脂肪酶的方法，其特征在于，所述的诱导培养液为含12ml/LPTM1的100%甲醇。
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