CN102911701A

CN102911701A - 一种制备生物柴油的方法及其使用的复合酶

Info

Publication number: CN102911701A
Application number: CN2012104334981A
Authority: CN
Inventors: 李迅; 邓若冰; 王飞; 李治林; 时号
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2012-11-02
Filing date: 2012-11-02
Publication date: 2013-02-06

Abstract

本发明公开了一种制备生物柴油的方法及其使用的复合酶，该方法：在反应容器中，加入短链醇、油脂、水和复合酶，控温30-50℃，反应48-72h，制得生物柴油；其中，短链醇与油脂摩尔比为3~5：1，水的用量为油脂重量的40~100%，复合酶用量为4-22U/g大豆油。该方法不需要加入任何有机溶剂，对环境友好，利用重组菌表达复合酶，不需要购买商业酶，采用复合脂肪酶协同催化，克服单一脂肪酶的底物专一性，提高了酶法制备生物柴油的转酯效率，产品易于分离，且使用复合脂肪酶催化的方法，所需酶量较单一脂肪酶的酶用量减少50%以上，生物柴油中的有效成分即脂肪酸甲酯的得率为98%，从而大大降低了生产成本。具有很好工业化前景。

Description

一种制备生物柴油的方法及其使用的复合酶

技术领域

本发明属于生物酶法制备生物柴油技术领域，尤其涉及利用两种不同来源的脂肪酶复合协同催化制备生物柴油的方法及其使用的复合酶。

背景技术

化石能源是现代社会赖以生存和发展的物质基础。随着全球经济的快速发展，世界能源的消耗量也越来越大，这使得人们开始意识到缓解能源危机，寻求化石能源的替代品是一件刻不容缓的大事。生物柴油正是这样一种以动植物油脂为原料，通过酯交换工艺制备而成的可再生清洁燃料，属于生物质能之一。较传统石化柴油而言，生物柴油具有良好的燃料性能、较高的安全性能和发动机低温启动性能，且润滑性能好，可延长发动机的使用寿命，是一种真正的绿色能源，广受世界各国的高度重视。

目前工业上大多使用化学法来生产生物柴油，虽然使用化学法生产的产率较高，但存在醇消耗量大，产物难回收，环境污染大等缺点。与传统的化学法相比较，利用脂肪酶的酶法制备生物柴油具有反应条件温和，特异性强，产品易分离、对环境无污染等优势，已成为目前生物柴油制备技术的主流发展方向。

制备生物柴油的脂肪酶催化特性也存在着差异，南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B，CALB）不存在位置特异性，可以同时作用甘油三酯1,2,3位上的酯键，一般情况下，脂肪酶的活性部位被一个螺旋片段（又称“盖子”）所包住。由于脂肪酶/水界面的缔合作用，出现界面活化现象，酶的构象发生变化，酶活性中心的“盖子”结构被打开，活性部位得以暴露，使得脂肪酶与底物的结合能力增强，而CALB的一大特性就是，它的活性中心并没有被“盖子”埋藏，因此CALB对水溶性和非水溶性物质都表现出较高的催化活性，应用最为广泛。但是，天然的CALB仍然存在一定的缺陷，如热稳定性较差、水含量耐受性较差等。

米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae lipase，ROL）是一种典型的1,3位特异性脂肪酶，甘油三酯中的2位上酰基只有迁移到1或3位上才能继续被催化水解为脂肪酸，这是一个自发迁移的过程，水对酰基迁移有促进作用，因此ROL催化的转酯化反应具有较高的水含量耐受，而且对碳链长度为C8-C18的饱和脂肪酸表现出偏爱性。但是，酰基迁移的过程也影响了米根霉脂肪酶的催化效率。

除了用单一脂肪酶直接催化生产生物柴油之外，为了降低生物柴油生产成本，近年来开发出用复合脂肪酶生产生物柴油的新工艺。复合脂肪酶能有效地克服单一脂肪酶的底物专一性，提高酶法制备生物柴油的转酯化效率，特别在转酯化能力相当而位置特异性不同的脂肪酶之间表现出较强的协同效应。另外，有些报道指出，酶法制备生物柴油过程中需使用有机溶剂作为反应介质，从而促进甲醇及甘油在反映体系中的溶解，因此，选择合适的脂肪酶参与协同催化，例如使用具有很好的水含量耐受性的脂肪酶，可以构建一个高产生物柴油的无溶剂催化体系，更加增强了生物酶法的环境友好性。

然而，目前应用在生物柴油制备中的商业化固定化脂肪酶最为广泛的是诺维信公司的Novozym 435（CALB），由于其高昂的价格，每公斤2270美元，使得它的工业化应用受到限制。因此，自主研发出一种高催化活性的用于生物柴油制备的脂肪酶具有重要意义。

毕赤酵母表达系统能高效表达外源蛋白、蛋白可分泌表达而无需纯化，减少生产成本，它所具有的AOX启动子是一种强有力的启动子，而且该表达系统由于对营养要求低，培养基成分简单廉价，可进行高密度高产量的发酵培养，便于工业化生产。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种制备生物柴油的方法，使其在无有机溶剂的环境下，高效快速的制备出生物柴油。本发明的另一目的是提供一种上述方法是用的复合酶。本发明还有一个目的是提供上述复合酶的一种表达载体及重组菌。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种制备生物柴油的方法：在反应容器中，加入短链醇、油脂、水和复合酶，控温30-50℃，反应48-72h，制得生物柴油；其中，短链醇与油脂摩尔比为3~5：1，水的用量为油脂重量的40~100%，复合酶用量为4-22U/g大豆油。

所述的复合酶为南极假丝酵母脂肪酶B和米根霉脂肪酶混配而成的复合酶；其中，南极假丝酵母脂肪酶B为天然酶或重组酶，米根霉脂肪酶为天然酶或重组酶。

所述的南极假丝酵母脂肪酶B和米根霉脂肪酶的酶活配比为：4：32~1。

所述的油脂为植物油脂。

一种用于在毕赤酵母中表达的上述南极假丝酵母脂肪酶B的重组质粒pPICZαA-CALB，在pPICZαA-CALB上克隆有南极假丝酵母脂肪酶B基因。

一种用于在毕赤酵母中表达的上述米根霉脂肪酶的重组质粒pPICZαA-ROL，在pPICZαA-ROL上克隆有米根霉脂肪酶基因。

一种含有上述的重组质粒pPICZαA-CALB的毕赤酵母工程菌。

一种含有上述的重组质粒pPICZαA-ROL的毕赤酵母工程菌。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

（1）不需要加入任何有机溶剂，对环境友好，无环境污染，节约成本。

（2）利用重组菌制备复合酶，提高酶活，增加酶产量，不需要购买商业酶，有效节约成本。

（3）采用复合脂肪酶协同催化，克服单一脂肪酶的底物专一性，提高了酶法制备生物柴油的转酯效率，产品易于分离，且使用复合脂肪酶催化的方法，所需酶量较单一脂肪酶的酶用量减少50%以上，生物柴油中的有效成分即脂肪酸甲酯的得率为98%，从而大大降低了生产成本。

（4）具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益，有很好的工业化前景。

附图说明

图1是含水率对脂肪酸甲酯得率的影响结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，应理解这些方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：CALB基因的克隆，

引物：上游引物：5’-CCCGAATTCGCCACTCCTTTGGTGAAGC-3’（含EcoRI酶切位点）；下游引物：5’-CCCGGTACCTCAGGGGGTGACGATGCCGGAGCAG-3’（含KpnI酶切位点）。

PCR反应体系：1 μL Candida antarctica（NRRL No.Y-7954）基因组DNA，1 μL上游引物，1μL下游引物，25 μL Premix ExTaq，22 μL超纯水。

PCR反应条件：94℃变性10 min；94℃变性30 sec，56℃退火30 sec，72℃延伸1 min，30 Cycles；72℃延伸10 min；4℃保温。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化（BIOMIGA，上海）。

将纯化的PCR扩增产物与克隆载体pMD-19T进行连接反应，将连接液电转化入E. coli-TOP10感受态细胞中，用试剂盒（BIOMIGA，上海）小量提取质粒，1.0%琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性克隆，命名为pMD19T-CALB。将该质粒送至上海生工生物工程有限公司测序，将测序结果与NCBI上序列比对，验证序列确实为CALB基因序列。

实施例2：ROL基因的克隆，

引物：上游引物：5’-CCCGAATTCATGGTTCCTGTTTCTGGTAAATC-3’（含EcoR I酶切位点）；下游引物：5’-CCCTCTAGATTACAAACAGCTTCCTTCGT-3’（含Xba I酶切位点），PCR反应体系：1 μL R. oryzae（DSM 853）基因组DNA，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，25μL Premix ExTaq，22 μL超纯水。

PCR反应条件：94℃变性2 min；94℃变性30 sec，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，30Cycles；72℃延伸10 min；4℃保温。

将纯化的PCR扩增产物和克隆载体pMD-18T进行连接反应，将连接液电转化入E. coli-TOP10（NOVAGEN）感受态细胞中，用试剂盒（BIOMIGA，上海）小量提取质粒，1.0%琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性克隆，命名为pMD18T-ROL。将该质粒送至上海生工生物工程有限公司测序，将测序结果与NCBI上序列比对，验证序列确实为ROL的基因序列。

实施例3：构建毕赤酵母表达载体。

用已设计好的带有酶切位点的引物（同实施例1和2），以构建好的pMD19T-CALB（实施例1）、pMD18T-ROL（实施例2）重组质粒为模板，进行PCR扩增（反应体系和条件同实施例1、2），凝胶电泳检测并割胶回收PCR扩增产物。将目的基因PCR产物纯化样和载体pPICZαA（购自Invitrogen公司）分别进行双酶切（CALB所用酶切位点为EcoR I和KpnI，ROL所用酶切位点为EcoR I和Xba I）。

将酶切后的PCR产物分别和pPICZαA载体，经浓缩加入8μL无菌水重悬，加入1 μL 10×Ligase Buffer和1 μL Ligase，于16℃连接过夜。将连接液电转入E. coli-TOP10感受态细胞中，涂布于含25μg/mL Zeocin抗生素的LLB平板上，放于37℃恒温培养箱中倒置培养12-16 h，从转化平板上挑取多个单菌落，进行质粒小量提取，PCR验证正确，进而分别构建出重组质粒pPICZαA-CALB和pPICZαA-ROL。

实施例4：筛选能表达高脂肪酶活性的基因工程菌，并诱导其产脂肪酶。

分别选择经PCR验证的阳性重组子pPICZαA-CALB和pPICZαA-ROL，在含有Zeocin抗生素的LLB培养基中过夜培养，进行质粒的大量提取，选择限制性酶Sac I进行单酶切，使质粒pPICZαA-CALB和pPICZαA-ROL分别线性化后各自电击转入毕赤酵母KM71H（购自Invitrogen公司）感受态细胞中。采用橄榄油-MMH-RB活性平板及三辛酸甘油酯平板来筛选产脂肪酶活力较高的重组菌，挑选橄榄油-MMH-RB活性平板中荧光圈大的和三辛酸甘油酯平板中水解圈大的菌落作为重组毕赤酵母工程菌。按Invitrogen公司的毕赤酵母表达手册上的操作进行诱导表达，获得CALB和ROL，无需纯化，可直接使用。

实施例5：表达产物的鉴定

酶活测定方法：以pNPC（p-nitrophenyl caprylate）为底物的分光光度法测定脂肪酶酶活，以13.5 mmol/L的p-NPC为底物，850 μL0.05 mol/L Tris-HCL pH 7.5缓冲液与100 μL酶液，40℃恒温水浴摇床保温5 min，加入50 μL底物溶液，40℃恒温水浴摇床准确反应5 min（150 r/min），将反应液离心后，取上清于410 nm处测定吸光值。将对硝基苯酚稀释成适当浓度做标准曲线。酶活力单位定义为：在pH 8.0、40℃条件下，每min水解底物释放1 μmol对硝基苯酚所需要的酶量为1个脂肪酶活力单位。

实施例6

将摩尔比为1：1的甲醇和大豆油（大豆油5 g和甲醇0.18 g），100U的ROL（实施例4表达），相对于大豆油重量100%的水，装入具塞三角瓶中混合均匀，并置于40℃的往复摇床中，分别在12 h、24 h、3 6h加入0.18 g甲醇，即总的醇油摩尔比为4：1。经72 h后，生物柴油中的有效成分即脂肪酸甲酯的得率（以内标法计算甲酯得率，内标为十七烷酸甲酯）为91%。

实施例7

将摩尔比为1：1的甲醇和大豆油（大豆油5 g和甲醇0.18 g），50U的复合重组脂肪酶（实施例4表达，CALB与ROL的酶活配比为7：3），相对于大豆油重量100%的水，装入具塞三角瓶中混合均匀，并置于40℃的往复摇床中，分别在12 h、24 h、36 h加入0.18 g甲醇，即总的醇油摩尔比为4：1。经72 h后，生物柴油中的有效成分即脂肪酸甲酯的得率为91%。

实施例8

将摩尔比为1：1的甲醇和大豆油（大豆油5g和甲醇0.18 g），60 U的复合重组脂肪酶（实施例4表达，CALB与ROL的酶活配比为5：5），相对于大豆油重量100%的水，装入具塞三角瓶中混合均匀，并置于40℃的往复摇床中，分别在12 h、24 h、36 h加入0.18 g甲醇，即总的醇油摩尔比为4：1。经72 h后，生物柴油中的有效成分即脂肪酸甲酯的得率为92%。

实施例9

将摩尔比为1：1的甲醇和大豆油（大豆油5 g和甲醇0.18 g），50U的复合重组脂肪酶（实施例4表达，CALB与ROL的酶活配比为3：7），相对于大豆油重量100%的水，装入具塞三角瓶中混合均匀，并置于40℃的往复摇床中，分别在12 h、24 h、36 h加入0.18 g甲醇，即总的醇油摩尔比为4：1。经72 h后，生物柴油中的有效成分即脂肪酸甲酯的得率为84%。

实施例10

方法同实施例7，其中水的体积分别为油重的100%、80%、60%、40%，进行试验，结果如图1所示，显示60%的水含量脂肪酸甲酯得率高达98%。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种制备生物柴油的方法及其使用的复合酶

<130> 100

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 克隆CALB基因的上游引物序列

<400> 1

cccgaattcg ccactccttt ggtgaagc 28

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 克隆CALB基因的下游引物序列

<400> 2

cccggtacct cagggggtga cgatgccgga gcag 34

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 克隆ROL基因的上游引物序列

<400> 3

cccgaattca tggttcctgt ttctggtaaa tc 32

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 克隆rol基因的下游引物序列

<400> 4

ccctctagat tacaaacagc ttccttcgt 29

Claims

1.一种制备生物柴油的方法，其特征在于：在反应容器中，加入短链醇、油脂、水和复合酶，控温30-50℃，反应48-72 h，制得生物柴油；其中，短链醇与油脂摩尔比为3~5：1，水的用量为油脂重量的40~100%，复合酶用量为4-22 U/g大豆油。

2.根据权利要求1所述的制备生物柴油的方法，其特征在于：所述的复合酶为南极假丝酵母脂肪酶B和米根霉脂肪酶混配而成的复合酶；其中，南极假丝酵母脂肪酶B为天然酶或重组酶，米根霉脂肪酶为天然酶或重组酶。

3.根据权利要求2所述的制备生物柴油的方法，其特征在于：所述的南极假丝酵母脂肪酶B和米根霉脂肪酶的酶活配比为：4：32~1。

4.根据权利要求1所述的制备生物柴油的方法，其特征在于：所述的油脂为植物油脂。

5.一种用于在毕赤酵母中表达的权利要求2所述的南极假丝酵母脂肪酶B的重组质粒pPICZαA-CALB，在pPICZαA-CALB上克隆有南极假丝酵母脂肪酶B基因。

6.一种用于在毕赤酵母中表达的权利要求2所述的米根霉脂肪酶的重组质粒pPICZαA-ROL，在pPICZαA-ROL上克隆有米根霉脂肪酶基因。

7.一种含有权利要求5所述的重组质粒pPICZαA-CALB的毕赤酵母工程菌。

8.一种含有权利要求6所述的重组质粒pPICZαA-ROL的毕赤酵母工程菌。