CN105087686B - 通过脂肪酶催化制备生物柴油的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备生物柴油的方法，先将脂肪酶组合和多元醇进行调配，用缓冲液调节体系pH值至3‑7，进行高速剪切处理，得到预处理的脂肪酶液，然后再用于催化油脂原料制备生物柴油的反应，特别适用于催化高酸价高熔点油脂原料制备生物柴油的反应。本发明还涉及提高液体脂肪酶催化活性的方法，其中液体脂肪酶的催化活性和使用寿命明显改善。
Description
技术领域
本发明涉及制备生物柴油的方法，特别涉及通过脂肪酶催化制备生物柴油的方法。本发明还涉及提高脂肪酶催化活性的方法。
背景技术
生物柴油，一般是指由动植物油脂等原料通过转酯化或酯化反应生成的长链脂肪酸酯类物质。面对日益严重的环境污染和能源危机，生物柴油作为一种新型无污染可再生能源，受到了广泛的关注和研究。然而，目前生物柴油的生产成本远远高于石化柴油，究其原因，生物柴油的生产原料主要来源于游离脂肪酸酸含量低的食用级植物精炼油脂如大豆油、棕榈油，菜籽油等，成本较高，而一些价格非常低廉的地沟油、植物油精炼馏出物和煎炸废油等油脂的游离脂肪酸酸含量高，因会与碱形成大量的皂而不能直接应用于传统的碱催化制备生物柴油工艺。工业上，往往对游离脂肪酸酸含量高的油脂进行两步法处理：首先在硫酸催化作用下游离酸与甲醇进行酯化反应，然后再用碱催化剩余的甘油酯进行转酯化反应。该法由于硫酸等催化剂的使用，会造成反应设备等的腐蚀以及大量污水的产生等诸多问题，从长远来看，不符合经济和环境可持续发展的要求。
生物酶法催化制备生物柴油，反应条件温和，对环境无污染，更为重要的是，对油脂原料中游离脂肪酸和水分的含量没有特殊要求，逐步受到人们的重视。目前用于酶促反应的脂肪酶主要分为固定化酶和游离酶两种形式，其中以固定化酶用于生物柴油反应研究最为广泛。但固定化酶成本高，风险大，一旦失活，载体难以重复利用而造成固体污染。游离脂肪酶价格便宜，有利于降低酶法制备生物柴油成本，但甲醇等醇类对液体酶具有很强的失活作用，作用底物单一，不易分离，同时液体酶热稳定性差，反应温度高于50℃时，酶蛋白容易变性失活，不适合催化高熔点油脂原料制备生物柴油，因此，利用游离脂肪酶催化制备生物柴油受到一定限制。
现有技术缺乏一种催化效率高、使用寿命长或热稳定性好的脂肪酶催化方法来用于生物柴油的制备。
发明内容
第一方面，本申请提供了一种制备生物柴油的方法，其包括以下步骤：
a)将脂肪酶组合添加到多元醇中，调节pH至3-7，进行高速剪切处理，得到预处理的脂肪酶液；
b)将步骤a)中得到的脂肪酶液与油脂原料和低级醇接触，进行反应。
优选地，上述制备生物柴油的方法还包括步骤c)：在步骤b)所述的反应结束后，使水酯两相分离，移除上层酯相后，向下层水相加入新的油脂原料进行反应。
在一实施方案中，本发明的多元醇为甘油、1,3丙二醇、1,4丁二醇或乙二醇，优选为甘油。
在优选的实施方案中，步骤a)中的脂肪酶和多元醇的重量比为1:4-1:20。
在一实施方案中，上述方法步骤a)中的脂肪酶为多种，优选为两种脂肪酶的组合，优选地，所述两种脂肪酶的组合为催化酯化反应的脂肪酶和催化转酯反应的脂肪酶的组合。在优选的实施方案中，催化酯化反应的脂肪酶和催化转酯反应的脂肪酶的重量比为1:10-10:1。
在优选的实施方案中，脂肪酶来自产生脂肪酶的微生物，优选地，所述微生物可以是黑曲霉菌(Aspergillus niger)、南极假丝酵母(Candida antarctic)、褶皱假丝酵母(Candida rugosa)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)或假单胞菌属(Pseudononas sp.)等。
在另一实施方案中，本发明得到的预处理脂肪酶液的pH为3.5-6.6。如果预处理脂肪酶液含有两种脂肪酶，其pH优选地介于所述两种脂肪酶的等电点之间。
在一实施方案中，与油脂原料反应的低级醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇，优选为甲醇或乙醇。
在另一实施方案中，油脂原料在与低级醇反应前预热，优选预热至55-75℃，即反应温度可达55-75℃。
优选地，本发明所利用的油脂原料的酸价大于10mgKOH/g。油脂原料可以为例如棕榈油脂肪酸馏出物(PFAD)、大豆油脱臭馏出物(SODD)、酸化油、地沟油、煎炸废油或其它动植物油脂等。
另一方面，本申请提供了由上述方法制备的生物柴油。
再一方面，提供了由本发明制备的生物柴油在制备环保燃料、润滑剂、工业溶剂、增塑剂等中的用途。
另一方面，本申请提供了一种提高脂肪酶催化活性的方法，其包括在催化反应前将脂肪酶添加到多元醇中，并调节pH至3-7，优选为3.5-6.6，其中多元醇优选为甘油，脂肪酶优选为来自产生脂肪酶的微生物。在优选的实施方案中，预先将脂肪酶组合添加到多元醇中，调节pH至3-7后，进行高速剪切处理。
再一方面，提供了一种脂肪酶液，其特征在于包含脂肪酶以及多元醇，且pH值为3-7，其中脂肪酶与多元醇的重量比优选为1:4-1:20，以及多元醇优选为甘油。在一些实施方案中，在本发明提供的制备生物柴油的方法中，脂肪酶的催化活性、使用寿命得到明显改善。在一些实施方案中，本发明提高了脂肪酶的热稳定性，使其适合催化高熔点油脂原料如棕榈油脂肪酸馏出物(PFAD)等来制备生物柴油。
具体实施方式
本申请提供了制备生物柴油的新方法，其包括以下步骤：a)将一种或多种脂肪酶添加到多元醇中，调节pH至3-7，混合均匀，得到预处理的脂肪酶液；以及b)将步骤a)中得到的脂肪酶液与油脂原料和低级醇接触，进行反应。任选地，上述方法还包括步骤c)：在步骤b)所述的反应结束后，使水酯两相分离，移除上层酯相后，下层水相无需任何处理，直接加入新的油脂原料进行反应。
在优选的实施方案中，本发明制备生物柴油的方法包括a)将脂肪酶组合添加到多元醇中，调节pH至3.5-6.6后，进行高速剪切处理，得到预处理的脂肪酶液；以及b)将步骤a)中得到的脂肪酶液加入到油脂原料中，加入低级醇进行反应。
本发明所述的“多元醇”是指具有两个以上羟基的醇，包括但不限于甘油、1,3丙二醇、1,4丁二醇、乙二醇、三羟甲基乙烷、季戊四醇、三羟甲基丙烷(TMP)、乳糖醇、半乳糖醇、甘露醇、肌醇等。在优选的技术方案中，使用的多元醇选自甘油、1,3丙二醇、1,4丁二醇和乙二醇，或其任意组合。更优选地，所述多元醇为甘油。
本发明所述的“脂肪酶”是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应。本发明所用的脂肪酶可以为液体脂肪酶、脂肪酶粉末或脂肪酶发酵液。脂肪酶广泛存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽等；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源。因此，优选地，脂肪酶来自产生脂肪酶的微生物。例如，所述微生物可以是黑曲霉菌(Aspergillus niger)、南极假丝酵母(Candida antarctic)、褶皱假丝酵母(Candida rugosa)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)或假单胞菌属(Pseudononas sp.)等。
本发明所述的“脂肪酶组合”是指两种或两种以上脂肪酶的组合。优选地，所述脂肪酶为液体脂肪酶。
在优选的实施方案中，在上述方法的步骤a)中得到的预处理脂肪酶液中含有两种脂肪酶，优选地，这两种酶分别为主要催化酯化反应的脂肪酶以及主要催化转酯反应的脂肪酶。
优选地，催化酯化反应的脂肪酶(下文称为酯化酶)为南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarcticlipase B,CALB)、假丝酵母脂肪酶A(CALA)、柱状假丝酵母(Candidacylindracea)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)和黑曲霉(Aspergillus niger)等；催化转酯反应的脂肪酶(下文称为转酯酶)选自疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyceslanuginosus lipase,TLL)、假单胞菌脂肪酶(PSL)、米黑根毛霉脂肪酶(RML)、德氏根酶(Rhizopus delemar)、米根霉(Rhizopus oryzae)和米曲霉(Aspergillus oryzea)等。
在一些实施方案中，基于油脂酸价(Acid value，缩写为AV，其是指油脂中所含游离脂肪酸的量，用中和1g油脂所需的KOH的毫克数来表示)的不同，酯化酶和转酯酶的重量比可以在1:10-10:1的范围内变动。例如，油脂原料AV为10-80mgKOH/g时，酯化酶和转酯酶的比例为1:10-1:1；油脂原料AV为80-120mgKOH/g时，酯化酶和转酯酶的比例为1:1-5:1；油脂原料AV为120-195mg KOH/g时，酯化酶和转酯酶的复合比例为5:1-10:1。
在一些实施方案中，所述的“低级醇”包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇等。在优选的实施方案中，使用的低级醇选自甲醇或乙醇，优选为甲醇。
在一些实施方案中，所述的“油脂原料”包括植物油脂、动物油脂、微生物油脂、化工废弃油脂、废弃食用油脂等。例如，油脂原料可以选自棕榈油脂肪酸馏出物(PFAD)、大豆油脱臭馏出物(SODD)、酸化油、地沟油、煎炸废油及其它动植物油脂等。在优选的实施方案中，油脂原料的酸价大于10mgKOH/g。
在一实施方案中，油脂原料在与低级醇反应前预热，优选预热至55-75℃，即反应温度可达55-75℃，这有利于脂肪酶对高熔点油脂如PFAD进行催化反应以制备生物柴油。
本发明用来调节体系pH的缓冲液可以选自但不限于以下的种类：磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液和乙酸-乙酸钠缓冲液等。
在优选的实施方案中，预处理的脂肪酶液的pH为3.5-6.6。在更优选的实施方案中，预处理的脂肪酶液的pH为4.5-6。如果上述脂肪酶液中含有两种脂肪酶，则pH被调节介于所述两种脂肪酶的等电点之间。
在一具体的实施方案中，在对脂肪酶进行预处理前，先取少量油脂原料进行AV测定，折算出油脂原料中游离脂肪酸含量的大致范围；然后根据游离脂肪酸含量，对分别具有酯化活性(下文称为酯化酶)和转酯化活性(下文称为转酯酶)的两种液体酶进行组合，并调整两种酶的组合比例。然后按照一定比例，将脂肪酶液添加至甘油中。优选地，所述比例为待处理的脂肪酶液组合：甘油的重量比＝1:4-1:20。
在优选的实施方案中，将脂肪酶液添加至甘油中并调节体系pH为3-7后，进行高速剪切处理。
在另一具体实施方案中，将油脂原料，特别是脂肪酸含量高的油脂原料加入到反应器中，预热至55-75℃，然后加入预处理的脂肪酶液，优选是含有酯化酶和转酯酶两种脂肪酶的酶液，搅拌均匀后，将甲(乙)醇分批次加入或流加到反应器，反应4-24h。反应结束后停止搅拌，使甲酯-水两相分离，移除上层甲酯相后，下层水相无需任何处理，直接重新加入原料进行批次反应。在优选的实施方案中，静止反应液至水酯两相分离。可选地，还可以利用本领域已知的其他分离方法使水酯两相分离，例如离心等。
另一方面，提供了提高脂肪酶催化活性的方法，其包括在催化反应前将脂肪酶、优选为脂肪酶组合添加到多元醇中，并调节pH至3-7，进行高速剪切处理，其中所述多元醇优选为甘油，所述pH优选为3.5-6.6，更优选为4.5-6。
本发明人通过用上述方法预处理脂肪酶，然后用于催化油脂原料和低级醇反应制备生物柴油，发现了以下至少一种意想不到的效果：脂肪酶在高达55℃-75℃的温度范围内罕见地表现出较强的催化反应活性；液体酶的耐热性和耐低级醇能力得到明显增强，可以重复使用多次；本发明还解决了液体酶因耐热性差而不适合催化高熔点脂肪原料制备生物柴油的问题。
另一方面，提供了一种脂肪酶液，其特征在于包含脂肪酶、优选为脂肪酶组合以及溶解脂肪酶的多元醇，且pH值为3-7。
在具体实施方案中，脂肪酶组合与多元醇的重量比为1:4-1:20，以及多元醇优选为甘油。
在优选实施方案中，脂肪酶组合为两种脂肪酶的组合，优选地，这两种酶分别为酯化酶和转酯酶。
另一方面，提供了由上述方法制备的生物柴油。
再一方面，提供了由本发明制备的生物柴油在制备环保燃料、润滑剂、工业溶剂、增塑剂等中的用途。
本发明的生物柴油与传统的石化能源相比，具有硫和芳烃含量低、闪点高、十六烷值高、具有良好的润滑性，且可被生物降解、对环境无害等诸多优点，可以添加到石化柴油中制备环保染料。由于生物柴油具有较好的润滑和溶解能力，可直接用作润滑剂(石油柴油润滑剂添加剂)，以及工业溶剂(主要用来溶解油脂、蜡或树脂等)。此外，将脂肪酸甲酯(生物柴油主要组成成分)环氧化所得的环氧脂肪酸甲酯还可以用作增塑剂，以提高塑料产品质量。
应该理解，在本发明的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
上述公开内容总体上描述了本发明，通过下面的实施例进一步示例本发明。描述这些实施例仅为说明本发明，而不是限制本发明的范围。尽管本文中使用了特殊的术语和值，这些术语和值同样被理解为示例性的，并不限定本发明的范围。除非特别指明，本说明书中的实验方法和技术为本领域技术人员所公知的方法和技术。
实施例
下述实施例中，油脂AV的测定是按照动植物油脂酸值和酸度测定的国家标准GB/T5530-2005中的方法进行的。
生物柴油得率测定的方法如下：反应结束静置分层后，取1.5mg上层反应产物，加入0.3ml浓度为0.7mg/L的十七烷酸甲酯(正己烷为溶剂)作为内标物，混合均匀后用于气相色谱分析。气相色谱分析的实验条件参照动植物油脂脂肪酸甲脂的气相色谱分析的国家标准GB/T17377-2008。
实施例1：脂肪酶催化煎炸废油和甲醇制备生物柴油
取煎炸废油样品测定AV为16mgKOH/g。
取液体酶CALB(购自诺维信公司)0.2g和TLL(购自诺维信公司)1.8g置于小烧杯中，加入8g甘油，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液调节pH值至6，用高速剪切机以5000r/min的速度剪切60s，以将上述复合酶液混合均匀。
取200g煎炸废油加入到反应瓶中，预热至55℃，加入上述复合酶液，以250min/s的速率进行机械搅拌，将35mL甲醇3小时内分7次加入反应瓶中，反应12小时，生物柴油得率为98.4％。
反应结束后停止搅拌，静置至甲酯-水两相分离，移除上层甲酯相后，下层水相无需任何处理，直接重新加入原料进行批次反应，方法同前。
如表1中的CALB+TLL预处理组所示，脂肪酶重复使用了25次，生物柴油的平均得率为98.4％，最高得率达到了99％。
比较实施例1-1
实验条件与实施例1相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALB。测试结果如表1中的CALB组所示。
比较实施例1-2
实验条件与实施例1相同，除了脂肪酶是未经过预处理的TLL。
测试结果如表1中的TLL组所示。
比较实施例1-3
实验条件与实施例1相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALB与TLL组合。
测试结果如表1中的CALB+TLL组所示。
比较实施例1-4
实验条件与实施例1相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALB
与TLL组合，以及将甘油添加在反应底物煎炸废油中。
测试结果如表1中的CALB+TLL+(甘油)组所示。
比较实施例1-5
实验条件与实施例1相同，除了没有用缓冲液调节脂肪酶液的PH值外。
测试结果如表1中的CALB+TLL+甘油(体系pH为7.1)组所示。
比较实施例1-6
实验条件与实施例1相同，除了没有预先将脂肪酶液添加至甘油中。
测试结果如表1中的CALB+TLL+缓冲液(体系pH为5.0)组所示。
比较实施例1-7
实验条件与实施例1相同，除了没有将酶液进行高速剪切处理外。
测试结果如表1中的CALB+TLL+甘油+缓冲液(体系pH为6.0)组。
比较实施例1-8
实验条件与实施例1相同，除了酶液只使用CALB。
测试结果如表1中的CALB预处理组。
比较实施例1-9
实验条件与实施例1相同，除了酶液只使用TLL。
测试结果如表1中的TLL预处理组。
表1相同反应条件下液体酶数据对比
注：①生物柴油最高得率，指延长反应时间至最终反应平衡时的产物得率。该值为第一批次使用时，延长反应时间至最终反应平衡时的所得结果。
由表1的对比结果可知，液体脂肪酶组合用本发明的方法预处理后，催化反应活性显著增强，生物柴油得率在98％以上；耐热性和耐甲醇的能力明显提高，重复使用次数明显提高，可达25次，之后液体脂肪酶才逐渐失去活性；而其它组中的液体脂肪酶在最多使用15次后，已基本失去催化活性，无法继续使用。
实施例2：酶催化地沟油和甲醇制备生物柴油
取地沟油样品测定AV为77.3mgKOH/g。
取液体酶CALA(购自诺维信公司)1g和TLL(购自诺维信公司)1g置于小烧杯中，加入20g甘油，用磷酸二氢钾–氢氧化钠缓冲液调节pH值至5.8，用高速剪切机以4500r/min剪切100s，以将上述复合酶液混合均匀。
取200g地沟油加入到反应瓶中，预热至55℃，加入上述复合酶液，以250min/s的速率进行机械搅拌，将35mL甲醇3小时内分7次加入反应瓶中，反应10小时，生物柴油得率为98.6％。
反应结束后停止搅拌，静置至甲酯-水两相分离，移除上层甲酯相后，下层水相无需任何处理，直接重新加入原料进行批次反应。
如表2中的CALA+TLL+甘油预处理组所示，脂肪酶重复使用了18次，生物柴油的平均得率为98.6％。
比较实施例2-1
实验条件与实施例2相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALA。
测试结果如表2中的CALA组所示。比较实施例2-2
实验条件与实施例2相同，除了脂肪酶是未经过预处理的TLL。
测试结果如表2中的TLL组所示。
比较实施例2-3
实验条件与实施例2相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALA与TLL组合。
测试结果如表2中的CALA+TLL组所示。
实施例3
实验条件与实施例2相同，除了调配酶液使用的多元醇为1,3-丙二醇。
测试结果如表2中的CALA+TLL+1,3-丙二醇预处理组所示，脂肪酶重复使用了15次，生物柴油的平均得率为94.2％。
实施例4
实验条件与实施例2相同，除了调配酶液使用的多元醇为1,4-丁二醇。
测试结果如表2中的CALA+TLL+1,4-丁二醇预处理组所示，脂肪酶重复使用了15次，生物柴油的平均得率为95.1％。
实施例5
实验条件与实施例2相同，除了调配酶液使用的多元醇为乙二醇。
测试结果如表2中的CALA+TLL+乙二醇预处理组所示，脂肪酶重复使用了16次，生物柴油的平均得率达到了96.7％。
表2相同反应条件下液体酶的数据对比
实施例6：酶催化酸化油和甲醇制备生物柴油
取酸化油样品测定AV为132mgKOH/g。
取液体酶CALB(购自诺维信公司)1.2g和PSL(购自日本天野公司)0.6g置于小烧杯中，加入120g甘油，用乙酸–乙酸钠缓冲液调节pH值至4.5，用高速剪切机以4000r/min剪切120s，以将上述复合酶液混合均匀。
取200g酸化油加入到反应瓶中，预热至58℃，加入上述复合酶液，以250min/s的速率进行机械搅拌，将35mL甲醇3小时内分7次加入反应瓶中，反应6小时，生物柴油得率为98％。反应结束后停止搅拌，静置至甲酯-水两相分离，移除上层甲酯相后，下层水相无需任何处理，直接重新加入原料进行批次反应。
如表3中的CALB+PSL预处理组所示，脂肪酶重复使用了15次，生物柴油的平均得率达到了98％。
比较实施例6-1
实验条件与实施例6相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALB。
测试结果如表3中的CALB组所示。
比较实施例6-2
实验条件与实施例6相同，除了脂肪酶是未经过预处理的PSL。
测试结果如表3中的PSL组所示。
比较实施例6-3
实验条件与实施例6相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALB与PSL组合。
测试结果如表3中的CALB+PSL组所示。
表3相同反应条件下液体酶数据对比
实施例7：酶催化PFAD和甲醇制备生物柴油
取PFAD样品测定AV为184mgKOH/g。
取液体酶CALA(购自诺维信公司)2g和PSL(购自日本天野公司)0.2g置于小烧杯中，加入20g甘油，用柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液调节pH值至5.3，用高速剪切机以3500r/min剪切120s，以将上述复合酶液混合均匀。
取200g PFAD加入到反应瓶中，预热至60℃，加入上述复合酶液，以250min/s的速率进行机械搅拌，将35mL甲醇3小时内分7次加入反应瓶中，反应4小时，生物柴油得率为99％。反应结束后停止搅拌，静置至甲酯-水两相分离，移除上层甲酯相后，下层水相无需任何处理，直接重新加入原料进行批次反应。如表4中的CALA+PSL预处理组所示，生物柴油的平均得率达到了99％，脂肪酶重复使用了30次。
比较实施例7-1
实验条件与实施例7相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALA。
测试结果如表4中的CALA组所示。
比较实施例7-2
实验条件与实施例7相同，除了脂肪酶是未经过预处理的PSL。
测试结果如表4中的PSL组所示。
比较实施例7-3
实验条件与实施例7相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALA与PSL组合。
测试结果如表4中的CALA+PSL组所示。
表4相同反应条件下液体酶数据对比
实施例8：酶催化煎炸油和乙醇制备生物柴油
取煎炸废油样品测定AV为16mgKOH/g。
取液体酶CALA(购自诺维信公司)0.4g和RML(购自诺维信公司)1.6g置于小烧杯中，加入12g甘油，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调节pH值至5.6，用高速剪切机以4000r/min剪切60s，以将上述复合酶液混合均匀。
取200g煎炸废油加入到反应瓶中，预热至65℃，加入上述复合酶液，以250min/s的速率进行机械搅拌，将50mL乙醇3小时内分7次加入反应瓶中，反应时间为12小时，生物柴油得率为99％。反应结束后停止搅拌，静置至乙酯-水两相分离，移除上层乙酯相后，下层水相无需任何处理，直接重新加入原料进行批次反应。
如表5中的CALA+RML预处理组所示，生物柴油的平均得率为99％，在反应温度为65℃的条件下，脂肪酶重复使用了26次。
比较实施例8-1
实验条件与实施例8相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALA。
测试结果如表5中的CALA组所示。
比较实施例8-2
实验条件与实施例8相同，除了脂肪酶是未经过预处理的RML。
测试结果如表5中的RML组所示。
比较实施例8-3
实验条件与实施例8相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALA与RML组合。
测试结果如表5中的CALA+RML组所示。
表5相同反应条件下液体酶的数据对比
实施例9：酶催化PFAD和乙醇制备生物柴油
取PFAD样品测定AV为195mgKOH/g。
取液体酶CALB(购自诺维信公司)1.8g和RML(购自诺维信公司)0.2g置于小烧杯中，加入30g甘油，用磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液缓冲液调节pH值至4.8，用高速剪切机以3000r/min剪切120s，以将上述复合酶液混合均匀。
取200g PFAD加入到反应瓶中，预热至70℃，加入上述复合酶液，以250min/s的速率进行机械搅拌，将50mL乙醇3小时内分7次加入反应瓶中，反应时间为4小时，生物柴油得率为99％。反应结束后停止搅拌，静置至乙酯-水两相分离，移除上层乙酯相后，下层水相无需任何处理，直接重新加入原料进行批次反应。
如表6中的CALB+RML预处理组所示，生物柴油的平均得率为99％，在反应温度为70℃的条件下，脂肪酶重复使用次数达到了30次。
比较实施例9-1
实验条件与实施例9相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALB，测试结果如表6中的CALB组所示。比较实施例9-2
实验条件与实施例9相同，除了脂肪酶是未经过预处理的RML，测试结果如表6中的RML组所示。
比较实施例9-3
实验条件与实施例9相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALB
与PML组合，测试结果如表6中的CALB+RML组所示。
表6相同反应条件下液体酶数据对比
实施例10：酶催化地沟油和乙醇制备生物柴油
取地沟油样品测定AV为77.3mgKOH/g。
取液体酶CALB(购自诺维信公司)0.6g和TLL(购自诺维信公司)1.4g置于小烧杯中，加入40g甘油，用磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液调节pH值至6.6，用高速剪切机以3800r/min速率剪切120s，以将上述复合酶液混合均匀。
取200g地沟油加入到反应瓶中，预热至55℃，加入上述复合酶液，以250min/s的速率进行机械搅拌，将35mL乙醇3小时内分7次加入反应瓶中，反应16小时，生物柴油得率为71.3％。
反应结束后停止搅拌，静置至乙酯-水两相分离，移除上层乙酯相后，下层水相无需任何处理，直接重新加入原料进行批次反应。
如表7中的CALB+TLL预处理组所示，脂肪酶重复使用了11次，生物柴油的平均得率为71.3％。
比较实施例10-1
实验条件与实施例10相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALB。
测试结果如表7中的CALB组所示。
比较实施例10-2
实验条件与实施例10相同，除了脂肪酶是未经过预处理的TLL。
测试结果如表7中的TLL组所示。
比较实施例10-3
实验条件与实施例10相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALB与TLL组合。
测试结果如表7中的CALB+TLL组所示。
表7相同反应条件下液体酶的数据对比
实施例11：酶催化SODD和甲醇制备生物柴油
取SODD样品测定AV为144mgKOH/g。
取液体酶CALB(购自诺维信公司)1.4g和PSL(购自日本天野公司)0.6g置于小烧杯中，加入100g甘油，用柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液调节pH值至3.5，用高速剪切机以3500r/min速率剪切120s，以将上述复合酶液混合均匀。
取200g SODD加入到反应瓶中，预热至65℃，加入上述复合酶液，以250min/s的速率进行机械搅拌，将35mL甲醇3小时内分7次加入反应瓶中，反应14小时，生物柴油得率为58％。反应结束后停止搅拌，静置至乙酯-水两相分离，移除上层甲酯相后，下层水相无需任何处理，直接重新加入原料进行批次反应。
如表8中的CALB+PSL预处理组所示，脂肪酶重复使用了9次，生物柴油的平均得率为58％。
比较实施例11-1
实验条件与实施例11相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALB。
测试结果如表8中的CALB组所示。
比较实施例11-2
实验条件与实施例11相同，除了脂肪酶是未经过预处理的PSL。
测试结果如表8中的PSL组所示。
比较实施例11-3
实验条件与实施例11相同，除了脂肪酶是未经过预处理的CALB与PSL组合。
测试结果如表8中的CALB+PSL组所示。
表8相同反应条件下液体酶数据对比
通过以上的实施例和比较实施例的结果可知，本发明预先将脂肪酶液添加到多元醇例如甘油、1,3丙二醇、1,4丁二醇和乙二醇中调节pH值至3.5-6.6，通过高速剪切处理混合均匀，然后再用于催化油脂原料，特别是游离脂肪酸含量高的油脂与低级醇，优选与甲或乙醇反应制备生物柴油，取得了本领域技术人员预想不到的以下至少一种有益技术效果：
(1)脂肪酶液在55℃-75℃范围内罕见地表现出较强的催化反应活性，同时反应时间大大缩短。例如，实施例7和9所示，在反应时间仅为仅为4小时的情况下，生物柴油平均得率高达99％。再如实施例8或9所述，在反应温度高达65℃或70℃的情况下，脂肪酶催化制备生物柴油的得率高达99％。
(2)液体酶的耐热性和耐甲(乙)醇能力得到明显增强，重复使用高达30次。如实施例7及表4所示，在反应温度高达60℃的情况下，液体酶重复使用次数达到了30次。在反应温度高达70℃时，脂肪酶仍能重复使用30次，如实施例9及表6所示。
(3)解决了液体酶因耐热性差而不适合催化高熔点脂肪材料如PFAD等制备生物柴油的问题。
与现有液体酶制备生物柴油技术相比，本方法反应效率明显提高，达到90％以上转化率的反应时间明显缩短，脂肪酶的重复使用次数显著增加；与现有固定化酶制备生物柴油技术相比，本方法的生物柴油得率可以与之等同，而成本仅为固定化酶方法的1/10左右。因此，本方法具有很好的工业应用化前景。
可以理解，尽管本发明以某种形式被说明，但本发明并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出各种变化。这些变化都在本发明要求保护的范围内。
Claims (16)
1.制备生物柴油的方法，包括以下步骤：
a)将催化酯化反应的脂肪酶和催化转酯反应的脂肪酶的组合添加到多元醇中，调节pH至3-7，进行高速剪切处理，从而得到预处理的脂肪酶液；
b)将步骤a)中得到的脂肪酶液与油脂原料和低级醇接触，进行反应；
其中
所述多元醇选自甘油、1,3丙二醇、1,4丁二醇和乙二醇或者其任意组合；
所述油脂原料选自棕榈油脂肪酸馏出物、大豆油脱臭馏出物、酸化油、地沟油和煎炸废油或者其任意组合。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述催化酯化反应的脂肪酶和催化转酯反应的脂肪酶的组合和多元醇的重量比为1:4-1:20。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述pH为3.5-6.6。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)还包括将所述油脂原料预热。
5.如权利要求4所述的方法，其中将所述油脂原料预热至55℃-75℃。
6.如权利要求1所述的方法，其还包括步骤c)：步骤b)所述的反应结束后，使水酯两相分离，移除上层酯相后，向下层水相加入新的油脂原料进行反应。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述多元醇为甘油。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述催化酯化反应的脂肪酶和所述催化转酯反应的脂肪酶的重量比为1:10-10:1。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述脂肪酶来自脂肪酶产生菌。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述脂肪酶产生菌选自以下微生物：黑曲霉菌(Aspergillus niger)、南极假丝酵母(Candida antarctic)、褶皱假丝酵母(Candidarugosa)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)和假单胞菌属(Pseudononas sp.)。
11.如权利要求1-10任一项所述的方法，其中所述低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇或者其任意组合。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述低级醇为甲醇或乙醇。
13.提高脂肪酶组合催化活性的方法，其包括在催化反应前将催化酯化反应的脂肪酶和催化转酯反应的脂肪酶的组合添加到多元醇中，并调节pH至3-7，以及进行高速剪切处理；
其中所述多元醇选自甘油、1,3丙二醇、1,4丁二醇和乙二醇或者其任意组合。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述pH为3.5-6.6。
15.脂肪酶液，其特征在于包含催化酯化反应的脂肪酶和催化转酯反应的脂肪酶的组合以及多元醇，且pH值为3-7；
其中所述多元醇选自甘油、1,3丙二醇、1,4丁二醇和乙二醇或者其任意组合。
16.如权利要求15所述的脂肪酶液，其中所述催化酯化反应的脂肪酶和催化转酯反应的脂肪酶的组合与多元醇的重量比选自1:4-1:20。
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