CN102272317A - 脂肪酸乙酯的酶法产生 - Google Patents

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CN102272317A CN2009801530708A CN200980153070A CN102272317A CN 102272317 A CN102272317 A CN 102272317A CN 2009801530708 A CN2009801530708 A CN 2009801530708A CN 200980153070 A CN200980153070 A CN 200980153070A CN 102272317 A CN102272317 A CN 102272317A
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Abstract

本发明涉及一种产生脂肪酸乙酯的方法，包括：a)将包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游离脂肪酸或其任意组合的底物与至少一种固定化的脂肪分解酶反应以提供反应混合物，其中酶加载量相对于底物为30％w/w以下，而乙醇对脂肪酸的摩尔比例(EtOH∶FA)为至少3.0当量；b)从所得的反应混合物分离固定化的脂肪分解酶；和c)对固定化的脂肪分解酶不经修饰直接进行至少另一次反应。

Description

脂肪酸乙酯的酶法产生
发明背景
技术领域
本发明涉及酶法产生脂肪酸乙酯。本发明具体而言涉及脂肪酸乙酯合成中再使用的固定化的酶的活性以及过量乙醇对酶活性的作用。
相关技术的描述
用于生物柴油的油类和脂肪的酶法加工在技术上是可行的。通过酶法生物转化产生的生物柴油与化学转化相比，更加环境友好并因此更加合意。然而除了少数例外，目前酶技术并未用于商业规模的生物柴油生产。这主要是由于未优化的工艺设计，以及缺乏可用的划算的酶。再使用酶的技术对于使得工艺具有竞争性而言通常被证明是不够充分的。
脂肪酶催化甘油三酯底物与醇如甲醇(MeOH)和乙醇(EtOH)的转酯作用以分别产生脂肪酸烷基酯如脂肪酸甲酯(FAME)和脂肪酸乙酯(FAEE)。此类酶催化工艺的一个问题是脂肪酶可由于醇而失活。因此，在整个工艺中一般将醇浓度保持较低。醇耐受性受因素如所述酶、所述醇、酶固定化的方式等影响。一般而言，所述醇愈小，其失活作用愈强。因此MeOH比EtOH失活作用更强，而EtOH比丙醇(PrOH)失活作用更强，余此类推。(E“Enzymatic biodieselproduction：Technical and economical considerations”Nielsen，PM等(2008)Eur.J.Lipid Sci.Technol.，vol.110，p.692-700)。
在生物柴油产生中充分利用脂肪分解酶的主要障碍是成本。因此，脂肪分解酶的再使用从经济视角而言是必需的，其可通过使用固定化形式的脂肪分解酶来实现。在生物柴油生产中再使用固定化的脂肪分解酶的方法已得到描述，其中一些如下所述：
“Different enzyme requirementsfor the synthesis ofbiodiesel：
Figure BDA0000072139100000011
435and
Figure BDA0000072139100000012
TL IM”Hernandez-Martín，E等(2008)Bioresource Technologyvol.99，p.277-286描述了在脂肪酸乙酯的产生中通过Novozym 435、LipozymeTL IM和Lipozyme RM IM转化不同的植物油。Novozyme 435的再使用表现为在25℃的7小时反应中使用相对于底物50％w/w的酶加载量，其中将Novozyme 435用氯仿洗涤并在每个反应周期之间干燥。Lipozyme TL IM的再使用同样用10％酶、24h反应时间和反应周期之间的氯仿洗涤来进行尝试。该反应中使用1(1eq)的EtOH/FA比例。然而，本文作者发现在第一个周期之后所述酶即仅具有10％的残余活性。
“Selective enzymatic synthesis of lower acylglycerols rich in polyunsaturatedfatty acids”Hernandez-Martín，E等(2008)Eur.J.Lipid Sci.Technol.Vol.110，p.325-333描述了在脂肪酸乙酯的生产中用Novozyme 435转化大豆油。Novozyme 435的再使用表现为在25℃的1小时反应中使用相对于底物50％w/w的酶加载量，其中将Novozyme 435用氯仿或2-丙醇之一洗涤并随后在每个反应周期之间干燥。
“Improved enzyme stability in lipase-catalysed synthesis of fatty acid ethylester from soybean oil”Rodrigues，RC等(2008)Appl.Biochem.Biotechnol.Vol.152，p.394-404描述了在脂肪酸乙酯的生产中用Lipozyme TL IM转化大豆油。Lipozyme TL IM的再使用表现为在相对于底物4％w/w的添加的水的存在下，在26℃的12小时反应中使用相对于底物25％w/w的酶加载量。将LipozymeTL IM在己烷、水、EtOH或丙醇中洗涤，并随后在每个反应周期之间在40℃干燥24小时。使用己烷洗涤时发现再使用率(reusability)最高。若没有洗涤步骤，酶活性迅速衰减。EtOH对油的比例为7.5∶1，意指相对于脂肪酸为2.5eq。未对更高量的EtOH测试再使用率。
“Immobilized Pseudomonas cepacia lipase for biodiesel fuel production fromsoybean oil”Noureddini，H等(2005)Bioresource Technology vol.96，p769-777描述了在高量醇的存在下转化大豆油以产生脂肪酸乙酯。该反应由固定于疏水性溶胶-凝胶基质中的洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)(PS)脂肪酶催化。固定化的PS脂肪酶的再使用表现为在0.3g相对于底物3％w/w添加的水存在下在1小时反应中使用30％w/w的酶加载量。
“Conversion of acid oil by-produced in vegetable oilrefining to biodiesel fuelby immobilized Candida antarctica lipase”Watanabe，Y等(2007)Journal ofMolecular Catalysis vol.44，p.99-105描述了在1-10MeOH∶FA摩尔比的存在下使用固定于疏水载体材料之上的经甘油激活的南极假丝酵母(Candidaantarctica)脂肪酶(Novozym 435)从酸油产生FAME的两步反应。
用于产生脂肪酸乙酯的方法目前是基于相对高的酶加载量，这对于工业目的是不理想的。此外，大多数应用依赖于固定于疏水的支持材料上的酶(例如Novozym 435)。疏水性聚合材料通常比无机亲水性材料(例如二氧化硅)更加昂贵。目前在大多数方法中包含修饰如在每个反应周期之间洗涤并干燥固定化的脂肪分解酶的步骤，此外，将多种量的水添加至反应也包含于许多报道的方法。
因此，仍有开发改进的方法的需要，其中在脂肪酸乙酯的产生中，可再使用固定于低成本亲水支持材料之上的脂肪分解酶。
发明内容
本发明令人意想不到地发现在高量乙醇存在下固定于亲水载体材料之上的脂肪分解酶可有效地再使用以供产生脂肪酸乙酯。
在第一个方面本发明涉及产生脂肪酸乙酯的方法，包括：
a)将包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游离脂肪酸或其任意组合的底物与至少一种固定化的脂肪分解酶反应以提供反应混合物，其中酶加载量相对于底物为30％w/w以下，而乙醇对脂肪酸的摩尔比例(EtOH∶FA)为至少3.0当量；
b)从所得的反应混合物分离固定化的脂肪分解酶；和
c)对固定化的脂肪分解酶不经修饰直接进行至少另一次反应(at least onefurther reaction)。
在第二个方面本发明涉及在通过将乙醇与包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游离脂肪酸或其任意组合的底物反应获得的脂肪酸乙酯的产生中再使用至少一种固定化的脂肪分解酶，其中底物中乙醇对脂肪酸的摩尔比例(EtOH∶FA)为至少3.0当量；相对于底物酶加载量为30％w/w以下；且在用于转化反应之后该酶与所得的反应混合物分离，并不经修饰直接再使用于下一个转化反应。
在第三个方面本发明涉及通过所述方法获得的组合物，其中所述组合物包含至少两种选自下组的组分：脂肪酸乙酯；甘油三酯；甘油二酯；甘油一酯；甘油；和水。
在第四个方面本发明涉及通过所述方法获得的组合物作为燃料的用途。
在第五个方面本发明涉及包含通过所述方法获得的组合物的燃料。
附图说明
图1显示了再使用固定化的细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosa)脂肪酶以供使用1-6当量的乙醇(EtOH)合成脂肪酸乙酯。标记表示为“周期数”，“eq.EtOH”。因此，“1，1”意指“第一个周期，1当量EtOH”，而“2，3”意指“第二个周期，3当量EtOH”。白/灰条指在4h反应之后脂肪酸乙酯含量(％，w/w)，而黑条指24h反应之后的脂肪酸乙酯含量。显然1当量和2当量EtOH在第二和之后的周期中导致非常少的脂肪酸乙酯形成。关于更多细节，请参考实施例1。
定义
生物柴油：术语“生物柴油”在本文中定义为通过下述反应获得的短链醇的脂肪酸烷基酯：甘油+FFA+醇→脂肪酸烷基酯(生物柴油)+甘油+水，其中短链醇为具有1至5个碳原子(C1-C5)的醇。
脂肪分解酶：术语“脂肪分解酶”在本文中定义为甘油三酯酰基水解酶，EC 3.1.1.3，其催化反应如水解、相互酯化、转酯、酯化、醇解、酸解和氨解。
底物：术语“底物”在本文中定义为包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游离脂肪酸或其任意组合的底物。
发明详述
生物柴油代表了用于压燃式(柴油)发动机的有希望的代用燃料。生物柴油标准(DIN 51606、EN 14214和ASTMD6751)要求或间接地规定生物燃料应为脂肪酸甲酯(FAME)。然而我们广义地将术语生物柴油用于由下述反应获得的短链醇的脂肪酸烷基酯：甘油+FFA+醇→脂肪酸烷基酯(生物柴油)+甘油+水。短链醇为具有1至5个碳原子(C1-C5)的醇。优选的短链醇是乙醇。
醇类的不稳定作用
固定化的脂肪分解酶在油中通常是非常热稳定的，而酶相互酯化的商用工艺通常在70℃进行。然而，短链醇对稳定性具有负面影响，并相应地脂肪分解酶的活性和该不稳定作用随着温度的增加而增加。醇类对脂肪分解酶的不稳定作用似随着醇分子量的增加而减少。几个研究组注意到了醇在油中的溶解度与油的不稳定作用之间的相关性。
少数事例描述了高醇剂量的积极作用：在酶非常稳定(robust)，或当使用不具有失活(inactivating)性质的较大的醇的情况下，失活并不是问题。在该情况下高醇浓度可为优势，其驱动平衡反应至完全转化。
甘油三酯底物的完全转化导致甘油作为副产物生成。已显示甘油使固定化的酶失活，可能是通过物理阻断底物对酶的接触。认为高醇浓度可能通过将甘油维持在溶液中而有助于避免甘油使固定化的酶失活。已显示吸附于经使用的二氧化硅颗粒上的甘油可通过乙醇处理继以干燥来去除(“Near-quantitative production of fatty acid alkyl esters by lipase-catalyzedalcoholysis of fats and oils with adsorption of glycerol by silica gel”Stevenson等(1994)Enzyme Microb.Technol.，vol.16，p.478-484)。
其中在大量过量的乙醇存在下将固定化的脂肪分解酶再使用于生物柴油的生产的方法迄今为止尚未成功或在工业上具有吸引力。因此，令人意想不到的是脂肪酸乙酯可在至少3.0当量，即相对高的底物中乙醇对脂肪酸的摩尔比(EtOH∶FA)的存在下产生，如在本发明中公开并由实施例所阐述的。
已经反复地指出水的存在对于维持脂肪分解酶的活性是重要的，且绝大多数目前已知的方法要求将水添加至反应。令人意想不到的是，发现本发明方法可无需额外的水而实施。
洗涤和干燥步骤常常包括在本领域中已知的以去除特别是被视为抑制脂肪分解酶的活性的甘油为目的的方法中。包括使用两种不同溶剂，己烷或叔丁醇(t-BuOH)洗涤步骤令人惊讶地显示与实施例2中所示未洗涤相比，当使用2.0eq.EtOH∶FA的摩尔比例时在至少三个反应周期之内(表2)或当使用3.5eq.EtOH∶FA的摩尔比例时在至少10个周期之内(表3)洗涤并未改变酶活性。
在某些实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸乙酯的方法，包括：a)将包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游离脂肪酸或其任意组合的底物与至少一种固定化的脂肪分解酶反应以提供反应混合物，其中酶加载量相对于底物为30％w/w以下，而乙醇对脂肪酸的摩尔比例(EtOH∶FA)为至少3.0当量；b)从所得的反应混合物分离固定化的脂肪分解酶；和c)对固定化的脂肪分解酶不经修饰直接进行至少一次进一步的反应。
脂肪分解酶
大多数在有机合成中用作催化剂的脂肪分解酶是微生物和真菌来源的，且它们可方便地通过发酵和基本纯化获得。从多种来源提取的脂肪分解酶已成功地用于产生生物柴油。固定于疏水性丙烯酸树脂上的南极假丝酵母B脂肪酶(Novozym 435)已为最常用的用于产生生物柴油的酶。然而，取决于实验变量如底物、醇、水、温度、pH、再使用等等，可利用不同的脂肪分解酶。
在本申请中，通过两种不同的脂肪分解酶细毛嗜热霉脂肪酶(TTL)和南极假丝酵母B脂肪酶(CALB)分别使用乙醇(EtOH)和2-丙醇(iPrOH)测试了脂肪酸烷基酯的产生。对于TLL，其结果示于实施例3和5，对于CALB，实施例6和7。这些酶的脂肪分解活性与之前报道的结果并不相同，即并不一致。然而，根据这些测试，一个共同的特征是显然的，即当使用底物中至少3当量醇对脂肪酸的摩尔比例时，在10个反应周期之内脂肪酸烷基酯的高转化。似乎CALB在2.0当量的摩尔比例保持一定活性，但该活性在至少3.0当量的摩尔比例时增加。
在某些实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸乙酯的方法，其中至少一种固定化的脂肪分解酶选自下组：细毛嗜热霉脂肪酶；南极假丝酵母A脂肪酶；南极假丝酵母B脂肪酶；Candida deformans脂肪酶；解脂假丝酵母(Candidalipolytica)脂肪酶；近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)脂肪酶；皱落假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶；隐球菌属菌种(Cryptococcus spp.)S-2脂肪酶；曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶；德氏根毛霉(Rhizomucor fdelemar)脂肪酶；洋葱(假单胞菌)伯克霍尔德氏菌(Burkholderia(Pseudomonas)cepacia)脂肪酶；沙门柏干酪假单胞菌(Pseudomonas camembertii)脂肪酶；萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)脂肪酶；白地霉(Geotrichium candidum)脂肪酶；Hyphozyma sp.脂肪酶；产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)脂肪酶；及其变体。
在某些实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸乙酯的方法，其中所述至少一种固定化的脂肪分解酶与选自下组的酶至少60％；至少70％；至少75％；至少80％；至少85％；至少88％；至少90％；至少92％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；至少98％；或至少99％相同：细毛嗜热霉脂肪酶；南极假丝酵母A脂肪酶；南极假丝酵母B脂肪酶；Candida deformans脂肪酶；解脂假丝酵母脂肪酶；近平滑假丝酵母脂肪酶；皱落假丝酵母脂肪酶；隐球菌属菌种S-2脂肪酶；曼赫根毛霉脂肪酶；德氏根毛霉脂肪酶；洋葱(假单胞菌)伯克霍尔德氏菌脂肪酶；沙门柏干酪假单胞菌脂肪酶；萤光假单胞菌脂肪酶；白地霉脂肪酶；Hyphozyma sp.脂肪酶；产酸克雷伯氏菌脂肪酶。该特异性可基于氨基酸序列或核苷酸序列计算。
两个氨基酸序列或两个核苷酸序列间的相关性由参数“同一性”描述。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如于EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物开放软件组(The European Molecular Biology OpenSoftware Suite)，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277；http://emboss.org)的Needle程序，优选3.0.0或更晚版本中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来确定。所使用的任选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并计算如下：
(相同的残基×100)/(比对的长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如于EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物开放软件组(The European MolecularBiology Open Software Suite)，Rice等，2000，如上；http://emboss.org)的Needle程序，优选3.0.0或更晚版本中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，如上)测定。所使用的任选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对的长度-比对中缺口的总数)。
脂肪分解酶加载量
就本发明的目的而言，酶加载量表示为相对于底物，在反应混合物中存在的固定化的脂肪分解酶(酶+支持材料)的重量/重量百分比(％w/w)。尽管一般而言增加量的脂肪分解酶减少转化时间，从经济观点在减少的酶加载量水平操作是合意的。
在某些实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸乙酯的方法，其中至少一种固定化脂肪分解酶加载量相对于底物为25.0％w/w以下；22.5％w/w以下；20.0％w/w以下；17.5％w/w以下；15.0％w/w以下；12.5％w/w以下；10.0％w/w以下；7.5％w/w以下；5.0％w/w以下；或2.5％w/w以下。
脂肪分解酶的固定化
由于对于人造黄油(margarine)和起酥油(shortenings)能够进行划算的甘油三酯相互酯化(以修饰融化性质)的新技术开发，在油和脂肪加工中使用固定化的酶正在经历显著的发展。固定化的酶的最基本的优势是其可从通过简单过滤的分批工艺中回收并再使用。此外，将固定化的酶填充于柱允许简单地实施连续工艺。固定化的酶通常还对催化剂的操作稳定性(与游离酶相比)具有积极作用。其使得操作更加简单(与游离酶粉末相比)，且其允许在低水条件下的操作(与液体配制酶相比)。
在某些实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸乙酯的方法，其中所述脂肪分解酶通过包埋于天然或合成基质如溶胶-凝胶、藻酸盐和角叉藻聚糖；通过交联方法如在交联的酶晶体(CLEC)和交联的酶聚集物(CLEA)中；或通过沉淀于盐晶体如包被蛋白的微晶体(PCMC)固定化于载体上。
在某些实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸乙酯的方法，其中所述载体是选自下组的亲水载体：由氧化铝、氧化硅和硅酸盐组成的多孔无机颗粒如多孔玻璃、沸石、硅藻土、膨润土、蛭石、水滑石；和由糖聚合物组成的多孔有机颗粒如琼脂糖或纤维素。
众所周知载体的特性可对固定化的酶的性质具有非常显著的作用。两种通常应用的商业酶：Novozym 435和Lipozyme TL IM代表疏水载体(Novozym435)和亲水载体(Lipozyme TL IM)的实例。从成本观点来看，亲水载体通常比疏水聚合树脂优选，但其性质可阻止在某些应用中被利用。
底物中乙醇对脂肪酸的摩尔比例(EtOH∶FA)
过量乙醇可将平衡反应向完全转化方向驱动。就本发明而言，醇的量表示为当量(eq.)，其为底物中存在的乙醇对脂肪酸的摩尔比例(EtOH∶FA)。
在某些实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸乙酯的方法，其中底物中乙醇对脂肪酸的摩尔比例(EtOH∶FA)为至少3.5；4.0；4.5；5.0；5.5；6.0；6.5；7.0；7.5；8.0；8.5；9.0；9.5或10.0当量。
在短链醇如甲醇和乙醇的存在下蛋白质一般而言是不稳定的，且在与不溶性醇(其在油中作为滴状物存在)接触之后，脂肪分解酶的失活迅速发生。因此，通常推荐将醇的量维持在其油中的溶解度极限以下。这可通过连续或逐步添加醇来获得。
在某些实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸乙酯的方法，其中连续或逐步添加乙醇。
取决于待用于转化反应的乙醇的总量，在逐步添加中的步骤数可变化。因此，逐步添加可由至少2个步骤；至少3个步骤；至少4个步骤；至少5个步骤；至少6个步骤；至少7个步骤；至少8个步骤；至少9个步骤；或至少10个步骤组成。
酶法生物柴油工艺设计
工艺设置是非常重要的，因为其必须考虑技术问题，如反应/产物化合物的均质性、醇的溶解性、酶的稳定性、酶的回收等。须考虑几种不同的工艺设计：分批、连续搅拌釜反应器和填充床反应器。在下述段落中将简短地概述这些。
分批工艺由于其简单的设置是用于实验室的通常工艺。该工艺可以从起始添加所有组分即大量添加(in bulk)，或以推荐的逐步添加醇来进行操作。分批工艺可用于收集关于工艺的数据，例如酶的生产力。在大规模情况下该工艺设置的不利因素为所需的罐体积大，反应时间长和该工艺并非连续的事实。须考虑的另一个非常重要的事实是随着再使用次数增加酶活性的逐渐衰减。当酶活性减少时，反应时间必须相应地增加以维持恒定程度的转化。随时间，设施的能力将减少并最终变得不可接受的低。此时必须替换酶。虽然如此，困难的决定是催化剂的能力和成本之间的妥协。
连续搅拌釜反应器是具有连续补料供应和产物收回的容器。该设计需要串联的多个罐以确保对于相同反应时间相同程度的转化，意指总的罐体积也会很大。此种系统的优点在于因为所述罐可维持不同新旧程度(age)/活性的酶，设施的能力可更恒定。这也暗示可更有效地使用酶直至活性变得非常低。该设计的另一个优点是在罐之间引入分离步骤的可能性，从而消除生成的甘油。
具有固定化的酶的填充床柱系统得到液体反应物和固体催化剂之间充分限定的接触时间。此外，使用该设置，在任何特定时间酶对底物的比例较高，且整个系统可设计得相对简洁。该技术的商业规模的先例已存在于油的酶法相互酯化。对于酶法生物柴油产生，以高于溶解度的浓度添加醇引起的酶失活问题可通过在每个柱之前的逐步添加来解决。以类似的方式，可在柱之间去除反应中产生的甘油。
在某些实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸乙酯的方法，其中所述方法选自下组工艺设计：分批、连续搅拌釜反应器、填充床柱和膨胀床反应器。
酶法产生生物柴油的原料
脂肪酸乙酯可从几种类型的植物油制备。在全球植物油生产中，棕榈油在产量上领先，且其与其他植物油相比具有最高的得率，因此经济上直观地考虑棕榈油作为用于生物柴油产生的有利的原材料。然而，也可辩论优先使用非食用油如麻风树油(Jatropha oil)，因为食用油的供应并不多余。可作为在脂肪酸乙酯产生中用作底物的植物油的原材料的植物实例为如巴西棕榈(babassu)、琉璃苣(borage)、加拿大低酸油植物(canola)、椰子、玉米、棉、大麻、麻风树(jatropha)、卡兰贾(karanj)、芥子、棕榈、花生、菜籽、稻、大豆和向日葵。
由于微藻(microalga)与植物相比更高的光合作用效率以及因此每单位面积可能更高的生产力，亦考虑将微藻作为生物柴油产生中的原料。
或者，可从非植物原料如动物脂肪(如猪油、牛脂、乳脂和禽类)；或海生动物油(marine oil)如鲔鱼油和福气鱼/好吉鱼(hoki)肝油来制备脂肪酸乙酯。
估计60-90％的生物柴油成本来自原料油的成本，因此使用较廉价的废油会对减少生物柴油成本有重大作用。此外，其被认为是减少并再循环废油中的重要步骤。新鲜植物油及其废物不同在于其水分和游离脂肪酸含量。与用于柴油燃料合成的常规化学路线不同，生物催化路线允许对广泛种类的原料油在酸性杂质如游离脂肪酸的存在下进行转酯作用。因此，脂肪酸馏出物(来自除臭剂/脂肪酸汽提)，酸油(来自化学油精炼中的皂料裂解(soap stocksplitting)、废油和经使用的油可在生物柴油产生中用作原料。
因此，原料可为粗级别的或经进一步加工的(经精制的、经漂白的和经除臭的)。合适的油和脂肪可为纯甘油三酯或甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯和游离脂肪酸的混合物，常见于废的植物油和动物脂肪。所述原料还可从植物油除臭馏出物获得。在原料中脂肪酸的类型包括在植物和动物油脂中以甘油酯的形式天然存在的那些。这包括油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸和月桂酸，仅举数例。粗植物油中的次要组分通常为磷脂、游离脂肪酸和甘油偏酯即甘油一酯和甘油二酯。
在某些实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸乙酯的方法，其中底物选自下组：巴西棕榈油、琉璃苣油、加拿大低酸油、椰子油、玉米油、棉籽油、大麻油、麻风树油、卡兰贾油、芥子油、棕榈油、花生油、菜籽油、米糠油、大豆油和向日葵油、来自微藻的油、动物脂肪、牛脂、猪油、乳脂、禽类、海生动物油、鲔鱼油、福气鱼/好吉鱼肝油、脂肪酸馏出物、酸油、废油、经使用的油、甘油偏酯及其任意组合。
在脂肪酸乙酯产生中再使用固定化的脂肪分解酶
在某些实施方案中，本发明涉及在通过将乙醇与包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游离脂肪酸或其任意组合的底物反应获得的脂肪酸乙酯的产生中再使用至少一种固定于亲水载体上的脂肪分解酶，其中底物中乙醇对脂肪酸的摩尔比例(EtOH∶FA)为至少3.0当量；酶加载量相对于底物为30％w/w以下；且其中将用于转化反应之后的酶从所得的反应混合物分离，且不经修饰直接再使用于下一步转化反应。修饰意指除了将固定化的酶从反应混合物分离之外的任何处理或活性如活化、洗涤、干燥等。
在某些实施方案中，本发明涉及在脂肪酸乙酯的产生中再使用至少一种固定化的脂肪分解酶，其中所述固定化的脂肪分解酶选自下组：细毛嗜热霉脂肪酶；南极假丝酵母A脂肪酶；南极假丝酵母B脂肪酶；Candida deformans脂肪酶；解脂假丝酵母脂肪酶；近平滑假丝酵母脂肪酶；皱落假丝酵母脂肪酶；隐球菌属菌种S-2脂肪酶；曼赫根毛霉脂肪酶；德氏根毛霉脂肪酶；洋葱(假单胞菌)伯克霍尔德氏菌脂肪酶；沙门柏干酪假单胞菌脂肪酶；萤光假单胞菌脂肪酶；白地霉脂肪酶；Hyphozyma sp.脂肪酶；产酸克雷伯氏菌脂肪酶；及其变体。
在某些实施方案中，本发明涉及在脂肪酸乙酯的产生中再使用至少一种固定化的脂肪分解酶，其中至少一种固定化的脂肪分解酶的加载量相对于底物为25.0％w/w以下；22.5％w/w以下；20.0％w/w以下；17.5％w/w以下；15.0％w/w以下；12.5％w/w以下；10.0％w/w以下；7.5％w/w以下；5.0％w/w以下；或2.5％w/w以下。
在某些实施方案中，本发明涉及在脂肪酸乙酯产生中再使用至少一种固定化的脂肪分解酶，其中所述脂肪分解酶通过包埋于天然或合成基质如溶胶-凝胶、藻酸盐和角叉藻聚糖；通过交联方法如交联的酶晶体(CLEC)和交联的酶聚集物(CLEA)；或通过沉淀于盐晶体如包被蛋白的微晶体(PCMC)固定于载体上。
在某些实施方案中，本发明涉及在脂肪酸乙酯产生中再使用至少一种固定化的脂肪分解酶，其中所述载体是选自下组的亲水载体：由氧化铝、氧化硅和硅酸盐组成的多孔无机颗粒如多孔玻璃、沸石、硅藻土、膨润土、蛭石、水滑石；和由糖聚合物组成的多孔有机颗粒如琼脂糖或纤维素。
在某些实施方案中，本发明涉及在脂肪酸乙酯产生中再使用至少一种固定化的脂肪分解酶，其中底物中乙醇对脂肪酸的摩尔比例(EtOH∶FA)为至少3.5；4.0；4.5；5.0；5.5；6.0；6.5；7.0；7.5；8.0；8.5；9.0；9.5或10.0当量。
在某些实施方案中，本发明涉及在脂肪酸乙酯产生中再使用至少一种固定化的脂肪分解酶，其中连续或逐步添加乙醇。
在某些实施方案中，本发明涉及在脂肪酸乙酯产生中再使用至少一种固定化的脂肪分解酶，其中所述方法选自下组的工艺设计：分批、连续搅拌釜反应器、填充床柱和膨胀床反应器。
在某些实施方案中，本发明涉及在脂肪酸乙酯产生中再使用至少一种固定化的脂肪分解酶，其中底物选自下组：巴西棕榈油、琉璃苣油、加拿大低酸油、椰子油、玉米油、棉籽油、大麻油、麻风树油、卡兰贾油、芥子油、棕榈油、花生油、菜籽油、米糠油、大豆油和向日葵油、来自微藻的油、动物脂肪、牛脂、猪油、乳脂、禽类、海生动物油、鲔鱼油、福气鱼/好吉鱼肝油、脂肪酸馏出物、酸油、废油、经使用的油、甘油偏酯及其任意组合。
组合物及其作为燃料的用途
在某些实施方案中，本发明涉及通过产生脂肪酸乙酯的方法获得的组合物，其中所述组合物包含至少两种选自下组的组分：脂肪酸乙酯；甘油三酯；甘油二酯；甘油一酯；甘油和水。
脂肪酸烷基酯用于广泛范围的产品并用作合成中间物。其一些工业应用包括用作润滑剂、增塑剂、防锈剂、钻孔和切削油以及合成超级酰胺(superamides)和脂肪醇的起始材料。多种脂肪酸烷基酯可用于化妆品或用作色拉油。本发明的某些实施方案特别涉及燃料。短链醇的脂肪酸烷基酯是无毒的、可生物降解的，并由于其与那些基于石油的燃料在十六烷值、能量含量、粘性和相变中的类似性为基于石油的燃料的完全或部分的优秀替代品。
根据某些实施方案，本发明涉及由至少两种下述组分的混合物组成的组合物：FAEE；甘油三酯；甘油二酯；甘油一酯；甘油；和水。所述组合物可潜在地通过本领域已知方法如蒸馏(包括闪蒸、汽提和除臭)；相分离；提取；和干燥来精制或纯化。此类精制的目的可为从组合物去除或回收一种或多种上述提及的组分。实例包括但不限于干燥以供去除水；相分离以供去除甘油和蒸馏以供分离FAEE。因此，可涵盖粗反应混合物(组合物)可无需进一步精炼而施用，或通过一种或多种方法精炼。
在某些实施方案中，本发明涉及由产生脂肪酸乙酯的方法获得的组合物作为燃料的用途。
在某些实施方案中，本发明涉及由产生脂肪酸乙酯的方法获得的组合物作为燃料的用途，其中所述组合物经精炼。
在某些实施方案中，本发明涉及燃料，其包含由产生脂肪酸乙酯的方法获得的组合物。
在某些实施方案中，本发明涉及燃料，其包含由产生脂肪酸乙酯的方法获得的组合物，其中所述组合物经精炼。
本发明进一步由下述实施例描述，其不应视为限制本发明的范围。
实施例
用作缓冲液和底物的化学品为至少试剂级的商品。
培养基和溶液
经精炼、漂白、除臭的大豆油(SBO)购自
Figure BDA0000072139100000131
Schulz Food Service A/S
Figure BDA0000072139100000132
Denmark)。乙醇为购自Sigma-Aldrich的绝对乙醇(99.8％v/v)。所有其他化学品购自Sigma-Aldrich并不经进一步纯化而使用。NMR分析在VarianMercury VX-400MHz系统上在30℃使用CDCl3溶剂进行。固定于氧化硅上的细毛嗜热霉脂肪酶(TLL)和固定于氧化硅上的南极假丝酵母B脂肪酶(CALB)从Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark获得。
实施例1：在使用1-6当量EtOH的FAEE分批合成中再使用固定化的细毛嗜热霉脂肪酶
我们在由固定于氧化硅上的细毛嗜热霉脂肪酶(TLL)(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)催化的反应中研究了使用大豆油(SBO)和乙醇(EtOH)的脂肪酸乙酯合成。FAEE反应是在100mL螺旋盖锥形瓶中进行的。将20mL SBO和1g固定化的酶添加至每个烧瓶。添加的EtOH的量相对于油中脂肪酸的总量(即[EtOH]∶[FA])从1至6摩尔当量变动。将EtOH以三个相等的部分在t＝0h，t＝2h和t＝4h逐步添加。为了起始反应，添加第一部分的EtOH，并将烧瓶闭合并置于35℃的水浴定轨振荡器中。
在转化至FAEE之后，进行1H NMR分析。因此，将20微升的等分试样从反应混合物中取出以供在4h和在24h之后进行分析，此时反应处于平衡。至FAEE的转化如“Quantification of soybean oil ethanolysis with 1H NMR”Neto等(2004)J.Am.Oil Chem.Soc.Vol.81，p.1111-1114中所述进行计算。
在24h之后，所有的反应通过从固定化的酶倾去反应混合物来终止。另一个反应周期通过将新的SBO和EtOH添加至固定化的酶来立即起始。
表1：4h/24h之后FAEE的含量(％w/w)
Figure BDA0000072139100000141
上述数据清楚地记录了酶在1eq.或2eq.EtOH存在下失活，而在与3至6eq.EtOH的反应中，酶活性在至少10个周期中得到保持。
实施例2：在周期之间具有溶剂洗涤的FAEE分批合成中再使用固定化的细毛嗜热霉脂肪酶
除了下述修正，该实验基本上如实施例1中所述实验进行。仅测试了2.0eq.和3.5eq.EtOH。逐步添加EtOH如下：t＝0h：0.5eq.；t＝2h：0.5eq.；t＝4h：1eq.(总计2eq.)或t＝0h：1eq.；t＝2h：1eq.；t＝4h：.5eq.(总计3.5eq.)。在每个周期之后，将反应混合物从固定化的酶倾出，并对其进行下述处理：a)无洗涤；b)用己烷洗涤；或c)用叔丁醇(t-BuOH)洗涤。在处理之后，添加新的SBO和EtOH，并起始下一个反应周期(即不尝试通过干燥酶来去除残余的溶剂)。在6h和24h之后取样以供NMR分析。
表2：使用2eq.EtOH获得的FAEE含量(％w/w)
Figure BDA0000072139100000142
表3：使用3.5eq.EtOH获得的FAEE含量(％w/w)
Figure BDA0000072139100000151
这些数据显示，即使用己烷或t-BuOH在周期之间洗涤酶，2eq.EtOH仍使酶迅速失活。使用3.5eq.EtOH，酶活性在此测试的10个周期中得到保持，无论该酶是否经洗涤。
实施例3：在使用一步/大量添加EtOH的FAEE分批合成中再使用固定化的细毛嗜热霉脂肪酶
该实验基本上如实施例1中所述实验进行，具有下述修正。EtOH并非逐步添加，而是在t＝0h大量添加。
表4：在4h/24h之后的FAEE含量(％w/w)
Figure BDA0000072139100000152
结果显示，在低于3.0eq.EtOH，酶活性迅速丧失，而在至少3eq.EtOH，部分酶活性在10个周期中得到保持。与实施例1中描述的逐步添加相比，一步或大量添加EtOH显然对酶是有害的。因此，优选逐步或者连续添加EtOH。
实施例4：在使用1-6eq.MeOH的FAME分批合成中再使用固定化的细毛嗜热霉脂肪酶
该实验基本上如实施例1中所述实验进行，具有下述修正。将1-6eq.甲醇(MeOH)代替EtOH添加(即FAME合成)。
从1H NMR光谱将转化率计算为％FAME＝100*(A2/3)/(A3/3)，其中A2为-OCH3的积分[3.60-3.70ppm]，而A3为来自所有脂肪酸的-CH3的积分[0.85-0.95ppm]。
表5：在4h/24h之后的FAME含量(％w/w)
Figure BDA0000072139100000161
仅仅反应1(使用1.0eq.MeOH)在第一个周期显示一些转化。该活性显著地在周期2中减少，并在周期3中缺乏。因此，当使用MeOH以供FAME合成时，未观察到至少3.0eq.EtOH存在下FAEE的高产生结果。
实施例5：在使用1-6eq.iPrOH的FAIE分批合成中再使用固定化的细毛嗜热霉脂肪酶
该实验基本上如实施例1中所述实验进行，具有下述修正。使用1-6eq.2-丙醇(iPrOH)代替EtOH(即FAIE合成)。将iPrOH以一个部分在t＝0h添加。
从1H NMR光谱将转化率计算为％FAIE＝100*(A2/1)/(A3/3)，其中A2为-OCH(CH3)2的积分[5.00-5.05ppm]，而A3为来自所有脂肪酸的-CH3的积分[0.85-0.95ppm]。
在该实验中，未在任何反应中观察到FAIE的转化。这可能是因为TLL酶的活性位点并不接受iPrOH，因此可能并不催化该反应。
实施例6：在使用1-6eq.EtOH的FAEE分批合成中再使用固定化的南极假丝酵母B脂肪酶
该实验基本上如实施例1中所述实验进行，具有下述修正。使用固定于氧化硅上的南极假丝酵母B脂肪酶(CALB)(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)代替细毛嗜热霉脂肪酶。EtOH并不逐步添加，而是在t＝0h大量添加。
表6：在4h/24h之后的FAEE含量(％w/w)
Figure BDA0000072139100000171
该数据显示1eq.和2eq.EtOH导致较差的结果。使用1eq.EtOH，酶在第三个周期之后失活。使用2eq.EtOH，在全部10个周期中维持一些活性。这与TLL的结果相反，后者中使用1eq.和2eq.EtOH在周期No.1之后即已导致酶失活。因此，在该实施例中，EtOH的最佳剂量似为约4-5eq.。
实施例7：在使用1-6eq.EtOH的FAIE分批合成中再使用南极假丝酵母B脂肪酶
该实验基本上如实施例1中所述实验进行，具有下述修正。使用固定于氧化硅上的南极假丝酵母B脂肪酶(CALB)(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)代替细毛嗜热霉脂肪酶。使用2-丙醇(iPrOH)代替EtOH(即FAIE合成)。iPrOH在t＝0h以一个部分添加。
从1H NMR光谱将转化率计算为％FAIE＝100*(A2/1)/(A3/3)，其中A2为-OCH(CH3)2的积分[5.00-5.05ppm]，而A3为来自所有脂肪酸的-CH3的积分[0.85-0.95ppm]。
表7：在4h/24h之后的FAIE含量(％w/w)
Figure BDA0000072139100000181
显然，与TLL相反，CALB可催化该反应(与实施例5相比)。在大多数反应中24h之后获得了高转化(70-90％)。同样至少3.0eq.醇导致更高的转化(与使用1.0eq.或2.0eq.EtOH的反应相比)。

Claims (15)

1.一种产生脂肪酸乙酯的方法，包括：
a)将包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游离脂肪酸或其任意组合的底物与至少一种固定化的脂肪分解酶反应以提供反应混合物，其中酶加载量相对于底物为30％w/w以下，而乙醇对脂肪酸的摩尔比例(EtOH∶FA)为至少3.0当量；
b)从所得的反应混合物分离固定化的脂肪分解酶；和
c)对固定化的脂肪分解酶不经修饰直接进行至少另一次反应。
2.权利要求1的方法，其中所述固定化的脂肪分解酶选自下组：细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginose)脂肪酶；南极假丝酵母(Candida Antarctica)A脂肪酶；南极假丝酵母B脂肪酶；Candida deformans脂肪酶；解脂假丝酵母(Candida lipolytica)脂肪酶；近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)脂肪酶；皱落假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶；隐球菌属菌种(Cryptococcus spp.)S-2脂肪酶；曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶；德氏根毛霉(Rhizomucor delemar)脂肪酶；洋葱(假单胞菌)伯克霍尔德氏菌(Burkholderia(Pseudomonas)cepacia)脂肪酶；沙门柏干酪假单胞菌(Pseudomonas camembertii)脂肪酶；萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)脂肪酶；白地霉(Geotrichium candidum)脂肪酶；Hyphozyma sp.脂肪酶；产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)脂肪酶；及其变体。
3.权利要求1或2的方法，其中所述至少一种固定化脂肪分解酶加载量相对于底物为25.0％w/w以下；22.5％w/w以下；20.0％w/w以下；17.5％w/w以下；15.0％w/w以下；12.5％w/w以下；10.0％w/w以下；7.5％w/w以下；5.0％w/w以下；或2.5％w/w以下。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述脂肪分解酶通过包埋于天然或合成基质如溶胶-凝胶、藻酸盐和角叉藻聚糖；通过交联方法如交联的酶晶体(CLEC)和交联的酶聚集物(CLEA)；或通过沉淀于盐晶体如包被蛋白的微晶体(PCMC)固定化于载体上。
5.权利要求4的方法，其中所述载体是选自下组的亲水载体：由氧化铝、氧化硅和硅酸盐组成的多孔无机颗粒如多孔玻璃、沸石、硅藻土、膨润土、蛭石、水滑石；和由糖聚合物组成的多孔有机颗粒如琼脂糖或纤维素。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中底物中乙醇对脂肪酸的摩尔比例(EtOH∶FA)为至少3.5；4.0；4.5；5.0；5.5；6.0；6.5；7.0；7.5；8.0；8.5；9.0；9.5或10.0当量。
7.权利要求6的方法，其中连续或逐步添加乙醇。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述方法选自下组的工艺设计：分批、连续搅拌釜反应器、填充床柱和膨胀床柱反应器。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述底物选自下组：巴西棕榈油、琉璃苣油、加拿大低酸油、椰子油、玉米油、棉籽油、大麻油、麻风树油、卡兰贾油、芥子油、棕榈油、花生油、菜籽油、米糠油、大豆油和向日葵油、来自微藻的油、动物脂肪、牛脂、猪油、乳脂、禽类、海生动物油、鲔鱼油、福气鱼/好吉鱼肝油、脂肪酸馏出物、酸油、废油、经使用的油、甘油偏酯及其任意组合。
10.在通过将乙醇与包含甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游离脂肪酸或其任意组合的底物反应获得的脂肪酸乙酯的产生中再使用至少一种固定于亲水载体上的脂肪分解酶，其中底物中乙醇对脂肪酸的摩尔比例(EtOH∶FA)为至少3.0当量；酶加载量相对于底物为30％w/w以下；且其中将用于转化反应之后的酶从所得的反应混合物分离，且不经修饰直接再使用于下一步转化反应。
11.通过权利要求1-9任一项的方法获得的组合物，其中所述组合物包含至少两种选自下组的成分：脂肪酸乙酯；甘油三酯；甘油二酯；甘油一酯；甘油和水。
12.权利要求11的组合物作为燃料的用途。
13.权利要求12的用途，其中所述组合物经精炼。
14.一种燃料，包含由权利要求1-9任一项的方法获得的组合物。
15.权利要求14的燃料，其中所述组合物经精炼。
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