CN103429747A - 产生脂肪酸烃基酯 - Google Patents

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Abstract

用于产生脂肪酸烃基酯的方法，其中将含有甘油三酯、醇、水、和甘油的溶液与脂肪分解酶接触。

Description

产生脂肪酸烃基酯
发明领域
本发明涉及用于从脂肪酸原料产生脂肪酸烃基酯的方法。
发明背景
脂肪酸烃基酯可以在标准柴油发动机中用作燃料、生物柴油。生物柴油可以单独使用，或掺以化石柴油。最近生物柴油变得更加有吸引力，因为其对环境的好处。
虽然生物柴油现在主要是化学产生的(使用例如，NaOH和/或甲醇钠作为催化剂)，但是有一些相关的问题限制其开发，如由于游离脂肪酸的高含量的预处理、需要在反应中高醇过剩、从酯和甘油相除去化学催化剂、以及在甘油回收期间除去无机盐。
由化学催化剂所导致的缺点主要通过使用脂肪分解酶作为催化剂预防，且近年间着眼于将脂肪酶用于酯交换以供产生生物柴油。
通过酶生物转化而产生的生物柴油相较于化学转化更加环境友好。然而，除了非常少数的例外，现在酶科技还没有在商业规模的生物柴油产生中使用。
为了使得产生生物柴油经济可行，酶的成本必须尽可能低。这只可能通过酶的重新使用而达成，无论所述酶是固定的或是液体脂肪酶配制物。为了能够使用和重新使用液体酶，所述酶需要作为水相的一部分存在于反应物混合物中。
使用液体酶而酶法产生脂肪酸烃基酯的工艺在例如WO2006/072256和Lv等(Process Biochemistry45(2010)446-450)中描述。
发明内容
本发明的发明人现在已经发现，当将部分的水替换为甘油时，酯交换反应可以更高速率进行和/或进行至更高百分数的脂肪酸烃基酯和更低百分数的的游离脂肪酸。这是令人惊讶的，因为甘油也是反应产物，因此本该预期高甘油的状况会减慢酯交换反应和/或将反应平衡推向甘油三酯形成。据推测，所述的来自将部分的水替换为甘油的好处是减少水活性和维持甘油-水相和脂肪相之间大的界面的组合的效果。脂肪酶是界面活性酶(interface-active enzyme)，因此增大的界面将导致提高的底物利用度。同时，减少的水活性会将反应推向酯交换，由此保持低的游离脂肪酸的量。
维持具有更低的水含量的高容积甘油-水相的进一步的优势是，为了从甘油-水相中离析甘油所需要除去的水更少。液态脂肪酶和未反应的醇溶解于甘油-水相。由于甘油-水相在工艺中是重新使用的，因此剩余的脂肪酶活性和醇是再循环的，由此提高工艺的效率。
相应地，本发明涉及用于产生脂肪酸烃基酯的工艺，其包括：形成包含脂肪酸原料、醇、水、和甘油的两相反应物混合物，使所述反应物混合物与一种或多种脂肪分解酶接触，其中甘油-水相构成反应物混合物的从5至50%、10至50%、20至50%、20至45%、或甚至20至40%(w/w)，并且其中甘油构成甘油-水相的30至85%、40至85%、45至85%、50至85%、或甚至60至80%(w/w)。
附图说明
图1显示本发明的工艺的实施方案。包括该图是仅为了例示性的目的，而不应解释为以任何方式限制本发明。
该图显示了分批操作工厂的工艺流程图。所述工厂也可以建设为连续搅拌釜式反应器系统(continuous stirred tank reactor system)。
原料罐：
F1：甘油三酯
F2：醇
F3：脂肪酶
F4：水
F5：甘油(可以在第一批次中添加)
反应器：
RA1：酯交换/酯化反应器。出口处是待在S1中分离的FAAE和甘油+水相之间的混合物。
分离单元：
S1：分离自RA1而出的混合物的甘油/水相
S2：通过分离而消除一定量的甘油和/或水。这可以通过使所需的体积流去或通过超滤进行。S2是任选的，因为整个甘油+水相都可以重新使用。
S3：通过蒸发从FAAE回收醇。
工艺：
P1：用于消除FAAE中的FFA的工艺。
a)碱洗(在酸化之后回收FFA并回送至F1，虚线)
b)在通过添加无水醇的工艺中使用固定的脂肪酶在酯化(将FFA转化为FAAE，虚线不适用)
发明详述
定义
生物柴油：短链醇的脂肪酸烃基酯(FAAE)，如脂肪酸甲酯(FAME)和脂肪酸乙酯(FAEE)，也叫做生物柴油，因为它们用作化石柴油的添加剂或替代物。
醇：在本发明的方法中所使用的醇优选是具有1到5个碳原子(C1、C2、C3、C4、或C5)的短链醇。优选的醇是甲醇或乙醇。醇含量优选少于在反应物混合物中的脂肪酸(游离的和甘油结合的脂肪酸)的量的4、3、2、1.5、或1.0摩尔当量。醇可以逐步(如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多步中添加)和/或连续添加。
脂肪酸原料：术语“脂肪酸原料”在本文中定义为包含甘油三酯的底物。除了甘油三酯外，底物还可以包含甘油二酯、甘油一酯、游离脂肪酸或其任意组合。在本发明的工艺中任何包含脂肪酸的植物或动物来源的油或脂肪都可以用作产生脂肪酸烃基酯的底物。
脂肪酸原料可以是选自下组的油：藻油(algae oil)、蓖麻油(castor oil)、椰子油(coconut oil)(椰干油(copra oil))、玉米油(corn oil)、棉籽油(cottonseedoil)、亚麻油(flax oil)、鱼油(fish oil)、葡萄籽油(grape seed oil)、大麻油(hempoil)、麻风树油(jatropha oil)、希蒙得木油(jojoba oil)、芥子油(mustard oil)、双低菜油(canola oil)、棕榈油(palm oil)、棕榈硬脂(palm stearin)、棕榈液油(palm olein)、棕榈仁油(palm kernel oil)、花生油(peanut oil)、菜籽油(rapeseedoil)、米糠油(rice bran oil)、红花油(safflower oil)、大豆油(soybean oil)、向日葵油(sunflower oil)、妥尔油(tall oil)、和来自盐生植物的油(oil fromhalophytes)、或其组合。
脂肪酸原料可以是选自下组的脂肪：动物脂肪，包括来自猪、牛肉和羊的动物脂(tallow)，猪油(lard)、鸡脂肪、鱼油、或者其组合。
脂肪酸原料可以是粗制的(crude)、精制的(refined)、漂白的(bleached)、除臭的(deodorized)、脱胶的(degummed)、或其任意组合。
食物品质的油和脂肪是昂贵的，因此其处理中的废物和副产物以及非食物等级的油和脂肪对于脂肪酸烃基酯已经成为越来越有吸引力的原料。皂料(Soap stock)是通过在炼油厂(oil refinery)中以碱处理油以将游离脂肪酸转化为皂类(例如，钠皂)而获得的油的级分。皂料通常除了肥皂外还含有甘油的级分。酸性油是从炼油厂通过皂类的酸化(acidification)以溶解皂类而产生的副产物。其主要含有游离脂肪酸(FFA)和酰基甘油。蒸馏物如棕榈脂肪酸蒸馏物(PFAD)是来自油精制的副产物，其来自用于从油中消除游离脂肪酸的蒸馏工艺。
原料可以是油或脂肪精制的中间产物、废产物(waste product)或者副产物，其选自下组：皂料；酸性油；脂肪酸蒸馏物如PFAD、大豆脂肪酸蒸馏物、菜籽脂肪酸蒸馏物、米糠脂肪酸蒸馏物、家禽脂肪酸蒸馏物、牛油脂脂肪酸蒸馏物、等等；来自脱胶的胶质(gums from degumming)；来自从鱼油产生ω-3脂肪酸(Omega-3fatty acid)衍生物的副产物；隔油器废油(fat trapgrease)；黄油脂(yellow grease)、和棕油脂(brown grease),游离脂肪酸如油酸(free fatty acids like oleic acid)；或通过物理分离的油级分(fractions of oilobtained by physical separations)；或其任意组合。
甘油-水相：按%反应物混合物计的甘油-水相定义为按%(w/w)计的(甘油+水)/(甘油+水+甘油三、二、和一酯+FAAE+FFA)。
醇既溶于甘油-水相也溶于脂肪相，但最大的部分溶于甘油-水相。在对“甘油-水相在反应物混合物中的%”的计算中将醇排除。
在本发明中，甘油-水相构成反应物混合物的从5至50%、10至50%、20至50%、20至45%、或甚至20至40%(w/w)。在甘油-水相中，甘油占30至70%、35至70%、40至70%或甚至45至70%(w/w)或者30至85%、40至85%、45至85%、50至85%、或甚至60至80%(w/w)。
脂肪分解酶
施用于本发明的方法中的一种或多种脂肪分解酶选自脂肪酶、磷脂酶、角质酶、酰基转移酶或脂肪酶、磷脂酶、角质酶、酰基转移酶的一种或多种的混合物。所述一种或多种脂肪分解酶选自在EC3.1.1、EC3.1.4、和EC2.3中的酶。所述一种或多种脂肪酶还可以是一种或多种脂肪酶的混合物。所述一种或多种脂肪酶可以包括脂肪酶和磷脂酶。所述一种或多种脂肪分解酶包括EC3.1.1.3的脂肪酶。所述一种或多种脂肪分解酶包括对甘油三/二/一酯具有活性的脂肪酶。
脂肪酶：合适的脂肪分解酶可以是具有脂肪酶活性的多肽，例如，选自来自南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A(CALA)的脂肪分解酶，如在WO88/02775中所公开的，南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)，如在WO88/02775中所公开并在WO2008065060的SEQ ID NO:1中所示的，细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)(曾用名细毛腐质霉(Humicola lanuginosus))脂肪酶(在EP258068中公开)，在WO2000/60063或WO1995/22615中公开的细毛嗜热霉变体，特别是在WO95/22615的SEQ ID NO:2的1-269位中所示的脂肪酶，Hyphozyma属种脂肪酶(WO98/018912)，和曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(WO2004/099400中的SEQ ID NO:5)，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP331376)、荚壳假单胞菌(P.glumae)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB1,372,034)、萤光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属种(Pseudomonas sp.)菌株SD705(WO95/06720和WO96/27002)、威斯康辛假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)的脂肪酶；芽孢杆菌(Bacillus)脂肪酶，例如，来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(Dartois等(1993),Biochemica etBiophysica Acta,1131,253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO91/16422)的脂肪酶。还优选来自任意以下生物的脂肪酶：尖镰孢(Fusarium oxysporum)、反射犁头霉(Absidiareflexa)、伞枝犁头霉(Absidia corymbefera)、曼赫根毛霉、米根霉(Rhizopusdelemar(oryzae))、黑曲霉(Aspergillus niger)、塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、沙门柏干酪青霉(Penicilium camembertii)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉和细毛嗜热霉，如选自在WO2004/099400中SEQID NO:1到15的任意脂肪酶。
用于在本发明中使用的优选的脂肪酶是具有与SEQ ID NO:2的成熟多肽序列同一性的脂肪酶，其为至少一个多肽，所述多肽与在WO95/22615的SEQ ID NO:2的1-269位中所示的或与在WO2008/065060的SEQ ID NO:1中所示的多肽具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至100%序列同一性。
适于在本发明的工艺中使用的商业脂肪酶制备物包括LIPOZYMECALB L、LIPOZYME(R)TL100L和CALLERATM TRANS(全部可从Novozymes A/S获得)。
磷脂酶：
一种或多种脂肪分解酶可以包括具有磷脂酶活性的多肽，优选磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D、溶血磷脂酶活性、和/或其任意组合。在本发明的工艺中所述一种或多种脂肪分解酶可以是磷脂酶，例如单一磷脂酶，例如，A1、A2、B、C、或D；两种或更多种磷脂酶，例如，来自磷脂酶，包括并不限于，A和B型；A1和A2型；A1和B型；A2和B型；A1和C型；A2和C型；或同型的两种或更多种磷脂酶。
一种或多种脂肪分解酶可以是具有磷脂酶活性，以及具有酰基转移酶活性的多肽，例如，选自在WO2003/100044、WO2004/064537、WO2005/066347、WO2008/019069、WO2009/002480、和WO2009/081094中所公开的多肽。酰基转移酶活性可以，例如，通过在WO2004/064537中所描述的测定法而测定。
磷脂酶可以选自在WO2008/036863和WO20003/2758中所公开的多肽。合适的磷脂酶制备物是PURIFINE(R)(可从Verenium获得)和LECITASE(R)ULTRA(可从Novozymes A/S获得)。具有酰基转移酶活性的酶可以商业酶制备物LYSOMAX(R)OIL(可从Danisco A/S获得)而获得。
角质酶：一种或多种脂肪分解酶可以包括具有角质酶活性的多肽。角质酶可以，例如，选自在WO2001/92502中公开的多肽，特别是在实施例2中公开的特异腐质霉(Humicola insolens)角质酶变体。
优选地，一种或多种脂肪分解酶是与前述的脂肪酶、磷脂酶、角质酶、和酰基转移酶具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%同一性的酶。
在一个优选的实施方案中，一种或多种脂肪分解酶与WO95/22615的SEQ ID NO:2的1-269位所示的氨基酸序列具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%同一性。
酶来源和配制物：在本发明的工艺中使用的一种或多种脂肪分解酶可以来源于或可得自本文中提及的任意来源。术语“来源于”在本文的环境中意指酶可以从生物分离，其中所述酶在所述生物中天然存在，即该酶的氨基酸序列的身份与天然酶相同。术语“来源于”还意指酶可以在宿主生物中重组地产生，该重组体产生与天然酶具有相同的同一性的酶或具有修饰的核苷酸序列的酶，例如，具有缺失的、插入的和/或取代的一个或多个氨基酸，即重组地产生的酶，其是天然氨基酸序列的突变体和/或片段。天然酶的含义包括天然变体。此外，术语“来源于”包含例如通过肽合成而合成产生的酶。术语“来源于”还涵盖已修饰的酶，例如通过糖基化、磷酸化等修饰，无论是体内还是体外修饰。术语“可得自”在本文的环境中意指酶具有与同样酶相同的氨基酸序列。该术语涵盖从生物分离的酶，其中所述酶天然存在于所述生物中，或者在相同种类的生物中或另一种生物中重组地表达，或通过例如肽合成而合成产生的酶。对于重组地产生的酶，术语“可得自”和“来源于”指代酶是相同的而非酶重组生成所在的宿主生物是相同的。
相应地，一种或多种脂肪分解酶可以通过使用任何合适的技术从微生物获得。例如，可以通过本领域已知的方法通过发酵合适微生物和接着从所得的发酵液或微生物分离酶制备物而获得酶制备物。酶亦可通过使用重组DNA技术而获得。这类方法一般包括培养以重组DNA载体转化的宿主细胞并从培养物中回收酶，所述DNA载体包含编码所讨论的酶的DNA序列，所述DNA序列可操纵地连接于合适的表达信号使得其能够在允许酶表达的条件下在培养基中表达酶。还可以将DNA序列组入宿主细胞的基因组中。所述DNA序列可为基因组、cDNA或合成来源，或其任意组合，并且可以根据领域内所知的方法分离或合成。
所述一种或多种脂肪分解酶可以以任意合适的配制物而应用，例如，作为冻干粉末或在水性溶液中。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关程度是以参数“序列同一性”描述的。
就本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)测定两个氨基酸序列之间的同一性，所述Needleman-Wunsch算法是如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)的Needle程序，优选版本5.0.0或更新版本中所执行的。所使用的参数是：10的缺口开放罚分(gap open penalty)、0.5的缺口延伸罚分(gap extensionpenalty)、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)的取代矩阵(substitution matrix)。将输出的标记为“最长一致性(longest identity)”的Needle(使用–nobrief选项获得)用作百分比同一性并如下计算：
(相同的残基x100)/(比对的长度–比对中的缺口总数)
就本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，同上)测定两个脱氧核苷酸序列之间的同一性，所述Needleman-Wunsch算法是如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Rice et al.,2000，同上)的Needle程序，优选版本5.0.0或更新版本中所执行的。所使用的参数是：10的缺口开放罚分、0.5的缺口延伸罚分、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)的取代矩阵。将输出的标记为“最长同一性”的Needle(使用–nobrief选项获得)用作百分比同一性并如下计算：
(相同的脱氧核苷酸x100)/(比对的长度–比对中的缺口总数)
工艺设计
此外，本发明涉及产生脂肪酸烃基酯的分批工艺和/或连续、多级工艺，其包括重新使用甘油和/或水的工艺。由于酶是在甘油-水相中，该相可以通过滗析器(decanter)、聚结器(coalesce)、旋风分离器(cyclone)或涡流分离器(vortex separator)、沉降器(settler)、或通过离心从脂肪相分离以重新使用酶。在连续工艺中，两相，即脂肪相和甘油-水相，可以逆流处理(processedcounter-currently)。Kosugi等(1990),Biotechnology and Bioengineering,vol.36,617-622，描述了通过固定的脂肪酶水解植物油的连续、逆流工艺。在一个实施方案中，反应物混合物中的两相是使用高剪切混合器(high shear mixer)或空化器(cavitator)混合的。
在处理期间，在甘油-水相中，甘油的量可以提高至高于最优水平。因此，可以有利地在甘油-水相重新使用之前，例如，在本发明的工艺中再使用之前，从包含脂肪酸烃基酯的相分离甘油-水相或其至少一部分，并减少甘油-水相中的甘油的量，例如，通过超滤法减少。
包含脂肪酸烃基酯的相可以以碱剂处理，优选以NaOH或KOH处理，以促进含有FFA的皂料级分的离析。可以酸化该含有FFA的级分(例如，以HCl或H2SO4酸化)，并将FFA用作酯化工艺中的原料，例如，在本发明的工艺中用作原料。
含有脂肪酸烃基酯和FFA的脂肪相可以在低水反应条件下与固定的脂肪酶在无水醇过剩下反应。该方法在填充层柱(packed bed column)中或在搅拌釜(stirred tank)中使用例如固定的脂肪酶(例如NOVOZYM435)。反应将会进行直至达到由反应中的水的量所决定的平衡。水是由游离脂肪酸的酯化所产生的。取决于反应之前在脂肪相中的游离脂肪酸的浓度和在终产物中FFA可接受的浓度，可能需要以固定的酶在多于一个步骤中进行酯化工艺。
在本发明的工艺的一个优选的实施方案中，使用来自细毛嗜热霉的液态脂肪酶处理大豆油和甲醇以产生FAME。甘油-水相可以包含45-85%甘油，且甘油-水相以反应物混合物的%计可以是15-25%。随着大豆油分解和FAME产生，甘油-水相中的甘油的量提高。含有酶和未反应的甲醇的主要部分的甘油-水相可以从FAME相分离并重新使用于下一批次的甘油三酯。可以添加新鲜的液体脂肪酶以将脂肪酶活性维持在合意的水平，并添加甲醇以保持大约1.5摩尔当量的浓度。该实施方案提供非常简单的工艺，其中多数过量的甲醇和剩余的酶活性随甘油-水相回收，并容易地重新使用于下一个批次。批次的数量仅仅受限于每个批次后甘油-水相的体积提高和由其导致的脂肪相的体积的下降。
可以将来自该反应的脂肪相(FAME+FFA)离析并以NaOH溶液洗涤以从FFA形成皂类，其中当将皂类离析、酸化后，将其分离以回收FFA，并添加回工艺中。作为碱处理消除FFA的替代，可以在单独步骤中通过使用液体或固定的脂肪酶酯化。
在本发明的工艺的另一个优选的实施方案中，使用来自细毛嗜热霉的液态脂肪酶处理大豆油和甲醇以产生FAME。甘油-水相包含45-85%甘油，且甘油-水相以反应物混合物的%计可以是15-25%。随着大豆油分解和FAME产生，甘油-水相中的甘油的量提高。含有酶和未反应的甲醇的主要部分的甘油-水相可以从FAME相分离并重新使用于下一批次的甘油三酯。甘油-水相的一部分通过分离(流走)而除去。当使甘油-水相返回反应器时，可以添加新鲜的液态脂肪酶以将脂肪酶活性维持在合意的水平并可以添加甲醇以保持其浓度在大约1.5摩尔当量。该实施方案允许以同等容量一批次接着一批次的处理，因为甘油-水相的体积是保持恒定的。
可将来自该反应的脂肪相(FAME+FFA)分离并以NaOH溶液洗涤以形成皂类，将皂类离析、酸化，分离以回收FFA，并将其添加回到工艺中。除了碱处理外，还可以在单独步骤中使用液态或固定的脂肪酶酯化FFA。
在本发明的工艺的另一个优选的实施方案中，使用来自细毛嗜热霉的液态脂肪酶处理大豆油和甲醇以产生FAME。甘油-水相包含45-85%甘油，且甘油-水相以反应物混合物的%计可以是15-25%。随着大豆油分解和FAME产生，甘油-水相中的甘油的量提高。含有酶和未反应的甲醇的主要部分的甘油-水相可以从FAME相分离并重新使用于下一批次的甘油三酯。甘油-水相的一部分通过分离(流走)而除去。在重新使用之前，通过重力分离甘油-水相以获得轻质级分和重质级分。轻质级分会具有相对高的酶活性。除去重质级分的一部分以减少甘油-水相的总体积。当使甘油-水相返回反应器时，添加新鲜的液体脂肪酶以将脂肪酶活性维持在合意的水平，并添加甲醇以将其浓度保持在大约1.5摩尔当量。
可以将来自该反应的脂肪相(FAME+FFA)离析并以NaOH溶液洗涤以形成皂类，将皂类离析、酸化，并分离以收集FFA，将其添加回到工艺中。除了碱处理外，还可以在单独步骤中通过使用液态或固定的脂肪酶酯化FFA。
在本发明的工艺的另一个优选的实施方案中，使用来自细毛嗜热霉的液态脂肪酶处理大豆油和甲醇以产生FAME。甘油-水相包含45-85%甘油，且甘油-水相以反应物混合物的%计可以是15-25%。随着大豆油分解和FAME产生，甘油-水相中的甘油的量提高。含有酶和未反应的甲醇的主要部分的甘油-水相可以从FAME相分离并重新使用于下一批次的甘油三酯。甘油-水相的一部分通过分离(流走)而除去。在重新使用之前，通过超滤法分离甘油-水相以获得包含酶的渗余物(retentate)级分和透过物级分(permeate fraction)。除去透过物级分以减少甘油-水相的总体积。当渗余物返回到反应器时，添加新鲜脂肪酶和甲醇以将脂肪酶活性和醇含量维持在合意的水平。可添加水和/或甘油以调节甘油-水相的体积。该实施方案提供了使几乎所有酶都从甘油-水相回收且在每个批次中甘油-水相的体积和组份可以保持恒定的方法。
可以将来自该反应的脂肪相(FAME+FFA)离析，并以NaOH溶液洗涤以形成皂类，将皂类离析、酸化，且分离以收集FFA，并将其添加回到工艺中。除了碱处理消除FFA之外，还可以在单独步骤中通过使用液态或固定的脂肪酶酯化FFA。
脂肪酸烃基酯组合物和其用途
脂肪酸烃基酯用在广范围的产品中，且用作合成中间体。它们的一些工业应用包括作为以下用途：润滑剂(lubricants)、增塑剂(plasticizers)、防锈剂(antirust agents)、钻井油和切削油(drilling and cutting oils)、以及用于过氧酰胺(superamide)和脂肪醇的合成的起始材料。本发明的一些实施方案特别涉及燃料。短链醇的脂肪酸烃基酯是无毒、可生物降解的，且由于其与基于石油的燃料在十六烷值(cetane number)、能含量(energy content)、粘度、相变(phasechanges)中的相似性，是完全或部分替代基于石油的燃料的极好的替代品。
通过本发明的工艺而产生的组合物可以是由以下组份的至少两种或甚至三种的混合物组成的：FAAE；甘油三酯；甘油二酯；甘油一酯；甘油；和水。
组合物可以潜在地通过领域内已知的方法精制或提纯，如蒸馏(包括闪蒸(flash evaporation)、汽提(stripping)、和除臭(deodorization));相分离(phaseseparation)；提取(extraction)；和干燥(drying)。这类精制的目的可以是从组合物中除去或回收一种或多种上述的组份。实例包括，但不限于，用于除去水的干燥；用于除去甘油的相分离；以及用于离析FAAE的蒸馏。因此，可以不加以进一步的精制而应用粗制的混合物(组合物)，或通过一种或多种方法精制。这可以包括从甘油-水相分离包含FAAE的相，并进一步以固定的脂肪酶处理以提高FAAE含量。优选将FAAE含量提高至至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或者甚至至少99%(w/w)。
进一步通过以下的实施例描述本发明，所述实施例不应理解为限制本发明的范围。
材料与方法
脂肪分解活性
可以使用甘油三丁酸酯(tributyrine)作为底物测定脂肪分解活性。该方法基于通过酶水解甘油三丁酸酯，以及将在水解期间为了维持pH恒定的碱消耗表示(register)为时间的方程。
将一个脂肪酶单位(Lipase Unit,LU)定义为在标准条件下(即，在30℃；pH7.0；带有作为乳化剂的0.1%w/v的阿拉伯胶(Gum Arabic)和作为底物的0.16M甘油三丁酸酯)，每分钟释放1微摩的可滴定的丁酸。一个KLU是1000LU。
脂肪分解酶
脂肪酶A是包含来自细毛嗜热霉的脂肪酶(氨基酸序列在WO95/22615的SEQ ID NO:2的1-269位中显示)的液态脂肪酶制备物，其具有100KLU/g的声明活性，以及大约1.05g/ml的密度。
脂肪酶B是包括来自南极假丝酵母的脂肪酶B(氨基酸序列在WO2008/065060的SEQ ID NO:1中显示)的液态脂肪酶制备物，其具有500KLU/g的声明活性，以及大约1.20g/ml的密度。
脂肪酶C是包含来自细毛嗜热霉的脂肪酶的变体的液态脂肪酶制备物，所述变体具有取代T231R+N233R。该变体在WO2000/60063中公开。该制备物具有100KLU/g的声明活性。
实施例1：
脂肪酸甲酯(Fatty acid methyl esters，FAME)是使用不同的甘油-水与甘油三酯比例和不同的甘油-水相中的水的比例，以脂肪酶A通过大豆油的酯交换产生的。以下参数在实验设置中是变化的(见表1)。
使用了带有玻璃滤器底部(glass filter bottom)的玻璃反应器(20ml体积)。在添加酶之前将玻璃滤器以少量的油浸湿。
甲醇的剂量是总脂肪酸的1.5摩尔当量，对应于1.63g甲醇每10g油。从开始以0.25倍当量添加甲醇，2小时后添加0.25倍当量且4小时后添加1倍当量。
反应是在35℃在Innova温育器中，以200rpm进行的。每批次的反应时间是24小时。
在24小时后，将含有酶的甘油-水相回收并与新的油和甲醇的批次重新使用。以相同的酶加载处理了5个批次。
通过气相色谱定量了脂肪酸甲酯的产率。
Figure BDA0000383808330000141
表示为来自五个批次的总的FAME的最高产率是以50:50甘油-水相，以及反应物混合物的40%(w/w)的甘油-水相而达到的。
实施例2：
脂肪酸乙酯(Fatty acid ethyl esters，FAEE)是通过大豆油的酯交换而产生的。将比例为8:1:1(800g:100g:100g)的大豆油、甘油和水添加至反应器，其中酶剂量为5g脂肪酶A/kg油。将反应器在35℃温育，并以1000rpm搅拌。将相对总脂肪酸(168.9g)的1.3摩尔当量的总剂量的乙醇(96%)在最初5小时25分钟连续添加。
在1、2、3、4、5、6、23、和32小时取1ml样品，并在真空浓缩器(vacuumconcentrator)中在60℃蒸发
Figure BDA0000383808330000142
小时以除去过量乙醇。通过气相色谱定量脂肪酸乙酯的产率。将结果在表4中显示。
实施例3：
将水：甘油：大豆油以比例1:1:8(2g:2g:16g)或0.5:1.5:8(1g:3g:16g)混合，并与量为油的0.5%w/w的脂肪酶(脂肪酶B)在35℃反应48小时。将相对总脂肪酸的1.5摩尔当量的甲醇添加，其中从开始和在1小时后添加0.25摩尔当量，在3小时后添加剩下的。将结果在表5中显示。
添加高量的甘油(b-组数据)导致了更低的FFA和高产量的FAME。对于高量甘油添加，达到了更高百分数的FAME。考虑到甘油是来自酯交换的反应产物，这是很令人惊讶的，因为本应到预期这会通过将平衡推向甘油三酯形成而减少FAME产生。
实施例4：
将菜籽油(85g)与由不同比例的水合甘油所组成的甘油-水相混合；甘油的含量从甘油-水相的0到90%w/w变化。将在每个批次前的系统中的甘油-水相的量维持恒定在总质量的20%w/w。将酶(脂肪酶C)以油的1%w/w的量添加。将相对于总脂肪酸的1.5摩尔当量的甲醇以三个相等的份数添加：在开始、在2小时后和在4小时后。反应温度是35℃且反应时间是21小时。反应是在良好混合的批式反应器中进行的。在残余甲醇挥发后，分别通过GC和滴定确定脂肪相中的FAME和FFA的含量。结果显示将部分的水替换为甘油提高了FAME的产量且减少了FFA的量(表6)。
Figure BDA0000383808330000152
实施例5：
将菜籽油(85g)用作底物并与由水组成的甘油-水相混合用于第一批次。第一批次的系统中的甘油-水相的量是总质量的20w/w%。将甲醇(相对于脂肪酸的1.5摩尔当量)以三个相等的份在开始、在2小时后和在4小时后添加。反应温度是35℃，酶(脂肪酶C)剂量是油的1%w/w。使反应在混合良好的批式反应器中进行24小时。在每个批次后将各相通过离心分离，并将甘油-水相除去。甘油水相含有水、产生自酯交换的甘油、酶、以及大约90%的残留甲醇。剩余的10%的甲醇溶解在脂肪相中。当重新使用甘油-水相时，在为下一个批次添加甲醇时，将残留的甲醇纳入考虑，所以对于批次2-5，仅添加1.0摩尔当量的甲醇。在残留甲醇挥发后，通过GC测定油相中的FAME的含量。将每个批次之后的结果在表7中显示。
Figure BDA0000383808330000161
该结果说明，甘油-水相的重新使用维持了酶活性的非常高的比例，因为在批次5之后FAME含量依然非常高。
对于每个处理的批次，由于在酯交换工艺中形成的甘油的量，甘油-水相的组成改变。每个批次甘油-水相要添加大约85g*0.1=8.5g的甘油(在第一批次后甘油-水相的28.6%)。将计算的在批次2-5的每一批次之前的甘油-水相中的水和甘油的比例在表8中显示。
Figure BDA0000383808330000162
Figure BDA0000383808330000171
实施例6：
将以95:5w/w的比例的大豆油和油酸作为与甲醇酯交换的底物。脂肪酶(脂肪酶C)剂量是相对于油底物的1%w/w。将甘油-水相(甘油-水相)与底物以甘油-水相：底物=20:80w/w的比例混合，其中所述甘油-水相是由1:4w/w的比例的水和甘油组成的。
将甲醇以脂肪酸的总量的1.5摩尔当量添加。将三分之一的甲醇从开始添加，并将剩余的甲醇在之后的4小时期间以恒定的速率添加。反应温度是35℃，且反应时间是16小时。
在离心后分离脂肪相和甘油-水相。在80℃以2%w/w的苛性碱溶液(85g水中的15g NaOH)在搅拌条件下洗涤脂肪相30分钟。通过离心和分离除去在碱洗中形成的皂类。分析碱洗之前和之后的脂肪相的样品。将结果在表9中显示。
Figure BDA0000383808330000172

Claims (15)

1.一种用于产生脂肪酸烃基酯的工艺，其包括：
形成包含脂肪酸原料、醇、水、和甘油的两相反应物混合物，
使所述反应物混合物与一种或多种脂肪分解酶接触，
其中甘油-水相构成反应物混合物的5至50%、10至50%、20至50%、20至45%、或甚至20至40%(w/w)，并且
其中甘油构成甘油-水相的30至85%、40至85%、45至85%、50至85%、或甚至60至80%(w/w)。
2.根据权利要求1的工艺，其中甘油构成甘油-水相的30至70%、35至70%、40至70%、或甚至45至70%(w/w)。
3.根据前述权利要求的任一项的工艺，其中所述醇是C1-C5醇，优选乙醇或甲醇。
4.根据前述权利要求的任一项的工艺，其中醇含量小于在反应物混合物中脂肪酸(游离的和甘油结合的脂肪酸)的量的4、3、2、1.5、或1.0摩尔当量。
5.根据前述权利要求的任一项的工艺，其中逐步和/或连续添加醇。
6.根据前述权利要求的任一项的工艺，其中所述一种或多种脂肪分解酶选自脂肪酶、磷脂酶、角质酶及其混合物。
7.根据前述权利要求的任一项的过程，其中所述脂肪酸衍生自以下的一种或多种：藻油(algae oil)、双低菜油(canola oil)、椰子油(coconut oil)、蓖麻油(castor oil)、椰子油、椰干油(copra oil)、玉米油(corn oil)、棉籽油(cottonseedoil)、亚麻油(flax oil)、鱼油(fish oil)、葡萄籽油(grape seed oil)、大麻油(hempoil)、麻风树油(jatropha oil)、希蒙得木油(jojoba oil)、芥子油(mustard oil)、双低菜油、棕榈油(palm oil)、棕榈硬脂(palm stearin)、棕榈液油(palm olein)、棕榈仁油(palm kernel oil)、花生油(peanut oil)、菜籽油(rapeseed oil)、米糠油(rice bran oil)、红花油(safflower oil)、大豆油(soybean oil)、向日葵油(sunfloweroil)、妥尔油(tall oil)、来自盐生植物的油(oil from halophytes)，和/或动物脂肪，包括来自猪、牛肉和羊的动物脂(tallow)，猪油(lard)、鸡脂肪、鱼油、黄油脂(yellow grease)、和棕油脂(brown grease)或其任意组合。
8.根据前述权利要求的任一项的工艺，其中所述过程是以分批模式或连续模式进行的。
9.根据前述权利要求的任一项的工艺，其中回收和重新使用所述甘油-水相。
10.根据前述权利要求的任一项的工艺，其中在甘油-水相重新使用前，减少所述回收的甘油-水相或至少其一部分中的甘油的量，例如通过超滤法减少。
11.根据前述权利要求的任一项的工艺，其中使用高剪切混合器或空化器混合所述反应物混合物中的溶液相。
12.根据前述权利要求的任一项的工艺，其中所述过程以逆流模式进行。
13.根据前述权利要求的任一项的工艺，其中将包含脂肪酸烃基酯的相从所述甘油-水相分离并进一步以固定的脂肪酶处理以提高脂肪酸烃基酯的含量，例如，到至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或者甚至至少99%(w/w)。
14.根据前述权利要求的任一项的工艺，其中以碱剂处理包含脂肪酸烃基酯的相以促进含有FFA的部分的分离。
15.根据前述权利要求的任一项的工艺，其中将含有FFA的部分用作酯化工艺中的原材料。
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