JP2859520B2 - リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物 - Google Patents

リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物

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    • Y10S530/825—Bacteria

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規なリパーゼ、それを
生産する微生物、該リパーゼの製造方法及びその用途に
関する。さらに詳しく言えば、シュードモナス（Pseudo
monas ）属細菌の生産する、洗濯液中で活性を有するリ
パーゼ、それを生産する微生物、該リパーゼの製造方法
及び洗濯液中で脂質を分解することの出来る酵素を含有
する洗剤組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】洗濯における洗浄効率の向上のために、
洗剤に酵素を配合して利用することは従来より知られて
いる。たとえば洗剤組成物にプロテアーゼを配合して被
洗浄物に付着したタンパク質その他汚垢を分解除去する
こと、また、セルラーゼを配合してセルロース繊維被洗
浄物に付着した汚垢を除去する、あるいはアミラーゼ等
の多糖分解酵素を配合して被洗浄物に付着した多糖その
他汚垢を分解除去することが知られている。更に、近年
においては、洗剤にリパーゼを配合して被洗浄物に付着
した脂質を分解除去し洗浄効率を向上出来ることが知ら
れている。この用途は、アンドレー（H.Andree）らによ
る「洗浄剤成分としてのリパーゼ」（Lipase as deterg
ent components）と題する報文（Journal of Applied B
iochemistry, 2, 218-229 (1980)）等に記載されてい
る。
【０００３】好ましい洗剤配合用のリパーゼは、洗濯液
中で充分にリパーゼ活性が機能するものである。通常の
洗濯条件では洗浄液のｐＨがアルカリ性領域にあるた
め、アルカリ性ｐＨで機能するリパーゼが求められる。
また、一般に脂質汚れは高温高アルカリ条件下では比較
的除去されやすいが、低温（60℃以下）の洗浄では充分
に脂質汚れを除去出来ないことが知られている。従来よ
り主として低温洗濯が行われているわが国はもとより、
欧米においても洗濯温度は低温化する傾向にあり、従っ
て、好ましい洗剤配合用リパーゼは、低温でも充分に機
能するものである。また、好ましい洗剤配合用リパーゼ
は、界面活性剤等の洗剤成分や、多くの洗剤に含有され
ているプロテアーゼや漂白剤存在下でも洗濯時に充分機
能を発揮しうるものである。さらに、好ましい洗剤配合
用リパーゼは、洗剤に配合した状態で保存する時にも共
存する洗剤含有成分に対して安定であるものである。以
上のような好ましい特性を有するリパーゼを配合してな
る脂質汚れに対して高い洗浄効果を有する洗剤組成物の
開発が望まれている。
【０００４】微生物の生産するリパーゼは、シュードモ
ナス（Pseudomonas ）属、アルカリゲネス（Alcaligene
s ）属、アクロモバクター（Achromobacter ）属、ムコ
ール（Mucor ）属、キャンディダ（Candida ）属、フミ
コーラ（Humicola）属等に由来することが知られてい
る。しかしながら、これらの菌株から得られる大部分の
リパーゼはその至適ｐＨが中性から微アルカリ性にある
ため、アルカリ性の洗剤溶液中で充分にリパーゼが機能
せず、また、洗剤溶液中での安定性も低い。さらには、
アクロモバクター（Achromobacter ）属、キャンディダ
（Candida ）属、ムコール（Mucor ）属、フミコーラ
（Humicola）属の各リパーゼは、アニオン性界面活性剤
の共存下においてその活性を強く阻害される。
【０００５】また、シュードモナス（Pseudomonas ）属
に属する微生物がリパーゼを生産することは、広く知ら
れている。リパーゼを生産するシュードモナス（Pseudo
monas ）属の菌株にはシュードモナス・フルオレッセン
ス（Ps.fluorescens）、シュードモナス・セパシア（P
s.cepacia）、シュードモナス・フラギ（Ps.fragi）、
シュードモナス・アルカリゲネス（Ps.alcaligenes）、
シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ps.pseudoa
lcaligenes）、シュードモナス・アエルギノサ（Ps.aer
uginosa ）がある。しかし、これらの菌株から得られる
公知の酵素も前記の特性を満足するものではない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、洗濯
液中で充分機能し、共存する洗剤含有成分により活性が
ほとんど阻害される事なく、且つ界面活性剤やプロテア
ーゼ等の洗剤成分に対する安定性が高いリパーゼ、かか
るリパーゼを生産する微生物、該リパーゼの製造方法を
提供しようとするものである。また、かかるリパーゼを
含有する酵素含有洗剤組成物を提供するものである。さ
らに、前記リパーゼの他にプロテアーゼなどのその他の
酵素を含んでなる酵素含有洗剤組成物を提供するもので
ある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の性
質を有するリパーゼを得るべく、多数の微生物を分離
し、培養して検索した結果、東京都下の土壌より分離し
た菌株であるシュードモナスｓｐ．（Pseudomonas sp.
）ＳＤ７０５株に代表されるシュードモナス（Pseudom
onas ）属に属する菌株が、洗剤配合用として有効な新
規なリパーゼを生産することを見いだした。
【０００８】（生産菌）本発明のリパーゼを製造するた
めに使用する微生物は、後記の性質を有するリパーゼを
生産することができ、かつ後記の分類学上の性質を有す
るシュードモナス（Pseudomonas ）属細菌であれば特に
限定されない。この様な細菌は、保存菌株中から、また
は自然界から新たに分離した微生物中から選択すること
が出来る。またこれらの細菌の自然または人工変異株で
あっても、後記の性質を有するリパーゼの生産能を有す
る限り、当然包含されるものである。かかる細菌菌株は
土壌その他の分離源から常法に従って分離することがで
きる。目的とする菌株の選択は、被検微生物を例えば通
常の細菌用培地中で培養し、高ｐＨ常温条件下での培養
液のリパーゼ活性を常法に従って測定することにより行
うことができる。
【０００９】本発明の新規なリパーゼを生産するシュー
ドモナス（Pseudomonas ）属に属する菌株の一例とし
て、本発明者らが東京都下の土より分離したＳＤ７０５
株が挙げられる。このＳＤ７０５株の菌学的性質につい
て、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック
・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology,1984 ）を参考にして本菌と比較的類似の
菌学的性質をもつシュードモナス・アルカリゲネス（Ps
eudomonas alacaligenes）、シュードモナス・シュード
アルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes ）と
比較して表１に記載した。
【００１０】
【表１】
【００１１】ＳＤ７０５株は表１に示したように、エタ
ノールアミン、メサコン酸、ベタイン、フラクトースの
資化性がシュードモナス・シュードアルカリゲネスと異
なり、アルギニンジヒドロラーゼの有無、脱窒反応の有
無、β−ヒドロキシ酪酸の資化性がシュードモナス・ア
ルカリゲネスと異なっており、さらにＧＣ含量は両菌株
よりも低かった。これらの結果より本菌株はシュードモ
ナス属に属するシュードモナス・アルカリゲネスの近縁
種の新種であると決定した。本菌株は工業技術院生命工
学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３７８１として寄
託されている。
【００１２】また、上記菌株を原菌株として自然または
誘発突然変異により、上記菌株が生産する後記の性質を
有するリパーゼを生産する変異株を得ることができ、本
発明によるリパーゼの生産菌として用いることができ
る。これらの変異株の調整法としては、例えば慣用の方
法として、原菌株を紫外線照射処理あるいはＮ- メチル
- Ｎ'-ニトロ- Ｎ- ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の
薬剤による人工的突然変異処理を施さずに、またはかか
る処理を施して、オリーブオイル等の油を含む寒天培地
に広げ、生育してくる菌株の中からコロニーのまわりに
形成されるクリアゾーンの大きさが、より大きいコロニ
ーを選抜し、リパーゼ生産用培地にて培養して生産性の
最も優れた菌株を選抜する方法がある。
【００１３】（製造方法）本発明のリパーゼはシュード
モナス（Pseudomonas ）属に属する本リパーゼ生産菌を
培養することにより、主として菌体外（培養液中）に産
生される。培地の栄養源としては、通常培養に用いられ
ているものが広く利用できる。炭素源としては同化でき
る炭素化合物またはこれを含有するものであればよく、
例えば油脂、コーンスティープリカー、Tween 系界面活
性剤などが用いられる。窒素源としては同化可能な窒素
化合物またはこれを含有するものであればよく、例えば
アンモニウム塩、硝酸塩、大豆粉、肉エキス、コーンス
ティープリカー、ファーマメディアなどが用いられる。
また、無機塩類としてはリン酸水素アンモニウム、リン
酸水素カリウム等のリン酸塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩、マンガン塩などの塩類を適宜添加することもで
きる。
【００１４】培養条件は培地組成により多少異なるが、
生産の目的である本リパーゼの生産に適した条件であれ
ば良いが、通常は以下に示す条件を選択する。培養温度
は１０〜４０℃、より好ましくは２０〜３７℃の範囲で
あり、培養時間は８時間から１００時間程度であり、本
リパーゼの生産が最高に達したときに培養を終了すれば
よい。培地のｐＨは５〜１２で行えば良いが、特に７〜
１０が本リパーゼ生産に好適である。この様な培養によ
り、目的とするリパーゼは主として菌体外（培養液中）
に産生される。
【００１５】（分離精製法）この様にして得られた培養
液からの本リパーゼの採取は、リパーゼを採取するため
の常法にしたがって分離、精製することにより行うこと
が出来る。すなわち、培養液からろ過法や遠心分離法な
どの公知の適当な方法により菌体や培地固形物を分離し
て得られる上清液またはろ液を分離し、これらの分離液
を濃縮しまたは濃縮することなく、可溶性塩類を添加し
て酵素を沈澱させる塩析法、親水性有機溶剤を添加し酵
素あるいは夾雑物を沈澱させる有機溶剤沈澱法、イオン
交換樹脂等を用いた吸着脱離法、ゲルろ過法、安定補助
剤を加えてまたは安定補助剤なしに噴霧乾燥する方法、
凍結乾燥法、等の分離もしくは精製手段を単独または複
数組み合わせて用いることにより、本リパーゼを得るこ
とができる。
【００１６】（酵素力価の測定方法）リパーゼ活性の測
定は、本発明においては、トリオレイン−ポリビニルア
ルコール（ＰＶＡ）エマルジョンを基質とする測定法を
用いて実施した。この力価測定法は具体的には以下の方
法で行った。
【００１７】酵素液０．１ｍｌ、1mM 塩化カルシウムを
含み、100mM ε−アミノカプロン酸、100mM ビストリス
（ビス〔２−ヒドロキシエチル〕イミノトリス〔ヒドロ
キシメチル〕メタン）及び100mM ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス
〔ヒドロキシメチル〕メチル−３−アミノプロパンスル
ホン酸）からなる混合液を水酸化ナトリウムでｐＨ調整
した緩衝液（pH10.0）０．４ｍｌ、及びトリオレインエ
マルジョン０．５ｍｌからなる混合液を共栓付き試験管
中で３７℃にて１０分間加熱して反応させ、反応停止液
として１Ｎ塩酸０．２ｍｌを用いて反応を停止させた。
ここで、トリオレインエマルジョンとしては、ポリビニ
ルアルコール（ＰＶＡ）２％水溶液（ポバールＰＶＡ１
１７（( 株) クラレ商品名）：ポバールＰＶＡ２０５
（（株）クラレ商品名）＝９：１（W/W ））１０ｍｌに
２．５ｇのトリオレインを加え、ホモジナイズしたもの
を用いた。反応停止後、ｎ−ヘキサン２ｍｌ、イソプロ
ピルアルコール２ｍｌ、蒸留水１ｍｌを加え激しく撹拌
し、静置後ヘキサン層をサンプリングし、ＴＬＣ−ＦＩ
Ｄ法（Minagawaら、Lipids, 18, 732(1983))にてオレイ
ン酸を定量した。活性の単位は１分間に１マイクロモル
のオレイン酸を生成する酵素量を１ユニットと（１Ｕ）
とした。
【００１８】プロテアーゼ活性の測定は、特公昭６０−
５５１１８号に記載の力価測定法により行い、活性の単
位は、ｎｋａｔａｌ（ナノカタール；nkatal=10-9kata
l）で表示した。
【００１９】（酵素の性質）本発明のリパーゼは下記の
性質を有する。すなわち本発明のシュードモナスｓｐ．
（Pseudomonas sp. ）ＳＤ７０５株の生産するリパーゼ
について、以下にその性質を記載する。
【００２０】（１）作用 トリグリセリドに作用し、そのエステルを加水分解す
る。
【００２１】（２）基質特異性 各種グリセリド、エステルなどを広範囲にわたり加水分
解する。グリセリド基質としては、各グリセリド−アラ
ビアゴムエマルジョンを用いた。用いたエマルジョンは
グリセリド１０ｇにアラビアゴム１０ｇ、蒸留水１００
ｇを加え、ホモジナイズしたエマルジョンを用いた。
【００２２】前記エマルジョン５ｍｌ，100mM 塩化ナト
リウム及び25mM塩化カルシウムを含む10mMトリス緩衝液
（ｐＨ１０．０）５ｍｌ、蒸留水４．５ｍｌ、酵素液
０．５ｍｌの混合物を３０℃、ｐＨ１０にて反応せしめ
たときの脂肪酸生成速度を0.05N 水酸化ナトリウム水溶
液を用いたｐＨスタット滴定法により求めた。この脂肪
酸生成速度を各基質の分解力とした。
【００２３】トリオレインの分解力を１００とするとト
リブチリン１２５、オリーブ油５５、大豆油７０、綿実
油６６の相対活性を示す。また、エステルに対する分解
力は、ｐ−ニトロフェニル脂肪酸エステルを基質とし、
ｐＨ８．０、３０℃での加水分解反応により生じるｐ−
ニトロフェノールの比色（ＯＤ405 ）より求めた。ｐＮ
ＰＰ（ｐ−ニトロフェニルパルミテート）の分解力を１
００とした場合、ｐＮＰＬ（ｐ−ニトロフェニルラウレ
ート）１３４、ｐＮＰＶ（ｐ−ニトロフェニルバレレー
ト）３４の相対活性を示す。
【００２４】（３）作用ｐＨおよび至適ｐＨ トリオレインエマルジョンを基質として、前記の力価測
定法により測定した。反応時のｐＨは、3.5 〜12.0の範
囲で異なるｐＨにおいて測定した。ただし緩衝液として
1.0mM の塩化カルシウムを含み、100mM ε−アミノカプ
ロン酸、100mMビストリス（ビス〔２−ヒドロキシエチ
ル〕イミノトリス〔ヒドロキシメチル〕メタン）及び 1
00mMＴＡＰＳ（Ｎ−トリス〔ヒドロキシメチル〕メチル
−３−アミノプロパンスルホン酸）からなる混合緩衝液
を塩酸または水酸化ナトリウムでｐＨ調整したものを用
いた。反応ｐＨと相対活性の関係は図１に示すとおりで
あり、ｐＨ３．５〜１２の範囲で測定した場合、作用ｐ
Ｈは３．５〜１２であり、至適ｐＨは１０〜１１であ
る。
【００２５】（４）作用温度および至適温度 トリオレインエマルジョンを基質として、３０〜８０℃
の範囲の異なる反応温度にて行うこと以外は、前記の力
価測定法と同様の方法で測定した。反応温度と相対活性
の関係は図２に示すとおりであり、３０〜８０℃の範囲
で測定した場合の作用温度は３０〜８０℃、至適温度は
５５〜６５℃である。４０℃および７０℃においては、
至適温度における活性の約５０％の相対活性を示す。
【００２６】（５）温度安定性 ２０℃〜７０℃の温度範囲の異なる温度でｐＨ７にて１
時間保温処理した後の残存活性を、前記の力価測定法で
測定した。この時の処理温度と残存活性の関係は図３に
示すとおりであり、６０℃の処理で８０％以上の活性を
有する。処理時の緩衝液は、50mMε−アミノカプロン
酸、50mMビストリス（ビス〔２−ヒドロキシエチル〕イ
ミノトリス〔ヒドロキシメチル〕メタン）及び50mMＴＡ
ＰＳ（Ｎ−トリス〔ヒドロキシメチル〕メチル−３−ア
ミノプロパンスルホン酸）からなる混合緩衝液を塩酸で
ｐＨ７に調整したものを用いた。
【００２７】（６）ｐＨ安定性 ｐＨ４〜１２のｐＨ範囲の異なるｐＨで３７℃にて１時
間処理した後の残存活性を前記の力価測定法で測定し
た。この時の処理ｐＨと残存活性の関係は図４に示すと
おりであり、ｐＨ４〜１０で５０％以上の残存活性を有
する。処理時の緩衝液は0.5mM の塩化カルシウムを含
み、50mMε−アミノカプロン酸、50mMビストリス（ビス
〔２−ヒドロキシエチル〕イミノトリス〔ヒドロキシメ
チル〕メタン）、50mMＴＡＰＳ（Ｎ−トリス〔ヒドロキ
シメチル〕メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）混
合緩衝液を塩酸または水酸化ナトリウムでｐＨ調整した
ものを用いた。
【００２８】（７）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（分子量標
準：チトクロームＣ(モノマー、ダイマー、トリマー、
テトラマー、ヘキサマー) ）により得られた分子量は 3
1000±2000である。
【００２９】（８）等電点 等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定し
た等電点は 5.2±0.5である。
【００３０】（９）洗剤成分による影響 トリオレインエマルジョンを基質として、後記標準使用
濃度の各種市販洗剤（４種）と代表的な洗剤用アルカリ
プロテアーゼであるＡＰＩ−２１（特公昭６０−５５１
１８号）を０．３ｎｋａｔ／ｍｌの濃度で添加し反応ｐ
Ｈを１０、反応時間を３０分とする以外は、前記の力価
測定法と同様の方法により測定した。市販洗剤およびＡ
ＰＩ−２１を添加しない時の活性を１００としたときの
相対活性は表２に示すとおりであり、プロテアーゼを含
む各種洗剤溶液中で高い活性を有する。
【００３１】上記の性質を有するリパーゼは低温（６０
℃以下）でも十分に機能し、洗剤溶液中でも安定にその
活性を発現することから洗剤配合用リパーゼとして好ま
しい。
【００３２】（洗剤組成物）本発明により、前記の性質
を有するリパーゼを配合した洗剤組成物が提供される。
本発明の洗剤組成物に配合されるリパーゼの量には特に
限定はないが、一般には洗剤組成物１グラム当たり１０
０〜１００００ユニット、好ましくは５００〜４０００
ユニットの割合で配合する。この配合量が少なすぎると
十分な洗浄効果の向上が得られず、また逆に多過ぎた場
合には酵素配合量に比して洗浄効果の向上が大きくな
く、経済性の点で好ましくない。
【００３３】本発明に従えば、前記リパーゼは従来公知
の任意の洗剤組成物に洗剤組成物の組成を何等変更する
ことなく配合することができ、本発明の洗剤組成物の成
分については特に限定はない。そのような洗剤組成物の
代表例をあげれば、洗剤組成物重量当たり１０〜５０重
量％の界面活性剤、０〜５０重量％のビルダー、１〜５
０重量％のアルカリ剤あるいは無機電解質、０．１〜５
重量％の再汚染防止剤、酵素、漂白剤、蛍光染料、ケー
キング防止剤及び酸化防止剤からなる群より選ばれる少
なくとも１種以上の配合成分からなる洗剤組成物があげ
られる。
【００３４】界面活性剤としては石鹸、例えば直鎖また
は分岐アルキルあるいはアルケニル硫酸塩、アミド硫酸
塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基
を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及
びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは複数成分が
付加したアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩のよ
うな脂肪族硫酸化物、アルキルスルホン酸塩、アミドス
ルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩、α−オレフ
ィン、ビニリデン型オレフィン及び内部オレフィンの各
スルホン酸塩のような脂肪族スルホン酸塩、直鎖または
分岐鎖のアルキルベンゼンスルホン酸塩のような芳香族
スルホン酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはア
ルケニル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオ
キサイド及びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは
複数成分が付加したアルキルまたはアルケニルエーテル
カルボン酸塩またはアミド、α−スルホ脂肪酸塩または
エステル、アミノ酸型界面活性剤、アルキルまたはアル
ケニル酸性リン酸エステル、アルキルまたはアルケニル
リン酸塩の如きリン酸エステル系界面活性剤、スルホン
酸型両性界面活性剤、ベタイン型両性界面活性剤、直鎖
または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有し、
エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレ
ンオキサイドのうちの単独あるいは複数成分が付加した
アルキルまたはアルケニルエーテルあるいはアルコー
ル、直鎖または分岐鎖のアルキル基を有し、エチレンオ
キサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイ
ドのうちの単独あるいは複数成分が付加したポリオキシ
エチレンアルキルフェニルエーテル、高級脂肪酸アルカ
ノールアミドまたはそのアルキレンオキサイド付加物、
ショ糖脂肪酸エステル、脂肪酸グリセリンモノエステ
ル、アルキルまたはアルケニルアミンオキサイド、テト
ラアルキルアンモニウム塩型カチオン界面活性剤など洗
剤組成物として通常配合される界面活性剤であればいず
れも使用可能であり、陰イオン性界面活性剤の場合の対
イオンとしてはナトリウムイオンまたはカリウムイオン
であることが好ましい。これらの界面活性剤は、単独ま
たは２種以上の混合物として使用される。
【００３５】ビルダー及びアルカリ剤あるいは無機電解
質としてはオルソリン酸塩、ピロリン酸塩、トリポリ酸
塩、メタリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩、フィチン酸塩
などのリン酸塩、エタン−１，１−ジホスホン酸、エタ
ン−１，１，２−トリホスホン酸、エタン−１−ヒドロ
キシ−１，１−ジホスホン酸及びその誘導体、エタンヒ
ドロキシ−１，１，２−トリホスホン酸、エタン−１，
２−ジカルボキシ−１，２ジホスホン酸、メタンヒドロ
キシホスホン酸などのホスホン酸塩、２−ホスホノブタ
ン−１，２−ジカルボン酸、１−ホスホノブタン−２，
３，４−トリカルボン酸、α−メチルホスホノコハク酸
などのホスホノカルボン酸塩、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸などのアミノ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレン
ジアミン四酢酸塩、ジエチレントリアミン五酢酸塩など
のアミノポリ酢酸塩、ポリアクリル酸、ポリイタコン
酸、ポリマレイン酸、無水マレイン酸共重合体、カルボ
キシメチルセルロース塩などの高分子電解質、ポリエチ
レングリコール、ポリビニルアルコールなどの非解離高
分子、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキシ
メチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、ショ
糖、ラクトースなどのカルボキシメチル化物、ペンタエ
リスリトールのカルボキシメチル化物、グルコン酸のカ
ルボキシメチル化物、ベンゼンポリカルボン酸、シュウ
酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸などの有
機酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、炭酸塩、
セスキ炭酸塩、硫酸塩、メタケイ酸塩などの無機塩をア
ルカリ金属塩として用いることができ、またデンプン、
尿素などの有機物質及び塩化ナトリウム、ベントナイト
などの無機化合物を用いることができ、更には有機アル
カリ剤としてトリエタノールアミン、ジエタノールアミ
ン、モノエタノールアミン、トリイソプロパノールアミ
ンなどを用いることができる。
【００３６】本発明の洗剤組成物は、前述の如く、界面
活性剤、リパーゼ、アルカリ剤または無機電解質を必須
の構成成分として含むが、その他必要に応じて両性界面
活性剤、例えば過炭酸ソーダ、過ホウ酸ソーダなどの漂
白剤、色素、ビルダー、例えばポリエチレングリコー
ル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カ
ルボキシメチルセルロースなどの再汚染防止剤、ケーキ
ング防止剤、酸化防止剤、プロテア−ゼなどのその他の
酵素を必要に応じて含ませることができる。
【００３７】本発明の洗剤組成物にリパーゼあるいはプ
ロテアーゼなどのその他の酵素を配合するには如何なる
方法をもって行ってもよいが、微粉末状で配合すること
は、洗剤取扱い時の発塵による洗剤使用者や洗剤工業に
おける作業者の安全衛生上好ましいことではなく、溶液
状態あるいはあらかじめ発塵性をおさえた形状に賦形し
ておくことが好ましい。この賦形は通常良く用いられる
マルメ造粒、押し出し造粒、流動造粒、遠心流動造粒や
その他の方法のいずれによるものであっても良く、本発
明の洗剤組成物に配合するリパーゼあるいはプロテアー
ゼなどのその他の酵素の形状は特にこれらの方法によっ
て賦形されたものに限定されるものではない。
【００３８】
【実施例】次に本発明を実施例を挙げて説明するが、本
発明は下記の実施例に限定されるものではない。なお、
下記の説明中、特に記載がない限り％は重量を基準をす
るものである。
【００３９】実施例１：リパーゼ生産菌（ＳＤ７０５
株）の培養 大豆粉２％、リン酸水素二アンモニウム０．１％、オリ
ーブオイル１％、リン酸水素二カリウム０．５％、硫酸
マグネシウム・７水和物０．１％及び炭酸ナトリウム
０．３％濃度の液体培地２ｍｌを１８ｍｍ径の試験管に
とり、１２１℃、２０分間高圧蒸気滅菌した後、シュー
ドモナスｓｐ．（Pseudomonas sp. ）ＳＤ７０５株を１
白金耳接種し、３５℃で２４時間、１３０rpm で培養し
た。培養後、遠心分離により菌体を除去しリパーゼ液を
得た。この液のリパーゼ活性は５Ｕ／ｍｌであった。
【００４０】実施例２：リパーゼ生産菌（ＳＤ７０５
株）の培養およびリパーゼの取得 大豆粉２％、リン酸水素二アンモニウム０．１％、リン
酸水素二カリウム０．５％、硫酸マグネシウム・７水和
物０．１％、炭酸ナトリウム０．３％及びＴｗｅｅｎ８
５ １．０％濃度の液体培地２リットルを５リットル培
養槽にとり、１２１℃、２０分間高圧蒸気滅菌した後、
シュードモナスｓｐ．（Pseudomonas sp. ）ＳＤ７０５
株を接種し、３５℃で２４時間、１０００rpm で通気撹
拌培養した。培養後、遠心分離により菌体を除去しリパ
ーゼ液を得た。この液のリパーゼ活性は２０Ｕ／ｍｌで
あった。このようにして得られたリパーゼ液から硫安沈
澱法にて２０〜４０％飽和画分の沈澱を得た。これを常
法により脱塩後、凍結乾燥によりリパーゼ原末を得た。
【００４１】実施例３：リパーゼの精製 実施例２で得られたリパーゼ原末を１０％飽和の硫酸ア
ンモニウム溶液に溶解させ、Butyl-Toyopearl 650M（東
ソー（株）商品名）での疎水クロマトグラフィーを行い
活性画分を得た。この活性画分を０．３mMの塩化カルシ
ウムを含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）にて透
析後、同緩衝液で平衡化したDEAE-Cellulofine A-800
（生化学工業（株）商品名）でのイオン交換クロマト樹
脂に吸着させ、塩化ナトリウム濃度勾配にて溶出し活性
画分を得た。これを脱塩後凍結乾燥により精製酵素を得
た。この凍結乾燥品はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により単一であることが確認された。
【００４２】実施例４：本発明リパーゼと他のリパーゼ
の洗剤溶液中の活性比較 実施例２で得られたリパーゼ原末を用いて洗剤溶液中の
活性測定を行い、米国特許第５０６９８１０号に記載さ
れた、シュードモナス アルカリゲネス ＳＤ２株（Ps
eudomonas alcaligenes strain SD2）（ＡＴＣＣ５３８
７７）の生産するリパーゼSD2 、欧州特許２１８２７２
号に記載されたシュードモナス シュードアルカリゲネ
ス（Pseudomonas pseudoalcaligenes ）ＣＢＳ４６７．
８５株、ＣＢＳ４６８．８５株、ＣＢＳ４７１．８５
株、ＣＢＳ４７３．８５株の生産するリパーゼの洗剤溶
液中での活性測定結果と比較した。シュードモナス ア
ルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes ）ＳＤ２株の
酵素は硫酸アンモニウム０．５％、リン酸水素二カリウ
ム０．０５％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０２５
％、トリプトン２．０％、ポリオキシエチレン（２０）
セチルエーテル１．０mMの培地で３０℃で１６時間培養
し、また、前記４種のシュードモナス シュードアルカ
リゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes ）株の酵素
は、それぞれの株をスキムミルク１０％、ｐＨ７の培地
で２０℃で４８時間培養し、遠心分離で得られた培養上
清を用いた。
【００４３】トリオレインエマルジョンを基質として、
標準使用濃度の各種市販洗剤（４種）と代表的な洗剤用
アルカリプロテアーゼであるＡＰＩ−２１（特公昭６０
−５５１１８号）を０．３ｎｋａｔ／ｍｌの濃度で添加
し反応ｐＨを１０、反応時間を３０分とする以外は、前
記の力価測定法と同様の方法により測定した。なお洗剤
は標準使用濃度として、最終濃度がそれぞれアタック
（花王（株）商品名）８３３ｐｐｍ，ウルトラアリエー
ル（プロクター・アンド・ギャンブル・ファーイースト
（株）商品名）１０００ｐｐｍ，ウルトラタイド（プロ
クター・アンド・ギャンブル（株）商品名）１０００ｐ
ｐｍ，フレッシュスタート（コルゲート−パルモリブ
（株）商品名）６２４ｐｐｍとなるよう添加した。市販
洗剤およびＡＰＩ−２１を添加しない時の活性を１００
としたときの相対活性を表２に示した。
【００４４】
【表２】
【００４５】この表より、本発明リパーゼは他のリパー
ゼに比べて洗剤溶液中で高い活性を発揮することが認め
られる。
【００４６】実施例５：洗剤組成物及び洗濯評価 市販洗剤であるアタック（花王（株）商品名）に、実施
例２で得られたリパーゼ原末を２４００ユニット／ｇと
なるように配合して、本発明によるリパーゼを含有する
洗剤組成物を調製した。
【００４７】洗濯評価は次のようにして行った。すなわ
ち、汚染布は、脱脂した綿布（15cm×15cm）に、ベンゼ
ンに溶解したトリオレイン70mgを浸透させ１夜室温で乾
燥したものを用い、洗浄装置は、Ｔｅｒｇ−Ｏ−Ｔｏｍ
ｅｔｅｒを用いた。塩化カルシウムを終濃度50ppm とな
るよう添加した蒸留水１リットルに前記リパーゼ配合洗
剤組成物、及び市販洗剤アタック（花王）をそれぞれ標
準使用濃度で溶解した。前者の場合、液中のリパーゼ濃
度は２ユニット／ｍｌである。更に、プロテアーゼＡＰ
Ｉ−２１（特公昭６０−５５４４８号）を0.3nkat/mlに
なるように添加した。洗濯液１リットルあたり６枚の前
記トリオレイン汚染布を入れ、３０℃の洗濯温度にて、
120rpmで３０分間洗浄した。洗浄後、前記のカルシウム
含有蒸留水１リットルで３分間ずつ２回すすぎを行った
後室温で乾燥した。未洗浄と洗浄後の汚垢布のトリオレ
イン量は、n-ヘキサンで抽出後前記ＴＬＣ−ＦＩＤ法に
て定量し、洗浄効率を以下の計算式により求めた。 洗浄効率（％）＝｛（未洗浄汚染布のトリオレイン量−
洗浄後汚染布のトリオレイン量）／未洗浄汚染布のトリ
オレイン量｝×１００ その結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】表３に示したように本リパーゼを添加した
洗浄では、脂質汚れに対する洗浄効果がリパーゼ無添加
に比べて高い。
【００５０】実施例６：洗剤組成物及び洗濯評価 市販洗剤であるオール（レバーブラザーズ社、商品名）
に、実施例２で得られたリパーゼ原末を２４００ユニッ
ト／ｇとなるように配合したリパーゼ配合洗剤組成物及
び、オールにプロテアーゼＡＰＩ−２１（特公昭６０−
５５４４８号）原末を２７０ｎｋａｔ／ｇとなるように
配合したプロテアーゼ配合洗剤組成物及び、オールに実
施例２で得られたリパーゼ原末を２４００ユニット／ｇ
及びプロテアーゼＡＰＩ−２１原末を２７０ｎｋａｔ／
ｇとなるように配合したリパーゼ／プロテアーゼ配合洗
剤組成物の３種類の洗剤組成物を調製した。
【００５１】洗濯評価は次のようにして行った。すなわ
ち、汚染布は市販の汚染布ＥＭＰＡ１１２を用い、洗浄
装置は、Ｔｅｒｇ−Ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒを用いた。塩化
カルシウムを終濃度50ppm となるよう添加した蒸留水１
リットルに前記の洗剤組成物、または、市販洗剤である
オールをそれぞれ標準使用濃度（終濃度１１００ｐｐ
ｍ）で溶解した。リパーゼ配合洗剤組成物の場合、液中
のリパーゼ濃度は２．６ユニット／ｍｌであり、プロテ
アーゼ配合洗剤組成物の場合、液中のプロテアーゼ濃度
は０．３ｎｋａｔ／ｍｌである。洗濯液１リットルあた
り６枚の前記汚染布を入れ、３０℃の洗濯温度にて、12
0rpmで３０分間洗浄した。洗浄後、前記のカルシウム含
有蒸留水１リットルで３分間ずつ２回すすぎを行った後
室温で乾燥した。洗浄後の汚染布の反射率（４６０ｎ
ｍ）を測定した。洗浄に対する酵素の添加効果は、酵素
配合洗剤組成物で洗浄した場合の反射率と酵素無配合の
洗剤で洗浄した場合の反射率の差で表した。その結果を
表４に示す。
【００５２】
【表４】
【００５３】本リパーゼを添加した洗浄では、プロテア
ーゼを添加した場合も添加しない場合も、洗浄効果がリ
パーゼ無添加に比べて高い。
【００５４】
【発明の効果】本発明のリパーゼは各種の市販洗剤溶液
中、また、界面活性剤、プロテアーゼ等の洗剤成分共存
下で高い安定性と活性を有するため、洗濯条件下で油脂
汚れを効率的に分解除去でき、洗剤に配合して洗浄力の
増強を図ることが出来る。
【００５５】また、本発明のシュードモナスｓｐ．（Ps
eudomonas sp. ）ＳＤ７０５株及びそれと菌学的に同等
な菌株及びその変異株は、本発明のリパーゼを効率的に
生産するために有用である。
【００５６】さらにまた、本発明の、かかる菌株を用い
る、前記性質を有するリパーゼの製造方法は該リパーゼ
の生産を効率的に行うことができる利点を有する。
【００５７】また、本発明によるリパーゼを洗剤に配合
することにより、洗浄特性に優れた洗剤組成物が提供さ
れる。
【００５８】また、本発明によるリパーゼ及びその他の
酵素を洗剤に配合することにより、洗浄特性に優れた洗
剤組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＤ７０５株の生産するリパーゼの反応ｐＨと
相対活性との関係を示すグラフである。
【図２】ＳＤ７０５株の生産するリパーゼの反応温度と
相対活性との関係を示すグラフである。
【図３】ＳＤ７０５株の生産するリパーゼを種々の温度
にてｐＨ７で１時間処理した場合の残存活性を示すグラ
フである。
【図４】ＳＤ７０５株の生産するリパーゼを種々のｐＨ
にて３７℃で１時間保持した後の残存活性を示すグラフ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 小塚 隆司 東京都大田区多摩川２丁目24番25号 昭 和電工株式会社 生化学研究所内 (72)発明者 崎元 和範 東京都大田区多摩川２丁目24番25号 昭 和電工株式会社 生化学研究所内 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，1169（２) （1993），ｐ．156−164 Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（ＴＯＫＹＯ）, 112（５）（1992），ｐ．598−603 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/20 C07K 14/21 C12N 1/20 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の性質を有するリパーゼ： （１）作用pHおよび至適pH トリオレインエマルジョンを基質とし、pH３．５〜１２
    の範囲で測定した場合の作用pHが３．５〜１２、至適pH
    が１０〜１１である； （２）作用温度および至適温度 トリオレインエマルジョンを基質とし、３０〜８０℃の
    範囲で測定した場合の作用温度が３０〜８０℃、至適温
    度が５５〜６５℃である； （３）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定
    した分子量が３１０００±２０００である； （４）等電点 等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定し
    た等電点が５．２±０．５である。
  2. 【請求項２】 シュードモナス（Pseudomonas ) 属に属
    する細菌の培養物より得られる請求項１記載のリパー
    ゼ。
  3. 【請求項３】 シュードモナス ｓｐ．(Pseudomonas s
    p.) ＳＤ７０５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７８１）または
    それと菌学的に同等な菌株の培養物より得られる請求項
    １記載のリパーゼ。
  4. 【請求項４】 請求項１記載のリパーゼを生産するシュ
    ードモナス ｓｐ．(Pseudomonas sp.) ＳＤ７０５株
    （ＦＥＲＭ Ｐ−１３７８１）またはそれと菌学的に同
    等な菌株またはその変異株。
  5. 【請求項５】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のリ
    パーゼの製造方法において、該酵素を生産することがで
    きるシュードモナス（Pseudomonas ) 属微生物又は該リ
    パーゼを生産することができるその変異株を培養し、培
    養液より該リパーゼを採取することを特徴とする方法。
  6. 【請求項６】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のリ
    パーゼを含んでなることを特徴とする洗剤組成物。
  7. 【請求項７】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のリ
    パーゼ及びその他の酵素を含有する洗剤組成物。
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