JP4880469B2 - 洗剤中で改良された安定性を有するプロテアーゼ - Google Patents

Description

本発明は、洗剤組成物中の安定性が改良されたプロテアーゼに関する。本発明は、また、プロテアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド、核酸構築物、組換え発現ベクター、核酸構築物を含んでなる宿主細胞、および本発明のプロテアーゼの製造方法および使用方法に関する。さらに、本発明は、本発明のプロテアーゼを含んでなるクリーニング組成物および洗剤組成物、ならびに洗剤組成物における前記プロテアーゼの使用に関する。

発明の背景
洗剤産業において、酵素は30年より長い間洗浄配合物に関係付けられてきている。このような配合物において使用される酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、マンノシダーゼならびに他の酵素またはそれらの混合物を含んでなる。商業的に最も重要な酵素はプロテアーゼである。

多数のこのようなプロテアーゼの変異型は先行技術、例えば、下記の文献に開示されている: EP 130756 (GENENTECH) (米国再発行特許No. 34,606 (GENENTECH) に対応する); EP 214435 (HENKEL); WO 87/04461 (AMGEN); WO 87/05050 (GENEX); EP 260105 (GENENCOR); Thomas、Russell、およびFersht (1985) Nature 318 375-376; Thomas、Russell、およびFersht (1987) J. Mol. Biol. 193 803-813; Thomas、Russell、およびFersht Nature 328 496-500 (1987); WO 88/08028 (Genex); WO 88/08033 (Amgen); WO 95/27049 (SOLVAY S.A.); WO 95/30011 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/30010 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/29979 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); US 5,543,302 (SOLVAY S.A.); EP 251 446 (GENENCOR); WO 89/06279 (NOVOZYMES A/S); WO 91/00345 (NOVOZYMES A/S); EP 525 610 A1 (SOLVAY); WO 94/02618 (GIST-BROCADES N.V.)。

WO 89/06270 (Novozymes A/S) には、狭い基質特異性をもつプロテアーゼ、すなわち、リジンまたはアルギニンのC-末端側でペプチド結合を切断できるトリプシン様プロテアーゼを含んでなる洗剤組成物が開示されている。
さらにWO 94/25583には、フザリウム (Fusarium) トリプシン様プロテアーゼをコードするDNA配列のクローニング、および前記DNA配列から活性なトリプシン様プロテアーゼを発現させることが開示されている。

しかしながら、多数の有効なプロテアーゼおよびプロテアーゼ変異型が記載されてきているが、多数の工業的使用のためにプロテアーゼまたはプロテアーゼ変異型をさらに改良することがなお必要とされている。
特に、洗剤中に存在する物質がプロテアーゼの安定性を減少させる傾向があるために、洗剤中の安定性の問題は顕著である。
したがって、本発明の目的は、例えば、洗濯および/または硬質表面をクリーニングするとき使用する洗剤において使用するために適当な、改良されたプロテアーゼを提供することである。

発明の要約
第1の面において、本発明は、洗剤中で改良された安定性を有するプロテアーゼに関し、このプロテアーゼは下記のプロテアーゼから成る群から選択される:
a. 配列番号2のアミノ酸1〜226として示すアミノ酸配列と少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるプロテアーゼ; および
b. 低いストリンジェント条件下に、
(i) 配列番号1のヌクレオチド127〜804として示す核酸配列の相補的鎖、または
(ii) 少なくとも100ヌクレオチドの (i) のサブ配列、
とハイブリダイゼーションする核酸配列によりコードされるプロテアーゼ; および
c. 配列番号2のアミノ酸1〜226として示すアミノ酸配列に比較して1〜50、好ましくは1〜40、または1〜30、より好ましくは1〜20、最も好ましくは1〜10のアミノ酸置換を有するプロテアーゼ。

第2の面において、本発明は、本発明によるプロテアーゼをコードする核酸配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドに関する。

第3の面において、本発明は、下記の核酸配列から成る群から選択される、本発明によるプロテアーゼをコードする核酸配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドに関する:
a. 配列番号1のヌクレオチド52〜804として示す核酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸配列、および
b. 低いストリンジェンシイの条件下に、
(i) 配列番号1のヌクレオチド52〜804として示す核酸配列の相補的鎖; または
(ii) 少なくとも100の (i) のサブ配列、
とハイブリダイゼーションする核酸配列。

第4の面において、本発明は、適当な宿主におけるプロテアーゼの発現を指令することができる1または2以上の制御配列に作用可能に連鎖された本発明による核酸配列を含んでなる核酸構築物に関する。
第5の面において、本発明は、本発明による核酸構築物、プロモーター、転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナルを含んでなる組換え発現ベクターに関する。

第6の面において、本発明は、本発明による核酸構築物を含んでなる組換え宿主細胞に関する。
第7の面において、本発明は、プロテアーゼを製造する方法に関し、この方法は下記の工程を含んでなる:
(a)プロテアーゼの産生を促す条件下に本発明による組換え宿主細胞を培養し、そして
(b)プロテアーゼを回収する。

第8の面において、本発明は、本発明によるプロテアーゼを含んでなるクリーニング組成物または洗剤組成物、好ましくは洗濯組成物または皿洗浄組成物に関する。
本発明のそれ以上の面は、クリーニング組成物または洗剤組成物における本発明によるプロテアーゼの使用; 硬質表面または洗濯物を本発明の組成物と接触させることを含んでなる硬質表面または洗濯物をクリーニングまたは洗浄する方法に関する。

定義
本発明をさらに詳細に論ずる前に、下記の用語およびコンベンションをまず定義する。

アミノ酸の命名法
A = Ala = アラニン
V = Val = バリン
L = Leu = ロイシン
I = Ile = イソロイシン
P = Pro = プロリン
F = Phe = フェニルアラニン
W = Trp = トリプトファン
M = Met = メチオニン
G = Gly = グリシン
S = Ser = セリン
T = Thr = トレオニン
C = Cys = システイン
Y = Tyr = チロシン
N = Asn = アスパラギン
Q = Gln = グルタミン
D = Asp = アスパラギン酸
E = Glu = グルタミン酸
K = Lys = リジン
R = Arg = アルギニン
H = His = ヒスチジン
X = Xaa = 任意のアミノ酸

核酸の命名法
A = アデニン
G = グアニン
C = シトシン
T = チミン (DNAにおいてのみ)
U = ウラシル (RNAにおいてのみ)

プロテアーゼ
タンパク質基質中のアミド結合を切断する酵素はプロテアーゼ、または (互換的に) ペプチダーゼとして分類される (参照: Walsh、1979、Enzyme Reaction Mechanisms、W. H. Freeman and Company、サンフランシスコ、第3章)。

セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、そして活性部位に本質的なセリン残基が存在する酵素である (White、HandlerおよびSmith、1973、“Principles of Biochemistry”、第5版、McGraw-Hill Book Company、NY、pp. 271-272)。細菌のセリンプロテアーゼは20,000〜45,000ダルトン範囲の分子量を有する。セリンプロテアーゼはジイソプロピルフルオロホスフェートにより開始される。セリンプロテアーゼは簡単な末端のエステルを加水分解し、またセリンプロテアーゼである真核生物のキモトリプシンに活性が類似する。いっそう狭い用語、アルカリ性プロテアーゼは、サブグループをカバーし、pH 9.0〜11.0のセリンプロテアーゼのいくつかの高いpH最適値を反映する (概観については、下記の文献を参照のこと: Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711-753)。

トリプシン様プロテアーゼ
本発明の関係において、用語 「トリプシン様プロテアーゼ」 は、トリプシン、すなわち、リジンまたはアルギニンのC-末端側におけるペプチド結合を切断することができる酵素の活性に類似する活性を有する酵素を示すことを意図する。トリプシン様プロテアーゼ活性は、トリプシン基質の切断に基づくアッセイ、例えば、下記の材料および方法の節、実施例4に記載されているアッセイにおいて決定することができる。

親プロテアーゼ
親プロテアーゼは天然源から単離されたプロテアーゼであることができ、ここでプロテアーゼの特性を保持しながら、引き続く修飾はなされている。さらに、親プロテアーゼは、また、DNAシャフリング技術、例えば、J. E. Ness 他、Nature Biotechnology 17、893-896 (1999) に記載されている技術により製造されたプロテアーゼであることができる。選択的に、用語 「親プロテアーゼ」 は「野生型プロテアーゼ」と命名することができる。

プロテアーゼの1または2以上の修飾
本発明において使用する用語 「1または2以上の修飾」 は、プロテアーゼの化学的修飾ならびにプロテアーゼをコードするDNAの遺伝子操作を包含すると定義される。1または2以上の修飾は、1または2以上のアミノ酸側鎖の1または2以上の置換、問題の1または2以上のアミノ酸中のまたはアミノ酸における1または2以上の置換、欠失、および/または挿入であることができる。

プロテアーゼ変異型
本発明の関係において、用語 「プロテアーゼ変異型」 または 「突然変異したプロテアーゼ」 は、もとのまたは親の遺伝子を有しかつ対応する親酵素を産生した親微生物に由来する突然変異遺伝子を発現している生物により産生されたプロテアーゼを意味し、親遺伝子は、適当な宿主において発現されるとき、前記突然変異したプロテアーゼを産生する突然変異遺伝子を産生するように突然変異されている。同様に、突然変異遺伝子はDNAシャフリング技術により産生された親遺伝子から誘導することもできる。

相同的プロテアーゼ配列
本発明の関係において、2アミノ酸配列間の相同性はパラメーター 「同一性」 により記載される。
2プロテアーゼ間の同一性の程度を決定するために、デフォルト設定を使用するベクターNTIプログラムスイートv8のAlignX適用のGAPルーチンを適用できる。このルーチンからの出力は、アミノ酸のアラインメントの他に、2アミノ酸間の 「同一性の百分率」 の計算である。
この説明に基づき、本発明に従い修飾できる、適当な相同的プロテアーゼおよび対応する相同的活性部位のループ領域を同定することは当業者にとって日常的なことである。

単離されたポリヌクレオチド
用語 「単離されたポリヌクレオチド」 は、本明細書において使用するとき、単離され、精製され、こうして遺伝子操作されたタンパク質産生系内で使用するために適当な形態であるポリヌクレオチドを意味する。このような単離された分子はそれらの天然の環境から分離された分子であることができ、そしてcDNAおよびゲノムクローンならびにDNAシャフリング実験からまたは位置特異的オートジェネシス実験から誘導されるポリヌクレオチドを包含する。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、それらが通常関連する他の遺伝子を含有しないが、5’ および3’ 非翻訳領域、例えば、プロモーターおよびターミネーターを含むことがある。関連する領域の同定は当業者にとって明らかであろう (例えば、下記文献を参照のこと、DynanおよびTijan、Nature 316: 774-78、1985)。用語 「単離された核酸配列」 は、選択的に 「単離されたDNA配列」 、 「クローニングされた核酸配列」 または 「クローニングされたDNA配列」 と命名することができる。

単離されたタンパク質
タンパク質に適用するとき、用語 「単離されたタンパク質」 は、タンパク質がその自然の環境から除去されていることを示す。
好ましい形態において、単離されたタンパク質は他のタンパク質、特に他の相同的タンパク質 (すなわち、 「相同的不純物」 (下を参照)) を実質的に含まない。

単離されたタンパク質は、SD-PAGEにより測定して、10%より高い純度、好ましくは20%より高い純度、より好ましくは30%より高い純度を有する。さらに、高度に純粋なタンパク質、すなわち、SD-PAGEにより測定して、40%より高い純度、60%より高い純度、80%より高い純度、より好ましくは95%より高い純度、最も好ましくは99%より高い純度のタンパク質を提供することが好ましい。
用語 「単離されたタンパク質」 は、別名 「精製されたタンパク質」 と称する。

相同的不純物
用語 「相同的不純物」 は、本発明のプロテアーゼが本来得られる相同的細胞に由来する、任意の不純物 (例えば、本発明のプロテアーゼ以外の他のポリペプチド) を意味する。

から得られる
用語 「から得られる」 は、特定の微生物源と関連して本明細書において使用するとき、ポリヌクレオチドおよび/またはプロテアーゼが特定の微生物源により、または前記源からの遺伝子が挿入された細胞により産生されることを意味する。

基質
プロテアーゼの基質と関連して使用する用語 「基質」 は、その最も広い形態において、プロテアーゼによる加水分解に対して感受性である少なくとも1つのペプチド結合を含有する化合物を含んでなるとして解釈すべきである。

生成物
プロテアーゼ酵素反応から誘導される生成物と関連して使用する用語 「生成物」 は、プロテアーゼを含む加水分解反応の生成物を包含すると解釈すべきである。生成物は引き続く加水分解反応における基質であることができる。

洗浄性能
本発明の関係において、用語 「洗浄性能」 は、例えば、洗浄または硬質表面のクリーニング間に、クリーニングすべき物体上に存在する汚れ、特に卵の汚れを除去する酵素の能力として使用する。また、実施例7における「モデル洗剤洗浄性能試験」参照。

発明の詳細な説明
本発明の第1の興味ある面において、改良された安定性を有するトリプシン様プロテアーゼは、配列番号2のアミノ酸1〜226として示すアミノ酸配列 (すなわち、成熟プロテアーゼ) に対して少なくとも73%の同一性を有する単離されたプロテアーゼである。

興味ある態様において、本発明のプロテアーゼは、配列番号2のアミノ酸1〜226として示すアミノ酸配列に対して75%より大きい、または80%より大きい、または85%より大きい、または90%より大きい、または92%より大きい、または94%より大きい、または96%より大きい、または97%より大きい、または98%より大きい、または99%より大きい同一性を有する。
本発明のそれ以上の興味ある面において、プロテアーゼは1または2以上のアミノ酸残基の置換、欠失および/または挿入を含んでなる配列番号2のアミノ酸-25〜226として示すアミノ酸配列を有するプロテアーゼの変異型である。

配列のアラインメントおよび同一性スコアの計算は、タンパク質およびDNAの両方のアラインメントに有効な、完全なSmith-Watermanアルゴリズムを使用して実施することができる。アミノ酸配列は、デフォルト設定を使用するベクターNTIプログラムスイートv8のAlignX適用により整列させることができる。これは変更されたClustalWアルゴリズム (Thompson J. D.、Higgins D. G. およびGibson T. J.、1994) 、ブロサム62mt2スコアマトリックス、10のギャップオープニングペナルティーおよび0.1のギャップエクステンションペナルティーを使用する。

配列番号2のアミノ酸配列を有するプロテアーゼのアミノ酸配列と先行技術に最も密接すると考えられるプロテアーゼのアミノ酸配列との間で、このようなアラインメントを実行することによって、成熟タンパク質の73%の同一性が見出された。

本発明の他の興味ある態様において、単離されたプロテアーゼは核酸配列によりコードされ、前記核酸配列は低いストリンジェンシイ条件下に、好ましくは中程度のストリンジェンシイ条件下に、より好ましくは高いストリンジェンシイ条件下に、 (i) 配列番号1のヌクレオチド127〜804として示す核酸配列の相補的鎖、または (ii) 少なくとも100ヌクレオチドの (i) のサブ配列とハイブリダイゼーションする (J. Sambrook、E. F. Fritsch、およびT. Maniatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor、New York)。

配列番号1のヌクレオチド127〜804として示す核酸配列の相補的鎖のサブ配列は、少なくとも100ヌクレオチド、好ましくは少なくとも200ヌクレオチドまたは少なくとも300ヌクレオチド、または少なくとも400ヌクレオチドである。その上、サブ配列は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼフラグメントをコードすべきである。また、プロテアーゼはタンパク質分解活性を有するアレレ変異型またはフラグメントであることができる。

配列番号1のヌクレオチド配列またはそのサブ配列、ならびに配列番号2のアミノ酸配列またはそのフラグメントを使用して、この分野においてよく知られている方法に従い、異なる属または種の株からタンパク質分解活性を有するスブチラーゼをコードするDNAを同定しかつクローニングするための核酸プローブを設計することができる。特に、このようなプローブは、標準的サザンブロッティング手法に従い、問題の属または種のゲノムDNAまたはcDNAとハイブリダイゼーションさせて、その中の対応する遺伝子を同定するために使用することができる。

このようなプローブは全配列よりもかなり小さいことができるが、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35のヌクレオチド長さをもつべきである。また、より長いプローブを使用することができる。DNAおよびRNAの両方を使用することができる。典型的には、プローブは対応する遺伝子を同定するために標識化される (例えば、32P、3H、35S、ビオチン、またはアビジン)。このようなプローブは本発明に包含される。

こうして、このような他の生物から製造されたゲノムDNAまたはcDNAライブラリーは、前述のプローブとハイブリダイゼーションし、かつ本発明によるスブチラーゼをコードするDNAについてスクリーニングすることができる。このような他の生物からのゲノムDNAまたは他のDNAは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または当業者に知られている技術により分離することができる。ライブラリーからのDNAまたは分離されたDNAをニトロセルロースまたは他の適当なキャリヤー物質に移し、または固定化することができる。

配列番号1またはその下位配列に対して相同的であるクローンまたはDNAを同定するために、キャリヤー物質をサザンブロットにおいて使用する。本発明の目的に対して、ハイブリダイゼーションは核酸配列が配列番号1に示す核酸配列、その相補的鎖、またはそのサブ配列に対応する標識化核酸プローブに、低〜高いストリンジェンシイ条件下にハイブリダイゼーションすることを示す。核酸配列がこれらの条件下にハイブリダイゼーションする分子は、X線フィルムを使用して検出される。

少なくとも100ヌクレオチド長さの長いプローブについて、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシイの条件は、標準的サザンブロッティング手法に従い、42℃における5×SSPE、0.3%のSDS、200 μg/mlの剪断かつ変性サケ精子DNA、および非常に低いストリンジェンシイについて25%のホルムアミド、中程度のストリンジェンシイについて35%のホルムアミド、または高いストリンジェンシイについて50%のホルムアミド中のプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。

少なくとも100ヌクレオチド長さの長いプローブについて、キャリヤー物質を最終的に各15分間2×SSC、0.2%のSDSを使用して好ましくは少なくとも50℃において (低いストリンジェンシイ)、より好ましくは少なくとも55℃において (中程度のストリンジェンシイ)、さらにより好ましくは少なくとも65℃において (高いストリンジェンシイ) 3回洗浄する。

約15ヌクレオチド〜約70ヌクレオチドの長さである短いプローブについて、ストリンジェンシイの条件は、標準的サザンブロッティング手法に従い、BoltonおよびMcCarthy (1962、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390) による計算を使用して計算されたT_mより5℃〜10℃低い温度において、0.9 M NaCl、0.09 M Tris-HCl、pH 7.6、6 mM EDTA、0.5% NP-40、1×デンハルト溶液、1 mM ピロリン酸ナトリウム、1 mM 一塩基性リン酸ナトリウム、0.1 mM ATP、および0.2 mgの酵母RNA/ml中のプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、およびハイブリダイゼーション後の洗浄として定義される。

約15ヌクレオチド〜約70ヌクレオチドの長さである短いプローブについて、キャリヤー物質を計算されたT_mより5℃〜10℃低い温度において6×SCC + 0.1% SDS中で15分間1回洗浄し、そして6×SCC中で各回15分間2回洗浄する。
この分野においてよく知られているように、同様なアミノ酸残基に対する1つのアミノ酸残基のいわゆる保存的置換は酵素の特性に小さい変化のみを生成することが期待される。

保存的アミノ酸置換のグループを下記表1に列挙する。
表1
保存的アミノ酸置換
普通の性質 アミノ酸
塩基性 (正電荷) R=アルギニン
K=リジン
H=ヒスチジン
酸性 (負電荷) E=グルタミン酸
D=アスパラギン酸
極性 Q=グルタミン酸
N=アスパラギン
疎水性 L=ロイシン
I=イソロイシン
V=バリン
M=メチオニン
芳香族 F=フェニルアラニン
W=トリプトファン
Y=チロシン
小さい G=グリシン
A=アラニン
S=セリン
T=トレオニン

したがって、本発明のそれ以上の興味ある態様において、配列番号2のアミノ酸配列を有するプロテアーゼを1または2以上のアミノ酸残基の置換、欠失、および/または挿入と組合わせる。

その上、配列番号2のアミノ酸配列を有するプロテアーゼに対して免疫化学的同一性または部分的免疫化学的同一性を有する、好ましくは精製された形態の、単離されたプロテアーゼは、また、本発明の範囲内に入ると考えられる。免疫学的性質は、広く知られているオクタロニー二重免疫拡散法により、免疫学的交差反応の同定試験により決定される。詳しくは、免疫反応性であるか、あるいは配列番号2のアミノ酸配列を有するプロテアーゼのエピトープに結合するポリクローナル抗体を含有する抗血清を、下記の文献に記載されているウサギ (または齧歯類) の免疫化により調製する: HarboeおよびIngild著、N. H. Axelsen、J. KrollおよびB. Weeks編、A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis、Blackwell Scientific Publications、1973、Chapter 23、またはJohnstoneおよびThorpe、Immuno-chemistry in Practice、Blackwell Scientific Publications、1982、より詳しくは、pp. 27-31)。

免疫同一性を有するプロテアーゼは、特定の免疫化学的技術を使用して、同一の方式、例えば、沈殿の全方式、同一の沈殿形態、および/または同一の電気泳動移動度で抗血清と反応するプロテアーゼである。Axelsen、Bock、およびKrollは、免疫化学的同一性をさらに説明している: N. H. Axelsen、J. KrollおよびB. Weeks編、A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis、Blackwell Scientific Publications、1973、Chapter 10。部分的免疫化学的同一性を有するプロテアーゼは、特定の免疫化学的技術を使用して、部分的に同一の方式、例えば、沈殿の部分的方式、部分的に同一の沈殿形態、および/または部分的に同一の電気泳動移動度で抗血清と反応するプロテアーゼである。Bock、およびAxelsenは、部分的免疫化学的同一性を説明している: N. H. Axelsen、J. KrollおよびB. Weeks編、A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis、Blackwell Scientific Publications、1973、Chapter 11。

また、抗体はモノクローナル抗体であることができる。モノクローナル抗体は、例えば、下記の文献に記載されている方法に従い製造し、使用することができる: E. HarlowおよびD. Lane編、Antibodies, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、New York。

本発明者らは、配列番号2のアミノ酸配列を有するスブチラーゼをコードする遺伝子を単離し、大腸菌 (Escherichia coli) NN 049696中に挿入した。この遺伝子を収容する大腸菌 (Escherichia coli) NN 049696株は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認についてのブタベスト条約の規定に従い2000年2月8日に寄託され (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellulturen GmbH、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschwelg、Germany) 、受け入れ番号DSM 15940と表示された。

本発明の興味ある態様において、プロテアーゼは、受け入れ番号DSM 15940で寄託された大腸菌 (Escherichia coli) NN 049696中に存在するプラスミドフラグメントの中にクローニングされたポリヌクレオチドのプロテアーゼをコードする部分によりコードされるプロテアーゼに対して73.0%より大きい、75.0%より大きい、または80.0%より大きい、または85.0%より大きい、または90.0%より大きい、または92.0%より大きい、または94.0%より大きい、または96.0%より大きい、または97.0%より大きい、または98.0%より大きい、または99.0%より大きい同一性を有する。

前述したように、本発明のプロテアーゼは洗剤中で改良された安定性を有する。したがって、この目的に有効なかつ好ましいプロテアーゼを当業者が選択できるようにするために、問題のプロテアーゼの性能を評価するために当業者が容易に実施できる、適当な試験を本発明者らは提供する。
こうして、実施例Vに記載されている安定性の試験を使用して、選択されたプロテアーゼの安定性を評価することができる。換言すると、この実施例において、標準的洗剤組成物の中に混入したとき、参照系 (同一モデルの洗剤系の中に混入し、同一条件下に試験した) に比較して、プロテアーゼの安定性を評価することができる。

本発明の興味ある面において、プロテアーゼは、 「実施例5洗剤中の安定性」 において試験したとき、30℃において少なくとも40%、30℃において少なくとも50%、例えば、30℃において少なくとも60%、より好ましくは30℃において少なくとも70%の残留活性を有する。
本発明の他の興味ある面において、プロテアーゼは、 「実施例5洗剤中の安定性」 において試験したとき、35℃において少なくとも40%、35℃において少なくとも50%、例えば、35℃において少なくとも60%、より好ましくは35℃において少なくとも70%の残留活性を有する。

したがって、洗濯の目的に特に興味あるプロテアーゼは、本明細書中の 「安定性試験」 に記載されているように、下記の成分を含んでなるモデルの洗剤組成物中で試験したとき、同一条件下に試験した参照系に比較して、改良された安定性を示すプロテアーゼである:

スルホン酸塩 20〜30%
非イオン界面活性剤 0〜4%
Na₂SO₄ 2〜8%
Na₂CO₃ 20〜40%
Na₂O・2SiO₂ 1〜3%
ゼオライト4A 5〜15%
非極性炭化水素 0〜0.5%
クエン酸ナトリウム 2〜8%
PCAコポリマー 0〜2%

本発明のプロテアーゼは、多様性を人工的に発生させる標準的技術、例えば、異なるプロテアーゼ遺伝子のDNAシャフリングにより構築することができる (下記の文献を参照のこと、WO 95/22625およびJ. E. Ness 他、Nature Biotechnology 17、893-896 (1999))。

明らかなように、本発明のプロテアーゼは、また、天然源から単離することができる、すなわち、本発明のプロテアーゼは、例えば、真菌のプロテアーゼ、より好ましくは糸状真菌のプロテアーゼ、例えば、下記のプロテアーゼであることができる: フザリウム (Fusarium)、アクレモニウム (Acremonium)、アスペルギルス (Aspergillus)、アウレオバシジウム (Aureobasidium)、クリプトコッカス (Cryptococcus)、フィリバシジウム (Filibasidium)、フミコラ (Humicola)、マグナポリテ (Magnaporthe)、ケカビ (Mucor)、ミセリオフトラ (Myceliopthora)、ネオカイリマスチックス (Neocailimastix)、ニューロスポラ (Neurospora)、ペシロマイセス (Paecilomyces)、ペニシリウム (Penicillium)、ピロマイセス (Piromyces)、シゾフィルム (Schizophyllum)、タラロマイセス (Talaromyces)、テルモアスカス (Thermoascus)、チエラビア (Thielavia)、トリポクラジウム (Tolypocladium)、またはトリコデルマ (Trichoderma)のプロテアーゼ; または酵母のプロテアーゼ、例えば、カンジダ (Candida)、クライベロマイセス (Kluyveromyces)、ピキア (Pichia)、サッカロマイセス (Saccharomyces)、シゾサッカロマイセス (Schizosaccharomyces)、またはヤロウィア (Yarrowia) のプロテアーゼ。

他の興味ある態様において、プロテアーゼは下記のプロテアーゼである: フザリウム・バクトリディオイデス (Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス (Fusarium cerealis)、フザリウム・クルックウェレンセ (Fusarium crookwellense)、フザリウム・クルモルム (Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアラム (Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミナム (Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポルム (Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンジ (Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum)、フザリウム・レチクラツム (Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロセウム (Fusarium roseum)、フザリウム・サムブシヌム (Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム (Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイデス (Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・スルフレウム (Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロクム (Fusarium torulocum)、フザリウム・トリコテキオイデス (Fusarium trichothecioides)、フザリウム・ベネナツム (Fusarium venenatum)、アスペルギルス・アクレアツス (Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フェチヅス (Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ジャポニカス (Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae)、フミコラ・インソレンス (Humicola insolens)、フミコラ・ラヌギノサ (Humicola lanuginosa)、ムコール・ミエヘイ (Mucor miehei)、ミセリオフトラ・サーモフィラ (Myceliophthora themophila)、ニューロスポラ・クラッサ (Neurospora crassa)、ペニシリウム・パープロゲナム (Penicillium purpurogenum)、トリコデルマ・ハルジアナム (Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギイ (Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブラキアツム (Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei)、またはトリコデルマ・ビリデ (Trichoderma viride) のプロテアーゼ。

興味ある態様において、プロテアーゼは下記のプロテアーゼである: サッカロマイセス・カリスベルゲンシス (Saccharomyces carisbergensis)、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ジアスタチカス (Saccharomyces diastaticus)、サッカロマイセス・ドウグラシイ (Saccharomyces douglasii)、サッカロマイセス・クルイベリ (Saccharomyces kluyveri)、サッカロマイセス・ノルベンシス (Saccharomyces norbensis)、サッカロマイセス・オビフォルミス (Saccharomyces oviformis) のプロテアーゼである。

前述の種について、本発明は完全な状態および不完全な状態の両方を包含し、そしてそれらが知られている種の名称に無関係に他の分類学上の同等物を包含することが理解されるであろう。当業者は適当な同等物を容易に認識するであろう。

また、本発明のプロテアーゼは細菌のタンパク質、例えば、下記のプロテアーゼであることができる: グラム陽性細菌のプロテアーゼ、例えば、バシラス (Bacillus) のプロテアーゼ、例えば、バシラス・アルカロフィルス (Bacillus alkalophilus)、バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・ブレビス (Bacillus brevis)、バシラス・サーキュランス (Bacillus circulans)、バシラス・コアギュランス (Bacillus coagulans)、バシラス・ラウツス (Bacillus lautus)、バシラス・レンツス (Bacillus lentus)、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis)、バシラス・メガテリウム (Bacillus megaterium)、バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus)、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis)、またはバシラス・スリンジェンシス (Bacillus thuringiensis) のプロテアーゼ; またはストレプトマイセス (Streptomyces) のプロテアーゼ、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス (Streptomyces lividans) またはストレプトマイセス・ムリヌス (Streptomyces murinus) のプロテアーゼ; またはグラム陰性細菌のプロテアーゼ、例えば、大腸菌 (E. coli) またはシュードモナス(Pseudomonas) 種のプロテアーゼ。

これらの種の株は、ある数の微生物株保存機関、例えば、下記において容易に公衆にアクセス可能である: ATCC (American Type Culture Collection)、DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellulturen GmbH)、CBS (Centraalbureau Voor Schimmelcultures)、およびNRRL (Agricultural Research Service Patent Culture Collection)。

さらに、このようなプロテアーゼは、前述のプローブを使用して自然 (例えば、土壌、堆肥、水、およびその他) から単離された微生物を包含する他の源から同定し、そして得ることができる。自然の生息地から微生物を単離する技術はこの分野においてよく知られている。次いで、他の微生物のゲノムDNAまたはcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることによって、ポリヌクレオチドを誘導することができる。いったんポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが1または2以上のプローブを使用して検出されると、配列を当業者に知られている技術により単離またはクローニングすることができる (例えば、下記の文献を参照のこと: Sambrook 他、1989、前掲)。

一般に、遺伝子をクローニングし、挿入 (ランダムおよび/または位置指定) を前記遺伝子の中に導入する標準的方法を使用して、本発明のプロテアーゼ酵素を得ることができる。適当な技術は本明細書中の実施例 (下文参照) および下記の文献にさらに記載されている: Sambrook 他、1989、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York; Ausubel F. M. 他 (編者) 、“Current Protocols in Molecular Biology”、John Wiley and Sons、1995; Harwood C. R. およびCutting S. M. (編者) “Molecular Biological Methods for Bacillus”、John Wiley and Sons、1990; およびWO 96/34946。

さらに、本発明のプロテアーゼ酵素は、多様性を人工的に発生させる標準的技術、例えば、異なるプロテアーゼ遺伝子のDNAシャフリングにより構築することができる (下記の文献を参照のこと、WO 95/22625; Stemmer WPC、Nature 370: 389-91 (1994))。

ポリヌクレオチド
本発明は、また、本発明のプロテアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。

1つの興味ある態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド52〜804として示すポリヌクレオチドに対して少なくとも86%、例えば、少なくとも87%、例えば、好ましくは少なくとも88%、好ましくは少なくとも89%、例えば、少なくとも90%、例えば、少なくとも91%、より好ましくは少なくとも92%、例えば、少なくとも93%、例えば、少なくとも94%、最も好ましくは少なくとも95%、例えば、少なくとも96%、例えば、少なくとも97%、特に少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。本発明の他の興味ある態様において、ポリヌクレオチドは配列番号1のヌクレオチド127〜804として示すポリヌクレオチド、そのアレレ変異型、または本発明によるプロテアーゼをコードするできるそのフラグメントを含んでなる。明らかなように、ポリヌクレオチドは配列番号1のヌクレオチド127〜804として示すポリヌクレオチドから成ることができる。

また、本発明は、遺伝コードのデジェネラシーにより配列番号2と異なる、配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。また、本発明は、タンパク質分解活性を有する配列番号2のフラグメントをコードする配列番号1のサブ配列に関する。
配列番号1のサブ配列は、5’-末端および/または3’-末端からの1または2以上のヌクレオチドが欠失されている以外、配列番号1のヌクレオチド52〜804により包含されるポリヌクレオチドである。

ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離またはクローニングするために使用する技術はこの分野において知られており、そしてゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、またはそれらの任意の組合わせを包含する。このようなゲノムDNAからの本発明のポリヌクレオチドのクローニングは、よく知られているポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) または発現ライブラリーの抗体スクリーニングを使用して、共有された構造的特徴をもつクローニングされたDNAフラグメントを検出することによって実施することができる。例えば、下記の文献を参照のこと: Innis 他、1990、PCR: A Guide to Methods and Application、Academic Press、New York。他の核酸修飾法、例えば、リガーゼ連鎖反応 (LCR)、結合活性化転写 (LAT) および核酸配列に基づく増幅 (NASBA) を使用することができる。

単離されたポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子操作において使用される標準的クローニング法により、ポリヌクレオチドをその自然の位置からそれが再生される異なる部位に再配置することによって得ることができる。クローニング法は、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでなる所望の核酸フラグメントの切除および単離、ベクター分子中へのフラグメントの挿入、およびポリヌクレオチドの複数のコピーまたはクローンが複製される宿主細胞中への組換えベクターの組込みを含むことができる。ポリヌクレオチドは、ゲノムDNA、cDNA、RNA、半合成由来、合成由来、またはそれらの任意の組合わせのポリヌクレオチドであることができる。

本明細書の目的に対して、2ポリヌクレオチド間の同一性の程度は前述された。
本発明のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの修飾は、このプロテアーゼに実質的に類似するプロテアーゼの合成に必要であることがある。このプロテアーゼに「実質的に類似する」という用語は、プロテアーゼの天然に存在しない形態を意味する。これらのプロテアーゼは、天然源から単離されたプロテアーゼといくつかの操作された方法で異なることがあり、例えば、比活性、熱安定性、pH最適値、またはその他が異なる変異型である。

変異型の配列は、配列番号1のポリペプチドをコードする部分として存在するポリヌクレオチド、例えば、そのサブ配列に基づいて、および/または核酸配列によりコードされるプロテアーゼの他のアミノ酸配列を生じないが、酵素の産生に意図される宿主生物のコドン使用頻度に対応するヌクレオチド置換の導入により、または異なるアミノ酸配列を生ずることができるヌクレオチド置換の導入により構築することができる。例えば、下記の文献を参照のこと:Ford 他、1991、Protein Expression and Purification 2: 95-107。

当業者にとって明らかなように、このような置換は分子の機能に対して重大である領域の外側でなすことができ、そしてなお活性プロテアーゼを生ずることができる。本発明の単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの活性ために必須であり、したがって好ましくは置換を受けていないアミノ酸残基は、この分野において知られている方法、例えば、位置指定突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発に従い同定することができる (例えば、下記の文献を参照のこと: CunninghamおよびWells、1989、Science 244: 1081-1085)。

後者の技術において、突然変異を分子中のすべての正に帯電した残基に導入し、生ずる突然変異分子をタンパク質分解活性について試験して、分子の活性に対して重大であるアミノ酸残基を同定する。また、基質-酵素の相互作用部位は、核磁気共鳴分析、結晶学またはホトアフィニティーラベリングのような技術により決定される三次元構造の分析により決定することができる (例えば、下記文献を参照のこと: de Vos 他、1992、Science 255: 306-312; Smith 他、1992、Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wiodaver 他、1992、FEBS Letters 309: 59-64)。

核酸構築物
本発明は、また、適当な宿主細胞においてポリペプチドの発現を指令することができる1または2以上の制御配列に作用可能に連鎖された本発明のポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物に関する。

本発明のプロテアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドを種々の方法で操作して、プロテアーゼを発現させることができる。ベクターへの挿入前におけるポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターに依存して望ましいか、あるいは必要であることがある。組換えDNA法を使用してポリヌクレオチドを修飾する技術は、この分野においてよく知られている。

制御配列は、本発明のプロテアーゼの発現に必要または好都合であるすべての成分を包含する。各制御配列は、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドに対して自然または外来性であることができる。このような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プレプロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを包含するが、これらに限定されない。最小において、制御配列はプロモーター、および転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナルを包含する。制御配列は、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドのコーディング領域と制御配列との結合を促進する特異的制限部位を導入する目的で、リンカーを有することができる。

制御配列は、適当なプロモーター配列、核酸配列を発現する宿主細胞により認識されるポリヌクレオチドであることができる。プロモーター配列は、プロテアーゼの発現を仲介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであることができ、突然変異プロモーター、トランケーテッドプロモーター、およびハイブリッドプロモーターを包含し、そして宿主細胞に対して相同的または異種的である、細胞外または細胞内のプロテアーゼをコードする遺伝子から得ることができる。

糸状真菌宿主細胞細胞中で本発明の核酸構築物の転写を指令するために適当なプロモーターの例は、下記の遺伝子から得られるプロモーター、およびそれらの突然変異プロモーター、トランケーテッドプロモーター、およびハイブリッドプロモーターである: アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中性α-アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) またはアスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) グルコアミラーゼ (glaA) 、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) リパーゼ、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) アセトアミダーゼ、およびフザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) トリプシン様プロテアーゼ (WO 96/00787) 、ならびにNA2-tpiプロモーター (アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中性α-アミラーゼおよびアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド) 。

酵母宿主において、有効なプロモーターは下記の遺伝子から得られるプロモーターである: サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) エノラーゼ (ENO-1) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) ガラクトキナーゼ (GAL1) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) アルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-ホスフェート (ADH2/GAP) 、およびサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ。酵母宿主細胞に有効な他のプロモーターは下記の文献に記載されている: Romanos 他、1992、Yeast 8: 423-488。

特に細菌宿主細胞中で、本発明の核酸構築物の転写を指令するために適当なプロモーターの例は、下記から得られるプロモーターである: 大腸菌 (E. coli) lacオペロン、ストレプトマイセス・ケリコロル (Streptomyces coelicolor) アガロース遺伝子 (dagA) 、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) レバンスクラーゼ遺伝子 (sacB) 、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) α-アミラーゼ遺伝子 (amyL) 、バシラス・ステアロサーモフィルス (Bacillus stearothermophilus) マルトジェニックアミラーゼ遺伝子 (amyM) 、バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) α-アミラーゼ遺伝子 (amyQ) 、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) ペニシリナーゼ遺伝子 (penP) 、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) xylAおよびxylB遺伝子、および原核生物のβ-ラクタマーゼ遺伝子 (Villa-Kamroff 他、1978、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731) 、ならびにtacプロモーター (DeBoer 他、1983、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25) 。それ以上のプロモーターは下記の文献に記載されている: “Useful proteins from recombinant bacteria”、Scientific American 1980、242: 74-94; およびSambrook 他、1989、前掲。

また、制御配列は、適当な転写停止配列、すなわち、転写を停止するために宿主細胞により認識される配列であることができる。ターミネーター配列は、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの3’末端に作用可能に連鎖されている。選択した宿主細胞中で機能的である任意のターミネーターを本発明において使用することができる。

糸状真菌宿主細胞に好ましいターミネーターは、下記の遺伝子から得られるターミネーターである: アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) α-グルコシダーゼ、およびフザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) トリプシン様プロテアーゼ。

酵母宿主細胞に好ましいターミネーターは、下記の遺伝子から得られるターミネーターである: サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) エノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) シトクロムC (CYC1) 、およびサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ。酵母宿主細胞に有効な他のターミネーターは下記の文献に記載されている: Romanos 他、1992、前掲。

また、制御配列は、適当なリーダー配列、すなわち、宿主細胞による翻訳に重要であるmRNAの非翻訳領域である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5’末端に作用可能に連鎖されている。選択した宿主細胞中で機能的である任意のリーダー配列を本発明において使用することができる。
糸状真菌宿主細胞に好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼおよびアスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。

酵母宿主細胞に適当なリーダーは下記の遺伝子から得られるリーダーである: サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) エノラーゼ (ENO-1) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) α-因子、およびサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) アルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-ホスフェート (ADH2/GAP) 。

また、制御配列は、ポリアデニル化配列、すなわち、ポリヌクレオチドの3’末端に作用可能に連鎖されており、そして転写されたとき、ポリアデノシン残基を転写されたmRNAに付加するシグナルとして宿主細胞により認識される配列である。選択した宿主細胞中で機能的である任意のポリアデニル化配列を本発明において使用することができる。

糸状真菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は下記の遺伝子から得られる: アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) トリプシン様プロテアーゼ、およびアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) α-グルコシダーゼ。
酵母宿主細胞に有効なポリアデニル化配列は下記の文献に記載されている: GuoおよびSherman、1995、Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990。

また、制御配列は、プロテアーゼのアミノ末端に結合したアミノ酸配列をコードし、かつコードされたプロテアーゼを細胞の分泌経路に向ける、シグナルペプチドコーディング領域であることができる。ポリヌクレオチドのコーディング配列の5’末端は、分泌されたプロテアーゼをコードするコーディング領域のセグメントと翻訳リーデイングフレームで自然に結合した、シグナルペプチドコーディング領域を固有に含有することがある。

選択的に、コーディング配列の5’末端は、コーディング配列に対して外来性であるシグナルペプチドコーディング領域を含有することがある。コーディング配列がシグナルペプチドコーディング領域を自然に含有しない場合、外来性のシグナルペプチドコーディング領域は必要とされることがある。選択的に、外来性のシグナルペプチドコーディング領域を自然のシグナルペプチドコーディング領域と置換して、プロテアーゼの分泌を増強することができる。しかしながら、発現されたプロテアーゼを選択した宿主細胞の分泌経路に向けるシグナルペプチドコーディング領域を、本発明の方法において使用することができる。

糸状真菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコーディング領域は、下記の遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング領域である: アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) アスパラギン酸プロテアーゼ、フミコラ・インソレンス (Humicola insolens) セルラーゼ、およびフミコラ・ラヌギノサ (Humicola lanuginosa) リパーゼ。

酵母宿主細胞に有効なペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) α-因子およびサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有効なシグナルペプチドコーディング領域は下記の文献に記載されている: Romanos 他、1992、前掲。

細菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコーディング領域は、下記の遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング領域である: バシラス (Bacillus) NCIB 11837マルトジェニックアミラーゼ、バシラス・ステアロサーモフィルス (Bacillus stearothermophilus) α-アミラーゼ、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) スブチリジン、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) β-ラクタマーゼ、バシラス・ステアロサーモフィルス (Bacillus stearothermophilus) 中性プロテアーゼ (nprT、nprS、nprM) 、およびバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) prsA。それ以上のシグナルペプチドは下記の文献に記載されている: SimonenおよびPalva、1993、Microbiological Reviews 57: 109-137。

また、制御配列は、プロテアーゼのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコーディング領域であることができる。生ずるポリペプチドはプロ酵素またはプロポリペプチド (またはある場合においてチモーゲン) として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、そしてプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断により、成熟活性ポリペプチドに転化することができる。プロペプチドコーディング領域は下記の遺伝子から得ることができる: バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) アルカリ性プロテアーゼ (aprE) 、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) 中性プロテアーゼ (nprT) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) α-因子、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) アスパラギン酸プロテアーゼ、およびミセリオフトラ・サーモフィラ (Myceliophthora thermophila) ラッカーゼ (WO 95/33836) 。

シグナルペプチド領域およびプロペプチド領域の両方がスブチラーゼのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はプロテアーゼのアミノ末端の次に位置し、そしてシグナルペプチド領域はプロペプチド領域の次に位置する。
また、宿主細胞の生長に関してポリペプチドの発現の調節を可能とする調節配列を付加することが望ましいことがある。調節系の例は、化学的または物理的刺激、例えば、調節化合物の存在に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにする系である。原核生物系における調節系は、lac、tac、およびtrpオペレーター系を包含する。酵母において、ADH2系またはGAL1系を使用することができる。

糸状真菌において、TAKAα-アミラーゼのプロモーター、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼのプロモーター、およびアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) グルコアミラーゼのプロモーターを調節配列として使用することができる。調節配列の他の例は、遺伝子の増幅を可能とするものである。真核生物系において、これらはメトトレキセートの存在下に増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子を包含する。これらの場合において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは調節配列と作用可能に連鎖されるであろう。

発現ベクター
本発明は、また、本発明の核酸構築物、プロモーター、および転写および翻訳停止シグナルを含んでなる組換え発現ベクターに関する。
本発明の酵素をコードする核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクターは、組換えDNA手順に好都合に付すことができる任意のベクターであることができる。

しばしば、ベクターの選択は、それを導入すべき宿主細胞に依存するであろう。こうして、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外の実在物として存在するベクターであることができ、その複製は染色体、例えば、プラスミドの複製に対して独立である。選択的に、ベクターは宿主細胞の中に導入したとき、宿主細胞ゲノム中に一部分またはその全体で組込まれ、それが混入まれた1または2以上の染色体と一緒に複製するベクターであることができる。

ベクターは、本発明の酵素をコードするDNA配列がDNAの転写に要求される追加のセグメントに作用可能に連鎖されている、発現ベクターであることが好ましい。一般に、発現ベクターはプラスミドまたはウイルスDNAに由来するか、あるいは両方の要素を含有することができる。用語 「作用可能に連鎖された」 は、セグメントがそれらの意図する目的に協調して機能するように、例えば、転写がプロモーターにおいて開始、酵素をコードするDNA配列を通して進行するように、セグメントが配置されていることを示す。

プロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示す任意のDNA配列であり、そして、宿主細胞に対して相同的または異種的であるタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。

細菌宿主細胞において使用するために適当なプロモーターの例は下記の遺伝子のプロモーターを包含する: バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) マルトジェニックアミラーゼ遺伝子、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) α-アミラーゼ遺伝子、バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) α-アミラーゼ遺伝子、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) アルカリ性プロテアーゼ遺伝子、またはバシラス・プミラス (Bacillus pumillus) キシロシダーゼ遺伝子、またはファージラムダPRまたはPLプロモーターまたは大腸菌 (E. coli) lac、trpまたはtacプロモーター。

また、本発明の酵素をコードするDNA配列は、必要に応じて、適当なターミネーターに作用可能に接続することができる。
本発明の組換えベクターは、問題の宿主細胞中でベクターを発現させることができるDNA配列をさらに含んでなることができる。

また、ベクターは、選択可能なマーカー、例えば、その産物が宿主細胞における欠陥を補足する遺伝子、または、例えば、カナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、またはその他のような抗生物質に対する耐性、または重金属または除草剤に対する耐性をコードする遺伝子を含んでなることができる。

本発明の酵素を宿主細胞の分泌経路に向けるために、分泌シグナル配列 (また、リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列として知られている) を組換えベクター中に設けることができる。分泌シグナル配列は、酵素をコードするDNA配列に正しいリーデイングフレームで結合させる。通常、分泌シグナル配列は酵素をコードするDNA配列に対して5’ に位置する。分泌シグナル配列は、通常酵素に関連する配列であるか、あるいは他の分泌されたタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。

本発明の酵素をコードするDNA配列、プロモーターおよび必要に応じてターミネーターおよび/または分泌シグナル配列をそれぞれ結合するために、またはのようなPCR増幅スキームによりこれらの配列を組立てるために、かつ複製または組込みに必要な情報を含有する適当なベクター中にそれらを挿入するために用途する手順は当業者によく知られている (例えば、下記の文献を参照のこと:Sambrook 他、前掲)。

宿主細胞
本発明は、また、本発明の核酸構築物を含んでなる組換え宿主細胞に関する。
宿主細胞の中に導入される本発明の酵素をコードするDNA分子は、問題の宿主に対して相同的または異種的であることができる。宿主細胞に対して相同的である場合、すなわち、天然の宿主細胞により産生される場合、それは典型的には他のプロモーター配列、あるいは適用可能な場合、その天然の環境以外において他の分泌シグナル配列および/またはターミネーター配列に作用可能に結合されている。用語「相同的」は、問題の宿主生物に対して自然である酵素をコードするDNA配列を包含することを意図する。用語「異種的」は、自然における宿主細胞により発現されないDNA配列を包含することを意図する。こうして、DNA配列は他の生物に由来するか、あるいは合成配列であることができる。

本発明のDNA構築物または組換えベクターが導入された宿主細胞は本発明の酵素を産生できる任意の細胞であることができ、そして細菌、酵母、真菌および植物を含む高等真核生物の細胞を包含する。

培養時に本発明の酵素を産生することができる細菌細胞の例は次の通りである: グラム陽性細菌、例えば、バシラス (Bacillus) 株、バシラス・サチリス (B. subtilis)、バシラス・リヘニフォルミス (B. licheniformis)、バシラス・レンツス (B. lentus)、バシラス・ブレビス (B. brevis)、バシラス・ステアロサーモフィラス (B. stearothermophilus)、バシラス・アルカロフィルス (B. alkalophilus)、バシラス・アミロリクファシエンス (B. amyloliquefaciens)、バシラス・コアギュランス (B. coagulans)、バシラス・サーキュランス (B. circulans)、バシラス・ラウツス (B. lautus)、バシラス・メガテリウム (B. megaterium) またはシラス・スリンジェンシス (B. thuringiensis)、特にバシラス・レンツス (B. lentus) の株、またはストレプトマイセス (Streptomyces) の株、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス (S. lividans) またはストレプトマイセス・ムリヌス (S. murinus)、またはグラム陰性細菌、例えば、大腸菌 (Escherichia coli)。

細菌の形質転換は、プロトプラストの形質転換、エレクトロポレーション、接合により、またはそれ自体知られている方法 (例えば、Sambrook他、前掲、参照) においてコンピテント細胞を使用することによって実施することができる。

大腸菌 (E. coli) のような細菌中で酵素を発現させるとき、酵素を細胞質の中に、典型的には不溶性粒体 (封入体として知られている) として保持することができるか、あるいは細菌分泌経路により周辺腔に向けることができる。前者の場合において、細胞を溶解し、粒体を回収し、変性し、次いで変性剤を希釈することによって酵素をリフォルディングする。後者の場合において、例えば、超音波処理または浸透圧ショックにより、細胞を崩壊させることによって、周辺腔の内容物を解放し、酵素を回収することによって、酵素を周辺腔から回収することができる。

グラム陽性細菌、例えば、バシラス (Bacillus) 株またはストレプトマイセス (Streptomyces) 株中で酵素を発現させるとき、酵素を細胞質の中に保持することができるか、あるいは細菌分泌経路により細胞外媒質に向けることができる。後者の場合において、後述するように、酵素を媒質から回収することができる。

本発明の他の態様において、真菌宿主細胞は酵母細胞である。「酵母」は、本明細書において使用するとき、下記のものを包含する: 子嚢胞子酵母 (腸内細菌科 (Enterobacteriaceae)) 、担子胞子酵母、および不完全菌類 (Fungi Imperfecti) に属する酵母 (ブラストミセテス (Blastomycetes)) 。酵母の分類は、本発明の目的に対して、将来において変化することがあるが、酵母はBiology and Activities of Yeast に記載されているように定義されるであろう (Skinner F. A. およびDavenport R. R. 編者、Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9、1980) 。

好ましい態様において、酵母宿主細胞は、カンジダ (Candida) 、ハンゼヌラ (Hansenula) 、クライベロマイセス (Kluyveromyces) 、ピキア (Pichia) 、サッカロマイセス (Saccharomyces) 、シゾサッカロマイセス (Scizosaccharomyces) 、またはヤロウィア (Yarrowia) 細胞であることができる。

より好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はサッカロマイセス・カリスベルゲンシス (Saccharomyces carisbergensis)、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ジアスタチカス (Saccharomyces diastaticus)、サッカロマイセス・ドウグラシイ (Saccharomyces douglasii)、サッカロマイセス・クルイベリ (Saccharomyces kluyveri)、サッカロマイセス・ノルベンシス (Saccharomyces norbensis) またはサッカロマイセス・オビフォルミス (Saccharomyces oviformis) の細胞である。他の最も好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はクライベロマイセス・ラクチス (Kluyveromyces lactis) 細胞である。他の最も好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はヤロウィア・リポリチカ (Yarrowia lipolytica) 細胞である。

他の好ましい態様において、真菌宿主細胞は糸状真菌の細胞であることができる。「糸状真菌」は、亜門の真菌門 (Eumycota) および卵菌門 (Oomycota) のすべてのフィラメントの形態を包含する (Hawksworth 他、1995、前掲において定義されている) 。糸状真菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖から構成されている菌糸体壁により特徴づけられる。栄養成長は菌糸の伸長により、そして炭素異化作用は無条件的に好気性である。対照的に、酵母、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) による栄養成長は単細胞葉状体の発芽により、そして炭素異化作用は発酵的である。

なおより好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は下記の種であるが、これらに限定されない種の細胞である: フザリウム (Fusarium)、アクレモニウム (Acremonium)、アスペルギルス (Aspergillus)、フミコラ (Humicola)、ケカビ (Mucor)、ミセリオフトラ (Myceliopthora)、アカバンカビ (Neurospora)、ペニシリウム (Penicillium)、チエラビア (Thielavia)、トリポクラジウム (Tolypocladium)、またはトリコデルマ (Trichoderma)。

最も好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フェチヅス (Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ジャポニカス (Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) またはアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) の細胞である。

他の最も好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は次の通りである: フザリウム・バクトリディオイデス (Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス (Fusarium cerealis)、フザリウム・クロックウェレンセ (Fusarium crookwellense)、フザリウム・クルモルム (Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアラム (Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミナム (Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポルム (Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンジ (Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum)、フザリウム・レチクラツム (Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロセウム (Fusarium roseum)、フザリウム・サムブシヌム (Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム (Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイデス (Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・スルフレウム (Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロクム (Fusarium torulocum)、またはフザリウム・ベネナツム (Fusarium venenatum) の細胞。

なおより最も好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は、フザリウム・ベネナツム (Fusarium venenatum) (Nirenberg種nov.) 細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞はフミコラ・インソレンス (Humicola insolens)、フミコラ・ラヌギノサ (Humicola lanuginosa)、ムコール・ミエヘイ (Mucor miehei)、ミセリオフトラ・サーモフィラ (Myceliophthora themophila)、ニューロスポラ・クラッサ (Neurospora crassa)、ペニシリウム・パープロゲナム (Penicillium purpurogenum)、チエラビア・テレストリス (Thielavia terrestris)、トリコデルマ・ハルジアナム (Tricoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギイ (Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブラキアツム (Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei)、またはトリコデルマ・ビリデ (Trichoderma viride) の細胞。

真菌細胞は、それ自体知られている方法におけるプロトプラストの形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を包含する方法により形質転換することができる。アスペルギルス (Aspergillus) 宿主細胞の形質転換に適当な手順は下記の文献に記載されている: EP 238 023およびYelton 他、1984、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474。フザリウム (Fusarium) 種の形質転換に適当な方法は下記の文献に記載されている: Malardier 他、1989、Gene 78: 147-156およびWO 96/00787。

酵母は下記の文献に記載されている手順を使用して形質転換することができる: BeckerおよびGuarente、編者、Abelson J. N. およびSimon M. I. 、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology、Methods in Enzymology Vol. 194、pp. 182-187、Academic Press, Inc.、New York; Ito 他、1983、Journal of Bacteriology 153: 163; およびHinnen 他、1978、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920。

本発明のプロテアーゼを製造する方法
さらに、本発明は、下記の工程を含んでなる、本発明のプロテアーゼを製造する方法に関する:
a) プロテアーゼの製造を促進する条件下に本発明の組換え宿主細胞を培養し、そして
b) プロテアーゼを回収する。

酵素をコードするDNA配列を含んでなる発現ベクターを異種宿主細胞の中に形質転換するとき、本発明の酵素の異種組換え産生を可能とすることができる。
これにより、相同的不純物を含有しないことを特徴とする、高度に精製されたプロテアーゼ組成物を製造することが可能である。
この関係において、相同的不純物は本発明の酵素が本来得られた相同的細胞から生ずる不純物 (例えば、本発明の酵素以外の他のポリペプチド) を意味する。

形質転換された宿主細胞の培養に使用する培地は、問題の宿主細胞の増殖に適当な任意の慣用培地であることができる。発現されたプロテアーゼは好都合に培地中に分泌させることができ、よく知られている手順、例えば、遠心または濾過による培地からの細胞の分離、塩、例えば、硫酸アンモニウムによる培地のタンパク質成分の沈殿、次いでクロマトグラフィー手順、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたはその他により、培地から回収することができる。

本発明のプロテアーゼの使用
本発明のプロテアーゼ酵素は、多数の産業的用途、特に洗剤産業において使用することができる。こうして、本発明は、また、本発明のプロテアーゼ酵素を含んでなる、クリーニングまたは洗剤組成物、好ましくは洗濯または皿洗浄組成物に関する。

本発明のプロテアーゼを含んでなる洗剤組成物
一般に、クリーニングおよび洗剤組成物はこの分野において十分に記載されており、適当なクリーニングおよび洗浄剤組成物のそれ以上の説明については下記の文献を参照のこと:WO 96/34946; WO 97/07202; WO 95/30011。
さらに、本明細書中の実施例は本発明のプロテアーゼについての洗剤中の安定性の改良を証明している。

洗剤組成物
本発明の酵素を洗剤組成物に添加し、こうしてクリーニングまたは洗剤組成物の1構成成分することができる。
本発明の洗剤組成物は、例えば、汚れた布帛の前処理に適当な洗濯添加剤組成物およびリンス添加布帛柔軟剤組成物を包含する手によるまたは機械的洗濯洗剤組成物として配合することができ、または一般的家庭用硬質表面クリーニング作業において使用する洗剤組成物として配合することができ、または手による皿洗浄作業または機械的皿洗浄作業のために配合することができる。

特定の面において、本発明は、本発明のプロテアーゼを含んでなる洗剤添加剤を提供する。洗剤添加剤ならびに洗剤組成物は、1種または2種以上の他の酵素、例えば、他のプロテアーゼ、例えば、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えば、ラッカーゼ、および/またはペルオキシダーゼを含んでなることができる。

一般に、1種または2種以上の選択した酵素は、選択した洗剤と適合性 (すなわち、pH最適値、他の酵素および非酵素成分、およびその他と適合性) であるべきであり、そして1種または2種以上の酵素は有効量で存在すべきである。

プロテアーゼ: 適当なプロテアーゼは、動物、植物または微生物由来のプロテアーゼを包含する。微生物由来は好ましい。化学的または遺伝的に修飾された突然変異体が包含される。プロテアーゼはセリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼであることができる。アルカリ性プロテアーゼの例は、スブチリジン、特にバシラス (Bacillus) に由来するもの、例えば、スブチリジンNovo、スブチリジンCarlsberg、スブチリジン309、スブチリジン147およびスブチリジン168 (WO 89/06279に記載されている) である。トリプシン様プロテアーゼの例はトリプシン (例えば、ブタまたはウシ由来) およびWO 89/06270およびWO 94/25583に記載されているフザリウム (Fusarium) プロテアーゼである。

有効なプロテアーゼの例はWO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116、およびWO 98/34946に記載されている変異型、特に下記の位置の1または2以上において置換を有する変異型である: 27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、252および274 (BPNのナンバリング)。

好ましい商業的に入手可能なプロテアーゼ酵素は下記を包含する: Alcalase^TM、Savinase^TM、Primase^TM、Duralase^TM、Esperase^TM、およびKannase^TM (Novozymes A/S)、Maxatase^TM、Maxacal^TM、Maxapem^TM、Properase^TM、Purafect^TM、Purafect OxP^TM、FN2^TM、およびFN3^TM (Genencor International)。

リパーゼ: 適当なリパーゼは細菌または真菌由来である。化学的に修飾されたまたはタンパク質操作された突然変異体が包含される。有効なリパーゼの例は下記のからのリパーゼを包含する: フミコラ (Humicola) (同義語Thermomyces)、例えば、EP 258 068およびEP 305 216に記載されているフミコラ・ラヌギノサ (H. lanuginosa) (T. lanuginosa) またはWO 96/13580に記載されているフミコラ・インソレンス (H. insolens)、シュードモナス (Pseudomonas) リパーゼ、例えば、シュードモナス・アルカリゲネス (P. alcaligenes) またはシュードモナス・シュードアルカリゲネス (P. pseudoalcaligenes) (EP 218 272)、シュードモナス・セパシア (P. cepacia) (EP 331 376)、シュードモナス・スツゼリ (P. stutzeri) (GB 1,372,034)、シュードモナス・フルオレセンス (P. fluorescens)、シュードモナス (Pseudomonas) 種株SD 705 (WO 95/06720およびWO 96/27002)、シュードモナス・ウィスコンシネンシス (P. wisconsinensis) (WO 96/12012)、バシラス (Bacillus) リパーゼ、例えば、バシラス・サチリス (B. subtilis) (Dartois 他 (1993)、Biochimica et Biophysica Acta 1131、253-360)、バシラス・ステアロサーモフィラス (B. stearothermophilus) (JP 64/744992) またはバシラス・ピュミルス (B. pumilus) (WO 92/16422)。

他の例はリパーゼ変異型、例えば、下記の文献に記載されている変異型である: WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079およびWO 97/07202。
好ましい商業的に入手可能なリパーゼ酵素は、Lipolase^TMおよびLipolase Ultra^TM (Novozymes A/S) である。

アミラーゼ: 適当なアミラーゼ (α-および/またはβ-) は細菌または真菌由来のものを包含する。化学的に修飾されたまたはタンパク質操作された突然変異体が包含される。アミラーゼは、例えば、バシラス (Bacillus)、例えば、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) の特別の株から得られるα-アミラーゼを包含する (GB 1,296,839にいっそう詳細に記載されている)。

有用なアミラーゼの例は次の通りである: WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、WO 97/43424に記載されている変異型、特に下記の位置の1または2以上に置換をもつ変異型: 15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408および444。
商業的に入手可能なα-アミラーゼは下記のものを包含する: Duramly^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TMおよびBAN^TM (Novozymes A/S)、Rapidase^TMおよびPurastar^TM (Genencor International Inc.)。

セルラーゼ: 適当なセルラーゼは細菌または真菌由来のものを包含する。化学的に修飾されたまたはタンパク質操作された突然変異体が包含される。適当なセルラーゼは下記からのセルラーゼを包含する: 属バシラス (Bacillus)、シュードモナス (Pseudomonas)、フミコラ (Humicola)、フザリウム (Fusarium)、チエラビア (Thielavia)、アクレモニウム (Acremonium)、例えば、US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757およびWO 89/09259に開示されているフミコラ・インソレンス (Humicola insolens)、ミセリオフトラ・サーモフィラ (Myceliophthora thermophila) およびフザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) から産生された真菌セルラーゼ。

特に適当なセルラーゼは色ケアー利益を有するアルカリ性または中性のセルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940に記載されているセルラーゼである。他の例はセルラーゼ変異型、例えば、WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307、WO 99/01544およびPCT/DK 98/00299に記載されている変異型である。

商業的に入手可能なセルラーゼは下記のものを包含する:Celluzyme^TM、およびCarezyme^TM (Novozymes A/S)、Clazinase^TM、およびPuradax HA^TM (Genencor International Inc.)、およびKAC-500(B)^TM (Kao Corporation)。
ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ: 適当なペルオキシダーゼ/オキシダーゼは細菌または真菌由来のものを包含する。化学的に修飾されたまたはタンパク質操作された突然変異体が包含される。有効なペルオキシダーゼの例は、コプリヌス (Coprinus)、例えば、コプリヌス・シネレウス (C. cinereus) からのペルオキシダーゼ、およびそれらの変異型、例えば、WO 93/24618、WO 95/10602、およびWO 98/15257に記載されているものを包含する。

1種または2種以上の洗剤酵素は、洗剤組成物の中に、1種または2種以上の酵素を含有する別々の添加剤を添加するか、あるいはこれらの酵素のすべてを含んでなる組合わせた添加剤を添加することによって添加することができる。本発明の洗剤添加剤、すなわち、別々の添加剤または組合わせた添加剤は、例えば、粒体、液体、スラリー、およびその他として配合することができる。好ましい洗剤添加剤配合物は、粒体、特に非ダスチング粒体、特に安定化液体、またはスラリーである。

非ダスチング粒体は、例えば、US 4,106,991およびUS 4,661,452に記載されているようにして製造することができ、そして必要に応じてこの分野において知られている方法により被覆することができる。蝋状被覆物質の例は次の通りである: 平均分子量1000〜20000のポリ(エチレンオキシド) 生成物 (ポリエチレングリコール、PEG); 16〜50エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール; 12〜20個の炭素原子を含有しかつ18〜80エチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪族アルコール; 脂肪族アルコール; 脂肪酸; および脂肪酸のモノ-およびジ-およびトリグリセリド。流動床技術による適用に適当な皮膜形成被覆物質の例はGB 1483591に記載されている。液状酵素調製物は、例えば、確立された方法に従い、ポリオール、例えば、ポリエチレングリコール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸の添加により安定化することができる。保護された酵素は、EP 238,216に開示されている方法に従い製造することができる。

本発明の洗剤組成物は、任意の便利な形態、例えば、棒、タブレット、粉末、粒体、ペーストまたは液体であることができる。液状洗剤は、典型的には70%までの水および0〜30%の有機溶媒を含有する水性であるか、あるいは非水性であることができる。
洗剤組成物は、非イオン性であることができ、半極性および/またはアニオン性および/または双生イオンを包含する、1種または2種以上の界面活性剤を含んでなる。典型的には、界面活性剤は0.1〜60重量%のレベルで存在する。

その中に含めるとき、洗剤は通常約1%〜約40%のアニオン界面活性剤、例えば、線状アルキルベンゼンスルホネート、α-オレフィンスルホネート、アルキルサルフェート (脂肪族アルコールサルフェート) 、アルコールエトキシサルフェート、第二級アルカンスルホネート、α-スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル-またはアルケニルコハク酸または石鹸を含有するであろう。

その中に含めるとき、洗剤は通常約0.2%〜約40%の非イオン界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、またはグルコサミンのN-アシルN-アルキル誘導体 (「グルコサミド」)を含有するであろう。

洗剤は0〜65%の洗剤ビルダーまたは錯化剤、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル-またはアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩または層状化ケイ酸塩 (例えば、SKS-6、Hoechst) を含有することができる。
洗剤は1種または2種以上のポリマーを含んでなることができる。それらの例は次の通りである: カルボキシメチルセルロース、ポリ (ビニルピロリドン)、ポリ (エチレングリコール)、ポリ (ビニルアルコール)、ポリ (ビニルピリジン-N-オキシド) 、ポリ (ビニルイミダゾール)、ポリカルボキシレート、例えば、ポリアクリレート、マレイン酸/アクリル酸コポリマーおよびラウリルメトアクリレート/アクリル酸コポリマー。

洗剤は漂白系を含有することができる。漂白系は過酸化水素源、例えば、過ホウ素酸塩または過炭酸塩を含んでなり、これらは過酸生成漂白アクチベーター、例えば、テトラアセチルエチレンジアミンまたはノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩と組合わせることができる。選択的に、漂白系は、例えば、アミド、イミド、またはスルホン型のペルオキシ酸を含んでなることができる。

本発明の洗剤組成物の1種または2種以上の酵素は、慣用の安定剤、例えば、ポリオール、例えば、プロピレングリコールまたはグリセロール、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸、またはホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸エステル、またはフェニルホウ酸誘導体、例えば、4-ホルミルフェニルホウ酸を使用して安定化することができ、そして組成物はWO 92/19709およびWO 92/19708に記載されているようにして配合することができる。

また、洗剤は他の慣用の洗剤成分、例えば、布帛コンディショナー、例えば、粘土、発泡ブースター、泡抑制剤、腐蝕防止剤、汚れ懸濁剤、汚れ再付着防止剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、ハイドロトープ、曇り抑制剤、または香料を含有することができる。
現在、洗剤組成物において、酵素、特に本発明の酵素は0.01〜100 mgの酵素タンパク質/リットルの洗浄液、好ましくは0.05〜5 mgの酵素タンパク質/リットルの洗浄液、特に0.1〜1 mgの酵素タンパク質/リットルの洗浄液に相当する量で添加することができることが考えられる。

さらに、本発明の酵素は、WO 97/07202に開示されている洗剤配合物中に添加できる。
下記の実施例により、本発明の組成物をさらに説明するが、これらの実施例はいかなる方法においても本発明の範囲を限定することを意図しない。
洗剤組成物において、略した成分識別は下記の意味を有する:
LAS: 直鎖状C₁₂アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム
TAS: 獣脂アルキル硫酸ナトリウム
XYAS: C_1X-C_1Yアルキル硫酸ナトリウム
SS: 式2-ブチルオクタン酸の第二級石鹸界面活性剤
25EY: 平均Yモルのエチレンオキシドと縮合した主として直鎖状のC₁₂-C₁₅第一級アルコール
45EY: 平均Yモルのエチレンオキシドと縮合した主として直鎖状のC₁₄-C₁₅第一級アルコール
XYEZS: 平均Zモルのエチレンオキシド/モルと縮合したC_1X-C_1Yアルキル硫酸ナトリウム
非イオン: 商品名Plurafax LF404 (BASF GmbHから入手可能である) の3.8の平均エトキシル化度および4.5の平均プロポキシル化度を有するC₁₃-C₁₅混合エトキシル化/プロポキシル化脂肪族アルコール

CFAA: C₁₂-C₁₄アルキルN-メチルグルカミド
TFAA: C₁₆-C₁₈アルキルN-メチルグルカミド
ケイ酸塩: 非晶質ケイ酸ナトリウム (SiO₂:Na₂O比= 2.0)
NaSKS-6: 式δ-Na₂Si₂O₅の結晶質層状ケイ酸塩
炭酸塩: 無水炭酸ナトリウム
リン酸塩: トリポリリン酸ナトリウム
MA/AA: 1:4 マレイン酸/アクリル酸のコポリマー、平均分子量約80,000
ポリアクリレート: 商品名PA30 (BASF Gmbhから入手可能である) の平均分子量約8,000のポリアクリレートホモポリマー

ゼオライトA: 1〜10マイクロメーターの範囲の主要な粒度を有する式Na₁₂(AlO₂SiO₂)₁₂・27H₂Oの水和アルミノケイ酸ナトリウム
クエン酸塩: クエン酸三ナトリウム二水和物
Citric: クエン酸
過ホウ素酸塩: 実験式NaBO₂・H₂O₂の無水過臭素酸ナトリウム一水和物
PB4: 無水過臭素酸ナトリウム四水和物
過炭酸塩: 実験式2Na₂CO₃・3H₂O₂の無水過炭酸ナトリウム
TAED: テトラアセチルエチレンジアミン
CMC: ナトリウムカルボキシメチルセルロース
DETPMP: ジエチレントリアミンペンタ (メチレンホスホン酸)、商品名Dequest 2060 (Monsantoから入手可能である)

PVP: ポリビニルピロリドンポリマー
EDDS: エチレンジアミン-N,N’-ジコハク酸、ナトリウム塩の形態の[S,S]異性体
泡抑制剤: 25%パラフィン蝋、融点50 ℃、17%疎水性シリカ、58%パラフィン油
粒状泡抑制剤: 12%シリコーン/シリカ、18%ステアリルアルコール、70%粒体の形態の澱粉
硫酸塩: 無水硫酸ナトリウム
HMWPEO: 高分子量ポリエチレンオキシド
TAE 25: 獣脂アルコールエトキシレート (25)

洗剤の実施例1.
本発明に従う粒状布帛クリーニング組成物を次のように調製することができる:
成分 %
直鎖状C₁₂アルキルベンゼン
スルホン酸ナトリウム 6.5
硫酸ナトリウム 15.0
ゼオライトA 26.0
ニトリロ三酢酸ナトリウム 5.0
酵素 0.1
PVP 0.5
TAED 3.0
ホウ酸 4.0
過ホウ素酸塩 18.0
フェノールスルホネート 0.1
少量成分 100まで

洗剤の実施例2.
本発明に従う圧縮粒状布帛クリーニング組成物(密度800 g/l) を次のように調製することができる:
成分 %
45AS 8.0
25E3S 2.0
25E5 3.0
25E3 3.0
TFAA 2.5
ゼオライトA 17.0
NaSKS-6 12.0
クエン酸 3.0
炭酸塩 7.0
MA/AA 5.0
CMC 0.4
酵素 0.1
TAED 6.0
過炭酸塩 22.0
EDDS 0.3
粒状泡抑制剤 3.5
水/少量成分 100まで

洗剤の実施例3.
着色した布帛の洗濯において特に有効である、本発明に従う粒状布帛クリーニング組成物は、次のように調製することができる:

成分 % %
LAS 10.7 -
TAS 2.4 -
TFAA - 4.0
45AS 3.1 10.0
45E7 4.0 -
25E3S - 3.0
68E11 1.8 -
25E5 - 8.0
クエン酸塩 15.0 7.0
炭酸塩 - 10.0
クエン酸 2.5 3.0
ゼオライトA 32.1 25.0
NaSKS-6 - 9.0
MA/AA 5.0 5.0
DETPMP 0.2 0.8
酵素 0.10 0.05
ケイ酸塩 2.5 -
硫酸塩 5.2 3.0
PVP 0.5 -
ポリ(4-ビニルピリジン)-N-
オキシド/ビニルイミダゾールと
ビニルピリドンとのコポリマー - 0.2
過ホウ素酸塩 1.0 -
フェノールスルホネート 0.2 -
水/少量成分 100まで 100まで

洗剤の実施例4.
「洗浄に通して柔軟化」能力を提供する、本発明に従う粒状布帛クリーニング組成物は、次のように調製することができる:
成分 % %
45AS - 10.0
LAS 7.6 -
68AS 1.3 -
45E7 4.0 -
25E3 - 5.0
ココ-アルキル-ジメチル-ヒドロキ
シ-エチルアンモニウムクロライド 1.4 1.0
クエン酸塩 5.0 3.0
Na-SKS-6 - 11.0
ゼオライトA 15.0 15.0
MA/AA 4.0 4.0
DETPMP 0.4 0.4
過ホウ素酸塩 15.0 -
過炭酸塩 - 15.0
TAED 5.0 5.0
スメクタイト粘土 10.0 10.0
HMWPED - 0.1
酵素 0.10 0.05
ケイ酸塩 3.0 5.0
炭酸塩 10.0 10.0
粒状泡抑制剤 1.0 4.0
CMC 0.2 0.1
水/少量成分 100まで 100まで

洗剤の実施例5.
本発明に従う強力粒状布帛クリーニング組成物は、次のように調製することができる:
成分 % %
LAS酸型 - 25.0
クエン酸 5.0 2.0
25AS酸型 8.0 -
25AE2S酸型 3.0 -
25AE7 8.0 -
CFAA 5.0 -
DETPMP 1.0 1.0
脂肪酸 8 -
オレイン酸 - 1.0
エタノール 4.0 6.0
プロパンジオール 2.0 6.0
酵素 0.10 0.05
ココ-アルキル-ジメチルヒドロキ
シ-エチルアンモニウムクロライド - 3.0
スメクタイト粘土 - 5.0
PVP 2.0 -
水/少量成分 100まで 100まで

粉末状自動皿洗浄組成物I
非イオン界面活性剤 0.4〜2.5%
メタケイ酸ナトリウム 0〜20%
二ケイ酸ナトリウム 3〜20%
三リン酸ナトリウム 20〜40%
炭酸ナトリウム 0〜20%
過ホウ素酸ナトリウム 2〜9%
テトラアセチルエチレンジアミン (TAED) 1〜4%
硫酸ナトリウム 5〜33%
酵素 0.0001〜0.1%

粉末状自動皿洗浄組成物II
非イオン界面活性剤
(例えば、アルコールエトキシレート) 1〜2%
二ケイ酸ナトリウム 2〜30%
炭酸ナトリウム 10〜50%
リン酸ナトリウム 0〜5%
クエン酸三ナトリウム二水和物 9〜30%
ニトリロ三ナトリウム酢酸 (NTA) 0〜20%
過ホウ素酸ナトリウム一水和物 5〜10%
テトラアセチルエチレンジアミン (TAED) 1〜2%
ポリアクリレートポリマー (例えば、
マレイン酸/アクリル酸コポリマー) 6〜25%
酵素 0.0001〜0.1%
香料 0.1〜0.5%
水 5〜10%

粉末状自動皿洗浄組成物III
非イオン界面活性剤 0.5〜2.0%
二ケイ酸ナトリウム 25〜40%
クエン酸ナトリウム 30〜55%
炭酸ナトリウム 0〜29%
重炭酸ナトリウム 0〜20%
過ホウ素酸ナトリウム一水和物 0〜15%
テトラアセチルエチレンジアミン (TAED) 0〜6%
マレイン酸/アクリル酸コポリマー 0〜5%
粘土 1〜3%
ポリアミノ酸 0〜20%
ポリアクリル酸ナトリウム 0〜8%
酵素 0.0001〜0.1%

粉末状自動皿洗浄組成物IV
非イオン界面活性剤 1〜2%
ゼオライトMAP 15〜42%
二ケイ酸ナトリウム 30〜34%
クエン酸ナトリウム 0〜12%
炭酸ナトリウム 0〜20%
過ホウ素酸ナトリウム一水和物 7〜15%
テトラアセチルエチレンジアミン (TAED) 0〜3%
ポリマー 0〜4%
マレイン酸/アクリル酸コポリマー 0〜5%
有機ホスホネート 0〜4%
粘土 1〜2%
酵素 0.0001〜0.1%
硫酸ナトリウム 残部

粉末状自動皿洗浄組成物V
非イオン界面活性剤 1〜7%
二ケイ酸ナトリウム 18〜30%
クエン酸三ナトリウム 10〜24%
炭酸ナトリウム 12〜20%
モノ過硫酸塩 (2 KHSO₆・KHSO₄・K₂SO₄) 15〜21%
漂白安定剤 0.1〜2%
マレイン酸/アクリル酸コポリマー 0〜6%
ジエチレントリアミン五酢酸、
五ナトリウム塩 0〜2.5%
酵素 0.0001〜0.1%
硫酸ナトリウム、水 残部

クリーニング界面活性剤系を含む粉末状および液状皿洗浄組成物VI
非イオン界面活性剤 0〜1.5%
オクタデシルジメチルアミンN-オキシド
デヒドレート 0〜5%
オクタデシルジメチルアミンN-オキシド
デヒドレートとヘキサデシルジメチルアミン
N-オキシドデヒドレートとの80:20重量
C18/C16ブレンド 0〜4%
オクタデシルビス(ヒドロキシメチル)アミン
N-オキシド無水物とヘキサデシルオクタデシル
ビス(ヒドロキシメチル)アミンN-オキシド
無水物との70:30重量C18/C16ブレンド 0〜5%
平均エトキシル化度が3であるC₁₃-C₁₅
アルキルエトキシサルフェート 0〜10%
平均エトキシル化度が3であるC₁₂-C₁₅
アルキルエトキシサルフェート 0〜5%
平均エトキシル化度が12であるC₁₃-C₁₅
エトキシル化アルコール 0〜5%
平均エトキシル化度が9であるC₁₂-C₁₅
エトキシル化アルコールのブレンド 0〜6.5%
平均エトキシル化度が30であるC₁₃-C₁₅
エトキシル化アルコールのブレンド 0〜4%
二ケイ酸ナトリウム 0〜33%
トリポリリン酸ナトリウム 0〜46%
クエン酸ナトリウム 0〜28%
クエン酸 0〜29%
炭酸ナトリウム 0〜20%
過ホウ素酸ナトリウム一水和物 0〜11.5%
テトラアセチルエチレンジアミン (TAED) 0〜4%
マレイン酸/アクリル酸コポリマー 0〜7.5%
硫酸ナトリウム 0〜12.5%
酵素 0.0001〜0.1%

非水性液状自動皿洗浄組成物VII
液状非イオン界面活性剤 (例えば、
アルコールエトキシレート) 2.0〜10.0%
アルカリ金属ケイ酸塩 3.0〜15.0%
アルカリ金属リン酸塩 20.0〜40.0%
高級グリコール、ポリグリコール、ポリオキシド
グリコールエーテルから選択される液状担体 25.0〜45.0%
安定剤 (例えば、リン酸とC₁₆-C₁₈アルカ
ノールとの部分的エステル) 0.5〜7.0%
抑泡剤 (例えば、シリコーン) 0〜1.5%
酵素 0.0001〜0.1%

非水性液状皿洗浄組成物VIII
液状非イオン界面活性剤 (例えば、
アルコールエトキシレート) 2.0〜10.0%
ケイ酸ナトリウム 3.0〜15.0%
アルカリ金属炭酸塩 7.0〜20.0%
クエン酸ナトリウム 0.0〜1.5%
安定化系 (例えば、微粉砕シリコーンと低分子量
ジアルキルポリグリコールエーテルとの混合物) 0.5〜7.0%
低分子量ポリアクリレートポリマー 5.0〜15.0%
粘土ゲル増粘剤 (例えば、ベントナイト) 0.0〜10.0%
ヒドロキシプロピルセルロースポリマー 0.0〜0.6%
酵素 0.0001〜0.1%
高級グリコール、ポリグリコール、ポリオキシド
グリコールエーテルから選択される液状担体 残部

チキソトロープ液状自動皿洗浄組成物IX
C₁₂-C₁₄脂肪酸 0〜0.5%
ブロックコポリマーの界面活性剤 1.5〜15.0%
クエン酸ナトリウム 0〜12%
トリポリリン酸ナトリウム 0〜15%
炭酸ナトリウム 0〜8%
三ステアリン酸アルミニウム 0〜0.1%
クメンスルホン酸ナトリウム 0〜1.7%
ポリアクリレート増粘剤 1.32〜2.5%
ポリアクリル酸ナトリウム 2.4〜6.0%
ホウ酸 0〜4.0%
ギ酸ナトリウム 0〜0.45%
ギ酸カルシウム 0〜0.2%
n-デシルフェニルオキシド二硫酸
ナトリウム 0〜4.0%
モノエタノールアミン (MEA) 0〜1.86%
水酸化ナトリウム (50%) 1.9〜9.3%
1,2-プロパンジオール 0〜9.4%
酵素 0.0001〜0.1%
泡抑制剤、染料、香料、水 残部

液状自動皿洗浄組成物X
アルキルエトキシレート 0〜20%
脂肪酸エステルスルホネート 0〜30%
ドデシル硫酸ナトリウム 0〜20%
アルキルポリグリコシド 0〜21%
オレイン酸 0〜10%
二ケイ酸ナトリウム一水和物 18〜33%
クエン酸ナトリウムデヒドレート 18〜33%
ステアリン酸ナトリウム 0〜2.5%
過ホウ素酸ナトリウム一水和物 0〜13%
テトラアセチルエチレンジアミン (TAED) 0〜8%
マレイン酸/アクリル酸コポリマー 4〜8%
酵素 0.0001〜0.1%

保護された漂白剤粒子を含有する液状自動皿洗浄組成物XI
ケイ酸ナトリウム 5〜10%
ピロリン酸四カリウム 15〜25%
三リン酸ナトリウム 0〜2%
炭酸カリウム 4〜8%
保護された漂白剤粒子、例えば、塩素 5〜10%
ポリマー増粘剤 0.7〜1.5%
水酸化カリウム 0〜2%
酵素 0.0001〜0.1%
水 残部

XII: 過臭素酸塩が過炭酸塩に置き換わった、I、II、III、IV、VIおよびXに記載する自動皿洗浄組成物。
XIII: マンガン触媒をさらに含有するI〜VIに記載する自動皿洗浄組成物。マンガン触媒は、例えば、下記の文献に記載されている化合物の1つであることができる: “Efficient catalysts for low-temperature bleaching”、Nature (1994)、369、pp. 637-639。

材料および方法
真菌株フザリウム・ソラニ (Fusarium Solani)
アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 株BECh2 (WO 00/39322)
発現ベクターpCaHj483 (WO 98/00529)
アスペルギルス (Aspergillus) 発現構築物pMStr59 (実施例6)

プロテアーゼ活性のアッセイ
AZCL-カゼインアッセイ:
基質: AZCL-カゼイン (架橋しかつ染色したカゼイン、Megazymeから、カタログNo. I-AZCAS)。
温度: 制御。

アッセイ緩衝液:
・ pH分布のために:
100 mMのコハク酸、
100 mMのHEPES
100 mMのCHES、
100 mMのCABS、1 mMのCaCl₂
150 mMのKCl、
0.01%のトリトンX-100
HClまたはNaOHでpHを下記の値に調節した: 3.0; 4.0; 5.0; 6.0; 7.0; 8.0; 9.0; 10.0および11.0。
・ 他のために: 0.1 Mのホウ砂、pH 9.0。

AZCL-カゼインアッセイのプロトコル:
1) 0.02 gのAZCL-カゼインを10.0 mlのアッセイ緩衝液中に攪拌しながら懸濁させる。
2) 200 μlのこの懸濁液を管に移し、氷浴上に置き、次いで40 μlの試料 (アッセイ緩衝液中に希釈した) を基質管に添加する。
3) 基質および酵素試料の両方を含む管をサーモミキサー (これは少なくとも5分間アッセイ温度に前加温されている) に移すことによって、アッセイを開始する。
4) この管をサーモミキサー上で1200 rpmにおいて20分間インキュベートする。
5) この管を氷浴に移すことによって、インキュベーションを停止させる。
6) 次いで、管を冷遠心機中で数分間遠心する。
7) 相対プロテアーゼ活性の測度としてOD₅₉₅を測定する。

DMC/TNBSアッセイのプロトコル:
基質および試薬の調製:
・ DMC基質溶液:
0.075 gのDMC (ジメチルカゼイン、Novo Nordisk A/S) を10 mlのアッセイ緩衝液 (AZCL-カゼインアッセイと命名する) 中に溶解し、HClまたはNaOHでpHを調節し、0.45 μmの膜で濾過し、これをDMC基質溶液として使用する。
・ TNBS溶液:
17 μlの1 MのTNBS (Flukaから入手可能である) を5 mlの200 mMのCHES (Sigmaから入手可能である) 緩衝液pH 9.0で希釈し、光に露出しないで氷浴上に保持する。

手順:
1) 40 μlのDMC基質溶液を96ウェルのマイクロタイタープレートに移し、20 μlのプロテアーゼ試料を添加し、次いで十分に混合し、光に露出しないで氷浴上に保持する。
2) マイクロタイタープレートをサーモミキサー (これは少なくとも5分間アッセイ温度に前加温されている) に移すことによって、アッセイを開始する。
3) マイクロタイタープレートをサーモミキサー上で600 rpmにおいて20分間インキュベートする。
4) マイクロタイタープレートを氷浴に移すことによってインキュベーションを停止させ、次いで60 μlのTNBS溶液を添加し、暗所で15分間氷上に保持する。
5) プロテアーゼの相対活性の測度として、OD₄₀₅を読む。

開始剤
ストレプトマイセス (Streptomyces) スブチリジンインヒビター (SSI) (Novo Nordisk A/S製)
キモトリプシンインヒビター-2 (Cl-2) (Novo Nordisk A/S製)
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩 (EDTA) (USB Life Scienceから)

p-ニトロアニリン色素形成基質
Suc-AAPF-pNA (Sigma S-7388)
Suc-AAPE-pNA (BACHEM L-1710)
Suc-GGF-pNA (Sigma S-1899)
BA-pNA (ベンゾイルDLアルギニン、Sigma B-4875)
Suc-FGL-pNA (Sigma S-6768)

実施例1.酵素精製および遺伝子クローニングのための真菌株の培養
本発明のプロテアーゼをコードする遺伝子フラグメントを含有するフザリウム・ソラニ (Fusarium solani) をWB培地中で増殖させた。
500 mlの震蘯フラスコにつき:
・ 30 gのコムギふすま、および
・ 45 mlの下記の溶液:
0.18 gの酵母エキス、
0.045 gのKH₂PO₄、
0.0225 gのMgSO₄・7H₂O
0.675 gのグルコース、45 mlの水道水、
121℃において30分間オートクレーブ処理し、25℃以下に7日間保持する。

約150 mlの滅菌した水を添加し、滅菌したガラス棒で混合することによって、酵素を抽出し、次いでそれを4℃において一夜放置した。最後に、濾過し、遠心した後、上清を収集し、さらに精製するために、粗製プロテアーゼ試料として使用した。
次いで、10 gの発酵したWB培地をきれいなバッグに直接移し、次いで直ちに液体窒素中で凍結させることによって、菌糸体を収集した。凍結した菌糸体を-80℃のフリーザー中で貯蔵した後、RNA抽出に使用した。

実施例2.培養ブロスからのプロテアーゼの精製
実施例1に記載した株の4000 mlの上清をプロテアーゼの精製に使用した。全タンパク質を硫酸アンモニウム (80%の飽和) で沈殿させた。
遠心後、沈殿を100 mlの25 mMのリン酸塩緩衝液 (pH 6.0) 中に再溶解させ、次いで同一緩衝液で透析した。
次いで透析した試料を0.45 μmのフィルターで濾過し、次いで精製カラムに適用した。試料の最終体積は140 mlであった。

濾過した試料を25 mMのリン酸塩緩衝液pH 6.0中で平衡化した38 mlのSPセファローズFFカラム (Pharmaciaから) に適用し、タンパク質を線形NaCl勾配 (0〜0.3 M) で溶離した。カラムからの画分をAZCL-カゼインに対するプロテアーゼ活性について、SSIの前阻害の存在または非存在下に、分析した。

SSIで阻害しなかったプロテアーゼ活性の画分をプールした。プールした溶液を3k膜 (Amiconから) で濾過し、濃縮された溶液を25 mMのTris-HCl、pH 7.4と平衡化した180 mlのSephacryl 100カラム (Pharmaciaから) に適用した。タンパク質を同一緩衝液で溶離した。
プロテアーゼ活性試験 (SSIの前阻害の存在または非存在下) 後に、プロテアーゼ活性をもつ画分をSDS-PAGEにより分析し、精製されたプロテアーゼの画分をプールし、特性決定のための試料として使用した (実施例4参照)。

実施例3.プロテアーゼの遺伝子クローニング
本発明のプロテアーゼをコードする遺伝子フラグメントをRT-PCR技術によりクローニングした。
全RNAの抽出:
RNeasy Mini Kit (QIAGEN、カタログNo. 74904) を使用することによって、全RNAを凍結菌糸体から抽出した。実施例1に記載する株の100 mgの菌糸体から全RNAを抽出した。
クローニングのための特定プライマーの設計:
フザリウム (Fusarium) および関係する真菌からのトリプシンをPCR増幅するための特定のプライマーを、既知の真菌トリプシンDNA配列の保存された領域に基づいて設計した。プライマー配列 (CDS-プライマー) を配列番号5に示す。

3’ RACEキットを使用する本発明のプロテアーゼの全長クローニング: 3’ RACE系 (GIBCO、カタログNo. 18373-019) を使用して、本発明のプロテアーゼのcDNAを合成した。約5 μgの全RNAを鋳型として使用し、アダプタープライマー (3’ RACE系により提供される) を使用してcDNAの第1鎖を合成した。次いで、特定のCDS-プライマーを使用することによって、本発明のプロテアーゼのcDNAを増幅した。

CDS-プライマーを使用してPCR生成物をゲル分析すると、-1 kbのフラグメントの特定のバンドが得られ、生成物を1%のLMPアガロースゲルから回収し、次いで70℃においてインキュベートし、次いでPCR Preps DNA精製システム (Promega、カタログNo. A7170) を使用して精製した。精製したフラグメントをpGEM-Tベクター (Promega、カタログNo. A3600) に結合し、次いで2〜4 μlの結合生成物を50 μlのJM109高効力コンピテント細胞の中に「熱ショック」法により形質転換させた。
形質転換培養ブロスをアンピシリン/PTG/X-Galを含むLBプレート上にプレートし、これらのプレートを37℃において一夜インキュベートした。

インジケータープレート上の色スクリーニングおよびコロニーPCRスクリーニングにより、組換えクローンを同定した。陽性クローンを3 mlのLB液状培地に接種し、37℃において震蘯させながら (約250 rpm) 一夜インキュベートした。10,000 gにおいて5分間遠心することによって細胞を沈殿させた後、Minipreps DNA精製システム (Promega、カタログNo. A7100) を使用することによって、細胞沈殿物からプラスミド試料を調製した。最後に、ABI377配列決定装置を使用することによって、BigDyeターミネーターサイクル配列決定レディー反応キット (RE) でプラスミドを配列決定し、この遺伝子の全長配列を首尾よく得た。

実施例4.本発明のプロテアーゼの特性決定
阻害試験:
AZCL-カゼインアッセイにおいて、WO 94/25583に開示されているトリプシン様プロテアーゼおよびSavinase（商標）を対照とし、SSI、Cl-2およびEDTAを含む異なるインヒビターを使用することによって、本発明の精製されたプロテアーゼ (実施例2参照) を試験した。結果を図1に示す。本発明のプロテアーゼの活性はSSI、Cl-2およびEDTAにより阻害されず、これはプロテアーゼがセリンプロテアーゼファミリーにおけるスブチリジンプロテアーゼではないことを意味する。

基質特異性:
Savinase（商標）およびWO 94/25583に開示されているプロテアーゼを対照とし、AAPF、AAPE、GGF、BAおよびFGLを包含する異なるpNA基質を使用することによって、本発明のプロテアーゼにおける基質特異性を試験した。結果を図2に示す。
このプロテアーゼはWO 94/25583に開示されているトリプシン様プロテアーゼと同一の基質特異性を有し、そしてスブチリジンプロテアーゼSavinase（商標）と異なる。

温度分布:
前述したAZCL-カゼインアッセイを使用することによって、本発明のプロテアーゼについて温度分布を得た。結果を図3に示す。本発明のプロテアーゼは15℃〜70℃において活性であり、そして約40℃〜50℃の最適温度を有することを理解することができる。

pH分布:
節「プロテアーゼ活性のアッセイ」に記載されているようなAZCL-カゼインアッセイおよびDMC-アッセイの両方を使用することによって、本発明のプロテアーゼについてpH分布を得た。結果を図5 (AZCL-カゼインアッセイ) および図4 (DMCアッセイ) に示す。このプロテアーゼはpH 3 〜 pH 11において活性を示し、約pH 9において最適活性を示す。両方のアッセイにおいて、プロテアーゼはpH 11までにおいて高い活性を示した。

pH安定性:
pH安定性安定性について、15 μlの酵素試料を200 μlの緩衝液pH 3、4、5、6、7、8、9、10、11と混合し、37℃において2時間インキュベートした。引き続いて、節「プロテアーゼ活性のアッセイ」に記載されているようなAZCL-カゼインアッセイを使用することによって、酵素活性をアッセイした。結果を図6に示す。本発明のプロテアーゼはpH 4からpH 10までの広いpH範囲において安定であることを理解することができる。

実施例5.洗剤中の安定性
プロテアーゼを脱イオン水中で希釈し、アタック (Attack) 洗剤 (KAOから) の溶液 (脱イオン水中の1.4 g/l、6°dH (CaCl₂ : MgCl₂ 2:1)、加熱不活性化せず) と混合して、0.7 g/l (3°dH) の最終濃度および関係するプロテアーゼ含量を得た。混合物中のOD280における25〜50 mA/mlに対応するプロテアーゼ投与量は通常である。3回の反復実験を使用する。

この混合物を20℃、25℃、30℃、および35℃において30分間インキュベートした後、DMC/TNBSアッセイにおいて活性を測定するか、あるいは活性を参照として直ちに測定する。
参照試料の活性に関して貯蔵した試料の活性として、下記表に示す残留活性が計算される。

データから理解できるように、本発明のプロテアーゼはWO 94/25583に開示されているプロテアーゼに比較して安定性の顕著な改良を示す。

実施例6.アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) におけるフザリウム・ソラニ (Fusarium solani) からのトリプシンの発現
フザリウム・ソラニ (Fusarium solani) トリプシンをコードするヌクレオチド配列 (配列番号1) を使用して、発現ベクター中へのクローニングを促進するためにプライマー末端に適当な制限部位が付加された、遺伝子をPCR増幅するためのプライマーを設計した (参照: 配列番号3および配列番号4; プライマー配列)。

製造業者の使用説明書に従いPfu Turbo DNAポリメラーゼ (Stratagene、米国カリフォルニア州ラジョラ) および鋳型として実施例3に記載するcDNAクローンおよび30サイクル間の58℃のアニリーング温度および1分のエクステンション時間を使用して、PCR増幅を実施した。単一PCR生成物が得られ、標準的技術に従い、これをXhoIで制限し、NruIおよびXhoIで制限したアスペルギルス (Aspergillus) 発現ベクターpCaHj483 (WO 98/00529) 中にクローニングした。発現ベクターpCaHj483は、大腸菌 (E. coli) における選択および増殖およびアスペルギルス (Aspergillus) における発現のための配列を有する。

詳しくは、唯一の窒素源としてアセトアミドの使用を可能とする、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) のamdS遺伝子により、アスペルギルス (Aspergillus) における選択は促進される。アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) からのトリオースホスフェートイソメラーゼ (tpi) エンコーディング遺伝子の5’ リーダーに配列に融合されたアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) からの中性アミラーゼII (NA2) プロモーター、およびアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) からのアミログルコシダーゼエンコーディング遺伝子により、アスペルギルス (Aspergillus) における発現は仲介される。生ずるアスペルギルス (Aspergillus) 発現構築物pMStr59のトリプシンエンコーディング遺伝子を配列決定し、そして配列を以前に決定された配列と比較して、PCR増幅間にエラーが導入されていないことを確認した。

アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 株BECh2 (WO 00/39322) をpMStr59で標準的技術に従い形質転換した (Christensen T. 他、1998、Bacteriology 6、1419-1422)。WO 94/26925に記載されている方法により250 mlのフラスコ中で5.0 AU/lのニュートラーゼ1.5 MG (Novozymes A/S、デンマーク国バグスバード) で改良されたFG4P培地の100 mlを使用して、形質転換体を培養した。ニュートラーゼを万能緩衝液pH 6.5中に溶解し、添加前に濾過滅菌した。培養物を26℃において270 rpmで4日間震蘯した。

WO 94/26925に記載されているように、N-ベンジル-L-アルギニン-p-ニトロアニリン (L-BA-pNA) を基質としておよび組成: 25 mMのトリス、1 mMのCaCl₂および150 mMのKClのトリス緩衝液pH 8.0を使用して、フザリウム (Fusarium) トリプシンの発現をアッセイした。

万能緩衝液:
100 mMのコハク酸、
100 mMのHEPES
100 mMのCHES、
100 mMのCABS
1 mMのCaCl₂
150 mMのKCl、
0.01%のトリトンX-100

実施例7.「モデル洗剤洗浄性能試験」
標準的洗剤組成物におけるスブチラーゼの洗浄性能を評価するために、標準的洗浄試験を下記の実験条件を使用して実施することができる:
洗剤: モデル洗剤
洗剤投与量: 4.0 g/l
pH 10.1
洗浄時間: 20 分
温度: 30℃
水硬度: 15°dH
酵素濃度: 10 nm (洗剤溶液中)
試験系: 攪拌棒を有する10 mlのビーカー
繊維材料/体積: 5繊維材料片 (直径2.5 cm)/50 mlの洗剤溶液
試験材料: EMPA 117

モデル洗剤の組成は次の通りである:
6.2% LAS (Nansa 80S)
2% C₁₆-C₁₈脂肪酸のナトリウム塩
4% 非イオン界面活性剤 (Plurafax LF404)
22% ゼオライトP
10.5% Na₂CO₃
4% Na₂Si₂O₅
2% カルボキシメチルセルロース (CMC)
6.8% アクルレート液体CP5 40%
20% 過ホウ素酸ナトリウム (実験式NaBO₂・H₂O₂)
0.2% EDTA
21% Na₂SO₄
水 (残部)

HClまたはNaOHの添加により洗剤溶液のpHを調節する。試験系にCaCl₂およびMgCl₂ (Ca⁺² : Mg²⁺= 4:1) を添加して、水硬度を15°dHに調節する。洗浄後、繊維材料片を水道水中でフラッシュし、空気乾燥した。
Macbeth ColorEye 7000フォトメーター (Macbeth、Division of Kollmorgen Instruments Corporation、ドイツ国) を使用して460 nmにおいて、試験材料上の反射 (R_{スブチラーゼ}) を測定する。測定は製造業者のプロトコルに従い実行する。

ブランク値を決定するために、酵素を添加しないで同様な洗浄実験を実施する。引き続いて、反射 (R_ブランク) を前述したように測定する。
次いで、前述したように参照実験を実施し、ここで関係するプロテアーゼの洗浄性能を試験する。引き続いて、反射 (R_{サビナーゼ}) を前述したように測定する。

生物学的物質の寄託
下記の生物学的物質は、ブタベスト条約の規定に従い微生物株保存機関 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellulturen GmbH、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschwelg、ドイツ国) に寄託され、下記の受け入れ番号を与えられた:
寄託 受け入れ番号 寄託日付
大腸菌 (Escherichia coli) DSM 15940 2003年9月22日
NN 049696

図1は、本発明のプロテアーゼの阻害分布を記載する。 図2は、本発明のプロテアーゼの基質の特異性を記載する。 図3は、本発明のプロテアーゼ温度分布を記載する。 図4は、DMC-アッセイにより決定した本発明のプロテアーゼのpH分布を記載する。 図5は、ACZL-カゼイン-アッセイにより決定した本発明のプロテアーゼのpH分布を記載する。 図6は、本発明のプロテアーゼのpH-安定性分布を記載する。

Claims (25)

1. 下記のプロテアーゼから成る群から選択されるプロテアーゼ:
   ａ．配列番号２のアミノ酸1〜226として示すアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるプロテアーゼ；および
   ｂ．配列番号１のヌクレオチド52〜804として示される核酸配列と少なくとも90％の同一性を有する核酸配列によりコードされるプロテアーゼ；
   上記プロテアーゼは、下記の方法により貯蔵した場合、少なくとも50%の残留プロテアーゼ活性を有する；貯蔵方法：プロテアーゼを脱イオン水中で希釈し、アタック（Attack）（登録商標）洗剤（KAOから）の溶液（脱イオン水中1.4 g/L、６°dH(CaCl₂：MgCl₂ 2:1）、加熱不活性化せず）と混合し、0.7 g/Lの最終濃度、35℃において30分間インキュベートする。
2. 配列番号２のアミノ酸1〜226として示すアミノ酸配列に対して、92.0%より大きい、または94.0%より大きい、または96.0%より大きい、または97.0%より大きい、または98.0%より大きい、または99.0%より大きい同一性を有する、請求項１に記載のプロテアーゼ。
3. 配列番号２のアミノ酸1〜226として示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のプロテアーゼ。
4. 配列番号２のアミノ酸1〜226として示すアミノ酸配列から成る、請求項１に記載のプロテアーゼ。
5. プロテアーゼが１または２以上のアミノ酸残基の置換、欠失および/または挿入を含んでなる配列番号２のアミノ酸-25〜226として示すアミノ酸配列を有するプロテアーゼの変異型である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロテアーゼ。
6. 大腸菌 (Escherichia coil) DSM 15940の中に存在するプラスミドフラグメント中にクローニングされたポリヌクレオチドのプロテアーゼをコードする部分によりコードされているプロテアーゼ、または配列番号２のアミノ酸１〜アミノ酸226に対して90％を超える同一性を有する前記プロテアーゼの変異型である、請求項１に記載のプロテアーゼ。
7. 配列番号２のアミノ酸１〜アミノ酸226に対して、92.0%より大きい、または94.0%より大きい、または96.0%より大きい、または97.0%より大きい、または98.0%より大きい、または99.0%より大きい同一性を有する、請求項６に記載のプロテアーゼ。
8. 大腸菌 (Escherichia coil) DSM 15940の中に存在するプラスミドフラグメント中にクローニングされたポリヌクレオチドのプロテアーゼをコードする部分によりコードされるプロテアーゼを含んでなる、請求項７に記載のプロテアーゼ。
9. 大腸菌 (Escherichia coil) DSM 15940の中に存在するプラスミドフラグメント中にクローニングされたポリヌクレオチドのプロテアーゼをコードする部分によりコードされるプロテアーゼから成る、請求項７に記載のプロテアーゼ。
10. プロテアーゼがトリプシン様プロテアーゼである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプロテアーゼ。
11. プロテアーゼが35℃において貯蔵後少なくとも55%、例えば、35℃において貯蔵後少なくとも60%、より好ましくは35℃において貯蔵後少なくとも65%の残留プロテアーゼ活性を有する、請求項１又は10に記載のプロテアーゼ。
12. 請求項1〜11のいずれかに記載のプロテアーゼをコードする核酸配列を含んでなる核酸。
13. 配列番号１のヌクレオチド52〜804として示す核酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有する、プロテアーゼをコードする核酸；
    上記プロテアーゼは、下記の方法により貯蔵した場合、少なくとも50%の残留プロテアーゼ活性を有する；貯蔵方法：プロテアーゼを脱イオン水中で希釈し、アタック（Attack）（登録商標）洗剤（KAOから）の溶液（脱イオン水中1.4 g/L、６°dH(CaCl₂：MgCl₂ 2:1）、加熱不活性化せず）と混合し、0.7 g/Lの最終濃度、35℃において30分間インキュベートする。
14. 配列番号1のヌクレオチド52〜804として示す核酸配列に対して、少なくとも91%、または少なくとも92%、または少なくとも93%、または少なくとも94%、または少なくとも95%、または少なくとも96%、または少なくとも97%、又は少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を有する、請求項12に記載の核酸。
15. 適当な宿主におけるプロテアーゼの発現を指令することができる1または2以上の制御配列に作用可能に連鎖された、請求項12〜14のいずれかに記載の核酸配列を含んでなる核酸構築物。
16. 請求項15に記載の核酸構築物、プロモーター、転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナルを含んでなる組換え発現ベクター。
17. 請求項15に記載の核酸構築物を含んでなる組換え宿主細胞。
18. 真菌または酵母、好ましくは糸状真菌、特にアスペルギルス (Aspergillus) である、請求項17に記載の宿主細胞。
19. アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) である、請求項18に記載の宿主細胞。
20. 細菌、好ましくはバシラス (Bacillus) 、特にバシラス・レンツス (Bacillus lentus) である、請求項17に記載の宿主細胞。
21. 下記の工程を含んでなる、請求項1〜11のいずれかに記載のプロテアーゼを製造する方法:
    ａ．プロテアーゼの産生を促す条件下に請求項17〜20のいずれかに記載の組換え宿主細胞を培養し、そして
    ｂ．プロテアーゼを回収する。
22. 請求項1〜11のいずれかに記載のプロテアーゼを含んでなるクリーニング組成物または洗剤組成物、好ましくは洗濯組成物または皿洗浄組成物。
23. セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、他のプロテアーゼ、アミラーゼまたはそれらの混合物をさらに含んでなる、請求項22に記載の組成物。
24. クリーニング組成物または洗剤組成物の製造における請求項1〜11のいずれかに記載のプロテアーゼの使用。
25. 硬質表面または洗濯物を請求項22又は23に記載の組成物と接触させることを含んでなる、硬質表面または洗濯物をクリーニングまたは洗浄する方法。

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