JP2731407B2

JP2731407B2 - 新規なプロテアーゼ酵素

Info

Publication number: JP2731407B2
Application number: JP63503271A
Authority: JP
Inventors: サマル，バブル・ビー; スタビンスキー，イザーク
Original assignee: AMUJEN
Current assignee: AMUJEN
Priority date: 1987-04-03
Filing date: 1988-03-28
Publication date: 1998-03-25
Anticipated expiration: 2013-03-25
Also published as: NO179217C; WO1988007581A1; NO179217B; DK672088D0; DE3855375T2; KR890700675A; NO885391L; CA1331154C; FI100602B; JPH01502798A; EP0309550B1; EP0309550A4; FI885635A; AU617996B2; NO885391D0; FI885635A0; EP0309550A1; DE3855375D1; AU1571688A; ATE139567T1

Description

【発明の詳細な説明】背景本発明は、菌類Tritirachium albumの培養培地から単
離された新規なセリンプロテアーゼに係る。本発明のセ
リンプロテアーゼは、水溶液中及び乾燥洗剤製品中で高
度な安定性をもつ。本発明な更に、かかるプロテアーゼ
を含有する洗剤組成物及び洗剤、クリーナー及びしみぬ
きクリーナーにおける該プロテアーゼの使用に係る。更
に、本発明は、該プロテアーゼをコードするDNA配列及
び該プロセアーゼの産生方法に係る。

セリンプロテアーゼは活性部位にセリン残基をもつタ
ンパク分解酵素である。フェニルメチルスルフォニルフ
ルオリド（PMSF）のごとき物質で活性部位のセリン残基
を変性するとこれらの酵素が失活する。セリンプロテア
ーゼは、キモトリプシン様プロテアーゼとズブチリシン
様プロテアーゼとの２つのクラスに分類される。ズブチ
リシンは一般にタンパクまたはペプチドの内部ペプチド
結合を開裂する作用をもつセリンプロテアーゼである。
ズブチリシンは多数のBacillus種から分泌され、広く商
業利用されている（米国特許第3623957号、J.Miller、1
970、J.Appl.Bacteriol．、33、207;Ward、O.P.1983、p
p.251〜317、Enzymes and Biotechnology、ed．、W.M.F
ogarty、Applied Science Publishers、London参照）。
ズブチリシンは多数の洗剤製品において使用されている
（米国特許第1240058号、第3749671号、第3790482号、
第4266031号、英国特許第1315937号参照）。

タンパクの加水分解を必要とする工業プロセスにおけ
るプロテアーゼの使用は、かかるプロセスに関連する温
度及びpH条件下にこの酵素が不安定であるためその使用
に制約がある。プロテアーゼの工業利用の制約の最も重
要な要因は、プロテアーゼが熱失活を生じることである
が、広いpH範囲にわたる効力が欠如していること、洗剤
製品に変性剤が使用されること等の別の要因も工業プロ
セスにおけるプロテアーゼの使用に対する障害となって
いる。公知のBacillus由来のズブチリシンは洗剤酵素と
してのすべての用途、特により広いpH及び温度範囲にお
けるより大きい保存安定性及び活性を要する用途には理
想的でない。従って、温度、pH、変性剤等に対して極め
て安定なことを特徴とするクラスのプロテアーゼが必要
とされている。

また、洗剤と適合性であり、液体洗剤製品中で商業的
に実用化できる程度の十分な保存寿命をもつプロテアー
ゼも必要とされている。Tritirachium album（Ebelin
g、W.等、1971、Cerman Offenbach、1965、281）、Malb
ranchea pulchella（Ong、P.S.等、Can.J.Microbiol.2
2、165）、Acremonium kiliense、Fusarium及びGibber
ella種（Isono、M.等、1972、米国特許第3652399号）か
ら得られたプロテアーゼのごとき熱安定性菌類セリンプ
ロテアーゼは洗剤中で有効に使用されている。プロテイ
ナーゼＫ（EC3,4,21,14）はTritirachium album（Ebel
ing、W.等、1974、Eur.J.Biochem.47、91〜97）から単
離され、複数の研究グループ（Kraus、E.等、1976、Hop
pe Seyler's Z.Physiol.Chem.357、937〜947、前出、35
7、233〜237及びMorihara、K.等、1975、Agr.Biol.Che
m.39、1489〜1492）によって広く研究された。プロテイ
ナーゼＫの三次元構造はズブチリシンと同様であり（Pa
ehler、A.等、1983、EMBO J.3、1311〜1314）、プロテ
イナーゼＫのアミノ酸配列とズブチリシンのアミノ酸配
列とは約35％の相同性をもつ（Jany、Ｋ−D.等、FEBS L
etters、199、139〜144）。プロテイナーゼＫの洗剤適
合性は、高濃度の洗剤存在下に活性を維持することによ
って示唆される（Hilz、H.等、1975、Eur.J.、Bioche
m.、56、103〜108）。

タンパク分解酵素は一般に所定の温度及びpH範囲内に
限りペプチド結合の開裂を触媒する。更に、最適条件下
においても、タンパク分解酵素はポリペプチド鎖が天然
コンホーメーションを維持するときに限り活性を維持す
る。酵素が極端なpH及び温度に暴露されたりまたは界面
活性剤及び金属キレート化剤のごときある種の洗剤添加
剤に接触すると、しばしば天然構造の変性が生じる。金
属キレート化剤は特に、天然構造を安定化するためにCa
²⁺のごとき金属イオンを必要とする酵素例えば細菌ズブ
チリシンに影響を与える。プロテアーゼの場合、酵素の
天然コンホーメーションの変性は自己消化を促進し、従
って酵素が不可逆的に失活する。多くの市販洗濯用洗剤
はアルカリ性pHをもつので、かかる洗剤中で使用される
酵素は、pH範囲7.5〜13及び温度範囲20〜65℃で活性及
び安定であるのが好ましい。更に、かかる酵素の活性
は、カルシウム及びマグネシウムイオンの影響を比較的
受けないのが好ましくまた界面活性剤及び金属イオン封
鎖剤ビルダート適合性であるのが好ましい。ズブチリシ
ン属の細菌セリンプロテアーゼはこれらの要件をある程
度充足する。しかしながら、液体洗剤製品中での安定性
はよくない。

発明の概要本発明は、洗剤製品中における安定性が改良されたこ
とを特徴とする新規なセリンプロテアーゼに係る。本発
明は特に、菌類Tritirachium album Limber（ATCC2256
3）株から得られた新規なセリンプロテアーゼの単離、
精製及び特性決定を開示する。本発明のセリンプロテア
ーゼは、優れた洗剤用酵素であり、特に高温の水溶液中
で高度な熱安定性をもちこのため商業用液体洗剤製品の
添加剤として適していることが知見された。本発明は更
に、かかるプロテアーゼをコードする遺伝子の単離及び
特性決定に係る。本発明はまた、洗剤、クリーナーまた
はしみぬきクリーナーにおける本発明のセリンプロテア
ーゼの使用、及び、セリンプロテアーゼを含有する組成
物に係る。

本発明は更に、本文中で開示されるセリンプロテアー
ゼのゲノムまたはcDNAクローン中の相補的DNA配列とハ
イブリダイスするオリゴヌクレオチドプローブの使用に
係る。最後に本発明は、T.album Limber（ATCC22563）
株を含む培地から単離されたセリンプロテアーゼを宿主
原核細胞または真核細胞中で確実に発現させるべく有用
なDNA配列、及び、かかるプロテアーゼの単離方法に係
る。

本発明はまた、Tritirachium album Limber株ATCC225
63の培養物から単離されたセリンプロテアーゼの構造的
コンホーメーション（即ちアミノ酸残基の連続配列）を
もち、原核細胞または真核細胞による外来DNA配列の発
現産物であることを特徴とする精製単離されたセリンプ
ロテアーゼに係る。

また、本発明は、Tritirachium album Limber株ATCC2
2563の培養物から単離されたセリンプロテアーゼの構造
的コンホーメーションをもつセリンプロテアーゼの産生
方法を提供する。本発明方法は、所望のセリンプロテア
ーゼを宿主原核細胞または真核細胞中で確実に発現させ
るべく有用なDNA配列を含むDNAベクターで形質転換また
はトランスフェクトされた宿主原核細胞または真核細胞
を適当な栄養条件下に増殖させ、前記ベクター中のDNA
配列を発現産物である所望のセリンプロテアーゼを単離
する段階を含む。

本発明はまた、Tritirachium album Limber株ATCC225
63の培養培地から単離したセリンプロテアーゼの構造的
コンホーメーションをもつセリンプロテアーゼを宿主原
核細胞または真核細胞中で発現させ得るDNA配列とハイ
ブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブを提供す
る。

図面の簡単な説明第１図は、プロテアーゼTW7のゲノムクローンのヌク
レオチド配列を示す。

第２図はプロテアーゼTW7のcDNAクローンのヌクレオ
チド配列を示す。

第３図はプロテアーゼTW7のアミノ酸配列と相関させ
たコード鎖のヌクレオチド配列を示す。

第４図はプロテアーゼTW7のアミノ酸配列とプロテイ
ナーゼＫ、ズブチリシンnovo、ズブチリシンCarlsber
g、ズブチリシンDY及びテルミターゼ（thermitase）の
アミノ酸配列との比較を示す。

第５図はプロテアーゼTW7のpHプロフィルを示す。

第６図はプロテアーゼTW7の温度プロフィルを示す。

第７図はプロテアーゼTW3のcDNAクローンのヌクレオ
チド配列を示す。

第８図はプロテアーゼTW3のアミノ酸配列と相関させ
たコード鎖のヌクレオチド配列を示す。

第９図はプロテアーゼTW3のアミノ酸配列とプロテイ
ナーゼＫ、ズブチリシンnovo、ズブチリシンCarlsber
g、ズブチリシンDY及びテルミターゼのアミノ酸配列と
の比較を示す。

第10図はプロテアーゼTW3のpHプロフィルを示す。

第11図はプロテアーゼTW3の温度プロフィルを示す。

第12図はpCFM1156TW7の構築に使用される成分を示す
流れ図である。

詳細な説明 T.album Limberはプロテアーゼを低レベル量でしか産
生できない緩慢に増殖する菌類なので、プロテイナーゼ
Ｋまたはその他のズブチリシン様酵素を菌類発酵によっ
て商業規模で量産することは実際には無理である。更
に、菌類T.album Limberの増殖及びプロテアーゼの産生
が緩慢なので、ズブチリシン様酵素の製品化が不経済で
ある。

本発明の１つの目的は、本発明の新規なセリンプロテ
アーゼをコードする遺伝子をT.album Limberから単離
し、かかる遺伝子を適当な微生物中でクローニングし発
現させることである。活性セリン残基の周囲のアミノ酸
残基をコードするDNA配列をもつ遺伝子とハイブリダイ
ズするデオキシリボヌクレオチドオリゴマーを使用して
遺伝子を単離する。この方法を使用してゲノムライブラ
リイから２つ以上の遺伝子を単離した。これは、T.albu
m Limberによって２種以上のセリンプロテアーゼが産生
させることを示唆する。複数のプロテアーゼのアミノ末
端のアミノ酸配列が異なっていることが知見された。新
規なプロテアーゼとして、プロテアーゼTW7及びプロテ
アーゼTW3を単離し特性決定した。

プロテアーゼTW7をコードする遺伝子をゲノムライブ
ラリイから単離した。特に、T.albumのゲノムライブラ
リイからズブチリシン様遺伝子を単離するためには、
（１）pBR322プラスミド中でT.album LimberのゲノンDN
Aからライブラリイを構築し、（２）ズブチリシン様遺
伝子と特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオ
チドプロードでゲノムライブラリイをスクリーニング
し、（３）陽性クローンを制限酵素分析し次に種々の制
限フラグメントとのサザンブロットハイブリダイゼーシ
ョンによって完全遺伝子を保有するクローンを同定し、
（４）完全遺伝子を保有する制限フラグメントをバクテ
リオファージM13中でサブクローニングしてDNA配列を解
析し、（５）DNA部分配列データに基づいてオリゴヌク
レオチドプライマーを設計し遺伝子の２本の鎖の完全DN
A配列を決定する。

ゲノム遺伝子の２本の鎖の配列決定によって、２つの
イントロンの存在が判明した。スプライシング酵素が欠
如した微生物、例えばB.subtilis、E.coli等中でイント
ロン含有遺伝子を発現させるためには、遺伝子を再構築
するか（例えばin vitroスプライシング）またはcDNAラ
イブラリイから遺伝子を得ることが必要である。プロテ
アーゼTW7及びプロテアーゼTW3を夫々コードする遺伝子
をcDNAライブラリイから単離した。T.album LimberのcD
NAライブラリイからズブチリシン様遺伝子を単離するた
めには、（１）T.album Limberから全RNAを単離し、
（２）オリゴヌクレオチドdTセルロースカラムでRNAを
分画化し、ポリアデニル化mRNA分画を単離し、（３）オ
リゴヌクレオチドプローブを使用してノーザンブロット
分析を行なってズブチリシン様mRNAの存在を確認し、
（４）pBR322由来のプラスミド中でcDNAを合成してcDNA
ライブラリイを構築し、（５）ステップ（３）で使用し
た³²P標識オリゴヌクレオチドプローブでcDNAライブラ
リイをスクリーニングし、（６）陽性cDNAクローンを単
離して制限分析し、（７）完全タンパクコード配列を保
有する陽性cDNAクローンに由来の制限フラグメントをバ
クテリオファージM13中でサブクローニングしてDNAを配
列決定し、（８）オリゴヌクレオチドプライマーを使用
して遺伝子の２本の鎖のDNA配列の決定を完了する。

上記手順によって２つのcDNA遺伝子を同定し、そのア
ミノ酸配列をDNA配列から推定した結果、それらの産物
がズブチリシン様酵素であることが判明した。遺伝子産
物の１つは第３図に示すアミノ酸配列をもち、これをプ
ロテアーゼTW7と命名した。プロテアーゼTW7は、T.albu
m Limberに由来のプロテイナーゼＫに対して約53％のア
ミノ酸配列相同を示した。プロテアーゼTW7の推定アミ
ノ酸配列は、プロテイナーゼＫと違ってこのプロテアー
ゼが負の実効電荷をもつことを示し、従って、DEAEセフ
ァロースまたはDEAE−セルロースカラムクロマトグラフ
ィーによって他のプロテアーゼから分離できる。第２の
推定遺伝子産物をプロテアーゼTW3と命名した。このプ
ロテアーゼのアミノ酸配列とT.album Limber由来のプロ
テイナーゼＫとのアミノ酸配列は約90％の相同を示し
た。プロテアーゼTW3の推定アミノ酸配列は酵素が正の
実効電荷をもつことを示し、従ってCM−セルロースクロ
マトグラフィーによって他のプロテアーゼから分離でき
る。

本発明のセリンプロテアーゼは、T.album Limber株
（CBS348.55）ATCC寄託番号No.22563の培養ブイヨンか
ら以下の手順で単離された。

窒素源としてタンパクだけを含む培地、例えばスキム
ミルク、子ウシ血清アルブミンまたは大豆粉中で特定菌
類T.album株（ATCC22563）を増殖させた。アゾカゼイン
を基質として使用し培養培地のタンパク分解活性を試験
した。タンパク分解活性が平坦域に到達するかまたは下
降し始めると、遠心によって培養ブイヨンを菌類の菌糸
体から分離した。上清中のタンパクを硫酸アンモニウム
で沈降させた。沈降物をpH6.0の20mMのリン酸ナトリウ
ムバッファに溶解し、溶液を同じバッファに透析した。
溶液をCM−52（Whatman）カラムに通してプロテイナー
ゼＫ様酵素を捕獲し、次にDE−52（Whatman）カラムに
通した。pH6.0の20mMのリン酸ナトリウム中の100mMのNa
Clを使用しDE−52カラムからプロテアーゼTW7を溶出さ
せた。これを水に透析し凍結乾燥した。プロテアーゼTW
3はCM−52に結合したので、これをpH6.0の20mMのリン酸
バッファ中の200mMのNaClを使用してカラムから溶出さ
せた。

本発明のセリンプロテアーゼの洗剤適合性を測定し
た。第５図及び第10図に示すごとくプロテアーゼTW7及
びTW3は広いpH範囲にわたって活性である。最大活性は
ほぼpH10で生じるが、プロテアーゼTW7はpH範囲９〜13
でかなりの活性をもつ。更にプロテアーゼTW7はpH6.0の
バッファ中で最大活性の45％以上を維持する。第６図に
示すように、プロテアーゼTW7は広い温度範囲にわたっ
て酵素活性を維持する。最大活性は60〜65℃であるが、
プロテアーゼTW7は20℃で初期活性の25％以上を維持す
る。プロテアーゼTW7は種々のpH範囲のバッファ中で52
℃で安定である。pH8及び10.3で１時間インキュベーシ
ョン後、初期活性のほぼ100％が維持されているが、同
様の条件下で市販のズブチリシンは初期活性の30％以下
しか維持していない。pH8.0の0.5％のSDSの存在下で、
プロテアーゼTW7は52℃で１時間インキュベーション後
に100％の活性を維持しているが、市販のズブチリシン
は初期活性の約５〜６％しか維持していない。

第10図に示すごとくプロテアーゼTW3も広いpH範囲に
わたって活性である。例えば、プロテアーゼTW3はpH9で
最大酵素活性をもつが、pH範囲７〜10でもかなりの活性
を維持する。第11図に示すようにプロテアーゼTW3の酵
素活性の温度範囲も広い。最大活性は55〜65℃に存在す
るが、プロテアーゼTW3は25℃でも活性の32％以上を維
持する。このためプロテアーゼTW3は広い洗濯温度範囲
で活性である。更に、プロテアーゼTW3は種々のpH値の
バッファ中で50℃で極めて安定である。pH4.0、８及び1
0.0で時間インキュベーション後にプロテアーゼTW3は初
期活性の50〜90％を維持するが、同様の条件下に市販の
ズブチリシンは最小の活性しか維持していない。

種々の洗濯用洗剤製品において本発明のセリンプロテ
アーゼの安定性を試験した。洗剤製品を65℃で１時間加
熱することによって、内在酵素をすべて測定以前に失活
させた。

本発明の商業用粉末状洗剤組成物は酵素に加えて、一
般に、（ａ）アニオン性、非イオン性または両性または水溶性
石けんから成る少なくとも１種類の界面活性剤と、（ｂ）好ましくは同時に金属イオン封鎖剤の機能を果た
す１種類以上のビルダーと、（ｃ）好ましくは過ホウ酸ナトリウムのごときペルオキ
シ化合物から成る漂白剤と、（ｄ）カルボキシメチルセルロース、光学漂白剤及び香
料のごとき補助剤とを含む。

（ａ）の界面活性剤としては典型的には、アニオン性
界面活性剤（例えば直鎖状アルキルアリールスルホネー
ト）と非イオン性界面活性剤（例えばアルキルフェニル
ポリグリコールエーテル）とを夫々、洗剤組成物の５〜
30重量％及び１〜５重量％の量で使用する。

（ｂ）のビルダーとしては、トリポリリン酸ナトリウ
ム、クエン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム及びゼオラ
イトを使用し、これらのビルダーが通常は洗剤組成物の
10〜70重量％を構成する。

（ｃ）の漂白剤の典型的な使用量は組成物の30重量％
までの量である。

（ｄ）の補助剤には必要に応じて洗濯液のpHを8.0〜1
0.5の範囲に調製するpH調製剤を添加する。

本発明の粒状プロテアーゼ調製物は、洗濯用洗剤組成
物100g当たり少なくとも0.1Anson単位（AU）、好ましく
は0.5〜2.5AUのプロテアーゼ活性を与えるように計算さ
れた量で添加される。必要ならば、無機充填剤、好まし
くは硫酸ナトリウムを補充して全体を100％にする。

液体状洗剤組成物は、酵素スラリー、好ましくは非水
性媒体中の酵素スラリーから調製されてもよい。典型的
には、かかるスラリーは液体状非イオン性界面活性剤例
えばTergitol 15 S 9またはかかる界面活性剤の混合物
中の微細プロテアーゼ濃縮物の懸濁液から成る。通常は
スラリーが更に、微細塩化ナトリウムのごとき１種類以
上の無機充填剤を任意にヒュームドシリカ（Aerosil20
0）のごとき懸濁液安定剤と混合して含有してもよい。T
ergitol及びAerogilは商標である。

本発明のプロテアーゼスラリーは液体状洗剤組成物10
0g当たり少なくとも0.1AU好ましくは0.5〜2.5AUのプロ
テアーゼ活性を与えるように計算された量で添加され
る。

洗剤組成物は常法で、例えば成分を互いに混合するこ
とによって調製されてもよい。または、プレミックスを
調製し、これを残りの成分と混合してもよい。

以下の実施例より本発明が更に十分に理解されよう。
但し、本発明がこれらの特定実施例に限定されないこと
を理解されたい。

前記のごとく安定性及び活性に優れているため本発明
のタンパク分解酵素はタンパク分解酵素の使用が一般化
した総ての分野で使用できる。特に、洗剤、クレンザ
ー、しみぬき剤、脱色剤（depilatory in tanning）と
して使用でき、また食品産業でタンパク加水分解物の製
造に使用でき、血清学において不完全抗体の検出に使用
できる。本発明酵素は固体または溶解形態で優れた安定
性をもち、他の酵素製剤と違って水溶液中で酵素を安定
させるための生理学的に許容できる量のカルシウムイオ
ンが不要なので食品産業及び血清学において特に有利に
使用できる。

実施例１ Tritirachium album Limberからのセリンプロテアーゼ
の産生 American Type Culture Collection、912301Parklawn
Dr.、Rockville、MD.から菌類Tritirachium album Lim
ber（CBS348.55、ATCC22563）を入手した。菌類はMonil
iaceae属（Limber、1940、Mycoligia、32、23〜30）に
所属する。

菌類の典型的な特徴は、ヒアリン菌糸体（hyaline my
celium）、分岐し難いヒアリン分生子（hyaline conidi
a）、純白の緻密な菌糸体マット（mycelliar mat）を含
み低いドーム即ち半球を形成することである。Centralb
ureau voor Schimmelcultures（Oosterstraat1、Baar
n、P.O.Box273、3740Ag Baarn、Netherland、ref.MAAs/
tvs/7141985年10月４日）に従って、菌株をまず死んだ
皮膚から単離した。この菌株はプロテイナーゼＫの単離
に使用した菌株（CBS747.69）とは異なる。３％のモル
ト抽出物と0.3％のカゼインペプトンと２％のバクトア
ガールとを含むモルト−ペプトン−寒天プレートでTrit
irachium albumを増殖させた。15〜20mlの無菌蒸留水に
胞子を収集し、室温で30分以上維持した後に液体培地に
接種した。

プロテアーゼ産生に用いる液体培地の組成は、２％ス
キムミルムと0.17％の酵母窒素ベース（Cat.No.0335〜1
5、Difco Laboratories、Detroit、MIから入手）か、ま
たは１％の子ウシ血清アルブミン（BSA）と１％のブド
ウ糖と0.17％の酵母窒素ベースである。BSA含有培地を
0.45μフィルターに通して殺菌し、スキムミルク含有培
地を30分間オートクレーブ処理した。500mlの各培地に
胞子懸濁液を接種し、得られた混合物を震盪した。４〜
５滴の消泡剤を使用して震盪中の発泡を抑制した。Ｎ−
スクシニル−アラニル−アラニル−プロリル−フェニル
アラニンニトロアニリド（Delmar等、Anal Biochem.9
9、316）またはアゾカゼイン（Charney、J.等、1947、
J.Biol.Chem.177、501）を基質として使用し菌糸体外
（extramycelial）プロテアーゼの産生をモニタした。
プロテアーゼの産生が培地依存性であることが判明し
た。スキムミルク培地では培養８〜９日以内に最大量の
プロテアーゼが産生したが、BSA培地では培養14日〜15
日後まで最大量のプロテアーゼ産生が生じなかった。双
方の培地で最大産生レベルに到達後にプロテアーゼ活性
が減少した。

実施例２ズブチリシン様遺伝子の検出プローブの設計及び合成種々のズブチリシン様酵素はその活性部位のセリン残
基の周囲で高度な配列相同を共有する。221位のセリン
はセリンプロテアーゼ中の反応性セリンとして従来から
同定されている。更に、アミノ酸配列 GLY−THR−SER−MET−ALA に基づいてセリンプロテアーゼがズブチリシン属である
と判断した。いくつかのズブチリシン様酵素のアミノ酸
配列のアラインメントによって相同が以下のごときより
長い配列に及ぶことが判明した。

（Stahl、M.L.等、1984、前出;Wells、J.A.等、1983、
前出;Vasantha、N.等、1984、前出:Svendsen、Ｉ等、19
86、FEBS Letters196、228〜232;Koide、Y.等、1986、
J.Bacteriol.167、110〜116;Kaneda、M.等、1984;J.Bio
chem.95、825〜825;Jany、K.D等、1985、Biol.Chem.Hop
pe Seyler366、485〜492）。また、ズブチリシンのアミ
ノ酸をコードするDNA配列の解析によって、高度な保存
性が判明した。これらの観察に基づいて、同様のコード
配列を含む以下のデオキシオリゴヌクレオチド（41me
r）を遺伝子プローブとして設計した。

Beaucage等（1981、Tetrahedron Letters22、1859〜1
862）のホスホトリエステル法を使用してプローブを合
成した。

このオリゴヌクレオチドプローブは不適正の数に依存
して50〜78℃の温度範囲でセリンプロテアーゼのゲノム
クローンまたはcDNAクローン中の相補的DNA配列とハイ
ブリダイズする。従って、このプローブを使用するとき
は、適正ストリンジェンシイを与える複数の温度及び塩
濃度でハイブリダイゼーション及び洗浄を行なう必要が
ある。ゲノム及びcDNAライブラリイ中のズブチリシン様
酵素をコードする遺伝子及びズブチリシン様酵素をコー
ドするmRNAをプローブするために41merオリゴヌクレオ
チドを使用し得る。

実施例３プロテアーゼTW7のゲノムライブラリイの構築及び遺伝
子の単離菌類増殖の９〜15日後に前記のごとく菌糸体をmiracl
othに収集した。菌糸体を計量し、ドライアイス及びイ
ソプロパノールで急激に凍結した。10gの凍結菌糸体に1
0gのオートクレーブ処理したアルミナと20mlの溶菌バッ
ファ（４％SDS、20mMのTris−HCl、pH7.5、10mMのEDT
A、0.15MのNaCl）を添加した。得られた混合物を乳棒を
使用し無菌乳鉢中で５分間粉砕した。追加量の20mlのバ
ッファと40mlのフェノール−クロロホルム−イソアミル
アルコール（25:24:1）を粉砕化合物に添加し、溶菌液
を室温で20〜30分間震盪し、10分間遠心した。水相をフ
ェノール及びクロロホルムで抽出した。リボヌクレアー
ゼＡ及びプロテイナーゼＫを溶菌液に添加しDNA調製物
からRNA及びタンパクを夫々除去した。溶菌液にエタノ
ールを添加し、DNAをスプールし、TE（20mMのTris−HC
l、pH8.0、1mMのEDTA）に懸濁させ、４℃で保存した。

T.albumから単離したゲノムDNAを制限酵素EcoR I及び
BamH Iを使用して完全消化し、プラスミドベクターpBR3
22中のライブラリイを構築した。ベクターpBR322も同じ
酵素で消化し、アルカリホスファターゼで処理した。T.
album DNAフラグメントとpBR322ベクターとを結合し、M
andel等、1970、J.Mol.Biol.53、159〜162の手順でコン
ピテントHB101細胞を形質転換した。実施例２の41merオ
リゴヌクレオチドプローブを使用しアンピシリン耐性コ
ロニーにおいてズブチリシン様遺伝子の存在をプローブ
した。Grunstein等、1975、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、7
2、3960〜3965の手順を用いニトロセルロースの代わり
に遺伝子スクリーン膜（NEF−972、New England Nuclea
r）を使用してコロニーのリフトとハイブリダイゼーシ
ョンとを行なった。フィルターをin situでDNA変性処理
し、中和し、乾燥し、真空下80℃で熱処理した。200μ
ｇのtRNA/mlを含む５×Denhardt溶液中で55℃で３〜４
時間プレハイブリダイゼーションを行なった。５×SS
C、１％SDS、１×Denhardt溶液及び200μg tRNA/ml中で
55℃で20時間のハイブリダイゼーションを行なった。フ
ィルターをストリンジェント条件下に55℃の２×SSCで
バックグラウンド放射能が無視できる値になるまで洗浄
した。また1ml当たり50μｇのアンピシリンを含むＬ寒
天プレートに推定陽性クローンを再度接種し上記スクリ
ーニングステップを反復することによって41merオリゴ
ヌクレオチドプローブによる推定陽性コロニーの第２ラ
ウンドのスクリーニングを実施した、第２ラウンドのス
クリーニング後に陽性クローンが１つだけ得られた。陽
性コロニーを1ml当たり50μｇのアンピシリンを含むLur
iaブイヨンで培養した。１晩培養後、Birnboim、Method
s in Enzymol. 100、243〜154、（1983）の手順でプロテ
アーゼTW7の遺伝子を含むプラスミドを単離した。サザ
ンブロット及び広範囲の制限地図作成のために、塩化セ
シウム、臭化エチジウム勾配と超遠心とを使用してプラ
スミドを精製した。T.album DNAの2.8kbのフラグメント
がプロテアーゼTW7の遺伝子を含むことが判明した。

種々の酵素によって生成されたこのプラスミドの制限
フラグメントをアガロースゲルで電気泳動によって分解
し、遺伝子スクリーンplus（登録商標）膜に移し、実施
例２の41merオリゴヌクレオチドプローブでプローブし
てプロテアーゼTW7の完全遺伝子を含むフラグメントを
同定した。この結果、1056ヌクレオチドを含むEcoR I−
Cla Iフラグメントが遺伝子を含むと判定した。このフ
ラグメントを次にバクテリオファージM13mp18及びM13mp
19中でサブクローニングし、ユニバーサルプライマー
（Messings、J.、1983;Methods in ENzymol.101C、20〜
75）を使用して単鎖DNAを配列決定した。Sanger、F.
等、（1977）Proc.National Acad.Sci.USA 74、5463に記
載のジデオキシチェーンターミネーション手順でDNAを
配列決定した。いくつかの部分的DNA配列が得られた後
に、追加のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して遺
伝子の２つの鎖の配列決定を完了した。このように特性
決定された遺伝子のヌクレオチド配列を第１図に示す。
遺伝子は1056のヌクレオチドを含み、５′末端の制限酵
素EcoR I部位と３′末端のCla Iとによって規定され
る。フラグメントの制限地図作成によって制限酵素Hind
III、Kpn I及びBgl Iの非反復部位の存在が判明する。
この遺伝子によってコードされる推定プロテアーゼをプ
ロテアーゼTW7と命名した。

プロテアーゼTW7の単離遺伝子は、成熟タンパクの完
全アミノ酸配列と推定「プロ」領域の12個のアミノ酸と
をコードした。成熟プロテアーゼTW7をコードする遺伝
子は２つのイントロンによって中断されている。これら
のイントロンは54及び84ヌクレオチドの長さをもつ、ゲ
ノムDNAのヌクレオチド配列とプロテアーゼTW7のcDNAの
ヌクレオチド配列とを比較することによってイントロン
の正確な位置を決定した。２つのイントロンはヌクレオ
チド配列にGTで開始し配列AGで終結する。終結コドンと
してTAGが使用され、このコドンの後に８つのコドンを
隔てて別のTAGが存在する。mRNAの推定プロセシングは
成熟プロテアーゼTW7のセリン（可能なプレ−プロ配列
の最終アミノ酸）をコードする配列とアラニン（最初の
アミンノ酸）をコードする配列との間で生じる。

実施例４プロテアーゼTW7のcDNAライブラリイの構築及びcDNA遺
伝子の単離成熟プロテアーゼTW7をコードする完全遺伝子がゲノ
ムライブラリイから得られたが、この遺伝子をB.subtil
is及びE.coliのごとき微生物中のタンパク分解酵素の発
現に使用することはできない。その理由は新生RNAから
イントロン配列を除去して機能メッセンジャーRNAを形
成させる酵素がこれらの微生物に欠如しているからであ
る。プロテアーゼTW7の産生に適した微生物中で発現し
得る相補的DNAを得るために、T.album Limber菌類から
機能メッセンジャーRNAを単離した。

T.album Limberを実施例１のスキムミルク培地で９日
間増殖させ、miraclothの１つの層に菌糸体を収集し
た。約20gの新しく採取した菌糸体に100gの無菌アルミ
ナ、45mlの溶菌バッファ（４％SDS、1mMのEDTA、100mM
の酢酸Na、pH5.0）及び20mlのフェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール（25:24:1）を添加し、菌糸
体を乳棒を用い乳鉢中で20分間粉砕した。50mlのバッフ
ァと50mlのフェノール：クロロホルム：イソアミルアル
コールとを添加し、溶菌液を室温で30分間震盪し、5000
×ｇで15分間遠心した。フェノール：クロロホルム抽出
後、0.1倍容の3Mの酢酸アンモニウムと2.5倍容のエタノ
ールとを添加し、−20℃に１晩維持して核酸を沈降させ
た。Maniatis等（1982、前出）によって記載された手順
でオリゴdT−カラムを使用してポリアデニル化RNA種を
単離した。標本の操作中にRNAが破壊することを阻止す
るために、全部のバッファを0.1％ジエチルピロカーボ
ネートで処理し、次に60分間オートクレーブ処理した。
単離したmRNA集団に0.1倍容の3M酢酸アンモニウムを添
加しその後に2.5倍容のエタノールで沈降させた。

Maniatis等（1982）によって記載されたグリオキサル
−DMSO手順でmRNA集団のノーザンブロット分析を行なっ
た。mRNA種を1.1％アガロースゲルで分離し、gene scre
en plus membrane（NEF−976、New England Nuclear）
にブロットし、プロテアーゼTW7のアミノ末端を示しヌ
クレオチド配列５′TGGGGCGTCTTCCTGGGTGGC3′ をもつキナーゼ化したオリゴマーとハイブリダイズさせ
タ。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼー
ションを55℃で行ない、次に55℃及び60℃でストリンジ
ェント洗浄を行なう。フィルターをＸ線フィルムに露光
し、プロテアーゼTW7をコードする配列を含む約2000ヌ
クレオチド塩基の長さをもつ単鎖mRNA種をmRNA集団中で
同定した。

Okayama等、（1982）、Mol.Cell Biol.、２、161〜17
0に記載の手順で二重鎖cDNAをポリＡ＋mRNA鋳型で合成
した。コンピテント大腸菌HB101細胞をcDNAインサート
を含むプラスミドベクター（Hanahan、1983、J.Mol.Bio
l.166、557〜580）で形質転換した。ニトロセルロース
フィルター上の形質転換コロニーを第２組のニトロセル
ロースフィルターにレプリカプレートした。マスターフ
ィルター及びレプリカフィルターを1ml当たり50μｇの
アンピシリンを含むＬ寒天プレートで37℃でインキュベ
ートし、コロニーを完全に増殖させた（一般にマスター
プレートで２〜３時間、レプリカで５〜６時間）。マス
ターフィルターは４℃で保存し、レプリカフィルター
は、プラスミド増幅のために1ml当たり100μｇのクロラ
ムフニコールを含むＬ寒天プレートで１晩インキュベー
トした。レプリカフィルターをDNA変性、再結合、熱処
理、プレハイブリダイゼーションで順次処理した後に、
ノーザンブロットによるmRNA検出に使用されるオリゴマ
ープローブと共にハイブリダイゼーション処理した。第
２シリーズのスクリーニングによって、単離した単一の
陽性コロニーを同定した後に、Birnboim（1983、前出）
の手順でプラスミドDNAを調製した。実施例３のゲノム
クローンの場合とほぼ同様にして陽性クローンのヌクレ
オチド配列を決定した。

実施例５プロテアーゼTW7のcDNA遺伝子の特性決定 cDNAクローンのヌクレオチド配列を単鎖及び二重鎖DN
Aから決定した。第２図はプロテアーゼTW7のcDNAのヌク
レオチド配列を示す。配列は長さ1016塩基でありポリＡ
テイルで終結している。クローンの制限地図は、成熟分
泌形態の遺伝子産物をコードする配列の５′末端に近位
のEcoR I部位を存在を示す。

プロテアーゼTW7遺伝子のcDNAクローンのヌクレオチ
ド配列は、cDNAクローンにイントロンが欠失しているこ
とを除けばゲノムクローンと同じである。

実施例６プロテアーゼTW3のcDNAライブラリイの構築及びcDNA遺
伝子の単離プロテアーゼTW3の量産すべく産業用微生物中で任意
に発現し得る相補的DNA遺伝子を得るためにT.album菌類
から機能メッセンジャーRNAを単離した。

T.albumをBSA培地で15日間増殖させ、菌糸体をmiracl
othの１つの層に収集した。約20gの新しく採取した菌糸
体に100gの無菌アルミナと45mlの溶菌バッファ（４％SD
S、1mMのEDTA、100mMの酢酸Na、pH5.0）と20mlのフェノ
ール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:
1）とを添加し、菌糸体を無菌乳鉢中で乳棒で20分間粉
砕した。50mlのバッファと50mlのフェノール：クロロホ
ルム：イソアミルアルコールとを添加し、溶菌液を室温
で30分間震盪し5000×ｇで15分間遠心した。フェノー
ル：クロロホルムで抽出後、0.1倍容の3Mの酢酸アンモ
ニウムと2.5倍容のエタノールとを添加し、核酸を−20
℃で１晩沈降させた。

Maniatis等（1982、前出）に記載の手順でオリゴdT−
セルロースを使用しポリアデニル化RNA種を単離した。
単離mRNA集団に0.1倍容の3M酢酸アンモニウムを添加し
た後に2.5倍容のエタノールで沈降させた。

Maniatis等（1982）に記載のグリオキサル−DMSO手順
でmRNA集団をノーザンブロット分析した。mRNA種を1.1
％アガロースゲルで分離し、gene screen plus membran
e（登録商標）（NEN−976、New England Nuclear）にブ
ロットし、実施例２で調製したキナーゼ化オリゴマープ
ローブとハイブリダイズした。55℃でプレハイブリダイ
ゼーション及びハイブリダイゼーションを行ない、55℃
及び60℃でストリンジェント洗浄した。フィルターをＸ
線フィルムに露光し、mRNA集団中でプロテアーゼTW3の
コード配列を含む長さ約2000ヌクレオチド塩基の単一mR
NAを同定した。

これらの実施例ではRNAの分解を阻止するために、使
用した全部のバッファを0.1％ジエチルピロカーボネー
トで処理し60分間オートクレーブ処理した。Okayama等
（1982）Mol.Cell Biol. ２、161〜170の方法でポリＡ＋
mRNA鋳型に二重鎖cDNAを合成した。コンピテント大腸菌
HB101細胞をcDNAインサートを含むプラスミドベクター
で形質転換した（Hanahan、1983、J.Mol.Biol.166、557
〜580）。ニトロセルロースフィルター上の形質転換コ
ロニーを第２組のニトロセルロースフィルターにレプリ
カプレートした。マスターフィルター及びレプリカフィ
ルターを1ml当たり50μｇのアンピシリンを含むＬ寒天
プレートで37℃でコロニーが完全に増殖するまでインキ
ュベートした（一般にマスタープレートで２〜３時間、
レプリカプレートで５〜６時間）。マスターフィルター
を４℃で保存し、レプリカフィルターはプラスミド増殖
のために1ml当たり100μｇのクロラムフェニコールを含
むＬ寒天プレートで１晩インキュベートした。

レプリカフィルターに対しDNAの変性、再結合、熱処
理、プレハイブリダイゼーションの諸処理を行なった後
にノーザンブロットのmRNA検出に使用されるオリゴマー
プローブとのハイブリダイゼーションを行なった。第２
シリーズのスクリーニングによって単離された単一陽性
コロニーを同定した後に、プラスミドDNAを調製した（B
irnboim、1983、Methods in Enzymol.101C、20〜75）。
陽性クローンのヌクレオチド配列を以下の手順で決定し
た。クローンを完全制限分析し、種々のフラグメントを
M13mp18及びmp19にサブクローニングして単鎖DNA配列を
決定する。二重鎖配列決定は配列特異性プライマーを使
用して行なった。ジデオキシチェーンターミネーション
法（Sanger、F.等、1977、Proc.Natl.Acad.Science US
A、74:5463）を使用してDNA配列を決定した。

実施例７プロテアーゼTW3のcDNA遺伝子の特性決定プロテアーゼTW3の完全長さのcDNAクローンが得られ
た。クローンは成熟プロテアーゼ及びプロテアーゼの推
定プレプロ領域をコードする。成熟タンパクをコードす
る配列に先行する読取枠に４つのATCコドンが存在す
る。第1ATGに続いて疎水性アミノ酸に富む領域が存在す
るのでこの第1ATGコドンは出発メチオニンをコードする
と考えるのが最も妥当であろう（Von Heijene、G.、198
6、Nucleic Acids Res.14、4683〜4690）。推定プロ領
域は約100個のアミノ酸から成り、これはズブチリシン
と極めて類似した状況である（Stahl等、1984、前
出）。

ヌクレオチド配列から決定された成熟タンパクのアミ
ノ酸配列は、プロテイナーゼＫのアミノ酸配列と高い割
合の相同を示す。これらの２つのプロテアーゼの間には
約90％の相同がある。アミノ酸がズブチリシンに類似し
ているがプロテイナーゼＫには類似していないいくつか
の位置がある。例えばすべてのズブチリシン及びプロテ
アーゼTW3では143位にメチオニン残基が存在するがプロ
テイナーゼＫではこの位置にロイシン残基が存在する。
同様にプロテアーゼTW3及びズブチリシンで219位にアラ
ニン残基が存在するがプロテイナーゼＫでは存在しな
い。更に、アミノ酸フラグメントSer−Thr−がプロテイ
ナーゼＫには存在しないが第９図のその他の酵素では22
6位及び227位にこのフラグメントが存在する。

実施例８タンパク分解活性の定量以下の実施例ではアゾアルブミンを基質として使用し
セリンプロテアーゼのタンパク分解活性を定量した。酵
素溶液または酵素バッファ（対照）のアリコート（20μ
）を、0.05MのTris−HCl、pH8.2（特に注釈がない場
合）中の1mlの0.6％アゾアルブミンと混合し、室温で加
水分解反応を行なわせた。20分後に10％のトリクロロ酢
酸（400μ）を添加して反応を終了させた。遠心によ
って加水分解液を沈降タンパクから分離し、410nmにお
ける光学密度を測定し対照の測定値と比較した。

また、基質としてアゾカゼインを使用しプロテアーゼ
活性を検定した。最終容量500μに20μのアゾカゼ
イン（0.2MのTris−HCl、pH7.5、1mMのCaCl₂中の５％溶
液）と20μの酵素（１〜10μｇ）と460μの50mMのT
ris−HCl、pH7.5とを添加した。標本を37℃で30分間イ
ンキュベートした。インキュベーション後、500μの1
0％TCAを標本に添加し標本を氷上で15分間インキュベー
トした。２分間遠心後、800μの上清を200μの1.8N
のNaOHをいれた試験管に導入した。420nmの標本の光学
密度を測定し対照と比較した。

実施例９ Tritirachium album Limberの培養ブイヨンからのプロ
テアーゼTW7の単離及び精製 T.album培養物の細胞外培地からプロテアーゼTW7を分
離して精製した。実施例１に記載のBSA−ブドウ糖培地
中で15日間発酵後に得られたT.album培養ブイヨンの0.5
のアリコートを10分間遠心した。透明上清中のタンパ
クを硫酸アンモニウム（180g）で沈降させ、遠心によっ
て収集した。沈降物を0.2Mのリン酸ナトリウム、pH6.0
（50ml）に懸濁させ、不溶物を遠心によって除去した。
上清中のタンパクをアセトン（2.5倍容）によって再度
沈降させた。沈降物を遠心によって収集し焼結ガラス漏
斗に収集した。次に沈降物を水（40ml）に溶解し、得ら
れた溶液を４℃で0.02Mのリン酸ナトリウム、pH6.0に透
析した。透析した溶液を遠心によって清澄化し、次に毎
分2mlの速度でカルボキシメチルセルロース（CM−52、W
hatman）カラム（2.5×10cm）に通し、次にカラムを0.0
2Mのリン酸ナトリウム、pH6.0（30ml）で洗浄した。通
過した溶液と洗浄溶液との双方を合わせて2.5倍容のア
セトンを添加してタンパクを沈降させた。沈降物を遠心
によって分離し、過し、真空下に乾燥した。アセトン
粉末（185mg）を0.02Mの酢酸ナトリウム、pH5.0（2mg）
に溶解し、Sephadex G−75モレキュラーシーブカラム
（2.5×90cm）に充填した。毎時6mlの流速で0.02Mの酢
酸ナトリウムpH5.0を用いモレキュラーシーブカラムで
分画化した。2mlの分画を収集し、275nmのu.v.吸光度を
モニタした。カラムから溶出した３つの主要ピークのう
ちで１つのピークだけが、色素産生タンパク−基質アゾ
アルブミンを加水分解するタンパク分解活性を示した。
このピークの酵素（102〜110mlの間）をアセトン（2.5
倍容）によって沈降させ、遠心によって収集した。沈降
物を2mMの酢酸カルシウム（20ml）に溶解し、溶液を４
℃で水に透析し、凍結乾燥した。還元標本のSDS−PAGE
はプロテアーゼTW7を見掛け分子量35,000ダルトンをも
つ１つの主要バンド（＞95％）として示した。

実施例10 プロテアーゼTW7のアミノ末端分析実施例９に記載のごとく培養上清からプロテアーゼTW
7を精製した。精製タンパクをPMSF（フェニルメチルス
ルフォニルフルオリド）で失活させ、更にHPLCで精製し
た。1mMのPMSFを含む50％のトリフルオロ酢酸（TFA）中
でタンパクを液体に戻しアミノ末端を決定した。全自動
化気相エドマン分解法（automated gas phase Edman de
gradation）を行なってアミノ末端を分析し、アミノ末
端がAla−Thr−Gln−Glu−Asp−Ala−Pro−Trp−Leu−A
la−Arg−Ile−Ser−Serであることを決定した。

実施例11 プロテアーゼTW7のpHプロフィル基質としてアゾアルブミンを使用し25℃のプロテアー
ゼTW7のpH−プロフィルを作成した。pH範囲5.0〜12.75
をカバーするリン酸ナトリウム−ホウ酸ナトリウムバッ
ファ中に0.6％のアゾアルブミンを含む基質溶液を調製
した。アゾアルブミン溶液に水1ml当たり1mgのプロテア
ーゼTW7を含む水溶液10μ及び水10μ（対照）を添
加し、実施例８と同様に各溶液のタンパク分解活性を測
定した。プロテアーゼTW7のpH−プロフィルを第５図に
示す。第５図はpHに対する最大タンパク分解活性のパー
センテージをプロットしたものである。プロテアーゼTW
7の最適pH範囲は９〜11である。

実施例12 プロテアーゼTW7の温度プロフィル pH8.5の0.05リン酸ナトリウム中のプロテアーゼTW7の
温度プロフィルを温度範囲20℃〜70℃にわたるタンパク
分解活性の測定によって作成した。pH8.5の0.05Mのリン
酸ナトリウム中の0.6％のアゾアルブミンのアリコール
（1ml）を種々の温度でインキュベートし、酵素溶液
（同じバッファ1mlあたり0.5mgプロテアーゼTW7を含む
溶液20μ）、または20μのバッファ（対照）の添加
後、10分間反応させ、次に10％のトリクロロ酢酸（400
μ）を添加して反応を終了させた。プロテアーゼTW7
の温度プロフィルを第６図に示す。第６図は温度に対す
る最大酵素活性のパーセンテージをプロットたものであ
る。第６図に示すようにプロテアーゼTW7の好適温度は5
7℃〜62℃である。

実施例13 洗剤存在下のプロテアーゼ安定性の測定洗剤溶液及び非洗剤溶液中のプロテアーゼTW7の安定
性をズブチリシンCarlsbergの安定性及びプロテイナー
ゼＫの安定性と比較した。適当なバッファ中の評価すべ
き酵素の溶液を、種々の酵素溶液の初期タンパク分解活
性が実施例８に記載のアゾアルブミンアッセイによって
測定された値と同じになるように調製した。溶液を52℃
でインキュベートし、アリコートを採取し、残留酵素活
性を測定した。得られた結果を表Ｉ及びIIに示す。残留
酵素活性を初期酵素活性に対するパーセントで示す。

実施例14 洗剤組成物中のプロテアーゼTW7の安定性３種類の酵素含有市販洗濯用洗剤Era Plus（登録商
標）（Procter ＆ Gamble）、Tide（登録商標）（Proct
er ＆ Gamble）、Dynamo（登録商標）（Colgate−Palmo
live）中でプロテアーゼTW7及びプロテイナーゼＫの安
定性を試験した。濃縮洗剤原液を脱イオン水で10倍に希
釈した。被検プロテアーゼの添加以前に希釈洗剤を65℃
で１時間インキュベートして内在プロテアーゼを失活さ
せた。各洗剤調製物中の被検プロテアーゼの相対活性を
初期洗剤調製物中の酵素活性に等しくなるように調整し
た。

失活した被検プロテアーゼ含有洗剤を活性の内在酵素
含有洗剤と共に52℃でインキュベートした。標本を抜き
取り実施例８の手順で検定することによって種々のイン
キュベーション期間後の残留タンパク分解活性を定量し
た。

プロテアーゼTW7は試験した全部の洗剤調整物中で安
定であった。例えば、失活Era Plusを含有する調整物中
ではプロテアーゼTW7は６時間のインキュベーション後
に100％の酵素活性を維持していた。これに比較して内
在酵素は12％の活性しか維持していなかった。失活Dyna
mo含有調整物中でプロテアーゼTW7は29時間のインキュ
ベーション後に76％の酵素活性を維持していた。

また、組成中に酵素を含有しない洗濯用洗剤Wisk（登
録商標）を含有する調整物中でもプロテアーゼTW7の安
定性を試験した。洗剤原液を脱イオン水で1:10に希釈
し、プロテイナーゼＫまたはプロテアーゼTW7を添加
し、得られた調製物を52℃で種々の期間インキュベート
した。実施例８の手順で残留活性を検定した。表IVに示
すようにプロテアーゼTW7はプロテイナーゼＫよりも安
定であった。3.5時間のインキュベーション後にプロテ
イナーゼＫは初期活性の20.1％しか維持していなかった
がプロテアーゼTW7は初期酵素活性の約90％を維持して
いた。

実施例15 プロテイナーゼTW7の発現発現ベクターpCFM1156に成熟プロテアーゼTW7をコー
ドする遺伝子を挿入して大腸菌中で発現させるためにオ
リゴヌクレオチドアダプターを合成した。アダプターは
以下のをもつ。

大腸菌中で発現するための組換えプラスミドの構築は
以下の手順で行なった。

（１）発現ベクターpCFM1156のATG配列を含むXba I部位
からNde I部位までの部分と成熟プロテアーゼTW7遺伝子
のGCCから出発し最初のNCo I部位までのアミノ末端配列
とを順次に含む二重鎖オリゴヌクレオチドを構築する。
構築を容易にするような付加的EcoR I部位を得るために
５′末端に付加的ヌクレオチドを付加した。

（２）第12図に示すように、プロテアーゼTW7のcDNAを
制限酵素EcoR Iで完全に消化しNco Iで部分的に消化し
て大きいEcoR I−Nco Iフラグメントを得、これにキナ
ーゼ化したEcoR I−Nco Iとアダプターとを結合してア
ダプターの付いたプロテアーゼTW7のcDNA遺伝子を得
た。

（３）再構築したプロテアーゼTW7のcDNAをEcoR I及びC
laで消化しプロテアーゼTW7の遺伝子を得た。これをEco
R I及びAcc Iで消化しておいたM13mp18に挿入した。

（４）プロテアーゼTW7遺伝子を含むM13mp18を制限酵素
Xba I及びHind IIIで消化しプロテアーゼTW7遺伝子を保
護した。

（５）発現ベクターpCFM1156を制限酵素Xba I及びHind
IIIで消化し、M13mp18から得られたプロテアーゼTW7遺
伝子をXba I及びHind IIIフラグメントとして挿入し
た。

このように構築して得られた組換え発現プラスミドは
PLプロモーターとShine Dalgarno配列とATGコドンと該
コドンに後続する成熟プロテアーゼTW7タンパクをコー
ドするヌクレオチド配列とを含んでいた。

コンピテント大腸菌FM11細胞（ln^-、ptr3^-）をこの組
換えプラスミドで形質転換した。

形質転換細胞からプラスミドDNAを単離し、プラスミ
ドDNAをXba IとHind IIIとによって消化して陽性クロー
ンを同定した。陽性クローンの１つを１晩増殖させ1ml
当たり20μｇのカナマイシンを含むLuriaブイヨン培地
に接種した。30℃で600nmの光学密度0.25になるまで細
胞を増殖させた。インキュベーションの温度を42℃にシ
フトして２時間維持しプラスミド保有遺伝子産物を誘発
した。

大腸菌細胞を低速遠心によって収集した。ペレットを
計量し次に10倍容の50mMのTris−HCl、pH7.5に浮遊させ
た。Frenchプレスに３回通して細胞を溶解した。再度遠
心後に得られたペレット分画を5Mの尿素、50mMのTris−
HCl、pH8.0で抽出した。尿素可溶タンパクを種々の方法
で分析した。

タンパクをβメルカプトエタノールで還元しSDSの存
在下に10％のポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
た。組換えプラスミドを含む大腸菌に由来の可溶分画中
に存在するがベクター単独中には存在しない主要バンド
は単一の35,000ダルトンのタンパクであった。該タンパ
クはT.albumから精製されたプロテアーゼTWと共に泳動
した。このタンパクはまたウエスタンブロット分析で菌
類プロテアーゼTW7に対して感作した抗体と特異的に反
応した。このタンパクをポリアクリルアミドゲルから単
離しアミノ末端領域の配列を同定した。この配列は菌類
プロテアーゼW7の配列と整合した。

組換えプロテアーゼTW7は再生（refolding）以前に大
腸菌から単離されると酵素的に不活性である。再賦活す
るために8M尿素、10mMのDTT、25mMのTris−HCl、pH8.5
に1ml当たりタンパク1mgの最終濃度でタンパクを懸濁さ
せ、室温で25mMのTris−HCl、pH8.5で予め平衡したDE52
樹脂に結合した。同じバッファ及び同じバッファに4mM
のグルタチオン（還元）及び0.4mMのグルタチオン（酸
化）を添加した液を順次用いてで樹脂を洗浄して尿素を
除去した。上記試薬、即ち25mMのTris−HCl、pH8.5、4m
Mのグルタチオン（還元）及び0.4mMのグルタチオン（酸
化）の存在下に樹脂を１晩インキュベーション後に、0.
3MのNaclを含む50mMのTris−HClを用いタンパクをカラ
ムから溶出させ、３倍容のアセトンで沈降させた。この
再生タンパクは色素産生基質（実施例１）及びカゼイン
に対してプロテアーゼ活性を有していた。

実施例16 Tritirachium album Limberの培養ブイヨンからのプロ
テアーゼTW3の単離及び精製実施例１に記載のBSA−ブドウ糖培地中で15日間発酵
後に得られたTritirachium album Limber培養のブイヨ
ンの0.5のアリコートを15,000gで10分間遠心した。透
明上清中のタンパクを硫酸アンモニウム（180g）で沈降
させ、遠心によって収集した。沈降物を0.02Mのリン酸
ナトリウム、pH6.0（50ml）に懸濁させ、不溶物を遠心
によって除去後に上清中のタンパクをアセトン（2.5倍
容）によって再度沈降させた。沈降物を遠心によって収
集し、焼結ガラス漏斗に収集した。次に沈降物を水（40
ml）に溶解し、得られた溶液を４℃で0.02Mのリン酸ナ
トリウム、pH6.0に透析した。透析した溶液を遠心によ
って清澄化し、次に毎分2mlの速度でカルボキシメチル
セルロース（CM−52、Whatman）カラム（2.5×10cm）に
通し、次にカラムを0.02Mのリン酸ナトリウム、pH6.0
（30ml）で洗浄した。通過した溶液と洗浄溶液との双方
を合わせ2.5倍容のアセトンを添加してタンパクを沈降
させた。

pH6.0のリン酸ナトリウム中で０〜0.4MのNaClの直線
勾配を用いCM−52カラムからの溶出を完了した。実施例
８の記載と同様にpH8.2における分画のタンパク分解活
性を分光光度計（420nm）によって検定した。酵素活性
を含むピーク分画をプールし、４℃で水に透析し、凍結
乾燥した。２−メルカプトエタノールで処理した標本の
SDS−PAGEによれば、プロテアーゼTW3が見掛け分子量3
1,000ダルトンをもつ１つの主要バンド（クーマシーブ
ルー染色に基づいて＞96％）として検出された。

実施例17 プロテアーゼTW3のアミノ末端分析実施例16に記載のごとく培養上清からプロテアーゼTW
3を精製した。精製タンパクをPMSF（フェニルメチルス
ルフォニルフルオリド）で失活させ、更にHPLCで精製し
た。1mMのPMSFを含む50％のトリフルオロ酢酸（TFA）中
でタンパクを液体に戻しアミノ末端を決定した。全自動
化気相エドマン分解法（automated gas合phase Edman d
egradation）を行なってアミノ末端を分析し、アミノ末
端がAla−Glu−Gln−Arg−Asn−Ala−Pro−Trp−Gly−L
eu−Ala−Arg−Ile−Ser−Ser−Thrであることを決定し
た。

実施例18 プロテアーゼTW3のpHプロフィル基質としてアゾカゼインを使用し25℃のプロテアーゼ
TW3のpH−プロフィルを作成した。pH範囲5.0〜10をカバ
ーするＭバッファ中の基質溶液（0.6％）を調製した。
これらのアゾカゼイン溶液に水1ml当たり1mgのプロテア
ーゼTW3を含む水溶液20μ及び水20μ（対照）を添
加し、実施例８と同様に各溶液のタンパク分解活性を測
定した。プロテアーゼTW3のpH−プロフィルを第10図に
示す。第10図はpHに対する最大活性のパーセンテージを
プロットしたものである。プロテアーゼTW3の最適pHは
９であった。

実施例19 プロテアーゼTW3の温度プロフィル pH8.5の0.05リン酸ナトリウム中のプロテアーゼTW3の
温度プロフィルを温度範囲４℃〜65℃にわたるタンパク
分解活性（アゾカゼインアッセイ）によって作成した。
pH8.5の0.05Mのリン酸ナトリウム中の0.6％のアゾカゼ
インのアリコート（1ml）を種々の温度でインキュベー
トし、酵素溶液（同じバッファ1mlあたり0.5mgプロテア
ーゼTW3を含む溶液20μ）、または20μのバッファ
単独溶液（対照）の添加後、10分間反応させ、次に10％
のトリクロロ酢酸（400μ）を添加して反応を終了さ
せた。プロテアーゼTW3の温度プロフィルを第11図に示
す。第11図は温度に対する最大タンパク分解活性のパー
センテージをプロットたものである。第５図と同様にプ
ロテアーゼTW3の最適温度範囲は55℃〜60℃である。

実施例20 プロテアーゼTW3とズブチリシンとの安定性比較試験基質の非存在下に52℃でプロテアーゼTW3及び市販の
ズブチリシン（Sigma、プロテアーゼVII、Cat.No.525
5）の安定性を試験した。異なる３つのpH値（4.0、8.0
及び10.0）における試験を行なった。

1ml当たり約0.2mgの酵素を50℃でインキュベートし
た。所定時間経過後10μの標本を採取し実施例８に示
すごとくタンパク分解活性を検定して残留活性を定量し
た。表IVは得られた結果を示す。データは、保持された
酵素活性を初期酵素活性のパーセントで示す。プロテア
ーゼTW3は最良の安定性を示した。例えば、pH8.0で50℃
で１時間インキュベーション後にプロテアーゼTW3の初
期活性の90％が維持されていた。ズブチリシンでは初期
活性の２％しか維持されていなかった。２時間のインキ
ュベーション後にプロテアーゼTW3は初期活性の96％を
維持していたがズブチリシンは0.6％しか維持していな
かった。プロテアーゼTW3はまたpH4.0及び10.0において
もズブチリシンより安定であった。

実施例21 洗剤組成物中のプロテアーゼTW7の安定性３種類の酵素含有市販洗濯用洗剤Era Plus（登録商
標）（Procter ＆ Gamble）、Tide（登録商標）（Proct
er ＆ Gamble）、Dynamo（登録商標）（Colgate−Palmo
live）中でプロテアーゼTW3及びズブチリシンの安定性
を試験した。濃縮洗剤原液を脱イオン水で200倍に希釈
した。初期洗剤調製物中に存在する酵素活性を知るため
に、プロテアーゼTW3、プロテアーゼTW7、プロテイナー
ゼＫまたはズブチリシンの添加以前に希釈洗剤を65℃で
１時間インキュベートして内在プロテアーゼを失活させ
た。

プロテアーゼを添加した失活洗剤を活性の内在酵素含
有洗剤と共に50℃で種々の時間インキュベートした。標
本を抜き取り実施例８の手順で検定することによって種
々のインキュベーション期間後の残留タンパク分解活性
を定量した。

表Ｖに示すごとくプロテアーゼTW3は試験した全部の
洗剤調整物中で特に安定である。例えば、失活Era Plus
を含む調整物中でプロテアーゼTW3は１時間のインキュ
ベーション後に94％の酵素活性を維持していた。これに
比較して内在酵素を含む調製物は完全に失活していた。
Dynamoを含む調整物中でプロテアーゼTW3は１時間のイ
ンキュベーション後に80％の活性を維持していたが、内
在酵素を含む調製物は検出不能なレベルの活性し維持し
ていなかった。Tideを含む調製物中で１時間後にTW3は
初期活性の48％を維持していたが、内在酵素を含む調製
物では活性の23％しか残留しなかった。どの試験でもズ
ブチリシンは１時間以内に失活した。

また、組成中に酵素を含有しない洗濯用洗剤Wisk（登
録商標）中でもプロテアーゼTW3の安定性を試験した。
洗剤原液を脱イオン水で1:200に希釈し、ズブチリシン
またはプロテアーゼTW3を希釈洗剤に添加し、標本を50
℃でインキュベートした。実施例８の手順でタンパク分
解活性を検定した。結果を表Ｖに示す。

本発明の要旨及び範囲を逸脱することなく本文及び実
施例の記載に対する種々の変更が可能でありまたは別の
実施例も可能であること、及び、そのような変更または
実施例が請求の範囲に包含されることは本明細書の開示
より当業者に明らかであろう。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｑ 1/37 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/58 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:645） (56)参考文献ＦＥＢＳＬＥＴＴＥＲＳ，199（２) （1986），Ｐ．136−144

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】Tritirachium album Limber株ATCC22563の
培養培地から単離され、以下の式（ｉ）又は式（ii）に
示すアミノ酸配列を有する精製セリンプロテアーゼ。式（ｉ）：式（ii）：
【請求項２】請求項１に記載のセリンプロテアーゼをコ
ードする遺伝子とハイブリダイズし得る、以下のヌクレ
オチド配列をもつオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３】請求項１に記載のセリンプロテアーゼを宿
主原核細胞または真核細胞中で確実に発現させるために
使用される、請求項１に記載の式（ｉ）又は式（ii）の
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むDN
A。
【請求項４】式（ｉ）のアミノ酸配列をコードするヌク
レオチド配列をもつ請求項３に記載のDNA。
【請求項５】式（ii）のアミノ酸配列をコードするヌク
レオチド配列をもつ請求項３に記載のDNA。
【請求項６】以下に示すヌクレオチド配列をもつ請求項
３に記載のDNA。
【請求項７】以下に示すヌクレオチド配列をもつ請求項
３に記載のDNA。
【請求項８】請求項１に記載の式（ｉ）又は式（ii）の
アミノ酸配列をもつ有効量のセリンプロテアーゼを洗剤
組成物中に含むことを特徴とする組成物。
【請求項９】請求項３に記載のDNAを培養形質転換細胞
中で発現し得る発現ベクター。
【請求項１０】請求項９に記載の発現ベクターによって
形質転換された培養細胞。
【請求項１１】大腸菌の菌株の形質転換によって得られ
た微生物である請求項10に記載の培養細胞。
【請求項１２】請求項１に記載の式（ｉ）のアミノ酸配
列をもつセリンプロテアーゼを産生し得る大腸菌株。
【請求項１３】請求項１に記載の式（ii）のアミノ酸配
列をもつセリンプロテアーゼを産生し得る大腸菌株。
【請求項１４】請求項１に記載の式（ｉ）又は式（ii）
のアミノ酸配列をもち原核細胞または真核細胞による外
来DNA配列の発現産物であることを特徴とする精製及び
単離されたセリンプロテアーゼ。
【請求項１５】外来DNA配列がcDNA配列であることを特
徴とする請求項14に記載のセリンプロテアーゼ。
【請求項１６】外来DNA配列がゲノムDNA配列であること
を特徴とする請求項14に記載のセリンプロテアーゼ。
【請求項１７】外来DNA配列が人工DNA配列であることを
特徴とする請求項14に記載のセリンプロテアーゼ。
【請求項１８】請求項１に記載の式（ｉ）又は式（ii）
のアミノ酸配列をもつセリンプロテアーゼの産生方法で
あって、前記セリンプロテアーゼをコードするDNA配列
を含むDNAベクターで形質転換またはトランスフェクト
した宿主原核細胞または真核細胞を適当な栄養条件下に
増殖させ、前記ベクター中のDNA配列の発現によって産
生した前記セリンプロテアーゼを単離することを特徴と
する前記方法。