JPH06503720A - 酵素及び酵素洗剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素及び酵素洗剤組成物 産業上の利用分野 本発明は酵素と、例えばその製造に使用可能なｒ　ＤＮＡ技術と、その製造に有 用な突然変異化遺伝子、ベクター並びに突然変異体及び形質転換微生物と、例え ば該酵素を含有する酵素洗剤及び洗浄組成物を含めたそれらの使用とに関する。

特定の実施態様において、本発明は改変酵素並びにその製造及び使用、特に修飾 プロテアーゼに関する。このような修飾プロテアーゼとしては、遺伝的に例えば ｒＤＮＡ技術により改変された祖先から伝わった微生物由来のものが挙げられる 。

特定の実施態様において、本発明は改変酵素、特に改変アルカリ性セリンプロテ アーゼ、特に細菌及び真菌類起源のものの製造及び使用に関する。したがって、 本発明は下記のように、特に、Ｂａｃｉｌｌｕ＋　＋ｏｂｔｉｌｉ＋プロテアー ゼ及びその他のサブチリシンプロテアーゼの如きプロテアーゼの製造良術を提供 し、そしてさらにこのようなプロテアーゼの遺伝的改変形、及びこのような酵素 の洗剤及び洗浄組成物中への使用を提供する。

発明の背景 酵素、特にプロテアーゼは、望ましくないタンパク質性汚れなどを除去するか又 は除去を促すために洗剤及び洗浄組成物中に２０年以上もの開側用されてきた。

これらの目的で使用する酵素のうち商業上鏝も重要なものはプロテアーゼ、特に サブチリシンプロテアーゼである。

プロテアーゼは２０年以上もの間洗剤産業に用いられてきたが、しかしどのよう な物理的又は化学的特徴が良好な洗浄結果に寄与するのかは依然として正確には わかっていない。一般に用いられるプロテアーゼは自然界からプロテアーゼを単 離し、洗剤処方物中でそれらを試験して見出された。

セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、活性部位の必須セリ ン残基を特徴とする、サブチリシンを含めた種類の酵素として公知である（Ｗｈ ｉｔｅ、Ｈａｎｄｉｅｒａｎｃｌｓｍｉｔｈ、”Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆＢ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、５ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ。

ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉ　ｌ　ｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏ、、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９７３． 　ｐＩ）　２７１−２７２）。

公知のセリンプロテアーゼは、２５．Ｃ１００〜３０，０００の範囲の分子量を 有する。それらはジイソプロピルフルオロホスホネートにより阻害されるが、し かし金属プロテアーゼに対比して、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）に耐性 である（しかしそれらはカルシウムイオンにより高温で安定である）。

それらは単純な末端エステルを加水分解し、同じくセリンプロテアーゼである真 核生物キモトリプシンと同様の活性を示す。

言い換えればアルカリ性プロテアーゼは、セリンプロテアーゼに最適の高ｐＨｓ 即ちｐＨ９，０−１ｆ、Ｏを反映した呼び名Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　 Ｒｅｖ、４１ニア１１−７５３参照）。

サブチリシンは、グラム陽性細菌又は真菌により産生されるセリンプロテアーゼ である。広範なサブチリシンが同定され、少なくとも８種のサブチリシン類のア ミノ酸配列が確定されている。これらの例としては、Ｂｇｃｉｌｌａｔ株からの ６つのサブチリシン、即ちサブチリシン　１６８、サブチリシン　ＢＰＮ’　、 サブチリシン　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン　ＤＹ、サブチリシン　アミ ロサラカリチフス、及びメセンテリコペブチダーゼ（Ｋｕｒｉｈａｒａ　ｅｔ　 ａｌ、、１９７２．Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４７＋５６２９−５６３１；５ｔａｈｌ　ａｎｄ　Ｆｅ ｒｒａｒｉ、１９８４．　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５９：８１１−８１９．　Ｊａｃｏｂｓｅｔ　ａｌ、、 １９８５．Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１３：８９１３−８９２６；Ｎｅｄｋｏｖ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８５、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、Ｈｏｐｐｅ−３ａｙｌｅｒ３６６：４２１−４ ３０，５ｖｅｎｄｓｅｎ　ｅｔ　ａｔ、。

１９８６、ＦＥＢＳ　Ｌ、ｅｔｔ、１９６：２２８−２３２）、並びにＴｈｅｒ ｍｏ＊ｃｌｉｎｏｍ７ｃｅｔ　ｗｕｌｌ＊ｒｉｓからの２つの真菌サブチリシン 、即ちサブチリシンサーミターゼ（Ｍｅｌｏｕｎ　ｅｔａｌ、、１９８５．ＦＥ ＢＳ　Ｌｅｔｔ、１９８３：１９５−２００）、並びにＴｒｉｌｉｒｚｃｈｉｕ ＋＊　＊ｌｂａｍからのプロテイナーゼＫ　（Ｊａｎｙ　ａｎｄ　Ｍａｙｅｒ、 １９８５．Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ　３６６：５８４−４９２）が挙げられる 。

サブチリシンは物理的及び化学的に十分な特性を有する。これらの酵素の一次構 造（アミノ酸配列）についての知識の他に、基質の結合、遷移状態、生成物質、 ３つの異なるプロテアーゼ阻害剤を示し、そして自然変異に対する構造的結果を 明示するサブチリシンの５０以上の高分解能Ｘ線構造が確定されている（Ｋｒａ ｕｔ、１９７７、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

４６　：　３３１−３５８）。

サブチリシン遺伝子の無作為且つ特定部位の突然変異は、酵素の物理的及び化学 的特性についての知識とサブチリシンの触媒活性、基質特異性、三次構造等に関 する関連情報との両方から判明した（Ｗｅｉｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．Ｐ ｏｒｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４；１２１９−１２２３；Ｗｅ ｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６．Ｐｈ１ｌ。

Ｔｒａｎｓ、Ｒ，Ｓｏｃ、Ｌｏｎｄ、Ａ、３１７；４１５−４２３；Ｈｗａｎｇ 　ａｎｄ　Ｗａｒｓｈｅｌ、１９８７゜Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６；２６６９−２６ ７３；Ｒａｏ　ａｔａｌ、、１９８７．Ｎａｔｕｒｅ　３２８；５５１−５５４ ）。

サブチリシン遺伝子の特定部位の突然変異誘発の技術はおおいに注目され、覆々 の突然変異が下記の特許出願及び特許に記載されている： 欧州特許出願公開第１３０，７５６号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）（米国特許第４， ７６０．０２５号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）＋：対応）は、“カルボニルヒドロラー ゼにおける部位特異的又は無作為に発生した突然変異、その後の、種々の特性、 例えばＫｃａｔ／Ｋｍ比、ｐＨ−活性プロフィル、及び酸化安定性に関する突然 変異化酵素のスクリーニングに関する。部位特異的突然変異が実施可能であるこ と、また、酵素のある特定位置、即ち−ＩＴｙｒ、３２Ａｌｌｐ％　１３５Ａｓ ｎｓ　１０４Ｔｙｒ。

２２２Ｍｅ　ｔ、１６６ＧＩｙ、６４Ｈｉｓ、１６９Ｇ１ｙ。

１８９Ｐｈｅ、３３Ｓｅｒ、２２１Ｓｅｒ、２１７Ｔｙｒ。

１５６Ｇｌｕ又は１５２Ａ１ａにおけるサブチリシン　ＢＰＮ’の突然変異が変 更特性を示す酵素を提供するということを明らかにする以外には、この出願は、 所望の特性を有する酵素を得るために、どの位置に突然変異を導入するかを決定 する問題の解決に寄与していない。

欧州特許出願公開第２１４．４３５号（Ｈｅｎｋｅｌ）は、サブチリシン　Ｃａ ｒｌｓｂｅｒｇ及びその２つの突然変異体のクローニング及び発現に関する（し かし１５８Ａｓｐを１５８Ｓｅ　ｒに、また、１６１Ｓｅｒを１６１Ａｓｐに変 異させることの理由は示していない）。

国際特許出願ＷＯ８７１０４４６１（Ａｍｇｅｎ）は、親酵素中に存在するＡｓ ｎ−Ｇｌｙ配列の数を減少させてｐＨ及び熱安定性の改良を示す突然変異酵素を 得ることを記載し、サブチリシン　ＢＰＮ’　における１０９Ａｓｎ及び２１８ Ａｓｎ残基を除去し、突然変異化し、又は修飾することを強調している。

国際特許出願ＷＯ８７１０５０５０（Ｇｅｎｅｘ）は、無作為突然変異、その後 の、改良特性に関するサブチリシンＢＰＮ’　の多数の突然変異体のスクリーニ ングを開示し、また、２１８Ａｓｎ、１３１Ｇｌｙ、２５４Ｔｈｒ、１６６Ｇ！ ｙ。

１１６ＡＩａ、１８８Ｓｅｒ、１２６Ｌｅｕ及び５３Ｓｅ　ｒ位置における突然 変異を記載している。

欧州特許出願公開第２５１，４４６号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、−次及び三次 構造レベルでのいかなる相同要件が等価のアミノ酸残基が保存されたか否かを確 認するのに適用し得るかを記載している。この情報はサブチリシン　ＢＰＮ’　 の三次構造についての著者の知識と一緒になって、変更特性を有する突然変異体 を得るという期待を伴って突然変異を受けやすい多数の位置を著者に選択させた 。そのようにして確認された位置を以下に示す：１２４Ｍｅｔ、２２２Ｍｅｔ、 １０４Ｔｙｒ。

１５２Ａｌａ、１５６Ｇｌｕ、１６６Ｇｌｙ、１６９ＧＩｙ。

１８９Ｐｈｅ、２１７Ｔｙｒ０さらに１５５Ａｓｎ。

２１Ｔｙｒ、２２Ｔｈｒ、２４Ｓｅｒ、３２Ａｓｐ。

３３Ｓｅｒ、３６Ａｓｐ、４６Ｇｌｙ、４８ＡＩａ。

４９Ｓｅｒ、５０Ｍｅｔ、７７Ａｓｎ、８７Ｓｅｒ。

９４Ｌｙｓ、９５Ｖａｌ　、９６Ｌｅｕ、１０７１　１ｅ、１１０Ｇｌｙ、１７ ０Ｌｙｓ、１７１Ｔｙｒ、１７２Ｐｒｏ、１９７Ａ　ｓ　ｐ　Ｎ　１９９　Ｍ　 ｅ　ｔ　ｓ　２０４　Ｓ　ｅ　ｒ　ｓ　２１３　Ｌ　ｙ　ｓ　％及び２２１Ｓｅ ｒが酵素の種々の特性に影響を及ぼすことが確認されて、これらの示唆を支持す る多数の突然変異が例証されている。これらの位置における単一突然変異の他に 、著者はさらに多数の多面的突然変異を実施した。さらに、著者は２１５Ｇｌｙ 、６７Ｈｉｓ、１２６Ｌｅｕ、１３５Ｌｅｕ、並びにセグメント９７〜１０３． １２６〜１２９．２１３〜２１５及び１５２〜１７２内のアミノ酸残基を興味深 いものとして確認したが、これらの位置の突然変異は例証されていない。

欧州特許出願公開第２６０，１０５号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）は、触媒性圧つ組残 基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｔｒｉａｄ）から約１５Ａ内のアミノ酸残基を選択し 、選択されたアミノ酸残基を別の残基と置換することによる、触媒性圧つ組残基 を含有する酵素におけるある種の特性の改変を記載している。この明細書に記載 されているサブチリシン型の酵素は、触媒性圧つ組残基を含有する酵素の種類に 属すると特に言及されている。サブチリシンにおいては、２２２及び２１７位置 は、置換のための好ましい位置として示される。

さらに、サブチリシン　ＢＰＮ’　において９９Ａｓｐを９９Ｓｅｔに変えると 酵素のｐＨ依存性が変わるということがＴｈｏｍａｓ、Ｒｕ５ｓｅｌｌ及びＦｅ ｒｓｈｔ（Ｎａｔｕｒｅ　（１９８５）３１８，３７５−３７６）により示され ている。その後の文献（Ｊ、　Ｍｏ　１．　Ｂ　ｉ　ｏ　１（１９８７）１９３ ．８０３＝８１３）で、同著者はさらに、１５６ＧＩｕの代わりの１５６Ｓｅｔ の置換を考察している。

これらの突然変異はともに、活性６４Ｈｉｓから約１５Ａの距離内である。

Ｎａｔｕｒｅ　３２８，４９６−５００　（１９８７）において、Ｒｕ５ｓｅ’ ｌｌとＦｅｒｓｈｔは彼らの実験の結果を考察し、酵素を突然変異させてｐＨ− 活性プロフィールを変えて表面電荷の変化を得るための規則を提示している。

目下、下記のサブチリシンプロテアーゼが十分公知であって、それらの多くは世 界中の多くの国々で、特に洗剤に用いるために大量に販売されている： サブチリシン　ＢＰＮ’　又はＮｏｖｏ　（例えばＳ　ｉ　ｇｍａ。

Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡから販売）；サブチリシン　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　（ Ｎｏｖａ−ＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ（デンマーク）からＡＬＣＡＬＡＳＥ　（登録 商標）として、ＩＢＩＳ　（オランダ）からＭＡＸＡＴＡＳＥ　（登録商標）と して市販）； Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ　サブチリン：／（ＮＯＶＯ−Ｎｏｒｄｉｓｋ 　Ａ／Ｓ（デンマーク）からＳＡＶ　ＩＮＡＳＥ　（登８商標）　として市販） ；５ＡＶＩＮＡＳＥ　（登録商標）類似体（例えばｒＢＴｓからＭＡＸＡＣＡＬ 　（登録商標）として、並びにＭ　ｉ　ｌ　ｅ　！！Ｋａｌｉ　Ｃｈｅｍｉｅ（ ドイツ）からＯＰＴ　Ｉ　ＣＬＥＡＮ（登録商標）として市販）； Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓ　サブチリシン（Ｎｏｖ。

−Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ（デンマーク）からＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）と して市販）： ＫＡＺＵＳＡＳＥ　（登録商標）（Ｓｈｏｗａ　Ｄｅｎｋ。

（日本）から市販）。

しかしながら、有効であるためには、このような酵素は洗浄条件下で活性を示さ ねばならないだけでなく、製造及び貯蔵中に他の洗剤成分と混和性でなければな らない。

例えば、サブチリシンは他の基質に対して活性な他の酵素と組み合わせて用い得 るし、選択されたサブチリシンはこのような酵素に対する安定性を有する必要が あり、さらに選択されたサブチリシンは好ましくは他の酵素を消化すべきでない 。さらに、選択されたサブチリシンは洗剤処方物中の他の成分、例えば漂白剤、 酸化剤等からの作用に耐性であるべきであって、特に洗剤処方物中に用いられる 酵素は、貯蔵中の洗剤中の、及び洗浄中の洗濯液中の非酵素成分によって与えら れる酸化力、カルシウム結合特性、洗浄力及びｐＨ条件に関して安定である必要 がある。酵素が洗濯液で安定したままである能力はしばしばその洗濯能力又は洗 濯可能性と呼ばれる。

天然サブチリシンは、ｐＨ及びイオン強度のようなパラメーターの変動下でのそ れらの洗濯力又は能力に関して非常に変化しやすい特性を有することが判明して いる。上記の市販洗剤プロテアーゼのいくつかは、実際、約２０年前に市販され ていたものより良好な性能を有するが、しかし最適性能に関しては、各酵素は、 処方及び洗濯条件、例えばｐＨ，温度、イオン強度（■）、活性系、ビルダー等 に関してはそれ自体の特異的条件を有する。

その結果、低ｐＨ及び低■で望ましい特性を有する酵素はより高いアルカリ条件 又はその逆の条件では余り興味を引くものではないということが判明した。

さらに、洗濯工程中に生じる洗濯液のｐＨの変化に相対的に耐性である酵素を製 造及び使用するのが望ましい。

目下、所望のアミノ酸配列を有する酵素を構築できるし、上記のようにかなりの 量の研究が変更特性を有するサブチリシンの設計に向けられてきた。種々の提案 の中で、欧州特許出願公開第１３０．７５６号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）（米国特 許第４．７６０．０２５号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ））及び国際特許出願ＷＯ８７１ ０５０５０（Ｇｅｎｅｘ）に記載の多数の突然変異化酵素の製造及びスクリーニ ングの技術は、天然酵素を単離し、そしてその特性に関してそれらをスクリーニ ングする古典的方法に対応するが、しかしより有効である。

サブチリシンプロテアーゼは一般的に約２７５個の、各々２０種類の天然アミノ 酸のうちの１つであり得るアミノ酸残基を含有し得るため、その手法における１ つの重大な欠点は、興味あるものへの使用のための、例えばこの場合には洗濯液 の特定の条件下で改良洗濯能力を示す洗剤組成物を処方するための改良特性を有 する所望の酵素を得るために突然変異を起こさせるアミノ酸残基を確定する場合 の手本が示されていないので、最初のスクリーニングで興味深い特徴を示した選 択突然変異体をさらに試験する前に予備試験を受けねばならない極めて多数の生 成された突然変異が存在することである。

したがってこれらの特許出願に記載された手法は、長年公知であった伝統的無作 為突然変異法よりもわずかに良いだけである。

他の公知の方法は、特異的特性、例えば加水分解速度（欧州特許出願公開第２６ ０，１０５号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ））及びｐＨ活性プロフィール（Ｔｈｏｍａｓ 、Ｒｕ５ｓｅｌｌａｎｄ　Ｒｅｒｓｈｔ、上記）の変更に関する。これらの公報 はいずれも酵素の洗濯性能又は゛洗濯能力゛の変更に関するものではない。

実際、このように十分に定義づけられた酵素の特性と酵素の洗濯性能又は゛洗濯 能力゛　との間の関係は、当業界ではまだ確認されていない。

国際特許出願　ＷＯ８９１０６２７９（ＰＣＴ／ＤＫ８８１００００２）（Ｎｏ ｖｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／Ｓ）では、洗濯能力の所望の変化を得るためにど のアミノ酸を変えるべきか、そしてどのアミノ酸を挿入すべきかを確定するため の相同性比較の概念を用いることを提案する。

初期の、前公表されていない欧州特許出願公開第４０５．９０１号（Ｕｎｉｌｅ ｖｅｒ）は、変更ｐｔを有する突然変異体サブチリシンプロテアーゼ及びそれら を含有する洗剤組成物の製造及び使用を記載する。

残存する問題は、多くの研究がプロテアーゼ酵素作用の機序を明らかにすること に向けられてきたが、しかし依然としてその洗濯性能に関連した酵素の特性を確 定する構造中の因子及びアミノ酸残基の組み合わせについて少し分かつているだ けである。

その結果、洗濯系に対するプロテアーゼ酵素のさらなる改良及び改造、並びに洗 浄組成物又は洗剤組成物の特定の使用におけるプロテアーゼ作用の機序について のより良い理解が必要である。

本発明において、突然変異体プロテアーゼ、例えば突然変異体サブチリシンプロ テアーゼは原遺伝子又は親遺伝子を有する親機生物由来の突然変異体遺伝子を発 現中で、対応する親酵素を産生じ、好適な宿主中で発現される場合に上記の突然 変異体プロテアーゼが産生される突然変異体遺伝子を生成するために親遺伝子が 突然変異化されていた生物体によって生成されたプロテアーゼを意味する。

上記のように、細菌及び真菌起源のプロテアーゼ、特にサブチリシンプロテアー ゼはそれ自体、洗浄及び洗浄組成物、例えば洗濯用洗剤中でとりわけ有用である ことを示した。

サブチリシン及び他のアルカリ性プロテアーゼは、実際上その使用を可能にした アルカリ性洗濯条件にある程度まで耐え得る。にもかかわらず、それらはアルカ リ性範囲のｐＨに活性及び安定性のある種の依存性を示すので、その特性が今日 まで用いられている酵素の特性よりアルカリ性ｐＨで扱いやすい酵素調製物を提 供するのが望ましい。

その態様の１つにおいて本発明は、ｒ　ＤＮＡ技術により生成されるプロテアー ゼ、例えばそのアミノ酸配列の少なくとも１つの突然変異を有し、あるｐＨ範囲 にわたってプロテアーゼの分子電荷の、親プロテアーゼに比して低度の変異（例 えばあるｐＴ（範囲にわたって電荷の実質的恒常性に近づく、例えば中性に近づ く）を引き起こすサブチリシンプロテアーゼを提供する。

さらに本発明は、（例えば）界面活性剤及び洗剤添加剤、そのアミノ酸配列の少 な（とも１つの突然変異を有し、あるｐ）（範囲にわたってプロテアーゼの分子 電荷の、親プロテアーゼに比して低度の変異（例えばあるｐＨ範囲にわたって電 荷の実質的恒常性に近づく、例えば中性に近づく）を引き起こす、ｒＤＮＡ技術 により生成されるプロテアーゼを含有する酵素洗剤組成物を提供する。

本発明によれば、分子電荷におけるこのような低度の変異、特に例えばあるｐＨ 範囲に亘る分子電荷の実賞的中性又は恒常性は、洗剤処方物束縛の柔軟性増大を 提供し、数例においては所望のｐＨにより近いｐＨを有する洗剤の処方を可能に する。

このような酵素はさらに使用中のｐＨの変化に対して野生型より低い感受性を示 す。

このような突然変異体酵素は、洗剤組成物又は洗浄組成物の一部として用いる場 合、活性、安定性、及び／′又は洗浄性能、及び／又は広範なｐ　Ｈ範囲で用い られる能力に利益をもたらし得る。

このような突然変異体酵素はさらに、洗濯液のｐ　Ｈの変化に対して低感受性を 示すことにより、洗濯サイクル中の望ましくない性能変化を低減し得る。

このような酵素は、比較的高い及び比較的低いｐＨの洗剤中で実質的に等価の性 能を有して適用し得る。

広範に用いられるサブチリシンプロテアーゼの１つ（サブチリシン　３０９．上 記）は、ｐＨ範囲７〜１１で１分子当たり約８単位の、即ち低ｐＨで約＋５〜高 ｐＨで約−３の正味分子電荷の変化で反映されるｐＨに対する感受性を示す。

本発明に包含される突然変異体プロテアーゼ酵素の有用な例は、多少の範囲にま たがるｐＨ範囲で、例えば約８〜約１１のｐ　Ｈ範囲で、任意に約７〜約１１の 広範囲での、低度の変異、例えばこのような野生型酵素とｐＨを比較した場合分 子電荷の変化の実゛質的低減を示し、実質的恒常性に近づく二とさえあり、ある 場合には中性の分子電荷、例えば１分子当たり５１ｉ荷単位以下、例えば１分子 当たり３電荷単位以下であるか、又はより低電荷、ある場合には１分子当たり約 １電荷単位以下である。

最も普通には、電荷はｐＨの増加を伴ってさらに負となる。

突然変異体プロテアーゼが、ｐＨに伴って、Ｉ）８７〜１１の範囲より低い程度 、例えば少なくとも０．５ｐＨ単位、例えば少なくとも１ｐＨ単位例えば少なく とも２又は３ｐＨ単位の分子電荷の変化率の相対的減少を示すならば十分であっ て、このような低度範囲は約７〜約１１のｐＨ範囲内、例えば約８〜約１１のｐ Ｈ範囲内に位置する。

ｐＨに伴う電荷の変動性低下の領域内のｐＨ値の分子電荷は１分子当たり＋５〜 −３電荷単位の範囲内、例えば＋３〜−１単位の範囲内で、時折正味電荷が＋／ −１、例えば＋／−０，５の範囲内で、例えばゼロ又はわずかに正に近づく。

いくつかの場合には、プロテアーゼの正味電荷は、１分子当たり＋／−１又はさ らに狭い＋／−０，５電荷の変動範囲内で、例えばほとんど一定か又はほとんど ゼロのままである。

本発明の実施態様による突然変異体酵素は、例えば上記の引用公報及びそこに引 用された参考文献（その記載内容は参考として本明細書中に含めるものとする） に例証されている一般的に公知のｒＤＮＡ技術の適用により製造し得る。

下記の本発明の突然変異体酵素の実施態様は、タンパク質中に天然に存在する各 々のアミノ酸に関する以下の略号を参照して確定される： Ａ　＝　Ａｌａ　＝　アラニン Ｖ　＝　Ｖａｔ　＝　バリン Ｌ　＝　Ｌｅｕ　＝　ロイシン １　＝　Ｉｌｅ　＝　イソロイシン Ｐ　＝　Ｐｒｏ　＝　プロリン Ｆ　＝　Ｐｈｅ　＝　フェニルアラニンＷ＝Ｔｒｐ＝）リプトファン Ｍ　＝　Ｍｅｔ　＝　メチオニン Ｇ　＝　Ｇｌｙ　＝　グリシン Ｓ　＝　Ｓｅｔ　＝　セリン Ｔ　＝　Ｔｈｒ　＝　トレオニン Ｃ＝　Ｃｙｓ　＝　システィン Ｙ　＝　Ｔｙｒ　＝　チロシン Ｎ　＝　Ａｓｎ　−アスパラギン Ｑ　＝　Ｇｌｎ　＝　グルタミン Ｄ　＝　Ａｓｐ　＝　アスパラギン酸 Ｅ　＝　Ｇｌｕ　＝　グルタミン酸 Ｋ　＝　Ｌｙｓ　＝　リシン Ｒ＝　Ａｒｇ　＝　アルギニン Ｈ＝　Ｈｉｓ　冨　ヒスチジン Ｂ　＝　Ａｓｘ　＝　Ａｓｐ又はＡｓｎＺ　＝　Ｇｌｘ　＝　Ｇｌｕ又はＧｌｎ 本発明にしたがって作られる突然変異の対象である番号を付したアミノ酸配列位 置に対する本明細書での言及は、サブチリシン　ＢＰＮ’　の配列中にそれらが 生じた場合のアミノ酸残基及びその番号に関連する。本発明はさらに、たのサブ チリシンプロテアーゼの改変変異体、例えばその配列が国際特許出願ＷＯ９１１ ００３４５（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉ　ｓｋ）　（こ（７）記載内容は参考として 本明細書中に含めるものとする）の表Ｉに示されるものを包含する。本明細書中 に言及した番号付き突然変異部位をこのような他のプロテアーゼに適用するため に、言及の数字部分は、サブチリシン　ＢＰＮ’　との最大相同性の意味でのこ のような別の相同サブチリシンプロテアーゼの対応する位置に対する言及である と理解されるべきである。このような対応する位置は、ＢＰＮ’　の遺伝子の場 合と比較して、このような池のプロテアーゼの遺伝子における明白な欠失又は挿 入のために他のプロテアーゼの鎖に沿って数が異なる場合がある。欠失又は不在 アミノ酸は、上記の表では“＊°で示され、ＢＰＮ’　に関する挿入は位置番号 の下方にアルファベットを添字して示される。

（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｌｉｓ　３０９及び１４７は、Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　１ｅｎｔｕｓの変異株であって、受託番号　ＮＣＩＢ　１０１４７及びＮ ＣＩＢ　１０３０９でＮＣＩＢに寄託されたもので、米国特許第３．７２３．２ ５０号（１９７３年３月発行。この記載内容は参考として本明細書中に含めるも のとする）に記載されている。）本発明によれば、突然変異体サブチリシン酵素 は、サブチリシンＢＰＮ’　、サブチリシン　アミノサラカリチフス、サブチリ シン　１６８、サブチリシン　メセンテリコペブチダーゼ、サブチリシン　Ｃａ ｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン　ＤＹ、サブチリシン　３０９、サブチリシン　 １４７、サーミターゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ＰＨ１０プロテアーゼ及びプロテア ーゼ　Ｋ、好ましくはサブチリシン　３０９、サブチリシン１４７、サブチリシ ン　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、アクアリシン、又はＢａｃｉｌｌｕｓＰＢ９２　プロ テアーゼから選択される親酵素の突然変異を示すのが好ましい。

本発明の範囲内の有用な突然変異体サブチリシンプロテアーゼとしては、非滴定 （ｎｏｎ−ｔｉｔｒａｔｉｎｇ）残基、又は８〜１１の範囲の外側又は場合によ り７〜１２の範囲の外側のｐＫ＆を有する残基（特にチロシン以外の残基）によ って、特に例えばリシン（イソロイシン、システシン又はバリン）に対してはア ルギニン、ロイシン、トレオニン、アスパラギン、グルタメート又はアルパルテ ート；チロシンに対してはフェニルアラニン、トレオニン、バリン、トリプトフ ァン又はグルタメート；ヒスチジンに対してはグルタミン、アスパラギン、セリ ン、グルタメート又はアスパルテートによってそれらを置換するためにリジン、 イソロイシン、バリン、ヒスチジン、システィン及び／又はチロシン残基（これ はしばしば８〜１１内で滴定するか又はその範囲内のｐＫｇ値を有する）の突然 変異を有する突然変異体酵素が挙げられる。

本発明の特定の実施態様において、下記の任意の突然変異又は突然変異セットを 指定の部位に導入し得る：Ｈ１７Ｑ％に２７Ｒ％Ｈ３９ＳＳＥ５４Ｄ、Ｙ９１Ｆ 。

に９４Ｒ，Ｈ１２０Ｄ、Ｈ１２ＯＮ１　Ｙ１６７Ｅ、Ｙ１６７Ｆ。

Ｙ１７１Ｖ％　Ｙ１９２Ｅ、Ｙ１９２Ｆ、Ｙ２Ｏ９Ｆ、Ｙ　２１４Ｔ１　Ｈ２２ ６Ｓ、Ｋ２３５Ｌ、に２３５Ｒ，Ｋ２３７Ｒ。

Ｋ２５１Ｅ、に２５１Ｎ、Ｙ２６３Ｆ、突然変異Ｅ５４Ｄ及びに９４Ｒは普通は 一緒に導入すべきである。

突然変異のこれらの例は、さらに以下のようにグループ分けｂ　−Ｈ１７Ｑ＋に ２７Ｒ＋Ｈ３９Ｓ；ｃ　−Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋に９４Ｒ；ｄ　−Ｅ５４Ｄ＋Ｙ ９１Ｆ＋に９４Ｒ＋Ｈ１２０Ｄ；ｅ　−Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋に９４Ｒ＋Ｈ１２ ＯＮ；ｆ　−Ｙ１６７Ｆ＋Ｙ１７１Ｖ＋Ｙ１９２Ｆ＋Ｙ２Ｏ９Ｆ＋Ｙ２１４Ｔ； ｇ　−Ｋ２３５Ｌ＋に２３７Ｒ＋に２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ；ｈ　−Ｋ２３５Ｌ＋ に２３７Ｒ＋に２５１Ｎ＋Ｙ２６３Ｆ；ｉ　−Ｈ２２６Ｓ＋に２３５Ｌ＋に２３ ７Ｒ＋に２５１Ｎ＋Ｙ２６３Ｆ； ｋ　−Ｈ２２６Ｓ＋に２３５Ｌ＋に２３７Ｒ＋に２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ； ｇ’　−Ｋ２３５Ｒ＋に２３７Ｒ＋に２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ；ｈ’　−Ｋ２３５ Ｒ＋に２３７Ｒ＋に２５１Ｎ＋Ｙ２６３Ｆ；ｉ’　−Ｈ２２６Ｓ＋に２３５Ｒ＋ に２３７Ｒ＋に２５１Ｎ＋Ｙ２６３Ｆ； ｋ”−Ｈ２２６Ｓ＋に２３５Ｒ＋に２３７Ｒ＋に２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ。

したがって、本発明の実施態様はさらに、例えばａ＋ｃ＋ｆ＋ｇ、ｂ＋ｄ＋ｆ＋ ｉＳｂ＋ｅ＋ｆ＋ｋＳｂ＋ｅ＋ｆ＋ｉ、、ｂ＋ｄ＋ｆ＋ｋＳａ＋ｃ＋ｆ＋ｇ’　 、ｂ＋ｄ＋ｒ＋ｉ’　、ｂ＋ｅ＋　ｆ　＋　ｋ　’　、ｂ　＋　ｅ　＋　ｆ　＋ 　ｒ　’　、ｂ　＋　ｄ　＋　ｆ　＋　ｋ　’　（ここで、文字は前項に示した 突然変異又は突然変異セットを表す）に対応する突然変異セットを有する突然変 異体を包含する。

当該突然変異体プロテアーゼの特定の例としては、以下の突然変異体が挙げられ る： Ａ：　Ｋ２７Ｒ； Ｂ：　Ｋ２３５Ｒ＋に２３７Ｒ＋に２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ；Ｃ：　Ｅ５４Ｄ＋Ｙ ９１Ｆ＋に９４Ｒ；Ｄ：　Ｋ２７Ｒ＋Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋に９４Ｒ＋Ｙ２Ｏ９ Ｆ＋Ｙ２　１　４Ｔ＋に２　３　５Ｒ＋に２　３　７Ｒ＋に２　５　１　Ｅ＋Ｙ ２６３　Ｆ　； Ｅ：　Ｋ２７Ｒ＋Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋に９４Ｒ＋Ｙ１６７Ｆ＋Ｙ１７１Ｖ＋Ｙ １９２Ｆ＋Ｙ２Ｏ９Ｆ＋Ｙ２１４Ｔ＋に２３５Ｒ＋に２３７Ｒ＋に２５１Ｅ＋Ｙ ２６３Ｆ　（Ｙ、にはすべて変化）； Ｆ：　突然変異体Ｅと同様。但し、Ｄ残基の電荷を付加する２つのさらなる突然 変異とＥ残基の電荷を付加する１つの突然変異を有する； Ｇ：　突然変異体Ｆと同様。但し、１７．３９．１２０．２２６位置のヒスチジ ンの中性残基への突然変異をさらに有する； Ｈ：　突然変異体Ｇと同様。但し、Ｎ−末端が化学的に修飾されて（ブロックさ れて）中性基又は７〜１２の範囲外のｐＫａを有する基を生じる。

プロテアーゼＡ−Ｈに関する滴定曲線（算・出）を、野生型サブチリシン　３０ ９に関する曲線と一緒に添付の図１〜３に示す。

上記のプロテアーゼＨに関連して言及したように、そして一般的に適用できるよ うに、例えば、ブロッキング処理の結果がＮ−末端アミノ基を約８〜１１の範囲 外の、あるいは約７〜１２の範囲外のｐＫａを有する基に置換するよう配列する ことにより、８〜１１の範囲のアルカリ性ｐＨでの電荷の安定性の程度に寄与す るために、例えば、プロデューサー微生物によるその産生後にプロテアーゼのア シル化又はアルキル化を達成するために修飾試薬で処理することによりプロテア ーゼ（しばしば、ポリペプチド分子環境で約８のＩ）Ｋｌを有する）のＮ−末端 アミノ基を修飾することは有用である。

好適な方法は、例えば”ＣｈｅｍｉｃａｌＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ ｒｏｔｅｉｎｓ’、Ｇ。

Ｅ、Ｍｅａｎｓ、Ｒ，Ｅ、Ｆｅｅｎｅｙ、１９７１Ｈｏｌｄｅｎ　−Ｄａｙ　Ｉ ｎｃ、、５ａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏに、および’Ｉｎ　Ｖｉｖ。

Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ’　ｂｙ 　Ｆｉｎｎ　Ｗｏｌｄ、Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５０　（１９８１）、７８３−８１４に開示されてい る。最も好適な方法は、（ｉ）例えばアミノ基をホモグアニジニウム基に転化す るためのエチルアセトイミデ−トとの反応により、又は。−メチルイソウレアに ょるグアニジン化により末端アミノ基を修飾して、高ｐＫの正荷電基を脱離する ｈめの；又は（目）例えば無水酢酸によるアセチル化、又はシアネートによるカ ルバミル化によりＮ−末端を中和するための；又は（ｉ　ｉ　ｉ）例えば無水コ ハク酸にょるアシル化により末端アミノ基を負荷電基に転化するための工程を包 含する。

これらの方法はさらに、影響を受けやすいリシン残基に影響を及ぼす。

本発明はさらに、洗浄組成物及び洗剤組成物中の本発明の突然変異体酵素の使用 を包含し、さらにこのような突然変異体酵素を含有する洗浄組成物及び洗剤組成 物にもわたる。

これらの酵素は、洗剤組成物中に十分公知の標準量で用い得る。その量は非常に 広範な範囲、例えば洗剤組成物１グラム当たり約０．０００２〜０．０１、例え ば約０．００５〜０．０５Ａｎｓｏｎ単位である。他の単位で表すと、プロテア ーゼは洗剤処方物の約０．１〜１００ＧＵ／ｍｇ　（Ｎえばｆ〜５０、特に５〜 ２０　Ｇ　Ｕ　／　ｍ　ｇ　）のオーダーの量で、又は洗剤処方物１ｇ当たり約 ０．０１〜４、例えば０．１〜０．　４ｋＮＰＵを中央値におく広範な任意量で 組成物中に含まれる。

ＫＮＰＵは、Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ力（出版した技術文書に於ける と同様に定義される。

ＧＵは、グリシン単位であって、標準条件下で、基質としてＮ−アセチルカゼイ ンを用いて４０℃で１５分インキュベート中に１マイクロモルのグリシンと等価 の量のＮ　Ｈ２基を生成するタンパク質分解酵素活性と定義される。

例えば、洗濯液１リツトル当たり約０．２５ｍｇの酵素タンパク質の割合で本発 明の酵素を用いるのが好適である。対応する洗剤処方物は、例えば０．１〜０． ４ｋＮＰＵ／ｇのオーダーの量で酵素を含有する。

コノヨウな組成物は、任意の１つ又はそれ以上の突然変異体サブチリシン酵素の 他に、本発明の前記の態様１こした力くって、当業者に十分公知のこのような組 成物中に含まれる任意の通常成分を単独又は組み合わせて包含する。

このような成分としては、ビルダー、例え＋ｆ　ＩＪシン塩又はゼオライトビル ダー；界面活性剤、例えば隘イオン性、陽イオン性又は非イオン性界面活性剤； ポリマー、例え＋２アクリル酸又は等価のポリマー；漂白系、例え（ｆ過ホウ酸 塩−又はアミノ含有漂白前駆物質又は活性化剤１：構造（ヒ却１（ｓｔｒｕｃｔ ｕｒａｎｔｓ）、例えば珪酸塩構造化剤、ｐＨを調製するためのアルカリ又は酸 ：保湿剤、及び／又は中性無機塩が挙げられる。

洗剤組成物はさらに酵素も含有し得る。

例えば、リパーゼは顆粒組成物（あるいは溶液又はスラリー）の形態で、キャリ アー物質を伴う脂肪分解酵素（例えば欧州特許出願公開第２５８，０６８号（Ｎ ｏｖｏ　ＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ）に記載のような、並びにＮｏｖａ　Ｎｏｒｄｉ ｓｋＡ／Ｓのリポラーゼ（Ｌｉｐｏ！ａｓｅ）及び他の酵素組成物）の形態で有 用に添加し得る。

リパーゼの添加量は、広い限界内で、例えば界面活性剤系又は洗剤組成物１ｇ当 たり５０〜ａｏ、０ＯＯＬＵ／ｇ、例えばしばしば少なくとも１００ＬＵ／ｇ、 非常に有用には少なくとも５００　ＬＵ／ｇ、時折好ましくは１０００より多く 、２０００ＬＵ／ｇより多く、又は４０００ＬＵ／ｇ以上であって、したがって 非常にしばしば５０〜４０００ＬＵ／ｇの範囲内で、おそらくは２００〜１００ ＯＬＵ／ｇの範囲内である。本明細嘗においては、リパーゼ単位は欧州特許出願 公開第２５８．０６８号におけるように定義される。

脂肪分解酵素は、広範なリノく−ゼの中から、特番二例えｉｆ以下の特許明細書 に記載のリノ々−ゼから選択し得る：欧州特許出願公開第２１４．７６１号（Ｎ ｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ）、欧州特許出願公開第２５８．０６８号、特 にＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎｕｇｔｎｏｓｕｓ　ＡＴＣＣ２２０７０から のリパーゼに対する抗血清との免疫学的交差反応性を示すリパーゼ、欧州特許出 願公開第２０５．２０８号及び欧州特許出願公開第２０６，３９０号、特にＣｈ ｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏｓｕｍ　ｖａｒｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｍ　Ｎ ＲＲＬ　Ｂ−３６７３からの１ノ／く一セニ対する、又はＡｌｃａｌｉｇｅｎｅ ｓ　ＰＬ−６７９゜ＡＴＣＣ３１３７１及びＦＥＲＭ−Ｐ　３７８３からのＩＪ パーゼに対する抗血清との免疫学的交差反応性を示す＋ノＮ−ゼ、さらに明細書 Ｗ０　８７１００８５９（Ｇｉｓｔ　−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）及び欧州特許出願公 開第２０４．２８４号（Ｓａｐｐｏｒｏ　Ｂｒｅｗｅｒｉｅｓ）ｉこ記載の１ノ Ｉく−ゼ。

特に好適なものは、以下の市販のり、（−ゼ調製物である：Ｎｏｖｏ　リパーゼ 、Ａ　ｍ　ａ　ｎ　ｏ　Ｉｊ　ｐ＜−ゼ　ＣＥ、Ｐ、Ｂ。

ＡＰ、Ｍ−ＡＰ、ＡＭＬ及びＣＥＳ、並び：こＭｅｉｔｏ　’）Ａ−ゼ　ＭＹ− ３０，ＯＦ及びＰＬ、さらにＥｓｔｅｒａｓｅＭＭ、Ｌｉｐｏｚｙｍ、５Ｐ２２ ５．５Ｐ２８５、Ｓａ　ｉ　ｋｅｎ　リパーゼ、Ｅｎｚｅｃｏ　リパーゼ、Ｔｏ ｙ。

Ｊｏｚｏ　リパーゼ、並びにＤｉｏｓｙｎｔｈ　リパーゼ（登録商標）。

さらにこれらのリパーゼ酵素の遺伝子工学は、適切なリパーゼ遺伝子、例えばＴ ｈ　ｅ　ｒｍｏｍｙ　ｃ　ｅ　ｓＩａｎｕｇｉｎｏｓｕｓからの、又はその突然 変異体からのリパーゼに関する遺伝子の抽出、並びにＡｓｐｅｒｇｉ　Ｉ　Ｉｕ ｓのような好適なプロデューサー生物における遺伝子又はその誘導体の導入及び 発現により達成し得る。Ｗｏ　８８１０２７７５（Ｎｏｖａ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　 Ａ／Ｓ）、欧州特許出願公開第２４３．３３８号（Ｌａｂｏｆｉｎａ）、欧州特 許出願公開第２６８．４５２号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、及び特に欧州特許出願公 開第３０５．２１６号（Ｎｏｖ。

Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ）又は欧州特許出願公開第２８３．０７５号（Ｇｉｓ　 ｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）に記載の技術を適用及び応用し得る。

さらに存在し得る同様の要件は、他の酵素の場合には必要な変更を加えて適用す るが、これらに限定されない：例えばアミラーゼは、所望により、洗剤組成物１ ｇ当たり約１〜約１００ＭＵ（マルトース単位）　（又は０．０１４〜１．４、 例えば０．０７〜０．７ＫＮＵ／ｇ　（Ｎｏｖｏ単位））の範囲の量で用い得る 。例えばセルラーゼは、所望により、洗剤組成物１ｇ当たり約０．３〜約３５Ｃ ＥＶＵ単位の範囲の量で用い得る。

本発明の洗剤組成物中に通常量で存在し得る通常の洗剤成分を以下に示す：組成 物はビルダー入りであってもビルダーを用いなくてもよく、無リン型であっても よい（即ち、任意のリン含有ビルグーを含有しない）。したがって、組成物は、 例えば総計１〜５０重量％、例えば少なくとも約５重量％、しばしば約３５〜４ ０重量％までの１つ又はそれ以上の有機及び／又は無機ビルダーを含有し得る。

ビルダーの一般的例としては、すでに上記したものが挙げられるが、さらに広範 には、アルカリ金属オルト、ピロ及びトリポリリン酸塩、アルカリ金属炭酸塩、 単独で又は方解石との混合物で、クエン酸アルカリ金属塩、ニトリロトリ酢酸ア ルカリ金属塩、カルボキシメチルオキシコハク酸塩、ゼオライト、ポリアセタル カルボン酸塩等が挙げられる。

さらに、洗剤組成物は、１〜３５％の漂白剤、又は漂白剤前駆物質、あるいは漂 白剤及び／又はその活性化剤を有する前駆物質から成る系を含有し得る。さらに 任意の成分は、起泡増進剤、発泡抑制剤、耐食剤、汚れ懸濁剤、金属イオン封鎖 剤、汚れ再付着防止剤、香料、染料、酵素用安定剤等である。

組成物は、繊維製品、特に木綿及びポリエステルをベースにした繊維製品及びそ の混紡製品の洗濯に用い得るが、これらに限定されない。例えば、約６０〜６５ ℃又はそれ以下、例えば約３０〜３５℃又はそれ以下の温度で実施する洗濯工程 が特に適している。洗濯液中に例えば約０．４〜０．８ｇ、／ｌの界面活性剤を 提供するのに十分な割合で組成物を用いるのが非常に好適であるが、しかしもち ろん、所望によりそれ以下又はそれ以上の濃度で用いてもよい。例えば処方物が 実際に実施例に示すようなものである場合に用いるには、約１〜１０ｇ／ｌ、例 えば約３〜６ｇ／ｌの使用率の洗剤処方物が好適であると言えるが、しかしこれ らに限定されない。

本発明の範囲内の特定の形態の洗剤組成物を以下に示す：ａ）リン酸塩ビルグー 、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アクリル酸又は等価のポリマ ー、過硼酸塩漂白前駆物質、アミノ含有漂白活性化剤、珪酸塩又は他の構造化剤 、使用時に所望のｐＨに調整するためのアルカリ、並びに中性無機塩を含有する 、洗剤粉末として処方される洗剤組成物。

ｂ）ゼオライトビルダー、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アク リル酸又は等価のポリマー、過硼酸塩漂白前駆物質、アミノ含有漂白活性化剤、 珪酸塩又は他の構造化剤、使用時に所望のｐＨに調整するためのアルカリ、並び に中性無機塩を含有する、洗剤粉末として処方される洗剤組成物。

Ｃ）陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、保湿剤、有機酸、腐食性ア ルカリを含有し、９〜１０の値にｐＨを調整した、水性洗剤液として処方される 洗剤組成物。

液体非イオン性界面活性剤、トリアセチン、三リン酸ナトリウム、腐食性アルカ リ、過硼酸塩−水和物漂白前駆物質、及び第三アミン漂白活性化剤を含有し、９ 〜１０の値にｐＨを調整した、非水性洗剤液として処方される洗剤組成物。

ｅ）陰イオン性界面活性剤、及びそれぞれのアルコキシル化度が約７及び約３の 非イオン性界面活性剤混合物、−低又は実質的に零の中性無機塩、リン酸塩ビル グー、過硼酸塩漂白前駆物質、第三アミン漂白活性化剤、珪酸ナトリウム、並び に微量物質及び水分を含有する、少なくとも６００ｇ／ｌの嵩密度を有する顆粒 の形態の洗剤粉末として処方される洗剤組成物。

ｆ）陰イオン性界面活性剤、及びそれぞれのアルコキシル化度が約７及び約３の 非イオン性界面活性剤混合物、低又は実質的に零の中性無機塩、ゼオライトビル グー、過硼酸塩漂白前駆物質、第三アミン漂白活性化剤、珪酸ナトリウム、並び に微量物質及び水分を含有する、少なくとも６００　ｇ／　ｌの嵩密度を有する 顆粒の形態の洗剤粉末として処方される洗剤組成物。

ｇ）陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アクリル酸ポリマー、脂肪 酸石鹸、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、クレー粒子、過硼酸塩漂白前駆物質 、第三アミン漂白活性化剤、珪酸ナトリウム、並びに微量物質及び水分を含有す る、洗剤粉末として処方される洗剤組成物。

ｈ）オルトリン酸で中和し、プロテアーゼと混合し、さらに蟻酸ナトリウム、ホ ウ砂、プロピレングリコール及び硫酸ナトリウムと混合して、次に石鹸製造ライ ンで圧出した、献脂及びココヤシ油のパン−鹸化混合物をベースにした石鹸を含 有する洗剤（石鹸）バーとして処方される洗剤組成物。

ｊ）０．４〜０．８ｇ／Ｉの界面活性剤に相当する率で用いる場合にｐＨ９又は それ未満の洗濯液を生じるように処方される酵素洗剤組成物。

ｋ）０．４〜０．８ｇ／ｌの界面活性剤に相当する率で用いる場合にｐＨ８，５ 又はそれ以上の洗濯液を生じるように処方される酵素洗剤組成物。

１）０．４〜０．８ｇ／Ｉの界面活性剤に相当する率で用いる場合に０．ｏ３又 はそれ未満、例えば０．０２又はそれ未満の洗濯液イオン強度を生じるように処 方される酵素洗剤組成物。

ｍ）０．４〜０．８ｇ／ｌの界面活性剤に相当する率で用いる場合に０．０１又 はそれ以上、例えば０．０２又はそれ以上の洗濯液９２強度を生じるように処方 される酵素洗剤組成物。

以下の実施例並びに添付の請求の範囲により本発明をさらに説明する。

実施例 実施例Ａ１添付の図面の図１〜３、及び図４　（１／７〜７／７）は、適切なｒ 　ＤＮＡ技術による本発明の範囲内のある変異株プロテアーゼの構築、並びにプ ロテアーゼの生成に有用な突然変異化遺伝子、ベクター、並びに突然変異体及び 形質転換化微生物に関する。

実施例Ｂは、実施例Ａのプロテアーゼを含有する洗剤処方物を記載し、その性能 試験結果を示す。

実施例Ｄ１〜Ｄ１４はさらに、本発明のプロテアーゼが好適に混入される洗剤処 方物を記載する。

実施例Ａ： ■＝ 突然変異を遺伝子に導入するための多数の方法は、当業界では十分公知である。

サブチリシン遺伝子のクローニングについての簡単な考察後、サブチリシン遺伝 子内の無作為部位及び特定部位の両方における突然変異の発生方法を考察する。

サブチリシンをコードする遺伝子を、当業界で十分公知の種々の方法により、任 意のグラム陽性細菌又は真菌からクローニングした。先ず、試験すべきサブチリ シンを産生ずる生物からの染色体ＤＮＡ又はメツセンジャーＲＮＡを用いて、Ｄ ＮＡのゲノム及び／又はｃＤＮＡライブラリーを構築した。次に、サブチリシン のアミノ酸配列が公知である場合には、相同の標識化オリゴヌクレオチドプロー ブを合成し、それを用いて細１１ＤＮＡのゲノムライブラリーからの、又は真菌 ｃＤＮＡライブラリーからのサブチリシンコードクローンを同定した。あるいは 、細菌又は真菌の別の株からのサブチリシンと相同の配列を含有する標識化オリ ゴヌクレオチドプローブをプローブとして用いて、ハイブリッド形成及び低緊縮 性の洗濯条件を用いて、サブチリシンコードクローンを同定した。

サブチリシン産生クローンを同定するさらに別の方法は、ゲノムＤＮＡの断片を 発現ベクター、例えばプラスミドに挿入し、その結果生じたゲノムＤＮＡライブ ラリーを用いてプロテアーゼ陰性細菌を形質転換し、ついでスキムミルクのよう なサブチリシン用基買を含有する寒天上で形質転換細菌を平板培養することを包 含する。サブチリシン保有プラスミドを含有する細菌は、排出サブチリシンによ るスキムミルクの消化のために、透サブチリシン遺伝子がプラスミドのような好 適なベクター中で一旦クローニングされると、いくつかの方法を用いて無作為突 然変異を遺伝子に導入できる。１つの方法は、修正可能なべフターの一部として クローン化サブチリシン遺伝子を大腸菌のミューチーター株に組み入れることで ある。

別の方法は、−重鎖形態のサブチリシン遺伝子を生成し、次いで、サブチリシン 遺伝子の一部が一重鎖のままであるようにサブチリシン遺伝子を含有するＤＮＡ の断片を別のＤＮＡ断片とアニーリングすることを包含する。次に別々の一重鎖 領域を、重亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、蟻酸、又はヒドラ ラジンを含めた、しかしこれらに限定されない任意の多数の突然変異誘発剤に曝 露した。無作為突然変異を発生させるためのこの方法の特定の例は、５ｈｏｒｔ ｌｅとＮａｔｈａｎｓ　（１９７８，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、Ｕ。

Ｓ、Ａ、、７５　：　２１７０−２１７４）１．ｍ記載されテイル。５ｈｏｒｔ ｌｅとＮａｔｈａｎｓの方法によって、遺伝子内で切断する制限酵素により、サ ブチリシン遺伝子を有するプラスミドをニック化した。ＤＮＡポリメラーゼ■の エキソヌクレアーゼ作用を用いて、このニックをギャップ中に広げた。その結果 生じた一重鎖ギャップを次に上記の突然変異誘発剤のいずれかを用いて突然変異 化した。

あるいは、天然プロモーター及び他の調節配列を含むＢａａｉ１１ｕｓ種からの サブチリシン遺伝子を、大腸菌及びＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓの両者のためのレプリ コーン、選択可能な表現型マーカー、及びヘルパーファージ　ＩＲＩによる超感 染時の一重鎮ブラスミドＤＮＡの産生のためのＭ１３複製起源を含有するプラス ミドベクター中にクローニングした。クローン化サブチリシン遺伝子を含有する 一重鎖ブラスミドＤＮＡを単離し、ベクター配列は含有するがサブチリシンのコ ード領域は含有しないＤＮＡ断片とアニーリングし、ギャップ化二重鎖分子を得 た。重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸又は蟻酸を用いて、あるいは上記のような大腸 菌のミューチーター株中での複製により、突然変異をサブチリシン遺伝子中に導 入した。重亜硫酸ナトリウムは一重鎖ＤＮＡのシトシンともっばら反応するため 、この突然変異誘発物質によって生じる突然変異はコード領域のみに制限される 。反応時間及び重亜硫酸濃度は、サブチリシン遺伝子当たり平均１〜５個の突然 変異が生じるように異なる実験で変わる。４００マイクロリツトルの反応容量で ３７℃で９分間、４Ｍ　重亜硫酸ナトリウム、ｐＨ６，０中でギャップ化二重鎖 ＤＮＡ　１０Ｍｇをインキュベートとすると、−重鎖領域の約１％のシトシンが 脱アミノ化される。成熟サブチリシンのコード領域は、ＤＮＡ鎖に応じて、約２ ００個のシトシンを含有する。

反応時間を約４分（２００個中約１個の突然変異頻度を生じる）から約２０分（ ２００個中約５個）に変えると有益である。

突然変異誘発後、ギャップ化分子をＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片） でｉｎ　ｖｉｔｒｏ処理して、完全二重鎖分子を作り、突然変異を固定した。次 にコンピテント大腸菌を突然変異誘発物質処理ＤＮＡで形質転換して、突然変異 体サブチリシンの増幅ライブラリーを生成した。増幅突然変異体ライブラリーは 、そのエラーを起こしやすいＤＮＡポリメラーゼのために突然変異の範囲を増大 する大腸菌のＭｕｔ　Ｄ株中でプラスミドＤＮＡを増殖させても作製し得る。

突然変異体ライブラリーを作るには、突然変異誘発物質である亜硝酸及び蟻酸を 用いてもよい。これらの化学物質は重亜硫酸ナトリウムはど一重鎖ＤＮＡに特異 的でないため、突然変異誘発反応は以下の手順で実施した。標準的方法によりサ ブチリシン遺伝子のコード部分をＭ１３ファージ中でクローニングし、−重鎖フ ァージＤＮＡを調製した。次に一重鎖ＤＮＡを１Ｍ亜硝酸、ｐＨ４，３と２３℃ で１５〜６０分、又は２．４Ｍ蟻酸と２３℃で１〜５分反応させた。これらの範 囲の反応時間による突然変異頻度は１／１０００〜５／１０００であった。

突然変異誘発後、ユニバーサルブライマーをＭ１３　ＤＮＡにアニーリングし、 サブチリシン遺伝子のコード部分が完全に二重鎖となるように鋳型として突然変 異化−重鎖ＤＮＡを用いて二重鎖ＤＮＡを合成した。この部分で、制限酵素を用 いてコード領域をＭ１３ベクターから切り離し、制限断片だけに突然変異が起き る様に未突然変異化発現ベクターに連結できる（Ｍｙｅｒｓ　ｅｔ　ａ！、、５ ｃｉｅｎｃｅ　２２９　（１９８５）２４２−２５７）。

サブチリシン遺伝子が一部クローン化されると、突然変異に望ましい部位が同定 され、合成オリゴヌクレオチドを用いてこれらの突然変異を導入できる。÷れら のオリゴヌクレオチドは、所望の突然変異部位や側面に位置するヌクレオチド配 列を含有する：突然変異体ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成中に好ましい 方法において、サブチリシン遺伝子を架橋するＤＮＡの一重鎖ギャップをサブチ リシン遺伝子を有するベクター中に作った。次に、所望の突然変異を有する合成 ヌクレオチドを一重鎖ＤＮＡの相同部分にアニーリングした。次に残りのギャツ ブをＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）で充填し、Ｔ４リガーゼを用い て構築物を連結した。この方法の特定の例は、Ｍｏｒｉｎａｇａら（Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ　２（１９８４））に記載されている。Ｍ　ｏ　ｒ　ｉ　ｎ　 ａ　ｇ　ａらにより、遺伝子内の断片を制限エンドヌクレアーゼを用いて除去し た。

ここでギャップを含有するベクター／遺伝子を次に変性し、ギャップを含有する 代わりにギャップ中に含まれる領域外の部位で別の制限エンドヌクレアーゼで切 断されたベクター／遺伝子にハイブリダイズした。次いで遺伝子の一重鎖領域を 用いて突然変異化オリゴヌクレオチドとノーイブリッド形成し、残りのギャップ をＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片で充填し、挿入体をＴ４ＤＮＡリガ ーゼで連結し、そして１サイクル複製後、所望の突然変異を有する二重鎖プラス ミドを生成した。Ｍｏｒｉｎａｇａ法は新しい制限部位を構築するさらなる操作 が不要であり、したがって多数の部位での突然変異の発生が促される。

米国特許第４．７６０．０２５号（Ｅｓｔｅｌｌら）は、カオリゴヌクレオチド の導入方法を示しているが、しかしながら種々の長さの多数のオリゴヌクレオチ ドを導入し得るために、意の時期に導入できる。

本発明を実施する場合、上記と同様の方法で、又は当業界に公知の任意の別の方 法で上記のような突然変異化サブチリシン遺伝子を生成し、発現ベクターを用い て、酵素形態で発現し得る。発現ベクターは通常典型的クローニングベクターの 成分、即ち微生物のゲノムとは関係なく微生物中でのベクターの自律的複製を可 能にする要素、及び選択のための１つ又はそれ以上の表現型マーカーを含有する ため、発現ベクターは一般にクローニングベクターの定義が当てはまる。発現ベ クターは、プロモーター、オペレーター、リポソーム結合部位、翻訳開始シグナ ル、及び任意にレプレッサー遺伝子又は種々のアクチベーター遺伝子をコードす る調節配列を含有する。

発現タンパク質を分泌させるために、“シグナル配列”をコードするヌクレオチ ドを遺伝子のコード配列の前に挿入する。

調節配列の指示下での発現のために、本発明により処理される標的遺伝子を操作 できるように適切な読み取り枠内の調節配列に結合する。プラスミドベクター中 に組み込まれ、突然変異体サブチリシン遺伝子の転写を支持するプロモーター配 列は、原核生物ベータラクタマーゼプロモーター（Ｖ　ｉ　Ｉ　Ｉ　ａ−Ｋａｍ ａｒｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　 ７５　（１９７８）３７２７−３７３１）　、及びｔａＣプロモーター（ＤｅＢ ｏｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０　（１９８３）２１−２５）を含有す るが、これらに限定されない。さらに、”Ｕｓｅｆｕｌｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒ ｏｍ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ”、ｉｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆ ｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、２４２　（１９８０）７４−９４にも参照が見出され る。

一実施態様によって、突然変異化ＤＮＡを有する発現ベクターによりＢ、５ｕｂ ｔｉｌｉｓを形質転換した。発現がＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓのような分泌性微生物 で起きた場合には、ジグ先行する。シグナル配列は発現産物を、分泌時にはそれ が産物から切り離される細胞壁に輸送するよう作用する。上記の“調節配列”と いう用語は、それが存在する場合、シグナル配列を包含するよう意図される。

ｌ　■　： 本発明の実施態様にしたがって野生型及び変異型プロテアーゼ酵素をコードする ために遺伝子を構築し、発現するための目下好ましい方法を示す以下の実施例で は、下記の物質を言及する： Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　３０９及び１４７はＢａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓの 変異株で、受託番号ＮＣＴＢ１０１４７及びＮＣｒＢ１０３０９でＮＣ■Ｂに寄 託されており、米国特許第３．７２３．２５０号に記載されており、その記載内 容は参考として本明細書中に含めるものとする。

大腸菌ＭＣ１０００（Ｍ、Ｊ、Ｃａ５ａｄａｂａｎ　ａｎｄ　Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅ ｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１３８　（１９８０）１７９−２０７）を通常の方 法によりｒ−ｍ＋としたが、これは米国特許出願第０３９．２９８号に記載され ている。

サブチリシン３０９及びその突然変異体をコードする合成遺伝子に適合するベク ターを構築した。それは本質的にｐＵｃ１９プラスミドで（Ｃ，Ｙａｎｉｓｈ− Ｐｅｒｒｏｎ　ａｎｄＪ、Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ　３３（１９８５）１０３ −４１９参照）、この場合、多数のクローニング部位を、遺伝子を構築する５つ の亜断片を分離するために用いられる制限部位を含有するリンカ−と置換した。

新リンカ−をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｌＩＩ切断ｐＵｃ１９中に挿入し、それによ りこれらの部位を破壊した。

サブチリシン３０９の成熟部分をコードする合成遺伝子を以下の説明及び添付の 図面の図４（シート１／７〜７／７）に示されているように構築した。合成遺伝 子の構造はシート１／７〜４／７に要約しであるが、これは構築に用いる断片を 示す。

６〜１２個のオリゴヌクレオチドから各亜断片を作った。制御ガラス支持体上で ホスホアミダイト法を用いて自動ＤＮＡ合成器でオリゴヌクレオチドを合成した （Ｓ、Ｌ、７３　ｅ　ａ　ｕ　ｃ　ａ　ｇｅ　ａｎｄ　Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｒｕｔｈ ｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ２２（１９８１）１８５９− １８６９　参照）。図中のオリゴヌクレオチドの５°　−末端中のドツトは、こ れらのオリゴヌクレオチドがリン酸化されたことを示すための手段である。９０ ℃で５分加熱し、その後７５分間に亘って室温に冷却することによりオリゴヌク レオチドの対応する対から二重鎖（シート１／７〜４／７に示す）を形成した。

二重鎖を混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで処理した。

５つの亜断片を２％アガロースゲル上で単離し、ｐｓＸ１９１に挿入した。ジデ オキシヌクレオチド　シーケンシングにより配列を立証した。断片Ａ−Ｅを単離 し、Ｋｐｎｌ−ＢａｍＨ■切断ｐＸｓ１９１と一緒に連結した。連結混合物を用 いて、アンピシリン耐性を選択するコンピテント大腸菌ＭＣ１００Ｏｒ−、ｍ＋ を形質転換した。次に、酵素の成熟部分をコードするサブチリシン３０９遺伝子 の一部を構成するｓｓｏｂｐＫｐｎｌ−ＢａｍＨＩ断片を用いて、ｐｓＸ２１２ 上の野生型遺伝子を置換してｐｓＸ２２２を生じ、次にこれをコンピテントＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ　５Ｈａ２７３に形質転換した。形質転換株の発酵及び酵素の 精製後、生成物質は野生型産物量と区別できないことが示された。

合成遺伝子由来のプロテアーゼ変異体を、突然変異が望ましい場所に配列変更を 有する（例えば下記のような配列を有する）オリゴヌクレオチドを用いて、それ らを合成遺伝子に適した残りのオリゴヌクレオチドと混合することにより作製し た。変異体遺伝子のアッセンブリーは、上記の方法と同様の別の方法で変異体物 質を用いて実施した。合成遺伝子に関するさらなる情報は、一般にＡｇａｒｖａ ｌ　ｅｔ　ａｔ、、Ｎａｔｕｒｅ２２７　（１９７０）２７−３４から入手でき る。

Ｋｐｎ１部位を、酵素の成熟部分をコードするサブチリ９２３０９合成遺伝子の 開始部に導入した。用いた方法はオリゴヌクレオチド特異的二重鎖破損修復突然 変異誘発と呼ばれ、Ｗｌｏｄｅｋ　Ｍａｎｄｅｃｋｉ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃ ａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３　（１９８６）７１７７−７１８１に記載されている。ｐ ｓＸ１７２をサブチリシン３０９遺伝子の成熟部分の開始部でＮｃｏｌを用いて 開環し、２個の塩基を変え、アミノ酸配列は変えずに、Ｋｐｎ１部位をＮｃｏｌ の前の右に導入した。ｐｓＸ１７２は欧州特許出願公開第４０５，９０１号に記 載されている。そのようにして作られたＫｐｎＩ部位を４００ｂｐ　Ｐｖｕ［− ＮｈｅＩ断片上のｐ　Ｓ　Ｘ　１２０　ニ挿入して、ｐｓＸ２１２を得た。ｐｓ Ｘ１２０も欧州特許出願公開第４０５．９０１号に記載されている。

合成遺伝子をｐｓＸ２１２上のＫｐｎｌ及びＢａｍＨＴ間に挿入して、ｐｓＸ２ ２２を得た。

その結果束じた生成物質をオリゴヌクレオチド　Ｎ０Ｒ７８９（図４　（７／７ ）に示す配列）と混合し、１００℃に加熱して、０℃に冷却し、大腸菌中に形質 転換した。再形質転換後、３２−Ｐ−標識化　Ｎ０Ｒ７８９を用いたコロニーハ イブリツド形成により組換え体をスクリーニングした。

突然変異及び対応するオリゴヌクレオチドの例を以下に示す：Ａ２−０２−／Ａ ３−０１：に２７Ｒ；　Ｂ１−０２：Ｅ５４Ｄ、Ｂ４−０３：Ｙ９１Ｆ、に９４ Ｒ；　Ｄｉ−０１／Ｄ２−０２：Ｙ１６７Ｅ、Ｙ１７１Ｖ；　Ｄ３−０４：Ｙ１ ９２Ｅ；Ｄ４−０１／Ｄ５−０１：Ｙ２Ｏ９Ｆ、Ｙ２１４Ｔ；　Ｅ２−０１：に ２３５Ｒ，に２３７Ｒ；　Ｅ３−０１：に２５１Ｅ；Ｅ４−０２　：Ｙ２６３Ｆ ０２６３Ｅに記載の突然変異の導入に適したこのようなオリゴヌクレオチドは、 例えば以下の配列を有する： に２７Ｒ（Ａ２及びＡ３間で重複） Ｅ５４Ｄ　（断片Ｂ１） 皿Ｉ凹（断片［１４１ １！、ｕユｔｖ　（ＩＩＩｒ芹Ｄｉ　、６多ｖｒｏ２）広２旦（断片　０１％“ ７ｓｉ’Ｄ２１ｘＸ２２Ｘｔ断片０３１ ｎｉλＥ（ＩＸＩマｆｒｏコ） 況ｙ迅、浜工本（断片　Ｅ２１ 広ユ（ばＨ片　１ｊｌ に（断片　Ｅ４１ これらのオリゴヌクレオチドを、変化していない合成遺伝子からのオリゴヌクレ オチドの残りと組み合わせた。突然変異化断片Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥを、構築中の変 異体に必要な変化が認められない断片Ｃと連結した。

ＩＩＩ： 同様の方法で、サブチリシン　１４７をベースにした対応する変異体を作り、形 質転換化Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓを発酵させて、後処理し、望ましい酵素を精製し た。

■　ｖ　： 以下の適用可能な精製方法は、サブチリシン１４７酵素、サブチリシン３０９酵 素又はその突然変異体の１０リツトル規模の発酵の一般的精製に関する。

約８リツトルの発酵ブロスを１リツトル　ビーカー中で５０ＱＱｒｐｍで３５分 遠心分離した。１０％酢酸を用いて上清をｐＨ６，５に調整し、５ｅｉｔｚ　５ ｕｐｒａＳ１００フイルタープレート上で濾過した。

Ａｍ１ｃｏｎ　５ＩＹＩＯＵＦカートリッジを装備したＡｍ１ｃｏｎ　ＣＨ２Ａ 　ＵＦユニットを用いて濾液を約４００ｍ１に濃縮した。ＵＦ濃縮物を遠心分離 し、濾過して、その後、ｐＨ７でＢａｃ　ｉ　ｔ　ｒａｃ　ｉｎ　アフィニティ ーカラム上で室温で吸収させた。Ｏ，ＯＩＭ　ジメチルグルタル酸、０．１Ｍホ ウ酸、及び０．００２Ｍ　塩化カルシウムを含有し、ｐＨ７に調整した緩衝液に 溶解した２５％　２−プロパツール及びＩＭ　塩化すトリウムを用いてプロテア ーゼをＢａｃｉｔｒａｃｉｎカラムから溶離した。

Ｂａａ　ｉ　ｔ　ｒａｃ　ｉｎ精製工程からのプロテアーゼ活性を有する両分を 併合し、０．０１Ｍ　ジメチルグルタル酸、０．２Ｍ　ホウ酸、及び０．００２ Ｍ　塩化カルシウムを含有し、ｐＨ６，５に調整した緩衝液で平衡化した７５０ ｍ１の５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５カラム（直径５ｃｍ）に載置した。

５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５カラムからのタンパク質分解活性を有する画分を併合 し、Ｏ，ＯＩＭ　ジメチルグルタル酸、０゜２Ｍ　ホウ酸、及び０．００２Ｍ　 塩化カルシウムを含有し、ｐＨ６，５に調整した緩衝液で平衡化した１５０ｍ１ のＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　６Ｂ　陽イオン交換カラム（直径５ｃｍ）に 載置した。

同一緩衝液　２リツトルに溶解したＯ〜０．１Ｍ　塩化ナトリウムの直線勾配を 用いて、プロテアーゼを溶離した（サブチリシン　１４７の場合は０〜０．２Ｍ 　塩化ナト１ノウム）。

最終精製工程において、ＣＭ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ力ラムカＡらのプロテアーゼ 含有画分を併合し、ＧＲ８１ＰＰ膜（Ｄａｎｉｓｈ　Ｓｕｇａｒ　Ｆａｃｔｏｒ ｉｅｓ　ｔｎｃ、）を装備したＡｍ１ｃｏｎ限外濾過セル中で濃縮した。

実施例Ｂ： 本発明のプロテアーゼ及び洗剤組成物の０（つかの代表的な例の滴定曲線及び洗 浄性能を以下に示す：実施例Ａに記載の方法により生成された突然変異体プロテ アーゼ酵素Ａ、Ｂ及びＣを調べた。それらのアミノ酸量７１　ｉ！サブチリシ゛ ン３０９の配列に対応し、以下の突然変異を伴った：Ｂ：　Ｋ２３５Ｒ＋に２３ ７Ｒ＋に２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ；Ｃ：　Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋に９４Ｒ；それら の算出滴定曲線を、サブチリシン３０９唇こ関する曲線と一緒に図１に示す。

さらに次の突然変異体に関して算出した滴定曲線を図１〜３に示す： Ｄ：　Ｋ２７Ｒ＋Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋に９４Ｒ＋Ｙ２Ｏ９Ｆ＋Ｙ２１４Ｔ＋に ２３５　Ｒ＋に２３７Ｒ＋に２５１　Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ： Ｅ：　Ｋ２７Ｒ＋Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋に９４Ｒ＋Ｙ１６７Ｆ＋Ｙ１７１Ｖ＋Ｙ １９２Ｆ＋Ｙ２Ｏ９Ｆ＋Ｙ２１４Ｔ＋に２３５Ｒ＋に２３７Ｒ＋に２５１Ｅ＋Ｙ ２６３Ｆ；Ｆ：　突然変異体Ｅと同様。但し、Ｄ残基の電荷を付加する２つのさ らなる突然変異とＥ残基の電荷を付加する１つの突然変異を有する： Ｇ：　突然変異体Ｆと同様。但し、１７．３９．１２０．２２６位置のヒスチジ ンの中性残基への突然変異をさらに有する：Ｈ：　突然変異体Ｇと同様。但し、 Ｎ−末端が化学的に修飾されて（ブロックされて）中性基を与える。

突然変異体酵素のタンパク質分解活性は、Ｎｏｖａ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ、 Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋから入手したＮｏｖｏ　Ｐｕｂｌｉｃａｔ ｊｏｎ　ＡＦ　２２０−ｇｂ（又はその後の版）（この記載内容は参考として本 明細書中に含めるものとする）に記載のジメチルカゼイン（ＤＭＣ）法により検 定した。

以下の洗剤系で、洗濯試験を実施した：洗濯液は、下記の洗剤処方物（重量％） から得られる２０℃の０．８３ｇ／Ｉ溶液であった： 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム　２５ゼオライト　Ａ　２２ 珪酸ナトリウム　５ 硫酸ナトリウム　４ ポリエチレングリコール　２ 炭酸ナトリウム　１７ 草汁を入れたＭａｔｈｉｓ　洗濯乾燥ユニットＴＨ型（Ｗｅｒｎｅｒ　Ｍａｔｈ ｉｓ　ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）中の容器に裁断した木綿 （綿１００％、ＤＳ７１）布を通して、試験布（２，２ｃｍｘ２．２ｃｍ、約０ ．１ｇ）を作った。最後に布を強空気流で室温で乾燥させて、室温で３週間保存 し、次いで一１８℃に保持した後に使用した。

試験はすべて、モデルミニ洗濯系で実施した。この系で、６種類の試験布を、洗 剤溶液６０ｍ１を入れた１５０ｍ１ビーカー中で洗浄した。ビーカーを磁気攪拌 しながらサーモスタット水浴中で２０℃に保持した。

洗濯は１０分間実施し、洗濯後、バケツの中で水道流水で２５分間、布をすすい だ。

次に、布を一夜（日光から保護するために）風乾し、反射率ＲをＥＬＲＥＰＨＯ ２０００光度計（ＤａｔａｃｏｌｏｒＳ、Ａ、、Ｄｉｅｔｋｉｋｏｎ、Ｓｗｉ　 ｔｚｅｒｌａｎｄ）で４６０ｎｍで測定した。

洗濯性能の測定値として異なる反射率　デルタＲ（＝酵素を添加して洗濯後の反 射率−酵素を添加しないで洗濯後の反射率）を用いた。

用量一応答曲線から改良因子を算出したが、これは当該野生型酵素と比較した場 合に所定のデルタＲ値を得るのに必要な酵素の量に関連する。ここで、酵素の性 能を゛野生型°サブチリシン３０９　（’　ｗｔ’　）と比較した。例えば、「 ２」の改良因子は、同一デルタＲ値を得るには半量の酵素しか必要でないことを 示す。

結果を以下に示す： １琢　１０．Ｉ Ａ　１０．２　＜１　＜１　２．３　Ｌ３Ｂ　９．６　１４　１．３　３．６　 １．９Ｃ１０，４＜１　＜１　１．８　２−２ａ＋ｃｉ’　１０＋Ｌ　Ｌ２　Ｌ ４　１．４　１．０これらの突然変異体プロテアーゼの好ましい例はプロテアー ゼＢであって、野生型酵素に比して最小浸漬滴定曲線（ｔｈｅｌｅａｓｔ　５ｔ ｅｅｐ　ｔｉｔｒａｔｉｏｒ　ｃｕｒｖｅ）及び最大改良因子を示す。

さらに以下の実施例は本発明の洗剤処方物を示すが、これらに限定されない： 洗剤　Ｄ１ニ リン酸塩ビルダーを含有する本発明の一実施態様の洗剤粉末を、以下のものを含 有するように処方した：全活性洗剤約１６％、隘イオン性洗剤　約９％、非イオ ン性洗剤　約６％、リン酸塩含有ビルダー　約２０％、アクリル酸ポリマー又は 等価のポリマー　約３．５％（あるいは約２％に下げる）、過硼酸塩漂白前駆物 質　約６〜１８％、あるいは約１５〜２０％、アミノ含有漂白活性化剤　約２％ 、珪酸塩又は他の構造化剤　約３゜５％、あるいは約８％まで、約８グリシン単 位／ｍｇ活性の酵素、使用時に所望のｐＨに調整するためのアルカリ、中性無機 塩、及び酵素（約０．５％ずつの酵素）。

陰イオン性洗剤は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、あるいは直鎖アル キルベンゼンスルホン酸ナトリウム　６％と第一アルキル硫酸塩　３％の混合物 であった。非イオン性洗剤は、１ｍｏｌ当たり７個のエトキシレート残基を有す る約０１３〜Ｃ１５第一アルコールのエトキシレートであった。リン酸塩ビルダ ーは、トリポリリン酸ナトリウムであった。ポリマーは、ポリアクリル酸、ある いはアクリル酸／マレイン酸コポリマーであった。過硼酸塩漂白前駆物質は四硼 酸ナトリウム四水和物又は−水和物であった。活性化剤は、テトラアセチルエチ レンジアミンであった。構造化剤は、珪酸ナトリウムであった。

中性無機塩は、硫酸ナトリウムであった。酵素は上記のプロテアーゼＢを包含し た。

洗剤　Ｄｌａニ リン酸塩ビルダーを含有する本発明の一実施態様の洗剤粉末を、以下のものを含 有するように処方した：全活性洗剤約１５％、隘イオン性洗剤　約７％、非イオ ン性洗剤　約６％、リン酸塩含有ビルダー　約２５％、アクリル酸ポリマー又は 等価のポリマー　約０．５％、過硼酸塩漂白前駆物質　約１０％、アミノ含有漂 白活性化剤　約２％、珪酸塩又は他の構造化剤　約６％、約８グリシン単位／　 ｍ　ｇ活性のプロテアーゼ酵素、使用時に所望のｐＨに調整するためのアルカリ 、中性無機塩、及び酵素（約０．５％ずつの酵素）。

陰イオン性洗剤は、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムであった。非イ オン性洗剤は、１ｍｏｌ当たり７個のエトキシレート残基を有する約Ｃ１３〜Ｃ １５第一アルコールのエトキシレート、又はこれと１ｍｏ　１当たり３個の残基 という程度にエトキシル化された対応するアルコールとの混合物であった。リン 酸塩ビルダーは、トリポリリン酸ナトリウムであった。

過硼酸塩又は過酸漂白前駆物質は四硼酸ナトリウム四水和物であった。活性化剤 は、テトラアセチルエチレンジアミンであった。構造化剤は、珪酸ナトリウムで あった。中性無機塩は、硫酸ナトリウムであった。酵素は上記のプロテアーゼＢ を包含した。

洗剤　Ｄ２： ゼオライトビルダーを含有する本発明の一実施態様の洗剤粉末を、以下のものを 含有するように処方した：全活性洗剤　約１６％、陰イオン性洗剤　約９％、非 イオン性洗剤約６％、ゼオライト含有ビルグー　約２０％、アクリル酸ポリマー 又は等価のポリマー　約３．５％、過硼酸塩漂白前駆物質　約６〜１８％、アミ ノ含有漂白活性化剤　約２％、珪酸塩又は他の構造化剤　約３，５％、あるいは 約２．５％に下げる、約８（あるいは約１５）グリシン単位／ｍｇ活性の酵素、 使用時に所望のｐＨに調整するためのアルカリ、中性無機塩、及び酵素（約０゜ ５％ずつの酵素）。

陰イオン性洗剤は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、あるいは直鎖アル キルベンゼンスルホン酸ナトリウム　６％と第一アルキル硫酸塩　３％の混合物 であった。非イオン性洗剤は、１ｍｏ１当たり７個のエトキシレート残基を有す る約０１３〜Ｃ１５第一アルコールのエトキシレートであった。ゼオライトビル ダーは、Ａ型ゼオライトであった。ポリマーは、ポリアクリル酸であった。過硼 酸塩漂白前駆物質は四硼酸ナトリウム四水和物又は−水和物であった。活性化剤 は、テトラアセチルエチレンジアミンであった。構造化剤は、珪酸ナトリウムで あった。中性無機塩は、硫酸ナトリウムであった。酵素は上記のプロテアーゼＢ を包含した。

洗剤　Ｄ２ａ＋ ゼオライトビルダーを含有する本発明の一実施態様の洗剤粉末を、以下のものを 含有するように処方した：全活性洗剤　約１４％、陰イオン性洗剤　約７％、非 イオン性洗剤約７％、ゼオライト含有ビルグー　約２５％、アクリル酸ポリマー 又は等価のポリマー　約３％、過硼酸塩又は過酸漂白前駆物質　約１０％、アミ ノ含有票白活性化剤　約２％、珪酸塩又は他の構造化剤　約０．５％、約６グリ シン単位／ｍｇ等級の酵素、使用時に所望のｐＨに調整するためのアルカリ、中 性無機塩、及び陰イオン性洗剤は、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム であった。非イオン性洗剤は、１ｍｏ１当たりそれぞれ７及び３個のエトキシレ ート残基を有する約Ｃ１３〜Ｃ１５第一アルコールのエトキシレートの混合物で あった。ゼオライトビルダーは、Ａ型ゼオライトあった。ポリマーは、アクリル 酸／マレイン酸コポリマーであった。過硼酸塩漂白前駆物質は四硼酸ナトリウム −水和物であった。活性化剤は、テトラアセチルエチレンジアミンであった。構 造化剤は、珪酸ナトリウムであった。中性無機塩は、硫酸ナトリウムであった。

酵素は上記のプロテアーゼＢを包含した。

洗剤　Ｄ３： 本発明の一実施態様の水性洗剤液を、以下のものを含有するように処方したニド デシルベンゼンスルホン酸　１６％、７ｍｏ１／ｍｏｌ　エチレンオキシドと縮 合したＣ１２〜Ｃ１５直鎮アルコール　７％、モノエタノールアミン　２％、ク エン酸６．５％、キシレンスルホン酸ナトリウム　６％、水酸化ナトリウム　約 ４．１％、プロテアーゼ０．５％、全量を１００％とする微量物質及び水。ｐＨ は９〜１ｏの値に調整した。酵素は上記のプロテアーゼＢ及び／又はＣを包含し た。

洗剤　Ｄ４： 本発明の一実施態様の非水性洗剤液を、以下のものを用いて処方した：　４．９ ｍｏ　Ｉ／ｍｏ　ｌ　エチレンオキシド及び２゜７ｍｏｌ／ｍｏｌ　プロピレン オキシドでアルコキシル化したＣ１３〜Ｃ１５直鎖第一アルコール　３８．５％ 、トリアセチン　５％、三リン酸ナトリウム　３０％、ソーダ灰　４％、少量の オキソボレートを含有する過硼酸ナトリウム−水和物　１５．５％、ＴＡＥｏ　 ４％、ＥＤＴＡ　Ｏ，２５％（コノうちホスホン酸　０．１％）、Ａｅｒｏｓｉ ｌ　Ｏ，６％、ＳＣＭｏ　１％、及びプロテアーゼ　０．６％。ｐＨは９〜１ｏ の値、例えば約９．８に調整した。酵素は上記のプロテアーゼＢ及び／又はＣを 包含した。

洗剤　Ｄ５： 本発明の一実施態様の洗剤粉末を、以下のものを含有し、少なくとも６００ｇ／ ｌの量密度を有する顆粒の形態に処方した・界面活性剤　約２０重量％（このう ち１０％はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムで、残りは５ｙｎｐｅｒｏｎ ｉｃ　Ａ７と５ｙｎｐｓｒｏｎｉｃ　Ａ３の混合物（約５．５％対４゜５９６） であった）、写生性（−）ｅｒｏ　ｎｅｕｔｒａｌ）無機塩（例えば硫酸ナトリ ウム）＋リン酸塩ビルダー　約３３％、過硼酸ナトリウム四水和物　約１６％、 ＴＡＥＤ活性化剤　約４．５％、珪酸ナトリウム　約６％、炭酸ナトリウム　約 ２％を含む微量物質、並びに含水量　約１０％。酵素（約０．５％ずつの酵素） を包含した。酵素は上記のプロテアーゼＢを包含した。

洗剤　Ｄ６： 本発明の一実施態様の洗剤粉末を、以下のものを含有し、少なくとも６００ｇ／ ｌ、あるいは約５５０　ｇ／　Ｉの量密度を有する顆粒の形態に処方した：界面 活性剤　約２０重量％、あるいは約１６重量％に下げる（このうち約９％、ある いは約７％はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、あるいは直鎖アルキルベ ンゼンスルホン酸ナトリウムで、残りは５ｙｎｐｅｒ。

ｎｉｃ　Ａ７と５ｙｎｐｅｒｏｎｉｃ　Ａ３（又は同様のエトキシレート）の混 合物（それぞれ約５％と６％、あるいは約４％と７％）であった）、写生性無機 塩（例えば硫酸ナトリウム）＋ゼオライトビルグー　約３０％、あるいは約２５ ％、過硼酸ナトリウム四水和物、あるいは−水和物　約１４％又は１５％、ＴＡ ＥＤ活性化剤　約３．６％、炭酸ナトリウム　約９％、又は１５％まで、Ｄｅｑ ｕｅｓｔ　２０４７　約０．７％を含む微量物質、並びに含水量　約１０％。酵 素（約０．５％ずつの酵素、又はリパーゼ　約０．２％とプロテアーゼ　約０． ７％）を包含した。酵素は上記のプロテアーゼＢを包含した。

洗剤　Ｄ６ａ： 本発明の一実施態様の洗剤粉末を、以下のものを含有し、少なくとも６００　ｇ ／　１の量密度を有する顆粒の形態に処方した：界面活性剤　約１５重量％（こ のうち約７％は直鎮アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムで、２％は第一アル コール硫酸塩、残りは５ｙｎｐｅｒｏｎｉｃ　Ａ７又は同様のエトキシレートで あった）、写生性無機塩（例えば硫酸ナトリウム）＋ゼオライトビルグー　約２ ２％、過硼酸ナトリウム四水和物　約１５％、ＴＡＥＤ活性化剤　約７％、炭酸 ナトリウム　約１５％、Ｄｅｑｕｅｓｔ　２０４７　約０．７％を含む微量物質 、並びに含水量　約１０％。酵素（約１．２％）は上記のプロテアーゼＢを包含 した。

洗剤　Ｄ７： 本発明の一実施態様の洗剤粉末を、以下のものを含有するように処方したニドデ シルベンゼンスルホン酸　６％、７　ｍ　ｏ　１／　ｍ　ｏ　＋　エチレンオキ シドと縮合したＣ１２〜Ｃ１５直鎖アルコール　５％、脂肪酸石鹸　３％、５ｏ ｋｏｌａｎ　ＣＰ５ポリマー　３％、ゼオライト　Ａ　２２％、炭酸ナトリウム １０％、硫酸ナトリウム　１７％、クレー粒子　８％、過硼酸ナトリウム四水和 物　１３％、テトラアセチルエチレンジアミン　２％、プロテアーゼ　０．５％ 、全量を１００とする微量物質及び水。ｐＨは９〜１０の値に調整した。プロテ アーゼ酵素は上記のプロテアーゼＢを包含した。

洗剤　Ｄ８： 本発明の一実施態様の洗剤（石鹸）バーを、以下のものを用いて処方した： オルトリン酸０．１５％で中和し、プロテアーゼ（バー組成物の約８　Ｇ　Ｕ　 ／　ｍ　ｇ　）と混合し、さらに蟻酸ナトリウム　２％、ホウ砂　２％、プロピ レングリコール　２％及び硫酸ナトリウム　１％と混合して、次に石鹸製造ライ ンで圧出した、酸脂８２％及びココヤシ油　１８％のパン−鹸化混合物をベース にした石鹸。プロテアーゼ酵素は上記のプロテアーゼＢ及び／又はＣを包含した 。

洗剤　Ｄ９： 構造化液体洗剤は、本明細書に記載のプロテアーゼの他に例えば以下のものを含 有し得る：非イオン界面活性剤２〜１５％、全界面活性剤　５〜４０％（非イオ ン性及び任意に陰イオン性界面活性剤を包含）、リン酸塩含有又はリン酸塩非含 有ビルグー　５〜３５％、高分子増粘剤、例えば分子量が１０６を超える架橋ア クリルポリマー　０．２〜０．８％、珪酸ナトリウム、例えば中性水ガラス（ｗ ａｔｅｒ　ｇｌａｓｓ）として少なくとも１０％、所望のｐＨ，好ましくは９〜 １０又はそれ以上の範囲に、例えばｐＨ１１以上にｐＨを調整するためのアルカ リ（例えばカリウム含有アルカリ）で、ナトリウム陽イオン：珪酸塩陰イオン（ 遊離シリカとして）（重量％）の比が０．７：１未満であり、粘度が０．３〜３ ０Ｐａｓ　（２０℃、２０ｓ−’）である。

好適な実施例は、１分子当たり約５ＥＯ基で、及び１ｍｏ　ｌ当たり約２．７Ｐ Ｏ基でアルコキンル化された非イオン性界面活性剤Ｃ１３〜１５アルコール　約 ５％、シリカと酸化ナトリウムとの間の重量比が３．５である中性水ガラス　１ ５〜２３％、ＫＯＨ１３〜１９％、５ＴＰＰ　８〜２３％、炭酸ナトリウム　０ 〜１１％、Ｃａｒｂｏｐｏｌ　９４１　０．５％を含有する。　プロテアーゼは 、例えば上記のプロテアーゼＢを０．５％で混入し得る。

洗剤　Ｄｌｏ： 洗濯用に適した構造化粘性水性液体洗剤を以下のように処方した（重量％）： クエン酸　２．５ Ｂｏｒａｘ　（１０ａｑ）　’　”　４Ｃｌ　４−’ＣＩ　５　直鎖アルキルへ ゛ンセ゛ンスル本ン酸塩又は　Ｃｌ４−Ｃｌ３　第一′アルコールミ酸塩　゛　 ”６．５Ｓ　７’ｎ　ｐ　ｅ　ｔ　ｏ　ｎ　ｉ　ｃ　＾３　非イオン　Ｃｌ２− ［：１５’３ＥＯ’　１　、　２Ｓ７ｎｐｅ＋ｏｎｉｅ　＾７　非イオン　Ｃ’ ＋２−ｃｔ５　７ＥＯ’　３　、６ゼオライト　２０ プロテアーゼ　０．　５ アミラーゼ（Ｔｅｒ＋ａ＊ｍｙｌ　３００ＬＤＩ　）　０．　２微量物質及び水 　全量を１００とする量ｐＨは９〜１０の値に調整し得る。酵素は上記のプロテ アーゼＢであった。

洗剤　Ｄｌｌ： 洗濯用に適した等方性水性液体洗剤を以下のように処方した（重量％）： 非イオン性界面活性剤（Ｃ１２アルコール６．５ＥＯエトキシレート基／　ｍ　 ｏｌ）　１０７ｋ（又は第一−アルコール硫酸ナトリウム）オレイン酸　１６ ココヤシ油（Ｃ１２）石鹸　１１ プロテアーゼ　０．５ 微量物質及び水　全量を１００とする量ｐＨは９〜１０の値に調整し得る。酵素 は上記のプロテアーゼＢ及び／又はＣであった。

洗剤　Ｄ１２： 水性液体洗剤組成物を以下のものを含有するように処方した・アルキルベンゼン スルホン酸ナトリウム　１４．５Ｃ１８ナトリウム石鹸　２ 非イオン性洗剤（Ｃ１２−１５６ＥＯ）　９脂肪酸（オレイン酸）４．５ アルケニルコハク酸ナトリウム　１１ プロパンジオール　１．５ エタノール　３．６ クエン酸ナトリウム　３．２ プロテアーゼ　０．５ アミラーゼ　０．１ 塩化ナトリウム　０．５ 微量物質及び水　全量を１００とする量ｐＨは９〜１０の値に調整し得る。酵素 は上記のプロテアーゼＢ及び／又はＣであった。

洗剤　Ｄ１３： 水性液体洗剤組成物を以下のものを含有するように処方したアルキルベンゼンス ルホン酸ナトリウム　８非イオン性洗剤　５．５ＥＯ１０ オレイン酸ジエチルアミド　１０ 脂肪酸（Ｃ１２／Ｃ１８７５：２５）　１８クエン酸ナトリウム　１ トリエタノールアミン　５ Ｄｅｑｕｅｓｔ　２０６０　０．５ プロテアーゼ　０．５ アミラーゼ　０．１ 微量物質及び水　全量を１００とする量ｐＨは９〜１０の値に調整し得る。酵素 は上記のプロテアーゼＢ及び／又はＣであった。

洗剤　Ｄ１４： 非水性液体洗剤組成物を以下のものを含有するように処方した（重量％）： 液体非イオン性洗剤（ＣＩＯ−１２、６，２ＥＯ）　４１％トリアセチン　５ 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸　６ 酸化マグネシウム安定剤　１ 炭酸ナトリウムビルダー／塩基　１８ 炭酸カルシウムビルダー　８ 漂白活性化剤　ＴＡＥＤ　３．５ 漂白前駆物質過硼酸塩−水和物　１０．５部分的疎水性シリカ　２ プロテアーゼ　０．４ 微量物質又は付加的 液体非イオン性界面活性剤（水ではない）全量を１００とする量 本組成物を処方する場合、液体非イオン性界面活性剤及びト素以外の他の成分を 加える。混合物をコロイドミルでかき混ぜて、冷却し、最後に酵素及び任意の池 の熱感受性微量成分を加える。

酵素は上記のプロテアーゼＢであった。

欧州特許出願公開第３４２，１７７号に記載され、例示された洗剤処方物のいず れかを例えば上記のプロテアーゼＢと一緒に用いることもできる。

本発明を種々のその実施例と一緒に考察し、例示したが、これは本開示の適用可 能性及び範囲を限定するものではなく、前記の並びに添付の請求の範囲に後述し た特徴のすべての組み合わせおよび副次的組み合わせに広げて及ぶものである。

〜、４（７７／７３） ＭＣ５＋ 国際調査報告 ′ａｅ＊ｓｔ′ｊ□　ｐ、＋〒Ｂ’Ｄ　Ｏ１／ｌ’ｌつＪ＆つフロントページの 続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：１２５） （７２）発明者　オルセン、オーレ・ハビルステツドデンマーク国、デー・カー −２７００・プロエンショエイ、ベツケスコベイ・３８ （７２）発明者　エリクセン、ニナ デンマーク国、デー・カー−２０００・フレデリクスベルク、トチ−・べ−、マ テイルデベ付５ （７２）発明者　リンデガルド、ボールデンマーク国、デー・カー−２１００・ コペンハーゲン・オー、オイスター・ソエガーデ・５２ Ｉ （７２）発明者　カステレイン、エリツクオランダ国、２９０７・セー・へ−・ カペレ・アー／デー・イツセル、パリエテルブルク・１０５ （７２）発明者　エグモンド、マールテン・ロベルトオランダ国、３４６トヘー ・デー・リンスショーテン、デ・ネス・あ （７２）発明者　ハベルカンプ、ヨハンオランダ国、２６６１・カー・エル・ベ ルイスシエーンホック、デ・クロニスカルペル・（７２）発明者　ムステルズ、 ウオーテルオランダ国、３１４トエル・デー・マツスルイス、ウイペルスペルク ・１３８ （７２）発明者　デ・ブリーグ、ヤコブオランダ国、３０１１・カー・バー・ロ ッテルダム、ホウセシンゲル・２７４・二一

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．親プロテアーゼに比して、あるｐＨ範囲でプロテアーゼの分子電荷の低度の 変化を引き起こすアミノ酸の少なくとも１つの突然変異を有する突然変異体プロ テアーゼを含有する酵素洗剤組成物。
2. ２．サブチリシンのアミノ酸配列の単数又は複数の突然変異が、親プロテアーゼ に比して、約７〜約１１のｐＨ範囲内のｐＨ範囲でプロテアーゼの分子電荷の低 度の変化を突然変異体タンパク質に付与することを特徴とする請求項１記載の洗 剤組成物。
3. ３．正味電荷の上記低度の変化が約７〜約１１のｐＨ範囲内で少なくとも０．５ ｐＨ単位のｐＨ範囲内で示されることを特徴とする請求項２記載の洗剤組成物。
4. ４．正味電荷の上記低度の変化が約７〜約１１のｐＨ範囲内で少なくとも１ｐＨ 単位のｐＨ範囲内で示されることを特徴とする請求項２又は３記載の洗剤組成物 。
5. ５．正味電荷の上記低度の変化が約７〜約１１のｐＨ範囲内で少なくとも２ｐＨ 単位のｐＨ範囲内で示されることを特徴とする請求項２、３又は４記載の洗剤組 成物。
6. ６．正味電荷の上記低度の変化が約８〜約１１のｐＨ範囲の実質的に全体で示さ れることを特徴とする請求項２〜５のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
7. ７．正味電荷の上記低度の変化が約７〜約１１のｐＨ範囲の実質的に全体で示さ れることを特徴とする請求項２〜６のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
8. ８．１分子当たり＋／−１電荷の変動範囲内でプロテアーゼの正味電荷がほとん ど一定であるか又はほとんどゼロのままであることを特徴とする請求項２〜７の いずれか一項に記載の洗剤組成物。
9. ９．前記のほとんど一定であるか又はほとんどゼロの正味電荷が１分子当たり＋ ／−０．５電荷範囲内の変動範囲を有することを特徴とする請求項２〜８のいず れか一項に記載の洗剤組成物。
10. １０．前記のほとんど一定の正味電荷が約＋４、＋３、＋２＋１、０、−１、− ２、−３、又は−４である請求項９に記載の洗剤組成物。
11. １１．約８〜１１の範囲外の側鎖ｐＫ２を有する残基によって置換されない又は 残基によって置換されるリシン、ヒスチジン、システイン及び／又はチロシン残 基の少なくとも１つの突然変異を有することを特徴とする請求項１〜１０のいず れか一項に記載の洗剤組成物。
12. １２．（リシン又はシステインは）アルギニン、ロイシン、トレオニン、アルパ ラギン、グルタメート又はアスパルテートによって；（チロシンは）フェニルア ラニン、トレオニン、バリン、トリプトファン、又はグルタメートによって；あ るいは（ヒスチジンは）グルタミン、アスパラギン、セリン、グルタメート又は アスパルテートによって置換されるリシン、ヒスチジン、システイン及び／又は チロシン残基の少なくとも１つの突然変異を有することを特徴とする請求項１〜 １１のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
13. １３．以下の突然変異の少なくとも１つを有することを特徴とする請求項１〜１ ２のいずれか一項に記載の洗剤組成物：Ｅ５４Ｄ、Ｈ１７Ｑ、Ｈ１２０Ｄ、Ｈ１ ２０Ｎ、Ｈ２２６Ｓ、Ｈ３９Ｓ、Ｋ２７Ｒ、Ｋ９４Ｒ、Ｋ２３５Ｌ、Ｋ２３７Ｒ 、Ｋ２５１Ｅ、Ｋ２５１Ｎ、Ｙ９１Ｆ、Ｙ１６７Ｅ、Ｙ１６７Ｆ、Ｙ１７１Ｆ、 Ｙ１７１Ｖ、Ｙ１９２Ｅ、Ｙ１９２Ｆ、Ｙ２０９Ｆ、Ｙ２０９Ｌ、Ｙ２１４Ｆ、 Ｙ２１４Ｔ、Ｋ２３５Ｒ、Ｙ２６３Ｆ。
14. １４．以下の突然変異又は突然変異セットの少なくとも１つを有することを特徴 とする請求項１３記載の洗剤組成物：ａ　−　Ｋ２７Ｒ； ｂ　−　Ｈ１７Ｑ＋Ｋ２７Ｒ＋Ｈ３９Ｓ；ｃ　−　Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋Ｋ９４ Ｒ；ｄ　−　Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋Ｋ９４Ｒ＋Ｈ１２０Ｄ；ｅ　−　Ｅ５４Ｄ＋ Ｙ９１Ｆ＋Ｋ９４Ｒ＋Ｈ１２０Ｎ；ｆ　−　Ｙ１６７Ｆ＋Ｙ１７１Ｖ＋Ｙ１９２ Ｆ＋Ｙ２０９Ｆ＋Ｙ２１４Ｔ； ｇ　−　Ｋ２３５Ｌ＋Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ；ｈ　−　Ｋ２３５ Ｌ＋Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｎ＋Ｙ２６３Ｆ；ｉ　−　Ｈ２２６Ｓ＋Ｋ２３５Ｌ＋ Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｎ＋Ｙ２６３Ｆ； ｋ　−　Ｈ２２６Ｓ＋Ｋ２３５Ｌ＋Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ； ｇ′−　Ｋ２３５Ｒ＋Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ；ｈ′−　Ｋ２３５ Ｒ＋Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｎ＋Ｙ２６３Ｆ；ｉ′−　Ｈ２２６Ｓ＋Ｋ２３５Ｒ＋ Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｎ＋Ｙ２６３Ｆ； ｋ′−　Ｈ２２６Ｓ＋Ｋ２３５Ｒ＋Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ。
15. １５．以下の突然変異又は突然変異セットの少なくとも１つを有することを特徴 とする請求項１４記載の洗剤組成物：セットａ＋ｃ＋ｆ＋ｇ、ｂ＋ｄ＋ｆ＋ｉ、 ｂ＋ｅ＋ｆ＋ｋ、ｂ＋ｅ＋ｆ＋ｉ、ｂ＋ｄ＋ｆ＋ｋ、ａ＋ｃ＋ｆ＋ｇ′、ｂ＋ｄ ＋ｆ＋ｉ′、ｂ＋ｅ＋ｆ＋ｋ′、ｂ＋ｅ＋ｆ＋ｉ′、ｂ＋ｄ＋ｆ＋ｋ′（ここで 、文字は請求項１４に示した突然変異又は突然変異セットを表す）。
16. １６．Ｎ末端アミノ基を約８〜１１の範囲外のｐＫａを有する基に転換可能な試 薬による請求項１〜１５のいずれか−項に記載のプロテアーゼの処理を包含する 方法。
17. １７．約７〜１２の範囲内のアルカリ性ｐＨで電荷のいくらかの安定性を付与す るためにプロテアーゼのＮ末端アミノ基を修飾するのに有効な試薬と反応したこ とを特徴とする請求項１〜１５のいずれか−項に記載のプロテアーゼ。
18. １８．プロテアーゼがサブチリシンＢＰＮ′、サブチリシンアミノサッカリチク ス、サブチリシン　１６８、サブチリシン　メセンテリコペプチダーゼ、サブチ リシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン　ＤＹ、サブチリシン　３０９、サブ チリシン　１４７、サブチリシン　サーミターゼ、プロテアーゼＴＷ７、プロテ アーゼＴＷ３及びプロテイナーゼ　Ｋ又はアクアリシンから選択される親酸素の 突然変異を示すことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項に記載のプロテ アーゼ。
19. １９．プロテアーゼが親サブチリシンとしてサブチリシン３０９を基礎にするこ とを特徴とする請求項１８記載の洗剤組成物。
20. ２０．プロテアーゼが親サブチリシンとしてサブチリシン１４７を基礎にするこ とを特徴とする請求項１８記載の洗剤組成物。