KR100660742B1 - 활성부위 루프 영역에 추가적 아미노산 잔기를 가지는서브그룹 ｉ-ｓ１과 ｉ-ｓ２의 서브틸라제 효소 - Google Patents

Abstract

위치 95 내지 103의 활성부위 루프 (b) 영역의 위치 102에 추가적 아미노산 잔기를 가지는 서브그룹 I-S1과 I-S2의 서브틸라제에 관한 것이다. 변이체 서브틸라제는 모효소에 비하여 세제 내에서 개선된 세척 수행능을 나타낸다.

서브틸라제, I-S1, I-S2, 변이체, 서브틸리신

Description

활성부위 루프 영역에 추가적 아미노산 잔기를 가지는 서브그룹 Ｉ-Ｓ１과 Ｉ-Ｓ２의 서브틸라제 효소{SUBTILASE ENZYMES OF THE I-S1 AND I-S2 SUB-GROUPS HAVING AN ADDITIONAL AMINO ACID RESIDUE IN AN ACTIVE SITE LOOP REGION}

본 발명은 활성부위 루프 (b) 영역인 위치 95 내지 103의 위치 102에 적어도 하나의 추가적 아미노산 잔기를 가지는 서브그룹 I-S1과 I-S2의 신규한 서브틸라제 효소에 관한 것이다. 이 프로테아제는 세제; 세탁 및 세제 조성물에 사용될 때 뛰어나거나 개선된 세척수행능을 나타내는데 유용하다. 본 발명은 적당한 숙주세포나 생체에 삽입되었을 때 상기 효소의 발현을 코딩하는 유전자; 그것으로 형질전환되어 상기 효소 변이체를 발현할 능력이 있는 이 같은 숙주세포 및 신규 효소를 생산하는 방법과 더 관련된다.

세제산업 효소는 30년을 넘도록 세척 조제물에 사용되어 왔다. 이 같은 조제물에서 사용되는 효소는 프로테아제, 리파제, 아밀라제, 셀룰라제, 및 다른 효소나 그것들의 혼합물을 포함한다. 상업적으로 가장 중요한 효소는 프로테아제이다.

그 수가 증가하는 상업적으로 사용되는 프로테아제는, 천연적으로 생기는 야생형 프로테아제가 단백질 조작된, DURAZYM

(Novo Nordisk A/S), RELASE

(Novo Nordisk A/S), MAXAPEM

(Gist-Brocades N.V.), PURAFECT

(Genencor International, Inc.)같은 변이체이다.

게다가 다수의 프로테아제는 EP 130756 (GENENTECH (US 재발행특허 34,606호 (GENENCOR)에 대응)); EP 2154435 (HENKEL); WO 87/04461 (AMGEN); WO 87/05050 (GENEX); EP 260105 (GENENCOR); Thomas, Russell 및 Fersht (1985) Nature 318 375-376; Thomas, Russell 및 Fersht (1987) J. Mol. Biol. 193 803-813; Russel 및 Fersht Nature 328 496-500 (1987); WO 88/08028 (Genex); WO 88/08033 (Amgen); WO 95/27049 (SOLVAY S. A.); WO 95/30011 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/30010 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/29979 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); US 5.543.302 (SOLVAY S. A.); EP 251 446 (GENENCOR); WO 89/06279 (NOVO NORDISK A/S); WO 91/00345 (NOVO NORDISK A/S); EP 525 610 A1 (SOLVAY); 및 WO 94/02618 (GIST-BROCADES N. V.)와 같이 당업계에서 기술되어 있다.

그러나, 다수의 유용한 프로테아제 변이체가 기술되어 왔지만, 아직도 다수의 산업적 사용을 위한 새로운 개선된 프로테아제나 프로테아제 변이체에 대한 필요가 있다.

그러므로, 본 발명의 목적은 개선된 프로테아제나 단백질 조작된 프로테아제 변이체, 특히 세제산업에의 사용을 위하여 제공하는 것이다.

발명의 개요

본 발명자는 적어도 하나의 활성부위 루프가 현재 알려진 것보다 긴 서브틸리신이 세제 조성물 내에서 개선된 세척수행능 특성을 나타내는 것을 발견하였다. 그것의 동정은 서브틸리신 변이체, 특히 모 야생형 효소에 비하여 세제 조성물 내 에서 개선된 세척수행능 특성을 나타내는 서브틸리신 309 (BLSAVI or Savinase

) 를 제조하는 중 이루어졌다. 이는 우리의 선행 출원인 DK1332/97에 기술되어 있다.

활성부위 루프 (b) 영역인 위치 95 내지 103의 위치 102 (즉, 위치 102와 103 사이)에 적어도 하나의 추가적 아미노산 잔기를 가지는 서브그룹 I-S1 (진정 "서브틸리신")과 I-S2 (고알칼리성 서브틸리신)의 특정 서브틸라제나 그것의 변이체가 현재 공지인 그것과 상기 출원에 기술된 그것에 비하여 놀랍도록 개선된 세척수행능을 나타낸다는 것이 현재 발견되어 있다.

본 발명에 따른 개선된 프로테아제는 천연적 기원에서 분리하거나 야생형 서브틸리신 내 위치 102와 103 사이 활성부위 루프 (b)에 적어도 하나의 더 나아간 아미노산 잔기를 도입하여 얻어진다 (활성부위 정의와 위치의 번호부여에 대하여는 하기 참조).

비록 이 발견은 서브틸리신 309에서 행하여졌으나, 유사한 장점이 있는 서브틸라제나 서브틸라제 변이체를 생산하거나 분리하는 것이 가능할 것으로 예상된다.

더우기, 그 서브틸라제는 위치 102와 103 사이에 삽입된 아미노산 잔기를 가지는 것으로 간주될 수 있는 서브틸리신 309같이 대응하는 공지의 야생형 서브틸라제 내 활성부위 루프보다 더 긴 활성부위 루프를 함유하고, 서브틸리신 309같이 그것의 가장 가깝게 관련된 공지 서브틸리신과 비교하여 세제 내에서 뛰어난 세척수행능을 나타내는 신규한 야생형 서브틸라제를 동정하기 위하여 천연적 분리체를 특이적으로 스크리닝하는 것이 가능할 것이다.

관련되는 정렬과 번호부여 기준이 하기 도 1, 1a, 2, 및 2a에 대하여 생산되 어, 서브틸리신 BPN' (BASBPN) (a)과 서브틸리신 309 (BLSAVI) (b) 사이의 정렬과 서브틸리신 BPN' (a) (BASBPN)과 서브틸리신 Carlsberg (g) 사이의 정렬 나타낸다. 도 1a와 도 2a는 WO 91/00345에 나타낸 것과 동일하나, 도 1과 도 2에서 정렬은 하기된대로 GCG 패키지의 GAP 루틴을 사용하여 완성되었다. 이들 정렬은 본원에서 잔기를 번호부여하기 위한 기준으로서 사용된다.

7개의 활성부위 루프 (a) 내지 (g) (지시된 양 끝 아미노산도 포함하여)는 하기 주어진 단편

(a) 아미노산 잔기 33과 43사이 영역;

(b) 아미노산 잔기 95와 103사이 영역;

(c) 아미노산 잔기 125와 132사이 영역;

(d) 아미노산 잔기 153과 173사이 영역;

(e) 아미노산 잔기 181과 195사이 영역;

(f) 아미노산 잔기 202와 204사이 영역;

(g) 아미노산 잔기 218과 219사이 영역

내 아미노산 잔기들를 포괄하는 것으로 여기서 정의된다.

따라서, 제 1의 측면에서 본 발명은 분리된 (즉, 10%보다 더 순수한), 활성부위 루프 (b) 영역인 위치 95 내지 103의 위치 102에 적어도 하나의 추가적 아미노산 잔기를 가지고, 그것으로 인하여 상기 추가적 아미노산 잔기는 위치 102와 103 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기의 삽입에 대응하는 서브그룹 I-S1과 I-S2의 서브틸라제 효소와 관련된다.

제 2의 측면에서 본 발명은 본 발명의 서브틸라제 변이체를 코딩하는 분리된 DNA 서열과 관련된다.

제 3의 측면에서 본 발명은 본 발명의 서브틸라제 변이체를 코딩하는 분리된 DNA 서열을 포함하는 발현벡터에 관련된다.

제 4의 측면에서 본 발명은 제 3의 측면에 따르는 발현벡터로 형질전환된 미생물 숙주세포 관련된다.

나아간 측면에서 본 발명은 본 발명의 서브틸리신 효소의 생산과 관련된다.

본 발명의 효소는 그것으로부터 효소를 분리할 미생물 균주를 배양하고 유의하게 순수한 형태인 효소를 회수하거나; 제 4의 측면에 따르는 발현벡터를 적당한 미생물 숙주 내로 삽입하고 원하는 서브틸라제 효소를 발현하도록 숙주를 배양하며 효소산물을 회수하여 일반적으로 생산될 수 있다.

게다가 본 발명은 본 발명의 서브틸라제나 서브틸라제 변이체를 포함하는 조성물에 관련된다.

더 나아가 본 발명은 다수의 산업적 적당한 사용, 특히 세탁 조성물과 돌연변이 효소를 포함하는 세탁조성물, 특히 돌연변이 서브틸리신 효소를 포함하는 세제 조성물에서 본 발명의 효소의 사용에 관련된다.

정의

본 발명을 더 상세히 기술하기 전에 다음 용어와 관습이 우선 정의될 것이다.

아미노산 명명

A = Ala = 알라닌

V = Val = 발린

L = Leu = 류신

I = Ile = 이로류신

P = Pro = 프롤린

F = Phe = 페닐알라닌

W = Trp = 트립토판

M = Met = 메티오닌

G = Gly = 글리신

S = Ser = 세린

T = Thr = 트레오닌

C = Cys = 시스테인

Y = Tyr = 티로신

N = Asn = 아스파라긴

Q = Gln = 글루타민

D = Asp = 아스파르트산

E = Glu = 글루탐산

K = Lys = 라이신

R = Arg = 아르기닌

H = His = 히스티딘

X = Xaa = 임의의 아미노산

핵산의 명명

A = 아데닌

G = 구아닌

C = 시토신

T = 티민 (DNA에만)

U = 우라실 (RNA에만)

변이체 표시에 대한 명명과 관습

본 발명에 따라 생산되거나 고려된 다양한 효소 변이체를 기술함에 있어, 다음의 명명법과 관습이 참고의 편의를 위하여 적용된다:

분리된 모 야생형 효소를 서브틸리신 BPN'(BASBPN)에 대하여 정렬 하여 기준의 골격이 최초로 정의되었다.

정렬은 GCG 패키지 버젼 9.1의 GAP 루틴에 의하여 얻어져 다음의 매개변수를 사용하여 변이체에 번호부여할 수 있다: 갭 생성 페널티=8이고 갭 연장 페널티=8이며 다른 모든 매개변수는 그것의 디폴트값을 유지한다.

다른 방법은 WO 91/00345에 기술된 정렬 같은 서브틸라제 사이의 공지의 인식된 정렬을 사용하는 것이다. 대부분의 경우 차이점은 전혀 중요하지 않을 것이다.

서브틸리신 BPN' (BASBPN)와 서브틸리신 309 (BLSAVI)와 서브틸리신 Carlsberg (BLSCAR) 사이의 이 같은 정렬은 각각 도 1, 1a, 2 및 2a에 도시된다. 이것에 의하여 다수의 결실과 삽입이 BASBPN과 관련하여 정의될 것이다. 도 1에서, 서브틸리신 309는 BASBPN와 비교하여 6개의 결실을 위치 36, 58, 158, 162, 163 및 164에서 가지며, 도 1a에서 서브틸리신 309는 BASBPN와 비교하여 같은 결실을 위치 36, 56, 159, 164, 165, 및 166에서 가진다. 도 2에서, 서브틸리신 Carlsberg는 BASBPN와 비교하여 위치 56에서 하나의 결실을 가진다. 도 1, 1a, 2 및 2a의 이들 결실은 별표(*)로 도시된다.

야생형 효소에서 수행되는 다양한 변형은 일반적으로 다음 세가지 요소를 사용하여 나타낸다:

치환된 아미노산의 원래의 아미노산 위치

표기 G195E는 따라서 195위치의 글리신이 글루탐산으로 치환됨을 의미한다.

원래의 아미노산 잔기가 어떤 아미노산 잔기일 수도 있는 경우, 위치와 치환된 아미노산만을 가리키는 축약표기가 때때로 사용될 수 있다.

치환된 아미노산의 위치

이 같은 표시는 상동 서브틸라제 내 변형(들)과 관련하여 특히 적당하다 (하기 참조).

치환하는 아미노산 잔기의 동일성은 중요하지 않은 경우에도 이와 유사하다.

원래의 아미노산 위치

원래 아미노산과 치환된 아미노산 둘 모두 모든 아미노산을 포함하면, 오직 위치만을, 예를 들어: 170같이 표시한다.

원래의 아미노산 및/또는 치환된 아미노산이 모든 아미노산은 아닌 하나 이 상의 아미노산을 포함하면, 선택된 아미노산은 괄호 { } 안에 표시된다.

원래의 아미노산 위치 {치환된 아미노산 ₁ , . . . , 치환된 아미노산 _n }

특이적 변이체에 대하여, 임의의 아미노산 잔기를 가리키기 위한 코드 Xaa와 X를 포함하여 특이적 세문자나 한문자 코드가 사용된다.

치환:

위치 195에서 글리신이 글루탐산으로 치환되면:

Glyl95Glu 또는 G195E와 같이 표시되고,

위치 195에서 글리신이 임의의 아미노산 잔기로 치환되면:

Glyl95Xaa나 G195X 또는 Glyl95나 G195와 같이 표시된다.

위치 170의 임의의 아미노산이 세린으로 치환되면:

Xaal70Ser이나 X170S 또는 170Ser이나 170S와 같이 표시된다.

이 같은 표시는 상동 서브틸라제 내 변형과 관련하여 특히 적당하다 (하기 참조). 170Ser은 따라서 예를 들어 BASBPN 내의 변형 Lys170Ser와 BLSAVI에서의 변형 Arg170Ser 둘 모두를 포함하는 것을 의미한다 (도 1 참조).

원래의 아미노산 및/또는 치환된 아미노산이 아미노산 전부는 아니지만 하나 보다 많은 아미노산으로 치환된 변형에 대하여는, 위치 170에서 아르기닌의 글리신, 알라닌 세린 또는 트레오닌으로의 치환은

Arg170 {Gly, Ala, Ser, Thr} 이나 R170 {G, A, S, T} 로 표시되어 변이체 R170G, R170A, R170S, 및 R170T을 가리킬 것이다.

결실:

위치 195에서 글리신의 결실은 Glyl95* 나 G195*로 표시된다.

유사하게, 위치 195와 196의 글리신과 류신의 결실같은 하나보다 많은 아미노산 잔기의 결실은, 것은 Glyl95*+Leul96* or G195*+L196*로 표시될 것이다.

삽입:

예를 들어 G195 다음에 라이신과 같이 추가적 아미노산의 삽입은: Glyl95GlyLys나 G195GK;

하나보다 많은 아미노산 잔기가 삽입된 경우, 예를 들어 G195 다음에 Lys, Ala 및 Ser의 삽입은: Glyl95GlyLysAlaSer나 G195GKAS이다.

이 같은 경우, 삽입된 아미노산은, 삽입된 아미노산 잔기에 선행하는 아미노산 잔기 위치 수자에 알파벳인쇄체 소문자의 부가에 의하여 번호부여된다. 상기 예에서 서열 194 내지 196은 따라서:

194 195 196

BLSAVI A - G - L

194 195 195a 195b 195c 196

변이체 A - G - K - A - S - L

가 될 것이다.

기존의 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 잔기가 삽입되는 경우, 명명법상 다의성이 있을 것이 명백하다. 만약 예를 들어 상기 예에서 글리신 다음에 글리신이 삽입되면 이는 G195GG로 표시될 것이다.

194 195 196

BLSAVI A - G - L

로부터

194 195 195a 196

변이 A - G - G - L

194 194a 195 196

로의 변화에 대하여, 동일한 실제 변화는 단지 A194AG와 같이 표시될 수 있다. 이 같은 예는 숙련자에게 명백할 것이고, 표시 G195GG와 이런 형태의 삽입에 대한 대응하는 의미는 따라서 이 같은 균등 다의성을 포함한다는 의미이다.

갭을 메움:

번호부여에 사용된 서브틸리신 BPN' 서열과 비교한 기준 내 결실이 존재할 때, 그와 같은 위치에의 삽입인 위치 36에 아스파르트산 삽입에 대하여 *36Asp나 *36D와 같이 나타낸다.

다중 변형

다중 변형을 포함하는 변이체는 플러스 기호로 분리되는데, 예를 들어:

Arg170Tyr+Gly195Glu나 R170Y+G195E는 위치 170과 195에서 각각 아르기닌과 글리신이 티로신과 글루타민으로 치환된 것을 나타낸다.

또는 예를 들어 Tyrl67 {Gly, Ala, Ser, Thr} +Argl70 {Gly, Ala, Ser, Thr}는 변이체 Tyr167Gly+Arg170Gly, Tyr167Gly+Arg170Ala, Tyr167Gly+Arg170Ser, Tyr167Gly+Arg170Thr, Tyr167Ala+Arg170Gly, Tyr167Ala+Arg170Ala, Tyrl67Ala+Argl70Ser, Tyrl67Ala+Argl7OThr, Tyrl67Ser+Argl70Gly, Tyrl67Ser+Argl70Ala, Tyrl67Ser+Argl70Ser, Tyrl67Ser+Argl70Thr, Tyrl67Thr+Argl70Gly, Tyrl67Thr+Argl70Ala, Tyrl67Thr+Argl70Ser, 및 Tyrl67Thr+Argl70Thr를 나타낸다.

이 명명법은, 포지티브 전하 (K, R, H), 네거티브 전하 (D, E), 또는 작은 아미노산을 다른 작은 아미노산으로 치환하는 것을 나타내는, 예를 들어 Tyrl67 {Gly, Ala, Ser, Thr} +Argl70 {Gly, Ala, Ser, Thr}에서의 보존적 아미노산 변형 특정 일반적 특징을 가지는 아미노산 잔기의 치환, 교체, 삽입 또는 결실을 목적으로 하는 변형과 관련하여 특히 적당하다. 더 자세한 것은 "발명의 상세한 설명" 편을 참조하시오.

프로테아제

단백질 기질의 아미드 결합을 절단하는 효소는 프로테아제, 또는 (호환적으로) 펩티다제로 분류된다 (Walsh, 1979, Enzymetic Reaction Mechanisms, W.H. Freeman and Company, San Francisco, 제 3장).

아미노산 위치/잔기의 번호부여

만약 다른 언급이 없다면, 여기에서 사용된 아미노산 번호부여는 서브틸라제 BPN' (BASBPN) 서열의 번호부여에 대응된다. BPN' 서열의 더 나아간 기술은 도 1과 2 또는 Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737을 참조하시오.

세린 프로테아제

세린 프로테아제는 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하고 그 활성부위에 필수 적 세린 잔기를 가지는 효소이다 (White, Hadler 및 Smith, 1973 "Princeples of Biochemisty," Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, pp. 271-272).

세균의 세린 프로테아제는 분자량이 20,000 내지 45,000 달톤 범위에 있다. 그것은 디이소프로필 플루오로포스페이트에 의하여 저해된다. 그것은 간단한 말단 에스테르를 가수분해하고, 역시 세린 프로테아제인 진핵생물 키모트립신과 활성이 유사하다. 더 좁은 의미에서, 서브그룹을 포괄하는 알칼리성 프로테아제는 몇몇 세린 프로테아제의 pH 9.0 내지 11.0의 높은 최적 pH 반영한다 (리뷰로는 Priest (1997) Bacteriological Rev. 41 711-753을 참조하시오).

서브틸라제

서브틸라제라고 임시적으로 칭하여진 세린 프로테아제의 서브그룹이 Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737과 Siezen et al., Protein Science 6 (1997) 501-523에 의하여 제안되었다. 그것은 서브틸리신-유사 프로테아제로 이전에 명명되던 세린 프로테아제의 170개가 넘는 아미노산 서열의 상동성 분석에 의하여 정의되었다. 서브틸리신은 이전에 종종 그램-포지티브 세균이나 균류에 의하여 생산되는 세린 프로테아제로 정의되었고 현재는 Siezen et al.에 따라 서브틸라제의 서브그룹으로 정의된다. 광범위하게 다양한 서브틸라제가 동정되었고, 다수의 서브틸라제의 아미노산 서열이 결정되었다. 이 같은 서브틸라제와 그것의 아미노산 서열의 더 상세한 기술은 Siezen et al. (1997)이 참고문헌이 된다.

서브틸라제의 한 서브그룹인 I-S1 또는 "진정 서브틸리신"은 서브틸리신 168 (BSS168), 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 Carlsberg (ALCALASE

Novo Nordisk A/S) 및 서브틸리신 DY (BSSDY)같은 "전통적" 서브틸리신을 포함한다.

서브틸라제의 더 나아간 서브그룹, I-S2 또는 고알칼리성 서브틸리신은 Siezen et al. (상기)에 의하여 알려진다. 서브그룹 I-S2 프로테아제는 고알칼리성 서브틸리신으로 기술되며, 서브틸리신 PB92 (BAALKP) (MAXACAL

, Gist-Brocades NV), 서브틸리신 309 (SAVINASE

, NOVO NORDISK A/S), 서브틸리신 147 (BLS147) (ESPERASE

, NOVO NORDISK A/S) 및 알칼리성 에라스타제 YaB (BSEYAB) 같은 효소를 포함한다.

서브틸라제에 대한 약어 리스트

I-S1

서브틸리신 168, BSS168 (BSSAS (서브틸리신 아밀로사카리티쿠스), BSAPRJ (서브틸리신 J), BSAPRN (서브틸리신 NAT), BMSAMP (메센테리코펩티다제),

서브틸리신 BPN', BASBPN

서브틸리신 DY, BSSDY,

서브틸리신 Carlsberg, BLSCAR (BLKERA (케라티나제), BLSCA1, BLSCA2, BLSCA3),

BSSPRC, 세린프로테아제 C

BSSPRD, 세린프로테아제 D

I-S2

서브틸리신 Sendai, BSAPRS

서브틸리신 ALP 1, BSAPRQ,

서브틸리신 147, Esperase

BLS147 (BSAPRM (SubtilisinAprM), BAH101),

서브틸리신 309, Savinase

, BLS309/BLSAVI (BSKSMK (M-프로테아제), BAALKP (서브틸리신 PB92, Bacillus alkalophilic 알칼리성 프로테아제), BLSUBL (서브틸리신 BL)),

알칼리성 에레스타제 YaB, BYSYAB,

"SAVINASE

"

SAVINASE

는 NOVO NORDISK A/S에 의하여 판매된다. 이것은 B.leutus 유래 서브틸리신 309이고 BAALKP와 오직 한 위치 (N87S, 여기의 도 1 참조)만 상이하다. SAVINASE

는 도 1에서 b)로 표시된 아미노산 서열을 가진다.

모서브틸라제

용어 "모서브틸라제"는 Siezen et al. (1991과 1997)에 따라 정의된 서브틸라제를 의미한다. 더 자세한 기술은 바로 위의 "서브틸라제"의 기술을 참조하시오. 모서브틸라제는 또한 천연 기원으로 부터 분리된 서브틸라제이며, 서브틸리신의 특성을 유지한 채 그 다음의 변형이 수행되었다. 대안으로, 용어 "모서브틸라제"는 "야생형 서브틸라제"라고 명명된다.

서브틸라제 변이체의 변형

여기에서 사용된 용어 "변형"은 서브틸라제를 코딩하는 DNA의 유전적 조작 뿐 아니라 서브틸라제의 화학적 변형을 포함하는 것으로 정의된다. 변형은 관심의 아미노산에서나 그 안에서의 아미노산 곁사슬의 교체, 치환, 결실 및/또는 삽입일 수 있다.

서브틸라제 변이체

본 발명에 관련하여 용어 서브틸라제 변이체나 돌연변이된 서브틸라제는, 원래의 모유전자를 가지고 대응하는 모효소를 생산하는 모생체로부터 유래한 돌연변이 유전자를 발현하는 생체에 의하여 생산되는 서브틸라제를 의미하는데, 그 모유전자는, 적당한 숙주에서 발현될 때 돌연변이된 상기 서브틸라제 프로테아제가 생산되는 돌연변이 유전자를 생산하기 위하여 돌연변이되었다.

상동 서브틸라제 서열

본 발명의 서브틸리신 변이체를 얻기위한 변형을 위하여, 여기에서 특이적 활성부위 루프영역과 상기 SAVINASE

서브틸라제의 루프 내 아미노산 삽입이 동정된다.

그러나, 본 발명은 이 특정 서브틸라제의 변형에 한정되지 않고 SAVINASE

의 1차구조에 상동인 1차구조를 가지는 다른 모 (야생형) 서브틸라제에도 미친다. 이 문맥에서 두 아미노산 서열 사이의 상동성은 "동일성" 기준에 의하여 기술된다.

두 서브틸라제 사이의 동일성의 정도를 측정하기 위하여 GCG 패키지 버젼 9.1의 GAP 루틴이 동일한 세팅을 사용하여 적용될 수 있다 (하기). 이 루틴으로부터의 결과는 아미노산 정렬 외에도 두 서열 사이의 "백분율 동일성"의 계산이 있다.

이 기술에 기초하여 본 발명에 따라 변형될 수 있는 적당한 상동 서브틸라제 와 대응하는 상동 활성부위 루프 영역을 동정하는 것은 당업계 숙련자에게 용이하다.

세척수행능

예를 들어 세척이나 경표면 세탁동안, 효소가 세탁될 물체 상에 존재하는 다양한 천연 발생 기질의 분해를 촉매하는 능력을 종종 그것의 세척력, 세척-력, 세탁력 또는 세척수행능이라 말한다. 이 적용을 통하여 용어 세척수행능은 이 특징을 포괄하여 사용될 것이다.

분리된 DNA 서열

용어 "분리된"은, DNA 서열 분자에 사용될 때, DNA 서열이 그것의 천연 유전적 환경에서 분리되고 따라서 다른 외생이나 바라지 않는 코딩 서열이 없다는 것을 표시하고 유전적으로 조작된 단백질 생산에서의 사용에 적당한 형태이다. 이 같은 분리된 분자는 그것의 천연 환경으로부터 분리된 것이고 cDNA와 게놈 클론을 포함한다. 본 발명의 분리된 DNA 분자는 통상적으로 연결된 다른 유전자가 없지만 프로모터와 터미네이터 같은 천연적인 5'과 3' 비번역 영역을 포함할 수 있다. 연결된 영역의 동정은 당업계 통상적인 기술을 가진자에게 명백할 것이다 (예를 들어, Dynan과 Tijan, Nature 316: 774-78, 1985 참조). 용어 "분리된 DNA 서열"은 대안으로 "클론된 DNA 서열"로 명명될 수 있다.

분리된 단백질

단백질에 적용될 때, 용어 "분리된"은 그것의 천연 환경으로부터 분리된 단백질을 가리킨다.

바람직한 형태로는, 분리된 단백질은 다른 단백질, 특히 상동 단백질이 유의하게 부존재한다 (즉 "상동 불순물" (하기 참조)).

SDS-PAGE에 의하여 결정될 때, 분리된 단백질은 10%보다 더 순수하고, 바람직하게는 20%보다, 더 바람직하게는 30%보다 더 순수하다. 게다가, SDS-PAGE에 의하여 결정될 때, 고-정제형으로, 즉 40%보다 더, 60%보다 더, 80%보다 더 순수한, 더 바람직하게는 95%보다 더 순수한 더욱 더 바람직하게는 99%보다 더 순수한 단백질을 제공하는 것이 바람직하다. 용어 "분리된 단백질"은 대안으로 "정제된 단백질"이라고 명명한다.

상동 불순물

용어 "상동 불순물"는 본 발명의 폴리펩티드가 처음에 얻어진 상동 세포에서 유래한 어떤 불순물 (예를 들어 본 발명의 폴리펩티드 외의 다른 폴리펩티드)을 의미한다.

로부터 얻어지는

용어 "로부터 얻어지는"은, 특정 미생물 기원과 관련되어 여기에서 사용될 때, 특정 기원이나 그 기원 유래 유전자가 삽입된 세포에 의하여 생산되는 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 의미한다.

기질

프로테아제에 대한 기질과 관련하여 사용된 용어 "기질"은 서브틸리신 프로테아제에 의하여 가수분해되기 쉬운 적어도 하나의 펩티드 결합을 함유하는 화합물을 포함하는 그것의 가장 넓은 형태로 해석되어야 한다.

산물

프로테아제 효소적 반응과 관련하여 사용된 용어 "산물"은 본 발명과 관련하여 서브틸라제 프로테아제가 관련된 가수분해의 산물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 산물은 이어지는 가수분해 반응의 기질일 수 있다.

도 1은 상기 GAP 루틴을 사용한 서브틸리신 BPN' (a)와 Savinase

(b) 사이의 정렬을 도시한다.

도 1a는 WO 91/00345로부터 취하여진 것과 같이 서브틸리신 BPN'와 Savinase

사이의 정렬을 도시한다.

도 2는 GAP 루틴을 사용한 서브틸리신 BPN'와 서브틸리신 Carlsberg 사이의 정렬을 도시한다.

도2a는 WO 91/00345로부터 취하여진 것과 같이 서브틸리신 BPN'와 서브틸리신 Carlsberg 사이의 정렬을 도시한다.

도 3은 Savinase (Protein data bank (PDB) 엔트리 1SVN)의 3차원적 구조를 도시한다. 도에서 활성부위 루프 (b)가 표시된다.

본 발명의 서브틸라제는 제 1의 측면에서 위치 95 내지 103인 활성부위 루프 영역의 위치 102에 적어도 하나의 추가적 아미노산 잔기를 가짐으로써 상기 추가적 아미노산 잔기는 위치 102와 103 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기의 삽입에 대응하는, 서브그룹 I-S1와 I-S2의 분리된 (즉 10%보다 순수한) 서브틸라제 효소 에 관련된다.

환언하면, 본 발명의 서브틸라제는 9개보다 많은 아미노산 잔기의 활성부위 루프 (b) 영역을 포함하는 것을 특징으로 하고, 추가적 아미노산 잔기는, 모 또는 공지 야생형 서브틸라제에 비할 때 위치 102와 103 사이에 삽입되거나, 삽입된 것으로 간주되거나 될 수 있다.

본 발명의 제 1의 측면의 서브틸라제는 천연으로부터 동정되고 분리된 모 또는 야생형 서브틸라제이다.

이 같은 모 야생형 서브틸라제는 당업계 공지의 표준 기술에 의하여 특이적으로 스크리닝된다.

이것을 수행하는 바람직한 수단은 다수의 상이한 미생물, 바람직하게는 Bacillus 균주 유래 서브틸라제의 활성부위 루프 영역을 코딩하는 것으로 알려진 DNA 영역을 특이적으로 PCR 증폭하는 것이다.

서브틸라제는 그들의 DNA와 아미노산 서열이 상동이라는 점에서 한 군의 보존된 효소이다. 따라서, 활성부위 루프 양측에 접하는 상대적으로 특이적인 프라이머를 제작하는 것이 가능하다.

이것을 수행하는 한 수단은 상이한 서브틸라제들의 정렬을 수행하는 것이다 (예를 들어 Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523). 이것으로부터 BLSAVI 유래와 같은 그룹 I-S1이나 I-S2 중 어느 하나 내 아미노산 잔기 95 내지 103 사이의 활성부위 루프 (b)에 대응하는 활성부위 루프 양측에 접하는 PCR프라이머를 제작하는 것은 당업자에게 용이한 것이다. 이 같은 PCR 프라이머를 사용하여 다수의 상이한 미생물들, 바람직하게는 상이한 Bacillus 균주로부터 DNA를 증폭하고 상기 증폭된 PCR 단편을 DNA 서열결정하면, 예를 들어 BLSAVI와 비교하여 위치 95 내지 103의 활성부위 영역에 대응하는 더 긴 활성부위 영역을 포함하는 이들 군의 서브틸라제를 생산하는 균주를 동정할 수 있고, 삽입은 위치 102와 103 사이에 존재하는 것으로 간주될 수 있다. 이 같은 관심의 서브틸라제 균주와 부분적 DNA 서열이 동정되면, 이 같은 본 발명의 서브틸라제의 클로닝을 완성하고, 발현시키고, 정제하는 것은 당업계 숙련자에게 용이한 작업이다.

그러나, 본 발명의 서브틸라제 효소가 주요하게 모서브틸라제의 변이체임을 예측할 수 있다.

따라서, 구체예에서 본 발명은 본 발명의 제 1의 측면에 따라 분리된 서브틸라제 효소와 관련되는데, 상기 서브틸라제 효소는 아미노산 잔기 102와 103 사이에 적어도 하나의 아미노산을 가져 그것의 모효소보다 더 긴 활성부위 루프 (b)를 가지는 제조된 변이체이다.

본 발명의 서브틸라제는 세제 내에서 뛰어난 세척수행능을 나타내고, 만약 효소가 제조된 변이체인 경우 서브틸리신 309 같은 그것의 가장 가까운 관련 서브틸라제에 비하여 개선된 세척수행능을 나타낸다.

상이한 서브틸라제 산물은 상이한 타입의 세제 조성물 내에서 상이한 세척수행능을 나타낸다. 본 발명의 서브틸라제는 대다수의 이 같은 상이한 타입의 세제 조성물 내 가장 가까운 동류에 비하여 개선된 세척수행능을 가진다.

바람직하게는 여기 실시예 3에서 나타낸 세제 조성물에서 본 발명의 서브틸 라제 효소는 그것의 가장 가까운 동류에 비하여 개선된 세척수행능을 가진다 (하기 참조).

(그 서브틸라제 서열이 모 야생형 서브틸라제 서열인지 부위특이적 돌연변이유발 외의 다른 어떤 방법으로 생산된 서브틸라제 변이체 서열인지 관계없이) 주어진 서브틸라제 아미노산 서열이 본 발명의 범위 내인지 결정하기 위하여, 하기 과정:

i) 상기 서브틸라제 서열을 서브틸리신 BPN'의 아미노산 서열과 정렬시키는 단계 (여기 상기된 "정의" 편 참조 );

ii) 아미노산 잔기 95 내지 103 (양쪽 끝의 아미노산 포함하여)영역을 포함하는 서브틸리신 BPN'의 활성부위 루프 (b) 영역에 대응하는 상기 서브틸라제 서열에서, 단계 i)의 정렬에 기초하여 활성부위 루프 (b)를 동정하는 단계;

iii) 단계 ii)에서 동정된 상기 서브틸라제 서열 내 활성부위 루프 (b)가 대응하는 BLSAVI 내 활성부위 루프보다 더 긴지 여부와 상기 연장이 위치 102와 103 사이에 적어도 하나의 아미노산을 삽입하는 것에 대응하는지 여부를 결정하는 단계가 사용될 수 있다.

만약 그런 경우라면, 관찰되는 서브틸라제는 본 발명의 범위 내에 있는 서브틸라제이다.

상기 단계 i)에서 수행되는 정렬은 상기된 바대로 GAP 루틴을 사용하여 수행된다.

이 기재에 기초하여 서브틸라제 내 활성부위 루프 (b)를 동정하고 문제의 서 브틸라제가 본 발명의 범위 내에 있는지 결정하는 것은 당업계 숙련자에게 용이하다. 만약 변이체가 부위특이적 돌연변이유발에 의하여 제조된다면, 그 서브틸라제가 본 발명의 범위 내에 있는지 미리 알려진 것이 당연하다.

본 발명의 서브틸라제 변이체는 부위특이적 돌연변이유발/ 무작위돌연변이유발과 같은 당업계 공지의 표준 기술이나 상이한 서브틸라제 서열의 DNA 셔플링 (shuffling)에 의하여 제조된다. 그 이상의 상세한 기술은 여기 (상기 참조)의 "서브틸라제 변이체의 생산"과 재료와 방법 편을 참조하시오.

더 나아간 구체예에서 본 발명은

1. 본 발명에 따라 분리된 서브틸라제 효소로서, 상기 적어도 하나의 삽입된 아미노산 잔기는 T, G, A 및 S를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 효소;

2. 본 발명에 따라 분리된 서브틸라제 효소로서, 상기 적어도 하나의 삽입된 아미노산 잔기는 D, E, H, K, 및 R, 더 바람직하게는 D, E, K 및 R을 포함하는 전하를 띠는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 효소;

3. 본 발명에 따라 분리된 서브틸라제 효소로서, 상기 적어도 하나의 삽입된 아미노산 잔기는 C, N, Q, S 및 T, 더 바람직하게는 N, Q, S 및 T를 포함하는 친수성 아미노산 잔기 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 효소;

4. 본 발명에 따라 분리된 서브틸라제 효소로서, 상기 적어도 하나의 삽입된 아미노산 잔기는 A, G 및 V를 포함하는 작은 소수성 아미노산 잔기 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 효소;

5. 본 발명에 따라 분리된 서브틸라제 효소로서, 상기 적어도 하나의 삽입된 아미노산 잔기는 F, I, L, M, P, W 및 Y, 더 바람직하게는 F, I, L, M 및 Y를 포함하는 큰 소수성 아미노산 잔기 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 효소와 관련된다.

더 나아간 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 분리된 서브틸라제 효소와 관련되는데, 상기 위치 102와 103 사이의 삽입은 대응하는 BLSAVI의 활성부위 루프에 비할 때 적어도 두 아미노산을 포함한다.

더 나아간 구체예에서, 본 발명은

(BASBPN 번호부여에서)

X102X{T, G, A, S}

X102X{D, E, K, R}

X102X{H, V, C, N, Q}

X102X{F, I, L, M, P, W, Y}

또는 더 구체적으로 서브틸리신 309와 BAALKP, BLSUBL, 및 BSKSMK 같은 근관계 서브틸라제에 대하여

G102GA

G102GT

G102GG

G102GS

G102GD

G102GE

G102GK

G102GR

G102GH

G102GV

G102GC

G102GN

G102GQ

G102GF

G102GI

G102GL

G102GM

G102GP

G102GW

G102GY

를 포함하는 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 삽입을 포함하는 분리된 서브틸라제 효소와 관련된다.

더 나아가, 본 발명은 위치 102에 다중 삽입, 또는 하기 조합 G102GT+Y167A 중 어느 하나를 포함하는 서브틸라제와 관련된다.

하나의 아미노산 잔기를 유사한 아미노산 잔기로 소위 보존적 치환하는 것이 효소의 특성을 단지 사소하게만 변화시킬 것으로 예상하는 것은 당업계 주지이다.

하기 표 III은 보존적 아미노산 치환의 군을 열거한다.

표 3

보존적 아미노산 치환

일반적 특성 아미노산

염기성 (포지티브 전하) K = 라이신

H = 히스티딘

산성 (네거티브 전하) E = 글루탐산

D = 아스파르트산

극성 Q = 글루타민

N = 아스파라긴

소수성 L = 류신

I = 이소류신

V = 발린

M = 메티오닌

방향족 F = 페닐알라닌

W = 트립토판

Y = 티로신

작은 G = 글리신

A = 알라닌

S = 세린

T = 트레오닌

이 원칙에 따르면 G97A+A98S+S99G, G97S+A98AT+S99A같은 보존적 치환을 포함하는 서브틸라제 변이체는 서로 유의하게 상이하지 않은 특성을 나타낼 것으로 예상된다.

여기에서 개시되고/또는 예시된 서브틸라제 변이체에 기초하여 유사한 개선된 세척수행능을 나타내는 다른 서브틸라제 변이체를 얻기 위하여 이런 변이체에 대하여 적당한 보존적 변형을 동정하는 것은 당업계 숙련자에게 용이한 작업이다.

본 발명에 따라 본 발명의 서브틸라제는, 본 발명의 신규한 효소를 천연이나 다양한 인공적 생산으로부터 분리하는 점과 모서브틸라제로부터 변이체를 디자인하고 생산하는 점 두가지 모두에서 서브그룹 I-S1와 I-S2, 특히 서브그룹 I-S2에 속한다.

서브그룹 I-S1 유래 변이체와 관련하여, BSS168 (BSSAS, BSAPRJ, BSAPRN, BMSAMP), BASBPN, BSSDY, BLSCAR (BLKERA, BLSCA1, BLSCA2, BLSCA3), BSSPRC 및 BSSPRD나 서브그룹 I-S1의 특성을 유지한 그것의 기능적 변이체를 포함하는 군으로부터 모서브틸라제를 선택하는 것이 바람직하다.

서브그룹 I-S2 유래 변이체와 관련하여, BSAPRQ, BLS147 (BSAPRM, BAH101), BLSAVI (BSKSMK, BAALKP, BLSUBL), BYSYAB 및 BSAPRS나 서브그룹 I-S2의 특성을 유지한 그것의 기능적 변이체를 포함하는 군으로부터 모서브틸라제를 선택하는 것이 바람직하다.

특히 상기 모서브틸라제는 BLSAVI (SAVINASE

NOVO NORDISK A/S)이고, 본 발명의 바람직한 서브틸라제 변이체는 따라서 SAVINASE

의 변이체이다.

본 발명은 또한 본 발명의 상기 서브틸라제 중 어느 하나가 그것의 아미노산 서열에 대한 다른 변형 중 어느 하나와 조합된 것을 포함한다. 특히, 효소에 개선된 특성을 제공하는 당업계 공지인 다른 변형과의 조합이 예측된다. 당업계는 상이한 개선된 특성을 가진 다수의 서브틸라제 변이체를 기술하고 다수 변이체가 여기의 "배경기술" 편에 기술된다 (상기 참조). 그 참고문헌은 본 발명의 서브틸라제 변이체와 유리하게 조합할 수 있는 서브틸라제 변이체 동정용 참고문헌으로서 여기 개시된다.

이 같은 조합은 위치: 222 (산화 안정성 개선), 218 (열 안정성 개선), 효소를 안정화시키는 Ca-결합 부위 내 치환, 예를 들어 위치 76 및 선행기술로부터 명백한 다른 많은 것을 포함한다.

더 나아간 구체예에서, 본 발명의 서브틸라제 변이체는 위치:

27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 206, 218, 222, 224, 235 및 274 중 어느 하나에서의 하나 이상의 변형과 유리하게 조합된다.

구체적으로, 다음의 BLSAVI, BLSUBL, BSKSMK, 및 BAALKP 변이체:

K27R, *36D, S57P, N76D, S87N, G97N, S101G, S103A, V104A, V104I, V104N, V104Y, H120D, N123S, Y167, R170, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L 및 T274A가 조합에 적당한 것으로 생각되다.

S101G+V104N, S87N+S101G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A, N76D+S103A+V104I 또는 N76D+V104A나 이들 돌연변이 (V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A)의 다른 조합 중 어느 하나가 하나 이상의 상기 변형과 조합된 것을 포함하는 더 나아간 변이체는 개선된 특성을 나타낸다.

본 발명의 주요 측면의 한층 더 나아간 변이체는 위치 129, 131, 133 및 194중 어느 하나에서의, 바람직하게는 129K, 131H, 133P, 133D 및 194P 변형으로서, 그리고 가장 바람직하게는 P129K, P131H, A133P, A133D 및 A194P 변형으로서의 하나 이상의 변형과 바람직하게 조합된다. 이들 어떤 변형도 그것의 생산에 있어 본 발명의 서브틸라제 변이체의 더 높은 발현 수준을 제공할 것이 예상된다.

따라서, 본 발명의 한층 더 나아간 구체예는 변형이 를 포함하는 군으로부터 선택되는 본 발명에 따른 변이체와 관련된다.

서브틸라제 변이체의 생산

본 발명의 서브틸라제를 클로닝하고 유전자 (예를 들어 서브틸라제 유전자)에 삽입을 도입하는 다수의 방법이 당업계 주지이다 ("배경기술" 편에 인용된 참고문헌 참조).

일반적으로, 유전자를 클로닝하고 삽입을 상기 유전자 내로 (무작위 및/또는 부위특이적으로) 도입하는 표준 방법이 본 발명의 서브틸라제 변이체를 얻기 위하여 사용된다. 적당한 기술의 그 외의 기술에 대하여는 여기의 실시예 (하기 참조)와 (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. et al. (eds.) "Current protocols in Mollecular Biology", John Wiley와 Sons, 1995; Harwood, C.R., 와 Cutting, S.M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus"; John Wiley와 Sons, 1990; 및 WO 96/34946가 참고문헌이 된다.

게다가, 본 발명의 서브틸라제 변이체는 상이한 서브틸라제 유전자의 DNA 셔플링 (WO 95/22625; Stemmer WPC, Nature 370:389-91 (1994))같은 다양성의 인공적 생산을 위한 표준 기술에 의하여 제작된다. 예를 들어 Savinase

의 활성부위 (b) 루프보다 긴 활성부위 (b) 루프 영역을 포함하는 하나 이상의 천연에서 동정된 서브틸라제 부분서열을 가지는 Savinase

를 코딩하는 유전자의 DNA 셔플링은 이어지는 개선된 세척수행능 변이체에 대한 스크리닝 후 본 발명에 따르는 서브틸라제 변이체를 제공할 것이다.

발현 벡터

본 발명의 효소를 코딩하는 DNA 구성체를 포함하는 재조합 발현 벡터는 편리하게 재조합 DNA 과정을 수행할 어떤 벡터일 수도 있다.

벡터의 선택은 종종 그것이 도입될 숙주세포에 의존할 것이다. 그러므로, 벡터는 그 복제가 염색체의 복제에 독립적인 자율복제벡터, 즉 염색체외 유전인자로 존재하는 벡터, 예를 들어 플라스미드이다. 대안으로, 벡터는 숙주세포로 도입되어 전체나 일부가 숙주세포 게놈 내로 삽입되어 삽입된 염색체와 함께 복제되는 것일 수도 있다.

벡터는 바람직하게는, 본 발명의 효소를 코딩하는 DNA 서열이 DNA 전사에 필수적인 추가적 단편에 작동가능하게 연결된 발현벡터이다. 일반적으로, 발현벡터는 플라스미드나 바이러스 DNA에서 유래하거나 둘 모두의 인자를 함유한다. 용어 "작 동가능하게 연결된"은 단편이 그것의 의도된 목적, 예를 들어 프로모터에서 전사가 개시되고 효소를 코딩하는 DNA 서열에서 속행하는 것등의 목적에 맞게 작용하도록 배열된 것을 가리킨다.

프로모터는 선택의 숙주세포 내에서 전사활성을 나타내는 어떤 DNA 서열일 수 있고 숙주세포에 상동이나 비상동 단백질을 코딩하는 유전자에서 유래할 수 있다.

세균 숙주에서 사용에 적당한 프로모터의 예는 Bacillus stearothermophilus 말토제닉 아밀라제 유전자, Bacillus licheniformis α-아밀라제 유전자, Bacillus amyloliquefaciens α-아밀라제 유전자, Bacillus subtilis 알칼리성 프로테아제 유전자, 또는 Bacillus pumilus 자일로시다제 유전자의 프로모터 또는 파지 Lamda P_R 이나 P_L 프로모터 또는 E.coli lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함한다.

본 발명의 효소를 코딩하는 DNA 서열은 또한 필요하다면 적당한 터미네이터에 작동가능하게 연결된다.

본 발명의 재조합 벡터는 벡터를 문제의 숙주 내에서 복제할 수 있도록 하는 DNA 서열을 더 포함한다.

벡터는 또한 선택마커, 예를 들어 그 유전자 산물이 숙주세포에 결핍을 보충하는 유전자나 예를 들어 카나마이신, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 테트라마이신, 스펙티노마이신 등 같은 항생제에 대한 내성이나 중금속 내성을 코딩하는 유전 자를 포함한다.

본 발명의 효소를 숙주세포의 분비경로 내로 유도하기 위하여 (리더 서열, 프리프로 서열, 프리 서열이라고도 알려진) 분비신호서열이 재조합 벡터에 제공된다. 분비신호서열은 효소 코딩서열에 프레임에 맞도록 연결된다. 분비신호서열은 일반적으로 효소를 코딩하는 DNA 서열의 5'에 위치한다. 분비신호서열은 정상적으로 효소와 연관된 것이거나 다른 분비단백질을 코딩하는 유전자에서 유래한다.

본 효소, 프로모터 및 선택적으로 터미네이터 및/또는 분비신호서열 각각을 코딩하는 DNA 서열에 라이게이션하거나 이들 서열을 적당한 PCR 증폭 전략에 의하여 조립하고 복제나 삽입에 필요한 정보를 함유하는 적당한 벡터에 삽입하는데 사용되는 방법은 당업계 숙련자에게 주지이다 (예를 들어, Sambrook et al., 상기 인용문헌 참조).

숙주세포

숙주세포로 도입되는 본 효소를 코딩하는 DNA 서열은 문제의 숙주세포에 상동이나 비상동일 수 있다. 만약 숙주세포에 상동이면, 즉 숙주세포에 의하여 천연적으로 생산되면, 그것은 전형적으로 그것의 천연적 환경보다는 다른 프로모터 서열이나 만약 적용 가능하다면 다른 분비신호서열 및/또는 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결될 것이다. 용어 "상동"은 문제의 숙주생체에 천연적인 효소를 코딩하는 DNA 서열을 포함하도록 의도된다. 용어 "비상동"은 숙주세포에 의하여 천연적으로는 발현되지 않는 DNA 서열을 포함하도록 의도된다. 따라서, DNA 서열은 다른 생체로부터 유래하거나 합성서열이다.

본 발명의 DNA 구성체나 재조합 벡터가 도입된 숙주세포는 본 효소를 생산할 능력이 있는 어떤 세포일 수도 있고 세균, 효모, 균류 및 식물을 포함하는 고등 진핵세포를 포함한다.

배양에서 본 발명의 효소를 생산할 수 있는 세균 숙주세포의 예는 B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium, 또는 B. thuringiensis의 균주 같은 Bacillus의 균주나 S. lividans나 S. murinus 같은 Streptomyces의 균주 같은 그램-포지티브 세균이나 Escherichia coli 같은 그램-네거티브 세균이다.

세균의 형질전환은 원형질체 형질전환, 일렉트로포레이션, 접합, 또는 당업계에 알려진 수단 (상기 Sambrook et al. 참조)에 의하여 컴피턴트 세포를 사용하여 달성된다.

E. coli 같은 세균에서 효소를 발현할 때, 효소는 전형적으로 (봉입체라고 알려진) 불용성 과립으로서 세포질에 유지되거나, 세균 분비서열에 의하여 세포주변공간으로 이동된다. 전자의 경우, 세포는 용해되어 과립이 회수되고 변성된 다음 효소는 변성작용제의 희석에 의하여 리폴딩된다. 후자의 경우 효소는 세포를 파괴하고, 예를 들어 음파처리나 삼투압충격에 의하여 세포주변공간의 내용물을 분출하게하고 효소를 회수하여 세포주변공간으로부터 회수된다.

효소를 Bacillus나 Streptmyces 균주 같은 그램-포지티브 세균에서 발현할 때, 효소는 세포질 내에 유지되거나 세균 분비서열에 의하여 세포외 배지로 이동된 다. 후자의 경우, 효소는 하기된 대로 배양물에서 회수된다.

서브틸라제의 생산방법

본 발명은 본 발명에 따라 분리된 효소를 생산하는 방법을 제공하며, 효소를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환된 적당한 숙주 세포는 효소의 생산을 허용하는 조건 하에서 배양되고 결과적 효소는 배양물로부터 회수된다.

효소를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터는 본 발명의 효소의 비상동 재조합생산을 가능케하도록 비상동 숙주 세포 내로 형질전환된다.

따라서, 상동성 불순물이 없는 것을 특징으로 하는 고정제된 서브틸라제 조성물을 생산하는 것이 가능하다.

이 문맥에서 상동성 불순물은, 본 발명의 효소가 처음 얻어진 상동성 세포에서 유래한 어떤 불순물 (예를 들어, 본 발명의 효소외의 다른 폴리펩티드)도 의미한다.

형질전환된 숙주세포를 배양하는데 사용되는 배지는 문제의 숙주세포를 성장시키는데 적당한 어떤 전통적 배지도 될 수 있다. 발현된 서브틸라제는 배양배지 내로 편리하게 분비되며, 원심분리나 여과에 의하여 배지에서 세포를 분리하고, 암모늄 설페이트 같은 염에 의하여 단백질 조성을 침전시킨 다음 이온교환수지, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 주지의 방법에 의하여 그것으로부터 회수될 수 있다.

본 발명의 서브틸라제 변이체의 사용

본 발명의 서브틸라제 변이체는 특히 세제산업 내에서 다수의 산업적 응용에 사용된다.

게다가, 본 발명은 본 발명의 서브틸라제 변이체를 포함하는 효소 조성물에 관련된다.

바람직한 산업적 응용과 대응하는 바람직한 효소 조성물의 개요가 하기된다.

본 개요는 어떤 식으로도 본 발명의 서브틸라제 변이체의 적당한 응용의 열거를 완성하려고 의도되지 않는다. 본 발명의 서브틸라제 변이체는 프로테아제, 특히 서브틸라제의 사용을 포함하는 당업계 공지의 다른 산업적 응용에 사용될 수 있다.

돌연변이 효소를 포함하는 세제 조성물

본 발명은 본 발명의 돌연변이 효소의 세척과 세제 조성물에의 이용과 돌연변이 서브틸라제 효소를 포함하는 이 같은 조성물을 포함한다. 이 같은 세척과 세제 조성물은 당업계에 잘 기술되어 있으며 WO 96/34946; WO 97/07202; WO 95/30011이 적당한 세척과 세제 조성물의 그 이상의 기술에 대한 참고문헌이다.

더우기, 하기 실시예(들)은 본 발명의 서브틸라제 변이체에 대한 세척능의 개선을 기술한다.

세제 조성물

본 발명의 효소는 세제 조성물에 첨가되고 따라서 세제 조성물의 구성성분이된다.

본 발명의 세제 조성물은 얼룩진 직물의 전처리 세탁 첨가제 조성물과 헹굼제 첨가 직물 유연제 조성물을 포함하는 예를 들어 손세탁이나 기계세탁 세제 조성 물로서 조제되거나, 가내 경표면 세탁 조작에 일반적으로 사용되는 용도의 세제 조성물로서 조제되거나, 또는 식기손세척이나 기계식기세척 조작용으로 조제된다.

구체적 측면에서, 본 발명은 본 발명의 효소를 포함하는 세제 첨가물을 제공한다. 세제 조성물 뿐 아니라, 세제 첨가물은 프로테아제, 리파제, 큐티나제, 아밀라제, 카르보하이드라제, 셀룰라제, 펙티나제, 만난나제, 아라비나제, 갈락타나제, 크실라나제, 옥시다제, 예를 들어 락카제 및/또는 페르옥시다제와 같은 하나 이상의 다른 효소를 포함한다.

일반적으로, 선택된 효소의 특성은 선택된 세제와 양립할 수 있어야 하고, (즉, 최적-pH, 다른 효소와 비-효소적 성분과 양립가능성 등), 효소는 유효한 양으로 존재하여야 한다.

프로테아제: 적당한 프로테아제는 동물, 식물 또는 세균 기원의 것을 포함한다. 세균 기원이 바람직하다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이가 포함된다. 프로테아제는 세린 프로테아제나 메탈로 프로테아제일 수 있고, 바람직하게는 알칼리성 미생물 프로테아제나 트립신-유사 프로테아제이다. 알칼리성 프로테아제의 예는 서브틸리신, 특히 Bacillus에서 유래한 서브틸리신, 예를 들어 서브틸리신 Novo, 서브틸리신 Carlsberg, 서브틸리신 309, 서브틸리신 147 및 서브틸리신 168 (WO 89/06279에 기술됨)이다. 트립신-유사 프로테아제의 예는 트립신 (예를 들어, 돼지나 소 기원의)과 WO 89/06270과 WO 94/25583에 기술된 Fusarium 프로테아제이다.

유용한 프로테아제의 예는 WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 및 WO 98/34946에 기술된 변이체, 특히 하기 위치: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235, 274 중 하나 이상에서 치환된 변이체이다.

바람직한 시중구입 가능한 프로테아제 효소는 Alcalase^TM, Savinase^TM, Primase^TM, Duralase^TM, Esperase^TM, Kannase^TM (Novo Nordisk A/S), Maxatase^TM, Maxacal^TM, Maxapem^TM, Properase^TM, Purafect^TM, Purafect OxP^TM, FN2^TM 및 FN3^TM (Genencor International Inc.) 포함한다.

리파제: 적당한 리파제는 세균이나 균류 기원을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이가 포함된다. 유용한 리파제의 예는 Humicola (동의어 Thermomyces), 예를 들어 EP 258 068과 EP 305 216에 기술된 H. lanuginosa (T. lanuginosus) 또는 WO 96/13580에 기술된 H. insolens 유래 리파제, Pseudomonas 리파제, 예를 들어 P. alcaligenes나 P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonous 종 균주 SD 705 (WO 95/06720과 WO 96/27002), P. wisconsinesis 유래 리파제, Bacillus 리파제, 예를 들어 B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) 또는 B. pumilus (WO 91/16422) 유래 리파제를 포함한다.

다른 예는 WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 및 WO 97/07202에 기술된 것과 같은 리파제 변이체이다.

바람직한 시중구입가능한 리파제 효소는 Lipolase^TM와 Lipolase Ultra^TM (Novo Nordisk A/S)를 포함한다.

아밀라제: 적당한 아밀라제 (α및/또는 β)는 세균이나 균류 기원을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이가 포함된다. 아밀라제는 예를 들어 Bacillus, 예를 들어 GB 1,296, 839에 더 상세하게 기술된 B. licheniformis의 특정 균주에서 얻어진 α-아밀라제를 포함한다.

유용한 아밀라제의 예는 WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, 및 WO 97/43424에 기술된 변이체, 특히 하기의 위치: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 및 444에 하나 이상의 치환을 가지는 변이체이다.

시중구입가능한 아밀라제는 Duramyl^TM, Termamyl^TM, Fungamyl^TM 및 BAN ^TM (Novo Nordisk A/S), Rapidase^TM, 및 Purastar^TM( Genencor International Inc. 유래)이다.

셀룰라제: 적당한 셀룰라제는 세균이나 균류 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이가 포함된다. 적당한 셀룰라제는 Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium 속 유래 셀룰라제, 예를 들어 US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 및 WO 89/09259에 개시된 Humicola insolens, Myceliophthora thermophila 및 Fusarium oxysporum 로부터 생산되는 셀룰라제이다.

특히 적당한 셀룰라제는 색상보호 잇점이 있는 알칼리성이나 중성 셀룰라제이다. 이 같은 셀룰라제의 예는 EP O 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940에 기술된 셀룰라제이다. 셀룰라제 변이체의 다른 예는 WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 및 PCT/DK98/00299에 기술된 것이다.

시중구입가능한 셀룰라제는 Celluzyme^TM, Carezyme^TM (Novo Nordisk A/S), Clazinase^TM, Puradax HA^TM (Genencor International Inc.) 및 KAC-500(B)^TM (Kao Corporation)을 포함한다.

페르옥시다제/옥시다제: 적당한 페르옥시다제/옥시다제는 식물, 세균 또는 균류 기원을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이를 포함한다. 유용한 페르옥시다제의 예는 Coprinus, 예를 들어 WO 93/24618, WO 95/10602, 및 WO 98/15257에 기술된 것과 같은 C. cinereus에서 유래한 페르옥시다제와 그것의 변이체를 포함한다.

시중구입 가능한 페르옥시다제는 Guardzyme^TM (Novo Nordisk A/S)을 포함한다.

세제 효소는 하나 이상의 효소를 함유하는 개별 첨가제를 첨가하거나 이들 효소 모두를 포함하는 조합 첨가제를 첨가하여 세제 조성물에 포함된다. 본 발명의 세제 첨가제, 즉 개별 첨가제나 조합 첨가제는 예를 들어 과립, 액상, 슬러리 등으로서 조제될 수 있다. 바람직한 세제 첨가제 조제는 과립, 특히 무-분진 과립, 액 체, 특히 안정화 액체, 또는 슬러리이다.

무-분진 과립은, 예를 들어 US 4,106,991과 4,661,452에 기술된 대로 생산되고, 선택적으로 당업계 공지의 방법에 의하여 코팅된다. 왁스상 코팅 물질의 예는 평균 분자량 1000 내지 20000의 폴리(에틸렌 옥사이드) 제품 (폴리에틸렌 글리콜, PEG); 16 내지 50 에틸렌 옥사이드 단위체를 가지는 에톡실레이티드 논일페놀; 알콜은 12 내지 20 탄소를 함유하고 15 내지 80 에틸렌 옥시드 단위체가 있는 에톡실화된 지방알콜; 지방알콜; 지방산; 및 지방산의 모노-, 디- 및 트리글리세라이드이다. 액상기술에 적용하기 적당한 필름-형성 코팅물질의 예는 GB 1483591에 주어진다. 액상 효소 제제는 확립된 방법에 따라 예를 들어, 프로필렌 글리콜 같은 폴리올, 설탕 이나 설탕알콜, 락트산이나 붕산을 첨가하여 안정화된다. 보호되는 효소는 EP 238,216에 개시된 방법을 따라 준비될 수 있다.

본 발명의 세제 조성물은 어떤 편리한 형태, 예를 들어 막대, 정제, 분말, 과립, 반죽 또는 액상일 수 있다. 액상세제는 전형적으로 70% 까지의 물과 0 내지 30% 유기용매를 포함하는 수성이나 비수성이다.

세제 조성물은 비-이온계일 수 있고, 반-극성 및/또는 음이온 및/또는 양이온 및/또는 양성이온계를 포함하는 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 계면활성제는 전형적으로 중량으로 0.1% 내지 60% 수준으로 존재한다.

그 안에 포함될 때, 세제는 통상적으로 약 1% 내지 약 40%의 선형 알킬벤젠설포네이트, α-설포 지방산 메틸 에스테르, 알킬-이나 알케닐숙신산, 또는 비누와 같은 음이온계 계면활성제를 포함한다.

그 안에 포함될 때, 세제는 통상적으로 약 0.2% 내지 약 40%의 알콜 에톡실레이트, 논일페놀 에톡실레이트, 알킬폴리글리코사이드, 알킬디메틸아민옥사이드, 에톡실레이티드 지방산 아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드, 또는 글루코자민 ("글루카미드")의 N-아실 N-알킬 유도체와 같은 비이온계 계면활성제를 포함한다.

세제는 0 내지 65%의 제올라이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포네이트, 카르보네이트, 시트레이트, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌디아민테트라아세트산, 디에틸렌트리아민펜타아세트산. 알킬-이나 알케닐숙신산, 가용성 실리케이트나 층상 실리케이트 (예를 들어, Hoechst 유래 SKS-6)같은 혼화제나 복합 작용제를 포함할 수 있다.

세제는 하나 이상의 중합체를 함유할 수 있다. 예는 카르복시메틸셀룰로스, 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(비닐알콜), 폴리(비닐피리딘-N-옥사이드), 폴리 (비닐이미다졸), 폴리아크릴레이트 같은 폴리카르복실레이트, 말산/아크릴산 공중합체 및 로릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체이다.

세제는 테트라아세틸렌디아민이나 논애노일옥시벤젠설포네이트 같은 페르애시드-형성 표백제 활성제와 조합할 수 있는 페르보레이트나 페르카보네이트 같은 H₂O₂ 원을 포함하는 표백제 시스템을 함유할 수 있다. 대안으로, 표백제 시스템은 예를 들어 아미드, 이미드, 또는 설폰 형의 페르옥시산을 포함할 수 있다.

본 발명의 세제 조성물의 효소는 종래 안정화 작용제, 예를 들어 프로필렌 글리콜이나 글리콜 같은 폴리올, 설탕이나 설탕알콜, 락트산, 붕산이나 붕산 유도체, 예를 들어 방향족 보레이트 에스테르, 4-포르밀페닐 붕산 페닐 붕산 유도체를 사용하여 안정화될 수 있고 조성물은 예를 들어 WO 92/19709와 WO 92/19708에 기술된 대로 조제될 수 있다.

세제는 또한 예를 들어 진흙을 포함하는 직물 컨디셔너, 거품촉진제, 서드 (suds) 억제제, 항-부식제, 염료, 항세균제, 광학광택제, 방향물질, 변색 저해제, 또는 향수 같은 다른 종래 세제 성분을 함유할 수 있다.

세제 조성물에 어떤 효소, 특히 본 발명의 효소는 세척액 리터 당 0.01 내지 100mg 효소 단백질, 바람직하게는 세척액 리터 당 0.05 내지 5mg 효소단백질, 특히 세척액 리터 당 0.1 내지 1mg 효소단백질에 대응하는 양으로 첨가되는 것으로 현재 의도된다.

본 발명의 효소는 여기에 참고문헌으로 수록된 WO 97/07202에 개시된 세제 조제물에 추가적으로 삽입될 수 있다.

가죽산업에의 응용

본 발명의 서브틸라제는 가죽산업에서, 특히 가죽의 탈모 용으로 사용된다.

상기 응용에서, 본 발명의 서브틸라제 변이체는 다른 프로테아제를 더 포함하는 효소 조성물에서 바람직하게 사용된다.

적당한 다른 프로테아제의 더 상세한 기술에 대하여는 세제 조성물 용도로 적당한 효소와 관련된 편을 참조하시오 (상기 참조).

모직물산업에의 응용

본 발명의 서브틸라제는 모직물산업에, 특히 모를 함유한 직물의 세탁용으로 사용된다.

상기 응용에서, 본 발명의 서브틸라제 변이체는 다른 프로테아제를 더 포함하는 효소 조성물에서 바람직하게 사용된다.

적당한 다른 프로테아제의 더 상세한 기술에 대하여는 세제 조성물 용도로 적당한 효소와 관련된 편을 참조하시오 (상기 참조).

본 발명은 청구된 본 발명의 범위를 어떤 식으로도 제한하려는 의도가 아닌 하기 실시예에서 더 상세하게 기술된다.

재료와 방법

균주:

B. subtilis DN1885 (Diderichsen et al., 1990).

B. lentus 309와 147은 Bacillus lentus의 특정 균주이며, NCIB와 함께 기탁되고 기탁번호 NCIB 10309와 10147을 부여받고, 여기 참고문헌으로 수록된 미국 특허 3,723,250에 기술된다.

E. coli MC 1000 (M.J. Casadaban과 S.N. Cohen (1980); J. Mol. Biol. 138 179-207)은 종래 방법에 의하여 r^-, m⁺ 가 되었고, 또한 미국특허 039,298에 기술된다.

플라스미드:

pJS3: 서브틸라제 309를 코딩하는 합성 유전자를 함유하는 E. coli - B. subtilis 셔틀 벡터 (Jacob SchiØdt et al. Protein and Peptide letters 3:39-44 (1996)).

pSX222: B. subtilis 발현벡터 (WO 96/34946에 기술됨).

일반 분자생물학 방법:

별도로 언급되지 않으면 DNA 조작과 형질전환은 분자생물학 표준방법을 사용하여 수행되었다 (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology", John Wiley와 Sons, 1995; Harwood, C. R.와 Cutting, S.M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus", John Wiley와 Sons, 1990).

DNA 조작용 효소는 공급자의 명세에 따라 사용되었다.

DNA 조작용 효소

별도로 언급되지 않으면, 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제, 리가제 등과 같은 모든 DNA 조작용 효소는 New England Biolabs, Inc.로부터 구입된다.

단백질 분해활성

본 발명과 관련하여 단백질분해활성은 킬로 NOVO 프로테아제 단위 (KNPU)로 표현된다. 활성은 효소 표준 (SAVINASE

)에 대하여 상대적으로 측정되고, 측정은 표준 조건, 즉 50℃, pH 8.3, 9분의 반응시간, 3분의 측정시간에서 단백질분해효소에 의한 디메틸 카제인 (DMC) 용액의 가수분해에 기초한다. 폴더 AF 220/1이 요구에 따라 Novo Nordisk A/S, Denmark로부터 이용가능하고 이 폴더는 여기 참고문헌 으로 수록되어 있다.

GU는, 표준조건 하, 15분간 40℃에서 N-아세틸 카제인을 기질로 1mmole 글리신과 등가인 NH₂-기의 양을 생산하는 단백질분해효소활성으로 정의되는 글리신 단위이다.

효소활성은 또한 용해성 기질인 숙신일-알라닌-알라닌-프롤린-페닐-알라닌-파라-니트로-페놀과의 반응에 따르며, Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, T.M., Goodlander, B.D., Garrison, P.H., 및 Smith, L.A., (1988)에 기술된 PNA 분석에 의하여 측정될 수 있다.

발효:

서브틸라제 효소의 생산을 위한 발효는 30℃에서 5일간 BPX 배지를 함유하는 방해판이 있는 500ml Erlenmeyer 플라스크 내에서 회전진탕 테이블 (300 r.p.m.) 상에서 수행된다.

결과적으로, 예를 들어 2리터 육즙를 생산하기 위하여 20 Erlenmeyer 플라스크가 동시에 발효되었다.

배지:

BPX배지 조성 (리터당)

감자전분 100g

보리분말 50g

콩분말 20g

Na₂HPO₄ x 12H₂O 9g

플루론 0.1g

카제인산 나트륨 10g

배지 내 전분은 α-아밀라제로 액상화되고 배지는 120℃에서 45분간 가열하여 멸균된다. 멸균 후, 배지의 pH는 0.1M NaHCO₃ 의 첨가에 의하여 9로 조정된다.

실시예 1

효소 변이체의 제조와 발현

부위-특이적 돌연변이유발:

활성부위 루프 (b) 내 위치 102와 103 사이에 특정 삽입을 포함하는 본 발명의 서브틸라제 309 부위특이적 돌연변이는 원하는 삽입을 함유하는 올리고의 PCR에 의하여 생산된 DNA 단편 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor, 1989)의 전통적 클로닝에 의하여 생산되었다 (하기 참조).

주형 플라스미드 DNA는 pJS3이나 서브틸라제 309의 변이체를 포함하는 이것의 유도체였다.

삽입은 올리고-유도 돌연변이유발에 의하여 G102GX (X=위치 102와 103 사이에 삽입되는 임의의 아미노산 잔기) 삽입 변이체의 제조에 도입되어 G102GX 서브틸라제 309 변이체가 되었다.

서브틸라제 309 변이체는 E. coli 내로 형질전환되었다. 이 형질전환체의 하루밤 배양으로부터 정제된 DNA는 제한 엔도뉴클레아제 가수분해, DNA 단편의 정제, 라이게이션, B. subtilis의 형질전환에 의하여 B. subtilis 내로 형질전환되었다.

B. subtilis의 형질전환은 Dubnau et al., 1971, J. Mol. Biol. 56, pp. 209-221에 의하여 기술된 바대로 수행되었다.

편재된 영역 내로의 무작위 삽입을 삽입시키기 위한 편재된 무작위돌연변이유발:

편재된 무작위돌연변이유발을 수행하는데 사용된 전체적 전략은 다음과 같았다:

삽입 부위에 양쪽으로 접한 DNA 서열에 대응하고, 삽입을 정의하는 DNA 염기쌍에 의하여 분리되는 돌연변이유발 프라이머 (올리고뉴클레오티드)가 합성되었다.

그 다음, 결과적 돌연변이유발 프라이머는 적당한 상대 프라이머와 함께 PCR 반응에서 사용되었다. 결과적 PCR 단편은 엔도뉴클레아제에 의하여 가수분해되고 E. coli-B. subtilis 셔틀 벡터 내로 클론되기 전에, 제 2차 PCR-반응에 의하여 정제되고 연장되었다 (하기 참조).

대안으로, 만약 필요하다면, 결과적 PCR 단편은 제 2의 적당한 상대 프라이머와 함께 제 2차 PCR 반응의 프라이머로 사용되어 가수분해와 돌연변이유발된 영역의 셔틀벡터 내로의 클로닝을 허용한다. PCR 반응은 정상 조건 하에서 수행된다.

이 전략에 따라, SAVINASE에서 위치 102와 103 사이 활성부위 루프 영역에서 삽입이 도입된, 편재된 무작위돌연변이 라이브러리가 제조되었다.

모든 20가지 아미노산이 존재하도록(N = 25%의 A, T, C 및 G이고, S = 50%의 C와 G) 돌연변이유발 프라이머에 의하여(하기 참조) 돌연변이가 도입되었다. 생산된 PCR 단편은, 프라이머; 5' CTA AAT ATT CGT GGT GGC GC 3' (센스)와 5' GAC TTT AAC AGC GTA TAG CTC AGC 3' (안티센스)에 의한 PCR-증폭으로 생산된 PCR-단편과 겹치는 서열의 조합에 의한 다시 한번의 PCR 순환에 의하여 Savinase의 N-말단 방향으로 연장되었다. 연장된 DNA-단편은 변형된 플라스미드 pJS3의 Hind III-와 Mlu I- 부위 (상기 참조) 내로 클로닝되고 10 개의 무작위로 선택된 E. coli 콜로니를 서열결정하여 고안된 돌연변이를 확인하였다.

돌연변이유발 프라이머 (5' CTA GGG GCG AGC GGT TCA GGT NNS TCG GTC AGC TCG ATT GCC CAA 3'(센스))가 플라스미드 pJS3 내 Mlu I 부위의 하류에 위치한 적당한 안티센스 상대 프라이머 (예를 들어, 5'- CCC TTT AAC CGC ACA GCG TTT -3' (안티센스))와 함께 플라스미드 pJS3을 주형으로 하는 PCR 반응에 사용되었다. 이 결과적 PCR 산물은 제한효소 HindIII와 MluI의 사용에 의하여 pJS3 셔틀 벡터에 클로닝 되었다.

무작위 라이브러리는 주지의 기술에 의하여 E. coli 내로 형질전환되었다.

준비된 라이브러리는 라이브러리 당 대략 100,000 가지의 개별 클론을 포함하였다.

무작위로 선택된 콜로니는 고안된 돌연변이의 확인을 위하여 서열결정되었다.

본 발명의 서브틸라제 변이체를 정제하기 위하여, 본 발명의 변이체를 포함 하는 B. subtilis pJS3 발현 플라스미드가 컴피턴트 B. subtilis 균주 내로 형질전환되었고 10 ㎍/ml 클로람페니콜 (CAM)을 함유하는 배지 내에서 상기된 대로 발효되었다.

실시예 2

효소 변이체의 정제:

이 과정은 Bacillus 숙 주세포 내 본 발명의 서브틸라제 생산을 위한 2리터 규모 발효의 정제에 관련된다.

대략 1.6 리터의 발효 육즙을 5000rpm에서 35분간 1리터 비커에서 원심분리하였다. 10% 아세트산을 사용하여 상층액을 pH6.5로 조정하였고 Seitz Supra S100여과평판상에서 여과하였다.

여과산물은 Amicon S1Y10 UF 카트리지가 장치된 Amicon CH2A UF 유니트를 사용하여 대략 400ml로 농축하였다. UF 농축물을 원심분리하고 Bacitracin 친화성 컬럼에 실온, pH7에서 흡수시키기 전에 여과하였다. 프로테아제는 0.01M 디메틸글루탈산, 0.1M 붕산 및 0.002M 염화칼슘을 함유하며 pH 7로 조정된 완충액 내의 25% 2-프로판올과 1M 염화나트륨을 사용하여 Bacitracin 칼럼으로부터 실온에서 용출하였다.

Bacitracin 정제 단계로부터의 프로테아제 활성을 가지는 분획을 조합하여 pH 6.5로 조정된 0.01M 디메틸글루탈산, 0.2M 붕산 및 0.002M 염화칼슘을 함유하는 완충액으로 평형화된 750ml 세파덱스 G25 칼럼 (5 cm 지름)에 적용하였다.

세파덱스 G25 컬럼으로부터의 단백질가수분해 활성이 있는 분획은 조합하여 pH 6.5로 조정된 0.01M 디메틸글루탈산, 0.2M 붕산 및 0.002M 염화칼슘을 함유하는 완충액으로 평형화된 150ml CM 세파로스 CL 6B 양이온교환수지 컬럼 (5cm 지름)에 적용하였다.

프로테아제는 2리터의 동일한 완충액 내 0 내지 0.1M 염화나트륨 선형구배 (서브틸리신 147의 경우에는 0 내지 0.2M 염화나트륨)을 사용하여 용출하였다.

최종 정제단계에서 CM 세파로스 컬럼으로부터의 프로테아제 함유 분획을 조합하여 GR81PP 막 (Danish Sugar Factories Inc. 유래)으로 장치된 Amicon 초원심분리 단위체에서 농축하였다.

실시예 1의 제조와 발효 기술 및 상기 분리단계을 사용하여 하기 서브틸리신 309 변이체가 생산되고 분리되었다:

G102GT

G102GS

G102GA

G102GD

G102GE

G102GP

G102GG

G102GH

G102GI

G102GT+Y167A

이들 변이체는 예비분석에서 Savinase보다 좋은 세척수행능을 나타냈다.

실시예 3

효소 변이체를 함유하는 세제 조성물의 세척수행능

하기 실시예는 표시된 조건 하에서 수행된 다수의 세척 시험으로부터의 결과를 제공한다.

소규모세척

세척조건:

	유럽	미국
세제 투여량	4g/l	1g/l
세척온도	30℃	25℃
세척시간	30분	10분
물의 경도	18°dH (Ca2+/Mg2+ = 5:1)	6°dH (Ca2+/Mg2+ = 2:1)
pH	조정하지 않음	조정하지 않음
효소 농도	1, 2, 5, 10, 30, nM	1, 2, 5, 10, 30, nM
시험 시스템	교반막대를 가지는 150ml 유리비커	교반막대를 가지는 150ml 유리비커
직물/부피	50ml 세제 내에 5 개의 직물조각 (Ø2.5cm)	50ml 세제 내에 5 개의 직물조각 (Ø2.5cm)
시험물질	EMPA116	EMPA117

세제:

사용된 세제는 각각 덴마크 (OMO, 데이터시트 ED-9745105)와 미국 (Wisk, 데이터시트 ED-9711893)의 수퍼마켓에서 구입하였다. 사용 전에 세제 내 모든 효소활성은 마이크로파장 처리로 불활성화 시켰다.

견본:

사용된 견본은 EMPA Testmaterialen, Movenstrasse 12, CH-9015 St. Gall, Switzerland에서 구입한 EMPA116과 EMPA117이었다.

반사율

시험물질 상의 반사율 (R)의 측정은 460nm에서 Macbeth ColorEye 7000 광측정계를 사용하여 수행되었다. 측정은 제조자의 프로토콜에 따라 수행되었다.

평가

서브틸라제의 세척수행능의 평가는 관찰되는 서브틸라제에 대한 개선계수나 수행능 계수에 의하여 결정된다.

개선계수, IF_{투여량/반응}은 서브틸라제 농도가 0으로 점근되는 곳에서 관찰되는 서브틸라제를 함유하는 세제와 기준 서브틸라제를 함유하는 세제에 대한 세척수행능의 기울기의 비로 정의된다.

IF_{투여량/반응} = a/a_ref

세척능은 식 I:

R = R₀ + a ·ΔR_max ·c /(ΔR_max + a ·c) (I)

에 따라 계산되며 여기에서,

R은 반사단위에서 세척수행능; R₀는 곡선의 Y절편; a는 c →0 일때의 곡선의 기울기; c는 효소농도; ΔR_max 는 c →∞일때 이론적 최대 세척능이다.

수행능계수, P는 식 II:

P = ( R_변이체 -R_블랭크 )/( R_Savinase -R_블랭크 )

에 따라 계산되며 여기에서,

R_변이체 는 10nM 변이체로 세척된 시험물질의 반사율; R_Savinase 는 10nM Savinase로 세척된 시험물질의 반사율; R_블랭크 는 효소 없이 세척된 시험물질의 반사율이다.

US (세제: US Wisk, Swatch: EMPA117)

변이체	IF투여량/반응	P
G102GA		1.3
G102GT	>3	2.3

본 발명의 서브틸라제는 따라서 Savinase

에 비하여 개선된 세척능을 나타내는 것으로 보인다.

SEQUENCE LISTING <110> NOVOZYMES A/S <120> Subtilase enzymes of the I-S1 and I-S2 sub-groups having an ad-ditional amino acid residue in an active site loop region. <130> 5797.204 <150> PA 1998 01671 <151> 1998-12-18 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 275 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 1 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val 1 5 10 15 Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly 50 55 60 Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val 65 70 75 80 Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn 85 90 95 Ser Ser Gly Ser Gly Xaa Thr Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala 130 135 140 Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly 145 150 155 160 Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr 195 200 205 Tyr Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr 245 250 255 Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275 <210> 2 <211> 270 <212> PRT <213> Bacillus lentus <400> 2 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Xaa Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp 100 105 110 Ala Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro 115 120 125 Ser Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg 130 135 140 Gly Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp 165 170 175 Gln Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp 180 185 190 Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr 195 200 205 Tyr Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly 210 215 220 Ala Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln 225 230 235 240 Ile Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn 245 250 255 Leu Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 270

Claims (34)

1. 위치 95 내지 103의 활성부위 루프 (b) 영역의 위치 102에 1개의 추가적 아미노산 잔기를 가짐으로써, 상기 추가적 아미노산 잔기는 위치 102과 103 사이의 1개의 아미노산 잔기의 삽입에 대응하고, 아미노산 잔기는 T, A, S, D, E, P, G, H, 및 I로 구성되는 군으로부터 선택되고;

   서브틸라제 효소는

   (a) 아미노산 서열:

   1 10 20 30

   A-Q-T-V-P-Y-G-I-P-L-I-K-A-D-K-V-Q-A-Q-G-F-K-G-A-N-V-K-V-A-V

   40 50 60

   L-D-T-G-I-Q-A-S-H-P-D-L-N-V-V-G-G-A-S-F-V-A-G-E-A-*-Y-N-T-D

   70 80 90

   G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-V-A-A-L-D-N-T-T-G-V-L-G-V-A-P-S-V-S-L

   102a 110 120

   Y-A-V-K-V-L-N-S-S-G-S-G-X-T-Y-S-G-I-V-S-G-I-E-W-A-T-T-N-G-M-D

   130 140 150

   V-I-N-M-S-L-G-G-P-S-G-S-T-A-M-K-Q-A-V-D-N-A-Y-A-R-G-V-V-V-V

   160 170 180

   A-A-A-G-N-S-G-S-S-G-N-T-N-T-I-G-Y-P-A-K-Y-D-S-V-I-A-V-G-A-V

   190 200 210

   D-S-N-S-N-R-A-S-F-S-S-V-G-A-E-L-E-V-M-A-P-G-A-G-V-Y-S-T-Y-P

   220 230 240

   T-S-T-Y-A-T-L-N-G-T-S-M-A-S-P-H-V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-N

   250 260 270

   L-S-A-S-Q-V-R-N-R-L-S-S-T-A-T-Y-L-G-S-S-F-Y-Y-G-K-G-L-I-N-V

   275

   E-A-A-A-Q

   을 가지는 서브그룹 I-S1에 속하는 서브틸라제 또는

   (b) 아미노산 서열:

   1 10 20 30

   A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-

   40 50 60

   L-D-T-G-I-*-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-*-S-T-Q-D-

   70 80 90

   G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-E-L-

   102a 110 120

   Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-X-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-

   130 140 150

   V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-

   160 170 180

   A-A-S-G-N-S-G-A-*-G-S-I-S-*-*-*-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-

   190 200 210

   D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-

   220 230 240

   G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-

   250 260 270

   W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-

   275

   E-A-A-T-R

   을 가지는 서브그룹 I-S2에 속하는 서브틸라제, 또는

   (c) (a) 또는 (b)의 서브틸라제와 95% 이상의 동일성을 갖는 상동성 서브틸라제인 것을 특징으로 하는 서브틸라제 효소.
2. 제 1 항에 있어서,

   G102GA,

   G102GT,

   G102GG,

   G102GS,

   G102GD,

   G102GE,

   G102GH,

   G102GI,

   G102GP, 및

   G102GT+Y167A

   를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 서브틸라제 효소.
3. 제 1 항에 있어서, K27R, *36D, S57P, N76D, S87N, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, Y167X, R170X, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L, T274A, P129K, P131H, A133P, A133D, 및 A194P를 포함하는 군으로부터 선택된 변형을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 서브틸라제 효소.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 변형은 S101G+V104N, S87N+S101G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A, N76D+S103A+V104I 또는 N76D+V104A, 또는 이들 돌연변이 (V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A)의 다른 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 서브틸라제 효소.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 서브틸라제 효소를 코딩하는 분리된 DNA 서열.
6. 제 5 항의 분리된 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
7. 제 6 항의 발현 벡터로 형질전환된 미생물 숙주세포.
8. 제 7 항에 있어서, 미생물 숙주세포는 Bacillus lentus인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주세포.
9. 제 7 항에 있어서, 미생물 숙주세포는 Aspergillus인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주세포.
10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 서브틸라제 효소를 생산하는 방법으로서, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 서브틸라제 효소를 코딩하는 분리된 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 미생물 숙주 세포를 상기 효소의 발현과 분비에 도움이 되는 조건하에서 배양하고 효소를 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 서브틸라제 효소를 포함하는 조성물.
12. 제 11 항에 있어서, 셀룰라제, 리파제, 큐티나제, 산화환원효소, 다른 프로테아제 또는 아밀라제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제 11항에 있어서, 조성물은 세제 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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