KR100767710B1 - 위치 97 및 98 사이에 적어도 하나의 추가의 아미노산잔기를 가지는 ｉ-ｓ1 및 ｉ-ｓ2 아군의 서브틸라제 효소 - Google Patents

위치 97 및 98 사이에 적어도 하나의 추가의 아미노산잔기를 가지는 ｉ-ｓ1 및 ｉ-ｓ2 아군의 서브틸라제 효소 Download PDF

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Abstract

위치 95 내지 103 의 활성 루프 (b)영역의 위치 97 에서 추가의 아미노산 잔기를 가지는 I-S1 및 I-S2 아군의 서브틸라제 효소. 변이체 서브틸라제는 모효소에 비하여 세제에서 개선된 세척 성능을 나타낸다.
서브틸라제 효소, 개선된 세척 성능

Description

위치 97 및 98 사이에 적어도 하나의 추가의 아미노산 잔기를 가지는 Ｉ-Ｓ1 및 Ｉ-Ｓ2 아군의 서브틸라제 효소{SUBTILASE ENZYMES OF THE I-S1 AND I-S2 SUB-GROUPS HAVING AT LEAST ONE ADDITIONAL AMINO ACID RESIDUE BETWEEN POSITIONS 97 AND 98}
본 발명은 위치 95 내지 103의 활성 부위 루프 (b) 영역의 위치 97에 적어도 하나의 추가의 아미노산 잔기를 가지는 I-S1 및 I-S2 아군의 신규한 서브틸라제 효소에 관한 것이다. 이 프로테아제는 세제; 클린징 및 세제 조성물에 사용되는 경우에 우수한 또는 개선된 세척 성능 발현에 유용하다. 더욱이 본 발명은 적당한 숙주 세포 또는 유기물에 삽입되는 경우에 상기 효소의 발현을 코딩하는 유전자; 그것으로 형질전환되고 상기 효소 변이체를 발현할 수 있는 숙주 세포, 및 신규한 효소를 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
세제 산업에서 효소가 30 년 이상동안 세제 조성물에 사용되어왔다. 이러한 조성물에 사용된 효소는 프로테아제, 리파제, 아밀라제, 셀룰라제뿐만 아니라 다른 효소 또는 그것의 혼합물을 포함한다. 상업적으로 가장 중요한 효소는 프로테아제이다.
증가일로에 있는 많은 상업적으로 사용되는 프로테아제는 예를 들어, DURAZYM
Figure 112001030091918-pct00006
(Novo Nordisk A/S), PELASE
Figure 112001030091918-pct00007
(Novo Nordisk A/S), MAXAPEM
Figure 112001030091918-pct00008
(Gist-Brocades N.V.), PURAFECT
Figure 112001030091918-pct00009
(Genencor International, Inc.)와 같은 자연 발생 야생형 프로테아제의 단백질 유전자 조작된 변이체이다.
더이상의 많은 프로테아제 변이체는 EP 130756 (GENENTECH) (US 재발행 특허번호 34,606 에 대응 (GENENCOR)); EP 214435 (HENKEL); WO 87/04461 (AMGEN); WO 87/05050 (GENEX); EP 260105 (GENENCOR); Thomas, Russell, 및 Fersht (1985) Nature 318 375-376; Thomas, Russell, 및 Fersht (1987) J. Mol. Biol. 193 803-813; Russel 및 Fersht Nature 328 496-500 (1987); WO 88/08028 (Genex); WO 88/08033 (Amgen); WO 95/27049 (SOLVAY S. A.); WO 95/30011 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/30010 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/29979 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); US 5.543.302 (SOLVAY S. A.); EP 251 446 (GENENCOR); WO 89/06279 (NOVO NORDISK A/S); WO 91/00345 (NOVO NORDISK A/S); EP 525 610 Al (SOLVAY); 및 WO 94/02618 (GIST-BROCADES N. V.)에 개시되어 당업계에 알려진다.
그러나, 많은 유용한 프로테아제 변이체가 개시되었지만, 다양한 산업적 이용을 위한 신규하고 개선된 프로테아제 또는 프로테아제 변이체에 대한 필요성은 여전하다.
그러므로, 본 발명의 목적은 특히 세제 산업에 사용하기 위한 개선된 프로테아제 또는 단백질 유전자 조작된 프로테아제 변이체를 제공하는 것이다.
(발명의 개요)
본 발명은 적어도 하나의 활성 부위 루프가 현재 공지된 것보다 더 긴 서브 틸리신이 세제 조성물에서 개선된 세척 성능을 나타낸다는 것을 발견했다. 서브틸리신 변이체, 특히 모야생형 효소에 비하여 세제 조성물에서 개선된 세척 성능을 나타내는 서브틸리신 309(BLSAVI 또는 Savinase
Figure 112001030091918-pct00010
)를 제조하여 그것을 확인했다.이것은 본 출원인의 이전의 출원 DK1332/97(WO 99/27082 로 공개)에 개시되었다.
위치 95 내지 103 으로부터의 활성 부위 루프 (b) 영역의 위치 97(또는 위치 97 및 98 사이)에 적어도 하나의 추가의 아미노산 잔기를 가지는 I-S1(전형적인 "서브틸리신") 및 I-S2 (고알칼리 서브틸리신)아군의 어떤 서브틸라제 또는 그것의 변이체는 이미 공지되고 상기 출원에 개시된 것에 비하여 상당히 개선된 세척 성능을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. WO 99/27082 에 개시된 위치 97 삽입 변이체는 G97GASG, G97GAA, G97GAS, G97GAS+A98S+S99G, G97GGG+A98S+S99G, G97GAA+A98S+S99G, G97GASG +A98S+S99G+GlOOA+SlOlA 및 G97GAA+A98S+S99G+SlOlT을 포함한다. 이러한 변이체는 본 발명의 범위내가 아니다.
본 발명에 따른 개선된 프로테아제는 천연원으로부터 분리하거나 야생형 서브틸라제의 위치 97 및 98 사이의 활성 부위 루프(b)에 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기를 도입(삽입)함으로써 얻을 수 있다(활성 부위 루프의 정의 및 위치의 넘버링은 하기 참조).
이 발견은 서브틸리신 309 에서 이루어졌지만, 유사한 잇점이 있는 서브틸라제 또는 서브틸라제 변이체의 생산 또는 분리가 가능할 것이라는 것이 예견된다.
더욱이, 서브틸리신 309 와 같이 공지된 야생형 서브틸라제의 활성 부위 루프에 해당하는 것보다 더 긴 활성 부위 루프(b)를 포함하며, 서브틸리신 309 와 같 은 그들과 가장 동류의 공지된 서브틸리신과 비교하여, 세제에서 우수한 세척 성능을 나타내면서 위치 97 및 98 사이에 삽입된 아미노산 잔기를 가지는 것으로 여겨지는 신규한 야생형 서브틸라제를 동정하기 위하여 천연 분리균을 특이적으로 스크리닝하는 것이 가능할 것이다.
배열 및 넘버링 기준에 관한 것은 서브틸리신 BPN'(a) (BASBPN) 및 서브틸리신 309 (BLSAVI)(b) 사이의 배열, 및 서브틸리신 BPN'(a)(BASBPN) 및 서브틸리신 Carlsberg(g) 간의 배열을 보여주는 도 1, 1a, 2 및 2a 에 도시된다. 이러한 배열은 잔기의 넘버링 기준으로 사용된 부출원이다.
7 개의 활성 부위 루프(a) 내지 (g) (지시된 양 말단 아미노산 잔기를 포함) 는 본원에서
(a) 아미노산 잔기 33 내지 43 사이의 영역;
(b) 아미노산 잔기 95 내지 103 사이의 영역;
(c) 아미노산 잔기 125 내지 132 사이의 영역;
(d) 아미노산 잔기 153 내지 173 사이의 영역;
(e) 아미노산 잔기 181 내지 195 사이의 영역;
(f) 아미노산 잔기 202 내지 204 사이의 영역;
(g) 아미노산 잔기 218 내지 219 사이의 영역 절편의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 정의된다.
따라서, 본 발명의 제 1 의 양태는 위치 95 내지 103 으로부터의 활성 부위 루프(b)영역의 위치 97에서 적어도 하나의 추가의 아미노산 잔기를 가지며, 이로써 상기 추가의 아미노산 잔기는 서브틸라제 효소가 G97GASG, G97GAA, G97GAS, G97GAS+A98S+S99G, G97GGG+A98S+S99G, G97GAA+A98S+S99G, G97GASG+A98S+S99G+ GlOOA+SlOlA 및 G97GAA+A98S+S99G+S101T 를 포함하지 않는 것을 조건으로 위치 97 및 98 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기의 삽입에 해당하는 I-S1 및 I-S2 아군의 분리된(즉, 순도 10 % 이상) 서브틸라제 효소에 관한 것이다.
제 2 의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 서브틸라제 변이체를 코딩하는 분리된 DNA 서열에 관한 것이다.
제 3 의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 서브틸라제 변이체를 코딩하는 분리된 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
제 4 의 양태에서, 본 발명은 제 3 의 양태에 따른 발현 벡터로 형질전환된 미생물 숙주 세포에 관한 것이다.
더이상의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 서브틸리신 효소의 생산에 관한 것이다.
본 발명의 효소는 일반적으로 효소가 분리된 미생물 균주를 배양하고 실질적으로 순종 형태의 효소를 회수하거나; 본 발명의 제 3 의 양태에 따른 발현 벡터를 적당한 미생물 숙주에 삽입하고, 원하는 서브틸라제 효소를 발현하도록 숙주를 배양하고, 효소 산물을 회수하는 것에 의해 생산된다.
더이상의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 서브틸라제 또는 서브틸라제 변이체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
더이상의 양태에서, 본 발명은 많은 산업상 관련 용도, 특히 클린징 조성물 및 효소, 특히 본 발명의 서브틸리신 효소를 포함하는 세제 조성물을 포함하는 클린징 조성물에의 본 발명의 효소의 사용에 관한 것이다.
정의
본 발명의 상세한 설명을 하기 전에, 우선 하기의 용어 및 협정이 정의될 것이다.
아미노산의 명명법
A = Ala = 알라닌
V = Val = 발린
L = Leu = 류신
I = Ile = 이소류신
P = Pro = 프롤린
F = Phe = 페닐알라닌
W = Trp = 트립토판
M = Met = 메티오닌
G = Gly = 글리신
S = Ser = 세린
T = Thr = 트레오닌
C = Cys = 시스테인
Y = Tyr = 티로신
N = Asn = 아스파라긴
Q = Gln = 글루타민
D = Asp = 아스파르트산
E = Glu = 글루탐산
K = Lys = 리신
R = Arg = 아르기닌
H = His = 히스티딘
X = Xaa = 어떤 아미노산
핵산의 명명법
A = 아데닌
G = 구아닌
C = 시토신
T = 티민(DNA 에만)
U = 우라실 (RNA 에만)
변이체 표시를 위한 명명법 및 협정
본 발명에 따라서 생산되거나 기대되는 다양한 효소 변이체를 개시하기 전에, 하기의 명명법 및 협정을 기준의 용이성을 위해 채택했다.
기준 플레임은 1 차적으로 서브틸리신 BPN'(BASBPN)을 가지는 분리되거나 모 야생형을 배열함으로써 정의된다.
배열은 갭 생성 패널티 = 8 및 갭 확장 패널티 = 8 의 매개변수(모든 다른 매개변수는 그들의 생략값으로 유지되었다.)를 사용하여 변이체를 넘버링하는 GCG 버전 9.1 의 GAP 루틴에 의해 얻을 수 있다.
다른 방법은 WO 91/00345 에 나타난 배열과 같이 서브틸라제간에 공지된 인식 배열을 사용하는 것이다. 대부분의 경우에 차이는 중요하지 않다.
서브틸리신 BPN'(BASBPN) 및 서브틸리신 309(BLSAVI) 및 서브틸리신 Carlsberg(BLSCAR)간의 배열은 각각 도 1, 도 1a, 2, 및 2a 에 나타난다. 많은 결실 및 삽입이 BASBPN 에 관하여 정의될 것이다. 도 1 에서 서브틸리신 309 는 BASBPN 에 비교하여 위치 36, 58, 158, 162, 163, 및 164 에서 6 개의 결실을 가지는 반면에, 도 1a 에서 서브틸리신 309 는 BASBPN 에 비하여 위치 36, 56, 159, 164, 165, 및 166 에서 같은 결실을 가진다. 도 2에서, 서브틸리신 Carlsberg는 BASBPN 에 비하여 위치 58 에서 1 개의 결실을 가지는 반면에, 도 2a 에서 서브틸리신 Carlsberg 는 BASBPN 에 비하여 위치 56 에서 1 개의 결실을 가진다. 이러한 결실은 도 1, 1a, 2, 및 2a 에서 별표(*)로 표시된다.
야생형 효소에서 수행된 다양한 변형이 일반적으로 하기와 같은 3 개의 요소를 사용하여 표시된다.
본래의 아미노산 위치 치환 아미노산
그러므로 G195E 의 표시는 위치 195 의 글리신을 글루탐산으로의 치환을 의미한다.
위치 치환 아미노산
본래의 아미노산 잔기가 어떤 아미노산 잔기인 경우에, 종종 짧은 표시법만이 위치 및 치환 아미노산을 표시하기 위해 사용될 수 있다.
이러한 표시법은 특히 상동성 서브틸라제의 변형과 관련되어 있다.
본래의 아미노산 위치
이 표시법은 위치에서 특정 아미노산을 치환하는 아미노산 잔기가 중요하지 않은 경우에 사용될 수 있다.
위치
본래의 아미노산 및 치환 아미노산은 어떤 아미노산을 포함할 수 있고, 그 경우에 위치만이 예를 들어, 170 과 같이 표시된다.
본래 아미노산 위치{치환 아미노산}
본래 아미노산 및/또는 치환 아미노산이 모든 아미노산은 아니지만, 하나 이상의 아미노산을 포함하는 경우에, 선택 아미노산은 중괄호{} 내에 표시된다.
특정 변이체의 경우에 어떤 아미노산 잔기를 표시하기 위해서 코드 Xaa 및 X 를 포함하여 특정 3 또는 1 문자 코드가 사용된다.
치환:
위치 195 에서 글리신을 글루탐산으로 치환한 것은:
Gly195Glu 또는 G195E 로 표시되거나,
위치 195 에서 글리신을 어떤 아미노산 잔기 산으로의 치환은
Gly195Xaa 또는 G195X
또는
Gly195 또는 G195 로 표시한다.
따라서, 위치 170 에서 어떤 아미노산 잔기의 세린으로의 치환은
Xaa170Ser 또는 X170S 또는
170Ser 또는 170S 로 나타낼 것이다.
이러한 표시법은 상동성 서브틸라제의 변형과 특히 관련되어 있다(하기 참조). 따라서, 170Ser 은 예를 들어, BASBPN 에서 Lys170Ser 변형 및 BLSAVI에서 Arg170Ser 변형 모두를 포함하는 것을 의미한다(도 1 참조).
본래 아미노산 및/또는 치환 아미노산이 모든 아미노산을 아니지만, 하나 이상의 아미노산을 포함하는 경우에, 위치 170 에서 아르기닌을 글리신, 알라닌, 세린 또는 트레오닌으로 치환하는 것은
변이체 R170G, R170A, R170S, 및 R170T 를 나타내면서
Arg170{Gly, Ala, Ser, Thr} 또는 R170 {G, A, S, T}로 표시한다.
결실 :
위치 195 에서 글리신의 결실은 Gly195* 또는 G195* 으로 표시될 것이다.
상응하여, 위치 195 및 196 에서 글리신 및 류신의 결실과 같은 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실은
Gly195* + Leu196* 또는 G195* + L196* 으로 표시될 것이다.
삽입 :
예를 들어, G195 다음에 리신의 삽입과 같이 추가의 아미노산 잔기의 삽입은:
Gly195GlyLys 또는 G195K; 또는
예를 들어, G195 다음에 Lys, Ala 및 Ser 의 삽입과 같이 하나 이상의 아미 노산 잔기가 삽입되는 경우에,
Gly195GlyLysAlaSer 또는 G195GKAS 로 표시된다.
이 경우에 삽입된 아미노산 잔기는 삽입된 아미노산 잔기에 선행하는 아미노산 잔기의 위치 번호 아래에 문자를 기재하여 넘버링된다. 따라서, 상기 실시예에서 서열 194 내지 196 은 다음과 같다.
194 195 196
BLSAVI A - G - L
194 195 195a 195b 195c 196
변이체 A - G - K - A - S - L
현존하는 아미노산 잔기에 동일한 아미노산 잔기가 삽입되는 경우에, 명명법의 축퇴성이 있을 것이라는 것은 자명하다. 예를 들어, 글리신을 상기 예의 글리신 다음에 삽입하는 경우에, G195GG 로 표시될 것이다. 실제 변형은
194 195 196
BLSAVI A - G - L 을
194 195 195a 196
변이체 A - G - G - L
194 194a 195 196 로의 변형이 A194AG 로 표시되는 것과 같다.
이러한 예는 당업자에게 자명할 것이고, 따라서 이러한 유형의 삽입에 대한 표시 G195GG 및 상응하는 표시는 이러한 등가의 축퇴성 표시를 포함하는 것을 의미한다.
어떤 경우에 변형 및 삽입을 동시에 수행하는 것이 바람직하다. 치환은 또한 본 정의에 포함될 것이다. 따라서, S130TP 는 위치 130 에서 세린이 티로신으로 치환되었고, 프롤린이 위치 130 및 131 사이에 삽입되었다는 것을 나타낸다. 이러한 변이체를 개시하는 복잡한 방식은: S130SP+S130T 와 같을 것이다.
갭 채우기 :
넘버링에 사용된 서브틸리신 BPN' 서열과 비교하여 기준인 효소에 결실이 존재하는 경우, 이러한 위치에서의 삽입은 위치 36 에 아스파르트산의 삽입의 경우:
*36Asp 또는 *36D 로 표시한다.
다중 변형
다중 변형을 포함하는 변이체는 예를 들어,
위치 170 및 195 에서 각각 아르기닌 및 글리신을 티로신 및 글루탐산으로 치환하는 변형을 나타내면서, Argl70Tyr+Glyl95Glu 또는 R170Y+G195E 와 같이 + 로 분리한다. 예를 들어, Tyrl67{Gly,Ala,Ser,Thr}+Argl70{Gly,Ala,Ser,Thr}은 변이체
Tyrl67Gly+Argl7OGly, Tyrl67Gly+Argl7OAla,
Tyrl67Gly+Argl70Ser, Tyrl67Gly+Argl7OThr,
Tyrl67Ala+Argl7OGly, Tyrl67Ala+Argl7OAla,
Tyrl67Ala+Argl70Ser, Tyrl67Ala+Argl7OThr,
Tyrl67Ser+Argl7OGly, Tyrl67Ser+Argl7OAla,
Tyrl67Ser+Argl70Ser, Tyrl67Ser+Argl70Thr,
Tyrl67Thr+Argl70Gly, Tyrl67Thr+Argl7OAla,
Tyrl67Thr+Argl70Ser, 및 Tyrl67Thr+Argl7OThr 를 나타낸다.
이 명명법은 특히 다른 작은 아미노산을 작은 아미노산으로의 치환을 의미하면서 예를 들어, Tyrl67{Gly,Ala,Ser,Thr}+ Argl70{Gly,Ala,Ser,Thr}와 같이 양전하(K, R, H), 음전하(D, E)잔기, 또는 보존 아미노산 변형과 같은 특정 일반 성질을 가지는 아미노산 치환, 대체, 삽입 또는 결실을 목적으로 한 변형과 관련된다. 더욱 상세한 설명을 위해서는 "발명의 상세한 설명" 단락 참조.
아미노산 위치/잔기의 넘버링
다른 언급이 없다면, 본원에 사용된 아미노산 넘버링은 서브틸라제 BPN'(BASBPN) 서열의 넘버링에 해당한다. BPN' 서열의 더이상의 개시를 위해서 도1 및 2, 또는 Siezen 등, Protein engng.4(1991) 719-737 참조.
프로테아제
단백질 기질에서 아미드 결합을 절단하는 효소는 프로테아제, 또는(상호 교환적으로) 펩티다제로 분류된다( Walsh, 1979, Enzymatic Rection Mechanisms. W. H. Freeman and Company, San Francisco, Chapter 3 참조).
세린 프로테아제
세린 프로테아제는 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소이고, 효소내에 활성 부위에서 필수 세린 잔기가 존재한다(White, Handler and Smith, 1973"Principles of Biochemistry,"Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272 참조).
박테리아 세린 프로테아제는 20,000 내지 45,000 달톤 범위의 분자량을 가진 다. 이들은 디이소프로필플루오로포스페이트에 의해 억제된다. 이들은 간단한 말단 에스테르를 가수분해하고 진핵생물 키모트립신뿐만 아니라 세린 프로테아제에 대한 활성에서 유사하다. 아군을 포함하는 좁은 의미의 알칼리 프로테아제는 pH 9.0 내지 11.0 의 어떤 세린 프로테아제의 높은 pH 최적을 반영한다(개관을 위해서, Priest(1997) Bacteriological Rev. 41 711-753 참조).
서브틸라제
세린 프로테아제의 아군을 임시로 Siezen 등., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 및 Siezen 등. Protein Science 6 (1997) 501-523 에 제시된 서브틸라제로 지시한다. 서브틸리신-유사 프로테아제로 이미 명명된 세린 프로테아제의 170 이상의 아미노산 서열의 상동성 분석으로 한정된다. 서브틸리신은 이미 그람-양성 박테리아 또는 균류에 의해 생산된 세린 프로테아제로 정의되고, Siezen 등에 따라서, 현재에는 서브틸라제의 아군이다. 다양한 서브틸라제가 동정되었고, 많은 서브틸라제의 아미노산 서열을 결정했다. 이러한 서브틸라제 및 그들의 아미노산 서열의 더이상의 상세한 설명은 Siezen 등(1997)을 참조한다.
서브틸라제의 하나의 아군, I-S1 또는 "본래" 서브틸리신은 서브틸리신 168(BSS168), 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 Carlsberg(ALCALASE
Figure 112001030091918-pct00011
, NOVO NORDISK A/S), 및 서브틸리신 DY (BSSDY)와 같은 "전통적" 서브틸리신을 포함한다.
서브틸라제의 더이상의 아군, I-S2 또는 고 알칼리 서브틸리신은 Siezen 등으로 인식된다. 아군 I-S2 프로테아제는 고 알칼리 서브틸리신으로 개시되고,subtilisin PB92 (BAALKP) (MAXACAL, Gist-Brocades NV), subtilisin 309 (SAVINASE, NOVO NORDISK A/S), subtilisin 147 (BLS147) (ESPERASE, NOVO NORDISK A/S), 및 알칼리 엘라스타제 YaB (BSEYAB)와 같은 효소를 포함한다.
"SAVINASE
Figure 112001030091918-pct00012
"
SAVINASE
Figure 112001030091918-pct00013
은 NOVO NORDISK A/S 로부터 구입가능하다. B.Lentus 의 서브틸리신 309 이고 1 위치에서만 BAALKP 와 다르다(N87S, 본원의 도1 참조). SAVINASE
Figure 112001030091918-pct00014
은 도1 에 제시된 아미노산 서열을 가진다.
모 서브틸라제
용어 "모 서브틸라제"는 Siezen 등에 따라 한정된 서브틸라제를 개시한다(1991 및 1997). 더이상의 상세한 설명을 위해서 바로 윗단락의 "서브틸라제의 개시를 참조하시오. 모 서브틸라제는 또한 천연원에서 분리된 서브틸라제일 수 있고, 서브틸라제의 특징을 보유하면서 연속적인 변형이 만들어진다. 택일적으로 용어 "모 서브틸라제"는 "야생형 서브틸라제"로 명명될 수 있다.
서브틸라제 변이체의 변형
본원에 사용된 용어 "변형"은 서브틸라제의 화학적 변형뿐만 아니라 서브틸라제를 코딩하는 DNA 의 유전적 조작을 포함하도록 정의된다. 변형은 관심의 아미노산에서 아미노산 측쇄의 치환, 치환, 결실 및/또는 삽입일 수 있다.
서브틸라제 변이체
본원에서, 용어 서브틸라제 변이체 또는 돌연변이화된 서브틸라제는 천연 또는 모유전자를 포함하고 상응하는 모 효소를 생산하는 모 미생물로부터 유도된 돌연변이체 유전자를 발현하는 유기물에 의해 생산된 서브틸라제를 의미하고, 모유전 자는 상기 돌연변이화된 서브틸라제 프로테아제가 적당한 숙주에서 발현된 경우에 생산되는 돌연변이 유전자를 생산하기 위해서 돌연변이화 된다.
상동성 서브틸라제 서열
서브틸라제 SAVINASE
Figure 112001030091918-pct00015
의 특정 활성 부위 루프 영역, 및 아미노산 삽입은 본원에서 본 발명의 서브틸라제 변이체를 얻기위하여 동정된다.
그러나, 본 발명은 특정 서브틸라제의 변형에 제한되는 것이 아니라, SAVINASE
Figure 112001030091918-pct00016
의 상동성 제1의 기질을 가지는 다른 모(야생형) 서브틸라제로 확장된다. 2 개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 본원에서 매개변수 "동일성"으로 개시된다.
2 서브틸라제 간의 상동성 정도를 결정하기 위해서, GCG 패키지 버전 9.1 의 GAP 루틴은 상기에 기지된 같은 셋팅을 사용하여 이용될 수 있다. 루틴으로부터의 결과는 아미노산 배열외에 2 서열간의 "% 동일성"의 계산을 나타낸다.
개시에 기초하여, 적당한 상동성 서브틸라제 및 본 발명에 따라서 변형될 수 있는 상응하는 상동성 활성 부위 루프 영역을 확인하는 것은 당업자에게 용이하다.
세척 성능
예를 들어, 세척 또는 경표면 클린징 동안에 클리닝될 대상에 존재하는 다양한 자연 발생 기질 분해를 촉매하는 효소의 능력을 종종 그것의 세척력, 세제성, 또는 세척 성능으로 말한다. 본 출원에서는 용어 세척 성능은 이 성질을 포함하기 위해 사용될 것이다.
분리된 DNA 서열
DNA 서열 분자에 적용되는 경우에 용어 "분리"는 DNA 서열이 그것의 천연 유전적 환경으로부터 제거되었고, 따라서 다른 외인성 또는 원하지 않는 코드 서열이 없었고, 유전적으로 조작된 단백질 생산 시스템에서의 사용에 적합한 형태라는 것을 나타낸다. 이러한 분리된 분자는 그들의 천연환경으로부터 분리된 것이고, cDNA 및 게놈 클론을 포함한다. 본 발명의 분리된 DNA 분자는 DNA 분자가 통상 결합된 다른 유전자가 없지만, 프로모터 및 터미네이터와 같은 자연 발생 5' 및 3' 비번역 영역을 포함할 수 있다. 결합된 영역의 확인은 당업자에게 자명할 것이다(예를 들어, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985). 용어 "분리된 DNA 서열"은 용어 "클론된 DNA 서열"과 택일적일 수 있다.
분리된 단백질
단백질에 적용하는 경우에, 용어 "분리된"은 단백질이 그것의 천연 환경으로부터 제거되었다는 것을 나타낸다.
바람직한 형태에서, 분리된 단백질은 실질적으로 다른 단백질, 특히 다른 상동성 단백질(즉, "상동성 불순물"(하기 참조))이 결여된다.
분리된 단백질은 SDS-PAGE 로 결정될 때 10% 이상의 순도, 바람직하게는 20% 이상의 순도, 더욱 바람직하게는 30% 이상의 순도이다. 더욱이 SDS-PAGE 로 결정될 때 더 높은 순도 형태, 즉 40% 이상의 순도, 60% 이상의 순도, 80% 이상의 순도, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 순도, 더욱 더 바람직하게는 99% 순도로 제공되는 것이 바람직하다.
용어 "분리된 단백질"은 용어 "정제된 단백질"과 택일적이다.
상동성 불순물
용어 "상동성 불순물"은 본 발명의 폴리펩티드가 본래 기원하는 상동성 세포로부터 기원하는 어떤 불순물(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 제외한 폴리펩티드)을 의미한다.
기원
특정 미생물원과 연관되어 사용될 때, 용어 "기원"은 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드가 특정원, 또는 원의 유전가가 삽입된 세포에 의해 생산되는 것을 의미한다.
기질
프로테아제에 대한 기질과 연관하여 사용될 때, 용어 "기질"은 서브틸리신 프로테아제에 의한 가수분해에 놓이는 적어도 하나의 펩티드 결합을 포함하는 화합물을 포함하는 것과 같은 광범위한 형태로 해석되어야만 한다.
산물
프로테아제 효소적 반응으로 유도된 산물과 연관되어 사용될 때 용어 "산물"은 서브틸라제 프로테아제를 포함하는 가수분해 반응의 산물을 포함하는 것으로 해석되어야만 한다. 산물은 연속적인 가수분해 반응의 기질일 수 있다.
도 1은 상기에 언급된 GAP 루틴을 사용하여 서브틸리신 BPN'(a) 및 SAVINASE
Figure 112001030091918-pct00017
(b) 사이의 배열을 도시한다.
도 1a는 WO 91/00345 에서 취한 것과 같은 서브틸리신 BPN' 및 Savinase
Figure 112001030091918-pct00018
사이의 배열을 도시한다.
도 2는 상기에 언급된 GAP 루틴을 사용하여 서브틸리신 BPN' 및 서브틸리신 Carlsberg 사이의 배열을 도시한다.
도 2a는 WO 91/00345 에서 취한 서브틸리신 BPN' 및 서브틸리신 Carlsberg 사이의 배열을 도시한다.
도 3은 Savinase(단백질 데이타 뱅크 (PDB) entry ISVN)의 3 차원 구조를 도시한다. 도에서 활성 부위 루프(b)가 표시된다.
제1의 양태에서 본 발명의 서브틸라제는 위치 97 및 98 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기의 삽입에 해당하는 추가의 아미노산 잔기에 의해서 위치 95 내지 103 의 활성 부위 루프(b) 의 위치 97 에서 적어도 하나의 추가의 아미노산 잔기를 가지는 I-S1 및 I-S2 의 분리된(즉, 10% 이상의 순도) 서브틸라제 효소에 관한 것이다.
즉, 본 발명의 서브틸라제는 9 개의 아미노산 잔기 이상의 활성 부위 루프(b) 영역을 포함하는 것을 특징으로 하고, 여기에서 추가의 아미노산 잔기는 모 또는 공지된 야생형 서브틸라제와 비교할 때 위치 97 및 98 사이에 삽입된 것이거나 그렇게 여겨질 수 있다.
본 발명의 제1의 양태의 서브틸라제는 천연에서 동정되고 분리된 모 또는 야생형 서브틸라제일 수 있다.
이러한 모 야생형 서브틸라제는 특히 당업계에 알려진 표준 기법으로 스크리 닝될 수 있다.
이것을 행하는 바람직한 방법은 많은 다른 미생물, 바람직하게는 다른 Bacillus 균주의 서브틸라제에서 활성 부위 루프를 코딩하는 것으로 알려진 DNA 영역을 특이적으로 PCR 증폭하는 것일 수 있다.
서브틸라제는 보존 효소의 군이고, 그러한 의미에서 그들의 DNA 및 아미노산 서열은 상동성이다. 따라서, 활성 부위 루프의 양 측면에 위치한 상대적으로 특이적인 프라이머를 제조하는 것이 가능하다.
이것을 행하는 방법은 다른 서브틸라제의 배열을 조사하는 것에 의한다(예를 들어, Siezen 등, Protein Scinece 6(1997) 501-523). BLSAVI 와 같은 I-S1 또는 I-S2 의 어떤 그룹에서 아미노산 잔기 95 내지 103 사이의 활성 부위 루프(b) 에 해당하는 활성 부위 루프의 양 측면에 위치한 PCR 프라이머를 제조하는 것은 당업계의 제조자에게 용이한 일이다. 많은 미생물, 바람직하게는 다른 Bacillus 균주로부터 DNA 를 증폭하기 위해서 이러한 PCR 프라이머를 사용하고, 이어서 상기 증폭된 PCR 단편을 DNA 서열결정하는 것은 예를 들어, BLASVI 와 비교할 때, 위치 95 내지 103 의 활성 부위 루프 영역에 해당하는 더 긴 활성 부위 영역을 포함하고, 삽입은 위치 97 및 98 사이에 존재하는 것으로 여겨질 수 있는 이들 군의 서브틸라제를 생산하는 균주를 동정하는 것을 가능케 한다. 관심의 이러한 서브틸라제의 균주 및 부분적인 DNA 서열을 동정하기 위해서, 이러한 본 발명의 서브틸라제의 클로닝, 발현 및 정제는 당업자에게 용이하다.
그러나, 본 발명의 서브틸라제 효소가 우세하게 모 서브틸라제의 변이체라는 것이 예견된다.
따라서, 한 구체예에서 본 발명은 본 발명의 제1의 양태에 따른 분리된 서브틸라제 효소에 관한 것이고, 여기에서 상기 서브틸라제 효소는 아미노산 잔기 97 및 98 사이에서 적어도 하나의 아미노산 삽입을 가짐으로써 그것의 모 효소보다 더 긴 활성 부위 루프(b)를 가지는 제조된 변이체이다.
본 발명의 서브틸라제는 세제에서 우수한 세척 성능을 나타내고 효소가 제조된 변이체인 경우에 서브틸리신 309 와 같은 그것과 밀접하게 관련된 서브틸라제와 비교하여 세제에서 개선된 세척 성능을 나타낸다.
다른 서브틸라제 생산물은 다른 형태의 세제 조성물에서 다른 세척 성능을 나타낼 것이다. 본 발명의 서브틸라제는 대다수의 이러한 다른 형태의 세제 조성물에 밀접하게 관련된 것과 비교하여 개선된 세척 성능을 가진다.
바람직하게는 본 발명의 서브틸라제 효소는 본원의 실시예 3 에 나타난 세제 조성물과 밀접하게 관련된 것과 비교하여 개선된 세척 성능을 가진다.
주어진 서브틸라제 아미노산 서열(상기 서브틸라제 서열이 모 야생형 서브틸라제 서열 또는 부위 특이적 돌연변이유발을 제외한 방법으로 생산된 서브틸라제 변이체 서열인지와 무관)이 본 발명의 범위내인지를 결정하기 위해서, 하기의 과정이 사용될 수 있다:
i) 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열과 상기 서브틸라제 서열을 배열하는 단계;
ii) 단계 i) 에서 수행된 방법에 기초하여 아미노산 잔기 95 내지 103 사이 의 영역(양 말단 아미노산 포함)을 포함하는 서브틸리신 BPN'의 활성 부위 루프(b) 영역에 해당하는 상기 서브틸라제 서열에서 활성 부위 루프(b)를 확인하는 단계;
iii) 단계 ii) 에서 확인된 상기 서브틸라제 서열의 활성 부위 루프 (b)가 서브틸리신 BPN' 의 활성 부위 루프에 해당하는 것보다 더 긴지와 상기 연장이 위치 97 및 98 사이의 적어도 하나의 아미노산 잔기의 삽입에 해당하는지를 결정하는 단계.
연구되는 서브틸라제가 본 발명의 범위내인 서브틸라제이다.
상기 단계 i) 에서 수행된 배열은 상기에 개시된 GAP 루틴을 사용하여 수행된다.
본 개시에 기초하여 서브틸라제의 활성 부위 루프(b) 를 동정하고, 관심의 서브틸라제가 본 발명의 범위내인지를 확정하는 것은 당업자에게 용이하다. 부위 특이적 돌연변이유발로 변이체가 제조되는 경우에, 서브틸라제 변이체가 본 발명의이 범위내인지를 먼저 아는 것이 선행된다.
본 발명의 서브틸라제 변이체는 부위-특이적/무작위 돌연변이유발 또는 서로 다른 서브틸라제 서열의 DNA 셔플링과 같은 당업계에 공지된 표준 기법으로 제조될 수 있다. 상세한 설명에 대해서는 "서브틸라제 변이체의 생산" 및 "물질 및 방법"단락 참조.
더이상의 구체예에서, 본 발명은
1. 적어도 하나의 아미노산 잔기는 T, G, A, 및 S 를 포함하는 군으로부터 선택되는 본 발명에 따른 분리된 서브틸라제 효소
2. 상기의 적어도 하나의 삽입된 아미노산 잔기는 D, E, H, K, 및 R, 더욱 바람직하게는 D, E, K 및 R 을 포함하는 하전된 아미노산 잔기로부터 선택되는 본 발명에 따른 분리된 서브틸라제;
3. 상기의 적어도 하나의 삽입된 아미노산 잔기는 C, N, Q, S 및 T, 더욱 바람직하게는 N, Q, S 및 T 를 포함하는 친수성 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되는 본 발명에 따른 분리된 서브틸라제 효소;
4. 상기의 적어도 하나의 삽입된 아미노산 잔기는 A, G 및 V 를 포함하는 작은 소수성 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되는 본 발명에 따른 분리된 서브틸라제 효소;
5. 상기의 적어도 하나의 삽입된 아미노산 잔기는 F, I, L, M, P, W 및 Y, 더욱 바람직하게는 F, I, L, M, 및 Y 를 포함하는 더 큰 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되는 본 발명에 따른 분리된 서브틸라제 효소에 관한 것이다.
더이상의 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 분리된 서브틸라제 효소에 관한 것이고, 위치 97 및 98에서 상기 삽입은 서브틸리신 BPN' 의 해당하는 활성 부위 루프와 비교할 때 적어도 2 개의 아미노산을 포함한다.
더이상의 구체예에서, 본 발명은 (BASBPN 넘버링)에서
X97X{T,G,A,S}
X97X{D,E,K,R}
X97X{H,V,C,N,Q}
X97X{F,I,L,M,P,W,Y} 또는, 서브틸리신 309 에 더욱 특이적이고, BAALKP, BLSUBL, 및 BSKSMK
G97GA
G97GT
G97GG G97GS
G97GD
G97GE
G97GK
G97GR
G97GH
G97GV
G97GC
G97GN
G97GQ
G97GF
G97GI
G97GL
G97GM
G97GP
G97GW
G97GY 와 같은 밀접한 관련이 있는 서브틸라제를 포함하는 군으로부터 선택 된 적어도 하나의 삽입을 포함하는 분리된 서브틸라제 효소에 관한 것이다.
더욱이 본 발명은 위치 97, 또는 하기에 언급된 조합의 어떤 것에서 다중 삽입을 포함하는 서브틸라제에 관한 것이다.
어떤 아미노산 잔기를 유사한 아미노산 잔기로의 소위 보존적 치환은 효소의 특징의 단지 미미한 변화를 나타낸다는 것이 당업계에 잘 알려진다.
하기의 표 3은 보존적 아미노산 치환 군의 리스트이다.
보존 아미노산 치환
일반적인 성질 아미노산
염기성(양전하) K = 리신 H = 히스티딘
산성(음전하) E = 글루탐산 D = 아스파르트산
극성 Q = 글타민 N = 아스파라긴
소수성 L = 류신 I = 이소류신 V = 발린 M = 메티오닌
방향족 F = 페닐알라닌 W = 트립토판 Y = 티로신
작은 G = 글리신 A = 알라닌 S = 세린 T = 트레오닌
이 원칙에 따라서, G97A+A98AS+S99G, G97S+A98AT+S99A 과 같은 보존성 치환을 포함하는 서브틸라제 변이체는 서로 많이 다르지 않은 성질을 나타낼 것으로 기대된다.
본원에 개시되고/또는 예증된 서브틸라제 변이체에 기초하여, 유사하게 개선된 세척 성능을 나타내는 다른 서브틸라제 변이체를 얻기 위해서 이러한 변이체에 적당한 보존적 변형을 확인하는 것은 당업자에게 용이하다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 서브틸라제는 천연 또는 인공적인 다양성 생성으로부터 본 발명의 신규한 효소를 분리하고, 모 서브틸라제로부터 변이체를 유전자 조작하고 생산하는 아군 I-S1 및 I-S2, 특히 아군 I-S2 에 속한다.
아군 I-S1의 변이체에 관하여, BSS168 (BSSAS, BSAPRJ, BSAPRN, BMSAMP), BASBPN, BSSDY, BLSCAR (BLKERA, BLSCA1, BLSCA2, BLSCA3), BSSPRC, 및 BSSPRD, 또는 그것의 기능적 변이체를 포함하고, 아군 I-S2 의 특징을 보유하는 군의 모 서브틸라제를 선택하는 것이 바람직하다.
아군 I-S2의 변이체에 관하여 BSAPRQ, BLS147 (BSAPRM, BAH101), BLSAVI (BSKSMK, BAALKP, BLSUBL), BYSYAB, 및 BSAPRS, 또는 그것의 기능적 변이체를 포함하고, 아군 I-S2 의 특징을 보유하는 군의 모 서브틸라제를 선택하는 것이 바람직하다.
특히, 상기 서브틸라제는 BLSAVI (SAVINASE
Figure 112001030091918-pct00019
NOVO NORDISK A/S)이고, 따라서, 본 발명의 바람직한 서브틸라제는 SAVINASE
Figure 112001030091918-pct00020
이다.
본 발명은 또한 그것의 아미노산 서열에 어떤 다른 변형과 조합하여 상기 언급된 본 발명의 서브틸라제를 포함한다. 특히, 효소에 개선된 성질을 제공하기 위해 당업계에 알려진 다른 변형과의 조합이 연구된다. 다른 개선된 성질을 가지는 많은 서브틸라제 변이체가 당업계에 개시되고, 많은 것들이 본 원의 "기술분야"에 언급된다(하기 참조). 이러한 참고문헌은 본원에 서브틸라제 변이체를 동정하기 위한 참고문헌으로 개시되고, 이것은 본 발명의 서브틸라제 변이체와 조합될 수 있 다.
이러한 조합은 위치: 222(산화 안정성의 개선), 218(열안정성의 개선), 예를 들어, 위치 76 에서와 같은 Ca-결합 부위 안정화 효소내의 치환, 및 종래 기술로부터 자명한 다른 것을 포함한다.
더이상의 구체예에서, 본 발명의 서브틸라제 변이체는 다음의 위치:
27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 206, 218, 222, 224, 235 및 274 중 어떤 위치에서 유리하게 하나 이상의 변형과 조합될 수 있다.
구체적으로, 다음의 BLSAVI, BLSUBL, BSKSMK, 및 BAALKP 변이체가 조합에 적합한 것으로 고려된다: K27R, *36D, S57P, N76D, S87N, G97N, SlOlG, S103A, V104A, V104I, V104N, V104Y, H120D, N123S, Y167, R170, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L 및 T274A.
더욱이 상기 언급된 하나 이상의 변형의 어떤 것과 조합하는 변이체 SlOlG+V104N, S87N+SlOlG+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A, N76D+S103A+V104I 또는 N76D+V104A 또는 이들 돌연변이의(V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A) 어떤 조합은 개선된 성질을 나타낸다.
본 발명의 주요 양태의 더이상의 변이체는 바람직하게는 위치 129, 131, 133 및 194, 바람직하게는 129K, 131H, 133P, 133D 및 194P 변형, 및 가장 바람직하게는 P129K, P131H, A133P, A133D 및 A194P 변형 중 어떤 것에서 하나 이상의 변형과 조합된다. 이들 변형 중 어떤 것은 그것의 생산에서 본 발명이 서브틸라제 변이체의 더 많은 발현 수준을 제공할 것이라는 것이 기대된다.
따라서, 본 발명의 더이상의 구체예는 상기 변형이
G97GA
G97GT
G97GG
G97GS
G97GD
G97GE
G97GK
G97GR
G97GH
G97GV
G97GC
G97GN
G97GQ
G97GF
G97GI
G97GL
G97GM
G97GP
G97GW
G97GY 를 포함하는 군에서 선택된 본 발명의 변이체에 관한 것이다.
서브틸라제 변이체의 생산
본 발명의 서브틸라제를 클로닝하고 유전자(예를 들어, 서브틸라제 유전자)에 삽입을 도입하는 많은 방법은 당업계에 공지되고, "발명의 기술분야"단락에 참고로 언급된다.
유전자를 클로닝하고 상기 유전자에 도입(무작위 및/또는 부위 특이적)하는 일반적인 표준 절차는 본 발명의 서브틸라제 변이체를 얻기 위해 사용될 수 있다. 적당한 기법의 더이상의 개시를 위해 본원의 실시예 및 Sambrook 등(1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. 등. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.)"Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990); 및 WO 96/34946 을 참조하시오.
본 발명의 서브틸라제 변이체는 서로 다른 서브틸라제 유전자(WO 95/22625; Stemmer WPC, Nature 370 :389-91(1994))의 DNA 셔플링에 의하는 것과 같은 인공 송달의 표준 기법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, Savinase
Figure 112001030091918-pct00021
의 활성 부위 루프(b) 보다 더 긴 활성 부위 루프(b) 를 포함하도록 천연에서 동정된 하나 이상의 부분적인 서브틸라제 서열을 가지는 Savinase
Figure 112001030091918-pct00022
을 코딩하는 유전자의 DNA 셔플링은 개선된 세척 성능을 가지는 변이체의 연속적인 스크리닝이 뒤따를 것이고, 본 발명의 서브틸라제 변이체를 제공한다.
발현 벡터
본 발명의 효소를 코딩하는 DNA 구조체를 포함하는 재조합 발현 벡터는 용이하게 재조합 DNA 과정에 놓일 수 있는 어떤 벡터일 수 있다.
벡터의 선택은 종종 벡터가 도입된 숙주세포에 의존할 것이다. 그러므로, 벡터는 독립적으로 복제가능한 벡터 즉, 플라스미드와 같은 염색체외에서 전체로서 존재하여 염색체 복제와 무관하게 복제하는 벡터이다. 택일적으로, 벡터는 부분적으로 또는 전체로서 숙주 세포에 통합되어 통합된 염색체와 함께 복제된다.
바람직하게는 벡터는 본 발명의 효소를 코딩하는 DNA 서열이 DNA 의 복제에 요구되는 추가의 절편에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 벡터의 발현은 플라스미드 또는 바이러스 DNA 로부터 유도되거나, 양 요소 모두를 포함할 수 있다. 용어, "작동가능한 연결"은 전사가 프로모터에서 개시되어 효소를 코딩하는 DNA 서열을 통해 진행되는 것과 같이 의도한 목적에 맞게 기능하도록 배열된 절편을 나타낸다.
프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 보이고, 숙주 세포에 상동 도는 비상동인 단백질을 코딩하는 유전자로부터 얻을 수 있다.
박테리아 숙주 세포에 사용하기 위한 적당한 프로모터의 예는 Bacillus stearothermophilus 말토스생성 아밀라제 유전자, Bacillus licheniformis α-아밀라제 유전자, Bacillus amyloliquefaciens α-아밀라제 유전자, Bacillus subtils 알칼리 프로테아제 유전자, 또는 Bacillus pumilus 크실로시다제 유전자, 또는 파 지 람다 PR 또는 PL 프로모터 또는 E. coli lac, trp 또는 tac 프로모터이다.
본 발명의 효소를 코딩하는 DNA 서열은 또한 필요하다면, 적당한 터미네이터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 벡터가 관심의 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 하는 DNA 서열을 더 포함한다.
벡터는 또한 예를 들어, 숙주세포의 결점을 보완하는 유전자 산물, 또는 카나마이신, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 스펙티노마이신 등과 같은 항생제에 대한 내성, 또는 중금속 또는 제초제에 대한 내성을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 효소를 숙주 세포의 분비 경로로 특정지우기 위해서, 분비신호 서열(리더 서열, 프리프로 서열 또는 프리 서열로도 알려짐)은 재조합 벡터에 제공될 수 있다. 분비 신호 서열은 올바른 리딩 플레임내의 효소를 코딩하는 DNA 서열에 연결된다. 분비 신호 서열은 일반적으로 효소를 코딩하는 DNA 서열의 5' 에 위치한다. 분비 신호 서열은 일반적으로 효소와 연결된 것이거나, 다른 분비된 단백질을 코딩하는 유전자에서 기인할 수 있다.
본 효소를 코딩하는 DNA 서열, 프로모터 및 선택적으로 터미네이터 및/또는 분비 신호 서열 각각의 연결, 또는 적당한 PCR 증폭 계획에 의한 이러한 서열의 회합 및 복제 또는 통합에 필요한 정보를 포함하는 적당한 벡터에 이들의 삽입에 사용된 과정이 당업계에 공지된다(참고로, 예를 들어, Sambrook 등., 앞서 인용한 책 중에).
숙주 세포
숙주 세포에 도입되는 본 발명의 효소를 코딩하는 DNA 서열은 관심의 숙주에 상동 또는 비상동일 수 있다. 숙주 세포에 상동성, 즉, 천연 숙주 세포에 의해서 생산된다면, 그것의 천연환경보다는 일반적으로 다른 프로모터 서열 또는, 이용가능한 경우에는 다른 분비 신호 서열 및/또는 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결될 것이다. 용어"상동성"은 문제의 숙주 유기물 본래의 효소를 코딩하는 DNA 서열을 포함하고자 한다. 용어"비상동"은 천연의 숙주세포에 의해 발현되지 않는 DNA 서열을 포함하고자 한다. 그러므로, DNA 서열은 다른 유기물에서 기인할 수 있거나, 합성 서열일 수 있다.
DNA 구조체 또는 본 발명의 재조합 벡터가 삽입된 숙주 세포는 본 효소를 생산할 수 있는 어떤 세포일 수 있고, 박테리아, 효모, 균류 및 식물을 포함하는 고등 진핵생물 세포를 포함한다.
배양상, 본 발명의 효소를 생산할 수 있는 박테리아 숙주 세포의 예는 Bacillus 균주, 예컨대 균주 B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium 또는 B. thuringiensis 와 같은 그람 양성 박테리아, 또는 S. lividans 또는 S. murinus와 같은 균주 Streptomyces 또는 Echerichia coli 와 같은 그람-음성 박테리아이다.
박테리아의 형질전환은 원형질체 형질전환, 일렉트로포레이션, 컨쥬게이션에 의해 실행되거나, 그 자체로 공지된 방법으로 컴피턴트 세포를 사용함으로써 실행될 수 있다(참고로, Sambrook 등., 상기참조).
E.coli 와 같은 박테리아에서 효소를 발현하는 경우에, 효소는 일반적으로 불용성 과립(봉입체로 알려짐)으로서 세포질에 보유되거나, 박테리아 분비 서열에 의해 원형질막 공간으로 특정될 수 있다. 전자의 경우에, 세포는 용균되고, 과립이 회수되고 변성제를 희석시킴으로써 효소가 재폴딩된 후에 변성된다. 후자의 경우에, 효소는 원형질막 공간의 함유물을 해리하도록 초음파 또는 삼투압쇽에 의해 세포를 파괴하고 효소를 회수함으로서 원형질막 공간으로부터 회수될 수 있다.
Bacillus 또는 Streptomyces 균주와 같은 그람-양성 박테리아에서 효소를 발현하는 경우에, 효소는 세포질에 보유되거나, 박테리아 분비 서열에 의해 세포외 배지로 특정될 수 있다. 후자의 경우에, 효소는 하기에 개시된 대로 배지로부터 회수될 수 있다.
서브틸라제 생산 방법
본 발명은 적당한 숙주 세포에서 본 발명에 따른 분리된 효소를 생산하는 방법을 제공하고, 효소를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환된 적당한 숙주 세포가 효소의 생산을 허용하는 조건으로 배양되고, 결과의 효소가 배양물로부터 회수된다.
효소를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터로 비상동 숙주세포를 형질전환시킨 경우에, 본 발명의 효소의 비상동 재조합 생산을 가능하게 한다.
이에 의해서, 상동성 불순물이 없는 것을 특징으로 하는 고순도 서브틸라제 조성물을 만드는 것이 가능해진다.
본원에서, 상동성 불순물은 본 발명의 효소의 기원인 상동성 세포로부터 얻어진 어떤 불순물(예를 들어, 본 발명의 효소가 아닌 다른 폴리펩티드)을 의미한다.
형질전환된 숙주 세포 배양에 사용된 배지는 관심의 숙주 세포의 배양에 적합한 종래의 어떤 배지일 수 있다. 발현된 서브틸라제는 배양물 배지에 용이하게 분비되어 원심분리 또는 여과, 황산 암모늄과 같은 염으로 배지의 단백질성 성분 침전에 의해서 배지로부터 세포를 분리하는 것을 포함하는 주지된 과정에 이어서, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피 과정으로 그것으로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 서브틸라제 변이체의 사용
본 발명의 서브틸라제 프로테아제 변이체는 많은 이용분야, 특히 세제 산업에서 사용될 수 있다.
더욱이 본 발명은 본 발명의 서브틸라제 변이체를 포함하는 효소 조성물에 관한 것이다.
바람직한 산업상 이용분야 및 상응하는 바람직한 효소 조성물의 요약은 하기에 제공된다.
이 요약은 본 발명의 서브틸라제 변이체의 적당한 이용분야의 완전한 리스트를 의도하는 것은 아니다. 본 발명의 서브틸라제 변이체는 프로테아제, 특히 서브틸라제의 사용을 포함하도록 당업계에 알려진 다른 산업상 이용분야에 사용될 수 있다.
돌연변이 효소를 포함하는 세제 조성물
본 발명은 클린징 및 세포 조성물 및 돌연변이체 서브틸리신 효소를 포함하는 조성물에서 본 발명의 돌연변이 효소의 사용을 포함한다. 이러한 클린징 및 세제 조성물은 당업계에 개시되고, 적당한 클린징 및 세제 조성물의 더 이상의 개시에 관한 WO 96/34946; WO 97/07202; WO 95/30011 가 참고문헌이다.
더욱이, 하기의 실시예는 본 발명의 많은 서브틸라제 변이체의 세척 성능 개선을 증명했다.
세제 조성물
본 발명의 효소가 첨가되어 세제 조성물의 성분이 될 수 있다.
본 발명의 세제 조성물은 예를 들어, 염색된 직물의 선처리에 적합한 세탁 첨가 조성물 및 직물 연화 조성물로 첨가된 린스를 포함하는 손 또는 기계 세탁 세제 조성물로서 조제되거나, 일반적인 가전제품 경표면 클린징에 사용되는 세제 조성물로 조제되거나, 손 또는 기계 식기세척용으로 조제될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 본 발명의 효소를 포함하는 세제 첨가물을 제공한다. 세제 첨가제뿐만 아니라 세제 조성물은 프로테아제, 리파제, 큐티나제, 아밀라제, 카르복실라제, 셀룰라제, 펙티나제, 만나제, 아라비나제, 갈락타나제, 크실라나제, 예를 들어, 락카제, 및/또는 과산화효소와 같은 산화효소를 포함할 수 있다.
일반적으로 선택된 효소의 성질은 선택된 세제과 양립되어야 하고(즉, pH-최적, 효소 및 비효소 성분 등과의 양립성), 효소는 유효량으로 존재해야만 한다.
프로테아제: 적당한 프로테아제는 동물, 식물 또는 미생물 기원의 것을 포함 한다. 미생물원이 바람직하다. 화학적으로 변형 또는 단백질 유전자 조작된 돌연변이체가 포함된다. 프로테아제는 세린 프로테아제 또는 메탈로 프로테아제, 바람직하게는 알킬리 미생물 프로테아제 또는 트립신-유사 프로테아제일 수 있다. 알칼리 프로테아제의 예는 서브틸리신, 특히 예를 들어, 서브틸리신 Novo, 서브틸리신 Carlsberg, 서브틸리신 309, 서브틸리신 147 및 서브틸리신 168 (WO 89/06279 에 개시)와 같은 Bacillus 로부터 유래된 것일 수 있다. 트립신-유사 프로테아제의 예는 트립신(예를 들어, 소 또는 돼지 기원) 및 WO 89/06270 및 WO 94/25583 에 개시된 Fusarium 프로테아제이다.
유용한 프로테아제의 예는 WO92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, 및 WO 98/34946 에 개시된 변이체, 특히 다음의 위치에서 하나 이상의 치환을 가지는 변이체이다: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 및 274.
바람직한 화학적으로 이용가능한 프로테아제 효소는 AlcalaseTM, SavinaseTM, PrimaseTM, DuralaseTM, EsperaseTM, 및 KannaseTM (Novo Nordisk A/S), MaxataseTM, MaxacalTM, MaxapemTM, ProperaseTM, PurafectTM, Purafect OxPTM, FN2TM, 및 FN3TM (Genencor International Inc.)를 포함한다.
리파제: 적당한 리파제는 박테리아 또는 균류 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형 또는 단백질 유전자 조작 돌연변이체가 포함된다. 유용한 리파제의 예는 EP 258 068 및 EP 305 216에 개시된 H. lanuginosa (T. lanuginosus) 기원의 Humicola (Thermomyces 와 동의어), WO 96/13580 에 개시된 H.insolens, P. alcaligenes 또는 P. pseudoalcaligenes P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. 균주 SD 705 (WO 95/06720 및 WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012) 기원의 Pseudomonas 리파제, 예를 들어, B. subtils (Dartois 등. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131,253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) 또는 B. pumilus (WO 91/16422)와 같은 Bacillus 리파제 기원의 리파제를 포함한다.
다른 예는 WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 및 WO 97/07202 에 개시된 것과 같은 리파제 변이체이다.
바람직한 화학적으로 이용가능한 리파제 효소는 LipolaseTM 및 Lipolase UltraTM (Novo Nordisk A/S)을 포함한다.
아밀라제 : 적당한 아밀라제 (α 및/또는 β)는 박테리아 또는 균류 기원의것을 포함한다. 화학적으로 변형 또는 단백질 유전자 조작 돌연변이체가 포함된다. 아밀라제는 예를 들어, GB 1,296,839 에 상세하게 개시된 특정 균주 B. licheniformis 와 같은 Bacillus 로부터 얻은 α-아밀라제를 포함한다.
유용한 아밀라제의 예는 WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, 및 WO 97/43424 에 개시된 변이체, 특히 다음의 위치에서 하나 이상의 치환을 가지는 변이체이다:15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, 및 444.
상업적으로 이용가능한 아밀라제는 DuramylTM, Termamy1TM, FungamylTM 및 BANTM(Novo Nordisk A/S), RapidaseTM 및 PurastarTM (Genencor International Inc.에서 구입)이다.
셀룰라제: 적당한 셀룰라제는 박테리아 또는 균류 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형 또는 단백질 유전자 조작 돌연변이체가 포함된다. 적당한 셀룰라제는 US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 및 WO 89/09259 에 개시된 Humicola insolens, Myceliophthora thermophila 및 Fusarium oxysporum 에서 생산된 균류 셀룰라제와 같은, 속 Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium 의 셀룰라제를 포함한다.
특히 적당한 셀룰라제는 색조 보호 잇점을 가지는 알칼리 또는 중성 셀룰라제이다. 이러한 셀룰라제의 예는 EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940 에 개시된 셀룰라제이다. 다른 예는 WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 및 PCT/DK98/00299 에 개시된 것과 같은 셀룰라제 변이체이다.
상업적으로 이용가능한 셀룰라제는 CelluzymeTM, 및 CarezymeTM(Novo Nordisk A/S), ClazinaseTM, 및 Puradax HATM (Genencor International Inc.), 및 KAC-500 (B)TM (Kao Corporation)를 포함한다.
과산화효소/산화효소: 적당한 과산화효소/산화효소는 식물, 박테리아 또는 균류 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형 또는 단백질 유전자 조작 돌연변이체가 포함된다. 유용한 과산화효소의 예는 C. cinereus 와 같은 Coprinus 의 과산화효소, 및 WO 93/24618, WO 95/10602, 및 WO 98/15257 에 개시된 것과 같은 그것의 변이체이다.
상업적으로 이용가능한 과산화효소는 GuardzymeTM (Novo Nordisk A/S)이다.
세제 효소는 하나 이상의 효소를 포함하는 별개의 첨가제를 첨가하거나, 모든 효소를 포함하는 조합된 첨가제를 첨가함으로써 세제 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명의 세제 첨가제, 즉 별개의 첨가제 또는 조합된 첨가제는 예를 들어, 과립, 액체, 슬러리 등으로 조제될 수 있다. 바람직한 세제 첨가 조성물은 과립, 특히 비분진 과립, 액체, 특히 안정화 액체 또는 슬러리이다.
비분진 과립은 예를 들어, US 4,106,991 및 4,661,452 에 개시된 대로 생산될 수 있고, 당업계에 공지된 방법에 의해서 선택적으로 코팅될 수 있다. 왁스 코팅 재료의 예는 1000 내지 20000 의 소량의 분자량을 가지는 폴리(에틸렌 옥사이드) 산물(폴리에틸렌글리콜, PEG); 16 내지 50 에틸렌 옥사이드 단위를 가지는 에톡실화 노닐페놀; 15 내지 80 에틸렌 옥사이드 단위가 있고, 알콜이 12 내지 20 탄소 원자를 함유하는 에톡실화 지방 알콜; 지방 알콜; 지방산; 및 모노- 및 디- 및 트리글리세라이드의 지방산이다. 유동층 기법에 의해 본 출원에 적합한 필름-형성 코팅 재료의 예는 GB 1483591 에 나타난다. 액체 효소 준비는 예를 들어, 확립된 방법에 따른 프로필렌 글리콜, 당 또는 당알코올, 라트산 또는 붕산과 같은 폴리올을 첨가함으로써 안정화될 수 있다. 보호된 효소는 EP 238,216 에 개시된 방법에 따라서 준비될 수 있다.
본 발명의 세제 조성물은 예를 들어, 바, 정제, 분말, 과립, 페이스트 뜨는 액체와 같은 종래의 어떤 형태일 수 있다. 액체 세제는 수성, 전형적으로 70 % 이하의 물 및 0-30% 유기 용매, 또는 비-수성일 수 있다.
세제 조성물은 반극성 및/또는 음이온 및/또는 양이온 및/또는 쌍성이온을 포함하는 비이온일 수 있는 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 계면활성제는 전형적으로 0.1중량% 내지 60중량% 수준으로 존재한다.
거기에 포함되는 경우에, 세제는 일반적으로 선형 알킬벤젠술포네이트, 알파-올레핀술포네이트, 알킬 술페이트(지방 알콜 술페이트), 알콜 에톡시술페이트, 제 2 차 알칸술포네이트, α-술포 지방산 메틸 에스테르, 알킬-또는 알케닐숙신산 또는 비누와 같은 약 1% 내지 약 40% 의 음이온 계면활성제를 포함할 것이다.
거기에 포함되는 경우에, 세제는 일반적으로 알코올 에톡실레이트, 노닐페놀 에톡실레이트, 알킬폴리글리코사이드, 알킬디메틸아민옥사이드, 에톡실화 지방산 모노에탄올 아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드, 또는 글루코사민(글루카마이드)의 N-아실, 또는 N-알킬 유도체와 같은 약 0.2% 내지 약 40 % 의 비이온 계면활성제를 포함할 것이다.
세제는 지올라이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포네이트, 카르보네이트, 시트레이트, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌디아민테트라아세트산, 디에틸렌 트리아민펜타아세트산, 알킬 또는 알케닐숙신산, 가용성 실리케이트 또는 층상 실리케이트(예를 들어, Hoechst 의 SKS-6)와 같은 0-65% 의 세제 빌더를 포함할 수 있다.
세제는 하나 이상의 폴리머를 포함할 수 있다. 예는 카르복시메틸셀룰로스, 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피리딘-N-옥사이드), 폴리(비닐이미다졸), 폴리아크릴레이트와 같은 폴리카르복실레이트, 말레산/아클릴 산 코폴리모 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 코폴리머이다.
세제는 테트라아세틸에틸렌아민 또는 노나노일옥시벤텐술포네이트와 같은 과산 형성 표백 활성제와 결합될 수 있는 과붕산염 또는 과탄산염과 같은 H2O2 원을 포함할 수 있는 표백 시스템을 포함할 수 있다. 택일적으로, 표백 시스템은 예를 들어, 아미드, 이미드, 또는 술폰형과 같은 과산을 포함할 수 있다.
본 발명의 세제 조성물의 효소는 예를 들어, 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤과 같은 폴리올, 당 또는 당 알코올, 라트산, 예를 들어, 방향족 붕산염 에스테르, 또는 4-포밀페닐 붕산과 같은 페닐 붕산과 같은 붕산, 또는 붕산 유도체와 같은 종래의 안정제를 사용하여 안정화될 수 있고, 조성물은 WO 92/19709 및 WO 92/19708 에 개시된 대로 조제될 수 있다.
세제는 예를 들어, 클레이, 거품 부스터, 비누거품 억제제, 항-부식제, 오물-현탁제, 항-오물 재침전제, 염료, 살충제, 광증백제, 굴수성, 변색 억제제, 또는 퍼퓸을 포함하는 직물 컨디셔너와 같은 다른 종래의 세제 성분을 포함할 수 있다.
현재 세제 조성물에서 어떤 세제, 특히 본 발명의 효소는 세척액의 리터당 0.01-100 mg 의 효소 단백질, 바람직하게는 세척액의 리터당 0.05-5 mg 의 효소 단백질, 구체적으로는 세척액의 리터당 0.1-1mg 의 효소 단백질에 해당하는 양으로 첨가될 수 있다는 것이 기대된다.
본 발명의 효소는 본원에 참고문헌으로 수록된 WO 97/07202 에 개시된 세제 조성물에 추가적으로 통합될 수 있다.
가죽 산업에의 이용
본 발명의 서브틸라제는 가죽 산업, 특히 피혁의 탈모에 유용할 수 있다.
상기 이용분야에서, 본 발명의 서브틸라제 변이체는 바람직하게는 다른 프로테아제를 더 포함하는 효소 조성물에 사용된다.
적당한 다른 프로테아제의 더욱 상세한 개시를 위해서 세제 조성물에 사용하는 적당한 효소에 관련된 단락을 참조하시오(상기 참조).
울 산업에의 이용
본 발명의 서브틸라제는 울 산업, 특히 울을 포함하는 직물의 클린징에 유용할 수 있다.
상기 이용분야에서, 본 발명의 서브틸라제는 바람직하게는 다른 프로테아제를 더 포함하는 효소 조성물에 사용된다.
적당한 다른 프로테아제의 더 상세한 개시는 세제 조성물에 사용하는 적당한 효소에 관한 단락을 참조하시오(상기 참조).
본 발명은 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는 범위에서 하기의 실시예에 더 상세하게 개시된다.
물질 및 방법
균주
B. subtilis DN1885 (Diderichsen 등., 1990).
B. lentus 309 및 147 은 NCIB 에 기탁번호 NCIB 10309 및 10147로 기탁되고, 본원에 참고문헌으로 수록된 US 특허번호 3,723,250 에 개시된 특정균주 Bacillus lentus 이다.
E. coli MC 1000 (M. J. Casadaban and S. N. Cohen (1980); J. Mol. Biol. 138 179-207)은 종래의 방법으로 r-, m+ 로 생산되었고, US 특허 일련번호 039,298 에 개시된다.
플라스미드:
pJS3: 서브틸라제 309 를 코딩하는 합성 유전자를 포함하는 E.coli-B. subtils 셔틀 벡터(Jacob Schiodt 등. in Protein and Peptide letters 3: 39-44 (1996)에 개시).
pSX222: B. subtils 발현 벡터(WO 96/34946에 개시).
일반 분자생물학 방법:
달리 언급된 바 없는 한, DNA 조작 및 형질전환은 분자생물학의 표준 방법을 사용하여 수행된다(Sambrook 등. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. 등. (eds.)"Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.)"Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990).
DNA 조작용 효소는 공급자의 설명서에 따라 사용한다.
DNA 조작용 효소
예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제, 리가제등과 같은 DNA 조작용 모든 효소는 New England Biolabs, Inc 로부터 얻는다.
단백질분해 활성
본원에서, 단백질분해 활성은 Kilo NOVO 프로테아제 유니트(KNPU)에 상세히 개시된다. 활성을 효소 표준(SAVINASE
Figure 112001030091918-pct00023
)에 비교하여 결정하고, 표준 조건, 즉, 50 ℃, pH 8.3, 9분, 반응시간, 3 분. 측정시간으로 단백질분해 효소에 의해 디메틸 카제인(DMC)의 분해에 기초하여 결정했다. 폴더 AF 220/1 은 Novo Nordisk A/S 에 요청하여 이용가능하고, 폴더는 본원에 참고문헌으로 포함된다.
GU 는 표준 조건으로 40 ℃에서 15 분 인큐베이션하는 동안 기질로서 N-아세틸 카제인을 사용하는 단백질분해 효소 활성이 1m몰의 글리신에 해당하는 양의 NH2 기를 생산하는 것으로 정의될 때의 글리신 단위이다.
프로테아제 활성은 또한 기질로서 숙신일-알라닌-알라닌-프로린-페닐알라닌-파라니트로아닐라이드를 가지고 PNA 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. RNA 분석법의 예는 Rothgeb, T. M., Goodlander, B. D., Garrison, P. H., 및 Smith, L. A., Journal of the American Oil Chemists' Society, Vol. 65 (5) pp. 806-810 (1988)에 개시된다.
발효:
서브틸라제 효소의 생산을 위한 발효는 5 일동안 100ml BPX 배지를 포함하는 500 ml 진탕 Erlenmeyer 플라스크에서 진동 진탕 표(300 r.p.m)상의 30 ℃ 에서 수행된다.
결과적으로, 예를 들어 2 리터의 육즙을 만들기 위해서 20 Erlenmeyer 플라스크가 동시에 발효된다.
배지:
BPX 배지 조성물 (리터당)
감자 전분 100 g
갈은 보리 50 g
콩분말 20 g
Na2HP04 x 12 H20 9 g
플루론 0.1 g
나트륨 카제인에이트 10 g
배지에서 전분은 α-아밀라제로 액화되고, 45 분동안 120 ℃에서 가열시킴으로써 무균화시킨다. 무균화 후에, NaHCO3 의 첨가로 배지의 pH 를 9 에서 0.1 로 조정한다.
실시예 1
효소 변이체의 제조 및 발현
부위-특이적 돌연변이유발:
위치 97 및 98 사이의 활성 부위 루프(b)에 특이적 삽입체를 포함하는 본 발명의 서브틸라제 309 부위-특이적 변이체는 DNA 단편의 종래의 클로닝 기법에 의해 만들어지고(Sambrook 등., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989), 원하는 삽입체를 포함하는 올리고의 PCR 로 생산된다(하기 참조).
주형 플라스미드 DNA 는 pJS3 이거나, 서브틸라제 309 의 변이체를 포함하는 이것의 유사체이다.
올리고 특이적 돌연변이유발에 의해 G97X 삽입 변이체(X= 위치 97 및 98 사이에 삽입된 어떤 아미노산 잔기)의 제조에 도입된 삽입체는 G97GX 서브틸라제 309 변이체를 생산한다.
서브틸라제 309 변이체는 E.coli 를 형질전환시킨다. 이러한 형질전환체의 하룻 밤동안의 배양으로부터 분리된 DNA 는 제한 엔도뉴클레아제 분해, DNA 단편의 정제, 리게이션, B.subtilis 의 형질전환에 의해서 B.subtilis 를 형질전환시킨다. B.subtilis 의 형질전환은 Dubnau 등., 1971, J. Mol. Biol. 56, pp. 209-221에 개시된 대로 수행된다.
국부화 영역에 무작위 삽입체를 삽입하기 위한 국부화 무작위 돌연변이유발:
국부화 무작위 돌연변이유발을 수행하기 위해 사용된 전체적인 계획은:
삽입체를 한정하는 DNA 염기쌍 으로 분리되고, 삽입체 부위의 양측면에 위치한 DNA 서열에 해당하는 돌연변이유발 프라이머(올리고뉴클레오티드)를 합성한다.
이어서, 결과적인 돌연변이유발 프라이머는 적당한 대립 프라이머를 가지는 PCR 반응에 사용된다. 생성된 PCR 단편을 엔도뉴클레아제로 정제하고 분해한 다음 E.coli-B.subtilis 셔틀 벡터에 클로닝했다(하기 참조).
택일적으로, 필요하다면, 결과적인 PCR 단편은 셔틀 벡터에 돌연변이화된 영역의 분해 및 클로닝을 허용하기 위한 제2의 적당한 대립 프라이머와 함께 프라이머로서 제2의 PCR 반응에 사용된다. PCR 반응은 정상적인 조건하에서 수행한다.
이 계획에 이어서, 국부화 무작위 라이브러리를 위치 97 및 98 사이의 활성 부위 루프에 삽입체가 도입된 SAVINASE 에서 제조했다.
돌연변이를 돌연변이유발 프라이머로 도입했고(하기 참조), 모든 20 아미노산은 N = 25% 의 A, T, C, 및 G; 여기에서 S = 50% C 및 G 로 표현된다. 생산된 PCR 단편을 프라이머: 5'CTA AAT ATT CGT GGT GGC GC 3' (센스) 및 5'GAC TTT AAC AGC GTA TAG CTC AGC 3' (안티센스)와 함께 PCR-증폭으로 생산된 PCR-단편과 오버랩핑된 서열의 조합에 의해서 PCR 의 순환을 1 번 더 함으로써 Savinase 의 N-말단으로 확장되었다. 연장된 DNA-단편을 변형된 플라스미드 pJS3 의 Hind III-및 Mlu I-부위에 클로했고(상기 참조), 10 개의 무작위 선택된 E.coli 콜로니를 유전자조작된 돌연변이를 확인하기 위해 서열결정했다.
돌연변이유발 프라이머(5'GCT GAG CTA TAC GCT GTT AAA GTC CTA GGG NNS GCG AGC GGT TCA GGT TC 3' (센스))를 pJS3 및 주형으로서의 플라스미드 pJS3 의 Mlu I 부위의 다운스트림에 위치한 (예를 들어, 5'-CCC TTT AAC CGC ACA GCG TTT-3' (안티센스))적당한 안티센스 대립 프라이머와 함께 PCR 반응에 사용했다. 생성된 PCR 산물을 제한 효소 Hind III 및 Mlu I 을 사용하여 pJS3 셔틀 벡터에 클로닝했다.
무작위 라이브러리로 공지된 기법에 의해서 E.coli 를 형질전환시켰다.
준비된 라이브러리는 약 100,000 각각의 클론/라이브러리를 포함했다.
10 개의 무작위로 선택된 콜로니를 유전자 조작된 돌연변이를 확인하기 위해서 서열결정했다.
본 발명의 서브틸라제 변이체를 정제하기 위해서, 본 발명의 변이체를 포함하는 B.subtilis pJS3 발현 플라스미드로 컴피턴트 B.subtilis 균주를 형질전환시켰고, 상기에 개시된대로 10 ㎍/ml 클로람페니콜(CAM)을 포함하는 배지에서 발효시켰다.
실시예 2
효소 변이체의 정제
본 발명은 Bacillus 숙주 세포에서 본 발명의 서브틸라제를 생산하도록 2 리터 규모 발효의 정제에 관한 것이다.
약 1.6 리터의 발효 육즙을 1 리터 비이커에서 35 분동안 5000 rpm 으로 원심분리한다. 상청액을 10 % 아세트산을 사용하여 pH 6.5 로 조정하고, Seitz Supra S100 필터 플레이트상에서 여과한다.
여과물을 Amicon S1Y10 UF 원심분리기에서 공급된 Amicon CH2A UF 단위를 사 용하여 약 400 ml 로 농도조정한다. UF 농축액을 원심분리하여 pH 7, 실내온도로 Bacitracin 친화성 컬럼상에서 흡수전에 여과했다. 프로테아제를 pH 7 로 조정된 0.01 디메틸글루타르산, 0.1M 붕산 및 0.002 M 염화칼슘을 가진 완충액 용액에서 25% 2-프로판올 및 1 M 염화나트륨을 사용하여 실내온도에서 Bacitracin 컬럼으로부터 용리하다.
Bacitracin 정제 단계로부터 프로테아제 활성을 가진 분획을 조합하여 pH 6.5 로 조정된 0.01 디메틸글루타르산, 0.2 M 붕산 및 0.002 m 염화칼슘으로 평형화된 750 ml Sephadex G25 컬럼(5 cm dia.)에 적용한다.
Sephadex G25 컬럼으로부터 단백질분해 활성을 가지는 분획을 조합하여 pH 6.5 로 조합된 0.01 M 디메틸글루타르산, 0.2 M 붕산, 및 0.002 M 염화칼슘을 포함하는 완충액으로 평형화된 150 ml CM Sepharose CL 6B 양이온 교환 컬럼(5 cm dia.) 에 적용한다.
프로테아제를 2 리터의 같은 완충액(서브틸리신 147 의 경우에 0-0.2 M 염화 나트륨)에 0-0.1 M 염화 나트륨의 선형 구배를 사용하여 용리한다.
최종 정제 단계에서 CM Sepharose 컬럼의 분획을 포함하는 프로테아제를 조합하고, GR81PP 멤브레인(Danish Sugar Factories Inc.)을 구비한 Amicon 초여과 세포에서 농축한다.
제조 및 발효를 위한 실시예 1의 기법을 사용하여, 상기 분리 과정 및 하기의 서브틸리신 309 변이체를 생산하고 분리했다:
G97GT
G97GS
G97GD
G97GE
G97GP
G97GG
G97GH
G97GI
G97GA G97GT+Y167A
G97GP+A98T
이들 변이체는 예비 분석에서 사비나제보다 더 우수한 세척 성능을 발휘하는 것이 관찰되었다.
실시예 3
효소 변이체를 포함하는 세제 조성물의 세척 성능
하기의 실시예는 지시된 농도하에서 수행된 많은 세척 시험의 결과를 제공한다.
미니 세척
세척 조건:
유럽 US
세제 투여량 4g/l 1g/l
세척 온도 30℃ 25℃
세척 시간 30분 10분
물 경도 18°dH (Ca2+/Mg2+ = 5:1) 6°dH(Ca2+/Mg2+ = 2:1)
PH 비조정 비조정
효소 농도 1, 2, 5, 10, 30 nM 1, 2, 5, 10, 30 nM
시험 시스템 교반막대를 가진 150ml 유리 비이커 교반막대를 가진 150ml 유리 비이커
직물/부피 50ml 세제에서 5직물 조각(Ø2.5㎝) 50ml 세제에서 5직물 조각(Ø2.5㎝)
시험물질 EMPA116 EMPA117
세제:
사용된 세제는 각각 덴마크 (OMO, datasheet ED-9745105) 및 USA (Wisk, datasheet ED-9711893)로부터 얻는다. 사용하기 전에 세제상의 모든 효소 활성을 미세파장 처리로 불활성화시킨다.
견본;
사용된 견본은 스위스 EMPA Testmaterialen, Movenstrasse 12, CH-9015 St. Gall로부터 얻은 EMPA116 및 EMPA117 를 사용한다.
반사율
시험 재료에 대한 반사율(R)의 측정을 Macbeth ColorEye 7000 광도계를 사용하여 460 nm 에서 행한다. 측정은 제조자의 프로토콜에 따른다.
평가
서브틸라제 세척 성능의 평가는 연구된 서브틸라제에 대한 개선 인자 또는 성능 인자에 의해 결정한다.
성능인자, IF투여량/반응은 서브틸라제의 점근적 농도가 0 인 경우에 조사된 서브틸라제를 함유하는 세제 및 기준 서브틸라제를 함유하는 같은 세제에 대한 선 능 커브의 경사도 사이의 비율로서 한정된다.
IF투여량/반응 = a/a반사율
세척 성능은 식 I:
Figure 112001030091918-pct00024
(I);
여기에서, R 은 반사율 단위에서 세척 성능이다; R0 는 y축과 일치된 커브의 간격; a 는 c → 0 일 때, 일치된 커브의 경사도; c 는 효소 농도; 및 △Rmax 는 c → ∞ 일때, 이론상의 최대 세척 효과이다.
성능 인자, P 는 식 II 에 따라 계산한다.
Figure 112001030091918-pct00025
(II)
여기에서, R변이체 는 10 nM 변이체로 세척된 시험 재료의 반사율; RSavinase 는 10nM Savinase 로 세척된 시험 재료의 반사율; R블랭크 는 무효소로 세척된 시험 재료의 반사율이다.
US (세제: OMO, 견본: EMPA116)
변이체 IF투여량/반응 P
G97GA 2.2 -
US (세제: US Wisk, 견본: EMPA117)
변이체 IF투여량/반응 P
G97GA - 1.42
G97GP+A98T - 1.51
G97GAA+A98S+A98S+S99G+S101T* - 1.28
*1 WO 99/27082에 개시
따라서, 본 발명의 서브틸라제는 Savinase
Figure 112001030091918-pct00026
과 비교하여 개선된 세척 성능을 보였다.
<110> NOVOZYMES A/S <120> SUBTILASE ENZYMES OF THE I-S1 AND I-S2 SUB-GROUPS HAVING AT LEAST ONE ADDITIONAL AMINO ACID RESIDUE BETWEEN POSITIONS 97 AND 98 <130> 2 <150> PA 1999 00701 <151> 1999-05-20 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 275 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 1 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val 1 5 10 15 Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly 50 55 60 Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val 65 70 75 80 Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn 85 90 95 Xaa Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala 130 135 140 Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly 145 150 155 160 Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr 195 200 205 Tyr Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr 245 250 255 Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275 <210> 2 <211> 270 <212> PRT <213> Bacillus lentus <400> 2 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Xaa 85 90 95 Ala Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp 100 105 110 Ala Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro 115 120 125 Ser Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg 130 135 140 Gly Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp 165 170 175 Gln Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp 180 185 190 Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr 195 200 205 Tyr Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly 210 215 220 Ala Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln 225 230 235 240 Ile Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn 245 250 255 Leu Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 270

Claims (38)

  1. 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefacients) subtilisin BPN' (BASBPN) 번호 매기기에 의할 때, 위치 95 내지 103 으로부터의 활성 부위 루프(b) 영역의 위치 97 에서 하나의 추가의 아미노산 잔기를 가지는,
    바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 168의 Subtilisin I168 (ABSS168), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefacients) subtilisin BPN' (BASBPN), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)의 Subtilisin DY (BSSDY), 및 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis)의 Subtilisin Carsberg (BLSCAR)으로 구성되는 군으로부터 선택되거나,
    바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) Subtilisin 147 (BLS147), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) Subtilisin 309 (BLS309), subtilisin PB92 (BAALKP) 및 바실러스 YaB 알칼리 엘라스타제 (BYSYAB)로 구성되는 군으로부터 선택되는
    서브틸라제 효소로서, 상기 추가의 아미노산 잔기는 위치 97 및 98 사이에 A, T, G, S, D, E, H, I 및 P로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 잔기의 삽입에 해당하는 것을 특징으로 하는 서브틸라제 효소.
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  15. 제 1 항에 있어서, 모 서브틸라제는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 168의 Subtilisin I168 (ABSS168), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefacients) subtilisin BPN' (BASBPN), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)의 Subtilisin DY (BSSDY), 및 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis)의 Subtilisin Carsberg (BLSCAR)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 서브틸라제 효소.
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  18. 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefacients) subtilisin BPN'(BASBPN) 번호 매기기에 의할 때, 위치 95 내지 103으로부터의 활성 부위 루프(b) 영역의 위치 97에서 하나의 추가의 아미노산 잔기를 가지는,
    바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) Subtilisin 147 (BLS147), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) Subtilisin 309 (BLS309), subtilisin PB92 (BAALKP) 및 바실러스 YaB 알칼리 엘라스타제 (BYSYAB)로 구성되는 군으로부터 선택되는
    서브틸라제 효소로서, 상기 추가의 아미노산 잔기는 위치 97 및 98 사이에 하나의 아미노산 잔기의 삽입에 해당하고, 상기 삽입은:
    G97GA,
    G97GT,
    G97GG,
    G97GS,
    G97GD,
    G97GE,
    G97GH,
    G97GI, 및
    G97GP
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 서브틸라제 효소.
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  22. 제 18 항에 있어서, 서브틸라제는 G97GT+Y167A, G97GP+A98T 및 G97GA 로 구성되는 군으로부터 선택된 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 서브틸라제 효소.
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  26. 제 1 항, 제 15 항, 제 18 항, 및 제 22 항 중 어느 한 항의 서브틸라제 또는 서브틸라제 변이체를 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA 서열.
  27. 제 26 항의 분리된 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  28. 제 27 항의 발현 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 미생물 숙주 세포.
  29. 제 28 항에 있어서, 박테리아인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주세포.
  30. 제 29 항에 있어서, Bacillus인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주세포.
  31. 제 30 항에 있어서, B.lentus 인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주세포.
  32. 제 28 항에 있어서, 균류 또는 효모인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주세포.
  33. 제 32 항에 있어서, 사상균인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주세포.
  34. 제 33 항에 있어서, Aspergillus 인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주세포.
  35. 제 1 항, 제 15 항, 제 18 항, 및 제 22 항 중 어느 한 항의 서브틸라제 또는 서브틸라제 변이체를 코딩하는 분리된 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주를, 상기 서브틸라제 또는 서브틸라제 변이체가 발현 및 분비되는 조건하에서 배양하는 단계 및 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, 제 1 항, 제 15 항, 제 18 항 및 제 22 항 중 어떤 한 항의 서브틸라제 또는 서브틸라제 변이체를 생산하는 방법.
  36. 제 1 항, 제 15 항, 제 18 항, 및 제 22 항 중 어느 한 항의 서브틸라제 또는 서브틸라제 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 제 36 항에 있어서, 셀룰라제, 리파제, 큐티나제, 옥시도리덕타제, 다른 프로테아제, 또는 아밀라제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  38. 제 36 항에 있어서, 조성물은 세제 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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