MXPA01011836A - Enzimas subtilasas de los sub-grupos i-s1 e i-s2 que tienen al menos un residuo de un aminoacido adicional entre las posiciones 97 y 98. - Google Patents

Abstract

Las enzimas subtilasas de los sub-grupos I-Sl e I-S2 que tienen un residuo de un aminoacido adicional en la posicion 97 de la region de bucle del sitio activo (b) de las posiciones 95 a 103. Las subtilasas variantes exhiben un rendimiento de lavado mejorado en un detergente en comparacion a su enzima madre.

Description

ENZIMAS SUBTILASAS DE LOS SUB-GRUPOS I-SI E I-S2 QUE TIENEN AL MENOS UN RESIDUO DE UN POSICIONES 97 Y 98 5 CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere a nuevas enzimas subtilasas de los sub-grupos I-SI e I-S2 que tienen al menos un residuo de un aminoácido adicional en la posición 97 de la región del bucle del sitio activo (b) de las posiciones 95 a 10 103. Estas proteasas son útiles exhibiendo un rendimiento de lavado excelente o mejorado cuando se utilizan en detergentes; composiciones de limpieza y de detergente. La invención además se refiere a genes que codifican la expresión de las enzimas cuando se insertan en una célula u 15 organismo hospedante, adecuado; y estas células hospedantes transformadas con los mismos y capaces de expresar las variantes de enzimas, y métodos para la producción de las nuevas enzimas. también otras enzimas, o mezclas de las mismas. Las enzimas comercialmente más importantes son las proteasas. Un número creciente de proteasas comercialmente utilizadas son las variantes producidas mediante la ingeniería de proteínas de las proteasas del tipo nc cultivado, de origen natural, por ejemplo DURAZYM" (NOVO Nordisk A/S), RELASE® (Novo Nordisk A/S), MAXAPEM® (Gist-Brocades N.V.), PURAFECT® (Genencor International, Inc.). Además, en la técnica de describe un gran número de variantes de proteasa, tal como en la patente europea No. 130756 (GENENTECH) (correspondiente a la patente norteamericana reexpedida No. 34,606 (GENENCOR)); patente europea No. 214435 (HENKEL); patente WO 87/04461 (AMGEN); patente WO 87/05050 (GENEX) ; patente europea No. 260105 (GENENCOR); Thomas, Russell, y Fersht (1985) Na ture 318 375-376; Thomas, Russell y Fersht (1987) J. Mol . Biol . . 193 803-813; Russel and Fersht Na ture 328 496-500 (1987); patente WO 88/08028 (Genex) ; patente WO 88/08033 (Amgen); WO 95/27049 (SOLVAY S.A.); patente WO 95/30011 (PROCTER & GAMBLE COMPANY) ; patente WO 95/30010 (PROCTER & GAMBLE COMPANY) ; patente WO 95/29979 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); patente norteamericana No. 5,543,302 (SOLVAY S.A.); patente eruopea No. 251 446 (GENENCOR); patente WO 89/06279 (NOVO NORDISK A/S); patente WO 91/00345 (NOVO NORDISK A/S); patente europea No. 525 610 Al (SOLVAY); y patente WO 94/02618 (GIST-BROCADES N.V. ) . Sin embargo, aunque se ha descrito un gran número de variantes de proteasas útiles, existe aun una necesidad por proteasas o variantes de proteasas mejoradas para un gran número de usos industriales. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención, es proporcionar proteasas o variantes de proteasas mejoradas producidas mediante la ingeniería de proteínas, especialmente para el uso en la industria del detergente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han encontrado que las subtilisinas, en donde al menos uno de los bucles del sitio activo son más grandes que aquellos actualmente conocidos, exhiben propiedades de rendimiento de lavado mejorado en las composiciones de detergente. La identificación de las mismas fue hecha al construir variantes de subtilisina, especialmente de la subtilisina 309 (BLSAVI o Savinase®) , que exhiben propiedades de rendimiento de lavado mejorado en las composiciones de detergente con relación a la enzima de tipo i__cuÜivajdo, madre. Esto ha sido descrito en nuestra primera solicitud DK1332/97 (ahora publicada como WO 99/27082) . Ahora se ha encontrado que ciertas subtilasas o variantes de las mismas de los sub-grupos I-SI ("subtilisinas" verdaderas) e I-S2 (subtilisinas altamente alcalinas) que tienen al menos un residuo de un aminoácido adicional en la posición 97 (o preferiblemente entre las posiciones 97 y 98) de la región de bucle del sitio activo (b) de las posiciones 95 a 103, exhiben un rendimiento de lavado sorprendentemente mejorado en comparación con aquellas actualmente conocidas y aquellas descritas en la solicitud. Las variantes de inserción en la posición 97 descritas en la patente WO 99/27082 incluyen G97GASG, G97GAA, G97GAS, G97GAS+A98S+S99G, G97GGG+A98S+S99G, G97GAA+A98S+S99G, G97GASG+A98S+S99G+G100A+S101A Y G97GAA+A98S+S99G+S101T. Estas variantes no están dentro del alcance de la presente invención. Las proteasas mejoradas de acuerdo con la invención se pueden obtener mediante el aislamiento de recursos naturales o mediante la introducción de al menos un residuo de un aminoácido adicional (una inserción) en el bucle., del sitio activo (b) entre las posiciones 97 y 98 en una subtilasa del tipo no, cultivado (para una definición de los bucles del sitio activo y la numeración de las posiciones ver posteriormente) . Aunque este descubrimiento fue hecho en la subtilisina 309, se predice que será posible producir o aislar las subtilasas o variantes de subtilasa ventajosas, similares. -.áfa-li • - - - Saéfii&^tí - &?.

Además, será posible seleccionar específicamente los aislados naturales para identificar las nuevas subtilasas de tipo no cultivado que comprenden un bucle del sitio activo (b) el cual es más grande que el bucle del sitio activo correspondiente en las subtilasas de tipo no cultivado conocidas, tal como la subtilisina 309, subtilasas que pueden ser consideradas que tienen un residuo de un aminoácido insertado entre las posiciones 97 y 98, y que exhiben un rendimiento de lavado excelente en un detergente, en comparación con su subtilisina conocida más estrechamente relacionada, tal como la subtilisina 309. Concerniente al alineamiento y la numeración se hace referencia a las figuras 1, la, 2 y 2a posteriores que muestran los alineamientos entre la subtilisina BPN' (a) (BASBPN) y la subtilisina 309 (BLSAVI) (b) , y los alineamientos entre la subtilisina BPN' (a) (BASBPN) y la subtilisina Carlsberg (g) . Estos alineamientos se utilizan en esta solicitud de patente como una referencia para la numeración de los residuos. Los siete bucles del sito activo (a) a (g) (inclusive ambos residuos de un aminoácido finales indicados) son definidos en la presente para incluir los residuos de un aminoácido en los segmentos datos a continuación (a) la región entre el residuo de un aminoácido 33 y 43; (b) la región entre el residuo de un aminoácido 95 y 103; %%& >• (c) la región entre el residuo de un aminoácido 125 y 132; (d) la región entre el residuo de un aminoácido 153 y 173; 5 (e) la región entre el residuo de un aminoácido 181 y 195; (f) la región entre el residuo de un aminoácido 202 y 204; (g) la región entre el residuo de un aminoácido 218 y 10 219; Por consiguiente, en un primer aspecto la invención se refiere a una enzima subtilasa aislada ( es decir más de 10% pura) de los sub-grupos I-SI e I-S2 que tienen al menos 15 un residuo de un aminoácido adicional en la posición 97 de la región del bucle del sitio activo (b) de las posiciones 95 a 103, por lo que el (los) residuo (s) de un aminoácido adicional (es) corresponde (n) a la inserción de al menos un residuo de un aminoácido entre las posiciones 97 y 98, con la 20 condición que la enzima subtilasa no contenga las siguientes inserciones G97GASG, G97GAA, G97GAS, G97GAS+A98S+S99G, G97GGG+A98S+S99G, G97GAA+A98S+S99G, G97GASG+A98S+S99G+G100A+S101A y G97GAA+A98S+S99G+S101T. En un segundo aspecto, la invención se refiere a una i ??. cÁ LMáÁ?mi. siÉJ- k ..-*-_...> secuencia de ADN aislada que codifica la variante de subtilasa de la invención. En un tercer aspecto, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN aislada que codifica una variante de subtilasa de la invención. En un cuarto aspecto, la invención se refiere a una célula hospedante, microbiana transformada con un vector de expresión de acuerdo con el tercer aspecto. En un aspecto adicional, la invención se refiere a la producción de las enzimas subtilisinas de la invención. Las enzimas de la invención se pueden producir generalmente ya sea mediante el cultivo de una cepa microbiana de la cual se aisló la enzima y la recuperación de la enzima en forma sustancialmente pura; o al insertar un vector de expresión de acuerdo con el tercer aspecto de la invención en un hospedante microbiano adecuado, cultivar el hospedante para expresar la enzima subtilasa deseada y recuperar el producto enzimático. Además, la invención se refiere a una composición que comprende una subtilasa o una variante de subtilasa de la invención. Aun además, la invención se refiere al uso de las enzimas de la invención para un gran número de usos industriales relevantes, en particular para el uso en composiciones de limpieza y las composiciones de limpieza que comprenden las enzimas, especialmente las composiciones de detergente que comprenden las enzimas subtilisinas de la invención.

DEFINICIONES Antes de discutir esta invención en más detalle, primero serán definidos los siguientes términos y convenciones .

NOMENCLATURA DE LOS AMINOÁCIDOS A Ala Alanina V Val Valina L Leu Leucina I He Isoleucina P Pro Prolina F Phe Fenilalanina W Trp Triptófano M Met Metionina G Gly Glicina S Ser Serina T Thr Treonina C Cys Cisteína Y Tyr Tirosina N Asn Asparagina ÍÍ &éÁd&káéá* Q Gln Glutamina D Asp Acido Aspártico E Glu Acido Glutámico K Lys Lisina R Arg Arginina H His Histidina X Xaa Cualquier aminoácido NOMENCLATURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS A Adenina Guanina C Citosina Timina (únicamente en ADN) U Uracilo (únicamente en ARN) NOMENCLATURA Y CONVENCIONES PARA LA DESIGNACIÓN DE LAS VARIANTES En la descripción de las diversas variantes de enzima producidas o contempladas de acuerdo con la invención, las siguientes nomenclaturas y convenciones ha sido adaptadas para la facilidad de referencia: Una estructura de referencia es definida primero al alinear la enzima del tipo no cultivado, aislada o madre con la subtilisina BPN' (BASBPN) . * *->*-- • - ^¿¿¿¿?^^^^S^ El alineamiento se puede obtener mediante la rutina GAP del paquete GCG versión 9.1 para numerar las variantes utilizando los siguientes parámetros: penalización por creación de la abertura = 8 y penalización por extensión de la abertura = 8 y todos los otros parámetros mantenidos en sus valores predeterminados. Otro método es utilizar los alineamientos reconocidos, identificados entre las subtilasas, tal como el alineamiento indicado en la patente WO 91/00345. En la mayoría de los casos, las diferencias no serán de importancia. Estos alineamientos entre la subtilisina BPN' (BASBPN) y la subtilisina 309 (BLSAVI) y la subtilisina Carlsberg (BLSCAR) , respectivamente son indicados en las figuras 1, la, 2 y 2a. Por esto, un gran número de supresiones e inserciones serán definidas con relación a la BASBPN. En la figura 1, la subtilisina 309 tiene 6 supresiones en las posiciones 36, 58, 158, 162, 163 y 164 en comparación con la BASBPN, mientras que en la figura la, la subtilisina 309 tiene las mismas supresiones en las posiciones 36, 56, 159, 164, 165 y 166 en comparación con la BASBPN. En la figura 2, la subtilisina Carlsberg tiene una supresión en la posición 58 en comparación con la BASBPN, mientras que en la figura 2a, la subtilisina Carlsberg tiene una supresión en la posición 56 en comparación con la BASBPN.

Estas supresiones están indicadas en las figuras 1, la, 2 y 2a por asteriscos (*) . Las diversas modificaciones realizadas en una enzima del tipo no cultivado son indicadas en general utilizando tres elementos como sigue: Aminoácido Original Posición Aminoácido Sustituido De esta manera, la anotación G195E significa una sustitución de una glicina en la posición 195 con un ácido glutámico.

Posición Aminoácido Sustituido En el caso cuando el residuo de un aminoácido original pueda ser cualquier residuo de un aminoácido, a veces se puede utilizar una anotación hecha a mano, corta que indique únicamente la posición y el aminoácido sustituido. Esta anotación es particularmente relevante en conexión con la(s) modificación (es) en las subtilasas homologas .

Aminoácido Original Posición Esta anotación se puede utilizar cuando el (los) residuo (s) de aminoácido que reemplazan un aminoácido específico en una posición es inmaterial.

Posición Cuando tanto el (los) aminoácido (s) original (es) como el (los) aminoácido (s) sustituido (s) pueden comprender cualquier aminoácido, entonces únicamente se indica la posición, por ejemplo : 170.

Aminoácido original Posición {aminoácido, sustituido, . . . , aminoácido., sustituido} Cuando el (los) aminoácido (s) original (es) y/o el (los) aminoácido (s) sustituido (s) pueden comprender más de uno, pero no todos los aminoácidos, entonces los aminoácidos seleccionados se indican dentro de corchetes { } . Para variantes específicas se utilizan los códigos específicos de tres o una letra, inclusive los códigos Xaa y X para indicar cualquier residuo de un aminoácido.

SUSTITUCIONES La sustitución de ácido Glutámico por glicina en la posición 915 es designada como: Glyl95Glu o G195E o la sustitución de cualquier residuo de un aminoácido por glicina en la posición 195 es designada como: Glyl95Xaa o G195X o Glyl95 o G195 De esta manera, la sustitución de serina por cualquier residuo de un aminoácido en la posición 170 sería designada Xaal70Ser o X170S. o 170Ser 170S Esta anotación es particularmente relevante en conexión con la(s) modificación (es) en subtilasas homologas { vide infra ) . De esta manera, 170Ser se da a entender que comprende por ejemplo tanto una modificación de Lysl70Ser en BASBPN como una modificación de Argl70Ser en BLSAVI (ver. Figura 1) . Para una modificación donde el (los) aminoácido (s) original (es) y/o el (los) aminoácido (s) sustituido (s) pueden comprender más de uno, pero no todos los aminoácidos, la sustitución de glicina, alanina, serina o treonina por arginina en la posición 170 sería indicada por Argl70{Gly,Ala,Ser,Thr} o R170 {G, A, S, T} para indicar las variantes R170G, R170A, R170S y R170T.

SUPRESIONES: Una supresión de glicina en la posición 195 sería indicada por: Glyl95* o G195* Correspondientemente, la supresión de más de un residuo de un aminoácido, tal como la supresión de glicina y leucina en las posiciones 195 y 196 será designada Glyl95*+Leul96* o G195*+L196* INSERCIONES: La inserción de un residuo de un aminoácido adicional tal como por ejemplo una lisina después de G195 es: Glyl95GlyLys o G195GK; o cuando más de un residuo de un aminoácido es insertado, tal como por ejemplo un Lys, Ala y Ser después de G195 esto es : Glyl95GlyLysAlaSer o G195GKAS En tales casos, el (los) residuo (s) de aminoácido insertado (s) son numerados por la adición de letras de caja baja al número de posición del residuo de un aminoácido que precede el (los) residuo (s) de aminoácido insertado (s) . En el ejemplo anterior las secuencias 194 a 196 serían de esta manera : 194 195 196 BLSAVI A - G - L 194 195 195a 195b 195c 196 Variante A - G - K - A - S - L En los casos donde es insertado un residuo de un aminoácido idéntico al residuo de un aminoácido existente, es claro que surge una degeneración en la nomenclatura. Si, por ejemplo, una glicina es insertada después de la glicina en el ejemplo anterior esta sería indicada por G195GG. El mismo cambio real podría ser indicado muy bien como A194AG por el cambio de 194 195 196 BLSAVI A - G - L a 194 195 195a 196 Variante A - G - G - L 194 194a 195 196 Tales ejemplos serán aparentes para la persona experta, y la indicación G195GG y las indicaciones correspondientes para este tipo de inserciones de esta manera significan que comprenden tales indicaciones degeneradas, equivalentes . Algunas veces se desea tanto realizar una modificación como una inserción al mismo tiempo. Esta situación también es cubierta por las presentes definiciones. De esta manera, S130TP indica que la serina en la posición 130 ha sido reemplazada por una tirosina y una prolina ha sido insertada entre las posiciones 130 y 131. Una forma más incomoda de describir esta variante sería: il. ?.?.i.imA.jfctel......-.

S130SP+S130T.

RELLENO DE UNA ABERTURA: Donde existe una supresión en una enzima en la comparación de referencia con la secuencia de subtilisina BPN' utilizada para la numeración, una inserción en tal posición es indicada como: *36Asp o *36D para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36.

MODIFICACIONES MÚLTIPLES Las variantes que comprenden modificaciones múltiples están separadas por impulsos, por ejemplo: Argl70Tyr+Glyl95Glu o R170Y+G195E que representan modificaciones en las posiciones 170 y 195 al sustituir la tirosina y el ácido glutámico por arginina y glicina, respectivamente. o por ejemplo Tyrlß7 {Gly, la, Ser, Thr}+Argl70{Gly, la, Ser, Thr} indica las variantes Tyrl67Gly+Argl70Gly, Tyrl67Gly+Argl70Ala, Tyrl67Gly+Argl70Ser, Tyrl67Gly+Argl70Thr, Tyrl67Ala+Argl70Gly, Tyrl67Ala+Argl70Ala, Tyrl67Ala+Argl70Ser, Tyrl67Ala+Argl70Thr, Tyrl67Ser+Argl70Gly, Tyrl67Ser+Argl70Ala, Tyrl67Ser+Argl70Ser, Tyrl67Ser+Argl70Thr, Tyrl67Thr+Argl70Gly, Tyrl67Thr+Argl70Ala, Tyrl67Thr+Argl70Ser, y Tyrl67Thr+Argl70Thr .

Esta nomenclatura es particularmente relevante con relación a las modificaciones dirigidas hacia la sustitución, reemplazo, inserción o supresión de residuos de un aminoácido que tienen propiedades comunes específicas, tales como los residuos de carga positiva (K, R, H) , de carga negativa (D, E) , o modificación (es) de aminoácido conservativa (s) de por ej emplo Tyrl67{Gly, la, Ser, Thr }+Argl70 {Gly, Ala, Ser, Thr}, que significa la sustitución de un aminoácido pequeño por otro aminoácido pequeño. Ver la sección "Descripción detallada de la invención" para detalles adicionales.

Numeración de las posiciones/residuos de un aminoácido Si no se menciona algo más, la numeración de los aminoácidos utilizada en la presente corresponde a aquella de la secuencia de la subtilasa BPN' (BASBPN) . Para la descripción adicional de la secuencia de BPN' ver las figuras 1 y 2, o Siezen y colaboradores , Protein Engng. 4 (1991) 719- 737.

Proteasas Las enzimas que escinden los enlaces de amida en los substratos de proteína son clasificadas como proteasas, o (intercambiablemente) peptidasas (ver Walsh, 1979, Enzyma ti c Reaction Mechanisms . W.H. Freeman and Company, San Francisco, Capítulo 3) .

Serina proteasas Una serina proteasa es una enzima la cual cataliza la hidrólisis de las uniones peptídicas, y en la cual existe un residuo de serina esencial en el sitio activo (White, Handler y Smith, 1973 " Principies of Biochemistry", Quinta Edición, McGraw-Hill Book Company, NY, páginas 271-272) . Las serina proteasas bacterianas tienen pesos moleculares en la gama de 20,000 a 45,000 Daltons. Estas son inhibidas por el diisopropilfluorofosfato. Estas hidrolizan los esteres terminales, simples y son similares en actividad a la quimotripsina eucariótica, también una serina proteasa. Un término más amplio, proteasa alcalina, que cubre un subgrupo, refleja el pH alto, óptimo de algunas de las serina proteasas, de pH 9.0 a 11.0 (para revisión, ver Priest (1977) Bacteriológica! Rev. 41 711-753) .

Subtilasas Un sub-grupo de serina proteasas, las tentativamente designadas subtilasas, ha sido propuesto por Sienzen y colaboradores, Protein Engng. 4 (1991) 719-737 y Siezen y colaboradores, Protein Science 6 (1997) 501-523. -t.Aa-A-.l LJu.tA asi*.

Estas son definidas mediante el análisis de homología de más de 170 secuencias de aminoácidos de serina proteasas previamente referidas como proteasas similares a la subtilisina. Una subtilisina fue definida previamente con frecuencia como una serina proteasa producida por bacterias u hongos Gram-positivos y de acuerdo con Siezen y colaboradores ahora es un sub-grupo de las subtilasas. Se ha identificado una amplia variedad de subtilasas, y se ha determinado la secuencia de aminoácidos de un gran número de subtilasas. Para una descripción más detallada de tales subtilasas y sus secuencias de aminoácidos se hace referencia a Siezen y colaboradores (1997). Un sub-grupo de las subtilasas, I-SI o subtilisinas "verdaderas", comprende las subtilisinas "clásicas", tales como la subtilisina 168 (BSS168), subtilisina BPN', subtilisina Carlsberg (ALCALASE®, NOVO NORDISK A/S), y subtilisina DY (BSSDY) . Un sub-grupo adicional de las subtilasas, I-S2 o subtilisinas altamente alcalinas, es reconocido por Siezen y colaboradores . Las proteasas del sub-grupo I-S2 se describen como subtilisinas altamente alcalinas y comprende enzimas tales como la subtilisina PB92 (BAALKP) (MAXACAL®, Gist-Brocades NV) , subtilisina 309 (SAVINASE®, NOVO NORDISK A/S), subtilisina 147 (BLS147) (ESPERASE®, NOVO NORDISK A/S), y elastasa alcalina YaB (BSEYAB) .

"SAVIÑASE®" La SAVINASE® es comercializada por NOVO NORDISK A/S.

Es la subtilisina 309 de B. Lentus y difiere de BAALKP solo en una posición (N87S, ver figura 1 en la presente) . La SAVINASE® tiene la secuencia de aminoácidos designada b) en la figura 1.

Subtilasa madre El término "subtilasa madre" describe una subtilasa definida de acuerdo con Siezen y colaboradores (1991 y 1997) . Para detalles adicionales ver la descripción de "SUBTILASAS" inmediatamente antes. Una subtilasa madre también puede ser una subtilasa aislada de una fuente natural, en donde la modificación subsiguiente ha sido hecha mientras retiene la característica de una subtilasa. Alternativamente, el término "subtilasa madre" puede ser llamada "subtilasa del tipo no cultivado" .

Modificación (es) de una variante de subtilasa El término "modificación (es) " utilizado en la presente se define que incluye una modificación química de una subtilasa así como también la manipulación genética del ADN que codifica una subtilasa. La(s) modificación (es) puede (n) ser reemplazo (s) de la(s) cadena (s) lateral (es) de aminoácidos, sustitución (es) , supresión (es) y/o inserciones dentro o en el (los) aminoácido (s) de interés.

Variante de subtilasa En el contexto de esta invención, el término variante de subtilasa o subtilasa mutada significa una subtilasa que ha sido producida por un organismo el cual está expresando un gen mutante derivado de un microorganismo madre el cual posee un gen original o madre y el cual produce una enzima madre correspondiente, el gen madre que ha sido mutado a fin de producir el gen mutado a partir del cual se produce la proteasa mutada designada subtilasa cuando se expresa en un hospedante adecuado.

Secuencias de subtilasas homologas Las regiones de bucle del sitio activo específicas, y las inserciones de aminoácidos en los bucles de la subtilasa SAVINASE® son identificadas para la modificación en la presente para obtener una variante de subtilasa de la invención. Sin embargo, la invención no está limitada a las modificaciones de esta subtilasa particular, sino que se extiende a otras subtilasas madre (del tipo no cultivado) , las cuales tienen una estructura primaria homologa a aquella de la SAVINASE®. La homología entre dos secuencias de .^Mt^-aw^^fc» fc^...^..».¿^-^..^ti^^^^a.-a ••--'*-'-jtj^ «j»«w^..^gt&m -h-fcljfci. aminoácidos es descrita en este contexto por la "identidad" de parámetros. A fin de determinar el grado de identidad entre dos subtilasas se puede aplicar la rutina GAP del paquete GCG versión 9.1 utilizando los mismos ajustes indicados anteriormente. La salida o resultado de la rutina es además del alineamiento de aminoácidos, el cálculo del "Porcentaje de Identidad" entre las dos secuencias. En base a esta descripción es una rutina para una persona de experiencia en la técnica identificar las subtilasas homologas adecuadas y regiones de bucle del sitio activo homologas, correspondientes, las cuales pueden ser modificadas de acuerdo con la invención.

Rendimiento de lavado La capacidad de una enzima para catalizar la degradación de diversos substratos de origen natural presentes en los objetos a ser limpiados durante, por ejemplo, el lavado o limpieza de superficies duras es referida frecuentemente como su capacidad de lavado, capacidad para lavar, detergencia o rendimiento de lavado. Por toda esta solicitud el término rendimiento de lavado será utilizado para incluir esta propiedad. íµ .»«_ Ú-??zá.?iÁ. ÁsAjci.?M.aáL it?t Secuencia de ADN aislada El término "aislado", cuando se aplica a una molécula de secuencia de ADN, representa que la secuencia de ADN ha sido removida de su ambiente genético natural y de esta manera está libre de otras secuencias de codificación extrañas o no deseadas, y está en una forma adecuada para el uso dentro de los sistemas de producción de proteínas genéticamente diseñadas. Tales moléculas aisladas son aquellas que son separadas de su ambiente natural e incluyen ADNc y clones genómicos. Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención están libres de otros genes con los cuales éstas son asociadas ordinariamente, pero pueden incluir las regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural tal como promotores y terminadores. La identificación de las regiones asociadas será evidente a una persona de experiencia ordinaria en la técnica (ver por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316: 774-78, 1985). El término "una secuencia de ADN aislada" puede ser denominado alternativamente "una secuencia de ADN clonada".

Proteína aislada Cuando se aplica a una proteína, el término "aislado" indica que la proteína ha sido removida de su ambiente nativo o natural.

En una forma preferida, la proteína asilada está sustancialmente libre de otras proteínas, particularmente otras proteínas homologas (es decir, "impurezas homologas" (ver posteriormente) ) . Una proteína aislada es más de 10% pura, preferiblemente más de 20% pura, más preferiblemente más de 30% pura, determinado por SDS-PAGE. Además, se prefiere proporcionar la proteína en una forma altamente pura, es decir, más de 40% pura, más de 60% pura, más de 80% pura, más preferiblemente más de 95% pura, y aun más preferiblemente más de 99% pura, determinado por SDS-PAGE. El término "proteína aislada" puede ser denominado alternativamente "proteína purificada".

Impurezas homologas El término "impurezas homologas" significa cualquier impureza (por ejemplo otro polipéptido diferente del polipéptido de la invención) el cual se origina de la célula homologa de donde es obtenido originalmente el polipéptido de la invención.

Obtenido de El término "obtenido de" utilizado en la presente en conexión con una fuente microbiana específica, significa que ei ponnucieótido y/o el polipéptido -es producido por la fuente específica, o por una célula en la cual ha sido insertado un gen de la fuente.

Substrato El término "substrato" utilizado en conexión con un substrato para una proteasa debe ser interpretado en su forma más amplia como que comprende un compuesto que contiene al menos una unión de péptido susceptible a la hidrólisis por una proteasa designada subtilisina.

Producto El término "producto" utilizado en conexión con un producto derivado de una reacción enzimática de proteasa debe ser interpretado en el contexto de esta invención como que incluye los productos de una reacción de hidrólisis que involucra una proteasa designada subtilasa. Un producto puede ser el substrato en una reacción de hidrólisis subsiguiente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra un alineamiento entre la subtilisina BPN' (a) y la Savinase® (b) utilizando la rutina GAP mencionada anteriormente. La figura la muestra el alineamiento entre la subtilisina BPN' y la Savinase tomado de la patente WO 91/00345 . *. ?*t ****ffi~*- -tfff 'fr ""'t* ' La figura 2 muestra un alineamiento entre la subtilisina BPN' y la subtilisina Carlsberg utilizando la rutina GAP mencionada anteriormente. La figura 2a muestra el alineamiento entre la subtilisina BPN' y la subtilisina Carlsberg tomado de la patente WO 91/00345. La figura 3 muestra la estructura tridimensional de Savinase (entrada de Protein Data Bank (PDB) 1SVN) . En la figura se indica el bucle del sitio activo (b) es indicado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las subtilasas de la invención en un primer aspecto se refieren a una enzima subtilasa aislada (es decir más de 10% pura) de los sub-grupos I-SI e I-S2 que tienen al menos un residuo de un aminoácido adicional en la posición 97 de la región de bucle del sitio activo (b) de las posiciones 95 a 103, por lo que el (los) residuo (s) de un aminoácido adicionales corresponde a la inserción de al menos un residuo de un aminoácido entre las posiciones 97 y 98. En otras palabras, las subtilasas de la invención se caracterizan por comprender una región de bucle del sitio activo (b) de más de 9 residuos de un aminoácido y en donde el residuo de un aminoácido adicional es o puede ser considerado como que es insertado entre las posiciones 97 y 98 comparado a la subtilasa madre o una subtilasa del tipo no cultivado, conocida. Una subtilasa del primer aspecto de la invención puede ser una subtilasa madre o del tipo no cultivado identificada y aislada de la naturaleza. Esta subtilasa del tipo no cultivado, madre se puede seleccionar específicamente por técnicas normales conocidas en la técnica. Una forma preferida de hacer esto puede ser al amplificar específicamente por la PCR las regiones de ADN conocidas que codificar los bucles del sitio activo en las subtilasas de numerosos microorganismos diferentes, preferiblemente diferentes cepas de Bacillus. Las subtilasas son un grupo de enzimas conservadas, en el sentido que sus secuencias de ADN y de aminoácidos son homologas. Por consiguiente, es posible construir cebadores relativamente específicos que flanquean los bucles del sitio activo. Una forma de hacer esto es al investigar un alineamiento de diferentes subtilasas (ver por ejemplo Siezen y colaboradores, Protein Science 6 (1997) 501-523) . Es a partir de este trabajo de rutina para una persona experta en la técnica que se construyen los cebadores de la PCR que flanquean el bucle del sitio activo correspondiente al bucle del sitio activo (b) entre el residuo de un aminoácido 95 a ?.íLÉa?A?^c.??L» 103 en cualquiera de los grupos I-SI o I-S2, tal como de BLSAVI. Utilizando estos cebadores de la PCR para amplificar el ADN de un número de diferentes microorganismos, preferiblemente diferentes cepas de Bacillus, seguido por el ordenamiento en secuencias del ADN de los fragmentos de la PCR amplificados, será posible identificar las cepas las cuales producen las subtilasas de estos grupos que comprenden una región del sitio activo más grande, comparada con por ejemplo BLSAVI, correspondiente a la región de bucle del sitio activo de las posiciones 95 a 103, y donde se puede considerar que existe una inserción entre las posiciones 97 y 98. Habiendo identificado la cepa y una secuencia de ADN parcial de tal subtilasa de interés, es un trabajo de rutina para una persona experta en la técnica completar la clonación, expresión y purificación de esta subtilasa de la invención. Sin embargo, se considera que una enzima subtilasa de la invención es predominantemente una variante de una subtilasa madre. Por consiguiente, en una modalidad, la invención se refiere a una enzima subtilasa aislada de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en donde la enzima subtilasa es una variante construida que tiene un bucle del sitio activo (b) más grande que su enzima madre al tener al menos una inserción de aminoácido entre los residuos de un aminoácido 97 y 98. Las subtilasas de la invención exhiben excelente rendimiento de lavado en un detergente, y si la enzima es una variante construida exhibe un rendimiento de lavado mejorado en un detergente en comparación a su subtilasa más estrechamente relacionada, tal como la subtilisina 309. Los diferentes productos de subtilasa exhibirán un diferente rendimiento de lavado en diferentes tipos de composiciones de detergente. Una subtilasa de la invención tiene un rendimiento de lavado mejorado, comparado con su similar más cercano en la mayoría de tales tipos diferentes de composiciones de detergente. Preferiblemente, una enzima subtilasa de la invención tiene un rendimiento de lavado mejorado, comparado con a su similar más cercano en las composiciones de detergente indicadas en el ejemplo 3, en la presente. A fin de determinar si una secuencia de aminoácidos de subtilasa dada (inaplicable si la secuencia de subtilasa es una secuencia de subtilasa del tipo no cultivado, madre o una secuencia de una variante de subtilasa producida por cualquier otro método diferente de la mutagénesis dirigida al sitio) está dentro del alcance de la invención, se puede utilizar el siguiente procedimiento: i) alinear la secuencia de subtilasa a la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' ; ii) en base al alineamiento realizado en el paso i) identificar el bucle del sitio activo (b) , en la secuencia de subtilasa correspondiente a la región de bucle del sitio activo (b) de la subtilisina BPN' que comprende la región (tanto de los aminoácidos finales incluidos) entre el residuo de un aminoácido de 95 a 103; iii) determinar si el bucle del sitio activo (b) en la secuencia de subtilasa, identificada en el paso ii) es más grande que el bucle del sitio activo correspondiente en la subtilisina BPN' y si la prolongación corresponde a la inserción de al menos un residuo de un aminoácido entre las posiciones 97 y 98. Si este es el caso, la subtilasa investigada es una subtilasa dentro del alcance de la presente invención. El alineamiento realizado en el paso i) anterior se realiza como se describe anteriormente al utilizar la rutina GAP. ,lá*t.AAjAm¿¡á*AM, En base a esta descripción, es una rutina para una persona experta en la técnica identificar el bucle del sitio activo (b) en una subtilasa y determinar si la subtilasa en cuestión está dentro del alcance de la invención. Si se construye una variante mediante la mutagénesis dirigida al sitio, se sabe por supuesto de antemano si la variante de subtilasa está dentro del alcance de la invención. Una variante de subtilasa de la invención puede ser construida mediante técnicas normales conocidas en el arte tal como mediante la mutagénesis aleatoria/dirigida al sitio o al entremezclar el ADN de diferentes secuencias de subtilasa. Ver las secciones "PRODUCCIÓN DE UNA VARIANTE DE SUBTILASA" y "Materiales y métodos" para detalles adicionales . En las modalidades preferidas, la invención se refiere a 1. una enzima subtilasa aislada de acuerdo con la invención en donde al menos un residuo de un aminoácido insertado se selecciona del grupo que comprende: T,G,A y S; 2. una enzima subtilasa aislada de acuerdo con la invención, en donde al menos un residuo de un aminoácido insertado se selecciona del grupo de residuos de un aminoácido cargados que comprende: D, E, H, K, y R, más preferiblemente D, E, K y R; int -frt»—•«--',aaa«A« 3. una enzima subtilasa aislada de acuerdo con la invención, en donde al menos un residuo de un aminoácido insertado se selecciona del grupo de residuos de un aminoácido hidrofílicos que comprende: C, N, Q, S y T, más preferiblemente N, Q, S y T; 4. una enzima subtilasa aislada de acuerdo con la invención, en donde al menos un residuo de un aminoácido insertado se selecciona del grupo de residuos de un aminoácido hidrofóbicos, pequeños que comprende: A,G y V; o 5. una enzima subtilasa aislada de acuerdo con la invención, en donde al menos un residuo de un aminoácido insertado se selecciona del grupo de residuos de un aminoácido hidrofílicos, grandes que comprende: F, I, L, M, P, W y Y, más preferiblemente F, I, L, M, y Y. En una modalidad adicional, la invención se refiere a una enzima subtilasa aislada de acuerdo con la invención, en donde la inserción entre las posiciones 97 y 98 comprende al menos dos aminoácidos, comparado al bucle del sitio activo correspondiente en la subtilisina BPN' . En las modalidades adicionales, la invención se refiere a una enzima subtilasa aislada que comprende al menos una inserción, seleccionada del grupo que comprende (en la numeración de BASBPN) : X97X{T,G,A,S} X97X{D,E,K,R} X97X{H,V,C,N,Q} X97X{F,I,L,M,P,W,Y} o más específico para la subtilisina 309 y las subtilasas estrechamente relacionadas, tales como BAALKP, BLSUBL y BSKSMK G97GA G97GT G97GG G97GS G97GD G97GE G97GK G97GR G97GH G97GV G97GC G97GN G97GQ G97GF G97GI G97GL .-*a,a._M-ti>4 2^^¿a¿ m^^Jtíál?Mml, G97GM G97GP G97GW G97GY Además, la invención se refiere a las subtilasas que comprenden múltiples inserciones en la posición 97, o cualquiera de las combinaciones mencionadas posteriormente. Es bien conocido en la técnica que una sustitución comúnmente llamada conservativa de un residuo de un aminoácido a un residuo de un aminoácido similar se espera que produzca únicamente un cambio menor en la característica de la enzima. La Tabla III posterior enlista los grupos de sustituciones de aminoácidos conservativas.

Tabla III Sustituciones de aminoácidos conservativas Propiedad común Aminoácido Básica (carga positiva) K = lisina H = histidina Acídica (carga negativa) E = ácido glutámico D = ácido aspártico Polar Q = glutamina N = asparagina Hidrofóbica L = leucina ?ád ii.AÉt? tÁd , I = isoleucina V = valina M = metionina Aromática F = fenilalanina W = triptófano Y = tirosina Pequeña G = glicina A = alanina S = serina T = treonina De acuerdo con este principio, las variantes de subtilasa que comprenden sustituciones conservativas, tal como G97A+A98AS+S99G, G97S+A98AT+S99A se espera que exhiban características que no son drásticamente diferentes entre sí. En base a las variantes de subtilasa descritas y/o ejemplificadas en la presente, es un trabajo de rutina para una persona experta en la técnica identificar la(s) modificación (es) conservativa (s) adecuadas para estas variantes a fin de obtener otras variantes de subtilasa que exhiban un rendimiento de lavado mejorado de manera similar. De acuerdo con la invención, las subtilasas de la invención pertenecen a los sub-grupos I-SI e I-S2, especialmente el sub-grupo I-S2, tanto para aislar las nuevas enzimas de la invención del ambiente natural o de la creación artificial de una diversidad, como para diseñar y producir las variantes a partir de una subtilasa madre. Con relación a las variantes del sub-grupo I-SI, se prefiere seleccionar una subtilasa madre del grupo que comprende BSS168 (BSSAS, BSAPRJ, BSAPRN, BMSAMP) , BASBPN, BSSDY, BLSCAR (BLKERA, BLSCA1, BLSCA2, BLSCA3), BSSPRC, y BSSPRD, o las variantes funcionales de las mismas que tienen retenida la característica del sub-grupo I-SI. Con relación a las variantes del sub-grupo I-S2, se prefiere seleccionar una subtilasa madre del grupo que comprende BSAPRQ, BLS147 (BSAPRM, BAH101), BLSAVI (BSKSMK, BAALKP, BLSUBL) , BYSYAB y BSAPRS, o las variantes funcionales de las mismas que tienen retenida la característica del subgrupo I-S2. En particular, la subtilasa madre es BLSAVI (SAVINASE® NOVO NORDISK A/S), y una variante de subtilasa preferida de la invención es por consiguiente una variante de SAVINASE®. La presente invención también comprende cualquiera de las subtilasas mencionadas anteriormente de la invención en combinación con cualquier otra modificación a la secuencia de aminoácidos de las mismas. Son consideradas especialmente las combinaciones con otras modificaciones conocidas en la técnica que proporcionan propiedades mejoradas a la enzima. La técnica describe un número de variantes de subtilasa con :*d.,.,.¡. .. ... ...y ... M. &u¡?j*i.í?*?iM??íáíáíl?l? diferentes propiedades mejoradas y un número de estas se menciona en la sección "antecedentes de la invención" en la presente ( vide supra ) . Estas referencias se describen en la presente como referencias para identificar una variante de subtilasa, la cual se puede combinar ventajosamente con una variante de subtilasa de la invención. Tales combinaciones comprenden las posiciones: 222 (mejora la estabilidad contra la oxidación), 218 (mejora la estabilidad térmica) , las sustituciones en los sitios de unión de Ca que estabilizan la enzima, por ejemplo la posición 76 y muchos otros aparentes de la técnica anterior. En modalidades adicionales, una variante de subtilasa de la invención se puede combinar ventajosamente con una o más modificaciones en cualquiera de las posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 206, 218, 222, 224, 235 y 274. Específicamente, las siguientes variantes BLSAVI, BLSUBL, BSKSMK y BAALKP se consideran apropiadas para la combinación: K27R, *36D, S57P, N76D, S87N, G97N, S101G, S103A, V104A, V104I, V104N, V104Y, H120D, N123S, Y167, R170, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L y T274A. Las variantes adicionales que comprenden cualquiera de las variantes S101G*V104N, S87N+S101G+V104N, K27R*V104Y+N123S+T274A, N76D+S103A+V104I o N76D+V104A u otras combinaciones de estas mutaciones (V104N, S101G, K27R, V104Y, U- A¡Mtstt m?dániá?*i&* N123S, T274A, N76D, V014A) en combinación con cualquiera de una o más modificaciones mencionadas anteriormente que exhiben de propiedades mejoradas. Las variantes de subtilasa aun adicionales del (los) aspecto (s) principal (es) de la invención se combinan preferiblemente con una o más modificaciones en cualquiera de las posiciones 129, 131, 133 y 194, preferiblemente como las modificaciones 129K, 131H, 133P, 133D y 194P, y más preferiblemente como las modificaciones P129K, P131H, A133P, A133D y A194P. Se espera que cualquiera de estas modificaciones proporcione un nivel de expresión más alto de una variante de subtilasa de la invención en la producción de la misma. Por consiguiente, una modalidad aun adicional de la invención se refiere a una variante de acuerdo con la invención, en donde la modificación se selecciona del grupo que comprende : G97GA G97GT G97GG G97GS G97GD G97GE G97GK G97GR *&$&&. & G97GH G97GV G97GC G97GN G97GQ G97GF G97GI G97GL G97GM G97GP G97GW G97GY PRODUCCIÓN DE UNA VARIANTE DE SUBTILASA Muchos métodos para la clonación de una subtilasa de la invención y para la introducción de las inserciones en los genes (por ejemplo genes de subtilasa) son bien conocidos en la técnica, ver, las referencias citadas en la sección "ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN". En general, se pueden utilizar procedimientos normales para la clonación de genes y la introducción de inserciones (aleatoria y/o dirigida al sitio) en los genes a fin de obtener una variante de subtilasa de la invención. Para la descripción adicional de las técnicas adecuadas se hace referencia a los Ejemplos en la presente y Sambrook y colaboradores (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. y colaboradores (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. , and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990); y la patente WO 96/34946. Además, una variante de subtilasa de la invención se puede construir mediante técnicas normales para la creación artificial de una diversidad, tal como al entremezclar el ADN de diferentes genes de subtilasa (patente WO 95/22625; Stemmer WPC, Nature 370:389-91 (1994)). El entremezclado del ADN de, por ejemplo, el gen que codifica la Savinase® con una o más secuencias de subtilasa parciales identificadas en la naturaleza que comprenden regiones de bucle del sitio activo (b) más grandes que el bucle del sitio activo (b) de Savinase®, después de la selección subsiguiente de variantes con rendimiento de lavado mejorado, proporcionará variantes de subtilasa de acuerdo con la invención.

VECTORES DE EXPRESIÓN Un vector de expresión recombinante que comprende una construcción de ADN que codifica la enzima de la '^*fi 'invención puede ser cualquier vector el cual se puede sujetar convenientemente a los procedimientos de ADN recombinante. La selección del vector dependerá frecuentemente de la célula hospedante dentro de la cual se debe introducir. De 5 esta manera, el vector puede ser un vector de réplica de manera autónoma, es decir un vector el cual existe como una entidad extracromosómica, la réplica del cual es dependiente de la réplica cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que en la 10 introducción dentro de una célula hospedante se integra dentro del genoma de la célula hospedante en parte o en su totalidad y es replicado junto con el (los) cromosoma (s) dentro de los cuales ha sido integrado. El vector es preferiblemente un vector de expresión 15 en el cual la secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención se enlaza de manera operable a los segmentos adicionales requeridos para la transcripción del ADN. En general, el vector de expresión se deriva del plásmido o ADN viral, o puede contener elementos de ambos. El término 20 "enlazado de manera operable" indica que los segmentos son ordenados de modo que éstos funcionen en armonía para sus propósitos pensados, por ejemplo la transcripción inicia en un promotor y procede a través de la secuencia de ADN que codifica la enzima.

El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula hospedante de selección y pueda ser derivada de los genes que codifican las proteínas ya sea homólogos o heterólogos para la célula hospedante. Los ejemplos de promotores adecuados para el uso en las células hospedantes bacterianas incluyen el promotor del gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus , el gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis, el gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquef aciens , el gen de proteasa alcalina de Bacillus subtilis, o el gen de oxilosidasa de Bacillus pumil us, o los promotores Lambda PR o PL de fagos o los promotores lac, trp o tac de E. coli. La secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención también puede ser conectada, si es necesario, de manera operable a un terminador adecuado. El vector recombinante de la invención además puede comprender una secuencia de ADN que hace posible que el vector se duplique en la célula hospedante en cuestión. El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo un gen, el producto del cual complementa un defecto en la célula hospedante, o un gen que codifica la resistencia a, por ejemplo, los antibióticos como canamicina, cloramfenicol, eritromicina, tetraciclina, ZJ.? A.i?A.t.A.MáL^ espectinomicina, o similares, o la resistencia a metales pesados o herbicidas. Para dirigir una enzima de la presente invención en la vía secretoria de las células hospedantes, se puede proporcionar una secuencia de señales secretorias (también conocida como una secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) en el vector recombinante. La secuencia de señales secretorias se une a la secuencia de ADN que codifica la enzima en la estructura de lectura correcta. Las secuencias de señales secretorias son colocadas comúnmente en 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica la enzima. La secuencia de señales secretorias puede ser aquella asociada normalmente con la enzima o puede ser de un gen que codifica otra proteína secretada. Los procedimientos utilizados para ligar las secuencias de ADN que codifican la presente enzima, el promotor y opcionalmente el terminador y/o la secuencia de señales secretorias, respectivamente, o para juntar estas secuencias mediante los esquemas de amplificación de la PCR adecuados, y para insertarlas en los vectores adecuados que contienen la información necesaria para la duplicación o integración, son bien conocidos para personas expertas en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, op. cit . ) .

CÉLULA HOSPEDANTE La secuencia de ADN que codifica la presente enzima introducida dentro de la célula hospedante puede ser ya sea homologa o heteróloga para el hospedante en cuestión. Si es homologa para la célula hospedante, es decir, producida por la célula hospedante en la naturaleza, será conectada típicamente de manera operable a otra secuencia promotora o, si es aplicable, otra secuencia de señales secretorias y/ o secuencia de terminación que en su ambiente natural. El término "homólogo" se propone que incluye una secuencia de ADN que codifica una enzima nativa para el organismo hospedante en cuestión. El término "heterólogo" se propone que incluye una secuencia de ADN no expresada por la célula hospedante en la naturaleza. De esta manera, la secuencia de ADN puede ser de otro organismo, o puede ser una secuencia sintética. La célula hospedante dentro de la cual se introduce la construcción de ADN o el vector recombinante de la invención, puede ser cualquier célula que sea capaz de producir la presente enzima e incluye las bacterias, levadura, hongos y células eucarióticas mayores inclusive las plantas . Los ejemplos de células hospedantes bacterianas las cuales, en el cultivo, son capaces de producir la enzima de la invención son bacterias gram-positivas tales como cepas de íA .?-,AÁ*á.*L?*i : Bacillus, tal como cepas de B . subtilis , B. licheniformis, B. lentus , B . brevis , B. stearothermophilus , B . alkalophil us , B. amyloliquef aciens , B. coagulans , B. circulans, B. lautus, B. mega therium o B . thuringiensis, o cepas de Streptomyces, tal como S . lividans o S . murinus , o bacterias gram-negativas tales como Echerichia coli . La transformación de las bacterias puede ser afectada por la transformación de protoplastos, la electroporación, la conjugación o al utilizar células competentes de una manera conocida per se (ver, Sambrook y colaboradores, supra) . Cuando se expresa la enzima en bacterias tales como E. coli , la enzima puede ser retenida en el citoplasma, típicamente como granulos insolubles (conocidos como cuerpos de inclusión) , o se puede dirigir al espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el caso anterior, las células son usadas y los granulos son recuperados y desnaturalizados después de lo cual la enzima es replegada mediante la dilución del agente de desnaturalización. En el último caso, la enzima puede ser recuperada del espacio periplásmico al disrrumpir las células, por ejemplo mediante la sonicación o choque osmótico, para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la enzima. Cuando se expresa la enzima en bacterias gram- positivas tal como las cepas de Bacillus o Streptomyces, la ^"enzima puede ser retenida en el citoplasma, o puede ser dirigida al medio extracelular por una secuencia de secreción bacteriana. En el último caso, la enzima puede ser recuperada del medio como se describe posteriormente. 5 MÉTODO PARA PRODUCIR LA SUBTILASA La presente invención proporciona un método para producir una enzima aislada de acuerdo con la invención, en donde una célula hospedante adecuada, la cual ha sido 10 transformada con una secuencia de ADN que codifica la enzima, es cultivada bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y la enzima resultante es recuperada del cultivo. Cuando un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica la enzima se transforma en una 15 célula hospedante heteróloga, es posible permitir la producción recombinante heteróloga de la enzima de la invención. Por lo que es posible hacer una composición de subtilasa altamente purificada, caracterizada en que está 0 libre de impurezas homologas. En este contexto, las impurezas homologas significan cualquier impureza (por ejemplo otros polipéptidos diferentes de la enzima de la invención) que se origina de la célula homologa de donde la enzima de la invención es 5 obtenida originalmente. £_ Á .ii ?^ití t& iist El medio utilizado para cultivar las células hospedantes transformadas puede ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de las células hospedantes en cuestión. La subtilasa expresada puede ser secretada convenientemente dentro del medio de cultivo y puede ser recuperada del mismo mediante procedimientos bien conocidos que incluyen la separación de las células del medio por la centrifugación o filtración, la precipitación de componentes proteináceos del medio por una sal tal como un sulfato de amonio, seguido por los procedimientos cromatográficos tales como la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o similares, USO DE UNA VARIANTE DE SUBTILASA DE LA INVENCIÓN Una variante de proteasa designada subtilasa de la invención puede ser utilizada para un gran número de aplicaciones industriales, en particular dentro de la industria del detergente. Además, la invención se refiere a una composición enzimática, la cual comprende una variante de subtilasa de la invención. Posteriormente se proporciona un resumen de las aplicaciones industriales preferidas y las composiciones enzimáticas preferidas, correspondientes. |fa¡^|t|jfc_k- -Í-J-i-4.-t--I-'-«™-^---^ --._¡_ _MA«_«_._y- —,.».-«• JyJ-J-tl. ^^,*rfMl.a<-tit.t--*JL.y-yy«^^y¿-.y.yJ-a.» -.--. md^? í .Lt, De ninguna manera se propone que este resumen sea una lista completa de aplicaciones adecuadas de una variante de subtilasa de la invención. Las variantes de subtilasa de la invención se pueden utilizar en otras aplicaciones industriales conocidas en la técnica que incluyen el uso de una proteasa, en particular una subtilasa.

COMPOSICIONES DE DETERGENTE QUE COMPRENDEN LAS ENZIMAS MUTANTES La presente invención comprende el uso de las enzimas mutantes de la invención en las composiciones de limpieza y de detergente y estas composiciones que comprenden las enzimas subtilisina mutante. Estas composiciones de limpieza y de detergente son bien descritas en la técnica y se hace referencia a la patente WO 96/34946; patente WO 97/07202; patente WO 95/30011 para una descripción adicional de las composiciones de limpieza y de detergente adecuadas. Además, el (los) ejemplo (s) posterior (es) demuestra (n) los mejoramientos en el rendimiento de lavado para un gran número de variantes de subtilasa de la invención.

Composiciones de Detergente La enzima de la invención se puede adicionar a y de esta manera convertirse en un componente de la composición de detergente. La composición de detergente de la invención puede ser formulada por ejemplo como una composición de detergente para lavar ropa a mano o con máquina que incluye una composición de aditivo para lavar ropa adecuada para el pretratamiento de telas teñidas y una composición suavizante para telas adicionada al enjuague, o puede ser formulada como una composición de detergente para el uso en operaciones generales de limpieza de superficies duras de la casa, o puede ser formulada para las operaciones de lavaplatos a mano o con máquina. En un aspecto específico, la invención proporciona un aditivo de tipo detergente que comprende la enzima de la invención. El aditivo de tipo detergente así como también la composición de detergente pueden comprender una o más de otras enzimas tales como una proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, por ejemplo, una lacasa y/o una peroxidasa. En general, las propiedades de la(s) enzima (s) seleccionada (s) deben ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir, pH-óptimo, la compatibilidad con ^A-i.A &*¡,,? .Mm otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etcétera) , y la(s) enzima (s) debe estar presente en cantidades efectivas.

/ Proteasas : Las proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Están incluidos los mutantes químicamente modificados o producidos mediante la ingeniería de proteínas. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metalo proteasa, preferiblemente una proteasa microbiana, alcalina o una proteasa similar a la tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son las subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacillus, por ejemplo, la subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en la patente WO 89/06279) . Los ejemplos de las proteasas similares a la tripsina son la tripsina (por ejemplo de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusari um descrita en la patente WO 89/06270 y la patente WO 94/25583. Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en la patente WO 92/19729, patente WO 98/20115, patente WO 98/20116, y la patente Wo 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.

Las enzimas clasificadas como proteasas comercialmente disponibles, preferidas incluyen AlcalaseMR, SavmaseMR, PrimaseMR, DuralaseMR, EsperaseMR y KannaseMR (Novo Nordisk A/S), MaxataseMR, MaxacalMR, MaxapemMR, ProperaseMR, PurafectMR, Purafect OxPMR, FN2MR, y FN3MR (Genencor International Inc.).

Lipasas : Las lispasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fungal. Están incluidos los mutantes químicamente modificados o producidos mediante la ingeniería de proteínas. Ejemplos de lipasas útiles incluyen las lipasas de Humi cola (synonym Thermomyces) , por ejemplo de H. lanuginosa (T. lanuginosus) descrita en la patente europea No. 258 068 y la patente europea No. 305 216 o de H. insolens descrita en la patente WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo de P. al caligenes o P. pseudoal caligenes (patente europea No. 218 272), P. cepacia (patente europea No. 331 376), P. stutzeri (patente británica No. 1,372,034), P. fl uorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (patente WO 95/06720 y la patente WO 96/27002), P. wi sconsinensis (patente WO 96/12012), una lipasa de Bacill us, por ejemplo de B . subtilis (Dartois y colaboradores (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophil us (JP. 64/744992) o B. punil us (patente WO 91/16422) .

Otros ejemplos son las variantes de lipasa tales como aquellas descritas en la patente WO 92/05249, patente WO 94/01541, patente europea No. 407 225, patente europea No. 260 105, patente WO 95/35381, patente WO 96/00292, patente WO 95/30744, patente WO 94/25578, patente WO 95/14783, patente WO 95/22615, patente WO 97/04079 y patente WO 97/07202. Las enzimas de lipasa comercialmente disponibles, preferidas incluyen LipolaseMR, y Lipolase UltraMR (Novo Nordisck A/S) .

Amilasas : Las amilasas adecuadas (a y/o ß) incluyen aquellas de origen bacteriano o fungal. Están incluidos los mutantes químicamente modificados o producidos mediante la ingeniería de proteínas. Las amilasas incluyen, por ejemplo, a-amilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo una cepa especial de B . lincheniformis , descrita en mayor detalle en la patente británica No. 1,296,839. Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en la patente WO 94/02597, la patente WO 94/18314, la patente WO 96/23873, y la patente WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 y 444.

Las amilasas comercialmente disponibles son DuramylMR, TermamylMR, fungamylMR y BANMR (Novo Nordisk A/S), RapidaseMR y PurastarMR (de Genencor International Inc.).

Celulasas: Las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fungal. Están incluidos los mutantes químicamente modificados o producidos mediante la ingeniería de proteínas. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas del género Bacill us , Pseudomonas , Humicola , Fusarium, Thielavia , Acremonium, por ejemplo las celulosas fúngales producidas de Humicola insolens , Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en la patente norteamericana No. 4,435,307, la patente norteamericana No. 5,648,263, la patente norteamericana No. 5,691,178, la patente norteamericana 5,776,757 y la patente WO 89/09259. Las celulasas especialmente adecuadas son las celulosas alcalinas o neutras que tienen beneficios de cuidado del color. Ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas en la patente europea No. 0 495 257, la patente europea No. 0 531 372, la patente WO 96/11262, la patente WO 96/29397, la patente WO 98/08940. Otros ejemplos, son las variantes de celulasa tales como aquellas descritas en la patente WO 94/07998, la patente europea No. 0 531 315, la patente norteamericana No. 5,457,046, la patente norteamericana No. 5,686,593, la patente norteamericana No. . fei-i ...i. 5,763,254, la patente WO 95/24471, la patente WO 98/12307 y PCT/DK98/00299. Las celulasas comercialmente disponibles incluyen CelluzymeMR, y CarezymeMR (Novo Nordisk A/S), ClazinaseMR, y Puradax HaMR (Genencor International Inc.), y KAC-500(B)MR (Kao Corporation) .

Peroxidasas/oxidasas : Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fungal. Están incluidos los mutantes químicamente modificados o producidos mediante la ingeniería de proteínas. Los ejemplos de peroxidasas útiles incluyen las peroxidasas de Coprinus , por ejemplo de C. cinereus, y las variantes de las mismas como aquellas descritas en la patente WO 93/24618, la patente WO 95/10602 y la patente WO 98/15257. Las peroxidasas comercialmente disponibles incluyen GuardzymeMR (Novo Nordisk A/S) . La(s) enzima (s) del detergente se pueden incluir en una composición de detergente al adicionar aditivos separados que contienen una o más enzimas, o al adicionar un aditivo combinado que comprende todas estas enzimas. Una aditivo de tipo detergente de la invención, es decir un aditivo separado o un aditivo combinado, se puede formular por ejemplo como un material granulado, un líquido, una suspensión espesa, etcétera. Las formulaciones de aditivo de tipo detergente .¿4 Jtá-á-t.. _ lAá.»»..-fc ^¿ . feaéa -^¡^^ d^^ &c preferidas son materiales granulados, en particular materiales granulados no pulverizables, líquidos, en particular líquidos estabilizados o suspensiones espesas. Los materiales granulados no pulverizables se pueden producir, por ejemplo como se describe en las patentes norteamericanas Nos. 4,106,991 y 4,661,452 y pueden ser revestidos opcionalmente por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento cerosos son los productos de poli (óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos molares promedio de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los cuales hay 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento para la formación de películas adecuados para la aplicación mediante las técnicas de lecho fluidizado se dan en la patente británica 1483591. Las preparaciones líquidas de enzimas se pueden estabilizar, por ejemplo, al adicionar un poliol tal como propilen glicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico de acuerdo con los métodos establecidos. Las enzimas protegidas se pueden preparar de acuerdo con el método descrito en la patente europea No. 238,216. iJ-A-tt-Li-á-J ^*'*-»-nir_.? La composición de detergente de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una barra, una tableta, un polvo, un granulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, típicamente que contiene hasta 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso. La composición de detergente comprende uno o más surfactantes, los cuales pueden ser no iónicos inclusive semi-polares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o anfotéricos. Los surfactantes están presentes típicamente en un nivel de 0.1% a 60% en peso. Cuando se incluye en el mismo, usualmente el detergente contendrá de aproximadamente 1% a aproximadamente 40% de un surfactante aniónico tal como alquilbencensulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, sulfonato de alquilo (sulfato de alcohol graso) , etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, éster metílico de ácido graso alfa-sulfo, ácido alquil- o alquenilsuccínico o jabón. Cuando se incluye en el mismo, el detergente usualmente contendrá de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 40% de un surfactante no iónico tal como etoxilato de alcohol, etoxilato nonilfenólico, alquilpoliglicosido, alquildimetilaminoóxido, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, amida de ácido graso de polihidroxi-alquilo, o derivados N-acilo N-alquilo de glucosamina ("glucamidas") . _____^!_b ifSfciii.

El detergente puede contener 0-65% de un adyuvante o producto de adición de detergente o agente formador de complejos tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilendiaminatetraacético, ácido dietilentriaminopentaacético, ácido alquil- o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos en capas (por ejemplo SKS-6 de Hoechst) . El detergente puede comprender uno o más polímeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa, poli (vinilpirrolidona) , poli (etilen glicol), poli (alcohol vinílico), poli (vinilpiridin-N-óxido) , poli (vinilimidazol) , policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico. El detergente puede contener un sistema de blanqueo el cual puede comprender una fuente de H202 tal como perborato o percarbonato que se puede combinar con un activador de blanqueador que forma perácido tal como tetraacetiletilendiamina o nonanoiloxibencensulfonato. Alternativamente, el sistema de blanqueo puede comprender peroxiácidos de, por ejemplo, el tipo amida, imida, o sulfona . La(s) enzima (s) de la composición de detergente de la invención pueden ser estabilizadas utilizando agentes de > ktc >M**?, estabilización convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilen glicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenil borónico tal como ácido 4-formilfenil borónico, y la composición puede ser formulada como se describe en por ejemplo la patente WO 92/19709 y la patente WO 92/19708. El detergente también puede contener otros ingredientes de detergente convencionales tales como por ejemplo acondicionadores de telas que incluyen arcillas, fomentadores de espuma, supresores de jabonaduras, agentes anti-corrosión, agentes de suspensión de suciedad, agentes de redeposición anti-suciedad, tintes, bactericidas, abrillantadores ópticos, hidrotropos, inhibidores del descoloramiento o perfumes. Ahora se contempla que en las composiciones de detergente se puede adicionar cualquier enzima, en particular la enzima de la invención, en una cantidad correspondiente a 0.01-100 mg de proteína de enzimas por litro de licor de lavado, preferiblemente 0.05-5 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado, en particular 0.1-1 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado. " ' ' - r,.i i ? ?.? iii rtiiiii ii -í. Éiilttii.

La enzima de la invención se puede incorporar adicionalmente en las formulaciones de detergente descritas en la patente 97/07202 la cual se incorpora como referencia.

APLICACIONES EN LA INDUSTRIA DE LA PIEL Una subtilasa de la invención se puede utilizar en la industria de la piel, en particular para el uso en la depilación de las pieles. En la aplicación, una variante de subtilasa de la invención se utiliza preferentemente en una composición de enzimas la cual además comprende otra proteasa. Para una descripción más detallada de otras proteasas adecuadas ver la sección con relación a las enzimas adecuadas para el uso en una composición de detergente ( vide supra ) .

APLICACIONES EN LA INDUSTRIA DE LA LANA Una subtilasa de la invención se puede utilizar en la industria de la lana, en particular para el uso en la limpieza de telas que comprenden lana. En la aplicación, una variante de subtilasa de la invención se utiliza preferiblemente en una composición de enzimas la cual comprende adicionalmente otra proteasa. Para una descripción más detallada de otras proteasas adecuadas ver la sección con relación a las enzimas ^»a^.ti?..l..3¿i»-.-. adecuadas para el uso en una composición de detergente ( vide supra ) . La invención se describe en detalle adicional en los siguientes ejemplos los cuales no pretenden de ninguna manera limitar el alcance de la invención como se reclama.

MATERIALES Y MÉTODOS CEPAS: B. subtilis DN1885 (Diderichsen y colaboradores, 1990) . B . lentus 309 y 147 son cepas específicas de Bacillus lentus, depositadas con el NCIB y de acuerdo con los números de acceso NCIB 10309 y 10147, y descritas en la patente norteamericana No. 3,723,250 incorporada por referencia en la presente. E. coli MC 1000 (M.J. Casadaban y S.N. Cohén (1980); J. Mol . Biol . 138 179-207), fue hecho r", m+ por métodos convencionales y también se describe en la solicitud de patente norteamericana No. de serie 039,298.

PLÁSMIDOS: pJS3 : vector transportador de E. coli - B. subtilis que contiene un gen sintético que codifica la subtilasa 309. iásá¡á.áá>íAli¡? •* *•' ^m- (Descrito por Jacob Schi0dt y colaboradores en Protein and Peptide letters 3:39-44 (1996)). pSX222: vector de expresión de B . subtilis (descrito en la patente WO 96/34946) .

MÉTODOS GENERALES DE BIOLOGÍA MOLECULAR: A menos que se mencione de otra manera, las manipulaciones y las transformaciones del ADN se realizan utilizando métodos normales de la biología molecular (Sambrook y colaboradores (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M y colaboradores (eds.) "Current potocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. , y Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990) . Las enzimas para las manipulaciones de ADN se utilizan de acuerdo con las especificaciones de los proveedores .

ENZIMAS PARA LAS MANIPULACIONES DE ADN A menos que se mencione de otra manera, todas las enzimas para las manipulaciones de ADN, tales como por ejemplo, endonucleasas de restricción, ligasas etcétera, se obtienen de New England Biolabs, Inc.

ACTIVIDAD PROTEOLITICA En el contexto de esta invención, la actividad proteolítica es expresada en Unidades de Proteasa kilo NOVO (KNPU) . La actividad se determina relativamente para una enzima estándar (SAVINASE®) , y la determinación se basa en la digestión de una solución de caseína de dimetilo (DMC) por la enzima proteolítica en condiciones normales, es decir, 50 °C, pH 8.3, tiempo de reacción 9 minutos, tiempo de medición 3 minutos. Está disponible una carpeta AF 220/1 a petición de Novo Nordisk A/S, Dinamarca, la carpeta se incluye por este acto para referencia. Una GU es una unidad de glicina, definida como la actividad de enzima proteolítica que, bajo condiciones normales, durante una incubación de 15 minutos a 40 °C, con N-acetil caseína como el substrato, produce una cantidad de equivalente del grupo NH2 a 1 mmol de glicina. La actividad de proteasa también se puede medir utilizando el ensayo PNA con succinil-alanina-alanina-prolina-fenilalanina-paranitroanilida como un substrato. El principio del ensayo PNA se describe en Rothgeb, T.M., Goodlander, B.D., Garrison, P.H., y Smith, L.A., Journal of the American Oil Chemists' Society, Vol. 65 (5) páginas 806-810 (1988). taai», FERMENTACIÓN: Las fermentaciones para la producción de enzimas del sub-grupo subtilasa se realizan a 30°C en una mesa de agitación giratoria (300 r.p.m.) en matraces Erlenmeyer con deflector de 500 ml que contienen 100 mg del medio BPX durante 5 días. Consecuentemente, a fin de hacer un caldo de, por ejemplo, 2 litros se fermentaron simultáneamente 20 matraces Erlen eyer .

MEDIOS: Composición del medio BPX (por litro) Almidón de papa 100 g Cebada molida 50 g Harina de soya 20 g Na2HP04 x 12 H20 9 g PluronicMR 0.1 g Caseinato sódico 10 g El almidón en el medio es licuado con a-amilasa y el medio es esterificado mediante el calentamiento a 120°C durante 45 minutos. Después de la esterilización, el pH del medio se ajusta a 9 por la adición de NaHC03 a 0.1 M.

EJEMPLO 1 CONSTRUCCIÓN Y EXPRESIÓN DE VARIANTES DE ENZIMAS: MUTAGÉNESIS DIRIGIDA AL SITIO: Las variantes dirigidas al sitio de subtilasa 309 de la invención que comprenden inserciones específicas en el bucle del sitio activo (b) entre las posiciones 97 y 98 son hechas mediante la clonación tradicional de los fragmentos de ADN (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor, 1989) producidos mediante la PCR de oligos que contienen las inserciones deseadas (ver posteriormente) . El ADN del plásmido matriz o molde es pJS3, o un análogo de este que contiene una variante de Subtilasa 309. Las inserciones se introducen por la mutagénesis dirigida al oligo para la construcción de las variantes de inserción G97GX (X = cualquier residuo de un aminoácido insertado entre las posiciones 97 y 98) dando por resultado las variantes de Subtilasa 309 G97GX. Las variantes de subtilasa 309 son transformadas en E. coli . El ADN purificado de un cultivo durante la noche de estos transformantes se transformó en B . subtilis por la restricción de la digestión de endanucleasa, la purificación de fragmentos de ADN, ligación, transformación de B . subtilis . La transformación de B. subtilis se realiza como se -:lJyltjl^__* -^^J-*-« - describe por Dubnau y colaboradores, 1971, J. Mol. Biol. 56, páginas 209-221.

MUTAGÉNESIS ALEATORIA LOCALIZADA A FIN DE INSERTAR LAS INSERCIONES ALEATORIAS EN UNA REGIÓN LOCALIZADA: MUTAGÉNESIS ALEATORIA LOCALIZADA A FIN DE INSERTAR LAS INSERCIONES ALEATORIAS EN UNA REGIÓN LOCALIZADA: La estrategia total utilizada para realizar la mutagénesis aleatoria localizada es: Un cebador mutagénico (oligonucleótido) es sintetizado correspondiente a la secuencia de ADN que flanquea los sitios de inserción, separados por los pares de bases de ADN que definen la inserción. Subsecuentemente, el cebador mutagénico resultante se utiliza en una reacción PCR con un cebador opuesto, adecuado. El fragmento de PCR resultante se purificó y se digirió por las endonucleasas y se clonó en el vector transportador de E. coli - B . subtilis (ver posteriormente) . Alternativamente, y si es necesario, el fragmento de PCR resultante se utiliza en una segunda reacción de PCR como un cebador con un segundo cebador opuesto, adecuado para permitir la digestión y la clonación de la región mutagenizada dentro del vector transportador. Las reacciones de PCR se realizaron bajo condiciones normales. '^r- Siguiendo esta estrategia, una librearía o banco aleatoria localizada se construyó en SAVINASE en donde las inserciones se introdujeron en la región de bucle del sitio activo entre las posiciones 97 y 98. 5 Las mutaciones se introdujeron por los cebadores mutagénicos (ver posteriormente) , de modo que todos los 20 aminoácidos son representados (N = 25% de A, T, C y G; mientras que S = 50% de C y G. El fragmento de PCR producido se extendido hacia la terminación N de Savinase por otra 10 rutina de PCR mediante la combinación de una secuencia de sobreposición con un fragmento de PCR producido por la amplificación de PCR con los cebadores; 5' CTA AAT ATT CGT GGT GGC GC 3' ( sentido) y 5' GAC TTT AAC AGC GTA TAG CTC AGC 3' ( antisentido) . Los fragmentos de ADN extendidos se 15 clonaron en los sitios Hind III- y Mlu I- del plásmido modificado pJS3 (ver anteriormente) , y diez colonias de E. coli aleatoriamente seleccionadas se ordenaron en secuencia para confirmar las mutaciones designadas. El cebador mutagénico (5' GCT GAG CTA TAC GCT GTT 0 AAA GTC CTA GGG NNS GCG AGC GGT TCA GGT TC 3' ( sentido) ) se utilizó en una reacción PCR con un cebador opuesto anti sen tido adecuado, situado corriente abajo del sitio Mlu I en pJS3 (por ejemplo 5'- CCC TTT AAC CGC ACA GCG TTT -3' ( anti sentido) ) y el plásmido pJS3 como matriz. Este producto de la ??¿.Ád*.l*Ítá?:iÁA. A*¿Mt¿*. .* - PCR resultante se clonó en el vector transportador pJS3 al utilizar las enzimas de restricción Hind III y Mlu I. La librería aleatoria se transformó en E. coli mediante técnicas bien conocidas. La librería preparada contuvo aproximadamente 100,000 clones individuales/librería. Diez colonias aleatoriamente seleccionadas se ordenaron en secuencias para confirmar las mutaciones designadas . A fin de purificar una variante de subtilasa de la invención, el plásmido de expresión pJS3 de B . subtilis que comprende una variante de la invención se transformó en una cepa de B. subtilis competente y se fermentó como se describe anteriormente en un medio que contiene 10 µg/ml de cloramfenicol (CAM) .

EJEMPLO 2 PURIFICACIÓN DE VARIANTES DE ENZIMA: Este procedimiento se refiere a la purificación de una fermentación de escala de 2 litros para la producción de las subtilasas de la invención en una célula hospedante de Bacillus . Aproximadamente 1.6 litros del caldo de fermentación se centrifugaron a 5000 rpm durante 35 minutos en matraces de 1 litro. Los sobrenadantes se ajustaron a pH ¡ íi& _&_lt_, 6.5 utilizando ácido acético 10% y se filtraron en placas de filtro Seitz Supra SlOO. Los productos filtrados se concentraron a aproximadamente 400 ml utilizando una unidad Amicon CH2A UF equipada con un cartucho A icon S1Y10 UF. El concentrado UF se centrífugo y se filtró antes de la absorción a temperatura ambiente en una columna de afinidad Bacitracin a pH 7. La proteasa se eluyó de la columna Bacitracin a temperatura ambiente utilizando 2-propanol 25% y cloruro de sodio 1 M en una solución amortiguadora con ácido dimetilglutárico 0.01, ácido bórico 0.1 M y cloruro de calcio 0.002 M ajustado a pH 7. Las fracciones con actividad de proteasa del paso de purificación en Bacitracin se combinaron y se aplicaron a una columna Sephadex G25 de 750 ml (5 cm dia.) equilibrada con un amortiguador que contiene ácido dimetilglutárico 0.01, ácido bórico 0.2 M y cloruro de calcio 0.002 m ajustado a pH 6.5. Las fracciones con actividad proteolítica de la columna Sephadex G25 se combinaron y se aplicaron a una columna de intercambio catiónico CM Sepharose CL 6B de 150 ml (5 cm dia.) equilibrada con un amortiguador que contiene ácido dimetilglutárico 0.01 M, ácido bórico 0.2 M y cloruro de calcio 0.002 M ajustado a pH 6.5.

La proteasa se eluyó utilizando un gradiente lineal de cloruro de sodio 0-0.1 M en 2 litros del mismo amortiguador (cloruro de sodio 0-0.2 M en caso de la Subtilisina 147) . En un paso de purificación final, la proteasa que contiene fracciones de la columna CM Sepharose se combinan y se concentran en una celda o célula de ultrafiltración Amicon equipada con una membrana GR81PP (de the Danish Sugar Factories Inc. ) . Al utilizar las técnicas del Ejemplo 1 para la construcción y la fermentación, y el procedimiento de aislamiento anterior, se produjeron y se aislaron las siguientes variantes de subtilisina 309. G97GT G97GS G97GD G97GE G97GP G97GG G97GH G97GI G97GA G97GT+Y167A G97GP+A98T iJy &i Se encontró que estas variantes exhiben mejor rendimiento de lavado que Savmase en un ensayo preliminar.

EJEMPLO 3 RENDIMIENTO DE LAVADO DE LAS COMPOSICIONES DE DETERGENTE QUE COMPRENDEN LAS VARIANTES DE ENZIMA Los siguientes ejemplos proporcionan los resultados de un gran número de pruebas de lavado que se condujeron bajo las condiciones indicadas.

MINI LAVADO CONDICIONES DE LAVADO: Europa US Dosis de detergente 4 g/1 1 g/1 Temperatura del Lavado 30°C 25°C Tiempo de Lavado 30 minutos 10 minutos Dureza del agua 18°dH (Ca2+/Mg2+ = 6°dH (Ca2+/Mg2+ = 5 : 1) 2 : 1) PH No ajustado No ajustado Enzima conc. 1, 2, 5, 10, 30 nM 1, 2, 5, 10, 30 nM Sistema de prueba matraces de vidrio matraces de vidrio de 150 ml con una de 150 ml con una barra de agitación barra de agitación DETERGENTES: Los detergentes utilizados se obtuvieron de los supermercados en Dinamarca (OMO, datasheet ED-9745105) y EUA (Wisk, datasheet ED-9711893), respectivamente. Antes del uso, toda la actividad enzimática en los detergentes es inactivada mediante el tratamiento con microondas.

MUESTRAS DE GÉNERO; Las muestras de género utilizadas son EMPA116 y EMPA117, obtenidas de EMPA Testmaterialen, Movenstrasse 12, CH-9015 St. Gall, Suiza.

REFLECTANCIA La medición de la reflectancia (R) en el material de prueba se hace a 460 nm utilizando un fotómetro Macbeth ColorEye 7000. Las mediciones se hacen de acuerdo con el protocolo de los fabricantes.

JJmA. m?ihMi?.M , ..- ..-í-t-, ....- .y ^.. .... .........y.. :i..;.-.-r--"¡ .aMÍ-¿»a...»-....:... »-:. ,y,i-..-.. -. ?ll¿, ..ii.

EVALUACIÓN La evaluación del rendimiento de lavado de una subtilasa se determina por ya sea el factor de mejoramiento o el factor de rendimiento para la subtilasa investigada. El factor de mejoramiento, FMDosls/respuesta^ se define como la relación entre las pendientes de las curvas de rendimiento de lavado para un detergente que contiene la subtilasa investigada y el mismo detergente que contiene una subtilasa de referencia en la concentración asintótica de la subtilasa que va a cero.

El rendimiento de lavado se calcula de acuerdo con la fórmula I: a'?Rmax'c R = Ro + ( I ) ; ?Rmax+a-c donde R es el rendimiento de lavado en unidades de reflectancia; Ro es la intersección de la curva ajustada con el eje y (ciego) ; a es la pendiente de la curva ajustada como c -» 0; c es la concentración de enzimas; y ?Rmax es el efecto de lavado máximo, teoric ^^o c -> 8 .

El factor de rendimiento, P, se calcula de acuerdo con la fórmula II RVariante RModelo P = (II) Rsavinasa ^Modelo donde ^variante es ^a reflectancia del material de prueba lavado con la variante 10 nM; Rsavinase es Ia reflectancia del material de prueba lavado con Savinase 10 nM; Rmodelo es ^a reflectancia del material de prueba lavado sin enzima.

US (detergente: OMO, Muestra de género: EMPA116) US (detergente: US Wisk, Muestra de género: EMPA117) * Descrito en la patente WO 99/27082 ¡_¿_i, ¿-i_i De esta manera, se observa que las subtilasas de las invenciones exhiben un rendimiento de lavado mejorado en comparación con Savinase .

LISTADO DE SECUENCIAS <.110> Novo Nordj.sk A/S <120> Enzimas subtilasas de los sub-grupos I-SI e I-S2 que tienen al menos un residuo de un aminoácido adicional entre las posiciones 97 y 98 <130> 5926.204 <140> <141> <160> 2 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 275 <212> PRT <213> Bacillue lichepiformis <400> 1 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Qly He Pro Leu He Lys Ala Asp Lys Val 1 S 10 15 Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lyß Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly He Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly 50 55 €0 Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val 65 70 75 80 Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn 85 90 95 Xaa Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Ser Gly He val Ser Gly He Glu 100 105 lio Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Aßp Val He Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala 130 135 140 Arg sly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Aan Ser Gly Ser Ser Gly 145 150 155 160 Asn Thr Asn Thr He Gly Tyr Pro Ala Lyß Tyr Asp Ser Val He Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro sly Ala Gly Val Tyr Ser Thr .u.U-i,.-! Mk?Á?u??.... 195 200 205 Tyr Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu He Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Aen Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr 245 250 255 Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu lie Aen Val Glu Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275 <210> 2 c211> 270 <212> PRT «213> Bacillus lentuß <400> 2 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly He Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser sly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly He Ser Thr His Pro Aßp Leu Asn He Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr He Ala Ala Leu Asn Asn Ser He Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Qlu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Xaa 85 90 95 ?la Ser Qly Ser Gly Ser Val Ser Ser He Ala Gln Gly Leu Glu Trp 100 105 110 Ala Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Aen Leu Ser Leu Gly Ser Pro 115 120 125 Ser Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Aen Ser Ala Thr Ser Arg 130 135 140 Gly Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser He 145 150 155 160 Ser Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp 165 170 175 Gln Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp 180 185 190 ' Í »t,?:é-zÁ*kÍ¡mi.,t?.&Üéd He Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr 195 200 205 Tyr Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly 210 215 220 Ala Ala Ala Leu Val Lyß Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln 225 230 235 240 He Arg Asn His Leu Lyß Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn 245 250 255 Leu Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 270 y|*fe ^ *...i&^ i??Mi m Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (35)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una enzima subtilasa del sub-grupo I-SI o I- S2, caracterizada porque tiene al menos un residuo de un aminoácido adicional en la posición 97 de la región de bucle del sitio activo (b) de la posición 95 a 103, por lo que el (los) residuo (s) de aminoácido adicional (es) corresponden a la inserción de al menos un residuo de un aminoácido entre las posiciones 97 y 98, con la condición que la enzima subtilasa no contenga las siguientes inserciones G97GASG, G97GAA, G97GAS, G97GAS+A98S+S99G, G97GGG+A98S+S99G, G97GAA+A98S+S99G, G97GASG+A98S+S99G+G100A+S101A o G97GAA+A98S+S99G+S101T.
2. 2. La enzima subtilasa aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la enzima subtilasa es una variante construida que tiene al menos un residuo de un aminoácido insertado entre las posiciones 97 y 98 de una subtilasa precursora.
3. 3. La enzima subtilasa aislada de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de X97X{A,T,G,S} X97X{D,E,K,R} X97X{H,V,C,N,Q}, y X97{F,I,L,M,P,W,Y}
4. 4. La enzima subtilasa aislada de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque al menos un residuo de un aminoácido adicional o insertado se selecciona del grupo que consiste de T, G, A y S.
5. 5. La enzima subtilasa aislada de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque al menos un residuo de un aminoácido adicional o insertado se selecciona del grupo de residuos de un aminoácido cargados que consiste de D,E,H,K y R, más preferiblemente D; E, K y R.
6. 6. La enzima subtilasa aislada de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque al menos un residuo de un aminoácido adicional o insertado se selecciona del grupo de residuos de un aminoácido hidrofílicos que consiste de C, N, Q, S y T, más preferiblemente N, Q, S y T.
7. 7. La enzima subtilasa aislada de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque al menos un residuo de un aminoácido adicional o insertado se selecciona del grupo de residuos de un aminoácido hidrofóbicos, pequeños que consiste de A, G y V.
8. 8. La enzima subtilasa aislada de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque al menos un residuo de un aminoácido adicional o insertado se selecciona del grupo de residuos de un aminoácido hidrofóbicos, grandes que -*#5ßE de F, I, L, M, P, W y Y, más preferiblemente F, I, L, M, y Y.
9. 9. La enzima subtilasa aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada 5 porque al menos un residuo de un aminoácido adicional o insertado, comprende más de un residuo de un aminoácido adicional o insertado en el bucle del sitio activo (b) . 10. La enzima subtilasa aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque
10. 10 comprende un residuo de un aminoácido adicional o insertado en el bucle del sitio activo (b) .
11. 11. La variante de subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la(s) inserción (es) entre las posiciones 97 y 98 se 5 combinan con una o más modificaciones adicionales en cualquier otra posición.
12. 12. La variante de subtilasa de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la(s) modificación (es) adicional (es) es (son) en una o más de las 0 posiciones 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.
13. 13. La variante de subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la(s) modificación (es) es/son combinadas con la(s) -'•J-J-^-l*'»--tri, farfltofa_M_A-h.- MAj»MÍ* m*n— '-^»*^?.ÉIÍlf.<»?¡ii«Aa__^^ modificación (es) en una o más de las posiciones 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 y 103.
14. 14. La subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la subtilasa, o si la subtilasa es una variante, la subtilasa madre pertenece al sub-grupo I-SI.
15. 15. La subtilasa de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la subtilasa madre se selecciona del grupo que consiste de ABSS168, BASBPN, BSSDY, y BLSCAR, o variantes funcionales de las mismas que tienen retenida la característica del sub-grupo I-SI.
16. 16. La subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizada porque la subtilasa, o si la subtilasa es una variante, la subtilasa madre pertenece al sub-grupo I-S2.
17. 17. La subtilasa de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la subtilasa madre se selecciona del grupo que consiste de BLS147, BLS309, BAPB92, TVTHER y BYSYAB, o variantes funcionales de las mismas que tienen retenida la característica del sub-grupo I-S2.
18. 18. La enzima subtilasa aislada de conformidad con la reivindicación 3, 16 o 17, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de G97GA G97GT G97GG G97GS G97GD G97GE G97GK G97GR G97GH G97GV G97GC G97GN G97GQ G97GF G97GI G97GL G97GM G97GP G97GW, y G97GY.
19. 19. La variante de subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizada porque la(s) modificación (es) adicional (es) se seleccionan del grupo que consiste de K27R, *36D, S57P, N76D, S87N, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, Y167X, R170X, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L y T274A.
20. 20. La variante de subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizada porque la(s) modificación (es) adicional (es) se seleccionan del grupo que consiste de S101G+V104N, S87N+S101G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A, N76D+S103A+V104I o N76D+V104A u otras combinaciones de estas mutaciones (V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A) , en combinación con cualquiera de una o más de las sustituciones, supresiones y/o inserciones mencionadas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
21. 21. La variante de subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizada porque la(s) modificación (es) adicional (es) se seleccionan del grupo que consiste además de P129K, P131H, A133P, A133D Y A194P.
22. 22. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende la modificación seleccionada del grupo que consiste de G97GT+Y167A, G97GP+A98T y G97GA.
23. 23. Una subtilasa que pertenece al sub-grupo I-SI, caracterizada porque tiene la secuencia de aminoácidos: 1 10 20 30 A-Q-T-V-P-Y-G-I-P-L-I-K-A-D-K-V-Q-A-Q-G-F-K-G-A-N-V-K-V-A-V 40 50 60 L-D-T-G-I-Q-A-S-H-P-D-L-N-V-V-G-G-A-S-F-V-A-G-E-A-*-T-N-T-D 70 80 90 G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-V-A-A-L-D-N-T-T-G-V-L-G-V-A-P-S-V-S-L 97a 100 110 120 Y-A-V-K-V-L-N-X-S-S-G-S-G-T-Y-S-G-I-V-S-G-I-E-W-A-T-T-N-G-M-D 130 140 150 V-I-N-M-S-L-G-G-P-S-G-S-T-A-M-K-Q-A-V-D-N-A-Y-A-R-G-V-V-V-V 160 170 180 A-A-A-G-N-S-G-S-S-G-N-T-N-T-I-G-Y-P-A-K-Y-D-S-V-I-A-V-G-A-V 190 200 210 D-S-N-S-N-R-A-S-F-S-S-V-G-A-E-L-E-V-M-A-P-G-A-G-V-Y-S-T-Y-P 220 230 240 T-S-T-Y-A-T-L-N-G-T-S-M-A-S-P-H-V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-N 250 260 270 L-S-A-S-Q-V-R-N-R-L-S-S-T-A-T-Y-L-G-S-S-F-Y-Y-G-K-G-L-I-N-V 275 E-A-A-A-Q o una subtilasa homologa que tiene un secuencia de aminoácidos que comprende un residuo de un aminoácido en la posición 97a y que exhibe una identidad de más de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% con la misma.
24. 24. Una subtilasa que pertenece al sub-grupo I-S2, caracterizada porque tiene la secuencia de aminoácidos: j_y_ .ft¡-?. -Jíll- ll-HJ** ' * * -**----t-ükte.a.. y,..¿^:- -^-....-¡.y.. - . ?Í , m. MmmMmM* í .,.J.-aJ-iJ- .>. -. - y-.--t— ... í. ....-a.,...-»., .» i íií ?.j 1 10 20 30 A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V- 40 50 60 L-D-T-G-I-*-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-*-S-T-Q-D- 70 80 90 G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-E-L- 97a 100 110 120 Y-A-V-K-V-L-G—X-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H- 130 140 150 V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V- 160 170 180 A-A-S-G-N-S-G-A-*-G-S-I-S-*-*-*-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T- 190 200 210 D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P- 220 230 240 G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S- 250 260 270 W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A- 275 E-A-A-T-R o una subtilasa homologa que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende un residuo de un aminoácido en la posición 97a y que exhibe una identidad de más de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% con la misma.
25. 25. La variante de subtilasa de conformidad con las reivindicaciones 23 o 24, caracterizada porque X en la posición 97a se selecciona del grupo que consiste de T, A, G, S y P. 5
26. 26. Una secuencia de ADN aislada caracterizada porque codifica una subtilasa o una variante de subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.
27. 27. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende una secuencia de ADN aislada de conformidad con la 0 reivindicación 26.
28. 28. Una célula hospedante microbiana, caracterizada porque es transformada con un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 27.
29. 29. El hospedante microbiano de conformidad con la 5 reivindicación 28, caracterizado porque es una bacteria, preferiblemente un Bacillus, especialmente B . lentus .
30. 30. El hospedante microbiano de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque es un hongo o levadura, preferiblemente un hongo filamentoso, especialmente 0 un Aspergillus.
31. 31. Un método para producir una subtilasa o una variante de subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque un hospedante de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 es cultivado bajo condiciones conducentes a la expresión y secreción de la variante, y la variante es recuperada.
32. 32. Una composición, caracterizada porque comprende una subtilasa o una variante de subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.
33. 33. La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque comprende adicionalmente una celulosa, lipasa, cutinasa, oxidoreductasa, otra proteasa o una amilasa.
34. 34. La composición de conformidad con la reivindicación 32 o 33, caracterizada porque es una composición de detergente.
35. 35. El uso de una subtilasa o una variante de subtilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 o una composición de enzimas de conformidad con las reivindicaciones 32 o 33 en un detergente para lavandería y/o lavaplatos. ».iA4-J .AM .