JP5563180B2 - ９７位と９８位との間に少なくとも１個の追加のアミノ酸残基を有するｉ−ｓ１及びｉ−ｓ２サブグループのズブチラーゼ酵素 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は９５〜１０３位の活性部位ループ（ｂ）領域の９７位において少なくとも１個の追加のアミノ酸残基を有するＩ−Ｓ１及びＩ−Ｓ２サブグループの新規のズブチラーゼ酵素に関連する。これらのプロテアーゼは洗剤、クリーニング及び洗浄組成物において使用したときに優れた又は向上した洗浄性能を発揮させるのに有用である。本発明は更に適当な宿主細胞もしくは生物に挿入されたときに当該酵素の発現をコードする遺伝子、並びにそれにより形質転換されて当該酵素変異体を発現できる宿主細胞、及びかかる新規酵素を生産するための方法に関連する。

発明の背景
洗剤産業において、ここ３０年以上酵素が洗浄製剤に利用されてきた。かかる製剤に利用されている酵素にはプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、その他の酵素、又はそれらの混合物が含まれる。商業的に最も重要なのはプロテアーゼである。

商業的利用が高まっているプロテアーゼは天然野生型プロテアーゼのタンパク質工学変異体、例えばＤＵＲＡＺＹＭ（登録商標）（Novo Nordisk A/S）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）（Novo Nordisk A/S）、ＭＡＸＡＰＥＭ（登録商標）（Gist-Brocades, N.V. ）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）（Genecor International, Inc）である。

更なるプロテアーゼ変異体が当業界において、例えばＥＰ １３０７５６（GENENTECH ）（ＵＳ再発行特許第３４，６０６号（GENENCOR））；ＥＰ ２１４４３５（HENKEL）；ＷＯ ８７／０４４６１（AMGEN ）；ＷＯ ８７／０５０５０（GENEX ）；ＥＰ ２６０１０５（GENENCOR）；Thomas, Russell, and Fersht (1985) Nature 318 375-376; Thomas, Russell, and Fersht (1987) J.Mol.Biol. 193 803-813; Russel and Fersht Nature 328 496-500 (1987); ＷＯ ８８／０８０２８（Genex ）；ＷＯ ８８／０８０３３（Amgen ）；ＷＯ ９５／２７０４９（SOLVAY S.A. ）；ＷＯ ９５／３００１１（PROCTER & GAMBLE COMPANY）；ＷＯ ９５／３００１０（PROCTER & GAMBLE COMPANY）；ＷＯ ９５／２９９７９（PROCTER & GAMBLE COMPANY）；ＵＳ ５，５４３，３０２（SOLVAY S.A. ）；ＥＰ ２５１ ４４６（GENENCOR）；ＷＯ ８９／０６２７９（NOVO NORDISK A/S）；ＷＯ ９１／００３４５（NOVO NORDISK A/S）；ＥＰ ５２５ ６１０ Ａ１（SOLVAY）；及びＷＯ ９４／０２６１８（GIST-BROCADES N.V.）に記載されている。

数多くの有用なプロテアーゼ変異体が発表されているにもかかわらず、様々な産業的用途のために新しい改良プロテアーゼ又はプロテアーゼ変異体のニーズが残っている。

従って、本発明の課題は特に洗剤産業において利用するための改良プロテアーゼ又はタンパク質工学プロテアーゼ変異体の提供にある。

発明の概要
本発明者は活性部位ループの少なくとも一つが現状公知のものより長いズブチリシンが洗浄組成物において向上した洗浄性能特性を発揮することを見い出した。その同定は、親野生型酵素と比べて洗浄組成物において向上した洗浄性能特性を発揮するズブチリシン変異体、特にズブチリシン３０９の変異体（ＢＬＳＡＶＩ又はＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標））の構築において行った。これは我々の先の出願ＤＫ １３３２／９７（ＷＯ ９９／２７０８２として公開）に記載されている。

９５〜１０３位の活性部位ループ（ｂ）領域の９７位（又はむしろ９７と９８位との間）において少なくとも１個の追加アミノ酸残基を有するＩ−Ｓ１（真の「ズブチリシン」）及びＩ−Ｓ２（高アルカリ性ズブチリシン）の所定のズブチラーゼ又はその変異体が、現状公知の且つ前記出願において記載されているものと比較して驚くべきなどに向上した洗浄性能を発揮することが見い出された。ＷＯ ９９／２７０８２に記載の９７位挿入変異体にはＧ９７ＧＡＳＧ，Ｇ９７ＧＡＡ，Ｇ９７ＧＡＳ，Ｇ９７ＧＡＳ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ，Ｇ９７ＧＧＧ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ，Ｇ９７ＧＡＡ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ，Ｇ９７ＧＡＳＧ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ＋Ｇ１００Ａ＋Ｓ１０１Ａ及びＧ９７ＧＡＡ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ＋Ｓ１０１Ｔが挙げられる。このような変異体は本発明の範囲には属しない。

本発明に係る改良プロテアーゼは天然資源からの単離により、又は野生型ズブチラーゼの９７位と９８位との間の活性部位ループ（ｂ）における少なくとも１個の更なるアミノ酸残基の導入（挿入）により得られうる（活性部位ループ及び位置番号の定義については以下参照のこと）。

この発見はズブチリシン３０９で行われたものであるが、類似の好都合なズブチラーゼ又はズブチラーゼ変異体の生産又は単離が可能であろうと推定される。

更に、公知の野生型ズブチラーゼ、例えばズブチリシン３０９における対応の活性部位ループよりも長い活性部位ループ（ｂ）を含んで成る新規の野生型ズブチラーゼを同定するために天然資源を特異的にスクリーニングすることが可能である。そのようなズブチラーゼは９７位と９８位との間に挿入アミノ酸残基を有し、且つその最も近縁な公知のズブチリシン、例えばズブチリシン３０９と比較して、洗剤において優れた洗浄性能を発揮するものと考えられうる。

アライメント及び番号付けについては、ズブチリシンＢＰＮ’（ａ）（ＢＡＳＢＰＮ）とズブチリシン３０９（ＢＬＳＡＶＩ）（ｂ）とのアライメント、及びズブチリシンＢＰＮ’（ａ）（ＢＡＳＢＰＮ）とズブチリシン・カールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）（ｇ）とのアライメントを示している図１，１ａ，２及び２ａを参照されたい。これらのアライメントは残基の番号付けのための参考として本願において利用する。

ここでは７本の活性部位ループ（ａ）〜（ｇ）（表示の両末端アミノ酸残基を含む）は下記のセグメント内のアミノ酸残基を包含するものと定義する：
（ａ）アミノ酸残基３３と４３との間の領域；
（ｂ）アミノ酸残基９５と１０３との間の領域；
（ｃ）アミノ酸残基１２５と１３２との間の領域；
（ｄ）アミノ酸残基１５３と１７３との間の領域；
（ｅ）アミノ酸残基１８１と１９５との間の領域；
（ｆ）アミノ酸残基２０２と２０４との間の領域；
（ｇ）アミノ酸残基２１８と２１９との間の領域。

従って、第一の態様において、本発明は９５位〜１０３位の活性部位ループ（ｂ）領域の９７位において少なくとも１個の追加のアミノ酸残基を有するＩ−Ｓ１及びＩ−Ｓ２サブグループの単離された（即ち、純度１０％超の）ズブチラーゼ酵素に関連し、ここで当該追加のアミノ酸残基は９７位と９８位との間の少なくとも１個のアミノ酸残基の挿入に対応し、但し、当該ズブチラーゼ酵素は挿入Ｇ９７ＧＡＳＧ，Ｇ９７ＧＡＡ，Ｇ９７ＧＡＳ，Ｇ９７ＧＡＳ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ，Ｇ９７ＧＧＧ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ，Ｇ９７ＧＡＡ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ，Ｇ９７ＧＡＳＧ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ＋Ｇ１００Ａ＋Ｓ１０１Ａ及びＧ９７ＧＡＡ＋Ａ９８Ｓ＋Ｓ９９Ｇ＋Ｓ１０１Ｔを含まないことを条件とする。

第二の態様において、本発明は本発明のズブチラーゼ変異体をコードする単離されたＤＮＡ配列に関連する。

第三の態様において、本発明は本発明のズブチラーゼ変異体をコードする単離されたＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターに関連する。

第四の態様において、本発明は第三の態様に従う発現ベクターで形質転換された微生物宿主細胞に関連する。

更なる態様において、本発明は本発明のズブチリシン酵素の生産に関連する。

本発明の酵素は一般に当該酵素が単離される微生物株を培養し、そして実質的に純粋な形態でこの酵素を回収するか、又は本発明の第三の態様に係る発現ベクターを適当な微生物宿主に導入し、この宿主を培養して所望のズブチラーゼ酵素を発現させ、そして酵素生成物を回収することにより生産されうる。

更に、本発明は本発明のズブチラーゼ又はズブチラーゼ変異体を含んで成る組成物に関連する。

なお更に、本発明は本発明の酵素の、様々な産業関連用途、特にクリーニング組成物及び酵素含有クリーニング組成物における利用、特に本発明のズブチリシン酵素を含んで成る洗浄組成物に関連する。

定義
本発明の更に詳細な説明に入る前に、下記の用語及び略語をまず定義する：

アミノ酸の命名
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン
Ｘ＝Ｘａａ＝任意のアミノ酸
核酸の命名
Ａ＝アデニン
Ｇ＝グアニン
Ｃ＝シトシン
Ｔ＝チミン（ＤＮＡのみ）
Ｕ＝ウラシル（ＲＮＡのみ）

変異体の命名法及び表示のための略語
本発明に従って生産される又は考慮される様々な酵素変異体の説明において、下記の命名及び略語を便宜のために採用した：

文言の骨組はまず単離された又は親の野生型酵素をズブチリシンＢＰＮ’（ＢＡＳＢＰＮ）とアライニングさせることによって規定する。

このアライメントはギャップ構築ペナルティー＝８及びギャップ伸長ペナルティー＝８のパラメーター、並びにそのデフォルト値に保たれたその他のパラメーターを用い変異体を番号付けするＧＣＧパッケージバージョン９．１のＧＡＰルーチンにより得られうる。

他の方法はズブチラーゼ間の既知のアライメント、例えばＷＯ ９１／００３４５に記載のアライメントの利用にある。たいていの場合、差はあまり重要でないであろう。

ズブチリシンＢＰＮ’（ＢＡＳＢＰＮ）、ズブチリシン３０９（ＢＬＳＡＶＩ）、ズブチリシン・カールスバーグ（ＢＬＳＣＡＲ）間でのかかるアライメントをそれぞれ図１，１ａ，２，２ａに示す。これにより、ＢＡＳＢＰＮとの関係で数多くの欠失及び挿入が特定されるであろう。図１おいて、ズブチリシン３０９はＢＡＳＢＰＮと比較して３６，５８，１５８，１６２，１６３及び１６４位において６つの欠失を有し、一方図１ａでは、ズブチリシン３０９はＢＡＳＢＰＮと比較して３６，５６，１５９，１６４，１６５及び１６６において同じ数の欠失を有する。図２では、ズブチリシン カールスバーグはＢＡＳＢＰＮと比較して５８位において１つの欠失を有し、一方図２ａではズブチリシン カールスバーグはＢＡＳＢＰＮと比較して５６位において１つの欠失を有する。これらの欠失は図１，１ａ，２，２ａにおいて星印（★）で示している。

野生型酵素において施した様々な修飾は下記の３つの要素を利用して一般表示する：
もとのアミノ酸 位置 置換アミノ酸
従って、記号Ｇ１９５Ｅは１９５位のグリシンのグルタミン酸による置換を意味する。
位置 置換アミノ酸
もとのアミノ酸残基が任意のアミノ酸であってよい場合、位置と置換アミノ酸だけを表示する短い記号を使用することがある。
かかる記号は相同ズブチラーゼの修飾との関連で特に使用する。

もとのアミノ酸 位置
この記号はある位置の特定のアミノ酸を置換するアミノ酸が重要でないときに使うことがある。

位置
もとのアミノ酸と置換アミノ酸の両者が任意のアミノ酸を含んで成ってよいとき、位置のみを表示する。例えば：１７０。
もとのアミノ酸の位置 ｛置換アミノ酸１、…、置換アミノ酸ｎ｝
もとのアミノ酸及び／又は置換アミノ酸が複数個の、しかしながら全てではないアミノ酸を含んで成りうるとき、選定のアミノ酸はかっこ｛ ｝の中で表示する。

特定の変異体については３又は１文字コードを使用し、コードＸａａ及びＸは任意のアミノ酸残基を表示する。

置換：
１９５位でのグリシンのグルタミン酸による置換は以下の通りに表示する：
Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ又はＧ１９５Ｅ
あるいは、１９５位でのグリシンの任意のアミノ酸残基による置換は以下の通りに表示する：
Ｇｌｙ１９５Ｘａａ又はＧ１９５Ｘ
あるいは、
Ｇｌｙ１９５又はＧ１９５

１７０位での任意のアミノ酸残基のセリンによる置換はかくして次のように表示する：
Ｘａａ１７０Ｓｅｒ又はＸ１７０Ｓ
あるいは
１７０Ｓｅｒ又は１７０Ｓ

かかる記号は相同ズブチラーゼ（前掲）の修飾との関連で特に表示する。

従って、１７０Ｓｅｒは例えばＢＡＳＢＰＮにおけるＬｙｓ１７０Ｓｅｒ修飾又はＢＬＳＡＶＩにおけるＡｒｇ１７０Ｓｅｒ修飾の双方を含むことを意味する。

もとのアミノ酸及び／又は置換アミノ酸が複数個の、しかしながら全てではないアミノ酸を含んで成りうるときの修飾に関し、１７０位でのアルギニンのグリシン、アラニン、セリン又はスレオニンによる置換は以下のように表示され、
Ａｒｇ１７０｛Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ｝又はＲ１７０｛Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｔ｝
変異体Ｒ１７０Ｇ，Ｒ１７０Ａ，Ｒ１７０Ｓ及びＲ１７０Ｔ
を表示する。

欠失：
１９５位でのグリシンの欠失は次のように表示する：
Ｇｌｙ１９５^★又はＧ１９５^★
対応して、複数個のアミノ酸残基の欠失、例えば１９５及び１９６位でのグリシン及びロイシンの欠失は以下のように表示する：
Ｇｌｙ１９５^★＋Ｌｅｕ１９６^★又はＧ１９５^★＋Ｌ１９６^★

挿入：
追加のアミノ酸残基の挿入、例えばＧ１９５の後のロイシンは次のように表示する：
Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ又はＧ１９５ＧＫ；あるいは
複数個のアミノ酸残基が挿入される場合、例えばＧ１９５の後のＬｙｓ，Ａｌａ及びＳｅｒは次のように表示する：
Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａＳｅｒ又はＧ１９５ＧＫＡＳ

このような場合、挿入アミノ酸残基はその前のアミノ酸残基の位置番号に小文字を付加することによって番号付けする。上記の例では、配列１９４〜１９６は次のようになる：

現存のアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基を挿入する場合、命名における縮重が生ずることが明らかである。例えば、上記の例ではグリシンの後にグリシンを挿入したら、それはＧ１９５ＧＧと表示される。同じ事実上の変更は

への変更について、Ａ１９４ＡＧとして表示されるのと同じである。

このような例は当業者に明らかであり、そして表示Ｇ１９５ＧＧ及びこの種の挿入の対応の表示にかかる均等な縮重表示を含むことを意味する。

時折り、修飾と挿入との両者を同時に行うことが所望される。この状況も本定義により包含される。かくして、Ｓ１３０ＴＰは１３０位のセリンがチロシンにより置き換えられ、そしてプロリンが１３０と１３１位の間に挿入されていることを示す。かかる変異体を記述する一段とめんどうな方法は次の通りである：
Ｓ１３０ＳＰ＋Ｓ１３０Ｔ

ギャップ埋め：
番号付けのために用いるズブチリシンＢＰＮ’配列との参照対比において酵素の中に欠失が存在しているとき、かかる位置における挿入は以下のように表示する：
^★３６Ａｓｐ又は^★３６Ｄ
３６位でのアスパラギン酸の挿入。

多重修飾
多数の修飾を含んで成る変異体はプラスで分割される。例えば：
Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ又はＲ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ
１７０及び１９５位のアルギニン及びグリシンのチロシン及びグルタミン酸それぞれによる置換を表わす。
あるいは、Ｔｙｒ１６７｛Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ｝＋Ａｒｇ１７０｛Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ｝は次の変異体を表示する。

この命名法は特定の一般的な特性を有するアミノ酸残基、例えば正電荷残基（Ｋ，Ｒ，Ｈ）、負電荷残基（Ｄ，Ｅ）の置換、交換、挿入もしはく欠失、又は保存性アミノ酸修飾、例えば小型アミノ酸の別の小型アミノ酸による置換を表わす修飾を狙いとする修飾との関係で特に表示する。更なる詳細については、「発明の詳細な説明」の章を参照されたい。

アミノ酸の位置の番号／残基
何らことわりのない場合、ここで用いるアミノ酸の番号付けはズブチラーゼＢＰＮ’（ＢＡＳＢＰＮ）配列のそれに対応する。ＢＰＮ’配列の更なる説明については図１及び２、又はSiezenら、Protein Engng. 4 (1991) 719-737 を参照のこと。

プロテアーゼ
タンパク質基質内のアミド結合を切断する酵素はプロテアーゼ又は（同義で）ペプチダーゼに分類される（Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H.Freeman and Company, San Francisco、第３章参照のこと）。

セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼはペプチド結合の加水分解を触媒し、且つその活性部位において必須セリン残基がある酵素をいう（White, Handler and Smith, 1973“Principles of Biochemistry”第５版、McGraw-Hill Book Company, NY, pp.271-272を参照のこと）。

細菌セリンプロテアーゼは２０，０００〜４５，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。これらはジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害される。これらは単純な末端エステルを加水分解し、そして真核系キモトリプシン（これもセリンプロテアーゼである）と活性が似ている。サブグループを包括するより狭い用語「アルカリ性プロテアーゼ」はpH９．０〜１１．０といった一部のセリンプロテアーゼの高い至適pHを反映する（Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711-753 を参照のこと）。

ズブチラーゼ
暫定的にズブチラーゼと称されているセリンプロテアーゼのサブグループはSiezenら、Protein Engng. 4 (1991) 719-737 及びSiezenら、Protein Science 6 (1997) 501-523 により提示されている。これらは過去にズブチリシン様プロテアーゼと称されていたセリンプロテアーゼの１７０超のアミノ酸配列の相同分析により規定されている。ズブチリシンは過去に往々にしてグラム陽性菌又は真菌により産生されるセリンプロテアーゼとして定義されていたが、今ではSiezenらに従いズブチラーゼのサブグループである。多種多様なズブチラーゼが同定され、そして数多くのズブチラーゼのアミノ酸配列が決定されている。かかるズブチラーゼ及びそのアミノ酸配列についてのより詳細な説明はSezenら（１９９７）を参照されたい。

ズブチラーゼの一のサブグループＩ−Ｓ１又は「真」のズブチリシンは「伝統的」なズブチリシン、例えばズブチリシン１６８（ＢＳＳ１６８）、ズブチリシンＢＰＮ’、ズブチリシン カールスバーグ（ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、NOVO NORDISK A/S）及びズブチリシンＤＹ（ＢＳＳＤＹ）を含んで成る。

ズブチラーゼの別のサブグループ、Ｉ−Ｓ２又は高アルカリ性ズブチリシンはSiezenらにより認められたものである。サブグループＩ−Ｓ２プロテアーゼは高アルカリ性ズブチリシンと記述され、そしてズブチリシンＰＢ９２（ＢＡＡＬＫＰ）（ＭＡＸＡＣＡＬ（登録商標）、Gist-Brocades NV）、ズブチリシン３０９（ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、NOVO NORDISK A/S）、ズブチリシン１４７（ＢＬＳ１４７）（ＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、NOVO NORDISK A/S）及びアルカリ性エステラーゼＹａＢ（ＢＳＥＹＡＢ）の如き酵素を含んで成る。

ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）
ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）はNOVO NORDISK A/Sより販売されている。これはＢ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）由来のズブチリシン３０９であり、そしてＢＡＡＬＫＰとは一の位置のみで相違する（図１を参照されたい）。ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）は図１のｂ）に表示したアミノ酸配列を有する。

親ズブチラーゼ
「親ズブチラーゼ」なる語はSiezenら（１９９１及び１９９７）に従って定義されたズブチラーゼをいう。更に詳しくは、前述の「ズブチラーゼ」の説明を参照されたい。親ズブチラーゼは天然資源から単離されたズブチラーゼであってもよく、この場合ズブチラーゼの特性を保たせながら修飾が施される。他に、「親ズブチラーゼ」は「野生型ズブチラーゼ」をいう。

ズブチラーゼ変異体の修飾
本明細書で用いる語「修飾」はズブチラーゼの化学的修飾及びズブチラーゼをコードするＤＮＡの遺伝子操作を含むものと定義する。この修飾はアミノ酸の側鎖の交換、注目のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入であってよい。

ズブチラーゼ変異体
本発明の背景において、ズブチラーゼ変異体又は突然変異ズブチラーゼなる語は、もとの又は親遺伝子を保有し、且つ対応の親酵素を産生する親微生物由来の突然変異遺伝子を発現する生物により産生されるズブチラーゼを意味する。この親遺伝子は適当な宿主の中で発現されたとき当該突然変異ズブチラーゼプロテアーゼが産生される突然変異遺伝子を作り上げるように突然変異されている。

相同ズブチラーゼ配列
特異的な活性部位ループ領域及びズブチラーゼＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）の当該ループ内のアミノ酸挿入が、本発明のズブチラーゼ変異体を得るためにここでいう修飾のために特定された。

しかしながら、本発明はこの特定のズブチラーゼの修飾に限定されず、その他の親（野生型）ズブチラーゼであって、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）のそれと相同な一次構造を有するものにも及ぶ。２つのアミノ酸配列間の相同性は本明細書では「同一性」といったパラメーターで説明する。

２種類のズブチラーゼ間の同一性の度合いを決定するため、ＧＣＧパッケージバージョン９．１のＧＡＰルーチンが上記と同じ設定を利用して適用されうる。このルーチンからのアウトプットはアミノ酸アライメントの他に、２本の配列間の「％同一性」の算出である。

この説明に基づき、適当な相同ズブチラーゼ及び対応の相同活性部位ループ領域（本発明に従って修飾されたものであってよい）を同定することは当業者にとって容易である。

洗浄性能
例えば洗浄又は硬質表面クリーニングの際に洗浄すべき物体の上の様々な天然基質の分解を触媒する酵素の能力は往々にしてその洗浄能力、浄化性又は洗浄性能と称される。本願を通じて、この特性を包含すべき洗浄性能なる用語を使う。

単離されたＤＮＡ配列
「単離された」なる語は、ＤＮＡ配列分子に適用した場合、ＤＮＡ配列がその天然遺伝環境から取り出され、かくしてその他の外因性又は不要なコード配列を含まず、そして遺伝子操作されたタンパク質産生系内での利用のために適当な形態にあるものをいう。かかる単離された分子はその自然環境から分離されたものをいい、そしてｃＤＮＡ及びゲノムクローンが含まれる。本発明の単離されたＤＮＡ分子はそれらが通常一緒になっているその他の遺伝子を含まないが、天然の５′及び３′非翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターは含んでよい。一緒になった領域の同定は当業者にとって明白となるであろう（例えば、Dynan and Tijan, Nature 316: 774-78, 1985 を参照されたい）。「単離されたＤＮＡ配列」は「クローニングされたＤＮＡ配列」とも称されうる。

単離されたタンパク質
タンパク質に適用した場合、「単離された」とは、タンパク質がその自然環境から取り出されたことをいう。

好適な態様において、単離されたタンパク質はその他のタンパク質、特にその他の相同タンパク質（即ち、「相同不純物」下記参照）を実質的に含まない。

単離されたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる決定に従い、純度１０％超、好ましくは純度２０％超、より好ましくは純度３０％超である。更に、タンパク質を高純度で、即ち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる決定に従い、純度４０％超、純度６０％超、純度８０％超、より好ましくは純度９５％超、そして更により好ましくは純度９９％超で提供することが好ましい。

「単離されたタンパク質」は「精製されたタンパク質」ということもある。

相同不純物
「相同不純物」とは、本発明のポリペプチドが本来由来する相同細胞を起源とする任意の不純物（例えば、本発明のポリペプチド以外のポリペプチド）をいう。

から得られる
特定の微生物起源との関係で本明細書において用いる「から得られる」とは、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドがその特定の起源により産生される、又はその起源に由来する遺伝子の挿入された細胞により産生されることをいう。

基質
プロテアーゼのための基質との関係で用いる語「基質」は、ズブチリシンプロテアーゼによる加水分解を受け易い少なくとも一のペプチド結合を含む化合物を含んで成るものとして最も広義に解釈されるべきである。

生成物
プロテアーゼ酵素反応に由来する生成物との関係で用いる語「生成物」は、本発明との関係では、ズブチラーゼプロテアーゼを包含する加水分解反応の生成物を含むものと解釈されるべきである。生成物はその後の加水分解反応の基質であってよい。

発明の詳細な説明
本発明のズブチラーゼは第一の態様において、９５〜１０３位の活性部位ループ（ｂ）領域の９７位において少なくとも１個の追加のアミノ酸残基を有するＩ−Ｓ１及びＩ−Ｓ２サブグループの単離された（即ち、純度１０％超の）ズブチラーゼ酵素に関連する。ここで、この追加のアミノ酸残基は９７位と９８位との間での少なくとも１個のアミノ酸残基の挿入に対応する。

換言すれば、本発明のズブチラーゼは９個超のアミノ酸残基の活性部位ループ（ｂ）領域を含んで成り、且つそのアミノ酸残基が親又は公知の野生型ズブチラーゼと比較して９７位と９８位との間に挿入されている又は挿入されることのできるものであることを特徴とする。

本発明の第一の態様のズブチラーゼは自然から同定且つ単離された親又は野生型ズブチラーゼであってよい。

かかる親野生型ズブチラーゼは当業界公知の標準的な技術により特異的にスクリーニングされうる。

これを行うための一の好適な手法は多種多様な微生物、好ましくは様々なバチルス株由来のズブチラーゼにおける活性部位ループをコードすることのわかっているＤＮＡ領域を特異的にＰＣＲ増幅することによる。

ズブチラーゼは、そのＤＮＡ及びアミノ酸配列が相同である観点で、保存酵素の群である。従って、活性部位ループに隣接する相対的に特異的なプライマーを構築することが可能である。

これを行うための一の手法は様々なズブチラーゼのアライメントの検討による（例えば、Siezenら、Protein Science 6 (1997) 501-523参照のこと）。当業者はこの慣用の作業から、Ｉ−Ｓ１又はＩ−Ｓ２の任意の群、例えばＢＬＳＡＶＩから９５〜１０３位のアミノ酸残基間の活性部位ループ（ｂ）に対応する活性部位ループに隣接するＰＣＲプライマーを構築できる。様々な微生物、好ましくは様々なバチルス株由来のＤＮＡを増幅するのにかかるＰＣＲプライマーを利用し、しかる後にこの増幅されたＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列決定を行うことにより、９５〜１０３位の活性部位ループ領域に相当し、且つ９７位と９８位との間に存在する挿入が考慮されうる、例えばＢＬＳＡＶＩと比べ長い活性部位領域を含んで成るこのような群のズブチラーゼを産生する株を同定することが可能であろう。このような株及び注目のかかるズブチラーゼの部位ＤＮＡ配列が同定されたら、本発明のかかるズブチラーゼの完全なクローニング、発現及び精製は当業者にとってルーチンな作業となる。

しかしながら、本発明のズブチラーゼ酵素は主として親ズブチラーゼの変異体であると考えられる。

従って、一の態様において、本発明は本発明の第一の態様に係る単離されたズブチラーゼ酵素であって、９７位と９８位のアミノ酸残基の間に少なくとも１個のアミノ酸挿入を有することによりその親酵素よりも長い活性部位ループ（ｂ）を有する構築変異体に関する。

本発明のズブチラーゼは洗剤において優れた洗浄性能を発揮し、そしてこの酵素が構築変異体なら、その最も近縁なズブチラーゼ、例えばズブチリシン３０９と比較して洗剤において洗浄性能を向上させる。

様々なズブチラーゼ生成物は様々なタイプの洗浄組成物において様々な洗浄性能を発揮するであろう。本発明のズブチラーゼはその最も近縁なものと比べ、かかる多種多様な洗浄組成物の大半において改善された洗浄性能を有する。

好ましくは、本発明のズブチラーゼ酵素はその最も近縁なものと比べ、本明細書の実施例３で示す洗浄組成物において改善された洗浄性能を有する。

所定のズブチラーゼアミノ酸配列が本発明の範囲に属するかを決定するため（そのズブチラーゼ配列が親野生型ズブチラーゼ配列又は部位特異的突然変異誘発以外の任意の方法により作られたズブチラーゼ変異体配列であろうと関係なく）、下記の手順が利用されうる：
ｉ）当該ズブチラーゼ配列をズブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列とアライニングさせる；
ii）工程ｉ）において実施したアライメントに基づき、９５〜１０３位のアミノ酸残基間の領域（両末端アミノ酸を含む）を含んで成るズブチリシンＢＰＮ’の活性部位ループ（ｂ）領域に対応する当該ズブチラーゼ配列内の活性部位ループ（ｂ）を同定する；
iii) 工程ii）で同定された当該ズブチラーゼ配列内の活性部位ループ（ｂ）がズブチリシンＢＰＮ’内の対応の活性部位ループより長いか、及びその伸長が９７位と９８位との間の少なくとも１個のアミノ酸残基の挿入に対応するかを決定する。

その通りとなれば、検討したズブチラーゼは本発明の範囲に属するズブチラーゼである。

上記工程ｉ）において実施したアライメントはＧＡＰルーチンを利用することによって上述の通りに実施する。

この記述に基づき、ズブチラーゼ内の活性部位ループ（ｂ）を同定すること及び注目のズブチラーゼが本発明の範囲内に属するかを決定することは当業者にとって容易である。変異体が部位特異的突然変異誘発により構築されたら、当然にそのズブチラーゼ変異体は本発明の範囲に属する。

本発明のズブチラーゼ変異体は当業界公知の標準的技術、例えば部位特異的／ランダム突然変異誘発又は様々なズブチラーゼのＤＮＡシャフリングにより構築されうる。より詳しくは、「ズブチラーゼ変異体の生産」及び「材料と方法」の章を参照のこと。

更なる態様において、本発明は
１．前記少なくとも１個の挿入されたアミノ酸残基がＴ，Ｇ，Ａ及びＳを含んで成る群から選ばれる本発明に係る単離されたズブチラーゼ酵素；
２．前記少なくとも１個の挿入されたアミノ酸残基がＤ，Ｅ，Ｈ，Ｋ及びＲ、より好ましくはＤ，Ｅ，Ｋ及びＲを含んで成る群から選ばれる本発明に係る単離されたズブチラーゼ酵素；
３．前記少なくとも１個の挿入されたアミノ酸残基がＣ，Ｎ，Ｑ，Ｓ及びＴ、より好ましくはＮ，Ｑ，Ｓ及びＴを含んで成る群から選ばれる本発明に係る単離されたズブチラーゼ酵素；
４．前記少なくとも１個の挿入されたアミノ酸残基がＡ，Ｇ及びＶを含んで成る群から選ばれる本発明に係る単離されたズブチラーゼ酵素；
５．前記少なくとも１個の挿入されたアミノ酸残基がＦ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｗ及びＹ、より好ましくはＦ，Ｉ，Ｌ，Ｍ及びＹを含んで成る群から選ばれる本発明に係る単離されたズブチラーゼ酵素；
に関する。

更なる態様において、本発明は９７位と９８位との間の前記挿入がズブチリシンＢＰＮ’内の対応の活性部位ループと比べ、少なくとも２個のアミノ酸を含んで成る本発明に係る単離されたズブチラーゼ酵素に関する。

更なる態様において、本発明は以下を含んで成る群（ＢＡＳＢＰＮの番号付け）から選ばれる少なくとも１個の挿入を含んで成る単離されたズブチラーゼ酵素
Ｘ９７Ｘ｛Ｔ，Ｇ，Ａ，Ｓ｝
Ｘ９７Ｘ｛Ｄ，Ｅ，Ｋ，Ｒ｝
Ｘ９７Ｘ｛Ｈ，Ｖ，Ｃ，Ｎ，Ｑ｝
Ｘ９７Ｘ｛Ｆ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｗ，Ｙ｝
又はより詳しくはズブチリシン３０９、並びに近縁のズブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ，ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫ
Ｇ９７ＧＡ
Ｇ９７ＧＴ
Ｇ９７ＧＧ
Ｇ９７ＧＳ
Ｇ９７ＧＤ
Ｇ９７ＧＥ
Ｇ９７ＧＫ
Ｇ９７ＧＲ
Ｇ９７ＧＨ
Ｇ９７ＧＶ
Ｇ９７ＧＣ
Ｇ９７ＧＮ
Ｇ９７ＧＱ
Ｇ９７ＧＦ
Ｇ９７ＧＩ
Ｇ９７ＧＬ
Ｇ９７ＧＭ
Ｇ９７ＧＰ
Ｇ９７ＧＷ
Ｇ９７ＧＹ
に関する。

更に、本発明は９７位に多重挿入を、又は下記の組合せのいずれかを含んで成るズブチラーゼに関する。

アミノ酸残基の類似のアミノ酸残基へのいわゆる保存置換は酵素の特性にごくわずかな変化しか及ぼさないことがよく知られている。

下記の表III には保存アミノ酸置換のグループを列挙する。
表 III
保存アミノ酸置換
一般特性 アミノ酸
塩基性（正電荷） Ｋ＝リジン
Ｈ＝ヒスチジン
酸性（負電荷） Ｅ＝グルタミン酸
Ｄ＝アスパラギン酸
極性 Ｑ＝グルタミン
Ｎ＝アスパラギン
疎水性 Ｌ＝ロイシン
Ｉ＝イソロイシン
Ｖ＝バリン
Ｍ＝メチオニン
芳香族 Ｆ＝フェニルアラニン
Ｗ＝トリプトファン
Ｙ＝チロシン
小 Ｇ＝グリシン
Ａ＝アラニン
Ｓ＝セリン
Ｔ＝スレオニン

この原理に従えば、保存置換を含んで成るズブチラーゼ変異体、例えば、Ｇ９７Ａ＋Ａ９８ＡＳ＋Ｓ９９Ｇ，Ｇ９７Ｓ＋Ａ９８ＡＴ＋Ｓ９９Ａは互いと著しく相違しない特性を示すものと予想される。

本明細書において開示する及び／又は例示するズブチラーゼに基づき、似かよった向上した洗浄性能を発揮するその他のズブチラーゼ変異体を獲得するためのこれらの変異体に対する適当な保存修飾の同定は当業者にとってルーチンな作業となる。

本発明に従うと、本発明のズブチラーゼはサブグループＩ−Ｓ１及びＩ−Ｓ２、特にＩ−Ｓ２に属し、双方とも自然から、又は様々な人工構築物から本発明の新規な酵素を単離するため、並びに親ズブチラーゼから変異体をデザイン及び生産するためにある。

サブグループＩ−Ｓ１由来の変異体に関し、ＢＳＳ１６８（ＢＳＳＡＳ，ＢＳＡＰＲＪ，ＢＳＡＰＲＮ，ＢＭＳＡＭＰ），ＢＡＳＢＰＮ，ＢＳＳＤＹ，ＢＬＳＣＡＲ（ＢＬＫＥＲＡ，ＢＬＳＣＡ１，ＢＬＳＣＡ２，ＢＬＳＣＡ３），ＢＳＳＰＲＣ及びＢＳＳＰＲＤ又はサブグループＩ−Ｓ１の特性を保持するその機能性変異体を含んで成る群から親ズブチラーゼ変異体を選定するのが好ましい。

サブグループＩ−Ｓ２由来の変異体に関し、ＢＳＡＰＲＱ，ＢＬＳ１４７（ＢＳＡＰＲＭ，ＢＡＨ１０１），ＢＬＳＡＶＩ（ＢＳＫＳＭＫ，ＢＡＡＬＫＰ，ＢＬＳＵＢＬ），ＢＹＳＹＡＢ及びＢＳＡＰＲＳ又はサブグループＩ−Ｓ２の特性を保持するその機能性変異体を含んで成る群から親ズブチラーゼ変異体を選定するのが好ましい。

詳しくは、当該親ズブチラーゼはＢＬＳＡＶＩ（ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）NOVO NORDISK A/S）であり、従って本発明の好適なズブチラーゼ変異体はＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）の変異体である。

本発明は更に、アミノ酸配列に対する任意のその他の修飾が組合された本発明の任意に上記のズブチラーゼをも含んで成る。特に、酵素の特性を改善する当業界周知のその他の修飾との組合せが考慮される。当業界には様々な向上した特性を有する数多くのズブチラーゼ変異体が発表されており、そしてその数多くのものを本明細書の「発明の背景」の章に挙げた（前掲）。これらの参考はズブチラーゼ変異体を同定するための参考としてここで開示し、それらは本発明のズブチラーゼ変異体と有利に組合せることができる。

かかる組合せは２２１位（酸化安定性の向上）、２１８位（熱安定性の向上）、酵素を安定化するＣａ結合部位での置換（例えば７６位）、及び従来技術から明らかな数多くのその他の位置を含んで成る。

更なる態様において、本発明のズブチラーゼ変異体は有利には下記の位置のいずれかにおける１又は複数の修飾と組合さってよい：２７，３６，５７，７６，８７，９７，１０１，１０４，１２０，１２３，１６７，１７０，２０６，２１８，２２２，２２４，２３５及び２７４。

特に、以下のＢＬＳＡＶＩ，ＢＬＳＵＢＬ，ＢＳＫＳＭＫ及びＢＡＡＬＫＰ変異体が組合せのために適当であると考えられる：Ｋ２７Ｒ，^★３６Ｄ，Ｓ５７Ｐ，Ｎ７６Ｄ，Ｓ８７Ｎ，Ｇ９７Ｎ，Ｓ１０１Ｇ，Ｓ１０３Ａ，Ｖ１０４Ａ，Ｖ１０４Ｉ，Ｖ１０４Ｎ，Ｖ１０４Ｙ，Ｈ１２０Ｄ，Ｎ１２３Ｓ，Ｙ１６７，Ｒ１７０，Ｑ２０６Ｅ，Ｎ２１８Ｓ，Ｍ２２２Ｓ，Ｍ２２２Ａ，Ｔ２２４Ｓ，Ｋ２３５Ｌ及びＴ２７４Ａ。

更に、任意の変異体Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ，Ｓ８７Ｎ＋Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ，Ｋ２７Ｒ＋Ｖ１０４Ｙ＋Ｎ１２３Ｓ＋Ｔ２７４Ａ，Ｎ７６Ｄ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４ＩもしくはＮ７６Ｄ＋Ｖ１０４Ａ又はこれらの突然変異の組合せ（Ｖ１０４Ｎ，Ｓ１０１Ｇ，Ｋ２７Ｒ，Ｖ１０４Ｙ，Ｎ１２３Ｓ，Ｔ２７４Ａ，Ｎ７６Ｄ，Ｖ１０４Ａ）と上記の任意の修飾との組合せを含んで成る変異体が改善された特性を示す。

なおまた、本発明の主たる態様のズブチラーゼ変異体は好ましくは１２９，１３１，１３３及び１９４位のいずれかでの１又は複数の修飾、好ましくは１２９Ｋ，１３１Ｈ，１３３Ｐ，１３３Ｄ及び１９４Ｐ修飾、そして最も好ましくはＰ１２９Ｋ，Ｐ１３１Ｈ，Ａ１３３Ｐ，Ａ１３３Ｄ及びＡ１９４Ｐ修飾と組合される。これらの修飾は全て本発明のズブチラーゼ変異体の生産において高い発現レベルを供するものと期待される。

従って、更なる態様において本発明は下記を含んで成る群から前記修飾が選定される本発明に係る変異体に関する：
Ｇ９７ＧＡ
Ｇ９７ＧＴ
Ｇ９７ＧＧ
Ｇ９７ＧＳ
Ｇ９７ＧＤ
Ｇ９７ＧＥ
Ｇ９７ＧＫ
Ｇ９７ＧＲ
Ｇ９７ＧＨ
Ｇ９７ＧＶ
Ｇ９７ＧＣ
Ｇ９７ＧＮ
Ｇ９７ＧＱ
Ｇ９７ＧＦ
Ｇ９７ＧＩ
Ｇ９７ＧＬ
Ｇ９７ＧＭ
Ｇ９７ＧＰ
Ｇ９７ＧＷ
Ｇ９７ＧＹ

ズブチラーゼ変異体の生産
本発明のズブチラーゼのクローニング及び遺伝子（例えばズブチラーゼ遺伝子）への挿入のための数多くの方法が当業界において周知である。「発明の背景」の章に引用する文献を参照されたい。

遺伝子のクローニング及び当該遺伝子に挿入を導入するための一般的な標準手順が本発明のズブチラーゼ変異体の獲得のために利用されうる。適当な技術の更なる説明については本明細書の実施例及びSambrookら（1989） Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M.ら（eds.)“Current protocols in Molecular Biology”. John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R. and Cutting, S.M. (eds.)“Molecular Bio-logical Methods for Bacillus”. John Wiley and Sons, 1990）；及びＷＯ ９６／３４９４６を参照されたい。

更に、本発明のズブチラーゼ変異体は様々な人工構築体のための標準技術、例えば様々なズブチラーゼ遺伝子のＤＮＡシャフリングによっても構築されうる（ＷＯ ９５／２２６２５；Stemmer WPC, Nature 370: 389-91 (1994)参照のこと）。例えば、天然において同定された１又は複数の部分ズブチラーゼ配列を有するＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標）をコードする遺伝子の、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）の活性部位ループ（ｂ）より長い活性部位ループ（ｂ）を含むようにするシャフリングは、向上した洗浄性能変異体のスクリーニングを経て、本発明にかかるズブチラーゼ変異体を供するであろう。

発現ベクター
本発明の酵素をコードするＤＮＡ構築体を含んで成る組換発現ベクターは組換ＤＮＡ手順に簡単にかけることのできうる任意のベクターであってよい。

選定のベクターはそれを導入すべき宿主細胞に往々して依存するであろう。かくして、このベクターは自己複製ベクター、即ち、染色体外質として存在し、複製が染色体の複製とは独立したベクター、例えばプラスミドであってよい。他に、このベクターは宿主細胞の中に導入されると宿主細胞のゲノムの中にその一部又は全体が組込まれ、そしてそれの組込まれた染色体と一緒に複製されうるものであってよい。

ベクターは好ましくは本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列がＤＮＡの転写のために必要な他のセグメントに作用可能式に連結された発現ベクターである。一般に、発現ベクターはプラスミドもしくはウィルスＤＮＡに由来するか、又は双方の要素を含むものであってよい。「作用可能式に連結」とは、セグメント同志が意図する目的のため、例えばプロモーターにおいて転写が開始し、そして当該酵素をコードするＤＮＡ配列にわたって進むよう協奏して機能するように並んでいることを意味する。

プロモーターは選定の宿主細胞において転写活性を示し、そして宿主細胞にとって相同又は異種のいずれでもよいタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる任意のＤＮＡ配列であってよい。

細菌宿主細胞において利用するための適当なプロモーターの例にはバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子、バチルス・リシェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファーアミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アルファーアミラーゼ遺伝子、バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性プロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）キシロシダーゼ遺伝子、又はファージラムダＰ_r もしくはＰ_L プロモーター、又は大腸菌ｌａｃ，ｔｒｐもしくはｔａｃプロモーターが含まれる。

本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列は、必要なら、適当なターミネーターに作用可能式に連結されていてもよい。

本発明の組換ベクターは更に注目の宿主細胞内でベクターが複製できるようにするＤＮＡ配列を含んで成ってよい。

このベクターは更に選択マーカー、例えば宿主細胞の欠陥を補う生成物を生成する遺伝子、又は例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、エリトロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン等の如き抗生物質に対する耐性、又は重金属もしくは除草剤に対する耐性をコードする遺伝子を含んで成ってもよい。

本発明の酵素を宿主細胞の分泌経路へと誘導するため、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られる）を組換ベクターの中に施してよい。この分泌シグナル配列は適正なリーディングフレーム内で当該酵素をコードするＤＮＡ配列と連結する。分泌シグナル配列は一般に酵素をコードするＤＮＡ配列に対して５′側に配置される。この分泌シグナル配列は当該酵素に通常結合したものであるか、又は別の分泌タンパク質をコードする遺伝子に由来してよい。

本発明の酵素、プロモーター並びに任意的にターミネーター及び／又は分泌シグナル配列のそれぞれをライゲーションするために用いる手順、又は適当なＰＣＲ増幅スキームによりこれらの配列を集成し、そして複製もしくは組込みのために必要な情報を含む適当なベクターにそれらを挿入するために用いる手順は当業者に周知である（例えば、Sambrookら、前掲を参照されたい）。

宿主細胞
宿主細胞に導入する本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列は注目の宿主に対して相同のものでも異種のものでもよい。もし宿主細胞に対して相同なものなら、即ち、天然において宿主細胞により産生されるなら、それは一般に別のプロモーター配列に対して作用可能式に連結され、又は適宜、その天然環境以外の分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に作用可能式に連結されているであろう。「相同」とは、注目の宿主生物にとって天然の酵素をコードするＤＮＡ配列を含むことを意図する。「異種」とは、天然では宿主細胞により発現されないＤＮＡ配列を含むことを意図する。かくして、このＤＮＡ配列は別の生物に由来するか、又は合成配列であってよい。

本発明のＤＮＡ構築体又は組換ベクターが導入される宿主細胞は本発明の酵素を産生できる任意の細胞であってよく、そして細菌、酵母、真菌、及び高等真核系細胞、例えば植物が含まれる。

培養することで本発明の酵素を産生できる細菌宿主細胞の例はグラム陽性菌、例えばバチルス属の株、例えばＢ．スブチリス、Ｂ．リシェニホルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ）又はＢ．スリンジエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の株、又はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の株、例えばＳ．リビダンズ（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はＳ．ミュリヌス（Ｓ．ｍｕｒｉｎｕｓ）、又はグラム陰性菌、例えば大腸菌である。

細菌の形質転換はプロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、又はコンピテント細胞を用いることにより、周知の要領で行うことができうる（Sambrookら、前掲を参照のこと）。

細菌、例えば大腸菌の中で当該酵素を発現させる場合、この酵素は細胞質内で一般には不溶性顆粒（封入体として知られる）として保持されることがあり、又は細菌分泌配列によりペリプラズマ空間へと誘導されうる。前者の場合、細胞を溶解させ、そして顆粒を回収し変性させ、しかる後にこの酵素を変性剤の希釈によりリフォルディングさせる。後者の場合、酵素は細胞を例えば音波処理又は浸透圧ショックにより破砕してペリプラズマ空間の中耳を放出させ、次いで酵素を回収することによって回収されうる。

酵素をグラム陽性菌、例えばバチルス又はストレプトマイセス属の株の中で発現させる場合、酵素は細胞質内に保持させてよく、又は細菌分泌配列により細胞外培地へと導かれることがある。後者の場合、この酵素は下記のようにして培地から回収されうる。

ズブチラーゼの生産方法
本発明は本発明に係る単離された酵素を生産する方法を提供し、それにおいては当該酵素をコードするＤＮＡ配列で形質転換された適当な宿主細胞を当該酵素の産生を可能とする条件下で培養し、そして得られる酵素をこの培養物から回収する。

当該酵素をコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターを異種宿主細胞に形質転換する場合、本発明の酵素の異種組換生産が可能となる。

これにより、相同不純物を含まないことを特徴とする高純度ズブチラーゼ組成物を作ることが可能となる。

尚、相同不純物とは本発明の酵素が本来由来する相同細胞を起源とする任意の不純物（例えば、本発明の酵素以外のポリペプチド）を意味する。

形質転換された宿主細胞を培養するのに用いる培地は注目の宿主細胞を増殖するのに適当な任意の慣用の培地であってよい。発現したズブチラーゼは好都合には培養培地の中に分泌されることがあり、そして周知の手順、例えば遠心分離もしくは濾過、硫酸アンモニウムの如き塩により培地のタンパク質性成分を沈殿させることにより培地から細胞を分離し、しかる後にクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を介して回収することができうる。

本発明のズブチラーゼ変異体の利用
本発明のズブチラーゼプロテアーゼ変異体は数多くの産業用途、特に洗剤産業において有用でありうる。

更に、本発明は本発明のズブチラーゼ変異体を含んで成る酵素組成物に関する。

好適な産業用途及び対応の好適な酵素組成物の概要を以下に提供する。

この概要は本発明のズブチラーゼ変異体の適当な用途の完全なリストではない。本発明のズブチラーゼ変異体は、プロテアーゼ、特にズブチラーゼの利用を包含する当業界公知のその他の産業用途においても利用されうる。

突然変異酵素を含んで成る洗浄組成物
本発明はクリーニング及び洗浄組成物における本発明の突然変異酵素の利用、並びに突然変異ズブチリシン酵素を含んで成るかかる組成物を含んで成る。かかるクリーニング及び洗浄組成物は当業界においてよく発表されており、そして適当なクリーニング及び洗浄組成物の更なる説明についてはＷＯ ９６／３４９４６；ＷＯ ９７／０７２０７；ＷＯ ９５／３００１１を参照されたい。

更に、下記の実施例はいくつかの本発明のズブチラーゼ変異体の洗浄性能の向上を実証する。

洗浄組成物
本発明の酵素は洗浄組成物に加えられてその成分となることができうる。

本発明の洗浄組成物は例えば染色布帛の前処理のために適当な洗濯添加剤及びリンス添加布帛柔軟剤等の手洗い又は洗濯機用洗浄組成物として、又は一般家庭用硬質表面クリーニング作業において利用するための洗浄組成物として、又は手洗い又は洗濯機用食品洗浄作業のための洗浄組成物として処方されうる。

特定の観点において、本発明は本発明の酵素を含んで成る洗浄添加剤を提供する。この洗浄添加剤並びに洗浄組成物は１又は複数種のその他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシナーゼ、例えばラッカーゼ及び／又はペルオキシダーゼを含んで成りうる。

一般に、選定の酵素の特性は選定の洗剤と適合すべきであり（即ち、至適pH、その他の酵素及び非酵素成分との適合性、等）、そして当該酵素は有効な量で存在しているべきである。

プロテアーゼ：適当なプロテアーゼは、動物、植物または微生物起源のものを含む。微生物起源が好ましい。化学的に変性された、またはタンパク質操作された変異体が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリ性プロテアーゼの例は、ズブチリシン、特にバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から誘導されたもの、例えばズブチリシン ノボ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｎｏｖｏ）、ズブチリシン カールスバーグ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、ズブチリシン３０９、ズブチリシン１４７およびズブチリシン１６８（ＷＯ ８９／０６２７９に記載されている）である。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば豚または牛起源）および、ＷＯ ８９／０６２７０およびＷＯ ９４／２５５８３に記載されたフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼである。

有用なプロテアーゼの例は、ＷＯ ９２／１９７２９，ＷＯ ９８／２０１１５，ＷＯ ９８／２０１１６およびＷＯ ９８／３４９４６に記載された変異体、特に、以下の位置の１つ以上に置換を有する変異体である：２７，３６，５７，７６，８７，９７，１０１，１０４，１２０，１２３，１６７，１７０，１９４，２０６，２１８，２２２，２２４，２３５および２７４。
好適な市販の入手可能なプロテアーゼとしては、Ａｌｃａｌａｓｅ（商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）、Ｐｒｉｍａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｌａｓｅ（商標）、Ｅｓｐｅｒａｓｅ（商標）およびＫａｎｎａｓｅ（商標）（Novo Nordisk A/S）、Ｍａｘａｔａｓｅ（商標）、Ｍａｘａｃａｌ（商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ＯｘＰ（商標）、ＦＮ２（商標）およびＦＮ３（商標）（Genencor International Inc. ）を包含する。

リパーゼ：適当なリパーゼには細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的に変性された又はタンパク質操作された突然変異体が含まれる。有用なリパーゼの例には、ヒュミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（別名サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ））、例えばＥＰ ２５８０６８及びＥＰ ３０５２１６に記載のＨ．ラヌギノーザ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ＷＯ ９６／１３５８０に記載のＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のリパーゼ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ、例えばＰ．アルカリジェンス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）又はＰ．シュードアルカリジェンス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（ＥＰ ２１８２７２）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）（ＥＰ ３３１３７６）、Ｐ．スタッシェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（ＧＢ １，３７２，０３４）、Ｐ．フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス種株ＳＤ７０５（ＷＯ ９５／０６７２０及びＷＯ ９６／２７００２）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（ＷＯ ９６／１２０１２）由来のリパーゼ、バチルスリパーゼ、例えばＢ．スブチリス（Dartois ら、 （1993) Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-260）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（ＪＰ ６４／７４４９９２）又はＢ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）（ＷＯ ９１／１６４２２）由来のリパーゼが挙げられる。

その他の例はリパーゼ変異体、例えばＷＯ ９２／０５２４９，ＷＯ ９４／０１５４１，ＥＰ ４０７ ２２５，ＥＰ ２６０ １０５，ＷＯ ９５／３５３８１，ＷＯ ９６／００２９２，ＷＯ ９５／３０７４４，ＷＯ ９４／２５５７８，ＷＯ ９５／１４７８３，ＷＯ ９５／２２６１５，ＷＯ ９７／０４０７９及びＷＯ ９７／０７２０２に記載のものである。

好適な商業的に入手可能なリパーゼ酵素にはＬｉｐｏｌａｓｅ（商標）及びＬｉｐｏｌａｓｅ Ｕｌｔｒａ（商標）（NOVO NORDISK A/S）が挙げられる。

アミラーゼ：適当なアミラーゼ（α及び／又はβ）には細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的に変性された又はタンパク質操作された突然変異体が含まれる。アミラーゼには、例えばバチルス、例えばＢ．リシェニホルミスの 特殊な株から得られるα−アミラーゼが挙げられる（ＧＢ １，２９６，８３９に詳細記載）。

有用なアミラーゼの例はＷＯ ９４／０２５９７，ＷＯ ９４／１８３１４，ＷＯ ９６／２３８７３及びＷＯ ９７／４３４２４、に記載の変異体、特に１又は複数の下記の位置で置換を有する変異体である：１５，２３，１０５，１０６，１２４，１２８，１３３，１５４，１５６，１８１，１８８，１９０，１９７，２０２，２０８，２０９，２４３，２６４，３０４，３０５，３９１，４０８及び４４４。

商業的に入手可能なアミラーゼはＤｕｒａｍｙｌ（商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（商標）及びＢＡＮ（商標）（NOVO NORDISK A/S）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（商標）及びＰｕｒａｓｔａｒ（商標）（Genencor International Inc. 由来）である。
セルラーゼ：適当なセルラーゼは、細菌または菌類起源のものを含む。化学的に変性された、またはタンパク質操作された変異体が含まれる。適当なセルラーゼとしては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ヒュミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属からのセルラーゼ、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号、同第５，６４８，２６３号、同第５，６９１，１７８号、同第５，７７６，７５７号およびＷＯ ８９／０９２５９に開示された、ヒュミコラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラ サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌａ）およびフサリウム オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から生成された菌類セルラーゼを包含する。

特に適当なセルラーゼは、カラー ケア ベネフィット（ｃｏｌｏｕｒ ｃａｒｅ ｂｅｎｅｆｉｔ）を有するアルカリ性または中性セルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、欧州特許第０，４９５，２５７号、欧州特許第０，５３１，３７２号、ＷＯ ９６／１１２６２，ＷＯ ９６／２９３９７，ＷＯ ９８／０８９４０に記載されたセルラーゼである。他の例は、ＷＯ ９４／０７９９８、欧州特許第０，５３１，３１５号、米国特許第５，４５７，０４６号、同第５，６８６，５９３号、同第５，７６３，２５４号、ＷＯ ９５／２４４７１，ＷＯ ９８／１２３０７およびＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９に記載されたようなセルラーゼ変異体である。

市販の入手可能なセルラーゼとしては、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（商標）およびＣａｒｅｚｙｍｅ（商標）（Novo Nordisk A/S）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（商標）およびＰｕｒａｄａｘ ＨＡ（Genencor International Inc.）ならびにＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（Kao Corporation ）を包含する。

ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：適当なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌または菌類起源のものを含む。化学的に変性された、またはタンパク質操作された変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、例えばＣ．シネレウス（ｃｉｎｅｒｅｕｓ）からのペルオキシダーゼおよび、ＷＯ ９３／２４６１８，ＷＯ ９５／１０６０２およびＷＯ ９８／１５２５７に記載されたようなその変異体を包含する。

市販の入手可能なペルオキシダーゼとしては、Ｇｕａｒｄｚｙｍｅ（商標）（Novo Nordisk A/S）を包含する。

洗剤酵素は、１種以上の酵素を含む別々の添加剤を加えることによって、または、これらの酵素をすべて含む、一緒にした添加剤を加えることによって、洗浄組成物中に含まれることができる。本発明の洗浄添加剤（すなわち、独立の添加剤または一緒にした添加剤）は、例えば顆粒、液体、スラリー等として処方されることができる。特定の洗剤添加剤処方物は、顆粒、特に粉塵の出ない（ｎｏｎｄｕｓｔｉｎｇ）顆粒、液体、特に安定化された液体またはスラリーである。

粉塵の出ない（ｎｏｎｄｕｓｔｉｎｇ）顆粒は、例えば米国特許第４，１０６，９９１号および同第４，６６１，４５２号に開示されたようにして製造することができ、任意的に当技術分野で公知の方法によってコーティングされることができる。蝋質コーティング材料の例は、平均分子量１０００〜２００００を有するポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；エトキシル化脂肪族アルコール（アルコールが１２〜２０個の炭素原子を有し、かつ１５〜８０個のエチレンオキシド単位がある）；脂肪族アルコール；脂肪酸；ならびに、脂肪酸のモノ−およびジ−およびトリグリセリドである。流動床技術による適用のために適当な膜形成コーティング材料の例は、英国特許第１４８３５９１号に与えられている。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従って、ポリオール、例えばプロピレングリコール、糖もしくは糖アルコール、乳酸またはホウ酸を添加することによって安定化され得る。保護された酵素は、欧州特許第２３８，２１６号に開示された方法に従って製造することができる。

本発明の洗浄組成物は任意の慣用の形状、例えば棒状、錠剤、粉末、顆粒、ペースト又は液状であってよい。液体洗剤は水性であってよく、典型的には７０％までの水及び０〜３０％の有機溶媒を含むか、又は無水であってよい。

洗浄組成物は１又は複数種の界面活性剤を含んで成り、これは半極性を含む非イオン性及び／又はアニオン性及び／又はカチオン性及び／又は双イオン性であってよい。界面活性剤は一般に０．１〜６０重量％のレベルで存在する。

適宜、洗剤は通常約１〜４０％のアニオン性界面活性剤、例えば線形アルキルベンゼンスルホネート、アルファーオレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート）、アルコールエトキシスルフェート、第二級アルカンスルホネート、脂肪スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル又はアルケニルコハク酸又は石けんを含むであろう。

適宜、洗剤は通常約０．２〜４０％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（「グルカミド」）を含むであろう。

洗剤は、０〜６５％の洗剤ビルダーまたは錯化剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、カーボネート、シトレート、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル−もしくはアルケニルコハク酸、可溶性シリケートまたは層をなす（ｌａｙｅｒｅｄ）シリケート（例えばHoechst からのＳＫＳ−６）を含むことができる。

洗剤は、１種以上のポリマーを含むことができる。例は、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマーおよびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーである。

洗剤は、漂白系を含むことができ、これは、Ｈ₂Ｏ₂源、例えばパーボレートまたはパーカーボネートを含むことができ、過酸生成漂白活性化剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミンまたはノナノイルオキシベンゼンスルホネートと組合せることができる。あるいは、漂白系は、アミド、イミドまたはスルホンタイプのペルオキシ酸を含むことができる。

本発明の洗浄組成物の酵素は、慣用の安定化剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコールまたはグリセロール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸もしくはホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステルまたはフェニルボロン酸（ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）誘導体、例えば４−ホルミルフェニルボロン酸（ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を用いて安定化することができ、組成物は、例えばＷＯ ９２／１９７０９およびＷＯ ９２／１９７０８に記載されたようにして処方することができる。

洗剤はまた、他の慣用の洗剤成分、例えばクレーを含む布帛用コンディショナー、発泡促進剤、泡立ち抑制剤、腐食防止剤、汚れ懸濁剤（ｓｏｉｌ−ｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、汚れ再沈積防止剤（ａｎｔｉ−ｓｏｉｌ ｒｅｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）、染料、殺菌剤、蛍光漂白剤、屈水性誘発物質、曇り防止剤または香料を含むことができる。
洗浄組成物においては、任意の酵素、特に本発明の変異体が、洗浄液１リットル当たり０．０１〜１００mgの酵素タンパク質、例えば洗浄液１リットル当たり０．０５〜５０mgの酵素タンパク質、特に洗浄液１リットル当たり０．１〜１mgの酵素タンパク質に相当する量で添加され得ることが目下予想される。

本発明の変異体は追加的に、ＷＯ ９７／０７２０２に開示された洗剤処方中に組み込まれ得る。この公報は、参照することによって本明細書に組入れられる。

レザー産業用途
本発明のズブチラーゼはレザー産業、特にスキンの脱毛において有用でありうる。
この用途では、本発明のズブチラーゼ変異体は好ましくは別のプロテアーゼを更に含んで成る酵素組成物に利用する。
その他の適当なプロテアーゼのより詳細な説明については洗浄組成物において利用する適当な酵素に関する章を参照された（前掲）。

ウール産業用途
本発明のズブチラーゼはウール産業、特にウールを含む衣服のクリーニングに有用でありうる。
この用途では、本発明のズブチラーゼ変異体は好ましくは別のプロテアーゼを更に含んで成る酵素組成物に利用する。
その他の適当なプロテアーゼのより詳細な説明については洗浄組成物において利用する適当な酵素に関する章を参照された（前掲）。

本発明を以下の限定ではない実施例で更に説明する。

材料と方法
株
Ｂ．スブチリスＤＮ１８８５（Diderichsen ら、１９９０）。
Ｂ．レンタス３０９及び１４７はバチルス・レンタスの特定の株であり、ＮＣＩＢに寄託され、そして受託番号ＮＣＩＢ１０３０９及び１０１４７が付され、そして引用することで本明細書に組入れる米国特許第３，７２３，２５０号に記載されている。
大腸菌ＭＣ１０００（M.J.Casadaban and S.N.Cohen (1980); J.Mol.Biol. 138 179-207 ）は慣用の方法によりｒ^- ，ｍ⁺ にされ、そして米国特許出願第０３９，２９８号に記載されている。

プラスミド：
ｐＪＳ３：ズブチラーゼ３０９をコードする合成遺伝子を含む大腸菌−Ｂ．スブチリスシャトルベクター（Jacob Schiodt ら、Protein and Peptide Letters 3: 39-44 (1996) に記載）。
ｐＳＸ２２２：Ｂ．スブチリス発現ベクター（ＷＯ ９６／３４９４６に記載）。

一般の分子生物学的方法：
何らかのことわりのない限り、ＤＮＡの操作及び形質転換は分子生物学の標準的な方法を利用して実施する（Sambrookら（1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M.ら（eds.)“Current protocols in Molecular Biology”. John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.)“Molecular Biological Methods for Bacillus”. John Wiley and Sons, 1990）。

ＤＮＡ操作のための酵素は供給者の仕様書に従って用いる。

ＤＮＡ操作のための酵素
何らかのことわりのない限り、ＤＮＡ操作のための酵素、例えば制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ等は全てNew England Biolabs, Inc. から入手した。

タンパク質分解活性
本発明との関係で、タンパク質分解活性はキロＮＯＶＯプロテアーゼ単位（ＫＮＰＵ）で表示する。この活性は酵素標準品（ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標））に対して決定し、そしてその決定は標準条件、即ち、５０℃、pH８．３、反応時間９分、測定時間３分においてのタンパク質分解酵素によるジメチルカゼイン（ＤＭＣ）溶液の消化を基準とする。フォルダーＡＦ２２０／１は注文によりNovo Nordisk A/S, Denmark から入手でき、そのフォルダーは引用することで本明細書に組入れる。

ＧＵはグリシン単位であり、タンパク質分解酵素活性として定義され、それは標準条件下で、４０℃での１５分のインキュベーションで、基質としてＮ−アセチルカゼインを用い、１mmole のグリシンに相当する量のＮＨ₂ 基を生成する。

プロテアーゼ活性は基質としてスクシニル−アラニン−アラニン−プロリン-フェニルアラニン−パラニトロアニリドによるＰＮＡアッセイを利用しても測定できうる。ＰＮＡアッセイの原理はRothgeb, T.M., Goodlander, B.D., Garrison, P.H., and Smith, L.A., Journal of the American Oil Chemists' Society, Vol.65 (5) pp.806-810 (1988) に記載されている。

発酵：
ズブチラーゼ酵素の生産のための発酵は３０℃で、ロータリーシェーキングテーブル上で（３００rpm ）、１００mlのＢＰＸ培地を含む５００mlのバッフル付きエーレンマイヤーフラスコの中で５日間実施する。

従って、例えば２０リットルの培地を作るには、２０本のエーレンマイヤーフラスコを同時に発酵させる。

培地：
ＢＰＸ培地組成（１リットル当り）
ポテトデンプン １００ｇ
粉砕オオムギ ５０ｇ
ダイズ穀粉 ２０ｇ
Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ ９ｇ
プルロニック ０．１ｇ
カゼイン酸ナトリウム １０ｇ

培地中のデンプンをα−アミラーゼで液化させ、そしてその培地を１２０℃で４５分かけて加熱することにより滅菌する。滅菌の後、ＮａＨＣＯ₃ を０．１Ｍ添加することにより培地のpHを９に合わせる。

実施例１
酵素変異体の構築及び発現
部位特異的突然変異誘発：
活性部位ループ（ｂ）における９７位と９８位との間に特異的な挿入を含んで成る本発明のズブチラーゼ３０９部位特異的変異体を、所望の挿入を含むオリゴのＰＣＲを介しＤＮＡフラグメントの伝統的なクローニング（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor, 1989）により作る。

鋳型プラスミドＤＮＡはｐＪＳ３、又はズブチラーゼ３０９の変異体を含むこの類似体とする。

挿入はＧ９７ＧＸ挿入変異体（Ｘは９７位と９８位との間に挿入された任意のアミノ酸残基）の構築体にオリゴ特異的突然変異誘発により導入し、Ｇ９７ＧＸズブチラーゼ３０９変異体が得られる。

ズブチラーゼ３０９変異体を大腸菌に形質転換させる。これらの形質転換体の一夜培養物から精製したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ消化、ＤＮＡフラグメントの精製、ライゲーション、Ｂ．スブチリスの形質転換を介し、Ｂ．スブチリスに形質転換する。Ｂ．スブチリスの形質転換はDubnauら、1971, J.Mol.Biol. 56, pp.209-221に記載されている。

局在領域にランダム挿入を施すための局在ランダム突然変異誘発
局在ランダム突然変異誘発を実施するために利用する全体的な戦略は以下の通りである：
挿入を規定するＤＮＡ塩基対により分割された挿入部位に隣接するＤＮＡ配列に対応する突然変異誘発プライマー（オリゴヌクレオチド）を合成する。

次に、得られる突然変異誘発プライマーを適当な対立プライマーによるＰＣＲ反応に用いる。得られるＰＣＲフラグメントを精製し、そしてエンドヌクレアーゼにより消化し、そして大腸菌−Ｂ．スブチリスシャトルベクターの中にクローニングする（下記参照）。

他方、且つ必要ならば、得られるＰＣＲを第二ＰＣＲ反応において、突然変異領域の消化及びシャトルベクターへのクローニングを可能にする第二の適当な対立プライマーと共にプライマーとして用いる。これらのＰＣＲ反応は正常な条件下で実施する。

この戦略に従い、局在ランダムライブラリーがＳＡＶＩＮＡＳＥの中で構築され、それにおいては挿入が活性部位ループ領域内の９７位と９８位との間に導入されている。

突然変異を突然変異誘発プライマーにより導入し（下記参照）、全てのアミノ酸が表示されるようにする（Ｎ＝２５％のＡ，Ｔ，Ｃ及びＧ；ここでＳ＝５０％のＣ及びＧ）。出来上がったＰＣＲフラグメントをサビナーゼのＮ末端に向い、重複配列と、プライマー５′ CTA AAT ATT CGT GGT GGC GC ３′（センス）及び５′ GAC TTT AAC AGC GTA TAG CTC AGC ３′（アンチセンス）によるＰＣＲ増幅によって作られたＰＣＲフラグメントとの組合せによるＰＣＲの別のラウンドにより伸長させる。伸長したＤＮＡフラグメントを修飾プラスミドｐＪＳ３（上記参照）のＨｉｎｄIII −及びＭｌｕＩ−部位の中にクローニングし、そして１０個のランダムに選別した大腸菌コロニーを配列決定してデザインした突然変異を確認した。

突然変異誘発プライマー（５′ GCT GAG CTA TAC GCT GTT AAA GTC CTA GGG NNS GCG AGC GGT TCA GGT TC ３′（センス））をｐＪＳ３内のＭｌｕＩ部位の下流に配置された適当なアンチセンス対立プライマー（例えば５′−CCT TTT AAC CGC ACA GGG TTT −３′（アンチセンス））及び鋳型としてのプラスミドｐＪＳ３によるＰＣＲ反応に用いる。得られるＰＣＲ生成物を制限酵素ＨｉｎｄIII 及びＭｌｕＩを用いることによりｐＪＳ３シャトルベクターの中にクローニングした。

ランダムライブラリーは周知の技術により大腸菌に形質転換させた。
調製したライブラリーは約１００，０００個の独立のクローン／ライブラリーを含んだ。
１０個のランダムに選別したコロニーを配列決定し、デザインした突然変異を確認した。

本発明のズブチラーゼ変異体を精製するため、本発明の変異体を含んで成るＢ．スブチリス ｐＪＳ３発現プラスミドをコンピテントＢ．スブチリス株に形質転換させ、そして上記の通りにして１０μｇ／mlのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含む培地の中で発酵させた。

実施例２
酵素変異体の精製
この手順はバチルス宿主細胞における本発明のズブチラーゼの生産のための２リットルスケール発酵の精製に関する。

約１．６リットルの発酵ブロスを１リットルのビーカー内で５０００rpm で３５分遠心分離する。その上清液を１０％の酢酸を用いてpH６．５にし、そしてＳｅｉｔｚ Ｓｕｐｒａ Ｓ１００フィルタープレート上で濾過した。

その濾液をＡｍｉｃｏｎ Ｓ１Ｙ１０ ＵＦカートリッジの付いたＡｍｉｃｏｎ ＣＨ２Ａ ＵＦユニットを用いて約４００mlに濃縮する。そのＵＦ濃縮物を遠心分離し、濾過し、それからバシトラシンアフィニティーカラムpH７上に室温で吸着させる。プロテアーゼをバシトラシンカラムから室温にて、０．０１Ｍのジメチルグルタル酸、０．１Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カルシウムを含むpH７に調整されたバッファー溶液中の２５％の２−プロパノール及び１Ｍの塩化ナトリウムを用いて溶出させる。

バシトラシン精製工程由来のプロテアーゼ活性を有する画分を組合せ、そして０．０１Ｍのジメチルグルタル酸、０．２Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カルシウムを含むpH６．５に調整されたバッファーで平衡にした７５０mlのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（直径５cm）に載せる。

Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム由来のタンパク質分解活性を有する画分を組合せ、そして０．０１Ｍのジメチルグルタル酸、０．２Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カルシウムを含むpH６．５に調整されたバッファーで平衡にした１５０mlのＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ ６Ｂ陽イオン交換カラム（直径５cm）に載せる。

プロテアーゼを同一のバッファー２リットルでの０〜０．１Ｍの塩化ナトリウムの線形勾配（ズブチリシン１４７の場合０〜０．２Ｍの塩化ナトリウム）を利用して溶出させる。

最終精製工程で、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム由来のプロテアーゼ含有画分を組合せ、そしてＧＲ８１ＰＰ膜（Danish Sugar Factories, Inc.由来）の付いたＡｍｉｃｏｎ限外濾過セルで濃縮する。

実施例１の構築及び発酵のための技術、並びに上記の単離手順を利用することにより、下記のズブチリシン３０９変異体が生成及び単離された：
Ｇ９７ＧＴ
Ｇ９７ＧＳ
Ｇ９７ＧＤ
Ｇ９７ＧＥ
Ｇ９７ＧＰ
Ｇ９７ＧＧ
Ｇ９７ＧＨ
Ｇ９７ＧＩ
Ｇ９７ＧＡ
Ｇ９７ＧＴ＋Ｙ１６７Ａ
Ｇ９７ＧＰ＋Ａ９８Ｔ

これらの変異体は予備アッセイでＳａｖｉｎａｓｅよりも優れた洗浄性能を発揮することがわかった。

実施例３
酵素変異体を含んで成る洗浄組成物の洗浄性能
下記の実施例は表示の条件下で行ったいくつかの洗浄試験曲線の結果である。

洗剤：
使用する洗剤はデンマーク（ＯＭＯ、データーシートＥＤ−９７４５１０５）及び米国（Ｗｉｓｋ、データーシートＥＤ−９７１１８９３）でスーパーマーケットからそれぞれ獲得した。使用前に、洗剤の酵素活性をマイクロ波処理で不活化する。

見本：
使用する見本はEMPA Testmaterialen, Movenstrasse 12, CH-9015 St.Gall, Switzerlandから入手したＥＭＰＡ１１６及びＥＭＰＡ１１７を用いる。

反射率
試験材料での反射率（Ｒ）の測定は４６０nmにて、Ｍａｃｂｅｔｈ Ｃｏｌｏｒ Ｅｙｅ ７０００光度計を用いて行う。測定は製造者のプロトコールに従って行う。

評価
ズブチラーゼの洗浄性能の評価は検討したズブチラーゼの向上係数又は性能係数のいずれかにより決定する。

向上係数ＩＦ_Dose／_responseは、検討したズブチラーゼを含む洗剤及び対照のズブチラーゼを含む同じ洗剤についての、ズブチラーゼ暫近的濃度が０に至るときの洗浄性能曲線の傾きである。
ＩＦ_Dose／_response＝ａ／ａ_ref

洗浄性能は次式Ｉに従って計算される：

ここで、
Ｒは反射単位の洗浄性能；Ｒ₀ はフィット曲線のｙ軸での切片（ブラインド）；ａはｃ→０でのフィット曲線の傾き；ｃは酵素濃度；そしてΔＲ_max はｃ→∞での理論的最大洗浄効果である。

性能係数Ｐは式IIに従って計算される

ここで
Ｒ_variant は１０nMの変異体で洗浄した試験材料の反射率；Ｒ_savinaseは１０nMのＳａｖｉｎａｓｅで洗浄した試験材料の反射率；Ｒ_blank は酵素抜きで洗浄した試験材料の反射率である。

本発明のズブチラーゼはＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標）と比べ向上した洗浄性能を発揮することがこのようにして認められる。

上記のＧＡＰルーチンを利用したズブチリシンＢＰＮ’（ａ）とＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標）（ｂ）とのアライメント。 ＷＯ ９１／００３４５から引用するズブチリシンＢＰＮ’とＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標）とのアライメント。 上記のＧＡＰルーチンを利用したズブチリシンＢＰＮ’とズブチリシン カールスバーグとのアライメント。 ＷＯ ９１／００３４５から引用するズブチリシンＢＰＮ’とズブチリシンカールスバーグとのアライメント。 Ｓａｖｉｎａｓｅの三次元構造（タンパク質データバンク（ＰＤＢ）エントリー１ＳＶＮ）。この図では活性部位ループ（ｂ）を示す。

Claims (21)

1. スブチリシン３０９において、Ｇ９７ＧＡ、Ｇ９７ＧＳ、Ｇ９７ＧＴ、Ｇ９７ＧＧ、Ｇ９７ＧＤ、Ｇ９７ＧＥ、Ｇ９７ＧＰ又はＧ９７ＧＩの挿入を含む、ズブチラーゼ酵素。
   
2. 前記９７位と９８位との間の挿入が任意のその他の位置における１又は複数の更なる修飾と組合されている、請求項１に記載のズブチラーゼ酵素。
   
3. 前記更なる修飾が２７，３６，５７，７６，８７，９７，１０１，１０４，１２０，１２３，１６７，１７０，２０６，２１８，２２２，２２４，２３５及び２７４位のうちの１又は複数にある、請求項２に記載のズブチラーゼ酵素。
   
4. 前記修飾が９５，９６，９７，９８，９９，１００，１０１，１０２及び１０３位のうちの１又は複数における修飾と組合されている、請求項２又は３に記載のズブチラーゼ酵素。
   
5. 前記更なる修飾が、Ｋ２７Ｒ，＊３６Ｄ，Ｓ５７Ｐ，Ｎ７６Ｄ，Ｓ８７Ｎ，Ｇ９７Ｎ，Ｓ１０１Ｇ，Ｖ１０４Ａ，Ｖ１０４Ｎ，Ｖ１０４Ｙ，Ｈ１２０Ｄ，Ｎ１２３Ｓ，Ｙ１６７Ｘ，Ｒ１７０Ｘ，Ｑ２０６Ｅ，Ｎ２１８Ｓ，Ｍ２２２Ｓ，Ｍ２２２Ａ，Ｔ２２４Ｓ，Ｋ２３５Ｌ及びＴ２７４Ａから成る群から選ばれる、請求項２又は３に記載のズブチラーゼ酵素。
   
6. 前記更なる修飾がＳ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ，Ｓ８７Ｎ＋Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ，Ｋ２７Ｒ＋Ｖ１０４Ｙ＋Ｎ１２３Ｓ＋Ｔ２７４Ａ，Ｎ７６Ｄ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４ＩもしくはＮ７６Ｄ＋Ｖ１０４Ａ、又はこれらの突然変異（Ｖ１０４Ｎ，Ｓ１０１Ｇ，Ｋ２７Ｒ，Ｖ１０４Ｙ，Ｎ１２３Ｓ，Ｔ２７４Ａ，Ｎ７６Ｄ，Ｖ１０４Ａ）の他の組み合わせ、請求項１〜４のいずれか１項に挙げた任意の１もしくは複数の置換、欠失及び／もしくは挿入との組合せにおけるその他の組合せから成る群から選ばれる、請求項２又は３に記載のズブチラーゼ酵素。
   
7. 前記更なる修飾がＰ１２９Ｋ，Ｐ１３１Ｈ，Ａ１３３Ｐ，Ａ１３３Ｄ及びＡ１９４Ｐから成る群から選ばれる、請求項２に記載のズブチラーゼ酵素。
   
8. Ｇ９７ＧＴ＋Ｙ１６７Ａ又はＧ９７ＧＰ＋Ａ９８Ｔを含んで成る、請求項１〜７のいずれか１項に記載のズブチラーゼ酵素。
   
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のズブチラーゼ又はズブチラーゼ変異体をコードする配列からなる単離されたＤＮＡ。
   
10. 請求項９に記載の単離されたＤＮＡ含んで成る発現ベクター。
    
11. 請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換された微生物宿主細胞。
    
12. 細菌である、請求項１１に記載の微生物宿主。
    
13. バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である、請求項１２に記載の微生物宿主。
    
14. Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）である、請求項１３に記載の微生物宿主。
    
15. 真菌又は酵母である、請求項１１に記載の微生物宿主。
    
16. 糸状菌である、請求項１５に記載の微生物宿主。
    
17. アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）である、請求項１６に記載の微生物宿主。
    
18. 請求項１〜８のいずれか１項記載のズブチラーゼ酵素を生産するための方法であって、請求項１１〜１７のいずれか１項記載の宿主を前記酵素の発現及び分泌を誘導する条件下で培養し、そして当該酵素を回収する、前記方法。
    
19. 請求項１〜８のいずれか１項記載のズブチラーゼ酵素を含んで成る洗浄組成物。
    
20. セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドリダクターゼ、その他のプロテアーゼ、又はアミラーゼを更に含んで成る、請求項１９記載の洗浄組成物。
    
21. 請求項１〜８のいずれか１項記載のズブチラーゼ酵素、又は請求項１９もしくは２０に記載の洗浄組成物の、洗濯及び／又は食器洗浄洗剤への利用。

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