KR100762164B1

KR100762164B1 - 프로테아제 변이체 및 조성물

Info

Publication number: KR100762164B1
Application number: KR1020007005484A
Authority: KR
Inventors: 한젠페테르캄프; 바우디츠페테르; 미켈젠프랑크
Original assignee: 노보자임스 에이/에스
Priority date: 1997-11-21
Filing date: 1998-11-17
Publication date: 2007-10-01
Anticipated expiration: 2018-11-17
Also published as: WO1999027082A1; DE69830743D1; EP1032655B1; JP2002508926A; DE69830743T2; CA2310454A1; CN101440360A; CN1279715A; BR9814236A; AU1225099A; KR20010032277A; US6605458B1; CA2310454C; EP1032655A1; ATE298791T1; US7026153B2; JP4246384B2; US20030180933A1

Abstract

본 발명에서는 최소한 하나의 활성 부위 루프에 삽입이 일어난 것을 특징으로 하는 프로테아제 서브틸라제 효소가 설명된다. 이 효소는 그것이 서브틸라제 변이체인 경우 그것의 모 효소와 비교하여 개선된 세척 성능을 나타낸다.

프로테아제, 서브틸라제, 세척성능, 직물세탁, 식기세척

Description

프로테아제 변이체 및 조성물{PROTEASE VARIANTS AND COMPOSITIONS}

본 발명은 세제 조성물의 제형에 유용하고 세제에서 우수한 세척 능력을 나타내는, 하나 또는 둘 이상의 활성 부위 루프에 삽입을 포함하고 있는 신규한 돌연변이 프로테아제 효소 또는 효소 변이체; 상기 효소를 함유하고 있는 클리닝 및 세제 조성물; 적당한 숙주 세포 또는 유기체에 삽입되었을 때 상기 효소의 발현을 코드하는 돌연변이된 유전자; 및 그것으로 형질전환되고 상기 효소 변이체를 발현할 수 있는 그러한 숙주 세포에 관한 것이다.

세제 산업분야에서 효소는 30 년이 넘는 세월동안 세척용 제형에 사용되어 왔다. 그러한 제형에 사용되는 효소들로는 프로테아제, 리파제, 아밀라제, 셀룰라제뿐만 아니라, 다른 효소들, 또는 그것들의 혼합물이 있다. 상업적으로 가장 중요한 효소는 프로테아제이다.

그 수가 증가하고 있는 상업적으로 사용되는 프로테아제는 자연 발생적인 야생형 프로테아제의 단백질 공학적으로 제조된 변이체, 예를 들면 DURAZYM

(Novo Nordisk A/S), RELASE

(Novo Nordisk A/S), MAXAPEM

(Gist-Brocades N.V.), PURAFECT

(Genencor International, Inc.)이다.

나아가, 많은 프로테아제 변이체가 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예컨대 EP 130756 (GENENTECH)(US Reissue Patent No. 34,606 (GENENCOR)에 대응함); EP 214435 (HENKEL); WO 87/04461 (AMGEN); WO 87/05050 (GENEX); EP 260105 (GENENCOR); Thomas, Russell, and Fersht (1985) Nature 318:375-376; Thomas, Russell, and Fersht (1987) J. Mol. Biol. 193:803-813; Russell and Fersht (1987) Nature 328:496-500; WO 88/08028 (Genex); WO 88/08033 (Amgen); WO 95/27049 (SOLVAY S.A.); WO 95/30011 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/30010 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/29979 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); USP 5,543,302 (SOLVAY S.A.); EP 251 446 (GENENCOR); WO 89/06279 (NOVO NORDISK A/S); WO 91/00345 (NOVO NORDISK A/S); EP 525 610 A1 (SOLVAY); 및 WO 94/02618 (GIST-BROCADES N.V.).

그러나, 비록 많은 유용한 프로테아제 변이체가 공개되어 있긴 하지만, 아직도 많은 산업적 용도를 위해 새로운 개선된 프로테아제 또는 프로테아제 변이체가 요구되고 있다.

그러므로, 본 발명의 목적은 개선된 프로테아제 또는 단백질 공학적으로 제조된 프로테아제 변이체를, 특히 세제 산업에 사용하기 위하여 제공하는 것이다.

(발명의 요약)

본 발명자들은 모 (parent) 야생형 BLSAVI 와 비교하여, 상기 BLSAVI 의 활성 부위 루프중 최소한 하나에 최소한 하나의 삽입을 도입함으로써 세제의 세척 성능이 개선된 BLSAVI (Savinase

)의 변이체를 제조하는 것이 가능함을 확인하였다.

BLSAVI 와 유사한 다른 서브틸라제에서 유사한 변이체를 제조하는 것이 가능할 것으로 예상된다.

나아가, BLSAVI 와 비교하여 세제에서 사용할 때 세척 성능이 개선된 자연 발생적인 모 또는 야생형 서브틸라제를, BLSAVI 에서의 상응하는 활성 부위 루프보다 더 긴 활성 부위 루프를 최소한 하나 포함하고 있는 그러한 모 야생형 서브틸라제를 특이적으로 스크리닝함에 의하여 확인하고 자연으로부터 단리하는 것이 가능한 것으로 예상된다.

따라서, 첫 번째 측면으로, 본 발명은 단리된 서브틸라제 효소에 관한 것으로, 이 효소는 BLSAVI 와 비교하여 세제에서 사용할 때 개선된 세척 성능을 가지고 있고, 성숙한 BLSAVI 의 아미노산 서열과 최소한 40 % 동일한 아미노산 서열을 가지고 있으며, 상기 단리된 서브틸라제에서 활성 부위 루프중 최소한 하나가 BLSAVI 의 상응하는 활성 부위 루프보다 더 길고, 그로써 하기로 이루어지는 군으로부터 특정된 바와 같은 최소 아미노산 길이를 가지는 것을 특징으로 한다:

(a) 아미노산 잔기 33 에서 43 사이의 영역 (양 끝단의 두 개의 아미노산이 포함됨)이 최소한 12 아미노산 길이이다 (즉 BLSAVI 와 비교하여 최소한 하나의 아미노산이 삽입됨);

(b) 아미노산 잔기 95 에서 103 사이의 영역 (양 끝단의 두 개의 아미노산이 포함됨)이 최소한 10 아미노산 길이이다 (즉 BLSAVI 와 비교하여 최소한 하나의 아미노산이 삽입됨);

(c) 아미노산 잔기 125 에서 132 사이의 영역 (양 끝단의 두 개의 아미노산이 포함됨)이 최소한 9 아미노산 길이이다 (즉 BLSAVI 와 비교하여 최소한 하나의 아미노산이 삽입됨);

(d) 아미노산 잔기 153 에서 173 사이의 영역 (양 끝단의 두 개의 아미노산이 포함됨)이 최소한 22 아미노산 길이이다 (즉 BLSAVI 와 비교하여 최소한 하나의 아미노산이 삽입됨);

(e) 아미노산 잔기 181 에서 195 사이의 영역 (양 끝단의 두 개의 아미노산이 포함됨)이 최소한 16 아미노산 길이이다 (즉 BLSAVI 와 비교하여 최소한 하나의 아미노산이 삽입됨);

(f) 아미노산 잔기 202 에서 204 사이의 영역 (양 끝단의 두 개의 아미노산이 포함됨)이 최소한 4 아미노산 길이이다 (즉 BLSAVI 와 비교하여 최소한 하나의 아미노산이 삽입됨); 및

(g) 아미노산 잔기 218 에서 219 사이의 영역 (양 끝단의 두 개의 아미노산이 포함됨)이 최소한 3 아미노산 길이이다 (즉 BLSAVI 와 비교하여 최소한 하나의 아미노산이 삽입됨).

두 번째 측면으로, 본 발명은 본 발명의 서브틸라제 변이체를 코드화하는 단리된 DNA 서열에 관한 것이다.

세 번째 측면으로, 본 발명은 본 발명의 서브틸라제 변이체를 코드화하는 단리된 DNA 서열을 포함하고 있는 발현 벡터에 관한 것이다.

네 번째 측면으로, 본 발명은 세 번째 측면에 따르는 발현 벡터로 형질전환된 미생물 숙주 세포에 관한 것이다.

추가의 측면으로, 본 발명은 적당한 미생물 숙주에 세 번째 측면에 따르는 발현 벡터를 삽입하고, 원하는 서브틸라제 효소를 발현하도록 숙주를 배양하고, 효소 생성물을 회수하는 것으로 이루어지는, 본 발명의 서브틸리신 효소를 제조하는 것에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명의 서브틸라제 변이체를 포함하고 있는 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 산업적으로 관련되어 있는 많은 용도에 사용하기 위하여, 특히 클리닝 조성물 및 돌연변이 효소를 포함하고 있는 클리닝 조성물, 특히 돌연변이 서브틸리신 효소를 포함하고 있는 세제 조성물에 사용하기 위한 돌연변이 효소에 관한 것이다.

정의

본 발명을 더욱 상세하게 논하기 전에 다음의 용어들을 먼저 규정하기로 한다.

아미노산의 명명법

A = Ala = 알라닌

V = Val = 발린

L = Leu = 로이신

I = Ile = 이소로이신

P = Pro = 프롤린

F = Phe = 페닐알라닌

W = Trp = 트립토판

M = Met = 메티오닌

G = Gly = 글리신

S = Ser = 세린

T = Thr = 트레오닌

C = Cys = 시스테인

Y = Tyr = 티로신

N = Asn = 아스파라긴

Q = Gln = 글루타민

D = Asp = 아스파르트산

E = Glu = 글루탐산

K = Lys = 라이신

R = Arg = 아르기닌

H = His = 히스티딘

X = Xaa = 모든 아미노산

핵산의 명명법

A = 아데닌

G = 구아닌

C = 시토신

T = 티민 (DNA 에서만)

U = 우라실 (RNA 에서만)

변이체의 명명법

본 발명에 따라 제조된 또는 예상되는 다양한 효소 변이체를 설명할 때, 용이한 참조를 위하여 다음의 명명법이 적용되었다:

원래의 아미노산(들) 위치(들) 치환된 아미노산(들):

원래의 아미노산 잔기가 어떠한 아미노산 잔기든지 될 수 있는 경우, 단지 위치만을 가리키는 짧은 손 표기법이 가끔 사용될 수 있고, 치환된 아미노산은,

위치 치환된 아미노산.

그러한 표기법은 특히 상동성 서브틸라제에서의 변형(들)과 관련하여 관계가 있다 (하기의 설명 참조).

유사하게 아미노산 잔기(들)을 치환하는 정체가 중요하지 않을 때에는,

원래의 아미노산 위치.

원래의 아미노산(들)과 치환된 아미노산(들) 모두 어떠한 아미노산이든지 포함할 수 있을 때에는, 단지 위치(들)만이 예컨대 170 으로 표시된다.

원래의 아미노산(들) 및/또는 치환된 아미노산(들)이 하나 이상의, 그러나 전부는 아닌 아미노산(들)을 포함하는 경우, 그 때에는 선택된 아미노산들이 괄호 {} 안에 표시된다.

원래의 아미노산 위치 {치환된 아미노산₁, ..., 치환된 아미노산_n}.

특이한 변이체에 대하여, 어떠한 아미노산 잔기를 표시하기 위하여 코드 Xaa 및 X 를 포함하여 특정한 세문자 또는 한 문자 코드가 사용된다.

치환:

위치 195 에서 글리신에 대한 글루탐산의 치환은 다음과 같이 표시된다:

Gly195Glu 또는 G195E

또는 위치 195 에서 글리신에 대한 어떠한 아미노산 잔기의 치환은 다음과 같이 표시된다:

Glu195Xaa 또는 G195X

또는

Glu195 또는 G195

그러므로, 위치 170 에서의 어떠한 아미노산 잔기에 대한 세린의 치환은 다음과 같이 표시될 것이다:

Xaa170Ser 또는 X170S

또는

170Ser 또는 170S.

그러한 표기법은 특히 상동성 서브틸라제의 변형(들)과 관련하여 관계가 있다 (하기의 설명 참조). 그러므로 170Ser 는 예컨대 BASBPN 에서의 Lys170Ser 변형 및 BLSAVI 에서의 Arg170Ser 변형 두가지를 모두 포함하는 것을 의미한다. 이들 실예에 관해서는 도 1 을 참조한다.

원래의 아미노산(들) 및/또는 치환된 아미노산(들)이 하나 이상의, 그러나 전부는 아닌 아미노산(들)을 포함할 수 있을 때에는, 변이체 R170G, R170A, R170S, 및 R170T 를 표시하기 위한, 위치 170 에서의 아르기닌에 대한 글리신, 알라닌, 세린 또는 트레오닌의 치환은 다음과 같이 표시될 것이다:

Arg170{Gly,Ala,Ser,Thr} 또는 R170{G,A,S,T}.

결실:

위치 195 에서의 글리신의 결실은 다음과 같이 표시될 것이다:

Gly195^* 또는 G195^*.

따라서 위치 195 및 196 에서의 글리신 및 로이신의 결실과 같은 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실은 다음과 같이 표시될 것이다:

Gly195^*+Leu196^* 또는 G195^*+L196^*.

삽입:

예컨대 G195 다음에 라이신과 같은 추가의 아미노산 잔기의 삽입은 :

Gly195GlylYS 또는 G195GK 이거나; 또는

195 뒤에 하나 이상의 잔기, 예컨대 Lys, Ala 및 Ser 이 삽입된 때에는, 다음과 같다:

Gly195GlyLysAlaSer 또는 G195GKAS.

그러한 경우에 삽입된 아미노산 잔기(들)은 삽입된 아미노산 잔기(들) 앞에 있는 아미노산 잔기의 위치 번호에 더 낮은 경우의 문자를 첨부함으로써 넘버링된다. 상기 실예에서 서열 194 에서 196 은 따라서 다음과 같을 것이다:

194 195 196

BLSAVI A - G - L

194 195 195a 195b 195c 196

변이체 A - G - K - A - S - L

기존의 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 잔기가 삽입되는 경우에는, 명명법에 어느 정도의 축퇴성이 발생하는 것이 명백하다. 만약 예를 들어 상기 실예에서 글리신이 글리신 다음에 삽입되면 G195GG 로 표시될 것이다. 동일한 실제적인 변화가

194 195 196

BLSAVI A - G - L 로부터

194 195 195a 196

변이체 A - G - G - L

194 194a 195 196 으로의 변화에 대하여 A194AG 로서 표시될 것이다.

그러한 경우는 숙련된 사람에게는 명백할 것이며, 표시 G195GG 와 이러한 종류의 삽입에 대한 상응하는 표시는 따라서 그러한 동등한 축퇴성 표시를 포함하는 것을 의미한다.

갭의 충전:

넘버링에 사용된 서브틸라제 서열과 비교하여 효소에 결실이 존재하는 경우, 그러한 위치에서의 삽입은, 예컨대 위치 36 에서 아스파르트산이 삽입되는 경우 다음과 같이 표시된다:

*36Asp 또는 *36D

다중 변형:

다중 변형을 포함하는 변이체들은 플러스 부호로 구별된다. 예를 들어,

Arg170Tyr + Gly195Glu 또는 R170Y+G195E

는 각각 위치 170 과 195 에서 아르기닌과 글리신 대신에 티로신과 글루탐산으로 치환된 것을 나타낸다.

또는 예를 들어, Tyr167{Gly,Ala,Ser,Thr}+Arg170{Gly,Ala,Ser,Thr} 은

변이체 Tyr167Gly+Arg170Gly, Tyr167Gly+Arg170Ala,

Tyr167Gly+Arg170Ser, Tyr167Gly+Arg170Thr,

Tyr167Ala+Arg170Gly, Tyr167Ala+Arg170Ala,

Tyr167Ala+Arg170Ser, Tyr167Ala+Arg170Thr,

Tyr167Ser+Arg170Gly, Tyr167Ser+Arg170Ala,

Tyr167Ser+Arg170Ser, Tyr167Ser+Arg170Thr,

Tyr167Thr+Arg170Gly, Tyr167Thr+Arg170Ala,

Tyr167Thr+Arg170Ser, 및 Tyr167Thr+Arg170Thr 를 표시한다.

이 명명법은 특정한 공통되는 성질을 가지고 있는 아미노산 잔기, 예를 들면 양성 전하를 가지고 있는 잔기 (K, R, H), 음성 전하를 가지고 있는 잔기 (D, E)의 치환, 대체, 삽입 또는 결실을 목표로 하는 변형, 또는 예컨대 다른 작은 아미노산에 대하여 작은 아미노산을 치환하는 것을 표시하는 Tyr167{Gly,Ala,Ser,Thr}+Arg170{Gly,Ala,Ser,Thr} 의 축퇴성 아미노산 변형(들) 에 특히 관련이 있다. 보다 상세한 설명은 하기의 "발명의 상세한 설명" 단원 참조.

프로테아제

단백질 기질의 아미드 결합을 절단하는 효소들을 프로테아제, 또는 (상호교환적으로) 펩티다제로 분류한다 [Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco, Chapter 3].

아미노산 위치/잔기의 넘버링

다른 언급이 없는 한, 본원에서 사용된 아미노산 넘버링은 서브틸라제 BPN' (BASBPN) 서열의 넘버링에 상응한다. BPN' 서열의 구체적인 설명에 대해서는 참고문헌을 참조한다 [Siezen et al., Protein Engng. 4(1991):719-737 및 도 1].

세린 프로테아제

세린 프로테아제는 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하고, 활성 부위에 필수 세린 잔기가 있는 효소이다 [White, Handler and Smith, 1973 "Principles of Biochemistry", Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY pp. 271-272].

박테리아성 세린 프로테아제는 20,000 내지 45,000 달톤 범위의 분자량을 가지고 있다. 이 효소들은 디이소프로필플루오로포스페이트에 의해 억제된다. 또한 이것들은 간단한 말단 에스테르를 가수분해시키고, 마찬가지로 세린 프로테아제인 진핵세포성 키모트립신과 활성이 유사하다. 하위-군에 속하는 보다 좁은 의미의 용어인 알칼리성 프로테아제는 pH 9.0 에서 11.0 까지의, 일부의 세린 프로테아제의 높은 pH 최적을 반영한다 [Priest (1977) Bacteriological Rev. 41:711-753].

서브틸라제

잠정적으로 서브텔라제로 표시된 세린 프로테아제의 하위-군은 시이즌 등에 의해 제안되었다 [Siezen et al., Protein Engng. 4(1991):719-737]. 그것들은 앞서 서브틸리신-유사 프로테아제로서 언급된 세린 프로테아제의 40 개 이상의 아미노산 서열의 상동성 분석에 의하여 규정된다. 서브틸리신은 전에는 그람-포지티브 박테리아 또는 진균에 의하여 생성된 세린 프로테아제로서 규정되었고, 현재는 시즌 등에 따라 서브틸라제의 하위군으로 분류된다. 광범위한 서브틸라제들이 확인되었고, 많은 서브틸라제의 아미노산 서열이 결정되었다. 그러한 서브틸라제 및 그것들의 아미노산 서열의 보다 상세한 설명에 대해서는 시즌 등 (Siezen et al.) 과 도 1 을 참조한다.

서브틸라제의 한 하위군인 I-S1 은 "고전적인" 서브틸리신, 예컨대 서브틸리신 168, 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 칼스버그 (ALCALASE

, NOVO NORDISK A/S), 및 서브틸리신 DY 를 포함한다.

서브틸라제의 또 하나의 하위군인 I-S2 는 시즌 등에 의해 인지된다. 하위-군 I-S2 프로테아제는 알칼리성이 매우 강한 서브틸리신이고, 예컨대 서브틸리신 PB92 (MAXACAL

, Gist-Brocades NV), 서브틸리신 309 (SAVINASE

, NOVO NORDISK A/S), 서브틸리신 147 (ESPERASE

, NOVO NORDISK A/S), 및 알칼리성 엘라스타제 YaB 를 포함한다.

"SAVINASER

"

SAVINASE

는 노보 노르디스크사에서 판매된다. 이것은 바실루스 렌투스로부터 얻어지는 서브틸리신 309 이며, 한 위치에서만 BABP92 와 상이하다 (N87S, 본원의 도 1 참조). SAVINASE

는 BLSAVI 로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 있다 (본원의 도 1 참조).

모 서브틸라제

용어 "모 서브틸라제" 는 시즌 등에 따라 규정된 서브틸라제이다 [Siezen et al., Protein Engineering 4:719-737 (1991)]. 모 서브틸라제는 또한 서브틸라제의 특성을 보유하면서 계속해서 변형이 이루어진 천연 공급원으로부터 단리된 서브틸라제일 수도 있다.

또는 달리, 용어 "모 서브틸라제" 는 "야생형 서브틸라제" 로도 명명될 수 있다.

서브틸라제 변이체의 변형(들)

본원에서 논의되는 바와 같은 서브틸라제 변이체의 변형(들)과 관련하여 사용된 용어 "변형(들)"은 유전자 조작뿐만 아니라 화학적인 변형까지도 포함하는 것으로 의도된다. 변형(들)은 관심의 아미노산(들)내에서의 또는 그것(들)의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의한 것일 수 있다.

서브틸라제 변이체

본 발명과 관련하여, 용어 서브틸라제 변이체 또는 돌연변이된 서브틸라제는 원래의 또는 모 유전자를 가지고 있고 상응하는 모 효소를 생성하는 모 미생물로부터 유도된 돌연변이 유전자를 발현하는 유기체에 의하여 생성되는 서브틸라제를 의 미하며, 모 유전자는 적당한 숙주에서 발현되었을 때 그것으로부터 상기 돌연변이된 서브틸라제 프로테아제가 생성되는 돌연변이 유전자를 생성하기 위하여 돌연변이되었다.

상동성 서브틸라제 서열

서브틸라제 SAVINASE

의 특정한 활성 부위 루프 영역, 및 상기 루프내의 아미노산 삽입이, 본 발명의 서브틸라제 변이체를 얻기 위한 본원에서의 변형을 위하여 확인되었다.

그러나, 본 발명은 이러한 특정한 서브틸라제의 변형에만 한정되는 것이 아니라, SAVINASE

의 일차 구조와 상동하는 일차 구조를 가지고 있는 다른 모 (야생형) 서브틸라제에도 연장된다.

본 발명의 범주내에서 다른 상동하는 서브틸라제를 확인하기 위하여, 앞서 배열된 서브틸라제의 군에 대비한 상기 서브틸라제(들)의 배열이 선행된 배열을 일정하게 유지하면서 수행된다. 서브틸라제의 18 개의 고도로 보존된 잔기에 대한 비교가 이루어진다. 18 개의 고도로 보존된 잔기들을 하기 표 1 에 나타낸다 (시즌 등의 문헌 참조).

서브틸라제의 18 개의 고도로 보존된 잔기

위 치	보존된 잔기
23	G
32	D
34	G
39	H
64	H
65	G
66	T
70	G
83	G
125	S
127	G
146	G
154	G
155	N
219	G
220	T
221	S
225	P

배열을 유지하기 위하여 필요한 삽입 및 결실이 허용된 배열후에, 적당한 상동성 활성 부위 루프 영역이 확인된다. 상기 상동성 잔기들은 그런 다음 본 발명에 따라 변형될 수 있다.

CLUSTALW (버젼 1.7, 1997. 6.) 컴퓨터 배열 프로그램 (Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680) 및 디폴트 배열 파라메터를 사용하여, 기존의 배열된 서브틸라제의 군에 대한 주어진 서브틸라제의 배열이 프로그램의 프로필 배열 옵션을 사용하여 이루어진다. 본 발명의 범주내에 있을 주어진 서브틸라제에 대하여, 18 개의 고도로 보존된 잔기가 바람직하게는 100 % 보존되어야 한다. 그러나, 18 개의 잔기중 17 개 또는 그 이상, 또는 상기 보존된 잔기중 16 개의 배열이 또한 상동성 잔기를 확인하기에 적당하다. 서브틸라제에서, 촉매작용 트리애드 Asp32/His64/Ser221 의 보존은 유지되 어야 한다.

규정된 바와 같은 10 개의 서브틸라제의 배열이 도 1 에 도시된다.

나아가 본 발명의 범주내에 있는 상동하는 모 (야생형) 서브틸라제를 확인하기 위한 상기의 과정에서, 상기의 18 개의 보존된 잔기들은 상기 상동하는 모 서브틸라제의 모 (야생형) 일차 서열과 관련된다. 달리 표현하면, 만약 모 서브틸라제가 상기의 18 개의 보존된 잔기들중 어느 곳에서든지 변형되었다면, 그것은 상기 18 개의 보존된 잔기들중의 원래의 모 야생형 서열이고, 원래의 모 서브틸라제와 상기 18 개의 보존된 잔기들중 어느 곳에서든지 변형된 상기 모 서브틸라제의 가능한 변이체중 어느 것이 본 발명의 범주내에 속하는 상동하는 서브틸라제인지 결정할 수 있게 한다.

이러한 설명을 토대로 당업자에게는 적당한 상동성 서브틸라제와, 본 발명에 따라 변형될 수 있는 상응하는 상동성 활성 부위 루프 영역을 확인하는 것이 기본적인 것이다.

세척 성능

예컨대 세척중에 세정될 물체상에 존재하는 다양한 자연 발생적인 기질의 분해를 촉매하는 효소의 능력은 때로 그것의 세척 능력, 세척-능, 세척성, 또는 세척 성능으로 언급된다. 본 명세서를 통털어서 용어 세척 성능은 이런 성질을 포함하는 것으로 사용될 것이다.

단리된 DNA 서열

용어 "단리된" 은 DNA 서열 분자에 적용될 때, DNA 서열이 그것의 천연 유전 적 환경으로부터 제거되었고 그로써 다른 외인성 또는 원하지 않는 코딩 서열이 없으며, 유전적으로 공학 제조된 단백질 제조 시스템내에서 사용하기에 적당한 형태로 존재하는 것을 의미한다. 그러한 단리된 분자들은 그것들의 천연 환경으로부터 분리된 것들이며, cDNA 및 게놈성 클론을 포함한다. 본 발명의 단리된 DNA 분자들은 그것들이 통상적으로 결합하는 다른 유전자들이 없지만, 자연적으로 발생하는 5' 및 3' 미번역 영역, 예컨대 프로모터 및 터미네이터를 포함할 수도 있다. 관련된 영역들의 확인은 당업자에게는 명백한 과정일 것이다 (Dynan and Tijan, Nature 316:774-778, 1985). 용어 "단리된 DNA 서열" 은 다르게는 "클론된 DNA 서열" 로도 교체사용될 수 있다.

단리된 단백질

단백질에 적용될 때 용어 "단리된"은 단백질이 그것의 천연 환경이 아닌 조건에서 발견되는 것을 의미한다. 바람직한 형태로, 단리된 단백질은 실질적으로 다른 단백질, 특히 다른 동종성 단백질 (즉 "동종성 불순물" (하기 설명 참조))이 없다. 단리된 단백질은 SDS-PAGE 에 의해 측정되는 바, 10 % 이상, 바람직하게는 20 % 이상, 보다 바람직하게는 30 % 이상 순수하다. 나아가, 단백질은 고도로 정제된 형태, 즉 SDS-PAGE 에 의해 측정되는 바, 40 % 이상, 60 % 이상, 80 % 이상, 보다 바람직하게는 95 % 이상, 더욱 바람직하게는 99 % 이상 순수한 형태로 제공되는 것이 바람직하다.

용어 "단리된 단백질" 은 "정제된 단백질" 이라는 용어로 교체 사용될 수도 있다.

동종성 불순물

용어 "동종성 불순물" 은 본 발명의 폴리펩티드가 원래 얻어지는 동종성 세포로부터 기원하는 어떠한 불순물 (예컨대 본 발명의 폴리펩티드 이외의 다른 폴리펩티드)을 의미한다.

으로부터 얻어지는

본원에서 특정 미생물 공급원과 관련하여 사용되는 용어 "으로부터 얻어지는" 은 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드가 특이한 공급원에 의해, 또는 그 안에 공급원으로부터의 유전자가 삽입되어 있는 세포에 의해 생성되는 것을 의미한다.

기질

프로테아제에 대한 기질과 관련하여 사용된 용어 "기질"은 프로테아제에 의해 가수분해되기 쉬운 펩티드 결합을 최소한 하나 함유하고 있는 화합물을 포함하는 것과 같이 가장 광범위한 의미로 설명되어져야 한다.

생성물

본 발명의 내용에서 프로테아제 효소 반응으로부터 유도되는 생성물과 관련하여 사용된 용어 "생성물" 은 서브틸라제 프로테아제를 포함하는 가수분해 반응의 생성물을 포함하는 것으로 설명되어져야 한다. 생성물은 후속적인 가수분해 반응에서 기질로서 사용될 수 있다.

도 1 은 서브틸라제의 상기 언급된 18 개의 고도로 보존된 잔기에 대해 배열 된, 10 개의 상동하는 서브틸라제의 배열을 도시한다. 18 개의 고도로 보존된 잔기들은 진하게 강조된다. JP170 을 제외한 모든 도시된 서브틸라제들은 상기 보존된 잔기들에서 100 % 의 동일성을 가지고 있다. JP170 은 보존된 글리신 잔기 "G" 대신에 위치 146 에서 아스파라긴 "N" 을 가지고 있다.

도 2 는 도 1 에 도시된 배열을 사용하여 본 발명의 3 개의 사비나제 변이체를 배열시킨 도면이다. 변이체 37.03, 37.04 및 37.06 의 각각은 도 1 의 배열을 이용하여 개별적으로 배열된다. 모든 세 개의 변이체들을 간결하게 하기 위하여 한 도면에 도시한다.

도 3 은 사비나제의 삼-차원 구조를 도시한다 (단백질 데이터 뱅크 (PDB) 엔트리 1SVN). 이 도면에서 본원의 관심의 활성 부위 루프가 표시된다.

세척 성능이 개선된 서브틸라제 효소

본 발명의 서브틸라제는 일반적으로 앞서 "발명의 개요" 단원에서 설명되었다.

본 발명의 첫 번째 측면의 서브틸라제는 자연에서 확인되는 모 야생형 서브틸라제일 수 있다.

그러한 모 야생형 서브틸라제는 당해 기술분야에 공지되어 있는 표준 기법에 의하여 특이적으로 스크린될 수 있다.

이것을 행하는 한 가지 바람직한 방법은 수많은 상이한 미생물, 바람직하게는 상이한 바실루스 스트레인으로부터 얻어지는 서브틸라제의 활성 부위 루프를 코 드화하는 것으로 알려져 있는 DNA 영역을 특이적으로 PCR 에 의하여 증폭시키는 것일 수 있다.

서브틸라제는 보존된 효소들의 한 군으로, 센스 가닥에서는 그것들의 DNA 와 아미노산 서열이 상동한다. 따라서, 활성 부위 루프의 양 옆의 상대적으로 특이한 프라이머를 제조하는 것이 가능하다.

예컨대 상이한 서브틸라제들의 배열을 연구조사함으로써 (예컨대 Siezen et al., Protein Science 6:501-523 (1997)), 예를 들면 BLSAVI 의 아미노산 잔기 95 와 103 사이에 있는 활성 부위 루프에 상응하는 활성 부위 양 옆에 있는 PCR 프라이머를 제조하는 것이 당업자에게는 기본적인 일이 되었다. 그러한 PCR 프라이머를 사용하여 많은 상이한 미생물, 바람직하게는 상이한 바실루스 스트레인으로부터 얻어지는 DNA 를 증폭시키고, 이어서 상기 증폭된 PCR 단편을 DNA 서열화함으로써, BLSAVI 와 비교하여 더 긴, BLSAVI 의 95 내지 103 의 활성 부위 영역에 상응하는 활성 부위 영역을 포함하는 서브틸라제를 생성하는 그러한 스트레인을 확인하는 것이 가능할 것이다. 확인된 스트레인 및 그러한 관심의 서브틸라제에 대한 부분적인 DNA 서열을 가지면, 당업자에게는 관심의 그러한 서브틸라제의 클로닝, 발현 및 정제를 완성하는 것이 기본적인 일이 된다.

그러나, 본 발명의 서브틸라제 효소는 우선적으로 모 서브틸라제의 변이체인 것으로 고려된다.

따라서, 본 발명의 구체예는 본 발명의 첫 번째 측면에 따르는 단리된 서브틸라제 효소에 관한 것으로, 상기 서브틸라제 효소는 제조된 변이체이고, 상기 변 이체는 본 발명의 첫 번째 측면에 따르는 활성 부위 루프들 중 최소한 하나에 최소한 하나의 아미노산의 최소한 하나의 삽입을 포함하고 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 서브틸라제 효소는 BLSAVI (사비나제

)와 비교하여 세제에 사용할 때, 개선된 세척 성능을 나타낸다. 상이한 상업용 서브틸라제 프로테아제 제품들은 상이한 종류의 세제 조성물에서 상이한 세척 성능을 나타낼 것이다. 본 발명의 서브틸라제는 대부분의 상이한 종류의 세제 조성물중에서, BLSAVI 와 비교하여 개선된 세척 성능을 나타낸다.

바람직하게는 본 발명의 서브틸라제 효소는 하기의 실시예 3 에서 나타낸 세제 조성물중에서, BLSAVI 와 비교하여 개선된 세척 성능을 나타낸다 (하기 참조).

주어진 서브틸라제 아미노산 서열 (이 서브틸라제 서열이 천연으로부터 단리된 야생형 서브틸라제 서열인지 또는 서브틸라제 변이체 서열인지에 관계없이)이 본 발명의 서브틸라제 서열의 범주내에 있는 지의 여부를 확인하기 위하여, 다음의 단계들이 수행될 수 있다:

i) 상기의 서브틸라제 서열이 서브틸라제 BLSAVI 의 위치 1 에서 275 (BASBPN 의 넘버링 사용)까지의 아미노산 서열과 최소한 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 또는 심지어 95 % 동일한 지를 확인한다;

ii) 만약 단계 i) 이 만족되면, 도 1 에 특정된 기존에 규정되어 있는 서브틸라제의 배열에 대하여 상기 서브틸라제 서열의 배열을 수행한다 (이 배열이 어떻게 바람직하게 수행되어야 하는지에 대해서는 상기의 "정의" 단원을 참조한다);

iii) 상기 ii) 단계에서 수행된 배열을 토대로, BLSAVI 의 활성 부위 루프 영역에 상응하는, 상기 서브틸라제 서열에서의 활성 부위 루프를 확인한다, 여기서 상기 활성 부위 루프는 다음과 같이 특정된다 (BASBPN 넘버링 사용):

(a) 아미노산 잔기 33 에서 43 사이의 영역 (양 끝의 아미노산 포함);

(b) 아미노산 잔기 95 에서 103 사이의 영역 (양 끝의 아미노산 포함);

(c) 아미노산 잔기 125 에서 132 사이의 영역 (양 끝의 아미노산 포함);

(d) 아미노산 잔기 153 에서 173 사이의 영역 (양 끝의 아미노산 포함);

(e) 아미노산 잔기 181 에서 195 사이의 영역 (양 끝의 아미노산 포함);

(f) 아미노산 잔기 202 에서 204 사이의 영역 (양 끝의 아미노산 포함); 및

(g) 아미노산 잔기 218 에서 219 사이의 영역 (양 끝의 아미노산 포함);

iv) 단계 iii) 에서 확인된, 상기 서브틸라제 서열의 하나 또는 둘 이상의 활성 부위 루프가 BLSAVI 에서의 상응하는 활성 부위 루프보다 더 긴지를 확인하다.

만약 상기 단계 iv) 에서의 기준이 만족되면, 주어진 서브틸라제 서열은 본 발명의 범주내에 있는 서브틸라제 서열이다.

본 발명의 서브틸라제와 BLSAVI 사이의 상기 단계 i) 에서 특정된 동일성은 바로 아래에서 설명되는 바와 같이 계산된다.

본 발명의 서브틸라제의 아미노산 서열의 BLSAVI 에 대한 동일성

상기에서 언급된 폴리펩티드 동일성은 두 번째 서열로부터 첫 번째 서열의 유도를 나타내는 두 개의 서열 사이의 동일성의 정도로서 측정된다. 동일성은 당 해 기술분야에서 GCG 프로그램 팩키지에서 제공된 GAP 과 같은 컴퓨터 프로그램에 의하여 적절하게 측정될 수 있다 (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). 폴리펩티드 서열 비교를 위한 다음의 세팅: 3.0 의 GAP 크리에이션 페널티 및 0.1 의 GAP 연장 페널티와 함께 GAP를 사용하여, 본 발명의 서브틸라제 아미노산 서열의 성숙한 부분은 BLSAVI 의 위치 1 에서 275 (BASBPN 넘버링)까지의 아미노산 서열의 성숙한 부분과 최소한 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 또는 심지어 95 % 의 동일성 정도를 나타낸다. 따라서, 동일성은 269 (BLSAVI 의 성숙한 부분은 269 개의 아미노산을 가지고 있다)로 나눈 동일한 잔기의 수로서 규정될 것이다.

상기 단계 ii) 에서 수행될 배열은 아래에서 설명되는 바와 같이 수행된다:

상동하는 서브틸라제 서열의 기존의 규정된 배열에 대한 본 발명의 서브틸라제 아미노산의 배열 (상기 단계 ii)), 및 BLSAVI 의 활성 부위 루프 영역과 상응하는 상기 서브틸라제에서의 서브틸라제 상동성 활성 부위 루프의 확인 (상기 단계 iii))

본 발명의 범주내에 있는 다른 상동하는 서브틸라제를 확인하기 위하여, 기존에 배열된 서브틸라제 군에 대한 상기 서브틸라제(들)의 배열을, 기존의 배열을 일정하게 유지시키면서 수행한다 (상기 단계 ii)).

CLUSTALW (버젼 1.7, 1997. 6.) 컴퓨터 배열 프로그램 (Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680) 및 디폴트 배열 파라메터를 사용하여, 기존의 배열된 서브틸라제의 군에 대한 주어진 서브틸라제의 배열이 프로그램의 프로필 배열 옵션을 사용하여 이루어진다. 서브틸라제에서, 촉매작용 트리애드 Asp32/His64/Ser221 의 보존은 유지되어야 한다.

서브틸라제 군의 상기 규정된 배열을 도 1 에 도시된다.

배열을 유지하기 위하여 필요한 삽입 및 결실이 허용되는 배열후에, 본 발명의 상기 서브틸라제에서 적당한 상동성 활성 부위 루프는 상기 단계 iii) 에서 설명된 것과 같이 확인된다.

상기 설명을 토대로, 당업자에게는 상기 서브틸라제에서, 적절한 상동성 서브틸라제와 상응하는 적당한 상동성 활성 부위 루프를 확인하는 것이 기본적인 것이 된다.

설명된 바와 같은 본 발명의 서브틸라제의 바람직한 활성 부위 루프는 하기의 것으로 규정되는 루프이다:

(b) 아미노산 잔기 95 와 103 사이의 영역 (양 끝의 아미노산도 포함됨)은 최소한 10 아미노산 길이이다 (즉 BLSAVI 와 비교하여 최소한 하나의 아미노산이 삽입됨); 및

(c) 아미노산 잔기 125 와 132 사이의 영역 (양 끝의 아미노산도 포함됨)은 최소한 9 아미노산 길이이다 (즉 BLSAVI 와 비교하여 최소한 하나의 아미노산이 삽입됨).

서브틸라제 변이체는 부위-특정된/무작위 돌연변이생성에 의해 또는 상이한 서브틸라제 서열의 DNA 셔플링에 의한 것과 같은 당해 기술분야에 공지되어 있는 표준 기법들에 의하여 제조될 수 있다. 보다 상세한 설명은 하기의 "서브틸라제 변이체의 제조" 및 재료 및 방법 단원 참조.

추가의 구체예에서, 본 발명은 다음에 관한 것이다:

1. 본 발명에 따르는 단리된 서브틸라제 효소, 이 때 상기 삽입된 아미노산 잔기중 최소한 하나는 T, G, A 및 S 로 이루어지는 군으로부터 선택된다;

2. 본 발명에 따르는 단리된 서브틸라제 효소, 이 때 상기 삽입된 아미노산 잔기중 최소한 하나는 D, E, H, K 및 R, 보다 바람직하게는 D, E, K 및 R 로 이루어지는 하전된 아미노산 잔기 군으로부터 선택된다;

3. 본 발명에 따르는 단리된 서브틸라제 효소, 이 때 상기 삽입된 아미노산 잔기중 최소한 하나는 C, N, Q, S 및 T, 보다 바람직하게는 N, Q, S 및 T 로 이루어지는 친수성 아미노산 잔기 군으로부터 선택된다;

4. 본 발명에 따르는 단리된 서브틸라제 효소, 이 때 상기 삽입된 아미노산 잔기중 최소한 하나는 A, G 및 V 로 이루어지는 작은 소수성 아미노산 잔기 군으로부터 선택된다; 또는

5. 본 발명에 따르는 단리된 서브틸라제 효소, 이 때 상기 삽입된 아미노산 잔기중 최소한 하나는 F, I, L, M, P, W 및 Y, 보다 바람직하게는 F, I, L, M 및 Y 로 이루어지는 큰 친수성 아미노산 잔기 군으로부터 선택된다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 활성 부위 루프중 최소한 하나에서의 상기 삽입이 BLSAVI 의 상응하는 활성 부위 루프와 비교하여 최소한 두 개의 아미노산을 포함하는, 본 발명에 따르는 단리된 서브틸라제 효소에 관한 것이다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 서브틸라제 효소가

G97GASG;

G97GAA; 및

G97GAS (BASBPN 넘버링)로 이루어지는 군으로부터 선택된, 본 발명에 따르는 단리된 서브틸라제 효소 및 서브틸라제 효소가

37.03: G97GASG + A98S+S99G+G100A+S101A;

37.06: G97GAA + A98S+S99G+S101T; 및

37.04: G97GAS + A98S+S99G (BASBPN 넘버링)로 이루어지는 군으로부터 선택된, 최소한 하나의 삽입/변형을 포함하고 있는, 본 발명에 따르는 단리된 서브틸라제 효소에 관한 것이다.

세 개의 후자의 변이체의 잔기 91 에서 107 까지의 배열은 도 2 에 도시된다.

유사한 보존성 아미노산에 대한 한 아미노산의 치환은 대부분 효소의 특징에 거의 변화를 일으키지 않는다는 것이 당업계에는 잘 알려져 있다.

하기의 표 2 는 보존성 아미노산 그룹을 열거한 것이다.

보존성 아미노산 치환

염기성	R = 아르기닌 K = 라이신 H = 히스티딘
산성	E = 글루탐산 D = 아스파르트산
극성	Q = 글루타민 N = 아스파라긴
소수성	L = 로이신 I = 이소로이신 V = 발린 M = 메티오닌
방향성	F = 페닐알라닌 W = 트립토판 Y = 티로신
작은 크기	G = 글리신 A = 알라닌 S = 세린 T = 트레오닌

따라서, G97GGG+A98S+S99G 와 같은 서브틸라제 변이체는 변이체 G97GAA+A98S+S99G 와 유사한 개선된 세척-성능을 나타낼 것으로 예상된다. 예컨대 상기 G97GAA+A98S+S99G 변이체의 특이한 세척 성능 시험에 대한 하기의 실시예 참조.

상기의 설명 및 특히 본원에서 예시된 서브틸라제 변이체를 토대로, 당업자에게는, 특히 상기 예시된 변이체들의 추가의 적절한 보존성 변형(들)을, 본 발명의 모든 측면 및 구체예에 따라 개선된 세척 성능을 가지고 있는 서브틸라제 변이체를 얻기 위하여 확인하는 것은 기본적인 작업이다.

본 발명의 구체예에서, 관심의 서브틸라제들은 바람직하게도 하위군 I-S1 및 I-S2 에 속하는 것들이다.

하위군 I-S1 과 관련하여, 바람직한 모 서브틸라제는 ABSS168, BASBPN, BSSDY, 및 BLSCAR 또는 하위군 I-S1 의 특성이 보유된 그것의 기능적 변이체들로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

하위군 I-S2 에 관하여는, 바람직한 모 서브틸라제는 BLS147, BLSAVI, BLS309, BAPB92, TVTHER 및 BYSYAB 또는 하위군 I-S2 의 특성이 보유된 그것의 기능적 변이체들로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

특히, 상기 모 서브틸라제는 BLSAVI (SAVINASE

, NOVO NORDISK A/S) 또는 그것에 대하여 95 % 이상의 동일성을 가지고 있는 서브틸라제이며, 따라서 본 발명의 바람직한 서브틸라제 변이체는 SAVINASE

의 변이체 또는 그것에 대하여 95 % 이상의 동일성을 가지고 있는 서브틸라제이다.

본 발명은 또한 모 효소의 아미노산 서열에 대한 어떠한 다른 변형과 함께 상기 언급된 위치에서의 어떠한 하나 또는 둘 이상의 변형을 포함한다. 특히 효소에 개선된 성질을 제공하는 것으로 당업계에 알려져 있는 다른 변형과의 조합이 예상된다. 당해 기술분야에는 상이한 개선된 성질을 가지고 있는 많은 서브틸라제 변이체들이 설명되어 있고, 상기의 "발명의 배경" 단원에서 그러한 것들이 많이 언급되었다. 그러한 참조 효소들은 서브틸라제 변이체를 확인하기 위한 참조로서 개시된 것이며, 그것들은 유익하게도 본 발명의 서브틸라제 변이체와 조합될 수 있다.

그러한 조합은 위치: 222 (산화 안정성을 개선시킨다), 218 (열 안정성을 개선시킨다), 효소를 안정시키는 Ca-결합 부위, 예컨대 위치 76 에서의 치환, 및 당해 기술분야로부터 드러나는 많은 다른 것들을 포함한다.

추가의 구체예에서, 본 발명의 서브틸라제 변이체는 유익하게도 다음의 위치중 어느 곳에서의 하나 또는 둘 이상의 변형(들)과 조합될 수 있다: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 206, 218, 222, 224, 235 및 274.

특이적으로, 다음의 BLS309 와 BAPB92 변이체들이 조합용으로 적당한 것으로 간주된다: K27R, ^*36D, S57P, N76D, S87N, G97N, S101G, S103A, V104A, V104I, V104N, V104Y, H120D, N123S, Y167, R170, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L 및 T274A.

나아가, 변이체 S101G+V104N, S87N+S101G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A, N76D+S103A+V104I 또는 N76D+V104A 중 어느 것 또는 이들 돌연변이들 (V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A)의 다른 조합을, 상기 언급된 변형(들)중 어느 하나 또는 둘 이상과 조합하여 포함하는 변이체들이 개선된 성질을 나타낸다.

또한 본 발명의 주요 측면(들)의 서브틸라제 변이체들은 바람직하게도 위치 129, 131, 133 및 194 중 어느 한 위치에서의 하나 또는 둘 이상의 변형(들), 바람직하게는 129K, 131H, 133P, 133D 및 194P 변형, 보다 바람직하게는 P129K, P131H, A133P, A133D 및 A194P 변형과 조합된다. 상기 변형(들)중 어느 것은 본 발명의 서브틸라제 변이체의 보다 높은 발현 수준을 제공한다.

따라서, 본 발명의 추가의 구체예는 발명에 따르는 변이체에 관한 것으로, 상기 변형은 하기의 변형으로 이루어지는 군으로부터 선택된다:

Y167A+R170S+A194P

Y167A+R170L+A194P

Y167A+R170N+A194P

Y167A+R170S+P129K

Y167A+R170L+P129K

Y167A+R170N+P129K

Y167A+R170S+P131H

Y167A+R170L+P131H

Y167A+R170N+P131H

Y167A+R170S+A133P

Y167A+R170L+A133P

Y167A+R170N+A133P

Y167A+R170S+A133D

Y167A+R170L+A133D

Y167A+R170N+A133D

서브틸라제 변이체의 제조

본 발명의 서브틸라제를 클로닝하고 유전자 (예컨대 서브틸라제 유전자) 안에 삽입을 도입시키기 위한 많은 방법들이 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.

유전자를 클로닝하고 상기 유전자안에 삽입 (무작위 및/또는 부위 특정된)을 도입시키기 위한 일반적인 표준 과정이 본 발명의 서브틸라제 변이체를 얻기 위하 여 사용될 수 있다 (하기의 실시예 및 Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al., (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990; 및 WO 96/34946 참조).

나아가 본 발명의 서브틸라제 변이체는 상이한 서브틸라제 유전자들의 DNA 셔플링의 표준 기법에 의하여 제조될 수 있다 (WO 95/22625; Stemmer WPC, Nature 370:389-391 (1994)). 사비나제

활성 부위 루프 영역보다 더 긴 서열을 포함하기 위하여 자연에서 확인된 하나 또는 둘 이상의 부분적인 서브틸라제 서열을 사용하여 예컨대 사비나제

의 DNA 를 셔플링하는 것은, 개선된 세척 성능 변이체에 대한 후속되는 스크리닝후에, 본 발명에 따르는 서브틸라제 변이체를 제공할 것이다.

발현 벡터

본 발명의 효소를 코드화하는 DNA 구성물을 포함하는 재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 과정을 편리하게 수행받을 수 있는 어떠한 벡터일 수 있고, 벡터의 선택은 때로 그것이 도입될 숙주 세포에 좌우될 것이다. 그러므로, 벡터는 자동으로 복제하는 벡터, 즉, 염색체외적으로 존재하는 벡터이며, 그것의 복제는 염색체 복제와 무관한 것으로, 예컨대 플라스미드이다. 또는 달리, 벡터는 숙주 세포안에 도입되었을 때, 부분적으로 또는 전체적으로 숙주 세포 게놈안에 통합되고, 그것이 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 것일 수 있다.

벡터는 바람직하게는 본 발명의 효소를 코드화하는 DNA 서열이 DNA 의 전사에 필요한 추가의 절편에 작동가능하게 연결되어 있는 발현 벡터인 것이 좋다. 일반적으로, 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA 로부터 유도되며, 또는 둘 다에서 얻어지는 엘레먼트를 포함할 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된" 은 절편들이 그것들의 의도된 목적을 위해 조화롭게 기능하도록, 예컨대 전사는 프로모터에서 개시되고 효소를 코딩하는 DNA 서열을 통하여 진행되도록 배열되는 것을 가리킨다.

프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 어떠한 DNA 서열일 수 있으며, 숙주 세포에 동종이거나 또는 이종성인 단백질을 코드화하는 유전자로부터 유도될 수 있다.

박테리아 숙주 세포에 사용하기에 적당한 프로모터의 실예로는 바실루스 스테아로써모필루스 말토제닉 아밀라제 유전자의 프로모터, 바실루스 리케니포르미스 알파-아밀라제 유전자의 프로모터, 바실루스 아밀로리퀴에파시엔스 유전자의 프로모터, 바실루스 서브틸리스 알칼리성 프로테아제 유전자의 프로모터, 또는 바실루스 퓨밀루스 크실로시다제 유전자의 프로모터, 또는 파지 람다 P_R 또는 P_L 프로모터 또는 대장균 lac, trp 또는 tac 프로모터가 있다.

본 발명의 효소를 코드화하는 DNA 서열은 또한, 필요에 따라, 적당한 터미네이터에 작동가능하게 연결될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 나아가 의문의 대상인 숙주 세포에서 벡터가 복제 하는 것을 가능하게 하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.

벡터는 또한 선택가능한 마아커, 예컨대 그것의 생성물이 숙주 세포에서의 결핍을 상쇄할 수 있는 유전자, 또는 예컨대 카나마이신, 클로르암페니콜, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 스펙티노마이신 등과 같은 항생물질에 대한 내성을 코드화하는 유전자, 또는 중금속 또는 제초제에 대한 내성을 코드화하는 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명의 효소를 숙주 세포의 분비 경로에 특정하기 위하여, 분비 신호 서열 (리더 서열, 프레-프로 서열 또는 프레 서열로도 알려져 있음)이 재조합 벡터안에 제공될 수 있다. 분비 신호 서열은 정확한 리딩 프레임내에서 효소를 코드화하는 DNA 서열과 결합된다. 분비 신호 서열은 통상적으로 효소를 코드화하는 DNA 서열에 대하여 5' 쪽에 위치한다. 분비 신호 서열은 정상적으로는 효소와 결합할 수 있는 것이거나 또는 다른 분비된 단백질을 코드화하는 유전자로부터 유래될 수 있다.

본 발명의 효소를 코드하는 DNA 서열, 프로모터 및 임의로 터미네이터 및/또는 분비 신호 서열을 각각 결찰시키기 위하여 사용된 과정, 또는 이들 서열을 적당한 PCR 증폭 계획에 의하여 어셈블링하는 과정, 및 그것들을 복제 또는 통합에 필요한 정보를 함유하고 있는 적당한 벡터안에 삽입시키기 위한 과정은 당업자에게 잘 알려져 있다 (예컨대 Sambrook 등 참조).

숙주 세포

숙주 세포안에 도입된 본 발명의 효소를 코드화하는 DNA 서열은 관심의 숙주 에 대하여 동종성일 수도 있고 또는 이종성일 수도 있다. 만약 숙주 세포에 대하여 동종성이라면, 즉 자연적으로 숙주 세포에 의하여 생성된다면, 그것은 전형적으로 다른 프로모터 서열 또는, 필요에 따라, 그것의 자연적인 환경 이외의 분비 신호 서열 및/또는 터미네이터 서열에 작동가능하게 연결된 것일 것이다. 용어 "동종성의" 는 관심의 숙주 유기체에 대하여 천연적인 효소를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "이종성의" 는 자연적인 숙주 세포에 의해 발현되지 않은 DNA 서열을 포함하는 것으로 의도된다. 그러므로, DNA 서열은 다른 유기체로부터 유래될 수도 있고, 또는 합성 서열일 수도 있다.

그 안으로 본 발명의 DNA 구성물 또는 재조합 벡터가 도입되는 숙주 세포는 본 발명의 효소를 생성할 수 있는 것이면 어떠한 세포든지 좋으며, 실예로 박테리아, 효모, 진균 및 고등 진핵 세포를 들 수 있다.

배양시 본 발명의 효소룰 생성할 수 있는 박테리아 숙주 세포의 실예로는 바실루스 스트레인과 같은 그람-포지티브 박테리아, 예컨대 바실루스 서브틸리스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 렌투스, 바실루스 브레비스, 바실루스 스테아로써모필루스, 바실루스 알칼로필루스, 바실루스 아밀로리퀴에파시엔스, 바실루스 코아귤란스, 바실루스 써큘란스, 바실루스 라우투스, 바실루스 메가테리움 또는 바실루스 튜링기엔시스, 또는 스트렙토마이세스 리비단스 또는 스트렙토마이세스 뮤리누스와 같은 스트렙토마이세스 스트레인, 또는 대장균과 같은 그람-네가티브 박테리아가 있다. 박테리아의 형질전환은 원형질체 형질전환, 일렉트로포레이션, 포합에 의하여, 또는 공지된 방법 그 자체로 경합 세포를 사용함에 의해 이루어질 수 있다 (Sambrook 등의 문헌 참조).

대장균과 같은 박테리아에서 효소를 발현시킬 때는, 효소는 세포질에 전형적으로 불용성 과립 (봉입체로서 알려져 있음)으로서 보유될 수 있거나, 또는 박테리아 분비 서열에 의하여 말단 영역에 특정될 수 있다. 전자의 경우에, 세포는 용해되고 과립이 회수되며 변성된 후에 변성제의 희석에 의하여 효소가 다시 접혀진다. 후자의 경우에는, 효소는 세포를 파괴함에 의해, 예컨대 초음파처리 또는 삼투 쇼크에 의하여 말단 영역의 내용물이 방출되고 효소가 회수됨에 의해, 말단 영역으로부터 회수될 수 있다.

효소가 바실루스 또는 스트렙토마이세스 스트레인과 같은 그람-포지티브 박테리아에서 발현될 때에는, 효소는 세포질에 보유될 수 있거나, 또는 박테리아 분비 서열에 의하여 세포외의 배지로 지정될 수도 있다. 후자의 경우에, 효소는 하기에서 설명되는 바와 같이 배지로부터 회수될 수 있다.

서브틸라제의 제조 방법

본 발명은 발명에 따르는 단리된 효소를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 효소를 코드화하는 DNA 서열로 형질전환되어 있는 적당한 숙주 세포가 효소의 생성을 허용하는 조건하에서 배양되고, 그 결과 생성된 효소가 배양물로부터 회수되는 것으로 이루어진다.

효소를 코드화하는 DNA 서열을 포함하고 있는 발현 벡터가 이종성 숙주 세포안에 형질전환된 때에는, 본 발명의 효소의 이종성 재조합 제조가 가능하다.

그로써, 동종성 불순물이 없는 것을 특징으로 하는, 고도로 정제된 서브틸라 제 조성물을 제조하는 것이 가능하다.

본 명세서에서, 동종성 불순물은 본 발명의 효소가 원래부터 얻어지는 동종성 세포로부터 기원하는 어떠한 불순물 (예컨대 본 발명의 효소 이외의 다른 폴리펩티드)을 의미한다.

형질전환된 숙주 세포를 배양하기 위하여 사용된 배지는 관심의 숙주 세포를 성장시키기에 적당한 종래의 어떤 배지일 수 있다. 발현된 서브틸라제는 편리하게도 배양 배지로 분비될 수 있고, 세포를 원심분리 또는 여과에 의하여 배지로부터 분리하고, 배지의 단백질성 성분을 암모늄 술페이트와 같은 염에 의하여 침전시킨 후, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로모토그래피 등과 같은 크로마토그래피 과정을 포함하는 잘 알려져 있는 과정에 의하여, 배양 배지로부터 회수될 수 있다.

본 발명의 서브틸라제 변이체의 용도

본 발명의 서브틸라제 프로테아제는 많은 산업적 적용, 특히 세제 산업분야에서 사용될 수 있다.

나아가 본 발명은 본 발명의 서브틸라제 변이체를 포함하는 효소 조성물에 관한 것이다.

바람직한 산업적 적용 및 상응하는 바람직한 효소 조성물에 대한 개요는 하기에서 설명된다.

이러한 개요는 어떤 방식으로든 본 발명의 서브틸라제 변이체의 적당한 적용을 완전하게 열거해 보이지는 못한다. 본 발명의 서브틸라제 변이체들은 프로테아제, 특히 서브틸라제의 용도를 포함하는 것으로 당업계에 알려져 있는 다른 산업적 인 적용에서도 사용될 수 있다.

돌연변이 효소를 포함하는 세제 조성물 :

본 발명은 클리닝 및 세제 조성물에서의 본 발명의 돌연변이 효소의 사용을 포함하며, 그러한 조성물은 돌연변이 서브틸리신 효소를 포함하고 있다. 그러한 클리닝 및 세제 조성물은 당해 기술분야에서 잘 설명되어 있다 (예컨대 WO 96/34946; WO 97/07202; WO 95/30011 참조).

또한 본 발명의 많은 서브틸라제 변이체들에 대한 세척 성능 개선을 나타내는 실시예(들)이 하기에서 제시된다.

세제 개시 및 실시예

계면활성제 시스템

본 발명에 따르는 세제 조성물은 계면활성제 시스템을 포함하는데, 계면활성제는 비이온성 및/또는 음이온성 및/또는 양이온성 및/또는 암폴리틱 (ampholytic) 및/또는 쯔비터이온성 및/또는 반-극성 계면활성제로부터 선택될 수 있다.

계면활성제는 전형적으로 0.1 내지 60 중량 % 의 수준으로 존재한다.

계면활성제는 바람직하게는 조성물중에 존재하는 효소 성분과 부합할 수 있도록 제형된다. 액체 또는 겔성 조성물에서 계면활성제는 가장 바람직하게는 그것이 이들 조성물중의 어떠한 효소의 안정성을 촉진하도록, 또는 최소한 효소 안정성을 분해하지 않도록 제형된다.

본 발명에 따라 사용될 바람직한 시스템은 계면활성제로서 본원에서 기술된 비이온성 및/또는 음이온성 계면활성제를 하나 또는 둘 이상 포함한다.

알킬 페놀의 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 및 폴리부틸렌 옥사이드 축합물이 본 발명의 계면활성제 시스템의 비이온성 계면활성제로서 사용하기에 적당하며, 폴리에틸렌 옥사이드 축합물이 가장 바람직하다. 이들 화합물들은 직쇄 또는 분기된 사슬 형태중 어느 형태에든지 약 6 내지 약 14 개의 탄소 원자, 바람직하게는 약 8 내지 약 14 개의 탄소 원자를 함유하고 있는 알킬기를 가지고 있는 알킬 페놀과 알킬렌 옥사이드와의 축합 생성물을 포함하고 있다. 바람직한 구체예에서, 에틸렌 옥사이드는 알킬 페놀의 몰 당 약 2 내지 약 25 몰, 보다 바람직하게는 약 3 내지 약 15 몰의 에틸렌 옥사이드의 양으로 존재한다. 이런 유형의 상업적으로 활용가능한 비이온성 계면활성제로는 GAF 코포레이션사에서 시판하는 Igepal^TM CO-630, 롬 앤드 하스 컴패니에서 시판하는 트리톤^TM X-45, X-114, X-100 및 X-102 가 있다. 이들 계면활성제는 통상적으로 알킬페놀 알콕실레이트 (예컨대 알킬 페놀 에톡실레이트)로서 언급된다.

약 1 내지 약 25 몰의 에틸렌 옥사이드와 일차 및 이차 지방족 알코올과의 축합 생성물이 본 발명의 비이온성 계면활성제 시스템의 비이온성 계면활성제로서 사용되기에 적당하다. 지방족 알코올의 알킬 사슬은 직쇄이거나 또는 분기된 일차 또는 이차 알코올이며, 일반적으로 약 8 내지 약 22 개의 탄소 원자를 함유하고 있다. 바람직한 것은 약 8 내지 약 20 개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 18 개의 탄소 원자를 함유하고 있는 알킬기를 가지고 있는 알코올과, 알코올의 몰 당 약 2 내지 약 10 몰의 에틸렌 옥사이드와의 축합 생성물이다. 알코올의 몰 당 약 2 내지 약 7 몰의 에틸렌 옥사이드, 가장 바람직하게는 약 2 내지 약 5 몰의 에틸렌 옥사이드가 상기 축합 생성물에 존재한다. 이런 유형의 상업적으로 활용가능한 비이온성 계면활성제의 실예로는 Tergitol^TM 15-S-9 (C₁₁-C₁₅ 선형 알코올과 9 몰의 에틸렌 옥사이드와의 축합 생성물), Tergitol^TM 24-L-6 NMW (C₁₂-C₁₄ 일차 알코올과 좁은 분자량 분포도를 가지고 있는 6 몰의 에틸렌 옥사이드와의 축합 생성물) (이 두가지는 모두 유니온 카바이드 코포레이션에서 시판함); 쉘 케미칼 컴패니에서 시판하는 Neodol^TM 45-9 (C₁₄-C₁₅ 선형 알코올과 9 몰의 에틸렌 옥사이드와의 축합 생성물), Neodol^TM 23-3 (C₁₂-C₁₃ 선형 알코올과 3.0 몰의 에틸렌 옥사이드와의 축합 생성물), Neodol^TM 45-7 (C₁₄-C₁₅ 선형 알코올과 7 몰의 에틸렌 옥사이드와의 축합 생성물), Neodol^TM 45-5 (C₁₄-C₁₅ 선형 알코올과 5 몰의 에틸렌 옥사이드와의 축합 생성물), 프록터 앤드 갬블 컴패니에서 시판하는 Kyro^TM EOB (C₁₃-C₁₅ 알코올과 9 몰의 에틸렌 옥사이드와의 축합 생성물), 획스트사 (Hoechst)에서 시판하는 Genapol LA 050 (C₁₂-C₁₄ 알코올과 5 몰의 에틸렌 옥사이드와의 축합 생성물)이 있다. 이들 생성물중의 바람직한 HLB 범위는 8 내지 11 이고, 가장 바람직한 범위는 8 내지 10 이다.

또한 본 발명의 계면활성제 시스템의 비이온성 계면활성제로서 유용한 것은 US 4,565,647 에서 개시된 알킬다당으로, 이것은 약 6 내지 약 30 개의 탄소 원자, 바람직하게는 약 10 내지 약 16 개의 탄소 원자와 다당, 예컨대 폴리글리코시드를 함유하고 있는 소수성기와, 약 1.3 내지 약 10, 바람직하게는 약 1.3 내지 약 3, 가장 바람직하게는 약 1.3 내지 약 2.7 의 당 유니트를 함유하고 있는 친수성 기를 가지고 있다. 5 또는 6 개의 탄소 원자를 함유하고 있는 어떠한 환원성 당, 예컨대 글루코스, 갈락토스 및 갈락토실 부분이 글루코실 부분에 대해 치환될 수 있다 (임의로 소수성 기는 2-, 3-, 4-, 등의 위치에 부착되며, 그로써 글루코시드 또는 갈락토시드에 대해 반대되는 글루코스 또는 갈락토스를 제공한다). 내부 당 결합은 예컨대 추가의 당 유니트중 하나와 선행하는 당 유니트의 2-, 3-, 4-, 및/또는 6- 위치 사이에 있을 수 있다.

바람직한 알킬폴리글리코시드는 다음 식을 갖는다:

R²O(C_nH_2nO)_t(글리코실)_x

상기 식에서, R² 는 알킬기가 약 10 내지 약 18, 바람직하게는 약 12 내지 약 14 개의 탄소 원자를 함유하고 있는 알킬, 알킬페닐, 히드록시알킬, 히드록시알킬페닐, 및 이것들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되고, n 은 2 또는 3, 바람직하게는 2 이며, t 는 0 내지 약 10, 바람직하게는 0 이고; x 는 약 1.3 내지 약 10, 바람직하게는 약 1.3 내지 약 3, 가장 바람직하게는 약 1.3 내지 약 2.7 이다. 글리코실은 글루코스로부터 유도되는 것이 바람직하다. 이들 화합물을 제조 하기 위하여, 알코올 또는 알킬폴리에톡시 알코올이 먼저 형성되고, 그런 다음 글루코스, 또는 글루코스의 공급원과 반응되어, 글루코시드가 형성된다 (1-위치에 부착됨). 그런 다음 추가의 글리코실 유니트가 그것들의 1-위치와 선행하는 글리코실 유니트의 2-, 3-, 4- 및/또는 6-위치, 바람직하게는 우선적으로 2-위치 사이에 부착될 수 있다.

에틸렌 옥사이드와, 프로필렌 옥사이드와 프로필렌 글리콜의 축합에 의해 형성된 소수성 염기와의 축합 생성물이 또한 본 발명의 추가의 비이온성 계면활성제 시스템으로서 사용되기에 적당하다. 이들 화합물의 소수성 부분은 바람직하게는 약 1500 내지 약 1800 의 분자량을 가질 것이며, 수불용성을 나타낼 것이다. 이런 소수성 부분에 폴리옥시에틸렌 부분을 첨가하는 것은 분자의 전체적인 수용성을 증가시키는 경향이 있고, 생성물의 액체 특성은 폴리옥시에틸렌 함량이, 에틸렌 옥사이드의 약 40 몰 까지와의 축합에 상응하는, 축합 생성물의 총 중량의 약 50 % 가 될 때까지 보유된다. 이런 유형의 화합물의 실예로는 BASF 사에서 시판하는 상업적으로 구입가능한 Pluronic^TM 계면활성제가 있다.

본 발명의 비이온성 계면활성제 시스템의 비이온성 계면활성제로서 사용하기에 또한 적당한 것은 에틸렌 옥사이드와, 프로필렌 옥사이드와 에틸렌디아민의 반응으로부터 생성된 생성물과의 축합 생성물이다. 이들 생성물의 소수성 부분은 에틸렌디아민과 초과량의 프로필렌 옥사이드와의 반응 생성물로 구성되고, 대체로 약 2500 내지 약 3000 의 분자량을 갖는다. 이 소수성 부분은 축합 생성물이 약 40 중량 % 내지 약 80 중량 % 의 폴리옥시에틸렌을 함유하고 약 5,000 내지 약 11,000 의 분자량을 가질 정도로 에틸렌 옥사이드와 축합된다. 이런 유형의 비이온성 계면활성제의 실예는 바스프사에서 시판하는 상업적으로 구입가능한 Tetronic^TM 화합물이다.

본 발명의 계면활성제 시스템의 비이온성 계면활성제로서 사용하기에 바람직한 것은 알킬 페놀의 폴리에틸렌 옥사이드 축합물, 일차 및 이차 지방족 알코올과 약 1 내지 약 25 몰의 에틸렌 옥사이드와의 축합 생성물, 알킬다당, 및 이것들의 혼합물이다. 가장 바람직한 것은 3 내지 15 개의 에톡시기를 가지고 있는 C₈-C₁₄ 알킬 페놀 에톡실레이트 및 2 내지 10 개의 에톡시기를 가지고 있는 C₈-C₁₈ 알코올 에톡실레이트 (바람직하게는 평균 C₁₀), 및 이것들의 혼합물이다. 매우 바람직한 비이온성 계면활성제는 하기 식의 폴리히드록시 지방산 아미드 계면활성제이다:

상기 식에서, R¹ 은 수소이거나, 또는 R¹ 은 C_1-4 히드로카르빌, 2-히드록시에틸, 2-히드록시프로필 또는 이것들의 혼합물이고, R² 는 C_5-31 히드로카르빌이며, Z 는 최소한 3 개의 히드록실기가 사슬에 직접 연결되어 있는 선형 히드로카르빌 사슬을 가지고 있는 폴리히드록시히드로카르빌, 또는 그것의 알콕실화된 유도체이다. 바람직하게는, R¹ 은 메틸이고, R² 는 코코넛 오일 또는 그것의 혼합물과 같은 직쇄 C_11-15 알킬 또는 C_16-18 알킬 또는 알케닐사슬 또는 그것의 혼합물이며, Z 는 환원성 아민화 반응에서 글루코스, 프룩토스, 말토스 또는 락토스와 같은 환원당으로부터 유도된다.

매우 바람직한 음이온성 계면활성제는 알킬 알콕실화된 술페이트 계면활성제를 포함한다. 그것의 실예로는 식 RO(A)_mSO3M 의 수용성 염 또는 산으로, 식에서 R 은 C₁₀-C₂₄ 알킬 성분을 가지고 있는 치환되지 않은 C₁₀-C₂₄-알킬 또는 히드록시알킬 기, 바람직하게는 C₁₂-C₂₀ 알킬 또는 히드록시알킬, 보다 바람직하게는 C₁₂-C ₁₈ 알킬 또는 히드록시알킬이고, A 는 에톡시 또는 프로폭시 유니트이며, m 은 0 보다 크고, 전형적으로 약 0.5 와 약 6 사이, 보다 바람직하게는 약 0.5 와 약 3 사이이며, M 은 수소이거나 또는 예컨대 금속 양이온일 수 있는 양이온 (예컨대 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 등), 암모늄 또는 치환된-암모늄 양이온이다. 알킬 프로폭실화된 술페이트뿐만 아니라 알킬 에톡실화된 술페이트가 본원에서 예상된다. 치환된 암모늄 양이온의 특정한 실예로는 메틸-, 디메틸-, 트리메틸-암모늄 양이온과 사차 암모늄 양이온, 예컨대 테트라메틸-암모늄 양이온 및 디메틸 피페리디늄 양이온 및 에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 그것들의 혼합물과 같은 알킬아민으로부터 유도된 것들, 등이 있다. 예시적인 계면활성제는 C₁₂-C₁₈ 알킬 폴리에톡실레이트 (1.0) 술페이트 (C₁₂-C₁₈E(1.0)M), C₁₂-C₁₈ 알킬 폴리에톡실레이트 (2.25) 술페이트 (C₁₂-C₁₈E(2.25)M), C₁₂-C₁₈ 알킬 폴리에톡실레이트 (3.0) 술페이트 (C₁₂-C₁₈E(3.0)M), 및 C₁₂-C₁₈ 알킬 폴리에톡실레이트 (4.0) 술페이트 (C₁₂-C₁₈E(4.0)M) 이고, 상기 M 은 나트륨과 칼륨으로부터 편리하게 선택된다.

사용될 적당한 음이온성 계면활성제는 문헌의 방법 ("The Journal of the American Oil Chemists Society", 52 (1975), pp. 323-329)에 따라 가스성 SO₃ 로 술폰화된 C₈-C₂₀ 카르복실산 (즉 지방산)의 선형 에스테르를 포함하는 알킬 에스테르 술포네이트 계면활성제이다. 적당한 출발 물질은 탈로우, 팜유 등으로부터 유도되는 바와 같은 천연 지방 물질을 포함할 것이다.

특히 세탁용으로 바람직한 알킬 에스테르 술포네이트 계면활성제는 하기 구조식의 알킬 에스테르 술포네이트 계면활성제를 포함한다:

상기 식에서, R³ 은 C₈-C₂₀ 히드로카르빌, 바람직하게는 알킬, 또는 그것들의 조합이고, R⁴ 는 C₁-C₆ 히드로카르빌, 바람직하게는 알킬, 또는 그것들의 조합이며, M 은 알킬 에스테르 술포네이트와 수용성 염을 형성하는 양이온이다. 적당한 염-형성 양이온으로는 나트륨, 칼륨, 및 리튬과 같은 금속, 및 치환된 또는 치환되지 않은 암모늄 이온, 예컨대 모노에탄올아민, 디에토놀아민, 및 트리에탄올아민이 있 다. 바람직한 것은 R³ 이 C₁₀-C₁₆ 알킬이고, R⁴ 가 메틸, 에틸 또는 이소프로필인 것이다. 특히 바람직한 것은 R³ 이 C₁₀-C₁₆ 알킬인 메틸 에스테르 술포네이트이다.

다른 적당한 음이온성 계면활성제로는 식 ROSO₃M 의 수용성 염 또는 산인 알킬 술페이트 계면활성제가 있으며, 식에서 R 은 바람직하게는 C₁₀-C₂₄ 히드로카르빌, 바람직하게는 C₁₀-C₂₄ 알킬 성분을 가지고 있는 알킬 또는 히드록시알킬, 보다 바람직하게는 C₁₂-C₁₈ 알킬 또는 히드록시알킬이고, M 은 수소이거나 또는 양이온, 예컨대 알칼리 금속 양이온 (예컨대 나트륨, 칼륨, 리튬), 암모늄 또는 치환된-암모늄 (예컨대 메틸-, 디메틸-, 및 트리메틸 암모늄 양이온 및 사차 암모늄 양이온, 예컨대 테트라메틸-암모늄 양이온 및 디메틸 피페리디늄 양이온 및 에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 및 그것들의 혼합물과 같은 알킬 아민으로부터 유도된 사차 암모늄 양이온 등)이다. 전형적으로, C₁₂-C₁₆ 의 알킬 사슬이 보다 낮은 세척 온도 (예컨대 약 50 ℃ 이하)에 대해서 바람직하고, 보다 높은 세척 온도 (예컨대 약 50 ℃ 이상)에 대해서는 C₁₆-C₁₈ 알킬 사슬이 바람직하다.

세제 목적에 대해 유용한 다른 음이온성 계면활성제가 본 발명의 세탁용 세제 조성물에 또한 포함될 수 있다. 그러한 것으로는 비누의 염 (예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 및 치환된 암모늄 염, 예컨대 모노-, 디- 및 트리에탄올아민 염을 포함함), C₈-C₂₂ 일차 또는 이차 알칸술포네이트, C₈-C₂₄ 올레핀술포네이트, 알칼 리 토금속 시트레이트의 열분해 생성물의 술폰화에 의해 제조된 술폰화된 폴리카르복실산; 예컨대 영국 특허 명세서 제 1,082,179 호에 설명된 바와 같은 C₈-C₂₄ 알킬폴리글리콜에테르술페이트 (10 몰까지의 에틸렌 옥사이드를 함유하고 있음); 알킬 글리세롤 술포네이트, 지방 아실 글리세롤 술포네이트, 지방 올레일 글리세롤 술페이트, 알킬 페놀 에틸렌 옥사이드 에테르 술페이트, 파라핀 술포네이트, 알킬 포스페이트, 이세티오네이트, 예컨대 아실 이세티오네이트, N-아실 타우레이트, 알킬 숙시나메이트 및 술포숙시네이트, 술포숙시네이트의 모노에스테르 (특히 포화 및 불포화 C₁₂-C₁₈ 모노에스테르) 및 술포숙시네이트의 디에스테르 (특히 포화 및 불포화 C₆-C₁₂ 디에스테르), 아실 사르코시네이트, 알킬폴리글루코시드의 술페이트와 같은 알킬다당의 술페이트 (하기에서 설명될 비이온성 비-술폰화된 화합물), 분지된 일차 알킬 술페이트, 및 식 RO(CH₂CH₂O)_k-CH₂COO-M+ 의 화합물과 같은 알킬 폴리에톡시 카르복실레이트 (식에서 R 은 C₈-C₂₂ 알킬이고, k 는 1 내지 10 의 정수이며, M 은 가용성 염을 형성하는 양이온이다)를 들 수 있다. 수지산 및 수소화된 수지산, 예컨대 로진, 수소화된 로진이 또한 적당하며, 수지산과 수소화된 수지산은 톨유에 존재하거나 또는 톨유로부터 유도된다.

알킬벤젠 술포네이트가 매우 바람직하다. 특히 바람직한 것은 선형 (직쇄) 알킬 벤젠 술포네이트 (LAS)로, 이것의 알킬기는 바람직하게는 10 내지 18 개의 탄소 원자를 함유한다.

추가의 실예는 문헌에 예시되어 있다 ("Surface Active Agents and Detergents", Vol. I and II by Schwartz, Perry and Berch). 다양한 그러한 계면활성제들이 또한 일반적으로 US 3,929,678 (Column 23, line 58 through Column 29, line 23)에 설명되어 있다.

본 발명의 세탁용 세제 조성물은 전형적으로 약 1 내지 약 40 중량 %, 바람직하게는 약 3 내지 약 20 중량 % 의 그러한 음이온성 계면활성제를 포함하고 있다.

본 발명의 세탁용 세제 조성물은 또한 이미 앞에서 설명된 비이온성 및/또는 음이온성 계면활성제 뿐만 아니라, 양이온성, 암폴리틱, 쯔비터이온성, 및 반-극성 계면활성제를 함유할 수 있다.

본 발명의 세탁용 세제 조성물에 사용하기에 적당한 양이온성 세제용 계면활성제는 하나의 긴-사슬 히드로카르빌 기를 가지고 있는 것들이다. 그러한 양이온성 계면활성제의 실예로는 알킬트리메틸암모늄 할로겐화물과 같은 암모늄 계면활성제와, 하기 식을 가지는 계면활성제가 있다:

[R²(OR³)_y][R⁴(OR³)_y]₂R ⁵N+X-

상기 식에서, R² 는 알킬 사슬에 약 8 내지 약 18 개의 탄소 원자를 가지고 있는 알킬 또는 알킬 벤질 기이고, 각각의 R³ 은 -CH₂CH₂-, -CH₂CH(CH ₃)-, -CH₂CH(CH₂OH)-, -CH₂CH₂CH₂-, 및 이것들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되 며; 각각의 R⁴ 는 C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 히드록시알킬, 두 개의 R⁴ 기를 결합시킴으로써 형성된 벤질 고리 구조, -CH₂CHOHCHOHCOR⁶CHOHCH₂OH (식에서 R⁶ 은 헥소스 또는 약 1000 보다 작은 분자량을 가지고 있는 헥소스 중합체이고, y 가 0 이 아닌 때 수소이다)이며; R⁵ 는 R⁴ 와 같거나 또는 알킬 사슬이고, 이 때 탄소 원자의 총수 또는 R² 플러스 R⁵ 는 약 18 을 넘지 않으며; 각각의 y 는 0 내지 10 으로, y 값의 총합은 0 내지 약 15이고; X 는 어떠한 부합하는 음이온이다.

매우 바람직한 양이온성 계면활성제는 하기 식을 가지고 있는 본 조성물에 유용한 수용성 사차 암모늄 화합물이다:

R₁R₂R₃R₄N⁺X^- (i)

상기 식에서, R₁ 은 C₈-C₁₆ 알킬이고, R₂, R₃ 및 R₄ 의 각각은 독립적으로 C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 히드록시 알킬, 벤질, 및 -(C₂H₄₀) _xH (식에서 x 는 2 내지 5 의 값을 갖는다)이며, X 는 음이온이다. R₂, R₃ 또는 R₄ 중 하나 이상이 벤질이 되어서는 안된다.

R₁ 에 대한 바람직한 알킬 사슬 길이는, 특히 알킬기가 코코넛 지방 또는 팜 커넬 지방으로부터 유도된 사슬 길이의 혼합물이거나 또는 올리펜 빌드 업 또는 OXO 알코올 합성에 의해 합성적으로 유도된 것인 경우에 C₁₂-C₁₅ 이다.

R₂, R₃ 및 R₄ 에 대한 바람직한 기는 메틸 및 히드록시에틸 기이며, 음이온 X 는 할라이드, 메토술페이트, 아세테이트 및 포스페이트 이온으로부터 선택될 수 있다.

본원에서 사용하기에 적당한 상기 식 (i) 의 사차 암모늄 화합물의 실예는 다음과 같다:

코코넛 트리메틸 암모늄 클로라이드 또는 브로마이드;

코코넛 메틸 디히드록시에틸 암모늄 클로라이드 또는 브로마이드;

데실 트리에틸 암모늄 클로라이드;

데실 디메틸 히드록시에틸 암모늄 클로라이드 또는 브로마이드;

C_12-15 디메틸 히드록시에틸 암모늄 클로라이드 또는 브로마이드;

코코넛 디메틸 히드록시에틸 암모늄 클로라이드 또는 브로마이드;

미리스틸 트리메틸 암모늄 메틸 술페이트;

라우릴 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 또는 브로마이드;

라우릴 디메틸 (에테녹시)₄ 암모늄 클로라이드 또는 브로마이드;

콜린 에스테르 (R₁ 이

알킬이고 R₂, R₃ 및 R₄ 가 메틸인 경우의 식 (i) 의 화합물);

디-알킬 이미다졸린 (식 (i) 의 화합물).

본원에 유용한 다른 양이온성 계면활성제들이 또한 US 4,228,044 호 및 EP 000 224 호에 개시되어 있다.

본원에서 사용될 때, 본 발명의 세탁용 세제 조성물은 전형적으로 0.2 내지 약 25 중량 %, 바람직하게는 약 1 내지 약 8 중량 % 의 그러한 양이온성 계면활성제를 포함한다.

암폴리틱 계면활성제가 또한 본 발명의 세탁용 세제 조성물에 사용하기에 적당하다. 이들 계면활성제는 이차 또는 삼차 아민의 지방족 유도체, 또는 헤테로고리형 이차 및 삼차 아민의 지방족 유도체로서 광역적으로 설명될 수 있으며, 상기 유도체에서 지방족 라디칼은 직쇄- 또는 분지된-사슬일 수 있다. 지방족 치환기중 하나는 최소한 약 8 개의 탄소 원자, 전형적으로 약 8 내지 약 18 개의 탄소 원자를 함유하며, 최소한 하나는 음이온성 수용성 기, 예컨대 카르복시, 술포네이트, 술페이트를 함유한다. 암폴리틱 계면활성제의 실예는 예컨대 US 3,929,678 호 (컬럼 19, 라인 18-35)를 참조한다.

본원에서 사용될 때, 본 발명의 세탁용 세제 조성물은 전형적으로 0.2 내지 약 15 중량 %, 바람직하게는 약 1 내지 약 10 중량 % 의 그러한 암폴리틱 계면활성제를 포함한다.

쯔비터이온성 계면활성제가 또한 세탁용 세제 조성물에 사용하기에 적당하다. 이들 계면활성제들은 이차 및 삼차 아민의 유도체, 헤테로고리형 이차 및 삼차 아민의 유도체, 또는 사차 암모늄, 사차 포스포늄 또는 삼차 술포늄 화합물의 유도체로서 광역적으로 설명될 수 있다. 쯔비터이온성 계면활성제의 실예는 예컨대 US 3,929,678 호를 참조한다.

본원에서 사용될 때, 본 발명의 세탁용 세제 조성물은 0.2 내지 약 15 중량 %, 바람직하게는 약 1 내지 약 10 중량 % 의 그러한 쯔비터이온성 계면활성제를 포함한다.

반-극성 비이온성 계면활성제는 비이온성 계면활성제의 특수한 범주인데, 거기에는 약 10 내지 약 18 개의 탄소 원자로 이루어진 하나의 알킬 부분과 약 1 내지 약 3 개의 탄소 원자를 함유하고 있는 알킬기 및 히드록시알킬기로 이루어지는 군으로부터 선택된 2 개의 부분을 함유하고 있는 수용성 아민 옥사이드; 약 10 내지 약 18 개의 탄소 원자로 이루어진 하나의 알킬 부분과 약 1 내지 약 3 개의 탄소 원자를 함유하고 있는 알킬기 및 히드록시알킬기로 이루어지는 군으로부터 선택된 2 개의 부분을 함유하고 있는 수용성 포스핀 옥사이드; 및 약 10 내지 약 18 개의 탄소 원자로 이루어진 하나의 알킬 부분과 약 1 내지 약 3 개의 탄소 원자를 함유하고 있는 알킬기 및 히드록시알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된 부분을 함유하고 있는 수용성 술폭시드가 포함된다.

반-극성 비이온성 세제 계면활성제는 다음 식을 가지는 아민 옥사이드 계면활성제를 포함한다:

상기 식에서, R³ 은 약 8 내지 약 22 개의 탄소 원자를 함유하고 있는 알킬, 히드록시알킬, 또는 알킬 페닐기 또는 그것들의 혼합물이고; R⁴ 는 약 2 내지 약 3 개의 탄소 원자를 함유하고 있는 알킬렌 또는 히드록시알킬렌 기 또는 그것들의 혼합물이며; x 는 0 내지 약 3 이고; 각각의 R⁵ 는 약 1 내지 약 3 개의 탄소 원자를 함유하고 있는 알킬 또는 히드록시알킬기 또는 약 1 내지 약 3 개의 에틸렌 옥사이드 기를 함유하고 있는 폴리에틸렌 옥사이드기이다. R⁵ 기는 예컨대 산소 또는 질소 원자를 통하여 상호간에 부착될 수 있어서 고리 구조를 형성할 수도 있다.

이들 아민 옥사이드 계면활성제는 특히 C₁₀-C₁₈ 알킬 디메틸 아민 옥사이드 및 C₈-C₁₂ 알콕시 에틸 디히드록시 에틸 아민 옥사이드를 포함한다.

본원에서 사용될 때, 본 발명의 세탁용 세제 조성물은 전형적으로 0.2 내지 약 15 중량 %, 바람직하게는 약 1 내지 약 10 중량 % 의 그러한 반-극성 비이온성 계면활성제를 포함한다.

빌더 시스템

본 발명에 따르는 조성물은 추가로 빌더 시스템을 포함할 수 있다. 알루미노실리케이트 물질, 실리케이트, 폴리카르보실레이트 및 지방산, 에틸렌디아민 테트라아세테이트와 같은 물질, 아미노폴리포스포네이트와 같은 금속 이온 시퀘스트란트, 특히 에틸렌디아민 테트라메틸렌 포스폰산 및 디에틸렌 트리아민 펜타메틸렌포스폰산을 포함하고 있는 어떠한 종래의 빌더 시스템도 본원에 사용하기에 적당하다. 명백한 환경적 이유로 덜 바람직하긴 하지만, 포스페이트 빌더가 또한 본원에서 사용될 수 있다.

적당한 빌더로는 무기 이온 교환 물질, 통상적으로 수화된 무기 알루미노실리케이트 물질, 보다 구체적으로 수화된 합성 제올라이트, 예컨대 수화된 제올라이트 A, X, B, HS 또는 MAP 를 들 수 있다.

다른 적당한 무기 빌더 물질은 적층된 실리케이트, 예컨대 SKS-6 (Hoechst) 이다. SKS-6 은 규산 나트륨으로 구성되는 결정성 적층된 실리케이트이다 (Na₂Si₂O₅).

하나의 카르복실기를 함유하고 있는 적당한 폴리카르복실레이트는 벨기에 특허 제 831,368 호, 821,369 호 및 821,370 호에 개시된 바와 같이 락트산, 글리콜산 및 그것의 에테르 유도체를 포함한다. 두 개의 카르복시기를 함유하고 있는 폴리카르복실레이트로는 숙신산, 말론산, (에틸렌디옥시) 디아세트산, 말레산, 디글리콜산, 타르타르산, 타르트론산 및 푸마르산의 수용성 염 뿐만 아니라, 독일 공개 공보 2,446,686 호 및 2,446,487 호, US 3,935,257 호에 개시된 에테르 카르복실레이트 및 벨기에 특허 제 840,623 호에 기재되어 있는 술피닐 카르복실레이트가 있다. 세 개의 카르복실기를 함유하고 있는 폴리카르복실레이트로는, 특히, 수용성 시트레이트, 아코니트레이트 및 시트라코네이트 뿐만 아니라, 영국 특허 제 1,379,241 호에 기재된 카르복시메틸옥시숙시네이트와 같은 숙시네이트 유도체, 네덜란드 출원 7205873 호에 기재된 락토옥시숙시네이트, 및 영국 특허 제 1,387,447 호에 기재된 2-옥사-1,1,3-프로판 트리카르복실레이트와 같은 옥시폴리카르복실레이트 물질이 있다.

네 개의 카르복시 기를 함유하고 있는 폴리카르복실레이트로는 영국 특허 제 1,261,829 호에서 개시된 옥시디숙시네이트, 1,1,2,2-에탄 테트라카르복실레이트, 영국 특허 제 1,398,421 호 및 1,398,422 호 및 US 3,936,448 호에서 개시된 술포숙시네이트 유도체를 포함하는 술포 치환체를 함유하고 있는 1,1,3,3-프로판 테트라카르복실레이트, 및 영국 특허 제 1,082,179 호에 기재된 술폰화된 열분해된 시트레이트가 있으며, 한편 포스폰 치환체를 함유하고 있는 폴리카르복실레이트가 영국 특허 제 1,439,000 호에서 개시된다.

지환족 및 헤테로고리형 폴리카르복실레이트로는 시클로펜탄-시스, 시스-시스-테트라카르복실레이트, 시클로펜타디에나이드 펜타카르복실레이트, 2,3,4,5-테트라히드로-퓨란 - 시스, 시스, 시스-테트라카르복실레이트, 2,5-테트라히드로-퓨란-시스, 디스카르복실레이트, 2,2,5,5-테트라히드로퓨란 - 테트라카르복실레이트, 1,2,3,4,5,6-헥산-헥사카르복실레이트 및 다가 알코올, 예컨대 소르비톨, 만니톨 및 크실리톨의 카르복시메틸 유도체가 있다. 방향족 폴리카르복실레이트로는 영국 특허 제 1,425,343 호에 개시되어 있는 멜리트산, 피로멜리트산 및 프탈산 유도체가 있다.

상기 열거한 것들중에서, 바람직한 폴리카르복실레이트는 분자당 세 개까지의 카르복시 기를 함유하고 있는 히드록시-카르복실레이트, 보다 구체적으로는 시트레이트이다.

본 발명의 조성물에 사용하기에 바람직한 빌더 시스템은 제올라이트 A 와 같은 수불용성 알루미노실리케이트 빌더 또는 적층된 실리케이트 (SKS-6)와, 시트르 산과 같은 수용성 카르복실레이트 킬레이트제와의 혼합물을 포함한다.

본 발명에 따라 세제 조성물중에 포함되기에 적당한 킬레이트제는 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 (EDDS) 또는 그것의 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄, 또는 치환된 암모늄 염, 또는 그것들의 혼합물이다. 바람직한 EDDS 화합물들은 유리산 형태 및 그것의 나트륨 또는 마그네슘 염이다. 그러한 EDDS 의 바람직한 나트륨 염의 실예는 Na₂EDDS 및 Na₄EDDS 이다. 그러한 EDDS 의 바람직한 마그네슘 염의 실예는 MgEDDS 및 Mg₂EDDS 이다. 마그네슘 염이 본 발명에 따라 조성물에 포함되기에 가장 바람직하다.

바람직한 빌더 시스템은 제올라이트 A 와 같은 수불용성 알루미노실리케이트 빌더와, 시트르산과 같은 수용성 카르복실레이트 킬레이트제와의 혼합물을 포함한다.

과립 조성물에 사용하기 위한 빌더 시스템의 부분을 형성할 수 있는 다른 빌더 물질로서는 무기 물질, 예컨대 알칼리 금속 탄산염, 중탄산염, 실리케이트, 및 유기 물질, 예컨대 유기 포스포네이트, 아미노 폴리알킬렌 포스포네이트 및 아미노 폴리카르복실레이트가 있다.

다른 적당한 수용성 유기 염은 단일- 또는 공-중합체 산 또는 그것들의 염이며, 이때 폴리카르복실산은 두 개 이하의 탄소 원자에 의해 상호 분리되는 최소한 두 개의 카르복실 라디칼을 포함한다.

이런 유형의 중합체는 GB-A-1,596,756 에 개시되어 있다. 그러한 염의 실예 는 분자량이 2000 내지 5000 인 폴리아크릴레이트 및 그것들의 말레산 무수물과의 공중합체이며, 그러한 공중합체의 분자량은 20,000 내지 70,000, 특히 약 40,000 이다.

세제 빌더 염은 정상적으로 조성물의 5 내지 80 중량 % 의 양으로 포함된다. 액체 세제용 빌더의 바람직한 수준은 5 내지 30 % 이다.

효소

바람직한 세제 조성물은 본 발명의 효소 제제외에, 세척 성능 및/또는 직물 보호 장점을 제공하는 다른 효소(들)을 포함한다.

그러한 효소들로는 다른 프로테아제, 리파제, 큐티나제, 아밀라제, 셀룰라제, 과산화효소, 산화효소 (예컨대 락카제)가 있다.

프로테아제: 알칼리성 용액중에서 사용하기에 적당하면 어떠한 다른 프로테아제도 사용될 수 있다. 적당한 프로테아제로는 동물, 식물 또는 미생물 기원의 프로테아제가 있다. 미생물 기원의 프로테아제가 바람직하다. 화학적으로 또는 유전적으로 변형된 돌연변이체들도 포함된다. 프로테아제는 세린 프로테아제일 수 있으며, 바람직하게는 알칼리성 미생물 기원의 프로테아제 또는 트립신-유사 프로테아제이다. 알칼리성 프로테아제의 실예는 서브틸리신, 특히 바실루스로부터 유도된 것들, 예를 들어 서브틸리신 Novo, 서브틸리신 Carlsberg, 서브틸리신 309, 서브틸리신 147 및 서브틸리신 168 (WO 89/06279)이다. 트립신-유사 프로테아제의 실예로는 트립신 (예컨대 돼지 또는 소 기원) 및 WO 89/06270 에 기재되어 있는 푸사리움 프로테아제가 있다.

바람직한 상업적으로 구매가능한 프로테아제 효소는 Novo Nordisk A/S (Denmark)에서 등록 상표명 Alcalase, Savinase, Primase, Durazym, 및 Esperase 하에 시판하는 것들, Genencor International 에서 등록 상표명 Maxatase, Maxacal, Maxapem, Properase, Purafect 및 Purafect OXP 하에 시판하는 것들, 및 Solvay Enzymes 에서 등록 상표명 Opticlean 및 Optimase 하에 시판하는 것들이다. 프로테아제 효소는 본 발명에 따르는 조성물안에 조성물의 0.00001 중량 % 내지 2 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 바람직하게는 조성물의 0.0001 중량 % 내지 1 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 보다 바람직하게는 조성물의 0.001 중량 % 내지 0.5 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 가장 바람직하게는 조성물의 0.01 중량 % 내지 0.2 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로 혼입될 수 있다.

리파제: 알칼리성 용액중에 사용되기에 적당하면 어떠한 리파제든지 사용될 수 있다. 적당한 리파제는 박테리아 또는 진균 기원의 리파제들이다. 화학적으로 또는 유전적으로 변형된 돌연변이체들도 포함된다.

유용한 리파제의 실예로는 예컨대 EP 258 068 호 및 EP 305 216 호에 기재되어 있는 것과 같은 휴미콜라 라누기노사 리파제, EP 238 023 호에 기재되어 있는 바와 같은 리조뮤코어 미헤이 리파제, 칸디다 리파제, 예를 들면 칸디다 안타르크티카 리파제, 예컨대 EP 214 761 호에 기재되어 있는 바와 같은 칸디다 안타르크티카 리파제 A 또는 B, 예컨대 EP 218 272 호에 기재되어 있는 바와 같은 슈도모나스 알칼리게네스 및 슈도모나스 슈도알칼리게네스 리파제와 같은 슈도모나스 리파제, 예컨대 EP 331 376 호에 기재되어 있는 바와 같은 슈도모나스 케파치아 리파제, 예 컨대 GB 1,372,034 호에 개시되어 있는 바와 같은 슈도모나스 스투트제리 리파제, 슈도모나스 플루오레센스 리파제, 바실루스 리파제, 예컨대 바실루스 서브틸리스 리파제 (Dartois et al., (1993), Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260), 바실루스 스테아로써모필루스 리파제 (JP 64/744992) 및 바실루스 푸밀루스 리파제 (WO 91/16422)가 있다.

나아가, 많은 클론된 리파제, 예를 들어 페니실리움 카멤베르티 리파제 (Yamaguchi et al., (1991), Gene 103, 61-67), 지오트리쿰 칸디듐 리파제 (Schimada, Y. et al., (1989), J. Biochem., 106, 383-388), 및 다양한 리조푸스 리파제, 예컨대 리조푸스 델레마르 리파제 (Hass, M.J. et al., (1991), Gene 109, 117-133), 리조푸스 니베우스 리파제 (Kugimiya et al., (1992), Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716-719) 및 리조푸스 오리자에 리파제도 유용할 것이다.

다른 유형의 지방 분해 효소, 예를 들어 WO 88/09367 호에 기재되어 있는 바와 같은 슈도모나스 멘도키나로부터 유도된 큐티나제, 또는 푸사리움 솔라니 피시로부터 유도된 큐티나제 (WO 90/09446 호에 기재되어 있음)와 같은 큐티나제가 또한 유용할 것이다.

특히 적당한 리파제는 M1 Lipase^TM, Luma fast^TM 및 Lipomax^TM (Genencor), Lipolase^TM 및 Lipolase Ultra^TM (Novo Nordisk A/S), 및 Lipase P "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.)와 같은 리파제이다.

리파제는 통상 세제 조성물중에, 조성물의 0.00001 중량 % 내지 2 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 바람직하게는 조성물의 0.0001 중량 % 내지 1 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 보다 바람직하게는 조성물의 0.001 중량 % 내지 0.5 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 가장 바람직하게는 조성물의 0.01 중량 % 내지 0.2 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로 혼입된다.

아밀라제: 알칼리성 용액에 사용되기에 적당하면 어떠한 아밀라제든지 (α 및/또는 β) 사용될 수 있다. 적당한 아밀라제는 박테리아 또는 진균 기원의 아밀라제들이다. 화학적으로 또는 유전적으로 변형된 돌연변이체들도 포함된다. 아밀라제는 예를 들면, GB 1,296,839 호에 상세하게 설명되어 있는 바와 같은, 바실루스 리케니포르미스의 특정 스트레인으로부터 얻어진 α-아밀라제이다. 상업적으로 이용할 수 있는 아밀라제는 Duramyl^TM, Termamyl^TM, Fungamyl^TM 및 BAN ^TM (Novo Nordisk A/S 에서 시판함) 및 Rapidase^TM 및 Maxamyl P^TM (Genencor 에서 시판함)이다.

아밀라제는 통상 세제 조성물중에, 조성물의 0.00001 중량 % 내지 2 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 바람직하게는 조성물의 0.0001 중량 % 내지 1 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 보다 바람직하게는 조성물의 0.001 중량 % 내지 0.5 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 가장 바람직하게는 조성물의 0.01 중량 % 내지 0.2 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로 혼입된다.

셀룰라제: 알칼리성 용액에 사용하기에 적당하면 어떠한 셀룰라제든지 사용될 수 있다. 적당한 셀룰라제는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이다. 화학적으 로 또는 유전적으로 변형된 돌연변이체들도 포함된다. 적당한 셀룰라제들은 US 4,435,307 호에 개시되어 있으며, 그 곳에는 휴미콜라 인솔렌스로부터 생성된 진균성 셀룰라제가 개시되어 있다. 특히 적당한 셀룰라제는 색상 보호 장점을 가지고 있는 것들이다. 그러한 셀룰라제의 실예는 유럽 특허 출원 0 495 257 호에 기재되어 있는 것들이다.

상업적으로 이용할 수 있는 셀룰라제는 휴미콜라 인솔렌스의 스트레인에 의해 생성되는 Celluzyme^TM (Novo Nordisk A/S) 및 KAC-500(B)^TM (Kao Corporation)이다.

셀룰라제는 통상 세제 조성물중에, 조성물의 0.00001 중량 % 내지 2 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 바람직하게는 조성물의 0.0001 중량 % 내지 1 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 보다 바람직하게는 조성물의 0.001 중량 % 내지 0.5 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 가장 바람직하게는 조성물의 0.01 중량 % 내지 0.2 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로 혼입된다.

과산화효소/산화효소: 과산화효소는 과산화수소 또는 그것의 공급원 (예컨대 과탄산염, 과붕산염 또는 과황산염)과 함께 사용된다. 산화 효소는 산소와 결합되어 사용된다. 두가지 유형의 효소들은 "용액 표백" 을 위해, 즉 직물들이 세척액중에서 함께, 바람직하게는 예컨대 WO 94/12621 및 WO 95/01426 에 기재되어 있는 바와 같은 증강제와 함께 세척될 때, 염색된 직물로부터 다른 직물로 섬유 염료가 전달되는 것을 방지하기 위하여 사용된다. 적당한 과산화효소/산화효소는 식물, 박테리아 또는 진균 기원의 것들이다. 화학적으로 및 유전적으로 변형된 돌연변이체들도 포함된다.

과산화효소 및/또는 산화효소는 통상 세제 조성물중에, 조성물의 0.00001 중량 % 내지 2 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 바람직하게는 조성물의 0.0001 중량 % 내지 1 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 보다 바람직하게는 조성물의 0.001 중량 % 내지 0.5 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 가장 바람직하게는 조성물의 0.01 중량 % 내지 0.2 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로 혼입된다.

상기 언급된 효소들의 혼합물, 특히 프로테아제, 아밀라제, 리파제 및/또는 셀룰라제의 혼합물이 본 발명에 포함된다.

본 발명의 효소, 또는 세제 조성물에 혼입된 어떠한 다른 효소는 통상 세제 조성물중에, 조성물의 0.00001 중량 % 내지 2 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 바람직하게는 조성물의 0.0001 중량 % 내지 1 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 보다 바람직하게는 조성물의 0.001 중량 % 내지 0.5 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로, 가장 바람직하게는 조성물의 0.01 중량 % 내지 0.2 중량 % 의 효소 단백질의 수준으로 혼입된다.

표백제

본 발명의 세제 조성물에 포함될 수 있는 추가의 임의의 세제 성분으로는 PB1, PB4 및 입자의 크기가 400 내지 800 미크론인 과탄산염과 같은 표백제가 있다. 이들 표백제 성분은 하나 또는 둘 이상의 산소 표백제와, 선택된 표백제에 따라 좌우되는 하나 또는 둘 이상의 표백 활성화제를 포함할 수 있다. 산소 표백 화 합물은 존재하는 경우 전형적으로 약 1 % 내지 약 25 % 의 수준으로 존재할 것이다. 일반적으로, 표백 화합물은 비-액체 제형, 예컨대 과립형 세제중에 임의로 첨가된 성분이다.

본원에 사용하기 위한 표백제 성분은 당해 기술 분야에 공지되어 있는 다른 것들 뿐만 아니라 산소 표백제를 포함하여, 세제 조성물에 유용한 어떠한 표백제일 수 있다.

본 발명에 적당한 표백제는 활성화된 또는 비-활성화된 표백제일 수 있다.

사용될 수 있는 산소 표백제의 한 카테고리에는 과카르복실산 표백제 및 그것의 염이 포함된다. 이 부류의 표백제의 적당한 실예로는 마그네슘 모노퍼옥시프탈레이트 6수화물, 메타-클로로 과벤조산, 4-노닐아미노-4-옥소퍼옥시부티르산 및 디퍼옥시도데칸디오산의 마그네슘 염이 있다. 그러한 표백제는 US 4,483,781 호, US 740,446 호, EP 0 133 354 호 및 US 4,412,934 호에 개시되어 있다. 매우 바람직한 표백제는 또한 US 4,634,551 호에 기재되어 있는 바와 같은 6-노닐아미노-6-옥소퍼옥시카프로산이다.

사용될 수 있는 표백제의 다른 카테고리에는 할로겐 표백제가 포함된다. 하이포할라이트 표백제의 실예로는, 예를 들면 트리클로로 이소시아누릭산 및 나트륨 및 칼륨 디클로로 이소시아누레이트 및 N-클로로 및 N-브로모 알칸 술폰아미드가 있다. 그러한 물질들은 통상 최종 생성물의 0.5 내지 10 중량 %, 바람직하게는 1 내지 5 중량 % 로 첨가된다.

과산화수소 방출제가 테트라아세틸에틸렌디아민 (TAED), 노나노일옥시벤젠술 포네이트 (NOBS, US 4,412,934 호), 3,5-트리메틸헥사놀옥시벤젠술포네이트 (ISONOBS, EP 120 591) 또는 펜타아세틸글루코스 (PAG)와 같은 표백 활성화제와 함께 사용될 수 있고, 그것은 과가수분해되어 개선된 표백 효과를 유발하는 활성 표백종으로서의 과산을 형성한다. 또한, C8(6-옥탄아미도-카프로일) 옥시벤젠-술포네이트, C9(6-노난아미도 카프로일) 옥시벤젠술포네이트 및 C10(6-데칸아미도 카프로일) 옥시벤젠술포네이트 또는 그것들의 혼합물이 매우 적당한 표백 활성화제이다. 또한 활성화제로서 적당한 것은 유럽 특허 출원 제 91870207.7 호에 개시된 바와 같은 아세틸화된 시트레이트 에스테르이다.

본 발명에 따르는 클리닝 조성물에 사용하기 위한 과산소 표백 화합물과 표백 활성화제를 포함하고 있는 표백 시스템과 퍼옥시산을 포함하고 있는 유용한 표백제는 출원 USSN 08/136,626 에 설명되어 있다.

과산화수소는 또한 세척 및/또는 세정 과정을 시작할 때 또는 중간에 과산화수소를 생성할 수 있는 효소적 시스템 (즉 효소 및 그것의 기질)을 첨가함으로써 존재할 수 있다. 그러한 효소적 시스템은 유럽 특허 출원 EP 0 537 381 에 개시되어 있다.

산소 표백제 이외의 표백제는 또한 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 본원에서도 활용될 수 있다. 특별한 관심의 대상이 되는 비-산소 표백제의 한 유형은 술폰화된 아연 및/또는 알루미늄 프탈로시아닌과 같은 광활성화된 표백제이다. 이들 물질은 세척 과정중에 기질위에 침착될 수 있다. 예컨대 옷을 건조시키기 위하여 낮에 바깥에 걸어놓는 것과 같이 산소의 존재하에 빛을 조사하였을 때, 술폰화 된 아연 프탈로시아닌은 활성화되고, 따라서 기질이 표백된다. 바람직한 아연 프탈로시아닌 및 광활성화된 표백 과정은 US 4,033,718 에 설명되어 있다. 전형적으로, 세제 조성물은 약 0.025 중량 % 내지 약 1.25 중량 % 의 술폰화된 아연 프탈로시아닌을 함유할 것이다.

표백제는 또한 망간 촉매를 포함할 수 있다. 망간 촉매는 예컨대 문헌에 기재된 화합물중 하나일 수 있다 ("Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, pp. 637-639).

비누거품 억제제

다른 임의의 성분은 비누거품 억제제, 예를 들면 실리콘, 및 실리카-실리콘 혼합물이다. 실리콘은 일반적으로 알킬화된 폴리실옥산 물질로 표시될 수 있는 한편, 실리카는 통상 실리카 에어로겔 및 제로겔 및 다양한 유형의 소수성 실리카로 예시되는 아주 세분화된 형태로 사용된다. 이들 물질은 입자로서 혼입될 수 있는데, 이 때 비누거품 억제제는 유익하게도 수용성 또는 수분산성의 실질적으로 비 표면-활성 세제 불투과성 담체중에 방출가능하게 혼입될 수 있다. 또는 달리, 비누거품 억제제는 액체 담체에 용해되거나 또는 분산될 수 있고, 하나 또는 둘 이상의 다른 화합물위에 분무에 의해 도포될 수 있다.

바람직한 실리콘 비누거품 조절제는 US 3,933,672 에 개시되어 있다. 다른 특히 유용한 비누거품 억제제는 독일 특허 출원 DTOS 2,646,126 에 기재되어 있는, 자체-유화 실리콘 비누거품 억제제이다. 그러한 화합물의 실예는 DC-544 로, 그것은 다우 코닝사에서 시판하는 실록산-글리콜 공중합체이다. 특히 바람직한 비누거 품 조절제는 실리콘 오일과 2-알킬-알칸올의 혼합물을 포함하고 있는 비누거품 억제 시스템이다. 적당한 2-알킬-알칸올은 등록상표명 Isofol 12 R 로 시판되는 2-부틸-옥탄올이다.

그러한 비누거품 억제 시스템은 유럽 특허 출원 EP 0 593 841 에 기재되어 있다.

특히 바람직한 실리콘 비누거품 조절제는 유럽 특허 출원 제 92201649. 8 에 기재되어 있다. 상기 조성물은 Aerosil

과 같은 훈증된 비다공성 실리카와 조합된 실리콘/실리카 혼합물을 포함할 수 있다.

상술된 비누거품 억제제는 통상적으로 조성물의 0.001 중량 % 내지 2 중량 %, 바람직하게는 0.01 중량 % 내지 1 중량 % 의 수준으로 사용된다.

다른 성분들

세제 조성물에 사용된 다른 성분들, 예컨대 얼룩-현탁제, 얼룩-방출제, 광증백제, 연마제, 살균제, 변색 억제제, 착색제, 및/또는 캡슐화된 또는 비캡슐화된 방향이 사용될 수 있다.

특히 적당한 캡슐화 물질은 GB 1,464,616 호에 기재된 바와 같은 다당과 폴리히드록시 화합물의 매트릭스로 구성되는 수용성 캡슐이다.

다른 적당한 수용성 캡슐화 물질은 US 3,455,838 호에 기재된 바와 같은 치환된 디카르복실산의 젤라틴화되지 않은 전분 산 에스테르로부터 유도된 덱스트린을 포함한다. 이들 산-에스테르 덱스트린은 바람직하게는, 예컨대 옥수수 밀랍, 수수 밀랍, 사고녹말 (sago), 타피오카 및 감자와 같은 전분으로부터 제조된다. 상기 캡슐화 물질의 적당한 실예로는 National Starch 사에 의해 제조되는 N-Lok 가 있다. N-Lok 캡슐화 물질은 변형된 옥수수 전분 및 글루코스로 구성된다. 전분은 옥테닐 숙신산 무수물과 같은 단일 기능성 치환된 그룹을 첨가함으로써 변형된다.

본원에 적당한 재침착 억제 및 얼룩 현탁제제로는 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 및 히드록시에틸셀룰로스와 같은 셀룰로스 유도체, 및 단일- 또는 공-중합체 폴리카르복실산 또는 그것들의 염이 있다. 이런 유형의 중합체는 상기 빌더로서 언급된 폴리아크릴레이트 및 말레산 무수물-아크릴산 공중합체 뿐만 아니라, 말레산 무수물과 에틸렌, 메틸비닐 에테르 또는 메타크릴산과의 공중합체를 포함하며, 이 때 말레산 무수물은 공중합체의 최소한 20 몰 % 를 구성한다. 이들 물질은 통상 조성물의 0.5 내지 10 중량 % 의 수준으로, 보다 바람직하게는 0.75 내지 8 중량 % 의 수준으로, 가장 바람직하게는 1 내지 6 중량 % 의 수준으로 사용된다.

바람직한 광증백제는 성질상 음이온성이며, 그러한 것들의 실예로는 디소디움 4,4'-비스-(2-디에탄올아미노-4-아닐리노-s-트리아진-6-일아미노)스틸벤-2:2' 디술포네이트, 디소디움 4,-4'-비스-(2-모르폴리노-4-아닐리노-s-트리아진-6-일아미노-스틸벤-2:2'-디술포네이트, 디소디움 4,4'-비스-(2,4-디아닐리노-s-트리아진-6-일아미노)스틸벤-2:2'-디술포네이트, 모노소디움 4',4''-비스-(2,4-디아닐리노-s-트리아진-6-일아미노)스틸벤-2-술포네이트, 디소디움 4,4'-비스-(2-아닐리노-4-(N-메틸-N-2-히드록시에틸아미노)-s-트리아진-6-일아미노)스틸벤-2,2'-디술포네이 트, 디소디움 4,4'-비스-(4-페닐-2,1,3-트리아졸-2-일)스틸벤-2,2'-디술포네이트, 디소디움 4,4' 비스(2-아닐리노-4-(1-메틸-2-히드록시에틸아미노)-s-트리아진-6-일아미노)스틸벤-2,2'디술포네이트, 소디움 2(스틸빌-4''-(나프토-1',2':4,5)-1,2,3-트리아졸-2''-술포네이트 및 4,4'-비스(2-술포스티릴)비페닐이 있다.

다른 유용한 중합체 물질은 폴리에틸렌 글리콜, 특히 분자량이 1000 내지 10000, 보다 바람직하게는 2000 내지 8000, 가장 바람직하게는 약 4000 인 폴리에틸렌 글리콜이다. 이것들은 0.20 내지 5 중량 %, 보다 바람직하게는 0.25 내지 2.5 중량 % 의 수준으로 사용된다. 이들 중합체 및 상기 언급된 단일- 또는 공-중합체 폴리카르복실레이트 염은 순백 유지, 직물의 재 (ash) 침착, 및 전이 금속 불순물의 존재하에 점토, 단백성 및 산화가능한 얼룩상에서의 세정 성능을 개선시키는데 가치있다.

본 발명의 조성물에 유용한 얼룩 방출제는 관례적으로, 테레프탈산과 다양한 배열의 에틸렌 글리콜 및/또는 프로필렌 글리콜 유니트와의 공중합체 또는 테르중합체이다. 그러한 중합체의 실예는 US 4,116,885 호 및 4,711,730 호 및 EP 0 272 033 호에서 개시된다. EP 0 272 033 호에 따르는 특히 바람직한 중합체는 다음 식을 갖는다:

(CH₃(PEG)₄₃)_0.75(POH)_0.25[(T-PO)_2.8(T-PEG)_0.4]T(POH)_0.25((PEG)₄₃CH₃)_0.75

상기 식에서, PEG 는 -(OC₂H₄)O- 이고, PO 는 (OC₃H₆O) 이며, T 는 (pOOC₆H₄CO) 이다.

또한 매우 유용한 것은 디메틸 테레프탈레이트, 디메틸 술포이소프탈레이트, 에틸렌 글리콜 및 1,2-프로판디올의 무작위 공중합체와 같은 변형된 폴리에스테르이며, 이것들의 단부기는 일차적으로 술포벤조에이트와 이차적으로 에틸렌 글리콜 및/또는 1,2-프로판디올의 모노 에스테르로 구성된다. 목표는 술포벤조에이트기로 양 단부에 캡핑되는 중합체를 얻는 것으로, 본 명세서에서 "일차적으로" 상기 공중합체의 대부분은 술포벤조에이트 기에 의해 단부가 캡핑될 것이다. 그러나, 일부의 공중합체들은 완전히 캡핑되지 않을 것이고, 따라서 그것들의 단부 기는 에틸렌 글리콜 및/또는 1,2-프로판디올의 모노에스테르로 구성될 수 있고, 이차적으로 그러한 종으로 구성된다.

본원에서 선택된 폴리에스테르는 약 46 중량 % 의 디메틸 테리프탈산, 약 16 중량 % 의 1,2-프로판디올, 약 10 중량 % 의 에틸렌 글리콜, 약 13 중량 % 의 디메틸 술포벤조산 및 약 15 중량 % 의 술포이소프탈산을 함유하고 있으며, 약 3,000 의 분자량을 가지고 있다. 폴리에스테르 및 그것들의 제조 방법은 EP 311 342 에서 상세하게 설명된다.

연화제: 직물 연화제가 또한 본 발명에 따르는 세탁용 세제 조성물에 혼입될 수 있다. 이들 제제는 무기 또는 유기 타입일 수 있다. 무기 연화제의 실예로는 GB-A-1 400 898 및 US 5,019,292 호에 개시되어 있는 스멕틱 점토를 들 수 있다. 유기 직물 연화제로는 GB-A1 514 276 호 및 EP 0 011 340 호에서 개시된 바와 같은 수불용성 삼차 아민을 들 수 있고, 그것들의 단일 C₁₂-C₁₄ 사차 암모늄 염과의 조합 은 EP-B-0 026 528 호에 개시되어 있고, 2-긴 사슬 아미드는 EP 0 242 919 호에 기재되어 있다. 직물 연화 시스템의 다른 유용한 유기 성분은 EP 0 299 575 및 0 313 416 호에 개시되어 있는 바와 같은 고분자량의 폴리에틸렌 옥사이드 물질이다.

스멕틱 점토의 수준은 통상 5 중량 % 내지 15 중량 %, 보다 바람직하게는 8 중량 % 내지 12 중량 % 이며, 이 물질은 제형의 나머지 성분들에 대하여 건조 혼합 성분으로서 첨가된다. 수불용성 삼차 아민 또는 2-긴 사슬 아미드 물질과 같은 유기 직물 연화제는 0.5 내지 5 중량 % 의 수준으로, 통상 1 내지 3 중량 % 의 수준으로 혼입되는 한편, 고분자량 폴리에틸렌 옥사이드 물질 및 수용성 양이온성 물질은 0.1 내지 2 중량 %, 통상 0.15 내지 1.5 중량 % 의 수준으로 첨가된다. 이들 물질은 보통 조성물의 분무 건조된 부분에 첨가되긴 하지만, 때로는 그것들이 건조 혼합된 과립으로서 첨가되는 것이 보다 편리할 수도 있으며, 또는 그것들은 용융 상태의 액체로서 조성물의 다른 고체 성분들위에 분무될 수도 있다.

중합체 염료-전달 억제제: 본 발명에 따르는 세제 조성물은 또한 0.001 내지 10 중량 %, 바람직하게는 0.01 내지 2 중량 %, 보다 바람직하게는 0.05 내지 1 중량 % 의 중합체 염료-전달 억제제를 포함할 수 있다. 상기 중합체 염료-전달 억제제는 통상적으로 함께 세척된 직물위에 착색되어 있던 직물로부터 염료가 전달되는 것을 억제하기 위하여 세제 조성물에 혼입된다. 이들 중합체는 염료가 세척물중의 다른 물체에 부착될 기회를 갖기 전에, 염색된 직물로부터 변색하기 쉬운 염료를 착체화하거나 또는 흡수하는 능력을 가지고 있다.

특히 적당한 중합체 염료-전달 억제제는 폴리아민 N-옥사이드 중합체, N-비 닐피롤리돈과 N-비닐이미다졸의 공중합체, 폴리비닐피롤리돈 중합체, 폴리비닐옥사졸리돈 및 폴리비닐이미다졸 또는 그것들의 혼합물이다.

그러한 중합체의 첨가는 또한 본 발명에 따르는 효소의 성능을 증강시킨다.

본 발명에 따르는 세제 조성물은 액체, 페이스트, 겔, 막대 또는 과립형태일 수 있다.

더럽히지 않는 과립이 예를 들어 US 4,106,991 호 및 4,661,452 호 (둘 다 Novo Industri A/S)에 개시되어 있는 바와 같이 제조될 수 있고, 임의로 당해기술분야에 공지되어 있는 방법들에 의하여 코팅될 수 있다. 밀랍형 코팅 물질의 실예로는 평균 분자량이 1000 내지 20000 인 폴리(에틸렌 옥사이드) 제품 (폴리에틸렌 글리콜, PEG); 16 내지 50 개의 에틸렌 옥사이드의 유니트를 가지고 있는 에톡실화된 노닐페놀; 알코올이 12 내지 20 개의 탄소 원자를 함유하고 있고 15 내지 80 개의 에틸렌 옥사이드 유니트가 포함되어 있는 에톡실화된 지방 알코올; 지방 알코올; 지방산; 및 지방산의 모노- 및 디- 및 트리글리세리드가 있다. 유동상 기법에 의해 적용되기에 적당한 필름-형성 코팅 물질의 실예는 GB 1483591 에서 제공된다.

본 발명에 따르는 과립형 조성물은 또한 "압축 형태" 일 수 있다, 즉 그것들은 상대적으로 종래의 과립형 세제보다 높은 밀도, 즉 그러한 경우 550 내지 950 g/l 의 밀도를 가질 수 있으며; 그런 경우 본 발명에 따르는 과립형 세제 조성물은 종래의 과립형 세제와 비교하여 보다 적은 양의 "무기 충전용 염" 을 함유할 것이고; 전형적인 충전용 염은 술페이트 및 클로라이드의 알칼리성 토금속 염, 전형적으로 황산 나트륨이며; "압축형" 세제는 전형적으로 10 % 미만의 충전용 염을 포함 한다. 본 발명에 따르는 액체 조성물은 또한 "농축 형태" 일 수 있으며, 그런 경우, 본 발명에 따르는 액체 세제 조성물은 종래의 액체 세제와 비교하여 더 적은 양의 물을 함유할 것이다. 전형적으로, 농축된 액체 세제의 물 함량은 세제 조성물의 30 중량 % 미만, 보다 바람직하게는 20 중량 % 미만, 가장 바람직하게는 10 중량 % 미만이다.

본 발명의 조성물은 예를 들어, 세탁용 첨가제 조성물 및 얼룩진 직물의 예비처리에 사용하기에 적당한 조성물, 린스가 첨가된 직물 연화제 조성물, 및 일반적인 가정용 경질 표면 클리닝 조작 및 식기 세척 조작에 사용하기 위한 조성물을 포함하여, 수동 및 기계용 세탁용 세제 조성물로서 제형될 수 있다.

다음의 실시예는 본 발명에 대한 조성물을 예시하기 위한 것이며, 반드시 본 발명의 범주를 제한하거나 또는 다르게 규정하는 것을 의미하지는 않는다.

세제 조성물에서, 약어로 표시된 성분 표시는 다음의 의미를 갖는다:

LAS : 선형 C₁₂ 알킬 벤젠 황산 나트륨

TAS : 탈로우 알킬 황산 나트륨

XYAS : C_1x- C_1Y 알킬 황산 나트륨

SS : 식 2-부틸 옥탄산의 이차 비누 계면활성제

25EY : 평균 Y 몰의 에틸렌 옥사이드와 축합된 C₁₂-C₁₅ 선형 지배적

일차 알코올

45EY : 평균 Y 몰의 에틸렌 옥사이드와 축합된 C₁₄-C₁₅ 선형 지배적

일차 알코올

XYEZS : 몰 당 평균 Z 몰의 에틸렌 옥사이드와 축합된 C_1x-C_1Y

알킬 황산 나트륨

비이온성: 평균 에톡실화도가 3.8이며 평균 프로폭실화도가 4.5인 BASF GmbH 에 의해 등록상표명 Plurafax LF404 하에 시판되는 C₁₃-C₁₅ 혼합 에톡실화/프로폭실화 지방 알코올

CFAA : C₁₂-C₁₄ 알킬 N-메틸 글루카미드

TFAA : C₁₆-C₁₈ 알킬 N-메틸 글루카미드

실리케이트: 비정질 나트륨 실리케이트 (SiO₂:Na₂O 비 = 2.0)

NaSKS-6 : 식 δ-Na₂Si₂O₅ 의 결정성 적층 실리케이트

탄산염: 무수 탄산 나트륨

포스페이트: 트리폴리인산 나트륨

MA/AA : 평균 분자량이 약 80,000 인 1:4 의 말레산/아크릴산의 공중합체

폴리아크릴레이트 : BASF GmbH 에서 등록상표명 PA30 으로 시판하는 평균 분자량이 8,000 인 폴리아크릴레이트 단일중합체

제올라이트 A: 일차 입자 크기가 1 내지 10 마이크로미터 범위내에 있는 식 Na₁₂(AlO₂SiO₂).27H₂O 의 수화된 나트륨 알루미노실리케이트

시트레이트: 트리-소디움 시트레이트 2 수화물

시트릭: 시트르산

과붕산염: 무수 과붕산 나트륨 1-수화물 표백제, 실험식 NaBO₂.H₂O₂

PB4 : 무수 과붕산 나트륨4-수화물

과탄산염: 실험식이 2Na₂CO₃.3H₂O₂ 인 무수 과탄산 나트륨 표백제

TAED : 테트라아세틸 에틸렌 디아민

CMC: 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스

DETPMP : Monsanto에서 등록상표명 Dequest 2060하에 시판하는 디에틸렌 트리아민 펜타(메틸렌 포스폰산)

PVP : 폴리비닐피롤리돈 중합체

EDDS : 나트륨 염 형태의 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산, [S,S] 이성질체

비누거품 억제제: 25 % 의 파라핀 왁스 Mpt 50 ℃, 17 % 의 소수성 실리카, 58 %의 파라핀 오일

과립형의 비누거품 억제제 : 12 % 의 실리콘/실리카, 18 % 의 스테아릴 알코올, 70 % 의 과립형태의 전분

황산염: 무수 황산 나트륨

HMWPEO: 고분자량의 폴리에틸렌 옥사이드

TAE 25: 탈로우 알코올 에톡실레이트 (25)

세제 실시예 I

본 발명에 따르는 과립형 직물 클리닝 조성물은 다음과 같이 제조될 수 있 다:

선형 C 알킬 벤젠 술폰산 나트륨 6.5

황산 나트륨 15.0

제올라이트 A 26.0

니트릴로트리아세트산 나트륨 5.0

본 발명의 효소 0.1

PVP 0.5

TAED 3.0

붕산 4.0

과붕산염 18.0

술폰산 페놀 0.1

그 외 총 100 으로 조정

세제 실시예 II

본 발명에 따르는 압축 과립형 직물 클리닝 조성물 (밀도 800 g/l)은 다음과 같이 제조될 수 있다:

45AS 8.0

25E3S 2.0

25E5 3.0

25E3 3.0

TFAA 2.5

제올라이트 A 17.0

NaSKS-6 12.0

시트르산 3.0

탄산염 7.0

MA/AA 5.0

CMC 0.4

본 발명의 효소 0.1

TAED 6.0

과탄산염 22.0

EDDS 0.3

과립형 비누거품 억제제 3.5

물/그 외 100 % 까지

세제 실시예 III

특히 착색된 직물의 세탁에 유용한 본 발명에 따르는 과립형 직물 클리닝 조성물은 다음과 같이 제조되었다:

LAS 10.7 -

TAS 2.4 -

TFAA - 4.0

45AS 3.1 10.0

45E7 4.0 -

25E3S - 3.0

68E11 1.8 -

25E5 - 8.0

시트레이트 15.0 7.0

탄산염 - 10

시트르산 2.5 3.0

제올라이트 A 32.1 25.0

Na-SKS-6 - 9.0

MA/AA 5.0 5.0

DETPMP 0.2 0.8

본 발명의 효소 0.10 0.05

실리케이트 2.5 -

황산염 5.2 3.0

PVP 0.5 -

폴리 (4-비닐피리딘)-N-옥사이드/비닐이미다졸과

비닐피롤리돈의 공중합체 - 0.2

과붕산염 1.0 -

술폰산 페놀 0.2 -

물/그 외 100 % 까지

세제 실시예 IV

"세척을 통한 연화" 능력을 제공하는 본 발명에 따르는 과립형 직물용 클리닝 조성물은 다음과 같이 제조될 수 있다:

45AS - 10.0

LAS 7.6 -

68AS 1.3 -

45E7 4.0 -

25E3 - 5.0

코코-알킬-디메틸 히드록시에틸

암모늄 클로라이드 1.4 1.0

시트레이트 5.0 3.0

Na-SKS-6 - 11.0

제올라이트 A 15.0 15.0

MA/AA 4.0 4.0

DETPMP 0.4 0.4

과붕산염 15.0 -

과탄산염 - 15.0

TAED 5.0 5.0

스멕틱 점토 10.0 10.0

HMWPEO - 0.1

본 발명의 효소 0.10 0.05

실리케이트 3.0 5.0

탄산염 10.0 10.0

과립형 비누거품 억제제 1.0 4.0

CMC 0.2 0.1

물/그 외 100 % 까지

세제 실시예 V

본 발명에 따르는 고부가 액체 직물 클리닝 조성물은 다음과 같이 제조될 수 있다:

I II

LAS 산 형태 - 25.0

시트르산 5.0 2.0

25AS 산 형태 8.0 -

25AE2S 산 형태 3.0 -

25AE7 8.0 -

CFAA 5 -

DETPMP 1.0 1.0

지방산 8 -

올레산 - 1.0

에탄올 4.0 6.0

프로판디올 2.0 6.0

본 발명의 효소 0.10 0.05

코코-알킬 디메틸 히드록시 에틸

암모늄 클로라이드 - 3.0

스멕틱 점토 - 5.0

PVP 2.0 -

물 / 그 외 100 % 까지

가죽 산업 적용

본 발명의 서브틸라제는 가죽 산업에, 특히 표피의 탈모에 사용하기 위해 사용될 수 있다.

상기 적용에서 본 발명의 서브틸라제 변이체는 바람직하게도 다른 프로테아제를 추가로 포함하는 효소 조성물에 사용된다.

적당한 다른 프로테아제에 대한 보다 상세한 설명은 세제 조성물에 사용하기에 적당한 효소에 관련된 단원을 참조한다 (상기 참조).

울 산업 적용

본 발명의 서브틸라제는 울 산업에, 특히 울을 포함하고 있는 의류의 클리닝에 사용하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명을 청구된 본 발명의 범주를 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 의도되지 않은 하기의 실시예로 추가로 상세하게 설명한다.

재료 및 방법

스트레인:

바실루스 서브틸리스 DN1885 (Diderichsen et al., 1990).

바실루스 렌투스 309 및 147 은 바실루스 렌투스의 특정 스트레인으로, NCIB 에 기탁하여 승인 번호 NCIB 10309 및 10147 을 받았고, 미국 특허 제 3,723,250 호에 설명되어 있다.

대장균 MC 1000 (M. J. Casadaban and S. N. Cohen (1980); J. Mol. Biol. 138:179-207) 은 종래 방법에 의하여 r^-,m⁺ 으로 만들었고, 이것은 또한 미국 특허 출원 일련 번호 039,298 호에서 설명된다.

플라스미드:

pJS3: 서브틸라제 309 를 코드화하고 있는 합성 유전자를 함유하고 있는 대장균 - 바실루스 서브틸리스 셔틀 벡터. (Jacob Schiodt et al., in Protein and Peptide letters 3:39-44 (1996)).

pSX222: 바실루스 서브틸리스 발현 벡터 (WO 96/34946 에 기재되어 있음).

일반적인 분자 생물학 방법:

다른 언급이 없는 한, DNA 조작 및 형질전환은 분자 생물학의 표준 방법을 사용하여 수행하였다 [Sambrook et al.,(1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al., (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990].

DNA 조작을 위한 효소들은 공급자의 명세를 따라 사용하였다.

DNA 조작을 위한 효소

다른 언급이 없는 한, DNA 조작을 위한 모든 효소들, 예컨대 제한 엔도뉴클레아제, 리가제 등은 뉴 잉글란드 바이오랩스사로부터 얻는다.

단백질 분해 활성

본 명세서에서, 단백질 분해 활성은 킬로 NOVO 프로테아제 유니트 (KNPU)로 표시한다. 활성은 효소 표준 (SAVINASE

)에 대하여 측정하고, 측정은 표준 조건, 즉 50 ℃, pH 8.3, 반응 시간 9 분, 측정 시간 3 분에서 단백질 분해 효소에 의한 디메틸 카제인 (DMC) 용액의 소화를 토대로 한다. 폴더 AF 220/1 이 노보 노르디스크사 (Denmark)로부터 구매가능하며, 이 폴더는 참조용이다.

GU 는 기질로서 N-아세틸 카제인과 함께 15 분동안 40 ℃ 에서 인큐베이션하는 표준 조건하에서, 1 몰의 글리신에 동등한 양의 NH₂-기를 생성하는 단백질 분해 효소 활성으로서 규정한다.

효소 활성은 또한 가용성 기질인 숙시닐-알라닌-알라닌-프롤린-페닐-알라닌- 파라니트로페놀과의 반응에 따라 PNA 검정을 사용하여 측정할 수 있다 [Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, T.M., Goodlander, B.D., Garrison, P.H., and Smith, L.A., (1988)].

발효:

서브틸라제 효소의 발효는 회전 진동 테이블 (300 r.p.m.)상에서, 100 ml 의 BPX 배지를 함유하고 있는 500 ml 용 배플된 엘렌마이어 플라스크중에서 5 일동안 30 ℃ 에서 수행하였다.

따라서, 예컨대 2 리터의 육즙을 생성하기 위해서는 20 개의 엘렌마이어 플라스크를 동시에 발효시켰다.

배지:

BPX: 조성 (리터 당)

감자 전분 100 g

갈은 보리 50 g

대두 가루 20 g

Na₂HPO₄ X 12 H₂O 9 g

플루로닉 0.1 g

카제인산 나트륨 10 g

배지중의 전분은 α-아밀라제에 의해 액화되고, 배지는 120 ℃ 에서 45 분동안 가열함으로써 멸균된다. 멸균후, 배지에 NaHCO₃ 를 0.1 M 로 첨가함으로써 pH 를 9 로 조정한다.

실시예 1

효소 변이체의 제조 및 발현

부위-특정된 돌연변이생성:

본 발명에 따라 하나의 활성 부위 루프에 특정한 삽입이 이루어져 있는 서브틸라제 309 부위-특정 변이체를, 각각 뎅 등에 의해 및 마르크바르드센 등에 의해 설명된 바와 같이 "독특한 부위 제거 (USE)" 또는 "우라실-USE" 기법에 의하여 만들었다 [Deng et al., Anal. Biochem. 200:81-88 (1992); Markvardsen et al., BioTechniques 18(3):371-372 (1995)].

주형 플라스미드는 pJS3, 또는 서브틸라제 309 의 변이체를 함유하고 있는 pJS3 의 유사체였고, 예를 들어 USE 돌연변이생성은 G97GASG 삽입 변이체의 제조에 대해 지정된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행하였고, 그 결과 최종적으로 G97GASG 서브틸라제 309 변이체가 생성되었다.

그런 다음 pJS3 에서 제조된 서브틸라제 309 변이체를, 제한 효소 KpnI 과 MluI 를 사용하여 바실루스 서브틸리스 pSX222 발현 플라스미드에 하위클론하였다.

국한된 영역에 무작위 삽입을 삽입시키기 위한 국한된 무작위 돌연변이생성:

국한된 무작위 돌연변이생성을 수행하기 위해 사용한 전체적인 전략은 다음과 같았다:

삽입에 의하여 변형될 아미노산 코돈(들)에 상응하는 뉴클레오티드(들)을 제 외하고, 변형될 DNA 서열의 부분에 상응하는 돌연변이 유발 프라이머 (올리고뉴클레오티드)를 합성하였다.

계속해서, 그 결과 생성된 돌연변이 유발 프라이머를 적당한 반대 프라이머와의 PCR 반응에 사용하였다. 그 결과의 PCR 단편을 정제하고 소화시킨 다음, 대장균-바실루스 서브틸리스 셔틀 벡터안에 클론하였다.

또는 달리, 그리고 필요하다면, 상기의 PCR 단편을 두 번째 적당한 반대 프라이머와의 두 번째 PCR 반응에서 프라이머로서 사용하여, 돌연변이된 영역의 소화 및 셔틀 벡터안으로의 클로닝을 허용하였다. PCR 반응은 정상적인 조건하에서 수행한다.

상기의 전략에 이어서, 국한된 무작위 라이브러리를, 95 내지 103 의 활성 부위 루프안에 삽입이 도입되어 있는 SAVINASE 에서 제조하였다.

돌연변이/삽입을 돌연변이 유발 프라이머에 의해 도입하여서 (하기에서 설명됨), 단지 4 개의 아미노산: Thr, Gly, Ala 및 Ser 만이 각각 두 개의 코돈으로 표시되도록 하였다 (R = 50 % A 및 G; S = 50 % C 및 G; 및 Y = 50 % C 및 T). 생성된 PCR 단편을 플라스미드 pJS3 의 Avr II 및 Not I 부위에 클론하고, 10 개의 무작위로 선택한 대장균 콜로니를 서열화하여 디자인한 돌연변이를 확인하였다.

돌연변이 유발 프라이머 (5'- CTA TAC GCT AAA GTC CTA GGG GCG RSY RSY RSY RSY RSY RSY RSY GTC AGC TCG ATT GCC CAA GG -3'(센스))를, pJS3 의 MluI 부위로부터 아래쪽에 있는 적당한 안티-센스 반대 프라이머 (예컨대 5'- CCC TTT AAC CGC ACA GCG TTT -3'(안티-센스))를 사용하고, 주형으로서 플라스미드 pJS3 을 사용하 는 PCR 반응에 사용하였다. 그 결과의 PCR 생성물을 제한 효소 Avr II 및 Not I 을 사용함으로써 pJS3 셔틀 벡터안에 클론하였다.

그런 다음 pJS3 에 제조된 국한된 무작위 라이브러리를 제한 효소 KpnI 및 MluI 을 사용하여 바실루스 서브틸리스 pSX222 발현 벡터안에 하위클론하였다.

제조된 라이브러리는 대략 100,000 개의 개별적인 클론/라이브러리를 함유하였다.

10 개의 무작위로 선택된 콜로니들을 서열화하여 디자인한 돌연변이를 확인하였다.

본 발명의 서브틸라제 변이체를 정제하기 위하여, 본 발명의 변이체를 포함하고 있는 바실루스 서브틸리스 pSX222 발현 플라스미드를 경합하는 바실루스 서브틸리스 스트레인안에 형질전환시키고, 상술한 바와 같이 10 ㎍/ml 의 클로르암페니콜 (CAM)을 함유하고 있는 배지중에서 발효시켰다.

실시예 2

효소 변이체의 정제

이 과정은 서브틸리신 147 효소, 서브틸리신 309 효소 및 그것들의 혼합물의 2 리터 규모의 발효의 정제에 대해 설명한다.

대략 1.6 리터의 발효 육즙을 1 리터 비이커로 5000 rpm 에서 35 분동안 원심분리하였다. 상층액을 10 % 아세트산을 사용하여 pH 6.5 로 조정하고, Seitz Supra S100 필터 플레이트상에서 여과하였다.

여과액을 아미콘 S1Y10 UF 카트리지가 장착되어 있는 아미콘 CH2A UF 유니트 를 사용하여 대략 400 ml 로 농축하였다. UF 농축액을 원심분리하고 여과한 후, pH 7 에서 바시트라신 친화성 칼럼상에 실온에서 흡수시켰다. 프로테아제를 0.01 M 의 디메틸글루타르산, 0.1 M 의 붕산 및 0.002 M 의 염화 칼슘이 첨가되고 pH 7 로 조정된 완충액중의 25 % 2-프로판올 및 1 M 염화 나트륨을 사용하여 실온에서 바시트리신 칼럼으로부터 용출시켰다.

바시트라신 정제 단계로부터 얻은, 프로테아제 활성을 나타내는 분획들을 모아서 0.01 M 의 디메틸글루타르산, 0.2 M 의 붕산 및 0.002 M 의 염화 칼슘을 함유하고 pH 6.5 로 조정된 완충액으로 평형된 750 ml 의 세파덱스 G25 칼럼 (직경 5 cm)에 적용시켰다.

세파덱스 G25 칼럼으로부터 얻어진, 단백질 분해 활성을 보이는 분획을 모아서 0.01 M 의 디메틸글루타르산, 0.2 M 의 붕산 및 0.002 M 의 염화 칼슘을 함유하고 pH 6.5 로 조정된 완충액으로 평형된 150 ml 의 CM 세파로스 CL 6B 양이온 교환 칼럼 (5 cm 직경)에 적용시켰다.

프로테아제를, 동일한 완충액 2 리터중의 0 내지 0.1 M 의 염화 나트륨(서브틸리신 147 의 경우 0 내지 0.2 M 의 염화 나트륨)의 선형 구배를 사용하여 용출시켰다.

최종 정제 단계로, CM 세파로스 칼럼으로부터 얻어진 프로테아제를 함유하고 있는 분획들을 모아서 GR81PP 멤브레인이 장착되어 있는 아미콘 한외여과 셀 (Danish Sugar Factories Inc. 로부터)에서 농축하였다.

제조 및 상기 단리 과정에 대한 실시예 1 의 기법들을 사용함으로써, 다음의 서브틸리신 309 변이체들을 제조하고 단리하였다:

37.03: G97GASG + A98S+S99G+G100A+S101A;

37.06: G97GAA + A98S+S99G+S101T; 및

37.04: G97GAS + A98S+S99G.

실시예 3

효소 변이체를 포함하고 있는 세제 조성물의 세척 성능

다음의 실시예는 표시된 조건하에서 수행된 많은 세척 시험으로부터 얻어진 결과를 제공한다.

실험 조건

서브틸리신 309 변이체를 평가하기 위한 실험 조건

세제	프로테아제 모델 세제 95
세제 용량	3.0 g/l
pH	10.5
세척 시간	15 분
온도	15 ℃
물의 경도	6。dH
효소	하기 열거되는 바와 같은 서브틸리신 309 변이체들
효소 농도	10 nM
시험 시스템	교반 막대가 부착된 150 ml 의 유리 비이커
섬유/부피	50 ml 의 세제중에 5 개의 섬유 조각 (Ø 2.5 cm)
시험 물질	EMPA117 (Center for Testmaterials, Holland)

사용된 세제는 간단한 모델 제형이다. pH 를 분말 세제에 대한 정상 범위내에 있는 10.5 로 조정한다. 모델 세제 95 의 조성은 다음과 같다:

STP (Na₅P₃O₁₀) 25 %

Na₂SO₄ 25 %

Na₂CO₃ 10 %

LAS (Nansa 80S) 20 %

비이온성 텐사이드 (Dobanol 25-7) 5.0 %

Na₂Si₂O₅ 5.0 %

카르복시메틸셀룰로스 (CMC) 0.5 %

물 9.5 %

탈이온수에 CaCl₂ 및 MgCl₂ (Ca²⁺:Mg²⁺ = 2:1) 을 첨가함으로써 물의 경도를 조정하였다 (Surfactants in Consumer Products - Theory, Technology and Application, Springer Verlag 1986). 세제 용액의 pH 는 HCl 을 첨가함으로써 pH 10.5 로 조정하였다.

시험 물질에 대한 반사율 (R)의 측정은 460 nm 에서 Macbeth ColorEye 7000 광도계를 사용하여 수행하였다. 측정은 제조업자의 프로토콜을 따라 행하였다.

서브틸리신 309 변이체들의 세척 성능을 다음의 성능 인자를 계산함으로써 평가하였다:

P: 성능 인자

R_변이체: 변이체로 세척된 시험 물질의 반사율

R_사비나제 : 사비나제

로 세척된 시험 물질의 반사율

R_블랭크 : 효소 없이 세척된 시험 물질의 반사율

청구된 서브틸리신 309 변이체들은 모두 사비나제

와 비교하여 개선된 세척 성능을 가질 것이다, 즉 P > 1 이다. 변이체들은 대문자로 표시된 개선된 부류로 나누어진다:

부류 A: 1 < P ≤1.5

부류 B: 1.5 < P ≤2

부류 C: P > 2

서브틸리신 309 변이체들 및 개선된 부류

개선된 부류	변이체
A	37.03: G97GASG + A98S+S99G+G100A+S101A 37.04: G97GAS + A98S+S99G
B	37.06: G97GAA + A98S+S99G+S101T
C

상기 표 4 로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 SAVINASE

변이체들은 세척성능이 개선된 것으로 나타난다.

Claims

a) 모 서브틸라제를 코딩하는 DNA 서열에, 아미노산 서열 95-103 위치 (바실러스 아밀로리퀘패시엔스 (Bacillus amyloliquefacients) 서브틸리신 BPN' (BASBPN) 번호 매기기를 사용함)에서 한 개 내지 세 개 아미노산 잔기 삽입에 해당하는 돌연변이를 도입하는 단계;

b) 단계 a)에서 얻어진 돌연변이 도입된 상기 DNA 서열을 숙주 세포에서 발현시키는 단계; 및

c) 모 서브틸라제와 비교하여 개선된 세척 성능을 나타내는, 돌연변이된 서브틸리신을 발현하는 숙주세포를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 세제에서 모 서브틸라제와 비교하여 개선된 세척 성능을 나타내는, 모 서브틸라제의 변이체를 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 삽입된 아미노산 잔기가 T, G, A 및 S 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 모 서브틸라제의 변이체를 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 삽입된 아미노산 잔기가 D, E, H, K 및 R로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 모 서브틸라제의 변이체를 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 삽입된 아미노산 잔기가 C, N, Q, S 및 T로 이루어진 친수성 아미노산 잔기군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 모 서브틸라제의 변이체를 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 삽입된 아미노산 잔기가 A, G 및 V로 이루어지는 작은 소수성 아미노산 잔기 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 모 서브틸라제의 변이체를 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 삽입된 아미노산 잔기가 F, I, L, M, P, W 및 Y로 이루어지는 큰 친수성 아미노산 잔기 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 모 서브틸라제의 변이체를 제조하는 방법.
바실루스 렌투스 (Bacillus lentus) 유래의 성숙한 서브틸리신 309와 비교하여 세제에서 개선된 세척 성능을 갖는 바실루스 렌투스 (Bacillus lentus) 유래의 서브틸리신 309의 단리된 서브틸라제 변이체로서, 서브틸라제 효소가 하기의 삽입들 (서브틸리신 BPN' 번호 매기기를 사용함):

G97GASG; G97GAA; 및 G97GAS; 및

그 삽입의 보존적 변이체 (여기에서, 삽입 변이체는 삽입된 A 또는 S 또는 G가 각각 T, G, A 또는 S로부터 선택되는 잔기로 치환된 것이다)

로 이루어지는 군으로부터 선택된 삽입을 갖는 것을 특징으로 하는 단리된 서브틸라제 변이체.
제 7 항에 있어서, 서브틸라제 효소가 하기의 것들 (서브틸리신 BPN' 넘버링을 사용함)로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 변형을 갖는 것을 특징으로 하는 단리된 서브틸라제 변이체:

G97GASG + A98S+S99G+G100A+S101A;

G97GAA + A98S+S99G+S101T; 및

G97GAS + A98S+S99G.
삭제
제 7 항에 있어서, 상기 삽입이 K27R, ^*36D, S57P, N76D, S87N, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, Y167A, R170S, R170L, R170N, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L, 및 T274A 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 추가의 변형과 조합된 것을 특징으로 하는 서브틸라제 변이체.
제 10 항에 있어서, 추가의 변형은 S101G+V104N, S87N+S101G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A, N76D+S103A+V104I 또는 N76D+V104A, 또는 이들 돌연변이들(V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A)의 다른 조합 중 어느 것으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 서브틸라제 변이체.
제 11 항에 있어서, 상기 변형은 P129K, P131H, A133P, A133D 및 A194P로 이루어지는 군으로부터 선택되는 추가의 변형과 결합되는 것을 특징으로 하는 서브틸라제 변이체.
삭제
제 12 항에 있어서, 서브틸라제 변이체는 하기:

Y167A+R170S+A194P

Y167A+R170L+A194P

Y167A+R170N+A194P

Y167A+R170S+P129K

Y167A+R170L+P129K

Y167A+R170N+P129K

Y167A+R170S+P131H

Y167A+R170L+P131H

Y167A+R170N+P131H

Y167A+R170S+A133P

Y167A+R170L+A133P

Y167A+R170N+A133P

Y167A+R170S+A133D

Y167A+R170L+A133D

Y167A+R170N+A133D로 이루어지는 군으로부터 선택되는 변형을 갖는 것을 특징으로 하는 변이체.
제 7 항의 서브틸라제 변이체를 코드화하는 단리된 DNA 서열.
제 15 항의 단리된 DNA 서열을 포함하고 있는 발현 벡터.
제 16 항의 발현 벡터로 형질전환된 미생물 숙주 세포.
제 17 항에 있어서, 박테리아인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주 세포.
제 17 항에 있어서, 진균 또는 효모인 것을 특징으로 하는 미생물 숙주 세포.
제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 상기 변이체의 발현 및 분비를 유도할 수 있는 조건하에서 배양하고, 변이체를 회수하는 것으로 이루어지는 제 7 항의 서브틸라제 변이체의 제조 방법.
제 7 항에 따르는 서브틸라제 변이체를 포함하고 있는 조성물.
제 21 항에 있어서, 추가로 셀룰라제, 리파제, 큐티나제, 산화환원효소, 다른 프로테아제, 또는 아밀라제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 조성물이 세제 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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