CN103534266A - 包含喜温地芽孢杆菌(geobacillus tepidamans)甘露聚糖酶的洗涤剂组合物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的组合物和方法涉及从喜温地芽孢杆菌(Geobacillus tepidamans)克隆的内切-β-甘露聚糖酶、编码所述内切-β-甘露聚糖酶的多核苷酸，以及它们的使用方法。包含内切-β-甘露聚糖酶的制剂非常适合用作洗涤剂。
Description
优先权
本专利申请要求2011年4月29日提交的国际专利申请No.PCT/CN2011/073536的优先权，该国际专利申请据此全文以引用方式并入。
技术领域
本发明的组合物和方法涉及从喜温地芽孢杆菌克隆的内切-β-甘露聚糖酶、编码内切-β-甘露聚糖酶的多核苷酸以及它们的使用方法。包含内切-β-甘露聚糖酶的制剂非常适合用作洗涤剂。
背景技术
当前的衣物洗涤剂和织物护理组合物包括诸如表面活性剂、酶（蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶和/或纤维素酶）、漂白剂、助洗剂体系、抑泡剂、悬污剂、去污剂、荧光增白剂、软化剂、分散剂、染料转移抑制化合物、研磨剂、杀菌剂和香料之类的活性成分的复杂组合。
包括内切-β-甘露聚糖酶在内的甘露聚糖酶已经用于通过水解甘露聚糖而移除树胶污渍的洗涤剂清洁组合物中。自然界中存在多种甘露聚糖。这些包括直链甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。在每种情况下，多糖包含甘露糖残基的β-1,4-连接主链，所述甘露糖残基可以由葡萄糖残基置换至多到33%（Yeoman et al.,Adv Appl Microbiol,Elsivier（Yeoman等人，《应用微生物学进展》，爱思唯尔出版社））。在半乳甘露聚糖或半乳葡甘露聚糖中，半乳糖残基以α-1,6-键与甘露聚糖主链连接（Moreira and Filho,Appl Microbiol Biotechnol,79:165,2008（Moreira和Filho，《应用微生物学和生物工程》，第79卷，第165页，2008年））。因此，甘露聚糖水解为其组分糖需要内切1,4-β-甘露聚糖酶，该酶水解主链键以生成短链甘露低聚糖，所述低聚糖由1,4-β-甘露糖苷酶进一步降解为单糖。
然而，酶通常被清洁组合物中存在的表面活性剂和其他组分抑制，这干扰其移除污渍的能力。例如，衣物洗涤剂中存在的蛋白酶可能在发生树胶污渍移除之前降解甘露聚糖酶。此外，甘露聚糖酶可能具有它们呈活性的有限pH和/或温度范围，这可使得它们不适于某些制剂和洗涤条件。因此，需要在清洁组合物的苛刻环境下保留活性的内切-β-甘露聚糖酶。
发明内容
本发明的组合物和方法涉及从喜温地芽孢杆菌克隆的内切-β-甘露聚糖酶1(Gte Man1)。包含内切-β-甘露聚糖酶的制剂非常适合用作洗涤剂。
具体地讲，本发明提供了包含内切-β-甘露聚糖酶的催化结构域的重组多肽，其中所述催化结构域与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少70%（70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）相同。本发明还提供了包含内切-β-甘露聚糖酶成熟形式的重组多肽，其中所述成熟形式与SEQID NO:11的氨基酸序列至少80%（80%、85%、86%、87%、88%、89%、90、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）相同。在一些实施例中，在洗涤剂存在的情况下，多肽具有可测量的甘露聚糖酶活性。在一些实施例中，在蛋白酶存在的情况下，多肽具有可测量的甘露聚糖酶活性。在一些实施例中，多肽和蛋白酶均以约0.1至约10.0ppm存在。在一些实施例中，多肽在4.2和6.4之间的pH值保持大于70%的甘露聚糖酶活性。在一些实施例中，多肽具有约5.0的最佳pH。在一些实施例中，其中多肽在48℃至62℃范围内的温度保持大于70%的甘露聚糖酶活性。在一些实施例中，多肽具有约54℃的最佳温度。在一些实施例中，多肽能够水解选自巧克力冰淇淋、瓜耳胶、刺槐豆胶以及它们的组合的底物。在一些实施例中，氨基酸序列与由SEQ ID NO:8-14和30-49组成的组中的一条序列至少95%相同。在一些实施例中，多肽还包含具有1-13个残基的氨基端延伸。在一些实施例中，氨基端延伸包含Ala-Gly-Lys。在一些实施例中，多肽还包含天然的或非天然的信号肽。在一些实施例中，多肽还包含至少一个糖类结合模块。在其他实施例中，多肽不包含糖类结合模块。
本发明还提供了包含至少一种前述段落的重组多肽的洗涤剂组合物。在一些实施例中，该组合物还包含表面活性剂。在一些实施例中，表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、氢化椰油酸钠、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠、C14-15链烷醇聚醚-4以及它们的组合。在一些优选的实施例中，表面活性剂为离子表面活性剂。在一些实施例中，离子表面活性剂选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂以及它们的组合。在一些优选的实施例中，组合物还包含酶，所述酶选自蛋白酶、蛋白酶、过氧化物酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、酰基转移酶、磷脂酶、酯酶、漆酶、过氧化氢酶、芳基酯酶、淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、卡拉胶酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、阿拉伯糖酶、透明质酸酶、软骨素酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、其他内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶以及它们的组合。在一些实施例中，该组合物包含蛋白酶和淀粉酶。在一些实施例中，洗涤剂选自衣物洗涤剂、织物软化洗涤剂、盘碟洗涤剂和硬质表面清洁洗涤剂。在一些实施例中，洗涤剂处于选自液体、粉末、颗粒状固体和片剂的形式。此外，本发明还提供了水解在表面上的污垢或污渍中存在的甘露聚糖底物的方法，该方法包括：使表面与洗涤剂组合物接触以获得清洁的表面。还提供了清洁纺织物的方法，该方法包括：使玷污的纺织物与洗涤剂组合物接触以获得清洁的纺织物。
此外，本发明提供了编码前述段落的重组多肽的分离的核酸。还提供了包含与调控序列有效组合的分离核酸的表达载体。另外，还提供了包含表达载体的宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞为细菌细胞或真菌细胞。本发明还提供了制备内切-β-甘露聚糖酶的方法，该方法包括：将宿主细胞在合适的条件下在培养基中培养，以形成包含内切-β-甘露聚糖酶的培养物。在一些实施例中，该方法还包括通过离心从培养物移除宿主细胞，以及通过过滤移除小于10kDa的碎片，从而获得富含内切-β-甘露聚糖酶的上清液。本发明还提供了用于水解多糖的方法，包括：使包含甘露糖的多糖与上清液接触以获得包含甘露糖的低聚糖。在一些实施例中，多糖选自甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖以及它们的组合。
Gte Man1组合物和方法的这些和其他方面将从以下描述显而易见。
附图说明
图1提供了pZQ184(aprE-Gte Man1)的质粒图谱。
图2A示出了Gte Man1在Small&Mighty液体洗涤剂中的清洁性能。图2B示出了Gte Man1在奥妙洁彩(OMO Color)粉末洗涤剂中的清洁性能。
图3A示出了Gte Man1的pH特征图。图3B示出了基准内切-β-甘露聚糖酶(MannastarTM)的pH特征图。
图4A示出了Gte Man1的温度特征图。图4B示出了基准内切-β-甘露聚糖酶(MannastarTM)的温度特征图。
图5A示出了Gte Man1在50℃和pH5.0保持10分钟后的甘露聚糖酶活性。图5B示出了Gte Man1在30℃和pH8.2保持30分钟后的甘露聚糖酶活性。
图6A-D提供了Gte Man1成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)与其他微生物甘露聚糖酶的序列(SEQ ID NO:15-27)的比对。表7-1通过NCBI和SEQ ID NO列出了同源甘露聚糖酶。
图7提供了Gte Man1的进化系统树。
图8示出了Gte Man1的预测的功能结构域。Gte Man1的催化结构域(SEQ ID NO:12)对应于SEQ ID NO:10的残基18-311。标出了两个预测的催化性谷氨酸(E)残基。还示出了Gte Man1的两个预测的糖类结合模块。
图9提供了Gte Man1和Gte Man1C端截短的蛋白结构域的图解。
图10A-D提供了pLL003(aprE-Gte Man11-300)、pLL004(aprE-GteMan11-475)、pLL005(aprE-Gte Man11-675)和pLL006(aprE-Gte Man11-850)的质粒图谱。
具体实施方式
I.简介
描述了与从喜温地芽孢杆菌菌株DSM16325克隆的内切-β-甘露聚糖酶1(Gte Man1)有关的组合物和方法。所述组合物和方法部分地基于观察到重组Gte Man1在洗涤剂组合物存在的情况下具有糖基水解酶活性。GteMan1的这个特征使其非常适合用于多种清洁应用，其中酶可以在洗涤剂组合物中找得到的表面活性剂和其他组分存在的情况下水解甘露聚糖。
II.定义
在详细描述本发明的组合物和方法之前，为清楚起见定义以下术语。未定义的术语和缩写应当与如本领域中所用的其通常含义相一致。
如本文所用，“甘露聚糖内切1,4-β-甘露糖苷酶”、“内切1,4-β-甘露聚糖酶”、“内切-β-1,4-甘露聚糖酶”、“β-甘露聚糖酶B”、“β-1,4-甘露聚糖4-甘露聚糖水解酶”、“内切-β-甘露聚糖酶”、“β-D-甘露聚糖酶”、“1,4-β-D-甘露聚糖甘露聚糖水解酶”或“内切-β-甘露聚糖酶”(EC3.2.1.78)指能够水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷键的酶。内切1,4-β-甘露聚糖酶为糖基水解酶的若干家族的成员，包括GH26和GH5。具体地讲，内切-β-甘露聚糖酶构成降解甘露聚糖的一组多糖酶并且指能够裂解包含甘露糖单元的多糖链（即，能够裂解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖中糖苷键）的酶。本发明的“内切-β-甘露聚糖酶”可以具有额外的酶活性（如，内切1,4-β-葡聚糖酶、1,4-β-甘露糖苷酶、纤维糊精酶活性等）。
如本文所用，“甘露聚糖酶”、“甘露糖苷酶”、“甘露分解酶”、“甘露聚糖酶多肽”或“甘露聚糖酶蛋白质”指显示甘露聚糖降解能力的酶、多肽或蛋白质。甘露聚糖酶可以是（例如）内切-β-甘露聚糖酶、外切β-甘露聚糖酶或糖基水解酶。如本文所用，甘露聚糖酶活性可以根据本领域已知的任何方法确定（参见如Lever,Anal.Biochem,47:248,1972（Lever，《分析生物化学》第47卷，第248页，1972年）；美国专利No.6,602,842；以及国际专利公开No.WO 95/35362A1）。
如本文所用，“甘露聚糖”为具有由β-1,4-连接的甘露糖构成的主链的多糖；“葡甘露聚糖”为具有由更规则或更不规则交替的β-1,4连接的甘露糖和葡萄糖构成的主链的多糖；“半乳甘露聚糖”和“半乳葡甘露聚糖”为具有α-1,6连接的半乳糖侧枝的甘露聚糖和葡甘露聚糖。这些化合物可以是乙酰化的。通过完全或部分移除半乳糖侧枝，促进半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的降解。另外，还通过完全或部分脱乙酰作用，促进乙酰化的甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的降解。可以通过碱或通过甘露聚糖乙酰酯酶移除乙酰基。从甘露聚糖酶释放或通过甘露聚糖酶与α-半乳糖苷酶和/或甘露聚糖乙酰酯酶的组合所释放的低聚物可以进一步由β-甘露糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶降解以释放麦芽糖。
如本文所用，“催化活性”或“活性”定量地描述了给定底物在限定的反应条件下的转化率。术语“残余活性”定义为酶在某组条件下的催化活性与一组组不同条件下的催化活性的比率。术语“比活性”定量地描述了每份酶在限定的反应条件下的催化活性。
如本文所用，“pH稳定性”描述蛋白经受有限暴露于下述pH值的特性，所述pH值明显偏离于其稳定性最佳的pH（例如，高于或低于最佳pH多于一个pH单位，而不会在其活性可测量的条件下丧失其活性）。
如本文所用，短语“洗涤剂稳定性”指所指定的洗涤剂组合物组分（如水解酶）在洗涤剂组合物混合物中的稳定性。
如本文所用，“过水解酶”是能够催化下述反应的酶，所述反应导致形成适于诸如清洁、漂白和消毒的应用的过酸。
如本文所用，短语“含水组合物”和“含水环境”中使用的术语“含水”指由至少50%的水组成的组合物。含水组合物可以包含至少50%的水、至少60%的水、至少70%的水、至少80%的水、至少90%的水、至少95%的水、至少97%的水、至少99%的水或甚至至少99%的水。
如本文所用，术语“表面活性剂”指本领域通常认可为具有表面活性性质的任何化合物。表面活性剂通常包括阴离子、阳离子、非离子和两性离子化合物，本文将对其作进一步描述。
如本文所用，“表面性质”用于指静电荷，以及蛋白质表面所展现的诸如疏水性和亲水性之类的性质。
术语“氧化稳定性”指在本文所公开的甘露糖苷化、水解、清洁或其他过程期间占优的条件下（例如同时暴露于漂白剂或氧化剂或与它们接触时）在给定时间段内保持指定量的酶活性的本发明内切-β-甘露聚糖酶。在一些实施例中，内切-β-甘露聚糖酶在与漂白剂或氧化剂接触给定的时间段（例如，至少约1分钟、约3分钟、约5分钟、约8分钟、约12分钟、约16分钟、约20分钟等）之后保持至少约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约92%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的内切-β-甘露聚糖酶活性。
术语“螯合剂稳定性”指在本文所公开的甘露糖苷化、水解、清洁或其他过程期间占优的条件下（例如同时暴露于螯合剂或与其接触时）在给定时间段内保持指定量的酶活性的本发明内切-β-甘露聚糖酶。在一些实施例中，内切-β-甘露聚糖酶在与螯合剂接触给定的时间段（例如，至少约10分钟、约20分钟、约40分钟、约60分钟、约100分钟等）之后保持至少约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约92%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的内切-β-甘露聚糖酶活性。
术语“热稳定性”和“热稳定的”指在本文所公开的甘露糖苷化、水解、清洁或其他过程期间占优的条件下（例如同时暴露于改变的温度）在暴露于确定的温度持续给定时间段后仍保持指定量的酶活性的本发明内切-β-甘露聚糖酶。改变的温度包括升高或降低的温度。在一些实施例中，内切-β-甘露聚糖酶在暴露于改变的温度下给定的时间段（例如，至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等）之后保持至少约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约92%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的内切-β-甘露聚糖酶活性。
术语“清洁活性”指在本文所公开的甘露糖苷化、水解、清洁或其他过程期间占优的条件下由内切-β-甘露聚糖酶实现的清洁性能。在一些实施例中，通过以下方式确定清洁性能：在使污渍经受标准洗涤条件之后，应用与酶敏感性污渍（例如冰淇淋、番茄酱、烧烤酱、蛋黄酱、巧克力牛奶、爽身水、刺槐豆胶或瓜耳胶）相关的多种清洁测定法，如通过各种色谱、分光光度法或其他定量方法确定。示例性的测定法包括但不限于WO99/34011、美国专利No.6,605,458和美国专利No.6,566,114中所述的那些（所有专利均以引用的方式并入本文）以及实例中包括的那些方法。
如本文所用，术语“清洁的表面”和“清洁的纺织物”分别指具有沾污表面或纺织物的至少10%，优选至少15%、20%、25%、30%、35%或40%的污渍去除百分比的表面或纺织物。
术语“内切-β-甘露聚糖酶的清洁有效量”指在具体清洁组合物中实现所需水平酶活性的本文前述的内切-β-甘露聚糖酶量。此类有效量由本领域的普通技术人员轻易地确定，并且基于多种因素，例如使用的具体内切-β-甘露聚糖酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成以及是否需要液态组合物或干燥（如，颗粒状、棒状）组合物等。
如本文所用，术语“清洁辅助材料”指经选择用于具体类型的所需清洁组合物和产品形式（如，液体、颗粒、粉末、棒、糊剂、喷雾、片剂、凝胶或泡沫组合物）的任何液态、固态或气态材料，所述材料还优选地与组合物中使用的内切-β-甘露聚糖酶相容。在一些实施例中，颗粒状组合物处于“致密”形式，而在其他实施例中，液态组合物处于“浓缩”形式。
如本文所用，“清洁组合物”和“清洁制剂”指用于从待清洁的物品（例如织物、盘子、隐形眼镜、其他固体表面、毛发、皮肤、牙齿等）移除不需要的混合物（如，污垢或污渍）的化学成分的混合物。该组合物或制剂可以处于液体、凝胶、颗粒、粉末或喷雾的形式，这取决于待清洁的表面、物品或织物，以及组合物或制剂的所需形式。
如本文所用，术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂制剂”指旨在洗涤介质中用于清洁玷污物体的化学成分的混合物。洗涤剂组合物/制剂通常包含至少一种表面活性剂，并可以任选地包含水解酶、氧化还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、染蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。
如本文所用，“洗涤组合物”或“衣物洗涤剂”指用于清洁纺织物的所有形式的组合物，包括但不限于颗粒状和液体形式。在一些实施例中，洗涤组合物为用于电动洗衣机的组合物。本发明不意在受限于任何具体类型的洗涤组合物。实际上，本发明用于清洁多种织物。
如本文所用，“盘碟洗涤组合物”指用于清洁包括餐具在内的盘碟的所有形式的组合物，包括但不限于颗粒状和液体形式。在一些实施例中，盘碟洗涤组合物为可用于自动洗碗机的“自动盘碟洗涤”组合物。本发明不意在受限于任何具体类型的盘碟洗涤组合物。实际上，本发明用于清洁任何材料的盘碟（如器皿，包括但不限于碟子、杯子、玻璃杯、碗等）和餐具（如器具，包括但不限于匙、餐刀、餐叉、上菜器具等），所述材料包括但不限于陶瓷、塑料、金属、瓷、玻璃、丙烯酸树脂等。本文中所用的术语“盘碟”指器皿和餐具。
如本文所用，术语“漂白”指在合适的pH和温度条件下处理材料（如织物、衣物、纸浆等）或表面持续足够长的时间，以实现材料的增亮（即，变白）和/或清洁。适用于漂白的化学品的例子包括但不限于ClO2、H2O2、过酸、NO2等。
如本文所用，变体内切-β-甘露聚糖酶的“洗涤性能”指变体内切-β-甘露聚糖酶对洗涤的贡献，这种贡献在不向组合物添加变体内切-β-甘露聚糖酶的情况下向洗涤剂提供额外的清洁性能。洗涤性能是在相关的洗涤条件下进行比较。
术语“相关的洗涤条件”在本文中用于指在盘碟和衣物洗涤剂细分市场中家居下实际使用的条件，尤其洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。
如本文所用，术语“消毒”指从表面除去污染物，以及抑制或杀死物品表面上的微生物。本发明不意在受限于任何特定表面、物品或待移除的污染物或微生物。
本文的清洁组合物的“致密”形式最佳地由密度反映，并且就组成而言，由无机填料盐的量反映。无机填料盐是处于粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规的洗涤剂组合物中，填料盐以巨大的量存在，通常占总组合物的约17至约35重量%。相比之下，在致密型组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15%的量存在。在一些实施例中，填料盐以不超过所述组合物的约10重量%，或更优选不超过约5重量%的量存在。在一些实施例中，无机填料盐选自碱金属和碱土金属硫酸盐和氯化物。在一些实施例中，优选的填料盐为硫酸钠。
如本文所用，术语“纺织物”或“纺织物材料”指机织物以及适于转化成或用作纱线、机织织物、针织织物和非织造织物的短纤维和原丝。该术语涵盖由天然纤维以及合成（如，制造）纤维制成的纱线。
如本文所用，术语“纯化的”和“分离的”指主题分子（例如，来自其天然来源（如，喜温地芽孢杆菌）的Gte Man1)或其他分子（例如蛋白质、核酸、脂类、培养基组分等）的物理分离。一旦纯化或分离，主题分子可以占样品中材料总量的至少50重量%、甚至至少60重量%、至少70重量%、至少80重量%、至少85重量%、至少90重量%、至少95重量%或更多（重量/重量）。
如本文所用，“多肽”指包含多个通过肽键连接的氨基酸的分子。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用。蛋白质可以任选地经修饰（如，糖基化、磷酰化、酰化、法尼基化、异戊烯基化、磺化、聚乙二醇化等），以增加功能。如果此类氨基酸序列显示活性，则它们可以称为“酶”。使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码，其中氨基酸序列以标准的氨基端至羧基端方向（即，N→C）提供。
术语“多核苷酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可以是单链或双链的，并可以具有化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用。由于遗传密码具有简并性，故多于一个密码子可以用来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另外指明，否则核酸序列以5′至3′方向存在。
如本文所用，术语“野生型”和“天然的”指自然界中存在的多肽或多核苷酸。
关于多肽的术语“野生型”、“亲本”或“参考”指在一个或多个氨基酸位置处不包括人造的置换、插入或缺失的天然存在多肽。类似地，关于多核苷酸的术语“野生型”、“亲本”或“参考”指不包括人造的核苷改变的天然存在多核苷酸。然而，应注意，编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，而涵盖编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的任何多核苷酸。
如本文所用，“变体多肽”指通过置换、添加或缺失一个或多个氨基酸，通常利用重组DNA技术，从亲本（或参考）多肽衍生的多肽。变体多肽可与亲本多肽相差少量的氨基酸残基，并可以通过它们的主要氨基酸序列与亲本多肽的同源性/同一性水平进行定义。优选地，变体多肽与亲本多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的氨基酸序列同一性。本发明的亲本多肽包括由SEQ ID NO:6-14和30-49所组成的组中列出的那些，并且
可以使用诸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL之类的已知程序，使用标准参数确定序列同一性。（参见，如Altschul et al.[1990]J.Mol.Biol.215:403-410（Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页）；Henikoff et al.[1989]Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915（Henikoff等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第10915页）；Karin et al.[1993]Proc.Natl.Acad.Sci USA90:5873（Karin等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873页）；以及Higgins et al.[1988]Gene73:237-244（Higgins等人，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页））。用于执行BLAST分析的软件是通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)可公开获得的。另外，可以使用FASTA对数据库进行搜索（Pearson et al.[1988]Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-2448（Pearson等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页））。两条多肽基本上相同的一个指标是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。通常，因保守氨基酸置换而不同的多肽是有免疫交叉反应性的。因此，一种多肽与第二多肽基本上相同，例如，在此情况下两种肽仅因保守置换而不同。
如本文所用，“变体多核苷酸”编码变体多肽、与亲本多核苷酸具有指定程度的同源性/同一性，或者在严格条件下与其亲本多核苷酸或互补物杂交。优选地，变体多核苷酸与亲本多核苷酸具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的核苷酸序列同一性。确定同一性百分比的方法是本领域已知的并且上文刚刚描述过。
术语“源自”涵盖术语“来源于”、“从...获得”、“可由...获得”、“分离自”和“由...产生”，并且通常是指一种指定材料在另一指定材料中找到其起源或者具有可参照另一指定材料而描述的特征。
如本文所用，术语“杂交”指用于使一条核酸链通过本领域已知的碱基配对与互补链接合的方法。
如本文所用，术语“杂交条件”指进行杂交反应的条件。这些条件通常根据测量杂交的条件的“严格性”程度进行分类。严格性程度可以基于（例如）核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最大严格性”通常在约Tm-5℃（比探针的Tm低5℃）出现；“高严格性”在Tm以下约5-10℃出现；“中等严格性”在探针Tm以下约10-20℃出现；并且“低严格性”在Tm以下约20-25℃出现生。作为另外一种选择或除此以外，杂交条件可以基于杂交和/或一种或多种严格洗涤的盐或离子强度条件，如，6×SSC=极低严格性，3×SSC=低至中等严格性，1×SSC=中等严格性，0.5×SSC=高严格性。在功能上，最大严格条件性可以用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近严格同一性的核酸序列；而高严格性条件用于鉴定与探针具有约80%或更高序列同一性的核酸序列。对于需要高选择性的应用，通常期望使用相对严格的条件以形成杂交体（如，使用相对低的盐和/或高温度条件）。如本文所用，严格条件定义为50℃和0.2×SSC（1×SSC=0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0）。
在关于至少两条核酸或多肽的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”意指，多核苷酸或多肽包含与亲本或参考序列具有至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或甚至至少约99%的同一性，或者不包括在不增加功能性的情况下仅为避开本描述所作的氨基酸置换、插入、缺失或修饰的序列。
如本文所用，“表达载体”指含有编码指定多肽并与合适控制序列可操作连接的DNA序列的DNA构建体，所述控制序列能够实现多肽在适当的宿主中的表达。这种控制序列包括实现转录的启动子、控制这种转录的可选择的操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。该载体可为质粒、噬菌体颗粒或只是潜在的基因组插入物。一旦转化入适当的宿主中，该载体可以独立于宿主基因组而复制并发挥功能，或者在一些情况下整合入基因组自身中。
术语“重组”指遗传物质（即，核酸、它们编码的多肽以及包含此类多核苷酸的载体和细胞）经改性以改变其序列或表达特性，例如通过将编码序列突变以获得改变的多肽、将所述编码序列与另一个基因的编码序列融合融合、将基因置于不同启动子的控制下、在异源生物中表达基因、以降低或升高的水平表达基因、以不同于其天然表达谱的方式使基因进行条件性表达或组成型表达等。通常，重组核酸、多肽和以它们为基础的细胞已受人类操纵，从而它们与自然界中存在的相关核酸、多肽和细胞不同。
“信号序列”指与多肽的N-端部分结合的氨基酸序列，其促进成熟形式的蛋白质从细胞分泌。成熟形式的细胞外蛋白质不存在信号序列，信号序列在分泌过程期间被切除。
术语“选择性标记”或“选择标记”指能够在宿主细胞中表达的允许轻易选择那些包含已引入核酸或载体的宿主的基因。选择标记的例子包括但不限于抗微生物物质（如潮霉素、博莱霉素或氯霉素）和/或赋予宿主细胞代谢优势（诸如营养优势）的基因。
如本文所用，术语“调控因子”指控制核酸序列表达的某方面的遗传元件。例如，启动子为有利于引发可操作地连接的编码区的转录的调控因子。另外的调控因子包括剪接信号、聚腺苷酸化信号和终止信号。
如本文所用，“宿主细胞”通常是以使用本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染的原核或真核宿主。转化的宿主细胞能够复制编码蛋白质变体的载体或表达所需的蛋白质变体。在编码前形式或原形式蛋白质变体的载体的情况下，当表达时，这种变体一般从宿主细胞分泌到宿主细胞培养基中。
在将核酸序列插入细胞的情况下，术语“引入”意指转化、转导或转染。转化的方法包括本领域已知的原生质体转化法、氯化钙沉淀法、电穿孔法、裸DNA法等。（参见Chang and Cohen[1979]Mol.Gen.Genet.168:111-115（Chang和Cohen，1979年，《分子遗传学与普通遗传学》第168卷，第111-115页）；Smith et al.[1986]Appl.Env.Microbiol.51:634（Smith等人，1986年，《应用环境微生物学》第51卷，第634页）；以及Ferrari等人在Harwood,Bacillus,Plenum Publishing Corporation,pp.57-72,1989（普莱南出版公司1989年出版的由Harwood编辑的《芽孢杆菌》第57-72页）中的综述文章）。
如本文所用，术语“可选标记”或“可选基因产物”指编码酶活性的基因的使用，该酶活性给表达该选择性标记的细胞赋予抗生素或药物抗性。
其他科技术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同（参见例如Singleton and Sainsbury,Dictionary of Microbiology andMolecular Biology,2d Ed.,John Wiley and Sons,NY1994（Singleton和Sainsbury，《微生物学与分子生物学词典》第二版，纽约约翰·威利父子出版公司，1994年）；以及Hale and Marham,The Harper Collins Dictionaryof Biology,Harper Perennial,NY1991（Hale和Marham，《哈普柯林斯生物学词典》，纽约哈珀永久出版社，1991年））。
除非文中另外明确说明，否则单数术语“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义。
如本文结合数值所用，术语“约”指数值的-10%至+10%的范围。例如，短语“约6的pH值”指从5.4至6.6的pH值。
标题是为了便利而提供的，并且不应理解为限制性的。在一个标题下包括的描述可以适用于整篇说明书。
III.Gte Man1多肽、多核苷酸、载体和宿主细胞
A.Gte Man1多肽
在一个方面，本发明的组合物和方法提供了重组的Gte Man1内切-β-甘露聚糖酶多肽、其片段或其变体。示例性的Gte Man1多肽从喜温地芽孢杆菌中所获得的多核苷酸重组表达。成熟的Gte Man1多肽具有如SEQ IDNO:11所述的氨基酸序列。类似地，基本上相同的Gte Man1多肽可以存在于自然界中，如存在于地芽孢杆菌(Geobacillus)的其他菌株或分离物中。本发明的组合物和方法涵盖这些和其他Gte Man1多肽。本发明的GteMan1多肽包括保持甘露聚糖酶活性的截短形式GteMan1，包括C-端截短物。这些多肽包括如实例中所述以及如SEQ ID NO:8-14和30-49所示的多肽。
在一些实施例中，分离的Gte Man1多肽为变体Gte Man1多肽，其与示例的Gte Man1多肽具有指定程度的氨基酸序列同一性，如与SEQ IDNO:11的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。可以通过氨基酸序列对比确定序列同一性，如，使用如本文所述的例如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序。
在一些实施例中，分离的Gte Man1多肽为变体Gte Man1多肽，其与示例的Gte Man1多肽具有指定程度的氨基酸序列同一性，如与SEQ IDNO:8-14或30-49中的任一者的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。可以通过氨基酸序列对比确定序列同一性，如，使用如本文所述的例如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序。
在某些实施例中，重组产生Gte Man1多肽，而在其他实施例中，GteMan1多肽以合成方式产生，或者从天然来源（地芽孢杆菌属物种(Geobacillus sp.)）中纯化获得。
在某些其他实施例中，分离的Gte Man1多肽包括基本上不影响多肽的结构和/或功能的置换。示例性的置换为保守突变，如表1中所汇总。
表I：氨基酸置换
通常通过使编码重组的Gte Man1多肽的核酸发生突变，然后在生物中表达变体多肽来进行涉及天然存在氨基酸的置换。涉及非天然存在氨基酸或氨基酸化学修饰的置换通常通过在重组Gte Man1多肽由生物来合成后化学修饰该多肽来进行。
在一些实施例中，分离的变体Gte Man1多肽与SEQ ID NO:11基本上相同，这意味着它们不包括并不显著影响多肽的结构、功能或表达的氨基酸置换、插入或缺失。此类分离的变体Gte Man1多肽包括仅设计以规避本说明书的那些。
在一些实施例中，分离的Gte Man1多肽（包括其变体）具有1,4-β-D-甘露糖苷水解酶活性，其包括甘露聚糖酶、内切-1,4-β-D-甘露聚糖酶、外切-1,4-β-D-甘露聚糖酶半乳甘露聚糖酶和/或葡甘聚糖酶活性。1,4-β-D-甘露糖苷水解酶活性可以使用本文所述的测定法或本领域已知的其他测定法测量和确定。在一些实施例中，分离的Gte Man1多肽在洗涤剂组合物的存在情况下具有活性。
Gte Man1多肽包括“全长”Gte Man1多肽的保持1,4-β-D-甘露糖苷水解酶活性的片段。此类片段优选地保留全长多肽的活性位点，但可以具有非关键的氨基酸残基的缺失。片段的活性可以使用本文所述的测定法或本领域已知的其他测定法容易地确定。在一些实施例中，Gte Man1多肽的片段在洗涤剂组合物存在的情况下保持1,4-β-D-甘露糖苷水解酶活性。在一些实施例中，Gte Man1多肽包含Gte Man1的催化结构域(SEQ ID NO:12)，或者包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的催化结构域。
在一些实施例中，将Gte Man1氨基酸序列和衍生物制备为N-端和/或C-端融合蛋白，例如以便有助于提取、检测和/或纯化和/或向Gte Man1多肽添加功能特性。融合蛋白伴侣的例子包括但不限于：谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6XHis、GAL4（DNA结合和/或转录激活域）、FLAG、MYC、BCE103(WO2010/044786)或本领域任何技术人员熟知的其他标签。在一些实施例中，蛋白水解裂解位点在融合蛋白伴侣与目的蛋白序列之间提供，以允许移除融合蛋白序列。优选地，融合蛋白不妨碍分离的Gte Man1多肽的活性。
在一些实施例中，分离的Gte Man1多肽与包括前导肽、前肽、结合域（模块）和/或催化结构域在内的功能结构域融合。合适的结合域包括但不限于具有各种特异性的碳水化合物结合域（如，CBD），从而提供对应用分离的Gte Man1多肽期间存在的碳水化合物组分增加的亲和力。如本文所述，Gte Man1多肽的CBD和催化结构域可操作地连接。
在一些实施例中，分离的Gte Man1多肽融合到包括前导肽、前肽、一个或多个结合域（模块）和/或催化结构域在内的功能结构域。合适的结合域包括但不限于具有各种特异性的糖类结合模块（如，CBM），从而提供对应用分离的Gte Man1多肽期间存在的碳水化合物组分增加的亲和力。如本文所述，Gte Man1多肽的CBM和催化结构域可操作地连接。
糖类结合模块(CBM)定义为碳水化合物活性酶内部具有独立折叠的连续氨基酸序列，所述独立折叠具备碳水化合物结合活性。少数例外是纤维素酶体支架蛋白中的CBM以及单独的推定CBM的罕见情况。对CBM作为模块在较大的酶内存在的要求使得这个类别的碳水化合物结合蛋白与其他非催化性糖结合蛋白（例如，凝集素和糖转运蛋白）区分。基于最初发现结合纤维素的几种模块，CBM先前划分为纤维素结合域(CBD)（Tommeet al.,Eur J Biochem,170:575-581,1988（Tomme等人，《欧洲生物化学杂志》第170卷，第575-581页，1988年）；以及Gilkes et al.,J Biol Chem,263:10401-10407,1988（Gilkes等人，《生物化学杂志》第263卷，第10401-10407页，1988年））。然而，持续发现在碳水化合物活性酶中结合除纤维素之外的碳水化合物然而却符合CBM标准的额外模块，因此需要使用更具包容性的分类学对这些多肽重新分类。先前对纤维素结合域的分类基于氨基酸相似性。将CBD的分组称为“型”并用罗马数字编号（如，I型或II型CBD）。为了与糖苷水解酶分类相符，现在将这些分组称为家族并用阿拉伯数字编号。1至13家族与I至XIII型相同（Tomme etal.,Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides(Saddler,J.N.&Penner,M.,eds.)，Cellulose-binding domains:classification and properties pp.142-163,American Chemical Society,Washington,1995（Tomme等人，“酶降解不溶多糖”（由Saddler,J.N.和Penner,M.编辑），《纤维素结合域：分类和性质》第142-163页，美国化学协会，华盛顿，1995年））。对CBM的结构和结合模式的详细评论可以见于Boraston et al.,Biochem J,382:769-81,2004（Boraston等人，《生物化学杂志》第382卷，第769-781页，2004年）。预期对CBM的家族分类将：有助于鉴定CBM，在一些情况下，预测结合特异性，有助于鉴定功能性残基，揭示进化关系并且可能预测多肽折叠。因为蛋白质的折叠比它们的序列更为保守，所以可以将CBM家族中的一些分为超家族或族群(clan)。现有的CBM家族为1-63。CBM/CBD还在藻类如红藻紫菜(Porphyra purpurea)中作为非水解性多糖结合蛋白存在。然而，CBD中的大多数来自纤维素酶和木聚糖酶。CBD存在于蛋白质的N-端和C-端或位于内部。酶杂合体是本领域已知的（参见如WO90/00609和WO 95/16782），并且可以通过以下方式制备：将包含编码纤维素结合域的至少一个DNA片段的DNA构建体转化入宿主细胞,所述DNA片段在采用或不采用接头的情况下与编码所公开的Gte Man1多肽的DNA序列连接，并且培育宿主细胞以表达融合基因。酶杂合体可以用下式描述：
CBM-MR-X或X-MR-CBM
在上式中，CBM是与至少糖类结合模块对应的氨基酸序列N-端或C-端区域；MR为中间区域（接头），并且可以是键，或者优选地具有约2至约100个碳原子、更优选地具有2至40个碳原子的短连接基团，或者优选地为约2至约100个氨基酸、更优选地为2至40个氨基酸；X为具有甘露聚糖酶催化活性的所公开Gte Man1多肽的N-端或C-端区域。另外，甘露聚糖酶可以包含多于一个CBM或非糖酵解功能的其他模块/结构域。术语“模块”和“结构域”在本发明中可以互换使用。
合适的酶活性结构域具有支持分离的Gte Man1多肽在制备所需产品时发挥作用的活性。催化结构域的非限制性例子包括：纤维素酶、半纤维素酶（例如木聚糖酶）、外切-甘露聚糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖苷酶、果胶酶和/或其他活性，例如蛋白酶、脂肪酶、酸性磷酸酶和/或其他酶或它们的功能性片段。融合蛋白任选地通过接头序列与分离的GteMan1多肽连接，所述接头序列仅将Gte Man1多肽与融合域连接在一起，而不会显著影响任一组分的性质，或者接头任选地针对预期应用具有功能重要性。
或者，本文所述的分离的Gte Man1多肽与一种或多种另外的目的蛋白联合使用。目的蛋白的非限制性例子包括：半纤维素酶、外切-β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、乳糖酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、纤维素酶、木糖苷酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖乙酰酯酶、半乳聚糖酶、外切-甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、果胶甲酯酶、聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、漆酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、蛋白酶、淀粉酶、磷酸酶、脂解酶、角质酶和/或其他酶。
在其他实施例中，分离的Gte Man1多肽与用于指导分离的Gte Man1多肽分泌至细胞外的信号肽融合。例如，在某些实施例中，信号肽为天然的Gte Man1信号肽。在其他实施例中，信号肽为非天然的信号肽，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)AprE信号肽。在一些实施例中，分离的Gte Man1多肽具有在成熟形式和信号肽之间的N-端延伸Ala-Gly-Lys。
在一些实施例中，分离的Gte Man1多肽在异源生物中表达，所述异源生物即除琼脂粘附芽孢杆菌(Bacillus agaradhaerens)之外的生物。示例性的异源生物为革兰氏阳性细菌，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、地芽孢杆菌（以前称为嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)）、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌(Escherichia coli)；酵母，例如酵母属(Saccharomycesspp.)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces spp.)，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；以及丝状真菌，例如曲霉属(Aspergillus spp.)，如米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillus niger)和里氏木霉(Trichodermareesei)。将核酸转化入这些生物的方法是本领域熟知的。用于转化曲霉菌(Aspergillus)宿主细胞的合适方法在EP 238 023中描述。
在特定的实施例中，分离的Gte Man1多肽在异源生物中作为分泌多肽表达，在这种情况下，所述组合物和方法涵盖将Gte Man1多肽在异源生物中作为分泌型多肽表达的方法。
B.Gte Man1多核苷酸
所述组合物和方法的另一个方面是编码分离的Gte Man1多肽（包括其变体和片段）的多核苷酸，其在用于指导Gte Man1多肽在异源生物（如本文中识别的那些）中表达的表达载体的背景下提供。编码Gte Man1多肽的多核苷酸可以可操作地连接到调控元件（如，启动子、终止子、增强子等），以帮助表达编码的多肽。
编码Gte Man1多肽的示例性多核苷酸序列具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列。类似的（包括基本上相同的）编码Gte Man1多肽和变体的多核苷酸可以存在于自然界中，如，存在于地芽孢杆菌的其他菌株或分离物中。应当理解，根据遗传密码的简并性，具有不同核苷酸序列的多核苷酸可以编码相同的Gte Man1多肽、变体或片段。
在一些实施例中，编码Gte Man1多肽的多核苷酸与编码Gte Man1多肽的示例的多核苷酸具有指定程度的氨基酸序列同一性，如与SEQ IDNO:11的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。在一些实施例中，多核苷酸编码Gte Man1多肽，所述Gte Man1多肽包含Gte Man1的催化结构域(SEQ ID NO:12)，或者与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的催化结构域。同源性可以通过氨基酸序列对比确定，如使用如本文所述的例如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序。
在一些实施例中，编码Gte Man1多肽的多核苷酸在用于指导GteMan1多肽分泌至细胞外的信号肽的编码序列后方（即，下游）符合可读框地融合。异源信号序列包括来自细菌纤维素酶基因的那些。表达载体可以在适于表达Gte Man1多肽的异源宿主细胞中提供，或在适于将所述表达载体引入合适的宿主细胞之前增殖表达载体的异源宿主细胞中提供。
在一些实施例中，编码Gte Man1多肽的多核苷酸在指定的杂交条件下与SEQ ID NO:1的示例性多核苷酸（或其互补物）杂交。示例性条件是本文所述的严格条件和高度严格条件。
Gte Man1多核苷酸可以是天然存在的或合成的（即人造的），并且可以经过密码子优化以在不同宿主中表达、经突变以引入克隆位点或以其他方式改变以增加功能性。
C.Gte Man1载体和宿主细胞
为了制备本发明所公开的Gte Man1多肽，编码多肽的DNA可以从公布的序列化学合成或从包含基因的宿主细胞直接获得（如，通过cDNA库筛选或PCR扩增）。在一些实施例中，在表达盒中包括Gte Man1多核苷酸和/或通过标准分子克隆技术将其克隆到合适的表达载体中。此类表达盒或载体包含有助于启动和终止转录的序列（如，启动子和终止子），并通常包含选择标记。
将表达盒或载体引入合适的表达宿主细胞中，所述表达宿主细胞然后表达相应的Gte Man1多核苷酸。特别合适的表达宿主是细菌性表达宿主属，包括埃希杆菌属(Escherichia)如，大肠杆菌）、假单胞菌属(Pseudomonas)（如，荧光假单胞菌(P.fluorescens)或斯氏假单胞菌(P.stutzerei)）、变形菌属(Proteus)（如，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)）、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)（如，真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)）、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)（如，肉糖葡萄球菌(S.carnosus)）、乳球菌属(Lactococcus)（如，乳酸乳球菌(L.lactis)）或芽孢杆菌属(Bacillus)（枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等）。此外，特别合适的为酵母表达宿主，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。特别合适的为真菌表达宿主，例如黑曲霉、勒克瑙金孢菌(Chrysosporiumlucknowense)、曲霉属（如，米曲霉、黑曲霉、小巢状曲菌(A.nidulans)等）或里氏木霉。此外，哺乳动物表达宿主是合适的，例如小鼠（如NS0）、中国仓鼠卵细胞(CHO)或幼地鼠肾(BHK)细胞系。诸如昆虫细胞之类的其他真核宿主或病毒表达系统（例如噬菌体，如M13、T7噬菌体或λ噬菌体；或病毒，例如杆状病毒）也适用于制备Gte Man1多肽。
与特定目的宿主中分泌型蛋白质连接的启动子和/或信号序列是用于该宿主或其他宿主中异源产生和分泌内切-β-甘露聚糖酶的候选物。例如，在丝状真菌系统中，驱动纤维二糖水解酶I(cbh1)、葡糖淀粉酶A(glaA)、TAKA-淀粉酶(amyA)、木聚糖酶(exlA)、gpd-启动子cbh1和cbhll，内切葡聚糖酶基因EGI-EGV、Cel61B、Cel74A、egl1-egl5，gpd启动子，Pgk1、pki1、EF-1α、tef1、cDNA1和hex1的基因的启动子是特别合适的，并且可以衍生自大量不同的生物（如黑曲霉、里氏木霉、米曲霉、泡盛曲霉和小巢状曲菌）。在一些实施例中，将Gte Man1多核苷酸重组地与编码合适的同源或异源信号序列的多核苷酸连接，其中所述的信号序列导致GteMan1多肽分泌到胞外（或周质）间隙中，从而允许直接检测细胞上清液（或周质间隙或裂解物）中的酶活性。用于大肠杆菌、其他革兰氏阴性细菌和本领域已知的其他生物的特别合适的信号序列包括驱动HlyA、DsbA、Pbp、PhoA、PelB、OmpA、OmpT或M13噬菌体Gill基因表达的那些。对于枯草芽孢杆菌、革兰氏阳性生物以及本领域已知的其他生物而言，特别合适的信号序列进一步包括驱动AprE、NprB、Mpr、AmyA、AmyE、Blac、SacB表达的那些，而对于酿酒酵母(S.cerevisiae)或其他酵母而言，包括杀伤毒素、Bar1、Suc2、交配因子α、Inu1A或Ggplp信号序列。信号序列可以由多种信号肽酶切割，因此将它们从已表达蛋白质的其余部分中除去。在一些实施例中，Gte Man1多肽的其余部分单独表达或与位于N-或C-端的其他肽、标签或蛋白质（如，BCE103(WO2010/044786)、6XHis、HA或FLAG标签）形成融合物。合适的融合物包含有利于亲和纯化或检测的标签、肽或蛋白质（如，BCE103、6XHis、HA、几丁质结合蛋白、硫氧还蛋白或FLAG标签），以及有利于表达、分泌或加工目标内切-β-甘露聚糖酶的那些。合适的加工位点包括用于体内或体外切割的肠激酶、STE13、Kex2或其他蛋白酶切割位点。
通过多种转化方法将Gte Man1多核苷酸引入表达宿主细胞，这些方法包括但不限于电穿孔、脂质辅助转化或转染（“脂质转染”）、化学介导转染（例如CaCl和/或CaP）、乙酸锂介导转化（例如，宿主细胞原生质体转化）、生物弹射“基因枪”转化、PEG介导的转化（例如，宿主细胞原生质体转化）、原生质体融合（例如使用细菌或真核细胞原生质体）、脂质体介导的转化、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、腺病毒或其他病毒或噬菌体转化或转导。
或者，Gte Man1多肽在细胞内表达。任选地，在胞内表达酶变体或使用信号序列（如上文提及的那些）使其分泌进入周质间隙之后，透化或裂解步骤可以用来将Gte Man1多肽释放到上清液中。通过使用机械方法（例如超声波、加压处理（弗氏压碎器））、空化法或使用膜消化酶（例如溶菌酶或酶混合物）来实现对膜屏障的破坏。作为另一种选择，通过使用合适的无细胞表达系统表达编码Gte Man1多肽的多核苷酸。在无细胞系统中，目的多核苷酸通常在启动子的帮助下进行转录，但连接形成环状表达载体是任选的。在其他实施例中，在无细胞系统中在不转录和翻译的情况下外源添加或生成RNA。
IV.Gte Man1的活性
本文所公开的分离的Gte Man1多肽可以在宽泛的pH条件范围内具有酶活性。在某些实施例中，所公开的Gte Man1多肽在约pH4.0至约pH11.5具有酶活性。在优选的实施例中，Gte Man1多肽在约pH4.0至约pH6.5具有大量酶活性。应该指出的是，本文所述的pH值可以在±0.2范围内变动。例如，8.0的pH值可以在pH7.8至pH8.2之间变动。
本文所公开的分离的Gte Man1多肽可以在宽泛的温度范围内具有酶活性，如，从35℃或更低至约75℃。在某些实施例中，Gte Man1多肽在约48℃至约62℃的温度范围内具有大量酶活性。应该指出的是，本文所述的温度值可以在±0.2℃范围内变动。例如，50℃的温度可以在49.8℃至50.2℃之间变动。
如实例3所示，Gte Man1多肽在蛋白酶存在的情况对刺槐豆胶和瓜耳胶具有清洁性能。此外，在粉末和液体洗涤剂存在的情况下，Gte Man1对示例性的沾污树胶的材料显示具有水解活性。因此，在某些实施例中，本文所述的分离的Gte Man1多肽的任一者可以水解甘露聚糖底物，所述底物包括但不限于刺槐豆胶、瓜耳胶以及它们的组合。
V.包含Gte Man1多肽的洗涤剂组合物
本文所公开的组合物和方法的一个方面为包含分离的Gte Man1多肽（包括其变体或片段）的洗涤剂组合物以及在清洁应用中使用此类组合物的方法。清洁应用包括但不限于衣物或纺织物清洁、衣物或纺织物软化、盘碟洗涤（手动和自动）、污渍预处理等。具体的应用是其中甘露聚糖（如，刺槐豆胶、瓜耳胶等）为待移除的污垢或污渍的组分的那些。洗涤剂组合物通常包含有效量的本文所述的Gte Man1多肽中的任何一种，如至少0.0001重量%、约0.0001至约1、约0.001至约0.5、约0.01至约0.1重量%，或甚至约0.1至约1重量%，或更多。洗涤剂组合物中Gte Man1多肽的有效量导致Gte Man1多肽具有足以水解含甘露聚糖底物（例如刺槐豆胶、瓜耳胶或它们的组合）的酶活性。
另外，浓度为约0.4g/L至约2.2g/L、约0.4g/L至约2.0g/L、约0.4g/L至约1.7g/L、约0.4g/L至约1.5g/L、约0.4g/L至约1g/L、约0.4g/L至约0.8g/L或约0.4g/L至约0.5g/L的洗涤剂组合物可以与有效量的分离的GteMan1多肽混合。洗涤剂组合物还可以按约0.4ml/L至约2.6ml/L、约0.4ml/L至约2.0ml/L、约0.4ml/L至约1.5m/L、约0.4ml/L至约1ml/L、约0.4ml/L至约0.8ml/L或约0.4ml/L至约0.5ml/L的浓度存在。
除非另有说明，否则本文提供的所有组分或组合物水平都是指所述组分或组合物的活性水平，并且市售来源中可能存在的杂质（例如残余溶剂或副产物）排除在外。酶组分重量基于总活性蛋白计。除非另外指明，否则所有百分比和比率都以重量计算。除非另外指明，否则所有百分比和比率都基于总组合物计算。在示例性的洗涤剂组合物中，酶水平是以纯酶占总组合物的重量比表示，并且除非另作规定，否则洗涤剂成分是以总组合物的重量比表示。
在一些实施例中，洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可以是非离子的、半极性的、阴离子的、阳离子的、两性离子的，或它们的组合和混合物。表面活性剂通常以约0.1%至60重量%的水平存在。示例性的表面活性剂包括但不限于十二烷基苯磺酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠、C14-15链烷醇聚醚-4、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠（如，Steol CS-370）、氢化椰油酸钠、C12乙氧基化物（Alfonic1012-6、Hetoxol LA7、Hetoxol LA4）、烷基苯磺酸钠（如，Nacconol90G），以及它们的组合和混合物。
可以与本文所述的洗涤剂组合物一起使用的阴离子型表面活性剂包括但不限于：直链烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐（脂肪醇硫酸盐）(AS)、醇乙氧基硫酸盐（AEOS或AES）、仲烷基磺酸盐(SAS)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸或皂。所述组合物还可以包含0-40%的非离子型表面活性剂，如醇乙氧基化物（AEO或AE）、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺（如例如在WO 92/06154中所述），以及它们的组合和混合物。
可以与本文所述的洗涤剂组合物一起使用的非离子型表面活性剂包括但不限于：脂肪酸的聚氧乙烯酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯（例如TWEEN）、聚氧乙烯醇、聚氧乙烯异醇、聚氧乙烯醚（例如TRITON和BRIJ）、聚氧乙烯酯、聚氧乙烯-对叔辛基酚或辛基苯基-氧化乙烯缩合物（例如NONIDET P40）、氧化乙烯与脂肪醇的缩合物（例如LUBROL）、聚氧乙烯壬基酚、聚亚烷基二醇(SYNPERONIC F108)、糖基表面活性剂（例如吡喃葡糖苷、硫代吡喃葡糖苷）以及它们的组合和混合物。
本文所公开的洗涤剂组合物可具有混合物，所述混合物包括但不限于：5%至15%阴离子型表面活性剂、<5%的非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、膦酸盐、皂、酶、香料、甲基丙酸丁基苯酯、香叶醇、沸石、聚羧酸酯、己基肉桂醛、柠檬烯、阳离子型表面活性剂、香茅醇和苯并异噻唑啉酮。
洗涤剂组合物可以额外包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂体系、络合剂、聚合物、漂白体系、稳定剂、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、水溶助长剂、晦暗抑制剂、荧光增白剂、织物调理剂和香料。洗涤剂组合物还可以包含酶，所述酶包括但不限于：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、果胶降解酶、木葡聚糖酶或另外的羧酸酯水解酶。洗涤剂组合物的pH应为中性至碱性，如本文所述。
在掺入至少一种助洗剂的一些实施例中，以清洁组合物的重量计，洗涤剂组合物包含至少约1%、约3%至约60%或甚至约5%至约40%的助洗剂。助洗剂可以包括但不限于：聚磷酸的碱金属盐、铵盐和链烷醇铵盐；碱金属硅酸盐；碱土金属和碱金属碳酸盐；铝硅酸盐；聚羧酸盐化合物；醚羟基聚羧酸盐；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物；1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸；和羧基甲氧基琥珀酸；聚乙酸（如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸）的多种碱金属盐、铵盐和取代的铵盐；以及聚羧酸盐，如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧基二琥珀酸、聚马来酸、苯1,3,5-三甲酸、羧基甲氧基琥珀酸以及它们的可溶性盐。实际上，设想到任何合适的助洗剂将用于本发明的多个实施例中。
在一些实施例中，助洗剂形成水溶性硬度离子络合物（如，螯合助洗剂），例如柠檬酸盐和聚磷酸盐（如，三聚磷酸钠和六水合三聚磷酸钠、三聚磷酸钾以及三聚磷酸钠与三聚磷酸钾的混合物等）。设想到，任何合适的助洗剂将用于本发明中，包括本领域已知的那些助洗剂（参见如EP 2100 949）。
如本文所指出的那样，在一些实施例中，本文所述的清洁组合物还包含辅助材料，包括但不限于：表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、污垢释放聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活性剂、荧光剂、织物调理剂、可水解性表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂（参见如美国专利No.6,610,642、No.6,605,458、No.5,705,464、No.5,710,115、No.5,698,504、No.5,695,679、No.5,686,014和No.5,646,101；全部专利均以引用方式并入本文中）。特定的清洁组合物材料的实施例在下文中详细举例说明。在清洁辅助材料与清洁组合物中的Gte Man1变体不相容的实施例中，则使用保持清洁辅助材料与内切-β-甘露聚糖酶分隔（即，相互不接触）直到两种组分组合是适宜的合适方法。此类分隔方法包括本领域已知的任何合适方法（如，胶囊锭法、包封法、片剂法、物理分隔法等）。
本文所述的清洁组合物有利地用于（例如）洗衣应用、硬质表面清洁、盘碟洗涤应用，以及化妆品应用，如假牙、牙齿、毛发和皮肤。另外，由于在低温溶液中效力增加的独特优势，本文所述的Gte Man1酶理想地适合于衣物和织物软化应用。此外，Gte Man1酶可以用于颗粒状和液体组合物。
本文所述的分离的Gte Man1多肽还可以用于添加剂产品中的清洁。在一些实施例中，用于低温溶液清洁应用。在一些实施例中，本发明提供了包含至少一种本发明所公开的Gte Man1多肽的清洁添加剂产品，当需要额外漂白效果时，该清洁添加剂产品理想地适于包括在洗涤过程中。这种情况包括但不限于低温溶液清洁应用。在一些实施例中，添加剂产品处于其最简单的形式，即一种或多种内切-β-甘露聚糖酶。在一些实施例中，将添加剂包装成用于添加到清洁过程中的剂型。在一些实施例中，将添加剂包装成用于添加到采用过氧源并且增加增加的漂白效用的清洁过程中的剂型。任何合适的单一剂量单位形式可用于本发明，包括但不限于：丸剂、片剂、胶囊锭，或其他单一剂量单位例如预计量的粉末或液体。在一些实施例中，包括填料或载体材料以增加此类组合物的体积。合适的填料或载体材料包括但不限于多种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐，以及滑石、粘土等。适用于液体组合物的填料或载体材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二醇。这些醇的例子包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施例中，组合物包含约5%至约90%的此类材料。酸性填料可用于降低pH。或者，在一些实施例中，清洁添加剂包含辅助成分，下文将予以更全面地描述。
本发明的清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的单独或与其他内切-β-甘露聚糖酶和/或额外酶组合的本文所述Gte Man1多肽中的至少一种。在某些实施例中，额外的酶包括但不限于选自以下的至少一种酶：蛋白酶、过氧化物酶、纤维素酶（内切葡聚糖酶）、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、酰基转移酶、磷脂酶、酯酶、漆酶、过氧化氢酶、芳基酯酶、淀粉酶、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、卡拉胶酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、阿拉伯糖酶、透明质酸酶、软骨素酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、其他内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶以及它们的混合物。
所需的酶水平通过添加一种或多种所公开的Gte Man1多肽来实现。通常，本发明的清洁组合物将包含至少约0.0001重量%、约0.0001至约10重量%、约0.001至约1重量%或甚至约0.01至约0.1重量%的本发明所公开的Gte Man1多肽中的至少一种。
本文的清洁组合物通常如此配制，从而在含水清洁操作中使用期间，洗涤水的pH将是约3.0至约11.0。液体产品制剂通常配制为具有约5.0至约9.0的净pH。颗粒状洗衣用产品通常配制为具有约8.0至约11.0的pH。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且这些技术是本领域技术人员所熟知的。
合适的低pH清洁组合物通常具有约3.0至约5.0的净pH，或甚至3.5至4.5的净pH。低pH清洁组合物通常不含在此类pH环境下水解的表面活性剂。此类表面活性剂包括含有至少一种环氧乙烷部分或甚至约1至约16摩尔的环氧乙烷的烷基硫酸钠表面活性剂。此类清洁组合物通常包含足量的pH调节剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，以向此类清洁组合物提供约3.0至约5.0的净pH。此类组合物通常包含至少一种酸稳定性酶。在一些实施例中，组合物为液体，而在其他实施例中，它们为固体。将此类液体组合物的pH通常度量为净pH。将此类固体组合物的pH作为所述组合物的10%固形物溶液来度量，其中溶剂是蒸馏水。在这些实施例中，除非另外指明，否则所有pH测量值都是在20℃取得。
合适的高pH清洁组合物通常具有约9.0至约11.0的净pH，或甚至9.5至10.5的净pH。此类清洁组合物通常包含足量的pH调节剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，以向此类清洁组合物提供约9.0至约11.0的净pH。此类组合物通常包含至少一种碱稳定性酶。在一些实施例中，组合物为液体，而在其他实施例中，它们为固体。此类液体组合物的pH通常度量为净pH。此类固体组合物的pH作为所述组合物的10%固形物溶液来度量，其中溶剂是蒸馏水。在这些实施例中，除非另外指明，否则所有pH测量值都是在20℃取得。
在一些实施例中，当颗粒状组合物或液体中采用Gte Man1多肽时，期望Gte Man1多肽处于封装颗粒的形式，以在储存过程中保护Gte Man1多肽免受该颗粒状组合物的其他组分的影响。另外，封装也是控制GteMan1多肽在清洁过程中的可用性的手段。在一些实施例中，封装增强了Gte Man1多肽和/或额外酶的性能。就这一点而言，本发明的Gte Man1多肽使用本领域已知的任何合适的封装材料封装。在一些实施例中，封装材料通常封装本文所述的Gte Man1多肽的催化剂的至少一部分。通常，封装材料具有水溶性和/或水分散性。在一些实施例中，封装材料的玻璃化转变温度(Tg)为0℃或更高。玻璃化转变温度在PCT专利申请WO 97/11151中详细描述。封装材料通常选自碳水化合物、天然或合成的树胶、甲壳质、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡以及它们的组合。当封装材料为碳水化合物时，它通常选自单糖、寡糖、多糖以及它们的组合。在一些典型的实施例中，封装材料为淀粉（参见如EP 0 922 499、U.S.4,977,252、U.S.5,354,559和U.S.5,935,826）。在一些实施例中，封装材料是由塑料例如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈以及它们的混合物制成的微球体；适用的市售微球体包括但不限于以
（瑞典斯瓦特维克(Stockviksverken,Sweden)）和PM6545、PM6550、PM7220、PM7228、
和
（美国宾夕法尼亚州福吉谷PQ公司(PQ Corp.,Valley Forge,PA)）供应的那些微球体。
术语“颗粒状组合物”指离散固体和宏观粒子的聚集物。粉末为特殊的一类颗粒状材料，因为它们具有较小的粒度，这使它们的内聚性更强并且更易于悬浮。
在清洁应用中使用包含Gte Man1的洗涤剂组合物时，将待清洁的织物、纺织物、器皿或其他表面在Gte Man1洗涤剂组合物存在的情况下温育一段足以允许Gte Man1水解存在于污垢或污渍中的甘露聚糖底物（包括但不限于刺槐豆胶、瓜耳胶以及它们的组合）的时间，然后通常用水或另一种水性溶剂漂洗以将Gte Man1洗涤剂组合物连同水解的甘露聚糖一起移除。
如本文所述，Gte Man1多肽尤其用于清洁行业，包括但不限于衣物和盘碟洗涤剂。这些应用使酶置于各种环境应力下。由于在多种条件下的稳定性，Gte Man1多肽可以提供胜过多种当前所用酶的优点。
实际上，存在洗涤中所涉及的内切-β-甘露聚糖酶所暴露的多种洗涤条件，包括变化的洗涤剂制剂、洗涤水体积、洗涤水温度和洗涤时间长度。此外，不同地理区域中使用的洗涤剂制剂具有不同浓度的在洗涤水中存在的其相关组分。例如，欧洲的洗涤剂通常在洗涤水中具有约4500-5000ppm的洗涤剂组分，而日本的洗涤剂通常在洗涤水中具有大约667ppm的洗涤剂组分。在北美，尤其是在美国，洗涤剂通常在洗涤水中具有约975ppm的洗涤剂组分。
低洗涤剂浓度系统包括其中少于约800ppm的洗涤剂组分在洗涤水中存在的洗涤剂。通常认为日本洗涤剂是低洗涤剂浓度系统，因为它们具有在洗涤水中存在的大约667ppm洗涤剂组分。
中等洗涤剂浓度系统包括其中约800ppm至约2000ppm之间的洗涤剂组分在洗涤水中存在的洗涤剂。一般认为北美洗涤剂是中等洗涤剂浓度系统，因为它们具有在洗涤水中存在的大约975ppm洗涤剂组分。巴西通常具有在洗涤水中存在的大约1500ppm洗涤剂组分。
高洗涤剂浓度系统包括其中超过约2000ppm的洗涤剂组分在洗涤水中存在的洗涤剂。一般认欧洲洗涤剂是高洗涤剂浓度系统，因为它们具有在洗涤水中存在的大约4500-5000ppm洗涤剂组分。
拉丁美洲的洗涤剂一般是高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂，而且拉丁美洲中使用的洗涤剂的范围可以处在中等洗涤剂浓度至高洗涤剂浓度之间，因为它们具有在洗涤水中1500ppm至6000ppm的洗涤剂组分。如上所述，巴西通常具有在洗涤水中存在的大约1500ppm的洗涤剂组分。然而，其他高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂地理区域（不限于其他拉丁美洲国家），可以具有在洗涤水中存在的至多到约6000ppm洗涤剂组分的高洗涤剂浓度系统。
根据前述内容，很明显在全世界范围内，常见洗涤溶液中洗涤剂组合物的浓度从低于约800ppm洗涤剂组合物（“低洗涤剂浓度地理位置”；例如在日本约667ppm）变动至约800ppm到约2000ppm之间（“中等洗涤剂浓度地理位置”；例如在美国约975ppm，在巴西约1500ppm），变动至高于约2000ppm（“高洗涤剂浓度地理位置”；例如在欧洲约4500ppm至约5000ppm，以及在高泡磷酸盐助洗剂地理位置中约6000ppm）。
常见洗涤溶液的浓度凭经验确定。例如，在美国，常见洗涤机容纳约64.4L体积的洗涤溶液。因此，为了在洗涤溶液内获得约975ppm洗涤剂浓度，必须将约62.79g洗涤剂组合物添加至64.4L洗涤溶液中。这个量是由消费者使用随洗涤剂一起提供的量杯计量加入洗涤水中的常见量。
作为又一个例子，不同地理区域使用不同的洗涤温度。日本的洗涤水温度通常低于欧洲所用的洗涤水温度。例如，北美和日本的洗涤水温度通常在约10℃和约30℃之间（如约20℃），而欧洲的洗涤水温度通常在约30℃和约60℃之间（如约40℃）。因此，在某些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物可以在如下温度下使用：约10℃至约60℃，或约20℃至约60℃，或约30℃至约60℃，或约40℃至约60℃，以及约40℃至约55℃范围内的所有其他组合，和10℃至60℃内的所有范围。然而，为了节省能源，许多消费者转向使用冷水洗涤。此外，在一些另外的区域中，通常将冷水用于洗衣以及餐具洗涤应用。在一些实施例中，本发明的“冷水洗涤”利用在约10℃至约40℃，或约20℃至约30℃，或约15℃至约25℃，以及在约15℃至约35℃范围内的所有其他组合和在10℃至40℃内的所有范围的温度下进行的洗涤。
为又一个例子，不同地理区域通常具有不同的水硬度。水硬度通常以每加仑混合的Ca2+/Mg2+的格令数来描述。硬度是水中钙(Ca2+)和镁(Mg2+)量的量度。在美国，大多数水是硬的，但硬度有波动。中等硬水(60-120ppm)至硬水(121-181ppm)具有60至181ppm（ppm换算成每美制加仑格令数是ppm数除以17.1等于每加仑格令数）硬度的矿物质。
表II：水硬度水平
| 水 | 每加仑格令数 | ppm |
| 软 | 低于1.0 | 低于1.7 |
| 略硬 | 1.0达3.5 | 17达60 |
| 中等硬度 | 3.5达7.0 | 60达120 |
| 硬 | 7.0达10.5 | 120达180 |
| 极硬 | 高于10.5 | 高于180 |
欧洲的水硬度通常高于每加仑混合的Ca2+/Mg2+约10.5（例如约10.5至约20.0）格令（例如每加仑的混合的Ca2+/Mg2+为约15格令）。北美的水硬度通常高于日本的水硬度，但小于欧洲的水硬度。例如，北美的水硬度可以在约3至约10格令、约3至约8格令之间或是约6格令。日本的水硬度通常小于北美的水硬度，通常小于约4，例如是每加仑混合的Ca2+/Mg2+约3格令。
因此，在一些实施例中，本发明提供在至少一组洗涤条件（如水温、水硬度和/或洗涤剂浓度）下显示惊人洗涤性能的Gte Man1多肽。在一些实施例中，Gte Man1多肽在洗涤性能方面可比于其他内切-β-甘露聚糖酶。在一些实施例中，与目前市售的内切-β-甘露聚糖酶相比，Gte Man1多肽表现增强的洗涤性能。因此，在一些优选的实施例中，本文提供的Gte Man1多肽表现出在各种条件下增强的氧化稳定性、增强的热稳定性、增强的清洁能力和/或增强的螯合剂稳定性。此外，Gte Man1多肽可以用于不包含洗涤剂（同样单独或与助洗剂和稳定剂组合）的清洁组合物。
在本发明的一些实施例中，以组合物的重量计，该清洁组合物以约0.00001%至约10%的水平包含本发明的至少一种Gte Man1多肽，并且以组合物的重量计，余量（如约99.999%至约90.0%）包含清洁辅助材料。在本发明的其他方面，以组合物的重量计，该清洁组合物以约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、或约0.005%至约0.5%的水平包含至少一种Gte Man1多肽，并且该清洁组合物的余量（如99.9999重量%至约90.0重量%、约99.999重量%至约98重量%、约99.995重量%至约99.5重量%）包含清洁辅助材料。
除本文提供的Gte Man1多肽之外，任何其他合适的内切-β-甘露聚糖酶均用于本发明的组合物。合适的内切-β-甘露聚糖酶包括但不限于糖基水解酶GH26家族的内切-β-甘露聚糖酶、糖基水解酶GH5家族的内切-β-甘露聚糖酶、酸性内切-β-甘露聚糖酶、中性内切-β-甘露聚糖酶以及碱性内切-β-甘露聚糖酶。碱性内切-β-甘露聚糖酶的例子包括在美国专利No.6,060,299、No.6,566,114和No.6,602,842、WO 9535362A1、WO 9964573A1以及WO9964619A1中所述的酶。另外，合适的内切-β-甘露聚糖酶包括但不限于动物、植物、细菌或真菌来源的那些。本发明涵盖以化学或遗传方式修饰的突变体。
有用的内切-β-甘露聚糖酶的例子包括芽孢杆菌内切-β-甘露聚糖酶例如枯草芽孢杆菌内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,060,299和WO 9964573A1）、芽孢杆菌属I633内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,566,114和WO9964619A1）、芽孢杆菌属AAI12内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利6,566,114和WO9964619A1）、芽孢杆菌属AA349内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,566,114和WO9964619A1）、琼脂粘附芽孢杆菌(B.agaradhaerens)NCIMB40482内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,566,114和WO9964619A1）、嗜碱耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)内切-β-甘露聚糖酶、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,566,114和WO9964619A1）、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,566,114和WO9964619A1）、腐质霉(Humicola)内切-β-甘露聚糖酶例如特异腐质霉(H.insolens)内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,566,114和WO9964619A1），以及热解纤维素菌(Caldocellulosiruptor)内切-β-甘露聚糖酶例如热解纤维素菌属(C.sp.)内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,566,114和WO9964619A1）。
此外，多种已鉴定的甘露聚糖酶（即内切-β-甘露聚糖酶和外切-β-甘露聚糖酶）用于本发明的一些实施例中，包括但不限于双孢蘑菇(Agaricusbisporus)甘露聚糖酶（参见Tang et al.,[2001]Appl.Environ.Microbiol.67:2298–2303（Tang等人，2001年，《应用环境微生物学》，第67卷，第2298–2303页））、溜曲霉(Aspergillu tamarii)甘露聚糖酶（参见Civas etal.,[1984]Biochem.J.219:857–863（Civas等人，1984年，《生物化学杂志》，第219卷，第857–863页））、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)甘露聚糖酶（参见Christgau et al.,[1994]Biochem.Mol.Biol.Int.33:917–925（Christgau等人，1994年，《国际生物化学与分子生物学》，第33卷，第917–925页））、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)甘露聚糖酶（参见Setati et al.,[2001]Protein Express Purif21:105–114（Setati等人，2001年，《蛋白质表达与纯化》，第21卷，第105–114页））、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)甘露聚糖酶（参见Puchart et al.,[2004]Biochimica etbiophysica Acta.1674:239–250（Puchart等人，2004年，《生物化学与生物物理学报》，第1674卷，第239–250页））、黑曲霉甘露聚糖酶（参见Ademark et al.,[1998]J.Biotechnol.63:199–210（Ademark等人，1998年，《生物技术杂志》，第63卷，第199–210页））、米曲霉NRRL甘露聚糖酶（参见Regalado et al.,[2000]J.Sci.Food Agric.80:1343–1350（Regalado等人，2000年，《食品科学与农业杂志》，第80卷，第1343–1350页））、硫色曲霉(Aspergillus sulphureus)甘露聚糖酶（参见Chen etal.,[2007]J.Biotechnol.128(3):452–461（Chen等人，2007年，《生物技术杂志》，第128卷，第3期，第452–461页））、土曲霉(Aspergillus terrus)甘露聚糖酶（参见Huang et al.,[2007]Wei Sheng Wu Xue Bao.47(2):280–284（Huang等人、2007年，《微生物学报》，第47卷，第2期，第280–284页））、琼脂粘附芽孢杆菌甘露聚糖酶（参见美国专利No.6,376,445.）、芽孢杆菌属AM001甘露聚糖酶（参见Akino et al.,[1989]Arch.Microbiol.152:10–15（Akino等人，1989年，《微生物学档案》，第152卷，第10–15页））、短芽孢杆菌甘露聚糖酶（参见Araujo and Ward,[1990]J.Appl.Bacteriol.68:253–261（Araujo和Ward，1990年，《应用细菌学杂志》，第68卷，第253–261页））、环状芽胞杆菌K-1甘露聚糖酶（参见Yoshida et al.,[1998]Biosci.Biotechnol.Biochem.62(3):514–520（Yoshida等人，1998年，《生物科学、生物技术与生物化学》，第62卷，第3期，第514–520页））、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)甘露聚糖酶（参见Araujo and Ward,[1990]J.Appl.Bacteriol.68:253–261（Araujo和Ward，1990年，《应用细菌学杂志》，第68卷，第253–261页））、芽孢杆菌属JAMB-750甘露聚糖酶（参见Hatada et al.,[2005]Extremophiles.9:497–500（Hatada等人，2005年，《极端微生物》，第9卷，第497–500页））、芽孢杆菌属M50甘露聚糖酶（参见Chen et al.,[2000]Wei ShengWu Xue Bao.40:62–68（Chen等人，2000年，《微生物学报》，第40卷，第62–68页））、芽孢杆菌属N16-5甘露聚糖酶（参见Yanhe et al.,[2004]Extremophiles8:447–454（Yanhe等人，2004年，《极端微生物》，第8卷，第447–454页））、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilu)甘露聚糖酶（参见Talbot and Sygusch,[1990]Appl.Environ.Microbiol.56:3505–3510（Talbot和Sygusch，1990年，《应用环境微生物学》，第56卷，第3505–3510页））、枯草芽孢杆菌甘露聚糖酶（参见Mendoza et al.,[1994]World J.Microbiol.Biotechnol.10:51–54（Mendoza等人，1994年，《世界微生物学与生物技术杂志》，第10卷，第51–54页））、枯草芽孢杆菌B36甘露聚糖酶（Li et al.,[2006]Z.Naturforsch(C).61:840–846（Li等人，2006年，《Z.Naturforsch》C辑，第61卷，第840–846页））、枯草芽孢杆菌BM9602甘露聚糖酶（参见Cui et al.,[1999]Wei Sheng Wu XueBao.39(1):60–63（Cui等人，1999年，《微生物学报》，第39卷，第1期，第60–63页））、枯草芽孢杆菌SA–22甘露聚糖酶（参见Sun et al.,[2003]Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao.19(3):327–330（Sun等人，2003年，《生物工程学报》，第19卷，第3期，第327–330页））、枯草芽孢杆菌168甘露聚糖酶（参见Helow and Khattab,[1996]Acta Microbiol.Immunol.Hung.43:289–299)（Helow和Khattab，1996年，《匈牙利微生物学与免疫学学报》，第43卷，第289–299页））、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)甘露聚糖酶（参见Gherardini et al.,[1987]J.Bacteriol.169:2038–2043)（Gherardini等人，1987年，《细菌学杂志》，第169卷，第2038–2043页））、栖瘤胃拟杆菌(Bacteroides ruminicola)甘露聚糖酶（参见Matsushita et al.,[1991]J.Bacteriol.173:6919–6926)（Matsushita等人，1991年，《细菌学杂志》，第173卷，第6919–6926页））、热解纤维素菌(Caldibacillus cellulovorans)甘露聚糖酶（参见Sunna et al.,[2000]Appl.Environ.Microbiol.66:664–670（Sunna等人，2000年，《应用环境微生物学》，第66卷，第664–670页））、Caldocellulosiruptorsaccharolyticus甘露聚糖酶（参见Morris et al.,[1995]Appl.Environ.Microbiol.61:2262–2269（Morris等人，1995年，《应用环境微生物学》，第61卷，第2262–2269页））、解糖热纤维菌(Caldocellumsaccharolyticum)甘露聚糖酶（参见Bicho et al.,[1991]Appl.Microbiol.Biotechnol.36:337–343（Bicho等人，1991年，《应用微生物学与生物技术》，第36卷，第337–343页））、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)甘露聚糖酶（参见Stoll et al.,[1999]Appl.Environ.Microbiol.65(6):2598–2605（Stoll等人，1999年，《应用环境微生物学》，第65卷，第6期，第2598–2605页））、酪酸梭菌/拜氏梭菌(Clostridium butyricum/beijerinckii)甘露聚糖酶（参见Nakajima and Matsuura,[1997]Biosci.Biotechnol.Biochem.61:1739–1742（Nakajima和Matsuura，1997年，《生物科学、生物技术与生物化学》，第61卷，第1739–1742页））、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)甘露聚糖酶（参见Perret et al.,[2004]Biotechnol.Appl.Biochem.40:255–259（Perret等人，2004年，《应用生物化学与生物技术》，第40卷，第255–259页））、第三梭菌(Clostridium tertium)甘露聚糖酶（参见Kataoka and Tokiwa,[1998]J.Appl.Microbiol.84:357–367（Kataoka和Tokiwa，1998年，《应用微生物学杂志》，第84卷，第357–367页））、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)甘露聚糖酶（参见Halstead et al.,[1999]Microbiol.145:3101–3108（Halstead等人，1999年，《微生物学》，第145卷，第3101–3108页））、嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)甘露聚糖酶（参见Gibbs et al.,[1999]Curr.Microbiol.39(6):351–357（Gibbs等人，1999年，《现代微生物学》，第39卷，第6期，第351–357页））、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)甘露聚糖酶（参见Zakaria et al.,[1998]Biosci.Biotechnol.Biochem.62:655–660（Zakaria等人，1998年，《生物科学、生物技术与生物化学》，第62卷，第655–660页））、腹足纲肺螺亚纲(Gastropoda pulmonata)甘露聚糖酶（参见Charrier and Rouland,[2001]J.Expt.Zool.290:125–135（Charrier和Rouland，2001年，《实验动物学杂志》，第290卷，第125–135页））、短滨螺(Littorina brevicula)甘露聚糖酶（参见Yamamura et al.,[1996]Biosci.Biotechnol.Biochem.60:674–676（Yamamura等人，1996年，《生物科学、生物技术与生物化学》，第60卷，第674–676页））、番茄(Lycopersicon esculentum)甘露聚糖酶（参见Filichkin et al.,[2000]PlantPhysiol.134:1080–1087（Filichkin等人，2000年，《植物生理学》，第134卷，第1080–1087页））、解凝乳类芽孢杆菌(Paenibacilluscurdlanolyticus)甘露聚糖酶（参见Pason and Ratanakhanokchai,[2006]Appl.Environ.Microbiol.72:2483–2490（Pason和Ratanakhanokchai，2006年，《应用环境微生物学》，第72卷，第2483–2490页））、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)甘露聚糖酶（参见Han et al.,[2006]Appl.MicrobiolBiotechnol.73(3):618–630（Han等人，2006年，《应用微生物学与生物技术》，第73卷，第3期，第618–630页））、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)甘露聚糖酶（参见Wymelenberg et al.,[2005]J.Biotechnol.118:17–34（Wymelenberg等人，2005年，《生物技术杂志》，第118卷，第17–34页））、厌气性瘤胃真菌(Piromyces sp)甘露聚糖酶（参见Fanutti et al.,[1995]J.Biol.Chem.270(49):29314–29322（Fanutti等人，1995年，《生物化学杂志》，第270卷，第49期，第29314–29322页））、Pomacea insulars甘露聚糖酶（参见Yamamura et al.,[1993]Biosci.Biotechnol.Biochem.7:1316–1319（Yamamura等人，1993年，《生物科学、生物技术与生物化学》，第7卷，第1316–1319页））、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)纤维素亚种甘露聚糖酶（参见Braithwaite et al.,[1995]Biochem J.305:1005–1010（Braithwaite等人，1995年，《生物化学杂志》，第305卷，第1005–1010页））、海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)甘露聚糖酶（参见Politz et al.,[2000]Appl.Microbiol.Biotechnol.53(6):715–721（Politz等人，2000年，《应用微生物学与生物技术》，第53卷，第6期，第715–721页））、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)甘露聚糖酶（参见Sachslehner et al.,[2000]J.Biotechnol.80:127–134（Sachslehner等人，2000年，《生物化学杂志》，第80卷，第127–134页））、鲜黄链霉菌(Streptomyces galbus)甘露聚糖酶（参见Kansoh and Nagieb,[2004]Anton.van.Leeuwonhoek.85:103–114（Kansoh和Nagieb，2004年，《安东尼·范·莱文胡克》，第85卷，第103–114页））、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)甘露聚糖酶（参见Arcand et al.,[1993]J.Biochem.290:857–863（Arcand等人，1993年，《生物化学杂志》，第290卷，第857–863页））、嗜热厌氧解多糖杆菌(Thermoanaerobacterium Polysaccharolyticum)甘露聚糖酶（参见Cann et al.,[1999]J.Bacteriol.181:1643–1651（Cann等人，1999年，《细菌学杂志》，第181卷，第1643–1651页））、褐色高温单孢菌(Thermomonospora fusca)甘露聚糖酶（参见Hilge et al.,[1998]Structure6:1433–1444（Hilge等人，1998年，《结构》，第6卷，第1433–1444页））、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)甘露聚糖酶（参见Parker et al.,[2001]Biotechnol.Bioeng.75(3):322–333（Parker等人，2001年，《生物技术与生物工程》，第75卷，第3期，第322–333页））、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)甘露聚糖酶（参见Duffaud et al.,[1997]Appl.Environ.Microbiol.63:169–177（Duffaud等人，1997年，《应用环境微生物学》，第63卷，第169–177页））、哈茨木霉(Trichoderma harzanium)菌株T4甘露聚糖酶（参见Franco et al.,[2004]Biotechnol Appl.Biochem.40:255–259（Franco等人，2004年，《生物技术与应用生物化学》，第40卷，第255–259页））、里氏木霉甘露聚糖酶（参见Stalbrand et al.,[1993]J.Biotechnol.29:229–242（Stalbrand等人，1993年，《生物技术杂志》，第29卷，第229–242页）），以及弧菌属(Vibrio sp.)甘露聚糖酶（参见Tamaru et al.,[1997]J.Ferment.Bioeng.83:201–205（Tamaru等人，1997年，《发酵和生物工程杂志》，第83卷，第201–205页））。
额外的合适内切-β-甘露聚糖酶包括市售的内切-β-甘露聚糖酶，例如
（美国高锦公司(Chemgen)）；
和
（丹麦诺维信公司(Novozymes A/S,Denmark)）；PURABRITETM和MANNASTARTM（美国加利福尼亚州帕罗奥图的丹尼斯克分公司杰能科公司(Genencor,A Danisco Division,Palo Alto,CA)；以及
160和
200(Diversa)。
在本发明一些实施例中，以组合物的重量计，本发明的清洁组合物还以约0.00001%至约10%额外内切-β-甘露聚糖酶的水平包含内切-β-甘露聚糖酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的其他方面，以组合物的重量计，本发明的清洁组合物还以约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%内切-β-甘露聚糖酶的水平包含内切-β-甘露聚糖酶。
在本发明的一些实施例中，可以使用任何合适的蛋白酶。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。在一些实施例中，包括以化学或遗传方式修饰的突变体。在一些实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，优选地为碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。各种蛋白酶在PCT专利申请WO 95/23221和WO 92/21760，美国专利公布No.2008/0090747，美国专利No.5,801,039、No.5,340,735、No.5,500,364、No.5,855,625、U.S.RE34,606、No.5,955,340、No.5,700,676、No.6,312,936、No.6,482,628以及各种其他专利中描述。在一些另外的实施例中，金属蛋白酶用于本发明中，包括但不限于PCT专利申请WO 07/044993中所述的中性金属蛋白酶。用于本发明中的市售蛋白酶包括但不限于
PRIME和（美国加利福尼亚州帕罗奥图的丹尼斯克分公司杰能科公司(Genencor,A Danisco Division,Palo Alto,CA)）。另外，用于本发明中的市售蛋白酶包括但不限于 
和（丹麦诺维信公司(Novozymes A/S,Denmark)）。
在本发明的一些实施例中，可以使用任何合适的淀粉酶。在一些实施例中，也使用适合在碱性溶液中使用的任何淀粉酶（例如α和/或β淀粉酶）。合适的淀粉酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些酶。在一些实施例中，包括以化学或遗传方式修饰的突变体。用于本发明中的淀粉酶包括但不限于从地衣芽孢杆菌获得的α-淀粉酶（参见例如GB 1,296,839）。用于本发明中的市售淀粉酶包括但不限于：
STAINZYME
和BANTM（丹麦诺维信公司(Novozymes A/S,Denmark)），以及
POWERASETM、
和P（美国加利福尼亚州帕罗奥图的丹尼斯克分公司杰能科公司(Genencor,A DaniscoDivision,Palo Alto,CA)）。
在本发明的一些实施例中，以组合物的重量计，所公开的清洁组合物还以约0.00001%至约10%额外淀粉酶的水平包含淀粉酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的其他方面，以清洁组合物的重量计，该组合物还以约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%淀粉酶的水平包含淀粉酶。
在本发明的一些实施例中，可以使用任何合适的果胶降解酶。如本文所用，“一种或多种果胶降解酶”涵盖阿拉伯聚糖酶(EC3.2.1.99)、半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)、外切聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.67)、外切聚α-半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.82)、果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、果胶酯酶(EC3.2.1.11)、果胶酸裂解酶(EC4.2.2.2)、外切聚半乳糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.9)，以及半纤维素酶例如外切-1,3-β-木糖苷酶(EC3.2.1.32)、木聚糖-1,4-β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)和α-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC3.2.1.55)。果胶降解酶是上述酶活性的天然混合物。因此，果胶酶包括水解果胶甲基酯键的果胶甲酯酶、裂解半乳糖醛酸分子之间糖苷键的聚半乳糖醛酸酶，和作用于果胶酸以引起α-1,4糖苷键发生非水解裂解以形成半乳糖醛酸的不饱和衍生物的果胶反式消去酶或裂解酶。
合适的果胶降解酶包括植物、真菌或微生物来源的那些酶。在一些实施例中，包括以化学或遗传方式修饰的突变体。在一些实施例中，果胶降解酶是碱性果胶降解酶，即在从约7.0至约12的pH具有其最大活性至少10%、优选至少25%、更优选至少40%的酶活性的酶。在某些其他实施例中，果胶降解酶是在从约7.0至约12的pH具有其最大活性的酶。碱性果胶降解酶由嗜碱微生物（如细菌、真菌）和酵母微生物（例如芽孢杆菌属菌种）生成。在一些实施例中，微生物为如JP 56131376和JP 56068393中所述的坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、环状芽孢杆菌以及枯草芽孢杆菌。碱性果胶分解酶可以包括但不限于半乳糖醛酸-1,4-α-半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.67)、聚-半乳糖醛酶活性(EC3.2.1.15)、果胶酯酶(EC3.1.1.11)、果胶酸裂解酶(EC4.2.2.2)以及它们的同工酶。碱性果胶分解酶可由欧文氏菌属(Erwinia)菌种产生，碱性果胶分解酶由菊欧文氏菌(E.chrysanthemi)、胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora)、解淀粉欧文氏菌(E.amylovora)、草生欧文氏菌(E.herbicola)和溶解肠杆菌(E.dissolvens)产生，如JP 59066588、JP63042988和World J.Microbiol.Microbiotechnol.(8,2,115-120)1992（《世界微生物学和生物技术杂志》，第8卷，第2期，第115-120页，1992年）中所述。在某些其他实施例中，碱性果胶酶由芽孢杆菌属菌种产生，如JP73006557和Agr.Biol.Chem.(1972),36(2)285-93（《农业与生物化学》，1972年，第36卷，第2期，第285-293页）中所公开。
在本发明的一些实施例中，以组合物的重量计，所公开的清洁组合物还以约0.00001%至约10%额外果胶降解酶的水平包含果胶降解酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的其他方面，以组合物的重量计，该清洁组合物还以约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%果胶降解酶的水平包含果胶降解酶。
在一些其他实施例中，任何合适的木葡聚糖酶用于本发明的清洁组合物中。合适的木葡聚糖酶包括但不限于植物、真菌或细菌来源的那些木葡聚糖酶。在一些实施例中，包括以化学或遗传方式修饰的突变体。如本文所用，“木葡聚糖酶”涵盖瓦赫宁根大学Vincken和Voragen所述的酶家族[Vincken et al(1994)Plant Physiol.,104,99-107（Vincken等人，1994年，《植物生理学》，第104卷，第99-107页）]并且能够降解木葡聚糖，如Hayashi et al(1989)Plant.Physiol.Plant Mol.Biol.,40,139-168（Hayashi等人，1989年，《植物生理学与植物分子生物学》，第40卷，第139-168页）中所述。Vincken等人证实从绿色木霉(Trichoderma viride)纯化的木葡聚糖酶（内切-IV-葡聚糖酶）能够从分离的苹果细胞壁的纤维素移除木葡聚糖包衣。这种酶增强嵌入细胞壁的纤维素的酶促降解并且与果胶酶协同作用。来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades)的RapidaseLIQ+包含木葡聚糖酶活性。
在本发明的一些实施例中，以组合物的重量计，所公开的清洁组合物还以约0.00001%至约10%额外木葡聚糖酶的水平包含木葡聚糖酶，并且以组合物重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的其他方面，以组合物的重量计，该清洁组合物还以约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%木葡聚糖酶的水平包含木葡聚糖酶。在某些其他实施例中，用于特定应用的木葡聚糖酶为碱性木葡聚糖酶，即在7至12的范围内的pH具有其最大活性至少10%、优选至少25%、更优选至少40%的酶活性的酶。在某些其他实施例中，木葡聚糖酶为在约7.0至约12的pH具有其最大活性的酶。
在一些其他实施例中，任何合适的纤维素酶用于本发明的清洁组合物中。合适的纤维素酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些纤维素酶。在一些实施例中，包括以化学或遗传方式修饰的突变体。合适的纤维素酶包括但不限于特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶（参见如美国专利No.4,435,307）。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理有益效果的纤维素酶（参见如EP 0 495 257）。用于本发明中的市售纤维素酶包括但不限于
（丹麦诺维信公司(Novozymes A/S,Denmark)）。额外的市售纤维素酶包括
（美国加利福尼亚州帕罗奥图的丹尼斯克分公司杰能科公司(Genencor,A Danisco Division,Palo Alto,CA)）和KAC-500(B)TM（花王公司(Kao Corporation)）。在一些实施例中，纤维素酶作为成熟野生型纤维素酶或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中N末端的一部分缺失（参见如，美国专利No.5,874,276）。在一些实施例中，以该组合物的重量计，本发明的清洁组合物还以约0.00001%至约10%额外纤维素酶的水平包含纤维素酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的其他方面，以组合物的重量计，清洁组合物还以约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%纤维素酶的水平包含纤维素酶。
在还有一些实施例中，适用于洗涤剂组合物中的任何脂肪酶也用于本发明中。合适的脂肪酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些酶。在一些实施例中，包括以化学或遗传方式修饰的突变体。可用的脂肪酶的例子包括柔毛腐质菌(Humicola lanuginosa)脂肪酶（参见如EP 258 068和EP 305216）、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶（参见如EP 238 023）、假丝酵母(Candida)脂肪酶例如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶（如，南极假丝酵母脂肪酶A或B；参见如EP 214 761）、假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)脂肪酶和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶（参见如，EP 218 272）、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶（参见如EP 331 376）、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶（参见如GB 1,372,034）、荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌属脂肪酶（如，枯草芽孢杆菌脂肪酶[Dartois et al.,(1993)Biochem.Biophys.Acta1131:253-260（Dartois等人，1993年，《生物化学与生物物理学学报》，第1131卷，第253-260页）]；嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)脂肪酶[参见如JP 64/744992]；以及短小芽孢杆菌(B.pumilus)脂肪酶[参见如WO 91/16422]）。此外，多种克隆的脂肪酶可用于本发明一些实施例中，包括但不限于卡门柏青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶（参见，Yamaguchi et al.,[1991]Gene103:61-67（Yamaguchi等人，1991年，《基因》，第103卷，第61-67页））、白地霉(Geotricumcandidum)脂肪酶（参见，Schimada et al.,[1989]J.Biochem.106:383-388（Schimada等人，1989年，《生物化学杂志》，第106卷，第383-388页））和多种根霉属(Rhizopus)脂肪酶例如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶（参见，Hass et al.,[1991]Gene109:117-113（Hass等人，1991年，《基因》，第109卷，第117-113页））、雪白根霉(R.niveus)脂肪酶（Kugimiya et al.,[1992]Biosci.Biotech.Biochem.56:716-719（Kugimiya等人，1992年，《生物科学、生物技术与生物化学》，第56卷，第716-719页））和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。其他类型的脂解酶（如角质酶）也用于本发明的一些实施例中，包括但不限于源自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶（参见，WO 88/09367）和源自豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solani pisi)的角质酶（参见，WO 90/09446）。另外合适的脂肪酶包括市售的脂肪酶，例如M1LIPASETM、LUMA FASTTM和LIPOMAXTM（美国加利福尼亚州帕罗奥图的丹尼斯克分公司杰能科公司(A Danisco Division,Palo Alto,CA)）；
和ULTRA（丹麦诺维信公司(Novozymes A/S,Denmark)）；以及LIPASE PTM“Amano”（日本的天野制药有限公司(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.,Japan)）。
在一些实施例中，以组合物的重量计，所公开的清洁组合物还以约0.00001%至约10%额外脂肪酶的水平包含脂肪酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的其他方面中，以组合物的重量计，清洁组合物还以约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%脂肪酶的水平包含脂肪酶。
在一些实施例中，过氧化物酶与过氧化氢或其来源（如，过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐）组合用于本发明的组合物中。在一些另外的实施例中，氧化酶与氧组合使用。这两种类型的酶，优选连同增强剂一起，均用于“溶液漂白”（即，当织物在洗涤液中一起洗涤时防止纺织物染料从一种染色织物转移到另一种织物）（参见如WO 94/12621和WO95/01426）。合适的过氧化物酶/氧化酶包括但不限于植物、细菌或真菌来源的那些酶。在一些实施例中，包括以化学或遗传方式修饰的突变体。在一些实施例中，以组合物重量计，本发明的清洁组合物还以约0.00001%至约10%额外过氧化物酶和/或氧化酶的水平包含过氧化物酶和/或氧化酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的其他方面中，以组合物重量计，清洁组合物还以约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%过氧化物酶和/或氧化酶的水平包含过氧化物酶和/或氧化酶。
在一些实施例中，使用额外的酶，包括但不限于过水解酶（参见如WO 05/056782）。此外，在一些特别优选的实施例中，本文涵盖上述酶的混合物，尤其一种或多种额外的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一种纤维素酶。实际上，预期这些酶的多种混合物将用于本发明中。还预期Gte Man1多肽与一种或多种另外的酶的不同水平均可以独立地范围到达约10%，该清洁组合物的余量为清洁辅助材料。通过考虑待清洁表面、物品或织物以及针对使用（如，通过使用洗涤剂）期间的清洁条件所需的组合物形式、轻易地选择清洁辅助材料。
合适的清洁辅助材料的例子包括但不限于表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、污垢释放聚合物聚合物、染料转移剂、染料转移抑制剂、催化材料、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂、结构增塑剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂、颜料、可水解性表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、防缩水剂、防皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银护理剂、抗晦暗和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂（参见如美国专利No.6,610,642、No.6,605,458、No.5,705,464、No.5,710,115、No.5,698,504、No.5,695,679、No.5,686,014和No.5,646,101，所有这些专利均以引用方式并入本文）。特定清洁组合物材料的实施例在下文中详细举例说明。在清洁辅助材料与清洁组合物中所公开的Gte Man1多肽不相容的实施例中，则使用保持清洁辅助材料与一种或多种内切-β-甘露聚糖酶分隔（即，相互不接触）直到适于组合两种组分的适合方法。这种分隔方法包括本领域已知的任何合适方法（如胶囊锭法、包封法、片剂法、物理分隔法等）。
在一些优选的实施例中，适用于清洁需要去除污渍的多种表面的组合物中包含有效量的一种或多种本文提供的Gte Man1多肽。此类清洁组合物包括用于诸如清洁硬质表面、织物和盘碟之类的应用的清洁组合物。实际上，在一些实施例中，本发明提供织物清洁组合物，而在其他实施例中，本发明提供非织物清洁组合物。值得注意的是，本发明还提供适于个人护理的清洁组合物，包括口腔护理（包括洁牙剂、牙膏、漱口水等，以及假牙清洁组合物）、皮肤和毛发清洁组合物。另外，在其他实施例中，本发明提供织物软化组合物。预期本发明涵盖任何形式（即，液体、颗粒状、条状、半固体、凝胶、乳液、片剂、胶囊等）的洗涤剂组合物。
以举例的方式，下文将更详细地描述其中使用所公开的Gte Man1多肽的几种清洁组合物。在所公开的清洁组合物配制成适用于洗衣机洗涤方法中的组合物的一些实施例中，本发明组合物优选地包含至少一种表面活性剂和至少一种助洗剂化合物，以及一种或多种清洁辅助材料，所述清洁辅助材料优选地选自有机聚合化合物、漂白剂、额外的酶、抑泡剂、分散剂、钙皂分散剂、悬污剂和抗再沉积剂以及腐蚀抑制剂。在一些实施例中，洗衣组合物还含有软化剂（即，作为额外的清洁辅助材料）。本发明组合物还使用固体或液体形式的洗涤添加剂产品。此类添加剂产品意在补充和/或提高常规洗涤剂组合物的性能，并且可以在洗涤过程的任何阶段添加。在一些实施例中，在20℃测量时，本文中衣物洗涤剂组合物的密度在约400至约1200g/L的范围内，而在其他实施例中，它约500至约950g/L组合物的范围内。
在配制为用于人工盘碟洗涤方法中的组合物的实施例中，本发明的组合物优选含有至少一种表面活性剂，以及优选至少一种另外的选自如下的清洁辅助材料：有机聚合化合物、泡沫增强剂、II族金属离子、溶剂、水溶助长剂和额外的酶。
在一些实施例中，多种清洁组合物例如美国专利No.6,605,458中提供的组合物与本发明的Gte Man1多肽一起使用。因此，在一些实施例中，包含本发明的至少一种Gte Man1多肽的组合物是致密的颗粒状织物清洁组合物，而在其他实施例中，所述组合物是适用于清洗有色织物的颗粒状织物清洁组合物，在另外的实施例中，所述组合物是通过洗涤能力提供软化作用的颗粒状织物清洁组合物，在其他实施例中，所述组合物是重垢液体织物清洁组合物。在一些实施例中，包含本发明的至少一种Gte Man1多肽的组合物是织物清洁组合物，例如美国专利No.6,610,642和No.6,376,450中所述的那些。此外，本发明的Gte Man1多肽用于欧洲或日本洗涤条件下特别有用的颗粒状衣物洗涤组合物中（参见如美国专利No.6,610,642）。
在一些另外的实施例中，本发明提供包含本文提供的至少一种GteMan1多肽的硬质表面清洁组合物。因此，在一些实施例中，包含本发明的至少一种Gte Man1多肽的组合物是硬质表面清洁组合物，例如美国专利No.6,610,642、No.6,376,450和No.6,376,450中所述的那些。
在其他实施例中，本发明提供包含本文提供的至少一种Gte Man1多肽的盘碟洗涤组合物。因此，在一些实施例中，包含本发明的至少一种Gte Man1多肽的组合物是硬质表面清洁组合物，例如美国专利No.6,610,642和No.6,376,450中所述的那些。在另一些其他实施例中，本发明提供包含本文提供的至少一种Gte Man1多肽的盘碟洗涤组合物。在一些其他实施例中，包含本发明的至少一种Gte Man1多肽的组合物包括口腔护理组合物，例如美国专利No.6,376,450和No.6,605,458中所述的那些。在上述美国专利No.6,376,450、No.6,605,458和No.6,610,642中所含的化合物和清洁辅助材料的配制和描述随本文提供的Gte Man1多肽使用。
在另一些实施例中，包含本发明的至少一种Gte Man1多肽的组合物包括织物软化组合物，例如在GB-A1 400898、GB-A1 514 276、EP 0 011340、EP 0 026 528、EP 0 242 919、EP 0 299 575、EP 0 313 146以及美国专利No.5,019,292中所述的那些。上述GB-A1 400898、GB-A1 514 276、EP0 011 340、EP 0 026 528、EP 0 242 919、EP 0 299 575、EP 0 313 146和美国专利No.5,019,292中所含的化合物和软化剂的配制和描述随本文提供的Gte Man1多肽使用。
通过配制人员选择的任何方法，将本发明的清洁组合物配制成任何合适的形式并制备，所述方法的非限制性例子在美国专利No.5,879,584、No.5,691,297、No.5,574,005、No.5,569,645、No.5,565,422、No.5,516,448、No.5,489,392和No.5,486,303中描述；所有专利均以引用的方式并入本文。当需要低pH清洁组合物时，通过添加诸如单乙醇胺或酸性材料（如HCl）之类的材料来调整这种组合物的pH。
尽管对于本发明目的而非并非必需，但下文示例的辅助材料的非限制性清单适用于本发明的清洁组合物中。在一些实施例中，掺入这些辅助材料，例如以帮助增强清洁性能以便处理待清洁的基底，或调节清洁组合物的美观性，如利用香料、着色剂、染料等情形就是如此。应当理解，这些辅助材料相对于本发明的Gte Man1多肽是额外的。这些额外组分的精确性质以及其掺入的水平将取决于组合物的物理形式和打算使用组合物的清洁操作的性质。合适的辅助材料包括但不限于：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、额外的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增强剂、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂/抗再沉积剂、增亮剂、抑泡剂、染料、香料、结构增塑剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂和/或颜料。除下文的公开内容外，此类其他辅助材料和使用水平的适合例子见于美国专利No.5,576,282、No.6,306,812和No.6,326,348（以引用的方式并入）中。上述辅助成分可以构成本发明清洁组合物的余量。
在一些实施例中，根据本发明的清洁组合物包含至少一种表面活性剂和/或表面活性剂系统，其中表面活性剂选自：非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂以及它们的混合物。在一些低pH清洁组合物实施例（如，具有约3至约5净pH的组合物）中，组合物通常不含烷基乙氧基化硫酸盐，因为据信这种表面活性剂可能被所述组合物的酸性内容物水解。在一些实施例中，以清洁组合物的重量计，表面活性剂以约0.1%至约60%的水平存在，而在另外的实施例中，所述水平是从约1%至约50%，而在其他实施例中，所述水平是从约5%至约40%。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物含有至少一种螯合剂。合适的螯合剂可以包括但不限于铜、铁和/或锰螯合剂以及它们的混合物。在使用至少一种螯合剂的实施例中，以主题清洁组合物的重量计，本发明的清洁组合物包含约0.1%至约15%或甚至约3.0%至约10%螯合剂。
在一些其他实施例中，本文中提供的清洁组合物含有至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括但不限于：聚乙二醇，聚丙二醇，聚羧酸盐，污垢释放聚合物例如聚对苯二甲酸，粘土例如高岭土、蒙脱土、绿坡缕石(atapulgite)、伊利石、膨润土、多水高岭土以及它们的混合物。
如本文所指出，在一些实施例中，抗再沉积剂用于本发明的一些实施例中。在一些优选的实施例中，可以使用非离子表面活性剂。例如，在自动盘碟洗涤实施例中，出于表面修饰目的使用非离子表面活性剂，尤其用于被单，以避免成膜和起斑以及以改善光泽度。这些非离子表面活性剂还用于防止污垢的再沉积。在一些优选的实施例中，抗再沉积剂是本领域已知的非离子表面活性剂（参见如EP 2 100 949）。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于：聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或它们的混合物。在使用至少一种染料转移抑制剂的实施例中，以清洁组合物的重量计，本发明的清洁组合物包含约0.0001%至约10%、约0.01%至约5%或甚至约0.1%至约3%。
在一些实施例中，本发明的组合物中包含硅酸盐。在一些此类实施例中，使用硅酸钠（如，二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐）。在一些实施例中，硅酸盐以约1%至约20%的水平存在。在一些优选的实施例中，以组合物的重量计，硅酸盐以约5%至约15%的水平存在。
在一些另外的实施例中，本发明的清洁组合物还包含分散剂。合适的水溶性有机材料包括但不限于均聚酸或共聚酸或它们的盐，其中多元羧酸包含彼此由不超过两个碳原子隔开的至少两个羧基。
在一些其他实施例中，利用任何合适的技术使清洁组合物中使用的酶稳定。在一些实施例中，本文所用的酶因成品组合物中存在钙离子和/或镁离子水溶性来源而稳定，其中所述水溶性来源向酶提供这类离子。在一些实施例中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐（包括碱土金属，如钙盐）。构思用于稳定酶的各种技术将用于本发明。例如，在一些实施例中，本文所采用的酶由成品组合物中存在向酶提供锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的这类离子的水溶性来源，以及其他金属离子（如钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV)）而稳定。氯化物和硫酸盐也用于本发明一些实施例中。合适的寡糖和多糖（如，糊精）的例子是本领域已知的（参见如WO 07/145964）。在一些实施例中，也使用可逆性蛋白酶抑制剂，如含硼化合物（如，硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸）和/或必要时，使用三肽醛以进一步提高稳定性。
在一些实施例中，漂白剂、漂白活化剂和/或漂白催化剂存在于本发明的组合物中。在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含无机和/或有机漂白化合物。无机漂白剂可以包括但不限于过氧化氢合物盐（如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐）。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐作为结晶固体包含，无额外保护，但在一些另外的实施例中，将所述盐包覆。本领域已知的任何适合的盐均用于本发明（参见如EP 2 100 949）。
在一些实施例中，漂白活化剂用于本发明的组合物中。漂白活化剂通常为有机过酸前体，这些有机过酸前体在60℃和更低温度的清洁过程期间增强漂白作用。适用于本文中的漂白活化剂包括在过水解条件下产生脂族过氧羧酸和/或任选地取代过苯甲酸的化合物，所述脂族过氧羧酸优选地具有约1个至约10个碳原子，尤其约2个至约4个碳原子。额外的漂白活化剂是本领域已知的并且用于本发明中（参见如EP 2 100 949）。
此外，在一些实施例中以及如本文中进一步描述的，本发明的清洁组合物还包含至少一种漂白催化剂。在一些实施例中，可以使用三氮杂环壬烷锰和相关络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物。其他漂白催化剂用于本发明中（参见如美国专利No.4,246,612、美国专利No.5,227,084、美国专利No.4,810,410、WO 99/06521和EP 2 100 949）。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物含有一种或多种催化性金属络合物。在一些实施例中，使用含金属的漂白催化剂。在一些优选的实施例中，金属漂白催化剂包含催化剂体系，所述催化剂体系包含具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子（如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子）、具有极低或无漂白催化活性的辅助性金属阳离子（如锌或铝阳离子），以及对催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的金属螯合剂(sequestrate)，尤其使用乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)以及它们的水溶性盐（参见如美国专利No.4,430,243）。在一些实施例中，借助锰化合物催化本发明的清洁组合物。此类化合物及其使用水平是本领域熟知的（参见如美国专利No.5,576,282）。在另外的实施例中，钴漂白催化剂用于本发明的清洁组合物中。各种钴漂白催化剂是本领域已知的（参见如美国专利No.5,597,936和No.5,595,967）并且通过已知方法轻易制备。
在一些额外的实施例中，本发明的清洁组合物包括大多环刚性配体(MRL)的过渡金属络合物。作为一种实践（但绝非限制），在一些实施例中，调整由本发明提供的组合物和清洁方法以便在水性洗涤介质中提供约至少1ppm的活性MRL物质，而在一些优选实施例中，在洗涤液中提供约0.005ppm至约25ppm、更优选约0.05ppm至约10ppm且最优选约0.1ppm至约5ppm的MRL。
在一些实施例中，本发明过渡金属漂白催化剂中的优选过渡金属包括（但不限于）锰、铁和铬。优选的MRL还包括（但不限于）交叉桥接的特定超刚性配体（如，5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷）。合适的过渡金属MRL由已知方法轻易制备（参见如WO 2000/32601和美国专利No.6,225,464）。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含金属护理剂。金属护理剂用于防止和/或减少包括铝、不锈钢和非铁金属（如，银和铜）在内的金属的锈污、腐蚀和/或氧化。合适的金属护理剂包括EP 2 100 949、WO94/26860和WO 94/26859中所述的金属护理剂。在一些实施例中，金属护理剂是锌盐。在一些其他实施例中，本发明的清洁组合物包含约0.1重量%至约5重量%的一种或多种金属护理剂。
如上文所指出，通过配制人员选择的任何方法，将本发明的清洁组合物配制成任何合适的形式并制备，所述方法的非限制性例子在美国专利No.5,879,584、No.5,691,297、No.5,574,005、No.5,569,645、No.5,516,448、No.5,489,392和No.5,486,303中描述，全部专利均以引用的方式并入本文中。在需要低pH清洁组合物的一些实施例中，通过添加诸如HCl之类的酸性材料来调整这种组合物的pH。
本文所公开的清洁组合物用于清洁位置（如表面、盘碟或织物）。通常，所述位置的至少一部分与纯形式或稀释于洗涤液中的本发明清洁组合的实施例接触，随后任选洗涤和/或冲洗所述位置。出于本发明的目的，“洗涤”包括（但不限于）擦洗和机械搅动。在一些实施例中，清洁组合物以溶液中通常约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常范围从约5℃至约90℃，并且当所述位置包括织物时，水对织物的质量比通常为约1:1至约30:1。
VI.作为化学试剂的Gte Man1多肽
对包含甘露糖单元的Gte Man1多糖链（包括但不限于甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖）的偏好使得本发明的多肽尤其可用于进行涉及含有1,4-β-D-甘露糖苷键的多糖底物的甘露聚糖水解反应。
一般说来，在适于进行甘露聚糖水解反应的条件下，将供体分子在分离Gte Man1多肽或其片段或变体存在的情况下温育，随后任选地从反应物分离产物。或者，在食品原料的背景下，产物可以在不分离的情况下变为食品原料的组分。在某些实施例中，供体分子是含有甘露糖单元的多糖链，包括但不限于甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。
VII.用于食品加工和动物饲料的Gte Man1多肽
几种抗营养因子可能限制在制备动物饲料和人类食物中使用特定植物材料。例如，含有寡甘露聚糖的植物材料例如甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖可以降低动物对营养化合物例如矿物质、维生素、糖类和脂类的消化率和吸收。这些不利作用尤其归咎于含甘露聚糖的聚合物的高粘度及含甘露聚糖的聚合物吸附营养化合物的能力。通过使用降解含甘露聚糖聚合物的酶，即内切-β-甘露聚糖酶，例如本文所述的Gte Man1多肽，削弱这些作用，这允许在饲料中包含更高比例的包含含甘露聚糖的聚合物的廉价植物材料，从而导致饲料成本降低。另外，通过Gte Man1多肽的作用，含甘露聚糖的聚合物降解为更简单的糖类，所述糖类可以更轻易地吸收以提供额外能量。因此，包含本文所述的任何GteMan1多肽的组合物优选用于加工和/或制备食品或动物饲料。
在本发明的一个方面，提供包含本发明的任何Gte Man1多肽的面包改良剂组合物，其中任选地存在甘露聚糖源或葡甘露聚糖源或半乳甘露聚糖源，并且还任选地存在其他酶。
一般而言，将含有植物材料的动物饲料在适合分解含甘露聚糖的聚合物的条件下在分离的Gte Man1多肽或其片段或变体存在的情况下温育。
本发明的Gte Man1多肽可用作非人类动物的饲料添加剂。术语“非人类动物”包括全部的非反刍动物和反刍动物。在具体实施例中，非反刍动物选自但不限于马和单胃动物，例如但不限于猪(pig)、家禽、猪(swine)和鱼。在另外的实施例中，猪可以是（但不限于）小猪、生长猪和母猪；家禽可以是（但不限于）火鸡、鸭子和鸡（包括但不限于肉鸡、蛋鸡）；以及鱼包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳动物包括但不限于小虾和大虾。例如家禽和猪(swine)，在另外的实施例中，非人类动物为反刍动物，包括但不限于牛、牛犊、山羊、绵羊、长颈鹿、野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和蓝牛。本发明的Gte Man1多肽还可用作添加剂。本发明的Gte Man1多肽还可用于人类食物。在一些实施例中，Gte Man1多肽用于预处理饲料而非用作饲料添加剂。在一些优选的实施例中，将Gte Man1多肽添加至或用来预处理断奶仔猪、保育猪、小猪、肥育猪、生长猪、育肥猪、蛋鸡、肉鸡、火鸡的饲料。在一些实施例中，将Gte Man1多肽添加至或用来预处理源自植物材料例如棕榈仁、椰子、魔芋、刺槐豆胶、瓜耳胶、大豆、大麦、燕麦、亚麻、小麦、玉米、亚麻籽、柑橘渣、棉籽、落花生、油菜籽、向日葵、豌豆和羽扇豆的饲料。
由于本发明的Gte Man1多肽为热稳定酶，因此它们用于生产颗粒饲料的工艺中，其中在造粒步骤之前将热施加至饲料混合物中，如大多数商用制粒机中那样。将Gte Man1多肽在造粒步骤之前添加至其他饲料成分或造粒步骤之后添加至成型的饲料颗粒。
在包含预期用于食品加工或用作饲料添加剂的任何所公开的Gte Man1多肽的组合物中，所述组合物任选地包含其他替代物，例如染色剂、芳香化合物、稳定剂、维生素、矿物质、其他饲料或食物增强酶等。这特别适用于所谓的预混料。可以将根据本发明的食物添加剂与其他食物组分组合，以产生加工的食品。将所得的组合食物添加剂以适当的量与其他食物组分例如谷类或植物蛋白混合以形成加工食品。
因此，本发明涉及一种包含Gte Man1多肽的动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品。
本发明还涉及用于制备这种动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的方法，包括将Bag Gte1多肽与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物食物成分混合。
此外，本发明涉及Gte Man1多肽在制备动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食物中的用途。
在本发明的背景下，术语“宠物食物”意在理解为意指以下动物的食物：家养动物，例如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、南美栗鼠、褐鼠、豚鼠；鸟类宠物，例如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行类宠物，例如乌龟、蜥蜴和蛇；以及水生宠物，例如热带鱼和青蛙。
术语“动物饲料组合物”、“饲料原料”、“草料”可互换使用并且可以包含一种或多种选自以下的饲料原料：a)谷物，例如小粒谷物（如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合）和/或大粒谷物（如玉蜀黍或高粱）；b)来自谷类的副产品，如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)（尤其是玉米干酒糟及可溶物(cDDGS)）、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)从例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉油菜、鱼粉、干血浆蛋白、肉粉及骨粉、马铃薯蛋白、乳清、椰干核、芝麻之类的来源获得的蛋白质；d)从植物和动物来源获得的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
VIIIa.用于发酵饮料（例如啤酒）的Gte Man1多肽
术语“动物饲料组合物”、“饲料原料”、“草料”可互换使用并可包含一种或多种选自以下的饲料材料：a)谷物，例如小粒谷物（如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合）和/或大粒谷物（如玉蜀黍或高粱）；b)谷类副产品，如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)（尤其是玉米干酒糟及可溶物(cDDGS)）、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)从例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉油菜、鱼粉、干血浆蛋白、肉粉及骨粉、马铃薯蛋白、乳清、椰干核、芝麻之类的来源获得的蛋白质；d)从植物和动物来源获得的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
在本发明的多个方面，食物组合物或添加剂可以为液体或固体。
在本发明的一个方面，食物组合物是包含本发明的Gte Man1多肽任一者的饮料，包括但不限于发酵饮料例如啤酒和葡萄酒。
在本发明的背景下，术语“发酵饮料”意在包含通过包括发酵工艺如微生物发酵（例如细菌和/或酵母发酵）的方法生产的任何饮料。
在本发明的一个方面，发酵饮料是啤酒。术语“啤酒”意在包含通过含淀粉植物材料的发酵/酿造所产生的任何发酵麦芽汁。通常，啤酒从麦芽或辅助材料、或作为含淀粉植物材料的麦芽和辅助材料的任何组合产生。如本文所用，术语“麦芽”应理解为任何麦芽化的谷粒，例如麦芽化的大麦或小麦。
如本文所用，术语“辅助材料”指不是麦芽的任何含淀粉和/或含糖植物材料，例如大麦或小麦芽。作为辅助材料的例子，可以提及多种材料，例如普通玉米糁、精制玉米糁、酿造碾磨酵母(brewer′s milled yeast)、稻、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘焙的谷类、麦片(cereal flake)、黑麦、燕麦、马铃薯、木薯淀粉、木薯和糖浆（例如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖浆、大麦和/或小麦糖浆）等可以用作淀粉源。
如本文所用，术语“麦芽浆”指任何含淀粉和/或含糖植物材料(如碎麦芽，例如包括破碎的大麦芽、破碎的大麦)和/或其他辅助材料或其组合的含水浆液，其稍后与水混合以分离成麦芽汁和酒糟。
术语“麦芽汁”指在制浆过程期间提取碎麦芽后的未发酵液体流出物。
在另一方面，本发明涉及制备发酵饮料如啤酒的方法，包括将本发明的Gte Man1多肽的任一者与麦芽或辅助材料混合。
啤酒的例子包括：全麦芽啤酒、在“纯净法”下酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡爱尔啤酒、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒（第二类啤酒）、第三类啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒、无酒精麦芽酒等，而且还包括可供选择的谷类和麦芽饮料，如水果味麦芽饮料，例如柑橘味，如柠檬、甜橙、酸橙或浆果味麦芽饮料；酒味麦芽饮料，例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒；或咖啡味麦芽饮料，如咖啡因味麦芽酒等。
本发明的一个方面涉及根据本发明的Gte Man1多肽的任一者在生产发酵饮料如啤酒中的用途。
另一方面涉及提供发酵饮料的方法，包括将麦芽浆和/或麦芽汁与本发明的Gte Man1多肽的任一者接触的步骤。
又一方面涉及提供发酵饮料的方法，该方法包括以下步骤：(a)制备麦芽浆，(b)过滤麦芽浆得到麦芽汁，以及(c)发酵麦芽汁以得到发酵饮料，如啤酒，其中将Gte Man1多肽的任一者添加至：(i)步骤(a)的麦芽浆中和/或(ii)步骤(b)的麦芽汁中和/或(iii)步骤(c)的麦芽汁中。
根据又一个方面，通过包括以下步骤的方法产生或提供发酵饮料如啤酒：(1)将麦芽浆和/或麦芽汁与本发明的Gte Man1多肽的任一者接触；和/或(2)(a)制备麦芽浆，(b)过滤麦芽浆以得到麦芽汁，以及(c)发酵麦芽汁以得到发酵饮料，如啤酒，其中将Gte Man1多肽的任一者添加至：(i)步骤(a)的麦芽浆中和/或(ii)步骤(b)的麦芽汁中和/或(iii)步骤(c)的麦芽汁中。
特定实施例涉及上述用途、方法或发酵饮料的任一者，其中所述发酵饮料为啤酒，如全麦芽啤酒、在“纯净法”下酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡爱尔啤酒、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒（第二类啤酒）、第三类啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒、无酒精麦芽酒等，而且还包括可供选择的谷类和麦芽饮料，如水果味麦芽饮料，例如柑橘味如柠檬、甜橙、酸橙或浆果味麦芽饮料；酒味麦芽饮料，例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒；或咖啡味麦芽饮料，如咖啡因味麦芽酒等。
VIII.用于处理咖啡提取物的Gte Man1多肽
本文所述的Gte Man1多肽还可以用于水解液体咖啡提取物中存在的半乳甘露聚糖。在某些优选实施例中，Gte Man1多肽用来在液体咖啡提取物的冷冻干燥期间抑制凝胶形成。降低的提取物粘度减少干燥期间的能量消耗。在某些其他优选实施例中，Gte Man1多肽以固定化形式施加，以减少酶消耗并避免污染咖啡提取物。该用途还公开于EP 676 145中。
一般说来，将咖啡提取物在适合水解存在于液体咖啡提取物中的半乳甘露聚糖的条件下在分离的Gte Man1多肽或其片段或变体存在时温育。
VIIIc用于烘焙食品的Gte Man1多肽
在另一方面，本发明涉及制备烘焙产品的方法，包括将本发明GteMan1多肽的任一者添加至生面团，然后烘焙生面团。烘焙产品的例子是本领域技术人员熟知的，并包括面包、面包卷、酥皮、甜发酵生面团、小圆面包、蛋糕、薄饼干、曲奇饼、饼干、华夫饼、煎饼、玉米粉圆饼、早餐谷物、膨化制品等。
可以将本发明Gte Man1多肽的任一者作为面包改良剂组合物的一部分添加至生面团。面包改良剂是含有多种改善生面团性质和烘培产品（如面包和蛋糕）品质的成分的组合物。面包改良剂通常在工业烘焙工艺中添加，这是由于其具有有益效果，如生面团稳定性及面包质地和体积。面包改良剂通常含有油脂以及添加剂如乳化剂、酶、抗氧化剂、氧化剂、稳定剂和还原剂。除了本发明Gte Man1多肽的任一者外，还可存在于面包改良剂中或可以另外与本发明Gte Man1多肽的任一者结合使用的其他酶包括淀粉酶、半纤维素酶、淀粉分解复合物、脂肪酶、蛋白酶、木聚糖酶、果胶酶、支链淀粉酶、非淀粉多糖降解酶和氧化还原酶（如葡萄糖氧化酶、脂氧合酶或抗坏血酸氧化酶）。
在本发明的优选烘焙方面，本发明Gte Man1多肽的任一者可以作为面包改良剂组合物的一部分添加至生面团，所述面包改良剂组合物还包含葡甘露聚糖源和/或半乳甘露聚糖源例如魔芋胶、瓜耳胶、刺槐豆胶（长角豆）、椰子核粉、象牙椰子甘露聚糖（太卡棕榈）、海藻甘露聚糖提取物、椰子粕和啤酒酵母细胞壁（可将其干燥或以啤酒酵母提取物的形式使用）。用于本发明的其他可接受甘露聚糖衍生物包括非分支的β-1,4-连接的甘露聚糖均聚物和甘露低聚糖（甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖和甘露戊糖）。本发明Gte Man1多肽的任一者与葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖和/或半乳葡甘露聚糖的组合进一步改善生面团耐受性、生面团柔韧性和生面团粘性，改善面包团粒结构并延迟面包老化，并且甘露聚糖酶水解产物通过促进在结肠中以有利种群密度存在时通常与良好健康相关的乳酸菌的生长充当可溶性益生元。
本发明的另一方面涉及本发明Gte Man1多肽的任一者在生面团中改善生面团耐受性、柔韧性和粘性的用途。优选地，可以向其添加本发明Gte Man1多肽中任一者的生面团不是纯白面粉生面团，而是除纯小麦粉之外或作为纯小麦粉的替代，包含麸皮或燕麦、大米、粟、玉蜀黍或豆类粉。
本发明的又一方面涉及本发明Gte Man1多肽的任一者在生面团中改善团粒结构并延迟最终烘焙产品如面包老化的用途。
VIIIc用于乳类食品的Gte Man1多肽
在本发明的一个方面，可以将本发明Gte Man1多肽的任一者添加至还已经添加了葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖的牛奶或任何其他乳类产品。常见的葡甘露聚糖源和/或半乳甘露聚糖源在上文的烘焙方面列出并且包括瓜耳胶或魔芋胶。本发明Gte Man1多肽的任一者与葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖的组合释放甘露聚糖酶水解产物（甘露低聚糖），该水解产物通过促进在大肠或结肠中以有利种群密度存在时通常与良好健康相关的益生菌（尤其是双歧杆菌(Bifidobacteria)和乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌）的选择性生长和繁殖而充当可溶性益生元。
在另一方面，本发明涉及制备奶或乳制品的方法，包括添加本发明Gte Man1多肽的任一者以及添加任何葡甘露聚糖或半乳甘露聚糖或半乳葡甘露聚糖。
在本发明的另一方面，在添加至乳基食品原料之前或之后，将本发明Gte Man1多肽的任一者与任何葡甘露聚糖或半乳甘露聚糖组合使用以生产包含益生性甘露聚糖水解产物的乳基食品原料。在本发明的另一方面，如此生产的含甘露低聚糖的乳制品能够增加有益性人类肠道菌群的种群，并且在本发明的又一方面，乳基食品原料可以包含本发明Gte Man1多肽的任一者，同时含有葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖和/或半乳葡甘露聚糖的任何来源，并且剂量足以在人类大肠中接种已知有益的至少一种细菌菌株（例如双歧杆菌或乳酸杆菌）。优选地，所述乳基食品原料为酸奶或乳饮料。
IX.用于纸浆漂白的Gte Man1多肽
本文所述的Gte Man1多肽还用于酶辅助漂白纸浆例如化学纸浆、半化学纸浆、牛皮纸浆、机械纸浆或通过亚硫酸盐方法制备的纸浆。一般而言，在适合漂白纸浆的条件下，将纸浆与分离的Gte Man1多肽或其片段或变体一起温育。
在一些实施例中，纸浆是用氧气、臭氧、过氧化物或过氧酸漂白的无氯纸浆。在一些实施例中，Gte Man1多肽用于酶辅助漂白通过改良或连续制浆方法制备的呈现低木质素含量的纸浆。在一些其他实施例中，GteMan1多肽单独施加或优选地与木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶组合施加。
X.用于降解增稠剂的Gte Man1多肽
半乳甘露聚糖例如瓜耳胶和刺槐豆胶广泛用作例如食物和纺织物印花（例如T恤上的印花）用印花色浆中的增稠剂。因此，本文所述的GteMan1多肽还用于降低含甘露聚糖的底物的稠度或粘度。在某些实施例中，本文所述的Gte Man1多肽用于降低加工设备中残余食物的粘度，从而有利于加工后清洁。在某些其他实施例中，所公开的Gte Man1多肽用于降低印花色浆的粘度，从而有利于洗掉纺织物印花后多余的印花色浆。一般说来，在适合降低含甘露聚糖的底物的粘性的条件下，将含甘露聚糖的底物与分离Gte Man1多肽或其片段或变体一起温育。
根据前面的描述和以下的实例，本发明组合物和方法的其他方面和实施例将显而易见。
实例
提供以下实施例以论证和说明本发明的某些优选实施例和方面，而不应该理解为限制。
在以下实验公开中，采用以下缩写：M（摩尔/升）、mM（毫摩尔/升）、μM（微摩尔/升）、nM（纳摩尔/升）、mol（摩尔）、mmol（毫摩尔）、μmol（微摩尔）、nmol（纳摩尔）、g和gm（克）、mg（毫克）、μg（微克）、pg（皮克）、L（升）、ml和mL（毫升）、μl和μL（微升）、cm（厘米）、mm（毫米）、μm（微米）、nm（纳米）、U（单位）、MW（分子量）、s（秒）、min（分钟）、h（小时）、℃（摄氏度）、QS（足量）、ND（未进行）、rpm（转/分钟）、H2O（水）、dH2O（去离子水）、HCl（盐酸）、aa（氨基酸）、bp（碱基对）、kb（千碱基对）、kD（千道尔顿）、MgCl2（氯化镁）、NaCl（氯化钠）、Ca（钙）、Mg（镁）、HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）、CHES（N-环己基-2-氨基乙磺酸）、w/v（重量与体积比）、v/v（体积比）、g（重力）、OD（光密度）、ppm（份每百万份）、m-（间）、o-（邻）、p-（对）、PAHBAH（对羟基苯甲酸酰肼）、Gte Man1（喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶1）、SRI（污渍去除指数）和%SR（污渍去除百分比）。
实例1
喜温地芽孢杆菌糖基水解酶Gte Man1的克隆
选择喜温地芽孢杆菌（
et al.,IJSEM,54:2361-2368,2004（
等人，《国际系统与进化微生物学杂志》，第54卷，第2361-2368页，2004年））作为可用于工业应用的多种糖基水解酶和其他酶的潜在来源。通过如下方式获得用于测序的基因组DNA：首先将喜温地芽孢杆菌菌株DSM16325在50℃于心浸液琼脂平板（Difco公司）上培育24小时。从平板上刮取细胞材料，并用来借助来自Zymo的ZF真菌/细菌DNA小量制备试剂盒（目录号D6005）制备基因组DNA。所述基因组DNA用于基因组测序并用来扩增供Gte Man1基因用于表达克隆。使用
合成测序技术(www.baseclear.com/sequencing/illumina-sequencing/)对喜温地芽孢杆菌菌株DSM16325（从德国DSMZ公司获得）的全基因组测序。由BaseClear公司（荷兰莱顿(Leiden,The Netherlands)）进行基因组测序和序列数据装配。由BioXpr公司（比利时那慕尔(Namur,Belgium)）注释重叠群。以这种方式在喜温地芽孢杆菌中鉴定出的基因之一编码糖基水解酶，其中通过BLASTP显示所述糖基水解酶与多种其他细菌的内切-β-甘露聚糖酶具有同源性。该基因（称为Gte Man1基因）的序列以SEQ ID NO:1示出。由Gte Man1基因编码的蛋白质以SEQ ID NO:2示出。在N端，该蛋白质具有40个氨基酸的信号肽，如设置成SignalP-NN系统的SignalP-3.0程序(www.cbs.dtu/services/SignalP)所预测（Emanuelsson et al.,NatureProtocols,2:953-971,2007（Emanuelsson等人，《自然实验手册》，第2卷，第953-971页，2007年））。信号序列的存在表明Gte Man1是分泌型糖基水解酶。
Gte Man1编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1示出。预测的信号序列的编码区以斜体表示。
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Gte Man1前体蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2示出。预测的信号肽以斜体表示。
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实例2
喜温地芽孢杆菌糖基水解酶Gte Man1的表达
使用以下引物从喜温地芽孢杆菌的基因组DNA扩增Gte Man1基因：引物15′-GGCAGCTGGT AAAAAAAAA CAAAAAAATC CTAGCAAACC-3’(SEQ ID NO:3)，和引物2(XhoI)5’-CGCCTCGAGT TATTCGGACAATGCCACGTC AT-3’(SEQ ID NO:4)。使用以下引物将aprE启动子和aprE信号序列独立地从p2JM103BBI表达载体扩增：引物35′-TTGTTTTTTTTTACCAGCTG CCTGCGCGCT CA-3’(SEQ ID NO:5)和引物4(EcoRI)5’-CGCGAATTCT CCATTTTCTT CTGCTATC-3’(SEQ ID NO:6)（Vogtentanz,Protein Expr Purif,55:40-52,2007（Vogtentanz，《蛋白表达纯化》，第55卷，第40-52页，2007年））。
然后通过使用引物2和4的第三PCR反应,将所述两种PCR产物组装成一体。在使用EcoRI/XhoI消化后，将PCR产物克隆至使用相同限制性内切酶消化的p2JM103BBI表达载体（Vogtentanz,Protein Expr Purif,55:40-52,2007（Vogtentanz，《蛋白表达与纯化》，第55卷，第40-52页，2007年））。该DNA片段与PCR扩增的编码Gte Man1成熟蛋白的基因连接，这导致在枯草芽孢杆菌AprE前肽的3’端与成熟Gte Man1多肽的编码序列的5’端之间添加三个密码子。将所得质粒标记为pZQ184(aprE-GteMan1)。pZQ184的质粒图谱在图1中示出。在宿主中的天然信号肽酶裂解后，以这种方式产生的重组Gte Man1蛋白在其氨基端具有三个额外氨基酸(Ala-Gly-Lys)。通过DNA测序确认Gte Man1基因的序列(SEQ ID NO:7)。
使用此前所述的方法，在枯草芽孢杆菌细胞中产生Gte Man1蛋白（Vogtentanz,Protein Expr Purif,55:40-52,2007（Vogtentanz，《蛋白表达纯化》，第55卷，第40-52页，2007年））。该蛋白分泌到细胞外培养基中，并将过滤的培养基用于实施清洁测定法。剂量基于使用伯乐(Biorad)蛋白质测定法(500-0006EDU)通过布拉德福德(Bradford)型测定法所确定的总蛋白质计，并根据使用来自伯乐公司的标准无污染系统通过SDS-PAGE确定的纯度进行修正。
使用下列三种色谱柱从浓缩的培养上清液纯化Gte Man1。1)用20mM醋酸钠(pH5.0)平衡的阳离子交换色谱柱(HiPrep16/10SP XL)，从其中使用含有0.5M NaCl的20mM醋酸钠(pH5.0)的平衡/洗涤缓冲液线性梯度洗脱蛋白质。2)用20mM Tris(pH7.0)、1M(NH4)2SO4)平衡的疏水相互作用色谱柱(HiPrep phenyl(high sub)16/10)，从其中使用20mM Tris(pH7.0)的平衡/洗涤缓冲液的线性梯度洗脱蛋白质。3)凝胶过滤HiLoad Superdex200pg26/60柱，从其中使用含有0.15M NaCl的20mM磷酸钠(pH7.0)洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE确认蛋白纯度和相对大小。使用纯化的蛋白进行pH、温度和活性实验。由pZQ184表达载体产生的1011个残基蛋白的分子量经计算为111.1kDa。
从pZQ184表达的Gte Man1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7示出。编码aprE信号序列的核酸序列以斜体示出。
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从质粒pZQ184表达的Gte Man1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8示出。aprE信号序列以斜体示出。
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从质粒pZQ184表达的成熟Gte Man1蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO:9示出。基于预测的裂解位点的三个残余N-端延伸以粗体示出。
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成熟Gte Man1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:10示出。
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如通过对枯草芽孢杆菌中表达的重组蛋白质测序所确定的成熟GteMan1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:11示出。
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GDLKWFTKVLNAIKADRNAKRIAYMQTWANFGLNGNLFVPYNDAPNGL
GDHELLPDFINYYKDPYTAFLREVKGVYNNKVEAAKEQPFMHIASPTDN
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VPLSNVNRVKFDVLVPVSAGQQNANASLRGIIMLPPDWNEKYGMTTTEK
ALANLQTVTINRVKYAEFPVMIDLNDPAKLSAAKGLVLSIVGNGLELNGA
VYVDNIKLFSTYTETPTDPALVDDFESYQGSNAVLQQKFVKAGGDTITVS
LDGSHKSSGTYAMKVDYTLAGSGYAGVTKSLGGVDWSRFNKLKFWLTP
DGKDQKLVIQLRVDGVYYEAYPSLASTTPGWVELHFNDFTVAPWDTAN
LGKKLNKISLKNVQDFAIYVNSKNGTTLSSTLYFDDIKAIYDATAASVPN
GGTGPGSTPEQPGTLYDFETGVQGWEVEQNQANATTPTITTDAAAKGTH
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实例3
Gte Man1的清洁性能
在微样本测定法和耐洗牢度试验仪中测试Gte Man1的清洁性能。
A.微样本96孔测定形式
在微样本测定法中测试与蛋白酶组合的Gte Man1(SEQ ID NO:11)的清洁性能。在使用250μl最终体积的96孔板形式（G080F，德国Kisker GbR(Kisker GbR,Germany)）中，使用CS-73刺槐豆胶和CS-43瓜耳胶预染棉布样本（荷兰的测试材料中心(Center For Testmaterials(CFT),theNetherlands)）实施去污实验。将约5mm样本片切割并置于平板的每个孔中。在市售热灭活
粉末、
2X强效洗衣液和亮彩、Actilift（宝洁公司(Procter&Gamble)）洗涤剂存在的情况下以0.3g/l最终浓度测试Gte Man1的性能。在应用相关的以下蛋白酶存在的情况下测试Gte Man1的清洁性能：（用于粉末洗涤剂）和PURAFECT
（用于液体洗涤剂）。商用甘露聚糖酶MannastarTM（美国加利福尼亚州帕罗奥图的杰能科国际公司(Genencor International,Palo Alto,CA)）用作这些研究的基准。
将Gte Man1作为无菌过滤发酵液使用，且剂量基于使用伯乐(BioRad)蛋白质测定法(500-0006EDU)通过布拉德福德(Bradford)型测定法所确定的总蛋白质计，并根据使用来自伯乐公司的标准无污染系统通过SDS-PAGE所确定的纯度修正。在0.25ppm和1.0ppm的浓度测试Gte Man1和基准甘露聚糖酶，并添加0.5ppm蛋白酶。将水硬度调整到100ppm2:1Ca:Mg的最终浓度，并且用5mM（HEPES pH8.2（用于
洗衣液和
凝胶洗涤剂），或CAPS pH10（用于
粉末洗涤剂））对溶液进行缓冲。每块平板含有3-4个重复试样，每个样本类型运行2-3块板，得到总共6-12个重复测定值。将平板密封，并在iEMS振荡器（赛默科技公司(ThermoScientific)）中在30℃以900rpm对板振荡30分钟。在温育之后，将织物使用洗板机4MK2（赛默公司(Thermo)）以去离子水漂洗三次，并在50℃干燥过夜。使用以扫描仪（中晶(Microtek)Scan Maker900)）取得的RGB量值对污渍去除定量。将图片输入Photoshop CSII中，其中使用来自麋鹿图形公司(Reindeer Graphics)的IPTK5.0从含有样本的区域提取RGB值。使用作为每个样本的清洁后和清洁前RGB颜色测量值的差值的RGB颜色值来计算污渍去除。
使用以下公式，相对于未清洗织物计算清洗后织物的ΔSRI（污垢去除指数的变化）值：
%污垢去除(RGB)=(污垢去除dE(RGB)/初始污垢dE(RGB))×100%
其中：
污垢去除dE(RGB)=SQRT((R之后-R之前)2+(G之后-G之前)2+(B之后-B之前)2)，
初始污垢dE(RGB)=SQRT((R参照–R之前)2+(G参照–G之前)2+(B参照-B之前)2)
RGB参照值是未染污棉布（白色）的值。
Gte Man1在蛋白酶存在情况下的清洁性能在表3-1中示出。
表3-1：Gte Man1在蛋白酶存在的情况下在不同洗涤剂中对CFT C-S-73刺槐豆胶的清洁性能（%SRI±标准偏差）
还以微样本形式测试与蛋白酶（
或
Prime）和淀粉酶（在WO2010/115021中所述的ACE prime或
）组合的Gte Man1蛋白的清洁性能。将蛋白酶与淀粉酶的组合称为CWS（冷水系统）。使用0.25ppm甘露聚糖酶连同0.5ppm
Prime和0.1ppm ACE prime连同液体洗涤剂，以及0.8ppm
和0.2ppm
连同粉末洗涤剂，如上文所述实施测定法。Gte Man1在蛋白酶和淀粉酶存在的情况下的清洁性能在表3-2中示出。
表3-2：Gte Man1在蛋白酶和淀粉酶(CWS)存在的情况下在不同洗涤
剂中对CFT C-S-73刺槐豆胶的清洁性能（对于n=12而言，处于%SRI±
95%置信区间）
B.耐洗牢度试验仪(Launder-O-meter)中等规模测定形式
使用购自荷兰测试材料中心的CS-43（瓜耳胶）、CS-73（刺槐豆胶）和PCS-43（沾染颜料的瓜耳胶）样本，在耐洗牢度试验仪LP-2（美国伊利诺州芝加哥的阿特拉斯电子设备有限公司(Atlas Electric Devices Co.,Chicago,IL)）或等效装置中测试Gte Man1蛋白(SEQ ID NO:11)的清洁性能。测试与蛋白酶（
或
Prime）组合的Gte Man1的清洁性能。将样本切割成3cm×3cm的尺寸，在柯尼卡美能达(KonicaMinolta)CR-400反射计上读取预清洗的LAB值，并将每种污渍类型的4个样本（12g，包括压载土(ballast soil)）连同6个不锈钢球一起添加到每个测试烧杯中。将水硬度调整至100ppm的最终浓度并用于稀释洗涤剂。将市售的奥妙洁彩粉末洗涤剂（联合利华公司(Unilever)）加热灭活，并以5.25g/L的剂量使用。市售的Small&Mighty生物液体洗涤剂（联合利华公司(Unilever)）不含酶且在不作加热灭活的情况下以2.33g/L的剂量使用。将不同剂量（0.25ppm、1ppm和2.5ppm）的Gte Man1连同用于液体洗涤剂的0.5ppm的Prime，或连同用于粉末洗涤剂的0.8ppm的
一起添加到每个烧杯中。洗涤循环在40℃进行45分钟。在清洗之后，取出样本，用冷自来水冲洗5分钟，然后在洗衣离心机中离心，并且平铺在加热箱中以干燥。将干燥样本在室温下用深色布覆盖，并且通过用柯尼卡美能达CR-400反射计测量LAB值评估污渍去除。1ppm GteMan1剂量的%SR读数在图2A和2B中示出。
实例4
Gte Man1的pH特征图
使用来自美格兹密公司(Megazyme)的β-甘露聚糖酶片剂测定法，同时略微修改建议的方案，测定Gte Man1(SEQ ID NO:11)和基准内切-β-甘露聚糖酶（TMNZ1/02；天青精交联的角豆胶半乳甘露聚糖）的pH特征图。在pH值调整至4与11之间的50mM醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液中实施该测定法。将酶溶液稀释到检测缓冲液中，并将500μL酶溶液在40℃平衡，随后添加一片底物片剂。10分钟之后，通过添加10mL2%Tris(pH12)终止反应。将管置于室温5分钟，搅拌并且通过Whatman1号滤纸过滤液体。通过测量590nm处的光密度，将从底物释出的蓝色染料定量。将每个pH处的酶活性报告为相对活性，此时将最适pH处的活性设定为100%。Gte Man1的pH特征图在图3A中示出。发现Gte Man1的最适pH在约5.0处并且发现在pH4.2与pH6.4之间保持大于70%的最大活性。
通过使用β-甘露聚糖酶片剂测定法（爱尔兰美格兹密公司(Megazyme,Ireland)）在4-11范围内变化的pH值时测定甘露聚糖酶活性来研究MannastarTM的pH特征图。在10分钟之后，在每个pH值于OD590nm监测水溶性染料片段的生成。通过将活性的最高OD值设定为100且相对于最高OD值在其他pH值测定活性，绘制pH特征图。MannastarTM的pH特征图在图3B中示出。发现MannastarTM在pH4与7.5之间保留大于70%的最大活性。
实例5
Gte Man1的温度特征图
在50mM柠檬酸钠缓冲液(pH6)中在35℃与75℃之间变化的温度测定酶活性10分钟，确定纯化的Gte Man1(SEQ ID NO:11)的最适温度。将活性报告为相对活性，此时将最适温度下的活性设定为100%。Gte Man1的温度特征图在图4A中示出。发现Gte Man14具有54℃的最适温度，且发现在48℃与62℃之间保留大于70%的最大活性。
通过在50mM醋酸钠缓冲液(pH6)中使用β-甘露聚糖酶片剂测定法（爱尔兰美格兹密公司(Megazyme,Ireland)）在20℃至75℃范围内变化的温度测定甘露聚糖酶活性，研究MannastarTM的温度特征图。10分钟之后，在每个温度处，监测在OD590nm的水溶性染料片段的生成。通过将活性的最大OD值设定为100%并且相对于最大值在其他温度测定活性，绘制温度特征图。MannastarTM的温度特征图在图4B中示出。发现MannastarTM在55℃与75℃之间保留大于70%的最大活性。
实例6
Gte Man1的甘露聚糖酶活性
在PAHBAH测定法（Lever,Anal Biochem,,47:248,1972（Lever，《分析生物化学》，第47卷，第248页，1972年））中使用1%美格兹密公司低粘度角豆胶半乳甘露聚糖（爱尔兰美格兹密国际公司(MegazymeInternational,Ireland)）作为底物，测量Gte Man1(SEQ ID NO:11)的甘露聚糖酶活性。在50℃在含0.005%Tween-80的50mM醋酸钠(pH5)缓冲液中保持10分钟，或在30℃在含0.005%Tween-80的50mM HEPES(pH8.2)缓冲液中保持30分钟，实施该测定法。针对每种缓冲液执行使用甘露糖的标准曲线，并使用该标准曲线来计算酶活性单位。酶比活性单位的定义：将一个甘露聚糖酶单位定义为在测定法的条件下每分钟产生1μmol甘露糖还原型糖当量所需的酶量。图5A示出Gte Man1在pH5.0处显示的甘露聚糖酶活性。图5B示出Gte Man1在pH8.2处显示的甘露聚糖酶活性。
实例7
Gte Man1与其他甘露聚糖酶的比较
A.同源甘露聚糖酶的鉴定
使用成熟形式的Gte Man1的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)用作查询序列，通过针对NCBI非冗余蛋白数据库(nr)进行BLAST搜索来鉴定同源物（Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-402,1997（Altschul等人，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页，1997年））。仅保留具有40%或更高同一性百分比的序列。将同一性百分比(PID)定义为相同残基的数目除以成对比对中比对的残基的数目。表7-1提供经鉴定与Gte Man1具有40%或更高同一性百分比的序列的列表。表7-1提供每种同源物的NCBI和SEQ ID NO.、每种序列的长度（氨基酸数目）以及PID（同一性百分比）。
B.同源甘露聚糖酶序列的比对
使用CLUSTALW软件（Thompson et al.,Nucleic Acids Res,22:4673-4680,1994（Thompson等人，《核酸研究》，第22卷，第4673-4680页，1994年）），采用默认参数对Gte Man1和所选同源物的序列进行多重比对。使用MUSCLE（MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation，Edgar,Nucleic Acids Res,32:1792-1797,2004（Edgar，《核酸研究》，第32卷，第1792-1797页，2004年）），采用默认参数将所述比对结果细化。对于同源序列，仅示出与种子序列相对应的区域。在进一步分析中不包含PID为98%或更高的冗余序列。图6A-D示出Gte Man1与同源甘露聚糖酶的比对结果。
C.进化系统树
基于上述的细化比对结果，使用具有10000次自展的ClustalW软件，采用邻接算法建立Gte Man1的进化系统树。使用自展法来评估进化系统树分枝的可靠性（Felsenstein,Evolution39:783-791,1985（Felsenstein，《进化》，第39卷，第783-791页，1985年））。将其他ClustalW参数设置为默认值。使用程序PhyloWidget（针对生命之树的基于网络的可视化程序，www.phylowidget.org）提供进化系统树（Jordan and Piel,Bioinformatics,24:1641-1642,2008（Jordan和Piel，《生物信息学》，第24卷，第1641-1642页，2008年））。Gte Man1的进化系统树在图7中示出。
表7-1：具有40或更高同一性百分比的Gte Man1同源物的列表
表7-2：与SEQ ID NO：12的催化结构域(294个残基)具有40或更高
同一性百分比的Gte Man1同源物的列表
| 同源物 | 长度 | PID(％) |
| YP_003850806 | 1410 | 77.2 |
| ZP_07386640 | 1555 | 72.4 |
| BAE80444 | 997 | 64.8 |
| JP2006087404-0005 | 971 | 64.8 |
| BAE80444 | 997 | 64.8 |
| US6566114-0010 | 586 | 64.4 |
| AAT42241 | 510 | 63.6 |
| Bsp Man4 | 296 | 61.6 |
| ZP 06365324 | 1121 | 59.2 |
| ZP_06625371 | 854 | 58.7 |
| ZP 06922280 | 786 | 54.5 |
| YP_003487354 | 667 | 52.7 |
| 2BVT_A | 475 | 52.4 |
实例8
对Gte Man 1的功能结构域的预测
使用位于NCBI网站上的保守结构域搜索服务(CD搜索)工具，利用BLAST结果列表内的参考序列，确定Gte Man1的结构域和功能结构域(例如催化区和碳水化合物结合结构域)的位置。CD-搜索使用RPS-BLAST(反向位置特异性BLAST)来比较查询序列与位置特异性打分矩阵，其中从保守结构域数据库(CDD)中存在的保守结构域比对结果准备所述位置特异性打分矩阵。CD搜索的结果呈现为用户查询序列上的注释蛋白质结构域。将同源物D2M1G9的蛋白质序列(TrEMBL，之前称为NCBI ZP_06365324)输入CD搜索工具中，以识别Gte Man1的催化结构域和碳水化合物结合结构域。D2M1G9的氨基酸序列与Gte Man1共有43.2％同一性。
使用Vector NTI(英杰公司(Invitrogen))内的AlignX，利用Gte Man1与其先前标注的每个同源物的ClustalW比对结果，鉴定结构域。基于D2M1G9与Gte Man1之间的比对结果，预测Gte Man1的催化结构域的长度为294个氨基酸，起始位置为V18，结束位置为W311。预测结合模块CBM27的长度为175个氨基酸，起始位置为E487，结束位置为F661。预测结合模块CBM11的长度为166个氨基酸，起始位置为P671，结束位置为K836。对糖类结合模块家族分类的完整描述以在CAZy碳水化合物活性酶数据库(www.cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.html)中找到。使用描述粪碱纤维单胞菌CfMan26A的结构的参考文献（Le Nours et al.,Biochemistry44:12700-8,2005（Le Nours等人，《生物化学》，第44卷，第12700-12708页，2005年）），预测Gte Man1的催化残基为E183和E293。所有位置均从成熟蛋白质序列的起点开始计算。图8示出Gte Man1的功能结构域。
Gte Man1的催化结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示：
VDPLATDDTKSLFAYLKDVRGKQVLFGHQHAIDEGLTLIGSKELESEVKN
SVGDFPAVFGWDTLSLEGKEKPGVPNDPKQSRANLVASMKKVHKLGGII
ALSAHMPNFVTGGSFNDTTGNVVEHILPGGDKNAEFNSFLDNIAQFAKEL
KDDKGKQIPILFRPFHEQNGSWFWWGAKTTTPSQYIEIYRYTVEYLRDKK
GVHNFLYVYSPNGTFGGSEANYLTTYPGDDYVDILGMDQYDNQSNPGTT
QFLTNLVKDLEMISKLADTKGKIAAFSEFGYSPQGMKTTGNGDLKW。
接下来，通过将Gte Man1的氨基酸序列串线到粪碱纤维单胞菌甘露聚糖酶的三维结构上，构建Gte Man1的同源模型。使用由化学计算集团有限公司（Chemical Computing Group Inc.，加拿大魁北克蒙特利尔(Montreal,Quebec,Canada)）提供的程序套件“MOE”完成构建同源模型的以下步骤。第一步骤涉及使用Gte Man1的蛋白质序列搜索蛋白质数据库(www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中已知结构的同源序列。根据这个搜索，鉴定到粪碱纤维单胞菌甘露聚糖酶（pdb登录号2X2Y），并发现2X2Y与Gte Man1之间共有43%同一性。下一个步骤涉及将Gte Man1的序列串线到粪碱纤维单胞菌甘露聚糖酶的已知序列的相关元件上。串线程序本身包括多个约束条件。一个这样的约束条件涉及将保守残基的主链和侧链结构保持一致。另一个约束条件涉及保持主链原子固定，同时搜索与模型内相邻原子的集合最相容的非保守残基的替代侧链的旋转异构体。当插入残基时，使用环结构库将可能的插入建模。在可能选择不同旋转异构体的情况下，将整个串线程序重复10次。使所有模型均经受有限的能量最小化，然后选择具有最低能量的模型。基于同源模型的Gte Man1的截短物种的氨基酸序列如下所示。
Gte Man1的截短种类1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
RVENLVDPLATDDTKSLFAYLKDVRGKQVLFGHQHAIDEGLTLIGSKELE
SEVKNSVGDFPAVFGWDTLSLEGKEKPGVPNDPKQSRANLVASMKKVH
KLGGIIALSAHMPNFVTGGSFNDTTGNVVEHILPGGDKNAEFNSFLDNIA
QFAKELKDDKGKQIPILFRPFHEQNGSWFWWGAKTTTPSQYIEIYRYTVE
YLRDKKGVHNFLYVYSPNGTFGGSEANYLTTYPGDDYVDILGMDQYDN
QSNPGTTQFLTNLVKDLEMISKLADTKGKIAAFSEFGYSPQGMKTTGNGD
LKWFTKVLNAIKADRNAKRIAYMQTWANFGLNGNLFVPYNDAPNGLGD
HELLPDFINYYKDPYTAFLREVKGVYNNKVEAAKEQPFMHIASPTDNAT
VKTATTKIRVRVLNQKPSKVVYVVEGSSKEVPMKLDADGYYSANWSPV
SKFNGKSVKITVKSYMP。
Gte Man1的截短种类2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
RVENLVDPLATDDTKSLFAYLKDVRGKQVLFGHQHAIDEGLTLIGSKELE
SEVKNSVGDFPAVFGWDTLSLEGKEKPGVPNDPKQSRANLVASMKKVH
KLGGIIALSAHMPNFVTGGSFNDTTGNVVEHILPGGDKNAEFNSFLDNIA
QFAKELKDDKGKQIPILFRPFHEQNGSWFWWGAKTTTPSQYIEIYRYTVE
YLRDKKGVHNFLYVYSPNGTFGGSEANYLTTYPGDDYVDILGMDQYDN
QSNPGTTQFLTNLVKDLEMISKLADTKGKIAAFSEFGYSPQGMKTTGNGD
LKWFTKVLNAIKADRNAKRIAYMQTWANFGLNGNLFVPYNDAPNGLGD
HELLPDFINYYKDPYTAFLREVKGVYNNKVEAAK。
在另外的实施例中，提供了Gte Man1的截短形式。一种形式包含SEQ ID NO:10的残基1至300，另一种形式包含SEQ ID NO:10的残基1至475，另一种形式包含SEQ ID NO:10的残基1至675，而又一种形式包含SEQ ID NO:10的残基1至850（如下所述）。
实例9
喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1变体的克隆
通过PCR从喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1野生型质粒DNApZQ184(aprE-Gte Man1)获得不同长度的喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶GteMan1变体。基于喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1全长基因序列和Gte Man1Pfam域结构（Pfam蛋白质家族数据库：M.Punta,P.C.Coggill,R.Y.Eberhardt,J.Mistry,J.Tate,C.Boursnell,N.Pang,K.Forslund,G.Ceric,J.Clements,A.Heger,L.Holm,E.L.L.Sonnhammer,S.R.Eddy,A.Bateman,R.D.Finn,Nucleic Acids Research(2012)Database Issue40:D290-D301（M.Punta、P.C.Coggill、R.Y.Eberhardt、J.Mistry、J.Tate、C.Boursnell、N.Pang、K.Forslund、G.Ceric、J.Clements、A.Heger、L.Holm、E.L.L.Sonnhammer、S.R.Eddy、A.Bateman、R.D.Finn，《核酸研究》，2012年，数据库专刊，第40卷，第D290-D301页））设计引物。截短物的图可以见于图9中。该项研究中所用的引物为：5′-ACTAGCCGACTAGTAAAAAACAAAAAAATCCTAGC-3(SEQ IDNO:28)’、v1_Rev:5’-CTTACGGGCTCGAGTTACCCTTGTGGGCTATAGCCAAACTCCG-3’(SEQ IDNO:29)、v2_Rev:5’-CTTACGGGCTCGAGTTACATCACGGTCTTGTTTGGCATATAGG-3’(SEQ ID NO:30)、v3_Rev:5’-CTTACGGGCTCGAGTTAGTCTACCAGCGCAGGATCAGTCGGCG-3’(SEQ IDNO:31)、v4_Rev:5’-CTTACGGGCTCGAGTTATCCGCCGTTCGGAACCGATGCGGCGG-3’(SEQ IDNO:32)。PCR引物包含用于克隆目的的Spe I限制性酶位点和Xho I限制性酶位点。使用热循环仪，根据制造商的说明书（复性温度为58℃）用KOD-plus聚合酶(TOYOBA)执行PCR。通过测序分析确认PCR产物的核酸序列。
PCR产物经Spe I和Xho I（得自纽英伦生物技术公司(New EnglandBiolabs)）消化并随后连接到表达载体p2JM中。根据制造商的方案（生命技术公司(Life Technology)）将连接混合物转化入大肠杆菌TOP10化学感受态细胞。随后将转化的细胞接种在Luria肉汤琼脂平板上并用50ppm氨苄青霉素抗生素选择，接着在37℃温育过夜。通过测序分析确认含有正确插入片段的阳性克隆。
喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1v1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:33所示。
AAAAAACAAAAAAATCCTAGCAAACCGAACAGTAAACGGGTAGAAA
ATTTGGTCGACCCGTTAGCAACTGATGATACTAAGTCATTGTTTGCGT
ATCTTAAAGATGTTCGCGGTAAACAGGTTTTGTTTGGACACCAACATG
CAATCGATGAAGGGTTAACGCTTATAGGCTCTAAAGAACTCGAATCTG
AAGTAAAAAACTCTGTCGGTGATTTCCCAGCTGTATTTGGATGGGACA
CCTTAAGTTTGGAAGGTAAAGAAAAGCCTGGGGTTCCAAACGACCCT
AAACAAAGTCGTGCCAACTTAGTAGCTTCTATGAAGAAGGTTCATAAA
CTTGGAGGTATTATTGCGTTAAGCGCACATATGCCGAATTTTGTAACA
GGTGGCAGTTTCAATGATACTACAGGAAATGTTGTTGAACATATTTTG
CCAGGTGGCGACAAAAATGCAGAGTTTAATTCTTTCTTAGATAACATT
GCACAGTTTGCCAAAGAACTTAAAGACGATAAGGGCAAACAGATCCC
GATTCTGTTCCGTCCGTTTCATGAGCAAAACGGTAGTTGGTTCTGGTG
GGGCGCCAAAACGACGACACCTAGCCAGTATATTGAGATTTACCGTT
ATACGGTAGAATACTTGCGGGATAAGAAAGGTGTCCACAATTTCCTTT
ACGTTTATTCGCCGAATGGAACTTTCGGCGGAAGTGAAGCAAACTACT
TGACCACGTATCCTGGCGATGACTATGTCGACATTCTCGGAATGGACC
AATATGATAACCAATCTAATCCGGGGACTACCCAATTCCTCACCAATC
TAGTGAAAGATTTGGAGATGATATCCAAATTAGCCGATACCAAAGGA
AAAATCGCAGCGTTTTCGGAGTTTGGCTATAGCCCACAAGGGTAA
喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1v1蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO:34示出。信号肽以斜体和小写字母示出。在信号肽与喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1v1的第一个密码子之间存在引入的限制性酶位点，其以小写字母和下划线示出。
tsKKQKNPSKPNSKRVENLVDPLATDDTKSLF
AYLKDVRGKQVLFGHQHAIDEGLTLIGSKELESEVKNSVGDFPAVFGWD
TLSLEGKEKPGVPNDPKQSRANLVASMKKVHKLGGIIALSAHMPNFVTG
GSFNDTTGNVVEHILPGGDKNAEFNSFLDNIAQFAKELKDDKGKQIPILFR
PFHEQNGSWFWWGAKTTTPSQYIEIYRYTVEYLRDKKGVHNFLYVYSPN
GTFGGSEANYLTTYPGDDYVDILGMDQYDNQSNPGTTQFLTNLVKDLEM
ISKLADTKGKIAAFSEFGYSPQG
成熟形式的喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1v1的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示。
KKQKNPSKPNSKRVENLVDPLATDDTKSLFAYLKDVRGKQVLFGHQHAI
DEGLTLIGSKELESEVKNSVGDFPAVFGWDTLSLEGKEKPGVPNDPKQSR
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NAEFNSFLDNIAQFAKELKDDKGKQIPILFRPFHEQNGSWFWWGAKTTTP
SQYIEIYRYTVEYLRDKKGVHNFLYVYSPNGTFGGSEANYLTTYPGDDY
VDILGMDQYDNQSNPGTTQFLTNLVKDLEMISKLADTKGKIAAFSEFGYS
PQG
喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1v2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:36所示。
AAAAAACAAAAAAATCCTAGCAAACCGAACAGTAAACGGGTAGAAA
ATTTGGTCGACCCGTTAGCAACTGATGATACTAAGTCATTGTTTGCGT
ATCTTAAAGATGTTCGCGGTAAACAGGTTTTGTTTGGACACCAACATG
CAATCGATGAAGGGTTAACGCTTATAGGCTCTAAAGAACTCGAATCTG
AAGTAAAAAACTCTGTCGGTGATTTCCCAGCTGTATTTGGATGGGACA
CCTTAAGTTTGGAAGGTAAAGAAAAGCCTGGGGTTCCAAACGACCCT
AAACAAAGTCGTGCCAACTTAGTAGCTTCTATGAAGAAGGTTCATAAA
CTTGGAGGTATTATTGCGTTAAGCGCACATATGCCGAATTTTGTAACA
GGTGGCAGTTTCAATGATACTACAGGAAATGTTGTTGAACATATTTTG
CCAGGTGGCGACAAAAATGCAGAGTTTAATTCTTTCTTAGATAACATT
GCACAGTTTGCCAAAGAACTTAAAGACGATAAGGGCAAACAGATCCC
GATTCTGTTCCGTCCGTTTCATGAGCAAAACGGTAGTTGGTTCTGGTG
GGGCGCCAAAACGACGACACCTAGCCAGTATATTGAGATTTACCGTT
ATACGGTAGAATACTTGCGGGATAAGAAAGGTGTCCACAATTTCCTTT
ACGTTTATTCGCCGAATGGAACTTTCGGCGGAAGTGAAGCAAACTACT
TGACCACGTATCCTGGCGATGACTATGTCGACATTCTCGGAATGGACC
AATATGATAACCAATCTAATCCGGGGACTACCCAATTCCTCACCAATC
TAGTGAAAGATTTGGAGATGATATCCAAATTAGCCGATACCAAAGGA
AAAATCGCAGCGTTTTCGGAGTTTGGCTATAGCCCACAAGGGATGAA
GACAACGGGTAACGGAGATCTCAAGTGGTTTACCAAAGTCCTGAATG
CGATCAAAGCAGATCGGAACGCCAAACGCATCGCTTATATGCAGACT
TGGGCCAATTTCGGTCTGAACGGTAACTTATTCGTTCCTTACAATGAC
GCTCCGAACGGCTTGGGCGACCATGAGCTTTTACCTGACTTTATCAAC
TACTACAAAGATCCATATACGGCGTTCCTTCGTGAAGTGAAAGGTGTT
TACAATAATAAAGTCGAAGCTGCAAAAGAGCAGCCGTTCATGCATAT
TGCTTCACCGACGGACAATGCTACGGTAAAAACGGCGACGACGAAAA
TTCGTGTCCGAGTGCTTAACCAAAAACCGTCCAAAGTCGTTTATGTCG
TTGAGGGATCCAGTAAAGAAGTGCCGATGAAACTCGACGCAGATGGC
TACTATTCAGCGAATTGGTCCCCGGTTTCCAAGTTTAACGGTAAATCG
GTCAAAATTACGGTGAAGTCCTATATGCCAAACAAGACCGTGATGTA
A
喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1v2蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO:37所示。信号肽以斜体和小写字母示出。在信号肽与喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1v2的第一个密码子之间存在引入的限制性酶位点，其以小写字母和下划线示出。
tsKKQKNPSKPNSKRVENLVDPLATDDTKSLF
AYLKDVRGKQVLFGHQHAIDEGLTLIGSKELESEVKNSVGDFPAVFGWD
TLSLEGKEKPGVPNDPKQSRANLVASMKKVHKLGGIIALSAHMPNFVTG
GSFNDTTGNVVEHILPGGDKNAEFNSFLDNIAQFAKELKDDKGKQIPILFR
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GTFGGSEANYLTTYPGDDYVDILGMDQYDNQSNPGTTQFLTNLVKDLEM
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RIAYMQTWANFGLNGNLFVPYNDAPNGLGDHELLPDFINYYKDPYTAFL
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VVYVVEGSSKEVPMKLDADGYYSANWSPVSKFNGKSVKITVKSYMPNK
TVM
成熟形式的Gte Man1v2的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示。
KKQKNPSKPNSKRVENLVDPLATDDTKSLFAYLKDVRGKQVLFGHQHAI
DEGLTLIGSKELESEVKNSVGDFPAVFGWDTLSLEGKEKPGVPNDPKQSR
ANLVASMKKVHKLGGIIALSAHMPNFVTGGSFNDTTGNVVEHILPGGDK
NAEFNSFLDNIAQFAKELKDDKGKQIPILFRPFHEQNGSWFWWGAKTTTP
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FMHIASPTDNATVKTATTKIRVRVLNQKPSKVVYVVEGSSKEVPMKLDA
DGYYSANWSPVSKFNGKSVKITVKSYMPNKTVM
喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1v3基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:39所示。
AAAAAACAAAAAAATCCTAGCAAACCGAACAGTAAACGGGTAGAAA
ATTTGGTCGACCCGTTAGCAACTGATGATACTAAGTCATTGTTTGCGT
ATCTTAAAGATGTTCGCGGTAAACAGGTTTTGTTTGGACACCAACATG
CAATCGATGAAGGGTTAACGCTTATAGGCTCTAAAGAACTCGAATCTG
AAGTAAAAAACTCTGTCGGTGATTTCCCAGCTGTATTTGGATGGGACA
CCTTAAGTTTGGAAGGTAAAGAAAAGCCTGGGGTTCCAAACGACCCT
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AAAATCGCAGCGTTTTCGGAGTTTGGCTATAGCCCACAAGGGATGAA
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CGATCAAAGCAGATCGGAACGCCAAACGCATCGCTTATATGCAGACT
TGGGCCAATTTCGGTCTGAACGGTAACTTATTCGTTCCTTACAATGAC
GCTCCGAACGGCTTGGGCGACCATGAGCTTTTACCTGACTTTATCAAC
TACTACAAAGATCCATATACGGCGTTCCTTCGTGAAGTGAAAGGTGTT
TACAATAATAAAGTCGAAGCTGCAAAAGAGCAGCCGTTCATGCATAT
TGCTTCACCGACGGACAATGCTACGGTAAAAACGGCGACGACGAAAA
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TTGAGGGATCCAGTAAAGAAGTGCCGATGAAACTCGACGCAGATGGC
TACTATTCAGCGAATTGGTCCCCGGTTTCCAAGTTTAACGGTAAATCG
GTCAAAATTACGGTGAAGTCCTATATGCCAAACAAGACCGTGATGAA
GCAGACAGTAAATGTGTTTGTCAAAGTTCCCGAAATTTTGATTAAGCA
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GCCGGATACAATTAAGACGAATTTTGAACATGCTAGGTTGAACGGAA
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TGGCAAGAGATTAAGTTAGAGTTATCCAATATTAAGGACATTGTTCCG
CTCTCCAATGTTAACCGTGTGAAATTTGATGTGCTCGTTCCAGTATCCG
CAGGACAACAAAATGCAAATGCCAGCTTGCGCGGAATTATAATGCTT
CCTCCAGATTGGAATGAAAAATATGGAATGACGACCACAGAGAAAGC
ATTAGCTAATTTGCAAACGGTTACAATAAATAGGGTTAAATATGCGGA
ATTTCCAGTTATGATTGATCTGAACGATCCGGCTAAGTTGTCGGCGGC
GAAGGGGCTTGTTCTCTCTATTGTCGGAAATGGATTGGAATTGAACGG
TGCAGTATATGTTGACAATATCAAGTTGTTCAGCACCTATACAGAAAC
GCCGACTGATCCTGCGCTGGTAGACTAA
喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1v3蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO:40所示。信号肽以斜体和小写字母示出。在信号肽与喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1v3的第一个密码子之间存在引入的限制性酶位点，其以小写字母和下划线示出。
AYLKDVRGKQVLFGHQHAIDEGLTLIGSKELESEVKNSVGDFPAVFGWD
TLSLEGKEKPGVPNDPKQSRANLVASMKKVHKLGGIIALSAHMPNFVTG
GSFNDTTGNVVEHILPGGDKNAEFNSFLDNIAQFAKELKDDKGKQIPILFR
PFHEQNGSWFWWGAKTTTPSQYIEIYRYTVEYLRDKKGVHNFLYVYSPN
GTFGGSEANYLTTYPGDDYVDILGMDQYDNQSNPGTTQFLTNLVKDLEM
ISKLADTKGKIAAFSEFGYSPQGMKTTGNGDLKWFTKVLNAIKADRNAK
RIAYMQTWANFGLNGNLFVPYNDAPNGLGDHELLPDFINYYKDPYTAFL
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TVMKQTVNVFVKVPEILIKQFTFDRDIKGIRNIGTWPDTIKTNFEHARLNG
NGKLKINITGMVRTDTWQEIKLELSNIKDIVPLSNVNRVKFDVLVPVSAG
QQNANASLRGIIMLPPDWNEKYGMTTTEKALANLQTVTINRVKYAEFPV
MIDLNDPAKLSAAKGLVLSIVGNGLELNGAVYVDNIKLFSTYTETPTDPA
LVD
成熟形式的Gte Man1v3的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示。
KKQKNPSKPNSKRVENLVDPLATDDTKSLFAYLKDVRGKQVLFGHQHAI
DEGLTLIGSKELESEVKNSVGDFPAVFGWDTLSLEGKEKPGVPNDPKQSR
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NAEFNSFLDNIAQFAKELKDDKGKQIPILFRPFHEQNGSWFWWGAKTTTP
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PQGMKTTGNGDLKWFTKVLNAIKADRNAKRIAYMQTWANFGLNGNLF
VPYNDAPNGLGDHELLPDFINYYKDPYTAFLREVKGVYNNKVEAAKEQP
FMHIASPTDNATVKTATTKIRVRVLNQKPSKVVYVVEGSSKEVPMKLDA
DGYYSANWSPVSKFNGKSVKITVKSYMPNKTVMKQTVNVFVKVPEILIK
QFTFDRDIKGIRNIGTWPDTIKTNFEHARLNGNGKLKINITGMVRTDTWQ
EIKLELSNIKDIVPLSNVNRVKFDVLVPVSAGQQNANASLRGIIMLPPDWN
EKYGMTTTEKALANLQTVTINRVKYAEFPVMIDLNDPAKLSAAKGLVLSI
VGNGLELNGAVYVDNIKLFSTYTETPTDPALVD
喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1v4基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:42所示。
AAAAAACAAAAAAATCCTAGCAAACCGAACAGTAAACGGGTAGAAA
ATTTGGTCGACCCGTTAGCAACTGATGATACTAAGTCATTGTTTGCGT
ATCTTAAAGATGTTCGCGGTAAACAGGTTTTGTTTGGACACCAACATG
CAATCGATGAAGGGTTAACGCTTATAGGCTCTAAAGAACTCGAATCTG
AAGTAAAAAACTCTGTCGGTGATTTCCCAGCTGTATTTGGATGGGACA
CCTTAAGTTTGGAAGGTAAAGAAAAGCCTGGGGTTCCAAACGACCCT
AAACAAAGTCGTGCCAACTTAGTAGCTTCTATGAAGAAGGTTCATAAA
CTTGGAGGTATTATTGCGTTAAGCGCACATATGCCGAATTTTGTAACA
GGTGGCAGTTTCAATGATACTACAGGAAATGTTGTTGAACATATTTTG
CCAGGTGGCGACAAAAATGCAGAGTTTAATTCTTTCTTAGATAACATT
GCACAGTTTGCCAAAGAACTTAAAGACGATAAGGGCAAACAGATCCC
GATTCTGTTCCGTCCGTTTCATGAGCAAAACGGTAGTTGGTTCTGGTG
GGGCGCCAAAACGACGACACCTAGCCAGTATATTGAGATTTACCGTT
ATACGGTAGAATACTTGCGGGATAAGAAAGGTGTCCACAATTTCCTTT
ACGTTTATTCGCCGAATGGAACTTTCGGCGGAAGTGAAGCAAACTACT
TGACCACGTATCCTGGCGATGACTATGTCGACATTCTCGGAATGGACC
AATATGATAACCAATCTAATCCGGGGACTACCCAATTCCTCACCAATC
TAGTGAAAGATTTGGAGATGATATCCAAATTAGCCGATACCAAAGGA
AAAATCGCAGCGTTTTCGGAGTTTGGCTATAGCCCACAAGGGATGAA
GACAACGGGTAACGGAGATCTCAAGTGGTTTACCAAAGTCCTGAATG
CGATCAAAGCAGATCGGAACGCCAAACGCATCGCTTATATGCAGACT
TGGGCCAATTTCGGTCTGAACGGTAACTTATTCGTTCCTTACAATGAC
GCTCCGAACGGCTTGGGCGACCATGAGCTTTTACCTGACTTTATCAAC
TACTACAAAGATCCATATACGGCGTTCCTTCGTGAAGTGAAAGGTGTT
TACAATAATAAAGTCGAAGCTGCAAAAGAGCAGCCGTTCATGCATAT
TGCTTCACCGACGGACAATGCTACGGTAAAAACGGCGACGACGAAAA
TTCGTGTCCGAGTGCTTAACCAAAAACCGTCCAAAGTCGTTTATGTCG
TTGAGGGATCCAGTAAAGAAGTGCCGATGAAACTCGACGCAGATGGC
TACTATTCAGCGAATTGGTCCCCGGTTTCCAAGTTTAACGGTAAATCG
GTCAAAATTACGGTGAAGTCCTATATGCCAAACAAGACCGTGATGAA
GCAGACAGTAAATGTGTTTGTCAAAGTTCCCGAAATTTTGATTAAGCA
ATTTACATTTGATAGGGATATTAAAGGGATCCGAAACATCGGTACTTG
GCCGGATACAATTAAGACGAATTTTGAACATGCTAGGTTGAACGGAA
ATGGTAAGCTGAAAATTAACATAACCGGTATGGTACGTACCGACACG
TGGCAAGAGATTAAGTTAGAGTTATCCAATATTAAGGACATTGTTCCG
CTCTCCAATGTTAACCGTGTGAAATTTGATGTGCTCGTTCCAGTATCCG
CAGGACAACAAAATGCAAATGCCAGCTTGCGCGGAATTATAATGCTT
CCTCCAGATTGGAATGAAAAATATGGAATGACGACCACAGAGAAAGC
ATTAGCTAATTTGCAAACGGTTACAATAAATAGGGTTAAATATGCGGA
ATTTCCAGTTATGATTGATCTGAACGATCCGGCTAAGTTGTCGGCGGC
GAAGGGGCTTGTTCTCTCTATTGTCGGAAATGGATTGGAATTGAACGG
TGCAGTATATGTTGACAATATCAAGTTGTTCAGCACCTATACAGAAAC
GCCGACTGATCCTGCGCTGGTAGACGATTTTGAGTCTTACCAAGGCAG
CAACGCTGTCTTACAGCAAAAGTTTGTAAAAGCAGGTGGGGACACGA
TTACGGTTTCATTGGATGGCTCTCACAAAAGCAGCGGCACATATGCTA
TGAAGGTTGACTATACGCTTGCTGGTTCAGGTTATGCGGGTGTTACGA
AATCGTTGGGCGGAGTGGATTGGTCCAGATTCAACAAATTGAAATTCT
GGCTCACACCGGACGGGAAAGATCAGAAGCTTGTTATCCAGCTCAGA
GTGGACGGCGTATACTACGAAGCGTATCCGTCGCTTGCTTCCACTACA
CCGGGATGGGTTGAGCTTCACTTCAACGATTTCACCGTCGCACCTTGG
GATACCGCTAATTTAGGCAAAAAACTCAATAAAATAAGCCTAAAAAA
CGTACAAGACTTCGCAATTTATGTAAACTCCAAAAACGGTACGACGCT
TAGCAGTACCCTGTATTTCGACGATATTAAAGCGATCTACGACGCAAC
CGCCGCATCGGTTCCGAACGGCGGATAA
喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1v4蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO.43所示。信号肽以斜体和小写字母示出。在信号肽与喜温地芽孢杆菌甘露聚糖酶Gte Man1v4的第一个密码子之间存在引入的限制性酶位点，其以小写字母和下划线示出。
AYLKDVRGKQVLFGHQHAIDEGLTLIGSKELESEVKNSVGDFPAVFGWD
TLSLEGKEKPGVPNDPKQSRANLVASMKKVHKLGGIIALSAHMPNFVTG
GSFNDTTGNVVEHILPGGDKNAEFNSFLDNIAQFAKELKDDKGKQIPILFR
PFHEQNGSWFWWGAKTTTPSQYIEIYRYTVEYLRDKKGVHNFLYVYSPN
GTFGGSEANYLTTYPGDDYVDILGMDQYDNQSNPGTTQFLTNLVKDLEM
ISKLADTKGKIAAFSEFGYSPQGMKTTGNGDLKWFTKVLNAIKADRNAK
RIAYMQTWANFGLNGNLFVPYNDAPNGLGDHELLPDFINYYKDPYTAFL
REVKGVYNNKVEAAKEQPFMHIASPTDNATVKTATTKIRVRVLNQKPSK
VVYVVEGSSKEVPMKLDADGYYSANWSPVSKFNGKSVKITVKSYMPNK
TVMKQTVNVFVKVPEILIKQFTFDRDIKGIRNIGTWPDTIKTNFEHARLNG
NGKLKINITGMVRTDTWQEIKLELSNIKDIVPLSNVNRVKFDVLVPVSAG
QQNANASLRGIIMLPPDWNEKYGMTTTEKALANLQTVTINRVKYAEFPV
MIDLNDPAKLSAAKGLVLSIVGNGLELNGAVYVDNIKLFSTYTETPTDPA
LVDDFESYQGSNAVLQQKFVKAGGDTITVSLDGSHKSSGTYAMKVDYTL
AGSGYAGVTKSLGGVDWSRFNKLKFWLTPDGKDQKLVIQLRVDGVYYE
AYPSLASTTPGWVELHFNDFTVAPWDTANLGKKLNKISLKNVQDFAIYV
NSKNGTTLSSTLYFDDIKAIYDATAASVPNGG
成熟形式的Gte Man1v4的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示。
KKQKNPSKPNSKRVENLVDPLATDDTKSLFAYLKDVRGKQVLFGHQHAI
DEGLTLIGSKELESEVKNSVGDFPAVFGWDTLSLEGKEKPGVPNDPKQSR
ANLVASMKKVHKLGGIIALSAHMPNFVTGGSFNDTTGNVVEHILPGGDK
NAEFNSFLDNIAQFAKELKDDKGKQIPILFRPFHEQNGSWFWWGAKTTTP
SQYIEIYRYTVEYLRDKKGVHNFLYVYSPNGTFGGSEANYLTTYPGDDY
VDILGMDQYDNQSNPGTTQFLTNLVKDLEMISKLADTKGKIAAFSEFGYS
PQGMKTTGNGDLKWFTKVLNAIKADRNAKRIAYMQTWANFGLNGNLF
VPYNDAPNGLGDHELLPDFINYYKDPYTAFLREVKGVYNNKVEAAKEQP
FMHIASPTDNATVKTATTKIRVRVLNQKPSKVVYVVEGSSKEVPMKLDA
DGYYSANWSPVSKFNGKSVKITVKSYMPNKTVMKQTVNVFVKVPEILIK
QFTFDRDIKGIRNIGTWPDTIKTNFEHARLNGNGKLKINITGMVRTDTWQ
EIKLELSNIKDIVPLSNVNRVKFDVLVPVSAGQQNANASLRGIIMLPPDWN
EKYGMTTTEKALANLQTVTINRVKYAEFPVMIDLNDPAKLSAAKGLVLSI
VGNGLELNGAVYVDNIKLFSTYTETPTDPALVDDFESYQGSNAVLQQKF
VKAGGDTITVSLDGSHKSSGTYAMKVDYTLAGSGYAGVTKSLGGVDWS
RFNKLKFWLTPDGKDQKLVIQLRVDGVYYEAYPSLASTTPGWVELHFND
FTVAPWDTANLGKKLNKISLKNVQDFAIYVNSKNGTTLSSTLYFDDIKAI
YDATAASVPNGG
实例10
Gte Man1缺失变体的表达
将Gte Man1v1、Gte Man1v2、Gte Man1v3和Gte Man1v4PCR产物克隆入p2JM表达载体中，并将所得的质粒标记为pLL003(aprE-Gte Man11-300)、pLL004(aprE-Gte Man11-475)、pLL005(aprE-Gte Man11-675)和pLL006(aprE-Gte Man11-850)。质粒图谱在图10A-D中提供。通过DNA测序确认缺失形式的基因的序列。
使用滚环试剂盒（美国新泽西州的通用电气医疗保健和生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences,NJ)）扩增质粒pLL003(aprE-Gte Man11-300)、pLL004(aprE-Gte Man11-475)、pLL005(aprE-Gte Man11-675)和pLL006(aprE-Gte Man11-850)序列，再进行转化。使用扩增的质粒转化枯草芽孢杆菌（degUHy32、ΔnprB、Δvpr、Δepr、ΔscoC、ΔwprA、Δmpr、ΔispA、Δbpr）。随后将转化的细胞接种在补充10ppm卡那霉素的Luria琼脂平板上。挑选单菌落并在摇瓶中培养。来自表达质粒pLL003(aprE-GteMan11-300)的Gte Man1v1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示。信号序列以粗体示出。
TGCGTATCTTAAAGATGTTCGCGGTAAACAGGTTTTGTTTGGACACCA
ACATGCAATCGATGAAGGGTTAACGCTTATAGGCTCTAAAGAACTCG
AATCTGAAGTAAAAAACTCTGTCGGTGATTTCCCAGCTGTATTTGGAT
GGGACACCTTAAGTTTGGAAGGTAAAGAAAAGCCTGGGGTTCCAAAC
GACCCTAAACAAAGTGCTTCTATGAAGAAGGTTC
ATAAACTTGGAGGTATTATTGCGTTAAGCGCACATATGCCGAATTTTG
TAACAGGTGGCAGTTTCAATGATACTACAGGAAATGTTGTTGAACATA
TTTTGCCAGGTGGCGACAAAAATGCAGAGTTTAATTCTTTCTTAGATA
ACATTGCACAGTTTGCCAAAGAACTTAAAGACGATAAGGGCAAACAG
ATCCCGATTCTGTTCCGTCCGTTTCATGAGCAAAACGGTAGTTGGTTCT
GGTGGGGCGCCAAAACGACGACACCTAGCCAGTATATTGAGATTTAC
CGTTATACGGTAGAATACTTGCGGGATAAGAAAGGTGTCCACAATTTC
CTTTACGTTTATTCGCCGAATGGAACTTTCGGCGGAAGTGAAGCAAAC
TACTTGACCACGTATCCTGGCGATGACTATGTCGACATTCTCGGAATG
GACCAATATGATAACCAATCTAATCCGGGGACTACCCAATTCCTCACC
AATCTAGTGAAAGATTTGGAGATGATATCCAAATTAGCCGATACCAA
AGGAAAAATCGCAGCGTTTTCGGAGTTTGGCTATAGCCCACAAGGGT
AA
来自表达质粒pll003(apre-gte man11-300)的Gte Man1v1蛋白质的氨基酸如SEQ ID NO:46所示。信号序列以斜体示出。
AGKTSKKQKNPSKPNSKRVENLV
DPLATDDTKSLFAYLKDVRGKQVLFGHQHAIDEGLTLIGSKELESEVKNS
VGDFPAVFGWDTLSLEGKEKPGVPNDPKQSRANLVASMKKVHKLGGIIA
LSAHMPNFVTGGSFNDTTGNVVEHILPGGDKNAEFNSFLDNIAQFAKELK
DDKGKQIPILFRPFHEQNGSWFWWGAKTTTPSQYIEIYRYTVEYLRDKKG
VHNFLYVYSPNGTFGGSEANYLTTYPGDDYVDILGMDQYDNQSNPGTTQ
FLTNLVKDLEMISKLADTKGKIAAFSEFGYSPQG
来自表达质粒pLL004(aprE-Gte Man11-475)的Gte Man1v2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示。信号序列以粗体示出。
GGTAAAACTAGTAAAAAACAAAAAAATCCTAGCAAACCGAACAGTAA
ACGGGTAGAAAATTTGGTCGACCCGTTAGCAACTGATGATACTAAGTC
ATTGTTTGCGTATCTTAAAGATGTTCGCGGTAAACAGGTTTTGTTTGGA
CACCAACATGCAATCGATGAAGGGTTAACGCTTATAGGCTCTAAAGA
ACTCGAATCTGAAGTAAAAAACTCTGTCGGTGATTTCCCAGCTGTATT
TGGATGGGACACCTTAAGTTTGGAAGGTAAAGAAAAGCCTGGGGTTC
CAAACGACCCTAAACAAAGTCGTGCCAACTTAGTAGCTTCTATGAAG
AAGGTTCATAAACTTGGAGGTATTATTGCGTTAAGCGCACATATGCCG
AATTTTGTAACAGGTGGCAGTTTCAATGATACTACAGGAAATGTTGTT
GAACATATTTTGCCAGGTGGCGACAAAAATGCAGAGTTTAATTCTTTC
TTAGATAACATTGCACAGTTTGCCAAAGAACTTAAAGACGATAAGGG
CAAACAGATCCCGATTCTGTTCCGTCCGTTTCATGAGCAAAACGGTAG
TTGGTTCTGGTGGGGCGCCAAAACGACGACACCTAGCCAGTATATTGA
GATTTACCGTTATACGGTAGAATACTTGCGGGATAAGAAAGGTGTCCA
CAATTTCCTTTACGTTTATTCGCCGAATGGAACTTTCGGCGGAAGTGA
AGCAAACTACTTGACCACGTATCCTGGCGATGACTATGTCGACATTCT
CGGAATGGACCAATATGATAACCAATCTAATCCGGGGACTACCCAAT
TCCTCACCAATCTAGTGAAAGATTTGGAGATGATATCCAAATTAGCCG
ATACCAAAGGAAAAATCGCAGCGTTTTCGGAGTTTGGCTATAGCCCAC
AAGGGATGAAGACAACGGGTAACGGAGATCTCAAGTGGTTTACCAAA
GTCCTGAATGCGATCAAAGCAGATCGGAACGCCAAACGCATCGCTTA
TATGCAGACTTGGGCCAATTTCGGTCTGAACGGTAACTTATTCGTTCC
TTACAATGACGCTCCGAACGGCTTGGGCGACCATGAGCTTTTACCTGA
CTTTATCAACTACTACAAAGATCCATATACGGCGTTCCTTCGTGAAGT
GAAAGGTGTTTACAATAATAAAGTCGAAGCTGCAAAAGAGCAGCCGT
TCATGCATATTGCTTCACCGACGGACAATGCTACGGTAAAAACGGCG
ACGACGAAAATTCGTGTCCGAGTGCTTAACCAAAAACCGTCCAAAGT
CGTTTATGTCGTTGAGGGATCCAGTAAAGAAGTGCCGATGAAACTCGA
CGCAGATGGCTACTATTCAGCGAATTGGTCCCCGGTTTCCAAGTTTAA
CGGTAAATCGGTCAAAATTACGGTGAAGTCCTATATGCCAAACAAGA
CCGTGATGTAA
来自表达质粒pLL004(aprE-Gte Man11-475)的Gte Man1v2蛋白质的氨基酸如SEQ ID NO:48所示。信号序列以斜体示出。
KSLFAYLKDVRGKQVLFGHQHAIDEGLTLIGSKELESEVKNSVGDFPAVF
GWDTLSLEGKEKPGVPNDPKQSRANLVASMKKVHKLGGIIALSAHMPNF
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QKPSKVVYVVEGSSKEVPMKLDADGYYSANWSPVSKFNGKSVKITVKS
YMPNKTVM
来自表达质粒pLL005(aprE-Gte Man11-675)的Gte Man1v3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示。信号序列以粗体示出。
GGTAAAACTAGTAAAAAACAAAAAAATCCTAGCAAACCGAACAGTAA
ACGGGTAGAAAATTTGGTCGACCCGTTAGCAACTGATGATACTAAGTC
ATTGTTTGCGTATCTTAAAGATGTTCGCGGTAAACAGGTTTTGTTTGGA
CACCAACATGCAATCGATGAAGGGTTAACGCTTATAGGCTCTAAAGA
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CAAACGACCCTAAACAAAGTCGTGCCAACTTAGTAGCTTCTATGAAG
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GAACATATTTTGCCAGGTGGCGACAAAAATGCAGAGTTTAATTCTTTC
TTAGATAACATTGCACAGTTTGCCAAAGAACTTAAAGACGATAAGGG
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CAATTTCCTTTACGTTTATTCGCCGAATGGAACTTTCGGCGGAAGTGA
AGCAAACTACTTGACCACGTATCCTGGCGATGACTATGTCGACATTCT
CGGAATGGACCAATATGATAACCAATCTAATCCGGGGACTACCCAAT
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ATACCAAAGGAAAAATCGCAGCGTTTTCGGAGTTTGGCTATAGCCCAC
AAGGGATGAAGACAACGGGTAACGGAGATCTCAAGTGGTTTACCAAA
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TATGCAGACTTGGGCCAATTTCGGTCTGAACGGTAACTTATTCGTTCC
TTACAATGACGCTCCGAACGGCTTGGGCGACCATGAGCTTTTACCTGA
CTTTATCAACTACTACAAAGATCCATATACGGCGTTCCTTCGTGAAGT
GAAAGGTGTTTACAATAATAAAGTCGAAGCTGCAAAAGAGCAGCCGT
TCATGCATATTGCTTCACCGACGGACAATGCTACGGTAAAAACGGCG
ACGACGAAAATTCGTGTCCGAGTGCTTAACCAAAAACCGTCCAAAGT
CGTTTATGTCGTTGAGGGATCCAGTAAAGAAGTGCCGATGAAACTCGA
CGCAGATGGCTACTATTCAGCGAATTGGTCCCCGGTTTCCAAGTTTAA
CGGTAAATCGGTCAAAATTACGGTGAAGTCCTATATGCCAAACAAGA
CCGTGATGAAGCAGACAGTAAATGTGTTTGTCAAAGTTCCCGAAATTT
TGATTAAGCAATTTACATTTGATAGGGATATTAAAGGGATCCGAAACA
TCGGTACTTGGCCGGATACAATTAAGACGAATTTTGAACATGCTAGGT
TGAACGGAAATGGTAAGCTGAAAATTAACATAACCGGTATGGTACGT
ACCGACACGTGGCAAGAGATTAAGTTAGAGTTATCCAATATTAAGGA
CATTGTTCCGCTCTCCAATGTTAACCGTGTGAAATTTGATGTGCTCGTT
CCAGTATCCGCAGGACAACAAAATGCAAATGCCAGCTTGCGCGGAAT
TATAATGCTTCCTCCAGATTGGAATGAAAAATATGGAATGACGACCAC
AGAGAAAGCATTAGCTAATTTGCAAACGGTTACAATAAATAGGGTTA
AATATGCGGAATTTCCAGTTATGATTGATCTGAACGATCCGGCTAAGT
TGTCGGCGGCGAAGGGGCTTGTTCTCTCTATTGTCGGAAATGGATTGG
AATTGAACGGTGCAGTATATGTTGACAATATCAAGTTGTTCAGCACCT
ATACAGAAACGCCGACTGATCCTGCGCTGGTAGACTAA
来自表达质粒pLL005(aprE-Gte Man11-675)的Gte Man1v3蛋白质的氨基酸如SEQ ID NO:50所示。信号序列以斜体示出。
KSLFAYLKDVRGKQVLFGHQHAIDEGLTLIGSKELESEVKNSVGDFPAVF
GWDTLSLEGKEKPGVPNDPKQSRANLVASMKKVHKLGGIIALSAHMPNF
VTGGSFNDTTGNVVEHILPGGDKNAEFNSFLDNIAQFAKELKDDKGKQIP
ILFRPFHEQNGSWFWWGAKTTTPSQYIEIYRYTVEYLRDKKGVHNFLYV
YSPNGTFGGSEANYLTTYPGDDYVDILGMDQYDNQSNPGTTQFLTNLVK
DLEMISKLADTKGKIAAFSEFGYSPQGMKTTGNGDLKWFTKVLNAIKAD
RNAKRIAYMQTWANFGLNGNLFVPYNDAPNGLGDHELLPDFINYYKDP
YTAFLREVKGVYNNKVEAAKEQPFMHIASPTDNATVKTATTKIRVRVLN
QKPSKVVYVVEGSSKEVPMKLDADGYYSANWSPVSKFNGKSVKITVKS
YMPNKTVMKQTVNVFVKVPEILIKQFTFDRDIKGIRNIGTWPDTIKTNFEH
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PVSAGQQNANASLRGIIMLPPDWNEKYGMTTTEKALANLQTVTINRVKY
AEFPVMIDLNDPAKLSAAKGLVLSIVGNGLELNGAVYVDNIKLFSTYTET
PTDPALVD
来自表达质粒pLL006(aprE-Gte Man11-850)的Gte Man1v4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:51所示。信号序列以粗体示出。
GGTAAAACTAGTAAAAAACAAAAAAATCCTAGCAAACCGAACAGTAA
ACGGGTAGAAAATTTGGTCGACCCGTTAGCAACTGATGATACTAAGTC
ATTGTTTGCGTATCTTAAAGATGTTCGCGGTAAACAGGTTTTGTTTGGA
CACCAACATGCAATCGATGAAGGGTTAACGCTTATAGGCTCTAAAGA
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GAACATATTTTGCCAGGTGGCGACAAAAATGCAGAGTTTAATTCTTTC
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AGCAAACTACTTGACCACGTATCCTGGCGATGACTATGTCGACATTCT
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ATACCAAAGGAAAAATCGCAGCGTTTTCGGAGTTTGGCTATAGCCCAC
AAGGGATGAAGACAACGGGTAACGGAGATCTCAAGTGGTTTACCAAA
GTCCTGAATGCGATCAAAGCAGATCGGAACGCCAAACGCATCGCTTA
TATGCAGACTTGGGCCAATTTCGGTCTGAACGGTAACTTATTCGTTCC
TTACAATGACGCTCCGAACGGCTTGGGCGACCATGAGCTTTTACCTGA
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GAAAGGTGTTTACAATAATAAAGTCGAAGCTGCAAAAGAGCAGCCGT
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CATTGTTCCGCTCTCCAATGTTAACCGTGTGAAATTTGATGTGCTCGTT
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TATAATGCTTCCTCCAGATTGGAATGAAAAATATGGAATGACGACCAC
AGAGAAAGCATTAGCTAATTTGCAAACGGTTACAATAAATAGGGTTA
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TGTCGGCGGCGAAGGGGCTTGTTCTCTCTATTGTCGGAAATGGATTGG
AATTGAACGGTGCAGTATATGTTGACAATATCAAGTTGTTCAGCACCT
ATACAGAAACGCCGACTGATCCTGCGCTGGTAGACTAA
来自表达质粒pLL006(aprE-Gte Man11-850)的Gte Man1v4蛋白质的氨基酸如SEQ ID NO:52所示。信号序列以斜体示出。
KSLFAYLKDVRGKQVLFGHQHAIDEGLTLIGSKELESEVKNSVGDFPAVF
GWDTLSLEGKEKPGVPNDPKQSRANLVASMKKVHKLGGIIALSAHMPNF
VTGGSFNDTTGNVVEHILPGGDKNAEFNSFLDNIAQFAKELKDDKGKQIP
ILFRPFHEQNGSWFWWGAKTTTPSQYIEIYRYTVEYLRDKKGVHNFLYV
YSPNGTFGGSEANYLTTYPGDDYVDILGMDQYDNQSNPGTTQFLTNLVK
DLEMISKLADTKGKIAAFSEFGYSPQGMKTTGNGDLKWFTKVLNAIKAD
RNAKRIAYMQTWANFGLNGNLFVPYNDAPNGLGDHELLPDFINYYKDP
YTAFLREVKGVYNNKVEAAKEQPFMHIASPTDNATVKTATTKIRVRVLN
QKPSKVVYVVEGSSKEVPMKLDADGYYSANWSPVSKFNGKSVKITVKS
YMPNKTVMKQTVNVFVKVPEILIKQFTFDRDIKGIRNIGTWPDTIKTNFEH
ARLNGNGKLKINITGMVRTDTWQEIKLELSNIKDIVPLSNVNRVKFDVLV
PVSAGQQNANASLRGIIMLPPDWNEKYGMTTTEKALANLQTVTINRVKY
AEFPVMIDLNDPAKLSAAKGLVLSIVGNGLELNGAVYVDNIKLFSTYTET
PTDPALVDDFESYQGSNAVLQQKFVKAGGDTITVSLDGSHKSSGTYAMK
VDYTLAGSGYAGVTKSLGGVDWSRFNKLKFWLTPDGKDQKLVIQLRVD
GVYYEAYPSLASTTPGWVELHFNDFTVAPWDTANLGKKLNKISLKNVQD
FAIYVNSKNGTTLSSTLYFDDIKAIYDATAASVPNGG
实例11
Gte Man1和截短形式的甘露聚糖酶活性
使用购自美格兹密国际爱尔兰公司(Megazyme International Ireland)（爱尔兰布雷(Bray,Ireland)）的1%半乳甘露聚糖（角豆胶；低粘度）（P-GALML；批号10501）测量Gte Man1亲本和截短形式的GteManv4，即Gte Man1v3、Gte Man1v2和Gte Man1v1的β-1-4甘露聚糖酶活性。在平底、无结合的微量滴定板(Corning3641)中，将10μL粗制（未纯化的澄清培养物上清液）蛋白质样本稀释于含有0.005%Tween-80的90μL水中，然后连续稀释6次。在本发明的实验中，在含0.005%Tween-80的50mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)中在50℃保持10分钟，或在含0.005%Tween-80的50mM HEPES缓冲液(pH8.2)中在30℃保持30分钟，实施该测定法。将90μL的缓冲溶液添加至每个孔，并使其在想要的温度平衡至少5分钟。将10μL预稀释酶粗制溶液添加至每个孔，随后将这些板在想要的温度伴随600rpm转速的摇动进行温育。采用PAHBAH（对羟基苯甲酸酰肼）测定方法（Lever,Anal.Biochem.47:248,1972（Lever，《分析生物化学》，第47卷，第248页，1972年））量化释放的还原糖。将10μL反应混合物添加至96孔PCR板中的100μL PAHBAH溶液中。将PCR板在95℃温育5分钟，随后将其冷却至4℃持续2分钟。通过将100μL最终溶液转移到新的平底96孔板中以分光光度方式对410nm(OD410mn)处的吸光度值定量。在pH5或pH8.2处测试的样本的相对活性在表11-1中列出。在此测定法中，“+”符号表示酶活性≥0.2OD410mn，“–”符号表示酶活性为0至≤0.2D410mn。
表11-1：Gte Man4蛋白质以及四个C端截短形式在pH5和pH8.2处
的甘露聚糖酶活性
| 受测试酶 | pH5 | pH8.2 |
| Gte Man4 | + | + |
| Gte Man4v4 | + | + |
| Gte Man4v3 | + | + |
| Gte Man4v2 | + | - |
| Gte Man4v1 | - | - |
实例12
包含Gte Man1的液体衣物洗涤剂组合物n1
在该实例中，提供液体衣物洗涤剂组合物的各种配方。在这些配方的每一种中，以约0.0001重量%至约10重量%的浓度包含Gte Man1。在一些另外的实施例中，如配制人员根据其需求决定，使用其他浓度。
#1:添加1N HCl水溶液以调节配方的净pH处于约3至约5的范围内。实例12(I)-(II)的pH为约5至约7，实例12(III)-(V)的pH为约7.5至约8.5。
实例13
包含Gte Man1的液体手洗盘碟洗涤剂组合物
在该实例中，提供各种手洗盘碟液体洗涤剂配方。在这些配方的每一种中，以约0.0001重量%至约10重量%的浓度包含Gte Man1。在一些另外的实施例中，如配制人员根据其需求决定，使用其他浓度。
实例13(I)-(VI)的pH为约8至约11。
实例14
包含Gte Man1的液体自动盘碟洗涤剂组合物
在该实例中，提供各种液体自动盘碟洗涤剂配方。在这些配方的每一种中，以约0.0001重量%至约10重量%的浓度包含Gte Man1多肽。在一些另外的实施例中，如配制人员根据其需求决定，使用其他浓度。
实例15
包含Gte Man1的颗粒状和/或片状洗涤组合物
该实例提供颗粒状和/或片状衣物洗涤剂的多种配方。在这些配方的每一种中，以约0.0001重量%至约10重量%包含Gte Man1。在一些另外的实施例中，如配制人员根据其需求决定，使用其他浓度。
*香料、染料、增白剂/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO4/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。
实例16
包含Gte Man1的另外的液体衣物洗涤剂
该实例提供液体衣物洗涤剂的另外配方。在这些配方的每一种中，以约0.0001重量%至约10重量%的浓度包含Gte Man1。在一些另外的实施例中，如配制人员根据其需求决定，使用其他浓度。
实例17
包含Gte Man1的高密度盘碟洗涤剂
该实例提供高密度盘碟洗涤剂的多种配方。在这些致密配方的每一者中，以约0.0001重量%至约10重量%的浓度包含Gte Man1。在一些另外的实施例中，如配制人员根据其需求决定，使用其他浓度。
*增白剂/染料/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO4/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。实例17(I)至(VI)的pH为约9.6至约11.3。
实例18
包含Gte Man1的片状盘碟洗涤剂组合物
该实例提供多种片状盘碟洗涤剂配方。通过用标准的12头旋转压片机以13KN/cm2的压力压制颗粒状盘碟洗涤剂组合物，制备本发明的以下片状洗涤剂组合物。在这些配方的每一种中，以约0.0001重量%至约10重量%的浓度包含Gte Man1。在一些另外的实施例中，如配制人员根据其需求决定，使用其他浓度。
*增白剂/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO4/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。实例18(I)至18(VII)的pH为约10至约11.5；18(VIII)的pH为8-10。实例18(I)至18(VIII)的片重为约20克至约30克。
实例19
包含Gte Man1的液体硬质表面清洁洗涤剂
该实例提供液体硬质表面清洁洗涤剂的多种配方。在这些配方的每一种中，以约0.0001重量%至约10重量%的浓度包含Gte Man1。在一些另外的实施例中，如配制人员根据其需求决定，使用其他浓度。
实例19(I)至(VII)的pH为约7.4至约9.5。
Claims (39)
1.一种包含内切-β-甘露聚糖酶的催化结构域的重组多肽，其中所述催化结构域与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少70%相同。
2.一种包含内切-β-甘露聚糖酶的成熟形式的重组多肽，其中所述成熟形式与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少80%相同。
3.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其中所述多肽在洗涤剂存在的情况下具有甘露聚糖酶活性。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽在蛋白酶存在的情况下具有甘露聚糖酶活性。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽在4.2至6.4之间的pH值保留大于70%的甘露聚糖酶活性。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽在48℃至62℃的温度范围内保留大于70%的甘露聚糖酶活性。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽能够水解选自巧克力冰淇淋、瓜耳胶、刺槐豆胶以及它们的组合的底物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的重组多肽，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:8-14和30-49组成的组中的一条序列至少95%相同。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的重组多肽，其还包含具有1-13个残基的氨基端延伸。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的重组多肽，其还包含天然或非天然信号肽。
11.根据权利要求1、3-7中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽不进一步包含糖类结合模块。
12.一种洗涤剂组合物，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的重组多肽。
13.根据权利要求12所述的洗涤剂组合物，其还包含表面活性剂。
14.根据权利要求13所述的洗涤剂组合物，其中所述表面活性剂为离子表面活性剂。
15.根据权利要求14所述的洗涤剂组合物，其中所述离子表面活性剂选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂以及它们的组合。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的洗涤剂组合物，其还包含选自以下的酶：蛋白酶、蛋白酶、过氧化物酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、酰基转移酶、磷脂酶、酯酶、漆酶、过氧化氢酶、芳基酯酶、淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、卡拉胶酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、阿拉伯糖酶、透明质酸酶、软骨素酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、其他内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶以及它们的组合。
17.根据权利要求16所述的洗涤剂组合物，其中所述组合包含蛋白酶和淀粉酶。
18.根据权利要求12-17中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂选自衣物洗涤剂、织物软化洗涤剂、盘碟洗涤剂以及硬质表面清洁洗涤剂。
19.根据权利要求12-18中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂处于选自液体、粉末、颗粒状固体和片剂的形式。
20.一种水解存在于表面上的污垢或污渍中的甘露聚糖底物的方法，其包括：使所述表面与根据权利要求12-19中任一项所述的洗涤剂组合物接触以产生清洁的表面。
21.一种纺织物清洁方法，其包括：使沾污的纺织物与根据权利要求12-19中任一项所述的洗涤剂组合物接触以产生清洁的纺织物。
22.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1-11中任一项所述的重组多肽。
23.一种表达载体，其包含与调控序列有效组合的根据权利要求22所述的分离的核酸。
24.一种宿主细胞，其包含根据权利要求23所述的表达载体。
25.根据权利要求24所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌细胞或真菌细胞。
26.一种产生内切-β-甘露聚糖酶的方法，其包括：将根据权利要求24或25所述的宿主细胞在适合的条件下在培养基中培养，以产生包含所述内切-β-甘露聚糖酶的培养物。
27.根据权利要求26所述的方法，其还包括通过离心从所述培养物移除所述宿主细胞，并通过过滤移除小于10kDa的碎片以产生富含内切-β-甘露聚糖酶的上清液。
28.一种水解多糖的方法，其包括：使包含甘露糖的多糖与根据权利要求27所述的上清液接触以产生包含甘露糖的寡糖。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述多糖选自甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖以及它们的组合。
30.一种食物或饲料组合物和/或食物添加剂，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的多肽。
31.一种制备食物或饲料组合物和/或食物或饲料添加剂的方法，其包括将本发明的所述多肽与一种或多种食物或饲料和/或食物或饲料添加剂成分混合。
32.根据权利要求1-11中任一项所述的多肽的用途，用于制备食物或饲料组合物和/或食物或饲料添加剂和/或食物或饲料和/或宠物食物。
33.根据权利要求30所述的食物或饲料组合物，其中所述食物或饲料组合物为发酵饮料如啤酒。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述食物或饲料组合物为发酵饮料如啤酒，并且其中所述一种或多种食物成分包含麦芽或辅助材料。
35.根据权利要求1-11中任一项所述的多肽的用途，用于制备发酵饮料如啤酒。
36.一种提供发酵饮料的方法，其包括使麦芽浆和/或麦芽汁与根据权利要求1-11中任一项所述的多肽接触的步骤。
37.一种提供发酵饮料的方法，其包括以下步骤：
a)制备麦芽浆，
b)过滤所述麦芽浆以得到麦芽汁，以及
c)发酵所述麦芽汁以得到发酵饮料，如啤酒
其中将根据权利要求1-11中任一项所述的多肽添加至：
i.步骤(a)的所述麦芽浆和/或
ii.步骤(b)的所述麦芽汁和/或
iii.步骤(c)的所述麦芽汁。
38.一种发酵饮料，如啤酒，其通过根据权利要求34或36所述的方法制备。
39.根据权利要求35所述的用途、根据权利要求34或36所述的方法或根据权利要求38所述的发酵饮料，其中所述发酵饮料为啤酒，如全麦芽啤酒、在“纯净法”下酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡爱尔啤酒、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒（第二类啤酒）、第三类啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒、无酒精麦芽酒等，而且还包括可供选择的谷类和麦芽饮料，如水果味麦芽饮料，例如柑橘味如柠檬、甜橙、酸橙或浆果味麦芽饮料；酒味麦芽饮料，例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒；或咖啡味麦芽饮料，如咖啡因味麦芽酒等。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140122 |