CN103502445A - 包含芽孢杆菌甘露聚糖酶的洗涤剂组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明的组合物和方法涉及从芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)克隆的内切-β-甘露聚糖酶、编码所述内切-β-甘露聚糖酶的多核苷酸及其使用方法。含有所述内切-β-甘露聚糖酶的制剂非常适合用作洗涤剂。

Description

包含芽孢杆菌甘露聚糖酶的洗涤剂组合物及其使用方法

优先权

本专利申请要求2011年4月29日提交的国际申请No.PCT/CN2011/073559的优先权，该国际申请据此全文以引用方式并入。

技术领域

本发明的组合物和方法涉及从芽孢杆菌(Bacillus)物种克隆的内切-β-甘露聚糖酶、编码内切-β-甘露聚糖酶的多核苷酸及其使用方法。包含内切-β-甘露聚糖酶的制剂非常适合用作洗涤剂。

背景技术

当前的衣物洗涤剂和织物护理组合物包括诸如表面活性剂、酶（蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶和/或纤维素酶）、漂白剂、助洗剂体系(buildersystem)、抑泡剂、悬污剂、去污剂、荧光增白剂、软化剂、分散剂、染料转移抑制化合物、研磨剂、杀菌剂和香料之类的活性成分的复杂组合。

包括内切-β-甘露聚糖酶在内的甘露聚糖酶已用于洗涤剂清洁组合物中以通过水解甘露聚糖而除去胶渍。多种甘露聚糖存在于自然界中。它们包括直链甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡半乳甘露聚糖(glucogalactomannan)。在每种情形中，该多糖均含有β-1,4-连接的甘露糖残基主链，这些残基中最多33%可被葡萄糖残基取代（Yeoman等人，AdvAppl Microbiol（《应用微生物学进展》），爱思唯尔出版公司(Elsivier)）。在半乳甘露聚糖或葡半乳甘露聚糖中，半乳糖残基以α-1,6-键连接至甘露聚糖主链（Moreira和Filho,Appl Microbiol Biotechnol（《应用微生物学与生物技术》），79:165,2008）。因此，甘露聚糖水解成其组分糖需要内切-1,4-β-甘露聚糖酶，该酶水解主链键生成短链甘露寡糖，而甘露寡糖则通过1,4-β-甘露糖苷酶进一步降解成单糖。

然而，酶通常受到存在于清洁组合物中的表面活性剂和其他组分的抑制，这会干扰它们去除污渍的能力。例如，存在于衣物洗涤剂中的蛋白酶可在发生胶渍去除前就降解甘露聚糖酶。此外，甘露聚糖酶在它们具有活性时的pH和/或温度范围可能有限，这可使得它们不适于某些制剂和洗涤条件。因此，对于在清洁组合物的苛刻条件下保留活性的内切-β-甘露聚糖酶的存在需要。

发明内容

本发明的组合物和方法涉及从芽孢杆菌SWT81克隆的内切-β-甘露聚糖酶1(Bsp Man4)。含有内切-β-甘露聚糖酶的制剂非常适用于洗涤剂、食物或饲料。

具体地讲，本发明提供包含内切-β-甘露聚糖酶的催化结构域的重组多肽，其中该催化结构域与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少85%（85%、86%、87%、88%、89%、90、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）的同一性。本发明还提供包含内切-β-甘露聚糖酶的成熟形式的重组多肽，其中该成熟形式与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少80%（80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）的同一性。在一些实施例中，该多肽在存在洗涤剂的情况下具有可测的甘露聚糖酶活性。在一些实施例中，该多肽在存在蛋白酶的情况下具有可测的甘露聚糖酶活性。在一些实施例中，该多肽和蛋白酶均以约0.1至约10.0ppm存在。在一些实施例中，该多肽在6至8.5之间的pH值下保留高于70%的甘露聚糖酶活性。在一些实施例中，该多肽具有约6.5的最佳pH值。在一些实施例中，该多肽在55℃至65℃的温度下保留大于70%的甘露聚糖酶活性。在一些实施例中，该多肽具有约60℃的最适温度。在一些实施例中，该多肽能够水解选自巧克力冰淇淋、瓜耳胶、刺槐豆胶以及它们的组合的底物。在一些实施例中，其中氨基酸序列与选自SEQ ID NO:6-14和30-49的序列具有至少95%的同一性。在一些实施例中，该多肽还包含氨基末端延伸Ala-Gly-Lys。在一些实施例中，该多肽还包含天然或非天然信号肽。在一些实施例中，该多肽还包含至少一个糖类结合模块。在其他实施例中，该多肽不含糖类结合模块。

本发明还提供包含至少一种前述段落的重组多肽的洗涤剂组合物。在一些实施例中，该组合物还包含表面活性剂。在一些实施例中，表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、氢化椰油酸钠、月桂醇聚醚硫酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠、C14-15链烷醇聚醚-4以及它们的组合。在一些优选的实施例中，表面活性剂为离子型表面活性剂。在一些实施例中，离子型表面活性剂选自阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂以及它们的组合。在一些优选的实施例中，组合物还包含选自以下的酶：蛋白酶、蛋白酶、过氧化物酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、酰基转移酶、磷脂酶、酯酶、漆酶、过氧化氢酶、芳基酯酶、淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、卡拉胶酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、阿拉伯糖酶、透明质酸酶、软骨素酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、其他内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶以及它们的组合。在一些实施例中，组合物包含蛋白酶和淀粉酶。在一些实施例中，洗涤剂选自衣物洗涤剂、织物软化洗涤剂、餐具洗涤剂和硬质表面清洁剂。在一些实施例中，洗涤剂为选自液体、粉末、颗粒状固体和片剂的形式。除此之外，本发明还提供水解存在于表面上的污垢或污渍中的甘露聚糖底物的方法，包括：将表面与洗涤剂组合物接触以产生清洁的表面。本发明还提供纺织物清洁方法，包括：将沾污的纺织物与洗涤剂组合物接触以产生清洁的纺织物。

此外，本发明提供编码前述段落的重组多肽的分离核酸。本发明还提供包含与调控序列有效组合的分离核酸的表达载体。另外，还提供包含表达载体的宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞为细菌细胞或真菌细胞。本发明还提供产生内切-β-甘露聚糖酶的方法，包括：在适合产生包含内切-β-甘露聚糖酶的培养物的条件下在培养基中培养宿主细胞。在一些实施例中，该方法还包括通过离心从培养物中移除宿主细胞，并通过过滤移除小于10kDa的碎片以产生富含内切-β-甘露聚糖酶的上清液。本发明还提供水解多糖的方法，包括：将包含甘露糖的多糖与上清液接触以产生包含甘露糖的寡糖。在一些实施例中，多糖选自甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖以及它们的组合。

本发明还提供具有至少一种如上所述的重组多肽的食物或饲料组合物、制备这些组合物的方法以及这些组合物的用途。这包括动物和/或人类食物或饲料，其还包括发酵饮料。

根据如下描述，Bsp Man4组合物和方法的这些和其他方面将显而易见。

附图说明

图1提供pZQ186(aprE-Bsp Man4)的质粒图谱。

图2A示出了Bsp Man4的pH值曲线图。图2B显示基准内切-β-甘露聚糖酶(Mannastar^TM)的pH值曲线图。

图3A示出了Bsp Man4的温度曲线图。图3B示出了基准内切-β-甘露聚糖酶(Mannastar^TM)的温度曲线图。

图4A示出了多种形式的Bsp Man4在30℃、pH8.2下30分钟的甘露聚糖酶活性。图4B示出了多种形式的Bsp Man4在50℃、pH5下10分钟的甘露聚糖酶活性。

图5A示出了Bsp Man4在Small&Mighty液体洗涤剂中的清洁性能。图5B示出了Bsp Man4在奥妙洁彩洗衣粉中的清洁性能。

图6A示出了多种形式的Bsp Man4在Small&Mighty液体洗涤剂中在存在蛋白酶和淀粉酶的情况下的清洁性能。图6B示出了多种形式的BspMan4在奥妙洁彩洗衣粉中在存在蛋白酶和淀粉酶的情况下的清洁性能。

图7A-C提供了成熟形式的Bsp Man4的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)与其他微生物甘露聚糖酶序列(SEQ ID NOS:15-24)的比对。表7-1按NCBI和SEQ ID NO列出了同源甘露聚糖酶。

图8提供了Bsp Man4的系统树。

图9示出了Bsp Man4的预测功能结构域。Bsp Man4的催化结构域(SEQ ID NO:9)对应于SEQ ID NO:8的残基11-306。对两个预测的催化谷氨酸(E)残基进行了标记。还示出了Bsp Man4的两个预测糖类结合模块。

图10提供了Bsp Man4和Bsp Man4C端截短物的蛋白结构域的图解。

图11A-D提供了pLL007(aprE-Bsp Man41-350)、pLL008(aprE-BspMan41-475)、pLL009(aprE-Bsp Man41-675)和pLL010(aprE-Bsp Man41-850)的质粒图谱。

图12示出了Bsp Man4v2的pH值曲线图。

图13示出了Bsp Man4v2的温度曲线图。

图14示出了Bsp Man4和Bsp Man4v2的热稳定性。

具体实施方式

I.简介

本发明描述了涉及从芽孢杆菌SWT81克隆的内切-β-甘露聚糖酶4(Bsp Man4)的组合物和方法。该组合物和方法部分基于重组Bsp Man4在存在洗涤剂组合物的情况下具有糖基水解酶活性的这一观察结果。Bsp Man4的这一特征使其特别适用于多种清洁应用，在这些应用中所述酶可在存在于洗涤剂组合物中的表面活性剂和其他组分的存在下水解甘露聚糖。

II.定义

在详细描述本发明组合物和方法之前，为清楚起见定义了以下术语。未定义的术语和缩写应符合其本领域所使用的通常含义：

如本文所用，“甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶”、“内切-1,4-β-甘露聚糖酶”、“内切-β-1,4-甘露聚糖酶”、“β-甘露聚糖酶B”、“β-1,4-甘露聚糖4-甘露水解酶”、“内切-β-甘露聚糖酶”、“β-D-甘露聚糖酶”、“1,4-β-D-甘露聚糖甘露水解酶”或“内切-β-甘露聚糖酶”(EC3.2.1.78)是指能够水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中的1,4-β-D-甘露糖苷键的酶。内切-1,4-β-甘露聚糖酶是若干糖基水解酶家族（包括GH26和GH5）的成员。具体地讲，内切-β-甘露聚糖酶构成一组可降解甘露聚糖的多糖酶，并表示能够裂解含有甘露糖单元的多糖链（即，能够裂解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖中的糖苷键）的酶。本发明的“内切-β-甘露聚糖酶”可具有另外的酶活性（例如内切-1,4-β-葡聚糖酶、1,4-β-甘露糖苷酶、纤维糊精酶活性等）。

如本文所用，“甘露聚糖酶”、“甘露糖苷酶”、“甘露聚糖水解酶”、“甘露聚糖酶多肽”或“甘露聚糖酶蛋白”是指表现出甘露聚糖降解能力的酶、多肽或蛋白质。甘露聚糖酶可例如为内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶或糖基水解酶。如本文所用，甘露聚糖酶活性可根据本领域已知的任何程序加以测定（参见例如Lever,Anal.Biochem（《分析生物化学》），47:248,1972；美国专利No.6,602,842；以及国际公布No.WO95/35362A1）。

如本文所用，“甘露聚糖”是具有由β-1,4-连接的甘露糖构成的主链的多糖；“葡甘露聚糖”是具有或多或少规律性交替的β-1,4连接的甘露糖和葡萄糖的主链的多糖；“半乳甘露聚糖”和“半乳葡甘露聚糖”是具有α-1,6连接的半乳糖侧面分支的甘露聚糖和葡甘露聚糖。这些化合物可以乙酰化。半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的降解通过完全或部分移除半乳糖侧枝而促进。另外，乙酰化甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的降解通过完全或部分脱乙酰化而促进。乙酰基可通过碱或通过甘露聚糖乙酰酯酶而移除。从甘露聚糖酶或通过甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶和/或甘露聚糖乙酰酯酶的组合释放的低聚物可通过β-甘露糖苷酶和/或β-葡糖苷酶进一步降解而释放游离的麦芽糖。

如本文所用，“催化活性”或“活性”定量描述给定底物在限定反应条件下的转化率。术语“残余活性”定义为酶在某一组条件下的催化活性与在一组不同条件下的催化活性的比率。术语“比活性”定量描述在限定反应条件下单位量的酶的催化活性。

如本文所用，“pH稳定性”描述蛋白经受pH值明显偏离于其稳定性最佳时的pH的有限暴露的性能（例如，高于或低于最佳pH不止一个pH单位，而不会在其活性可测的条件下丧失其活性）。

如本文所用，短语“洗涤剂稳定性”是指洗涤剂组合物混合物中指定洗涤剂组合物组分（如水解酶）的稳定性。

如本文所用，“过水解酶”是能够催化会导致形成适于诸如清洁、漂白和消毒的应用的过酸的反应的酶。

如本文所用，在短语“水性组合物”和“水性环境”中使用的术语“水性”是指由至少50%的水构成的组合物。水性组合物可含有至少50%的水、至少60%的水、至少70%的水、至少80%的水、至少90%的水、至少95%的水、至少97%的水、至少99%的水或甚至至少99%的水。

如本文所用，术语“表面活性剂”是指本领域通常认识到的具有表面活性性质的任何化合物。表面活性剂一般包括阴离子型、阳离子型、非离子型和两性离子型化合物，本文中将进一步进行描述。

如本文所用，“表面性质”用于指静电荷，以及蛋白质表面所展现的诸如疏水性和亲水性之类的性质。

术语“氧化稳定性”是指本发明的内切-β-甘露聚糖酶在本文所公开的甘露糖苷水解、清洁或其他处理期间（例如当暴露于漂白剂或氧化剂或者与漂白剂或氧化剂接触时）常见的条件下，在给定时间段内保留规定量的酶活性。在一些实施例中，内切-β-甘露聚糖酶在与漂白剂或氧化剂接触给定时间段（例如至少约1分钟、约3分钟、约5分钟、约8分钟、约12分钟、约16分钟、约20分钟等）后保留至少约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约92%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的内切-β-甘露聚糖酶活性。

术语“螯合剂稳定性”是指本发明的内切-β-甘露聚糖酶在本文所公开的甘露糖苷水解、清洁或其他处理期间（例如当暴露于螯合剂或者与螯合剂接触时）的常见条件下，在给定时间段内保留规定量的酶活性。在一些实施例中，内切-β-甘露聚糖酶在与螯合剂接触给定时间段（例如至少约10分钟、约20分钟、约40分钟、约60分钟、约100分钟等）后保留至少约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约92%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的内切-β-甘露聚糖酶活性。

术语“热稳定性”和“热稳定的”是指本发明的内切-β-甘露聚糖酶在本文所公开的甘露糖苷水解、清洁或其他处理期间（例如当暴露于改变的温度时）常见的条件下暴露于确定的温度给定时间段后保留规定量的酶活性。变化的温度包括增加或降低的温度。在一些实施例中，内切-β-甘露聚糖酶在暴露于改变的温度给定的时间段（例如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等）后保留至少约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约92%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的内切-β-甘露聚糖酶活性。

术语“清洁活性”是指在本文所公开的甘露糖苷水解、清洁或其他处理期间的常见条件下由内切-β-甘露聚糖酶实现的清洁性能。在一些实施例中，清洁性能通过应用涉及酶敏感性污渍（例如冰淇淋、蕃茄酱、烧烤酱、蛋黄酱、巧克力奶、爽身水、刺槐豆胶或瓜耳胶）的各种清洁测定法而测定，如在使污渍接受标准洗涤条件后通过各种色谱法、分光光度法或其他定量方法测定。示例性测定法包括但不限于WO 99/34011、美国专利No.6,605,458和美国专利No.6,566,114（它们均以引用方式并入本文）中所述的那些测定法，以及实例中包括的那些方法。

如本文所用，术语“清洁的表面”和“清洁的纺织物”分别指污渍去除百分比达受沾污表面或纺织物的至少10%优选至少15%、20%、25%、30%、35%或40%的表面或纺织物。

术语内切-β-甘露聚糖酶的“清洁有效量”是指特定清洁组合物中实现所需水平酶活性水平的前文所述内切-β-甘露聚糖酶的量。此类有效量可由本领域普通技术人员容易地确定并且基于多种因素，例如所用的特定内切-β-甘露聚糖酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成以及是需要液体组合物还是干燥（例如颗粒状、条状）组合物等等。

如本文所用，术语“清洁辅助材料”意指针对所需清洁组合物的特定类型和产品的形式（例如液体、颗粒、粉末、条、糊状物、喷雾、片剂、凝胶或泡沫组合物）选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料还优选与组合物中使用的内切-β-甘露聚糖酶相容。在一些实施例中，颗粒组合物为“紧凑(compact)”形式，而在其他实施例中，液体组合物为“浓缩”形式。

如本文所用，“清洁组合物”和“清洁制剂”是指可用于从待清洁物品例如织物、器皿、接触镜片、其他固体表面、毛发、皮肤、牙齿等除去不期望的化合物（例如污垢或污渍）的化学成分的混合物。所述组合物或制剂可视待清洁的表面、物品或织物以及组合物或制剂的所需形式而呈液体、凝胶、颗粒、粉末或喷雾形式。

如本文所用，术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂制剂”是指拟用于供清洁沾污物体的洗涤介质中的化学成分的混合物。洗涤剂组合物/制剂一般包含至少一种表面活性剂，并且可任选包含水解酶、氧化-还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、抗结块剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。

如本文所用，“衣物洗涤组合物”或“衣物洗涤剂”是指用于清洁纺织物的所有形式的组合物，其包括但不限于颗粒和液体形式。在一些实施例中，衣物洗涤组合物是可用于电动洗衣机的组合物。无意于使本发明局限于任何特定类型或衣物洗涤组合物。实际上，本发明可用于清洁许多织物。

如本文所用，“餐具洗涤组合物”是指用于清洁餐具（包括刀叉餐具）的所有形式的组合物，其包括但不限于颗粒和液体形式。在一些实施例中，餐具洗涤组合物是可用于自动洗碗碟机中的“自动餐具洗涤”组合物。无意于使本发明局限于任何特定类型或餐具洗涤组合物。实际上，本发明可用于清洁任何材料（包括但不限于陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃、丙烯酸树脂等）的餐具（例如器皿，其包括但不限于盘子、杯子、玻璃杯、碗等）和刀具（例如刀叉餐具，其包括但不限于匙、刀、叉、服务用具等）。术语“餐具”在本文指器皿和刀具二者。

如本文所用，术语“漂白”是指在适宜的pH和温度条件下处理材料（例如织物、衣物、浆料等）或表面足够长的时间以实现材料变亮（即，变白）和/或清洁。适于漂白的化学品的例子包括但不限于ClO₂、H₂O₂、过酸、NO₂等。

如本文所用，变体内切-β-甘露聚糖酶的“洗涤性能”是指变体内切-β-甘露聚糖酶对洗涤的贡献，这种贡献在不向组合物添加变体内切-β-甘露聚糖酶的情况下向洗涤剂提供另外的清洁性能。洗涤性能是在相关的洗涤条件下进行比较。

术语“相关的洗涤条件”在本文中用于指在家居中实际用于器皿或衣物洗涤剂市场部分中的条件，尤其是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。

如本文所用，术语“消毒”是指从表面除去污染物，以及抑制或杀死物品表面上的微生物。无意于本发明局限于任何特定的表面、物品或待去除的污染物或微生物。

本文的清洁组合物的“紧凑”形式最佳由密度反映，就组成来说，由无机填料盐的量反映。无机填料盐是呈粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐是大量存在，通常占总组合物的约17重量%至约35重量%。相比之下，在紧凑型组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15%的量存在。在一些实施例中，填料盐以不超过所述组合物的约10重量%，或更优选不超过约5重量%的量存在。在一些实施例中，无机填料盐选自碱金属和碱土金属硫酸盐和氯化物。在一些实施例中，优选填料盐为硫酸钠。

如本文所用，术语“纺织物”或“纺织材料”是指织造织物，以及适于转变成或用作纱线、机织材料、针织材料和非织造物的人造短纤维和细丝。该术语涵盖由天然以及合成（例如制造的）纤维制成的纱线。

如本文所用，术语“纯化的”和“分离的”是指对象分子例如BspMan4与其天然来源（例如芽孢杆菌物种）或其他分子例如蛋白质、核酸、脂质、培养基组分等物理分开。一旦纯化或分离，对象分子可占样品中材料总量的至少50%，且甚至至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更高（重量比）。

如本文所用，“多肽”是指包含多个通过肽键连接的氨基酸的分子。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用。蛋白质可任选经过修饰（例如糖基化、磷酸化、酰化、法尼基化、异戊烯化、磺酸化、聚乙二醇化等）以增加功能性。在此类氨基酸序列表现出活性的情况下，它们可被称为“酶”。使用常规的氨基酸残基的单字母或三字母代码，其中氨基酸序列以标准的氨基端至羧基端取向（即，N→C）提供。

术语“多核苷酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能编码多肽的合成分子。核酸可为单链或双链的，并且可以具有化学修饰。术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用。由于遗传密码具有简并性，故可以使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，否则核酸序列是以5′至3′取向提供。

如本文所用，术语“野生型”和“天然的”是指自然界中存在的多肽或多核苷酸。

关于多肽的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包括人为制造的核苷改变的天然存在的多核苷酸。然而，应注意，编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而涵盖编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的任何多核苷酸。

如本文所用，“变体多肽”是指通常利用重组DNA技术，通过一个或多个氨基酸的置换、添加或缺失而源于亲本（或参考）多肽的多肽。变体多肽与亲本多肽可能有少数氨基酸残基不同，并且可通过其与亲本多肽一级氨基酸序列的同源性/同一性水平来限定。优选地，变体多肽与亲本多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的氨基酸序列同一性。

序列同一性可使用诸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL之类的已知程序，使用标准参数测定。（参见例如Altschul等人[1990]J.Mol.Biol.（《分子生物学杂志）215:403-410；Henikoff等人[1989]Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）89:10915；Karin等人[1993]Proc.Natl.Acad.Sci USA（《美国国家科学院院刊》）90:5873；以及Higgins等人[1988]Gene（《基因》）73:237-244）。进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。另外，可使用FASTA对数据库进行搜索（Pearson等人[1988]Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）85:2444-2448）。两条多肽实质上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，因保守氨基酸置换而不同的多肽是免疫交叉反应性的。因此，例如，若两个多肽仅相差保守置换，则一种多肽与第二多肽实质上相同。

如本文所用，“变体多核苷酸”编码变体多肽；与亲本多核苷酸具有指定程度的同源性/同一性；或在严格条件下与亲本多核苷酸或其互补序列杂交。优选地，变体多核苷酸与亲本多核苷酸具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的核苷酸序列同一性。测定同一性百分比的方法是本领域已知的并且上文刚进行描述。

术语“源自”涵盖术语“来源于”、“从...获得”、“可由...获得”、“分离自”和“由...产生”，并且通常是指一种指定材料来源于另一指定材料或者具有可参照另一指定材料描述的特征。

如本文所用，术语“杂交”是指用于使一条核酸链通过本领域已知的碱基配对与互补链接合的方法。

如本文所用，短语“杂交条件”是指进行杂交反应的条件。这些条件通常根据测量杂交的条件的“严格性”程度来分类。严格性程度可例如基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最严格”通常发生在约Tm-5℃（比探针Tm低5℃）；“高严格”发生在比Tm低约5-10℃；“中等严格”发生在比探针Tm低约10-20℃；而“低严格”发生在比探针Tm低约20-25℃。作为另一种选择，或除此之外，杂交条件可基于杂交和/或一次或多次严格性洗涤的盐或离子强度条件，例如：6X SSC=极低严格性；3X SSC=低至中等严格性；1X SSC=中等严格性；且0.5X SSC=高严格性。在功能上，最严格条件可用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近严格同一性的核酸序列；而高严格条件用于鉴定与探针具有约80%或更高序列同一性的核酸序列。对于需要高选择性的应用，通常需要使用相对严格的条件来形成杂交物（例如，使用相对较低的盐和/或高温条件）。如本文所用，严格条件定义为50℃和0.2X SSC（1X SSC=0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0）。

在关于至少两条核酸或多肽的上下文中，短语“实质上相似”和“实质上相同”意指，多核苷酸或多肽包含与亲本或参考序列具有至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或甚至至少约99%的同一性，或者不包括在不增加功能性的情况下仅为避开本描述所作的氨基酸置换、插入、缺失或修饰的序列。

如本文所用，“表达载体”是指DNA构建体，其含有编码指定多肽且有效连接至能够实现该多肽在合适的宿主中表达的合适控制序列的DNA序列。这种控制序列包括实现转录的启动子、控制这种转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是潜在基因组插入物。一旦转化进适合宿主中，载体就可独立于宿主基因组复制和发挥作用，或者在一些情况下可整合进基因组本身中。

术语“重组”是指例如通过使编码序列突变以产生改变的多肽、将编码序列与另一基因的编码序列融合、使基因处于不同启动子控制下、在异源生物体中表达基因、以降低或升高的水平表达基因、以不同于基因的天然表达谱的方式有条件地或组成地表达基因等，对遗传物质（即，核酸、核酸编码的多肽以及包含这些多核苷酸的载体和细胞）进行修饰以改变其序列或表达特征。一般说来，重组核酸、多肽和基于它们的细胞已通过人进行操纵使得其与自然界中存在的相关核酸、多肽和细胞不相同。

“信号序列”是指结合至多肽的N端部分，并且促进成熟形式的蛋白质从细胞分泌的氨基酸序列。细胞外蛋白质的成熟形式没有信号序列，其在分泌过程期间被切除。

术语“选择标记”或“可选择标记”是指能够在宿主细胞中表达使得易于选择含有所引入的核酸或载体的宿主的基因。可选标记的例子包括但不限于抗微生物物质（例如潮霉素、博来霉素或氯霉素）和/或赋予宿主细胞代谢益处（如营养益处）的基因。

如本文所用，术语“调控元件”是指控制核酸序列表达的某一方面的遗传元件。例如，启动子是促进有效连接的编码区的转录起始的调控元件。另外的调控元件包括剪接信号、聚腺苷酸化信号和终止信号。

如本文所用，“宿主细胞”一般为以使用本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染的原核或真核宿主。转化的宿主细胞能够复制编码蛋白质变体的载体或者表达所需的蛋白质变体。在载体编码蛋白质变体的前蛋白或原蛋白形式的情况下，这些变体在表达时通常由宿主细胞分泌到宿主细胞培养基中。

在将核酸序列插入细胞的语境中，术语“引入”意指转化、转导或转染。转化的手段包括本领域已知的原生质体转化法、氯化钙沉淀法、电穿孔法、裸DNA法等。（参见Chang和Cohen[1979]Mol.Gen.Genet.（《分子遗传学与普通遗传学》）168:111-115；Smith等人[1986]Appl.Env.Microbiol.（《应用环境微生物学》）51:634；以及Ferrari等人的综述论文，载于：Harwood,Bacillus（《芽孢杆菌》），普莱南出版公司(Plenum Publishing Corporation)，第57-72页，1989）。

如本文所用，术语“可选标记”或“可选基因产物”是指编码酶活性的基因的使用，该酶活性给表达该选择性标记的细胞赋予抗生素或药物抗性。

其他科技术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同（参见例如Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology（《微生物学与分子生物学词典》），第2版，纽约约翰威立出版公司(John Wiley and Sons,NY)1994；以及Hale和Marham，TheHarper Collins Dictionary of Biology（《哈普柯林斯生物学词典》），纽约哈珀永久出版社(Harper Perennial,NY)1991）。

除非文中另外明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。

如本文结合数值所用，术语“约”是指数值的-10%至+10%范围。例如，短语“约6的pH值”是指5.4至6.6的pH值。

提供的小标题是出于便利的目的，不应解释为限制。在一个小标题下包括的描述可适用于本说明书整体。

III.Bsp Man4多肽、多核苷酸、载体和宿主细胞

A.Bsp Man4多肽

在一个方面，本发明的组合物和方法提供重组Bsp Man4内切-β-甘露聚糖酶多肽、其片段或其变体。示例性的Bsp Man4多肽通过得自芽孢杆菌的多核苷酸重组表达。成熟的Bsp Man4多肽具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。类似地，实质上相同的Bsp Man4多肽可存在于自然界中，例如存在于芽孢杆菌的其他菌株或分离株中。本发明的组合物和方法涵盖这些和其他Bsp Man4多肽。本发明的Bsp Man4多肽包括保留甘露聚糖酶活性的Bsp Man4的截短形式，包括C-端截短物。这些多肽包括如实例中所述并如SEQ ID NO:6-14和30-49所示的那些多肽。

在一些实施例中，分离的Bsp Man4多肽是与示例性Bsp Man4多肽具有指定程度的氨基酸序列同一性的变体Bsp Man4多肽，例如与SEQ IDNO:8的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。序列同一性可例如使用诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序（如本文中所述）通过氨基酸序列比对来测定。

在一些实施例中，分离的Bsp Man4多肽是与示例性Bsp Man4多肽具有指定程度的氨基酸序列同一性的变体Bsp Man4多肽，例如与SEQ IDNO:6-14或30-49任一者的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。序列同一性可例如使用诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序（如本文中所述）通过氨基酸序列比对来测定。

在某些实施例中，Bsp Man4多肽通过重组方式产生，而在其他实施例中，Bsp Man4多肽通过合成方式产生，或从天然来源（芽孢杆菌物种）中纯化而得。

在某些其他实施例中，分离的Bsp Man4多肽包含不会实质上影响多肽的结构和/或功能的置换。示例性的置换是保守突变，如表I中所概述的。

表I.氨基酸置换

涉及天然存在的氨基酸的置换一般是通过使编码重组Bsp Man4多肽的核酸突变，然后在生物体中表达变体多肽来进行。涉及非天然存在的氨基酸的置换或氨基酸的化学修饰一般是在由生物体合成重组Bsp Man4多肽后通过以化学方式对所述多肽进行修饰来实现。

在一些实施例中，分离的变体Bsp Man4多肽与SEQ ID NO:8实质上相同，这意指其不包含不会显著影响多肽的结构、功能或表达的氨基酸置换、插入或缺失。此类分离的变体Bsp Man4多肽包括仅设计用于避开本描述的多肽。

在一些实施例中，分离的Bsp Man4多肽（包括其变体）具有1,4-β-D-甘露糖苷水解酶活性，其包括甘露聚糖酶、内切-1,4-β-D-甘露聚糖酶、外切-1,4-β-D-甘露聚糖酶半乳甘露聚糖酶和/或葡甘聚糖酶活性。1,4-β-D-甘露糖苷水解酶活性可使用本文所述的测定法或通过本领域已知的其他测定法来测定和测量。在一些实施例中，分离的Bsp Man4多肽在存在洗涤剂组合物的情况下具有活性。

Bsp Man4多肽包括“全长”Bsp Man4多肽保留1,4-β-D-甘露糖苷水解酶活性的片段。这些片段优选保留全长多肽的活性位点，但可具有非关键性氨基酸残基的缺失。这些片段的活性可使用本文所述的测定法或通过本领域已知的其他测定法容易地测定。在一些实施例中，Bsp Man4多肽的片段在存在洗涤剂组合物的情况下保留1,4-β-D-甘露糖苷水解酶活性。在一些实施例中，Bsp Man4多肽包含Bsp Man4(SEQ ID NO:9)的催化结构域，或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的催化结构域。

在一些实施例中，Bsp Man4氨基酸序列和衍生物作为N和/或C端融合蛋白而产生，例如以有助于提取、检测和/或纯化和/或向Bsp Man4多肽增加功能性质。融合蛋白伴侣的例子包括但不限于谷胱甘肽S-转移酶(GST)、6XHis、GAL4（DNA结合和/或转录激活结构域）、FLAG、MYC、BCE103(WO 2010/044786)或本领域技术人员熟知的其他标签。在一些实施例中，在融合蛋白伴侣与所关注的蛋白质序列之间提供蛋白水解裂解位点，以允许移除融合蛋白序列。优选地，融合蛋白不阻碍分离的Bsp Man4多肽的活性。

在一些实施例中，将分离的Bsp Man4多肽融合至功能结构域，其包括前导肽、前肽、一个或多个结合结构域（模块）和/或催化结构域。合适的结合结构域包括但不限于各种特异性的糖类结合模块（例如CBM），从而在应用分离的Bsp Man4多肽的过程中向存在的碳水化合物组分提供增强的亲和力。如本文所述，Bsp Man4多肽的CBM和催化结构域有效连接。

糖类结合模块(CBM)被定义为碳水化合物活性酶内的连续氨基酸序列，其含有具有碳水化合物结合活性的分立折叠(discreet fold)。几个例外是纤维小体支架蛋白(cellulosomal scaffoldin protein)中的CBM以及极少数的独立推定CBM(independent putative CBM)。CBM需要作为模块存在于较大的酶内使这类碳水化合物结合蛋白与其他非催化性糖结合蛋白如凝集素和糖转运蛋白区分开来。CBM之前根据最初发现若干结合纤维素的模块而被分类为纤维素结合结构域(CBD)（Tomme等人Eur J Biochem（《欧洲生物化学杂志》），170:575-581,1988；以及Gilkes等人，J Biol Chem（《生物化学杂志》）263:10401-10407,1988）。然而，碳水化合物活性酶中结合碳水化合物而非纤维素但满足CBM标准的另外模块被持续发现，因此需要使用更加包容性的术语将这些多肽重新分类。之前对纤维素结合结构域的分类基于氨基酸相似性。CBD的分组称为“型”并用罗马数字进行编号（例如I型CBD或II型CBD）。为了与糖苷水解酶分类一致，现在将这些分组称为家族并用阿拉伯数字进行编号。家族1至13与I至XIII型相同（Tomme等人，载于Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides（《不溶性多糖的酶降解》）(Saddler,J.N.和Penner,M.编辑），Cellulose-binding domains:classification and properties（纤维素结合结构域：分类和性质）.第142-163页，华盛顿美国化学学会(AmericanChemical Society,Washington),1995）。对CBM的结构和结合模式的详细综述可见于（Boraston等人，Biochem J,（《生物化学杂志》）382:769-81,2004）。预计CBM的家族分类：有助于鉴别CBM，在一些情况下预测结合特异性，有助于鉴别功能残基，揭示进化关系并可能可预测多肽折叠。由于蛋白质的折叠比它们的序列更保守，因此可将一些CBM家族分成超家族或部族(clan)。当前的CBM家族为1-63。CBM/CBD还作为非水解型多糖结合蛋白存在于藻类，例如红藻紫红紫菜(Porphyra purpurea)中。然而，大多数CBD来自纤维素酶和木聚糖酶。CBD存在于蛋白的N端和C端或在内部。酶杂合体是本领域已知的（参见例如WO 90/00609和WO95/16782）并可通过以下方法制备：将包含连接（通过或不通过接头）到编码所公开的Bsp Man4多肽的DNA序列的编码纤维素结合结构域的DNA片段的DNA构建体转化进宿主细胞，然后使宿主细胞生长以表达融合基因。酶杂合体可由下式表示：

CBM-MR-X或X-MR-CBM

在上式中，CBM是与至少糖类结合模块相对应的氨基酸序列的N端或C端区域；MR是中间区域（接头），并且可以为键或优选约2至约100个碳原子、更优选2至40个碳原子的短连接基；或优选为约2至约100个氨基酸，更优选2至40个氨基酸；而X为所公开的具有甘露聚糖酶催化活性的Bsp Man4多肽的N端或C端区域。此外，甘露聚糖酶可包含不止一个CBM或其他无糖分解功能的模块/结构域。术语“模块”和“结构域”在本发明中可互换使用。

合适的酶活性结构域具有支持分离的Bsp Man4多肽在产生所需产物中的作用的活性。催化结构域的非限制性例子包括：纤维素酶、半纤维素酶（例如木聚糖酶）、外切-甘露聚糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖苷酶、果胶酶和/或其他活性如蛋白酶、脂肪酶、酸性磷酸酶和/或其他酶或其功能片段。融合蛋白任选通过接头序列连接至分离的Bsp Man4多肽，接头序列只是接合Bsp Man4多肽和融合结构域而不明显影响任一组分的性质，或者接头任选地针对预期应用具有功能重要性。

作为另外一种选择，将本文所述的分离Bsp Man4多肽与一种或多种所关注的另外的蛋白质结合使用。所关注的蛋白的非限制性例子包括：半纤维素酶、外切-β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、乳糖酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、纤维素酶、木糖苷酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖乙酰酯酶、半乳聚糖酶、外切-甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、果胶酯酶、聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、漆酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、蛋白酶、淀粉酶、磷酸酶、脂解酶、角质酶和/或其他酶。

在其他实施例中，分离的Bsp Man4多肽融合至引导分离的Bsp Man4多肽胞外分泌的信号肽。例如，在某些实施例中，信号肽为天然Bsp Man4信号肽。在其他实施例中，信号肽为非天然信号肽，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)AprE信号肽。在一些实施例中，分离的Bsp Man4多肽在成熟形式与信号肽之间具有Ala-Gly-Lys的N端延伸。

在一些实施例中，分离的Bsp Man4多肽在异源生物体中表达，即在非琼脂粘附芽孢杆菌(Bacillus agaradhaerens)的生物体中表达。示例性异源生物体为革兰氏阳性细菌，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、地芽孢杆菌(Geobacillus)（以前称为嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)）、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌(Escherichia coli.)；酵母，例如酵母属物种(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母属物种(Schizosaccharomyces spp.)，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；以及丝状真菌，例如曲霉属物种(Aspergillus spp.)，如米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillus niger)和里氏木霉(Trichoderma reesei)。将核酸转化进这些生物体中的方法是本领域熟知的。适用于转化曲霉菌宿主细胞的程序描述于EP 238 023中。

在特定的实施例中，分离的Bsp Man4多肽在异源生物体中作为分泌多肽表达，在此情形中，所述组合物和方法涵盖将Bsp Man4多肽在异源生物体中作为分泌多肽表达的方法。

B.Bsp Man4多核苷酸

所述组合物和方法的另一个方面是编码分离的Bsp Man4多肽（包括其变体和片段）的多核苷酸，所述多核苷酸在表达载体的背景中引导BspMan4多肽在异源生物体（例如本文中确定的那些）中的表达。编码BspMan4多肽的多核苷酸可以有效连接至调控元件（例如启动子、终止子、增强子等）以帮助表达编码的多肽。

编码Bsp Man4多肽的示例性多核苷酸序列具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列。类似地，包括实质上相同的编码Bsp Man4多肽和变体的多核苷酸可存在于自然界中，例如存在于芽孢杆菌的其他菌株或分离株中。鉴于遗传密码的简并性，应当理解具有不同核苷酸序列的多核苷酸可编码相同的Bsp Man4多肽、变体或片段。

在一些实施例中，编码Bsp Man4多肽的多核苷酸与编码Bsp Man4多肽的示例性多核苷酸具有指定程度的氨基酸序列同一性，例如与SEQ IDNO:8的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。在一些实施例中，多核苷酸编码包含Bsp Man4的催化结构域(SEQ ID NO:9)或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的催化结构域的Bsp Man4多肽。同源性可例如使用诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序（如本文中所述）通过氨基酸序列比对来测定。

在一些实施例中，编码Bsp Man4多肽的多核苷酸框内融合于用于引导Bsp Man4多肽的细胞外分泌的信号肽的编码序列之后（即下游）。异源信号序列包括来自细菌纤维素酶基因的信号序列。可在适于表达BspMan4多肽或适于在将表达载体引入合适宿主细胞之前使表达载体增殖的异源宿主细胞中提供表达载体。

在一些实施例中，编码Bsp Man4多肽的多核苷酸与SEQ ID NO:1的示例性多核苷酸（或其互补序列）在指定杂交条件下杂交。示例性的条件是严格条件和高严格条件，这些条件在本文中进行了描述。

Bsp Man4多核苷酸可为天然存在或合成的（即人造的），并且可经过密码子优化以在不同宿主中表达、经过突变以引入克隆位点或以其他方式改变以增加功能性。

C.Bsp Man4载体和宿主细胞

为了产生所公开的Bsp Man4多肽，编码该多肽的DNA可由已公布的序列通过化学方式合成或直接得自具有相应基因的宿主细胞（例如，通过cDNA文库筛选或PCR扩增）。在一些实施例中，将Bsp Man4多核苷酸包含在表达盒中和/或通过标准分子克隆技术克隆进合适的表达载体。此类表达盒或载体包含有助于转录起始和终止的序列（例如启动子和终止子），并且通常含有可选标记。

将表达盒或载体引入合适的表达宿主细胞，该宿主细胞然后表达相应的Bsp Man4多核苷酸。尤其合适的表达宿主为包括以下属的细菌表达宿主：埃希杆菌属(Escherichia)（例如大肠杆菌）、假单胞菌属(Pseudomonas)（例如荧光假单胞菌(P.fluorescens)或斯氏假单胞菌(P.stutzerei)）、变形杆菌属(Proteus)（例如奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)）、产碱杆菌属(Ralstonia)（例如真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)）、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)（例如肉葡萄球菌(S.carnosus)）、乳球菌属(Lactococcus)（例如乳酸乳球菌(L.lactis)）或芽孢杆菌属（枯草芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌等）。也尤其合适的是酵母表达宿主，例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。特别合适的是真菌表达宿主，例如黑曲霉、Chrysosporium lucknowense、曲霉菌（例如米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉(A.nidulans)等）或里氏木霉。还合适的是哺乳动物表达宿主，例如小鼠（例如NS0）、中国仓鼠卵巢(CHO)或幼仓鼠肾(BHK)细胞系。其他真核宿主例如昆虫细胞或病毒表达系统（例如细菌噬菌体，如M13、T7噬菌体或λ噬菌体，或病毒，如杆状病毒）也适用于产生Bsp Man4多肽。

在所关注的特定宿主中与分泌蛋白相关的启动子和/或信号序列是用于在该宿主或其他宿主中进行内切-β-甘露聚糖酶的异源产生和分泌的候选物。例如，在丝状真菌系统中，驱动纤维二糖水解酶I(cbh1)、葡糖淀粉酶A(glaA)、TAKA-淀粉酶(amyA)、木聚糖酶(exlA)、gpd-启动子cbh1、cbhll、内切葡聚糖酶基因EGI-EGV、Cel61B、Cel74A、egl1-egl5、gpd启动子、Pgk1、pki1、EF-1α、tef1、cDNA1和hex1的基因的启动子是尤其合适的并可来源于许多不同的生物体（例如黑曲霉、里氏木霉、米曲霉、泡盛曲霉(A.awamori)和构巢曲霉）。在一些实施例中，Bsp Man4多核苷酸与编码合适的同源或异源信号序列（导致Bsp Man4多肽分泌进细胞外（或周质）空间）的多核苷酸重组相关，从而允许直接在细胞上清液（或周质空间或裂解物）中检测酶活性。本领域已知的大肠杆菌、其他革兰氏阴性菌和其他生物体尤其合适的信号序列包括驱动HlyA、DsbA、Pbp、PhoA、PelB、OmpA、OmpT或M13噬菌体Gill基因表达的那些序列。对于本领域已知的枯草芽孢杆菌、革兰氏阳性生物体和其他生物体，尤其合适的信号序列还包括驱动AprE、NprB、Mpr、AmyA、AmyE、Blac、SacB表达的那些序列，并且对于酿酒酵母或其他酵母，包括杀伤毒素、Bar1、Suc2、交配因子α、Inu1A或Ggplp信号序列。信号序列可通过多种信号肽酶裂解，从而将它们从所表达的蛋白质的其余部分移除。在一些实施例中，Bsp Man4多肽的其余部分单独地或作为与位于N或C端的其他肽、标签或蛋白质（例如6XHis、HA或FLAG标签）的融合体而表达。合适的融合体包含有利于亲和纯化或检测的标签、肽或蛋白质（例如BCE103、6XHis、HA、几丁质结合蛋白、硫氧还蛋白或FLAG标签）以及有利于目标内切-β-甘露聚糖酶的表达、分泌或加工的那些。合适的加工位点包括肠激酶、STE13、Kex2或其他蛋白酶裂解位点以供在体内或体外裂解。

将Bsp Man4多核苷酸通过多种转化方法引入表达宿主细胞，这些方法包括但不限于电穿孔、脂质辅助转化或转染（“脂质转染”）、化学介导转染（例如CaCl和/或CaP）、醋酸锂介导转化（例如，宿主细胞原生质体的转化）、生物弹射“基因枪”转化、PEG介导的转化（例如，宿主细胞原生质体的转化）、原生质体融合（例如使用细菌或真核细胞原生质体）、脂质体介导的转化、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、腺病毒或其他病毒或噬菌体转化或转导。

作为另外一种选择，Bsp Man4多肽在细胞内表达。任选地，在酶变体在细胞内表达或利用诸如上述那些的信号序列分泌进周质空间后，可采用透化或裂解步骤使Bsp Man4多肽释放进上清液。膜屏障的破坏通过使用机械手段如超声波、加压处理（弗氏压碎器）、空化或使用膜消化酶如溶菌酶或酶混合物而实现。作为另外一种选择，编码Bsp Man4多肽的多核苷酸通过使用合适的无细胞表达系统而表达。在无细胞系统中，通常将所关注的多核苷酸在启动子帮助下转录，但任选进行连接以形成环状表达载体。在其他实施例中，以外源方式添加或生成RNA而不进行转录，然后在无细胞系统中翻译。

IV.Bsp Man4的活性

本文所公开的分离的Bsp Man4多肽可在宽泛的pH条件范围内具有酶活性。在某些实施例中，所公开的Bsp Man4多肽在约pH4.0至约pH11.5具有酶活性。在优选的实施例中，Bsp Man4多肽在约pH6.0至约pH8.5具有实质的酶活性。应该指出的是，本文所述的pH值可在±0.2内变动。例如，8.0的pH值可在pH7.8至pH8.2变动。

本文所公开的分离的Bsp Man4多肽可在宽泛的温度范围内（例如35℃或更低至约75℃）具有酶活性。在某些实施例中，Bsp Man4多肽在约55℃至约65℃的温度范围内具有实质的酶活性。应该指出的是，本文所述的温度值可在±0.2℃内变动。例如，50℃的温度可在49.8℃至50.2℃变动。

如实例5中所示，Bsp Man4多肽在存在蛋白酶的情况下具有针对刺槐豆胶和瓜耳胶的清洁性能。此外，Bsp Man4在存在粉末和液体洗涤剂的情况下显示出针对示例性胶沾污的材料的水解活性。因此，在某些实施例中，本文所述的分离的Bsp Man4多肽的任一者可水解包括但不限于刺槐豆胶、瓜耳胶以及它们的组合的甘露聚糖底物。

V.包含Bsp Man4多肽的洗涤剂组合物

本文所公开的组合物和方法的一个方面是包含分离的Bsp Man4多肽（包括其变体或片段）的洗涤剂组合物，以及将此类组合物用于清洁应用的方法。清洁应用包括但不限于衣物或纺织物清洁、衣物或纺织物软化、餐具洗涤（人工和自动餐具洗涤）、污渍预处理等。特定的应用是其中甘露聚糖（例如刺槐豆胶、瓜耳胶等）为待移除的污垢或污渍的组分的那些应用。洗涤剂组合物通常包含有效量的本文所述的Bsp Man4多肽的任一者，例如至少0.0001重量%、约0.0001至约1重量%、约0.001至约0.5重量%、约0.01至约0.1重量%或甚至约0.1至约1重量%或更高。洗涤剂组合物中有效量的Bsp Man4多肽导致Bsp Man4多肽具有足以水解含甘露聚糖的底物（例如刺槐豆胶、瓜耳胶或它们的组合）的酶活性。

另外，可将浓度为约0.4g/L至约2.2g/L、约0.4g/L至约2.0g/L、约0.4g/L至约1.7g/L、约0.4g/L至约1.5g/L、约0.4g/L至约1g/L、约0.4g/L至约0.8g/L或约0.4g/L至约0.5g/L的洗涤剂组合物与有效量的分离BspMan4多肽混合。洗涤剂组合物也可以约0.4ml/L至约2.6ml/L、约0.4ml/L至约2.0ml/L、约0.4ml/L至约1.5ml/L、约0.4ml/L至约1ml/L、约0.4ml/L至约0.8ml/L或约0.4ml/L至约0.5ml/L的浓度存在。

除非另作说明，否则本文提供的所有组分或组合物水平都是指所述组分或组合物的活性水平，而且市售来源中可能存在的杂质（例如残余溶剂或副产物）不排除在外。酶组分重量是基于总活性蛋白质。除非另作说明，否则所有百分比和比率都以重量计算。除非另作说明，否则所有百分比和比率都是基于总组合物计算。在示例性的洗涤剂组合物中，酶含量是以纯酶占总组合物的重量比表示，并且除非另作规定，否则洗涤剂成分是以占总组合物的重量比表示。

在一些实施例中，洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，这些表面活性剂可以是非离子型、半极性型、阴离子型、阳离子型、两性离子型或它们的组合和混合物。表面活性剂通常以约0.1重量%至60重量%的量存在。示例性的表面活性剂包括但不限于：十二烷基苯磺酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠、C14-15链烷醇聚醚-4、月桂醇聚醚硫酸钠（例如Steol CS-370）、氢化椰油酸钠、C12乙氧基化物（Alfonic1012-6、Hetoxol LA7、Hetoxol LA4）、烷基苯磺酸钠（例如Nacconol90G）以及它们的组合和混合物。

可用于本文所述的洗涤剂组合物的阴离子型表面活性剂包括但不限于：直链烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS）、烷基硫酸盐（脂肪醇硫酸盐）(AS)、醇乙氧基硫酸盐（AEOS或AES）、仲烷基磺酸盐(SAS)、α-磺基脂肪酸甲基酯、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸，或皂。其也可含有0-40%的非离子型表面活性剂，如醇乙氧基化物（AEO或AE）、羧化醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺（例如，如WO 92/06154中所述）以及它们的组合和混合物。

可用于本文所述的洗涤剂组合物的非离子型表面活性剂包括但不限于：脂肪酸的聚氧乙烯酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯（例如TWEEN）、聚氧乙烯醇、聚氧乙烯异醇、聚氧乙烯醚（例如TRITON和BRIJ）、聚氧乙烯酯、聚氧乙烯-对叔辛基酚或辛基苯基-氧化乙烯缩合物（例如NONIDET P40）、氧化乙烯与脂肪醇的缩合物（例如LUBROL）、聚氧乙烯壬基酚、聚烷二醇(SYNPERONIC F108)、糖基表面活性剂（例如吡喃葡糖苷、硫代吡喃葡糖苷）以及它们的组合和混合物。

本文所公开的洗涤剂组合物可具有混合物，所述混合物包括但不限于：5%至15%阴离子型表面活性剂、<5%的非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、膦酸盐、皂、酶、香料、甲基丙酸丁基苯酯、香叶醇、沸石、聚羧酸(盐)、己基肉桂醛、柠檬烯、阳离子型表面活性剂、香茅醇和苯并异噻唑啉酮。

洗涤剂组合物可另外包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂体系、络合剂、聚合物、漂白体系、稳定剂、发泡剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、水溶助长剂(hydrotope)、晦暗抑制剂、荧光增白剂、织物调理剂和香料。洗涤剂组合物还可包含酶，其包括但不限于蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、果胶降解酶、木葡聚糖酶或另外的羧酸酯水解酶。洗涤剂组合物的pH应为中性到碱性，如本文中所述。

在掺入至少一种助洗剂的一些实施例中，以清洁组合物的重量计洗涤剂组合物包含至少约1%、约3%至约60%或甚至约5%至约40%的助洗剂。助洗剂可包括但不限于：聚磷酸的碱金属盐、铵盐和链烷醇铵盐；碱金属硅酸盐；碱土金属和碱金属碳酸盐；铝硅酸盐；聚羧酸盐化合物；醚羟基聚羧酸盐；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物；1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸；和羧甲基氧基琥珀酸；聚乙酸（如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸）的多种碱金属盐、铵盐和取代的铵盐；以及聚羧酸(盐)，如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧基二琥珀酸、聚马来酸、苯1,3,5-三甲酸、羧甲基氧基琥珀酸以及它们的可溶性盐。实际上，可设想任何合适的助洗剂都可用于本发明多个实施例中。

在一些实施例中，助洗剂形成水溶性硬度离子络合物（例如螯合助洗剂），如柠檬酸盐和聚磷酸盐（例如三聚磷酸钠和六水合三聚磷酸钠、三聚磷酸钾以及三聚磷酸钠与三聚磷酸钾的混合物等）。可设想任何合适的助洗剂都可用于本发明中，包括本领域已知的那些助洗剂（参见例如EP 2100 949）。

如本文所指出的那样，在一些实施例中，本文所述的清洁组合物还包含辅助材料，其包括但不限于：表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定体系、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒(color speckle)、银护理剂(silvercare)、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂（参见例如美国专利No.6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，它们均以引用方式并入本文）。特定清洁组合物材料的实施例在下文中举例说明。在清洁辅助材料与清洁组合物中的Bsp Man4变体不相容的实施例中，则使用保持清洁辅助材料与内切-β-甘露聚糖酶分离（即，不彼此接触）直到两种组分的组合适宜时的合适方法。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法（例如软胶囊法、包封法、片剂法、物理分离法等）。

有利地，将本文所述的清洁组合物用于例如洗衣应用、硬质表面清洁、餐具洗涤应用，以及化妆品应用，如假牙、牙齿、毛发和皮肤。此外，归因于在较低温度溶液中效果增强的独特优势，使得本文所述的BspMan4酶理想地适合于衣物和织物软化应用。另外，Bsp Man4酶可用于颗粒和液体组合物中。

本文所述的分离的Bsp Man4多肽也可用于清洁添加剂产品。在一些实施例中，可使用低温溶液清洁应用。在一些实施例中，本发明提供清洁添加剂产品，其包含至少一种所公开的Bsp Man4多肽，当需要额外漂白效果时，所述清洁添加剂产品理想地适于包括在洗涤过程中。此类情形包括但不限于低温溶液清洁应用。在一些实施例中，添加剂产品为其最简单的形式，即一种或多种内切-β-甘露聚糖酶。在一些实施例中，添加剂被包装成用于添加到清洁过程中的剂型。在一些实施例中，添加剂被包装成用于添加到采用过氧源并且增加的漂白效果是所需的清洁过程中的剂型。任何合适的单一的剂量单位形式都可用于本发明，其包括但不限于：丸剂、片剂、软胶囊剂，或其他单一剂量单位如预先测量的粉末或液体。在一些实施例中，其包括填料或载体材料以增加所述组合物的体积。合适的填料或载体材料包括但不限于各种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐，以及滑石、粘土等。适于液体组合物的填料或载体材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二醇。此类醇的例子包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施例中，组合物含有约5%至约90%的这类材料。酸性填料可用于降低pH。或者，在一些实施例中，清洁添加剂包含辅助成分，下文将予以更完整地描述。

本发明的清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的单独的或与其他内切-β-甘露聚糖酶和/或另外的酶组合的本文所述Bsp Man4多肽中的至少一者。在某些实施例中，另外的酶包括但不限于选自以下的至少一种酶：蛋白酶、过氧化物酶、纤维素酶（内切葡聚糖酶）、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、酰基转移酶、磷脂酶、酯酶、漆酶、过氧化氢酶、芳基酯酶、淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、卡拉胶酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、阿拉伯糖酶、透明质酸酶、软骨素酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、其他内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶以及它们的混合物。

酶的所需含量通过添加一种或多种所公开的Bsp Man4多肽来实现。通常，本发明清洁组合物将包含至少约0.0001重量%、约0.0001至约10重量%、约0.001至约1重量%或甚至约0.01至约0.1重量%的所公开的Bsp Man4多肽中的至少一者。

通常配制本文的清洁组合物使得在水性清洁操作中使用期间洗涤水的pH将为约3.0至约11.0。液体产品制剂通常配制成净pH为约5.0至约9.0。颗粒洗衣用产品通常配制成pH为约8.0至约11.0。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且这些技术是本领域技术人员熟知的。

合适的低pH清洁组合物的净pH通常为约3.0至约5.0，或甚至3.5至4.5。低pH清洁组合物通常不含在这样的pH环境中水解的表面活性剂。此类表面活性剂包括包含至少一个氧化乙烯部分或甚至约1至约16摩尔的氧化乙烯的烷基硫酸钠表面活性剂。此类清洁组合物通常包含足量的pH调节剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，用以使此类清洁组合物的净pH为约3.0至约5.0。此类组合物通常包含至少一种酸稳定性酶。在一些实施例中，所述组合物为液体，而在其他实施例中，其为固体。这类液体组合物的pH通常是以净pH度量。这类固体组合物的pH是以所述组合物的10%固形物溶液测量，其中溶剂是蒸馏水。在这些实施例中，除非另外指明，否则所有pH测量值都是在20℃下取得。

合适的高pH清洁组合物的净pH通常为约9.0至约11.0，或甚至9.5至10.5。此类清洁组合物通常包含足量的pH调节剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，用以使此类清洁组合物的净pH为约9.0至约11.0。此类组合物通常包含至少一种碱稳定性酶。在一些实施例中，所述组合物为液体，而在其他实施例中，其为固体。这类液体组合物的pH通常是以净pH度量。这类固体组合物的pH是以所述组合物的10%固形物溶液度量，其中溶剂是蒸馏水。在这些实施例中，除非另外指明，否则所有pH测量值都是在20℃下取得。

在一些实施例中，当将Bsp Man4多肽用于颗粒组合物或液体中时，Bsp Man4多肽宜呈封装的粒子形式以保护Bsp Man4多肽在储存期间免受颗粒组合物中其他组分的影响。此外，封装还是控制Bsp Man4多肽在清洁过程中的可用性的手段。在一些实施例中，封装可增强Bsp Man4多肽和/或另外的酶的性能。就这一点而言，将本发明的Bsp Man4多肽用本领域已知的任何合适的封装材料封装。在一些实施例中，封装材料通常封装本文所述的Bsp Man4多肽的催化剂的至少一部分。通常，封装材料具有水溶性和/或水分散性。在一些实施例中，封装材料的玻璃化转变温度(Tg)为0℃或更高。玻璃转变温度在PCT申请WO 97/11151中进行了更详细的描述。封装材料通常选自如下：碳水化合物、天然的或合成的树胶、几丁质、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡以及它们的组合。当封装材料是碳水化合物时，其通常选自单糖、寡糖、多糖以及它们的组合。在一些典型实施例中，封装材料为淀粉（参见例如EP 0 922 499、U.S.4,977,252、U.S.5,354,559和U.S.5,935,826）。在一些实施例中，封装材料是由塑料如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈以及它们的混合物制成的微球；适用的市售微球包括但不限于以（瑞典的Stockviksverken）和PM6545、PM6550、PM7220、PM7228、

和

（宾夕法尼亚州福吉谷的PQ公司(PQ Corp.,Valley Forge,PA)）供应的那些微球。

术语“颗粒组合物”是指分立的固体宏观粒子的聚集物。粉末由于它们的小粒径而为一类特殊的颗粒材料，这使得它们内聚度更高并且更容易悬浮。

在清洁应用中使用包含Bsp Man4的洗涤剂组合物时，将待清洁的织物、纺织物、器皿或其他表面在存在Bsp Man4洗涤剂组合物的情况下温育一段足以允许Bsp Man4水解存在于污垢或污渍中的甘露聚糖底物（包括但不限于刺槐豆胶、瓜耳胶以及它们的组合）的时间，然后通常用水或另一水性溶剂漂洗以将Bsp Man4洗涤剂组合物连同水解的甘露聚糖一起移除。

如本文所述，Bsp Man4多肽特别可用于清洁行业，其包括但不限于衣物和餐具洗涤剂。这些应用使酶处于各种环境压力下。Bsp Man4多肽因其在多种条件下的稳定性而可提供优于许多当前所用酶的优势。

实际上，洗涤中所涉及的内切-β-甘露聚糖酶暴露于多种洗涤条件，其包括变化的洗涤剂制剂、洗涤水体积、洗涤水温度和洗涤时间长度。此外，不同地理区域中使用的洗涤剂制剂在洗涤水中存在不同浓度的其相关组分。例如，欧洲的洗涤剂通常在洗涤水中具有约4500-5000ppm的洗涤剂组分，而日本的洗涤剂通常在洗涤水中具有大约667ppm的洗涤剂组分。在北美，尤其是在美国，洗涤剂通常在洗涤水中具有约975ppm的洗涤剂组分。

低洗涤剂浓度体系包括在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。日本的洗涤剂通常被认为是低洗涤剂浓度体系，因为其在洗涤水中具有大约667ppm的洗涤剂组分。

中等洗涤剂浓度包括在洗涤水中存在介于约800ppm至约2000ppm之间的洗涤剂组分的洗涤剂。北美的洗涤剂一般被认为是中等洗涤剂浓度体系，因为其在洗涤水中具有大约975ppm的洗涤剂组分。巴西通常在洗涤水中具有大约1500ppm的洗涤剂组分。

高洗涤剂浓度体系包括在洗涤水中存在超过约2000ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。欧洲的洗涤剂一般被认为是高洗涤剂浓度体系，因为其在洗涤水中具有大约4500-5000ppm的洗涤剂组分。

拉丁美洲的洗涤剂一般是高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂，而且拉丁美洲中使用的洗涤剂的范围可在中等洗涤剂浓度至高洗涤剂浓度之间，因为其在洗涤水中具有1500ppm至6000ppm的洗涤剂组分。如上所述，巴西通常在洗涤水中具有大约1500ppm的洗涤剂组分。然而，其他高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂地理区域（不限于其他拉丁美洲国家）也可具有在洗涤水中存在最高达约6000ppm的洗涤剂组分的高洗涤剂浓度体系。

根据前述内容，很明显在全世界范围内，典型洗涤溶液中洗涤剂组合物的浓度在低于约800ppm洗涤剂组合物（“低洗涤剂浓度地理位置”；例如在日本约667ppm）至介于约800ppm至约2000ppm之间（“中等洗涤剂浓度地理位置”；例如在美国约975ppm，在巴西约1500ppm）再到高于约2000ppm（“高洗涤剂浓度地理位置”；例如在欧洲约4500ppm至约5000ppm，以及在高泡磷酸盐助洗剂地理位置中约6000ppm）间变动。

典型的洗涤溶液的浓度凭经验确定。例如，在美国，典型洗涤机器容纳约64.4L体积的洗涤溶液。因此，为了在洗涤溶液内获得约975ppm的洗涤剂浓度，须将约62.79g洗涤剂组合物添加至64.4L洗涤溶液中。该量是由消费者使用随洗涤剂一起提供的量杯计量加入洗涤水中的典型量。

再举个例子，不同地理区域使用不同的洗涤温度。日本的洗涤水温度通常低于欧洲所用的洗涤水温度。例如，北美和日本的洗涤水温度通常介于约10℃至约30℃之间（例如约20℃），而欧洲的洗涤水温度通常介于约30至约60℃之间（例如约40℃）。因此，在某些实施例中，本文所述的洗涤剂组合物可在以下温度下利用：约10℃至约60℃，或约20℃至约60℃，或约30℃至约60℃，或约40℃至约60℃，以及在约40℃至约55℃范围内的所有其他组合和在10℃至60℃内的所有范围。然而，为了节省能源，许多消费者转向使用冷水洗涤。此外，在一些另外的区域中，通常将冷水用于洗衣以及餐具洗涤应用。在一些实施例中，本发明的“冷水洗涤”利用在以下温度下进行的洗涤：约10℃至约40℃，或约20℃至约30℃，或约15℃至约25℃，以及在约15℃至约35℃范围内的所有其他组合和在10℃至40℃内的所有范围。

再举个例子，不同地理区域通常具有不同的水硬度。水硬度经常按每加仑混合的Ca²⁺/Mg²⁺的格令数(grain)来描述。硬度是水中钙(Ca²⁺)和镁(Mg²⁺)的量的量度。在美国，大多数水都较硬，但硬度有波动。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181ppm（ppm换算成每美制加仑格令数是ppm数除以17.1等于每加仑格令数）的硬度矿物质。

表II.水硬度水平

水	每加仑格令数	份每一百万份
			软	低于1.0	低于17
略硬	1.0达3.5	17达60
			中等硬	3.5达7.0	60达120
硬	7.0达10.5	120达180
			极硬	高于10.5	高于180

欧洲的水硬度通常是每加仑的混合Ca²⁺/Mg²⁺高于约10.5（例如约10.5至约20.0）格令（例如每加仑的混合Ca²⁺/Mg²⁺为约15格令）。北美的水硬度通常高于日本的水硬度，但小于欧洲的水硬度。例如，北美的水硬度可介于约3至约10格令、约3至约8格令之间或为约6格令。日本的水硬度通常小于北美的水硬度，通常小于约4，例如每加仑混合的Ca²⁺/Mg²⁺为约3格令。

因此，在一些实施例中，本发明提供在至少一组洗涤条件（例如水温、水硬度和/或洗涤剂浓度）下显示出出乎意料的洗涤性能的Bsp Man4多肽。在一些实施例中，Bsp Man4多肽在洗涤性能方面与其他内切-β-甘露聚糖酶相当。在一些实施例中，Bsp Man4多肽与当前可商购获得的内切-β-甘露聚糖酶相比表现出增强的洗涤性能。因此，在一些优选的实施例中，本文中提供的Bsp Man4多肽表现出增强的氧化稳定性、增强的热稳定性、增强的在多种条件下的清洁能力和/或增强的螯合剂稳定性。此外，Bsp Man4多肽可用于不含洗涤剂（单独或与助洗剂和稳定剂组合）的清洁组合物中。

在本发明的一些实施例中，以组合物的重量计，清洁组合物包含含量为约0.00001%至约10%的至少一种本发明的Bsp Man4多肽，并且以组合物的重量计，余量（例如约99.999%至约90.0%）包含清洁辅助材料。在本发明的其他方面，以组合物的重量计，清洁组合物包含含量为约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%的至少一种Bsp Man4多肽，而清洁组合物的余量（例如约99.9999重量%至约90.0重量%、约99.999重量%至约98重量%、约99.995重量%至约99.5重量%）包含清洁辅助材料。

除了本文提供的Bsp Man4多肽外，任何其他合适的内切-β-甘露聚糖酶均可用于本发明的组合物。合适的内切-β-甘露聚糖酶包括但不限于糖基水解酶的GH26家族的内切-β-甘露聚糖酶、糖基水解酶的GH5家族的内切-β-甘露聚糖酶、酸性内切-β-甘露聚糖酶、中性内切-β-甘露聚糖酶和碱性内切-β-甘露聚糖酶。碱性内切-β-甘露聚糖酶的例子包括在美国专利No.6,060,299、6,566,114和6,602,842、WO 9535362A1、WO 9964573A1以及WO9964619A1中所述的那些。另外，合适的内切-β-甘露聚糖酶包括但不限于来源于动物、植物、真菌或细菌的那些。本发明涵盖经化学或遗传修饰的突变体。

可用的内切-β-甘露聚糖酶的例子包括芽孢杆菌内切-β-甘露聚糖酶，例如枯草芽孢杆菌内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,060,299和WO 9964573A1）、芽孢杆菌I633内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,566,114和WO9964619A1）、芽孢杆菌AAI12内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,566,114和WO9964619A1）、芽孢杆菌AA349内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,566,114和WO9964619A1）、琼脂粘附芽孢杆菌NCIMB40482内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,566,114和WO9964619A1）、嗜碱耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)内切-β-甘露聚糖酶、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,566,114和WO9964619A1）、地衣芽孢杆菌内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,566,114和WO9964619A1）；腐质霉(Humicola)内切-β-甘露聚糖酶，例如特异腐质霉(H.insolens)内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,566,114和WO9964619A1）以及热解纤维素菌(Caldocellulosiruptor)内切-β-甘露聚糖酶，例如热解纤维素菌内切-β-甘露聚糖酶（参见例如美国专利No.6,566,114和WO9964619A1）。

此外，多种已鉴定的甘露聚糖酶（即内切-β-甘露聚糖酶和外切-β-甘露聚糖酶）可用于本发明的一些实施例，其包括但不限于双孢蘑菇(Agaricus bisporus)甘露聚糖酶（参见Tang等人，[2001]Appl.Environ.Microbiol.67:2298–2303）、溜曲霉(Aspergillu tamarii)甘露聚糖酶（参见Civas等人，[1984]Biochem.J.（《生物化学杂志》）219:857–863）、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)甘露聚糖酶（参见Christgau等人，[1994]Biochem.Mol.Biol.Int.（《国际生物化学与分子生物学》）33:917–925）、泡盛曲霉甘露聚糖酶（参见Setati等人，[2001]Protein ExpressPurif.（《蛋白表达与纯化》）21:105–114）、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)甘露聚糖酶（参见Puchart等人，[2004]Biochimica et biophysica Acta.（《生物化学与生物物理学报》）1674:239–250）、黑曲霉甘露聚糖酶（参见Ademark等人，[1998]J.Biotechnol.（《生物技术杂志》）63:199–210）、米曲霉NRRL甘露聚糖酶（参见Regalado等人，[2000]J.Sci.FoodAgric.（《食品科学与农业杂志》）80:1343–1350）、硫色曲霉(Aspergillussulphureus)甘露聚糖酶（参见Chen等人，[2007]J.Biotechnol.（《生物技术杂志》）128(3):452–461）、土曲霉(Aspergillus terrus)甘露聚糖酶（参见Huang等人，[2007]Wei Sheng Wu Xue Bao.（《微生物学报》）47(2):280–284）、琼脂粘附芽孢杆菌甘露聚糖酶（参见美国专利No.6,376,445）、芽孢杆菌AM001甘露聚糖酶（参见Akino等人，[1989]Arch.Microbiol.（《微生物学档案》）152:10–15）、短芽孢杆菌甘露聚糖酶（参见Araujo和Ward,[1990]J.Appl.Bacteriol.（《应用细菌学杂志》）68:253–261）、环状芽孢杆菌K-1甘露聚糖酶（参见Yoshida等人，[1998]Biosci.Biotechnol.Biochem.（《生物科学、生物技术与生物化学》）62(3):514–520）、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)甘露聚糖酶（参见Araujo和Ward,[1990]J.Appl.Bacteriol.（《应用细菌学杂志》）68:253–261）、芽孢杆菌JAMB-750甘露聚糖酶（参见Hatada等人，[2005]Extremophiles.（《极端微生物》）9:497–500）、芽孢杆菌M50甘露聚糖酶（参见Chen等人，[2000]Wei Sheng Wu Xue Bao.（《微生物学报》）40:62–68）、芽孢杆菌N16-5甘露聚糖酶（参见Yanhe等人，[2004]Extremophiles（《极端微生物》）8:447–454）、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilu)甘露聚糖酶（参见Talbot和Sygusch,[1990]Appl.Environ.Microbiol.（《应用环境微生物学》）56:3505–3510）、枯草芽孢杆菌甘露聚糖酶（参见Mendoza等人，[1994]World J.Microbiol.Biotechnol.（《世界微生物学与生物技术杂志》）10:51–54）、枯草芽孢杆菌B36甘露聚糖酶（Li等人，[2006]Z.Naturforsch(C).（《自然历史期刊C辑》）61:840–846）、枯草芽孢杆菌BM9602甘露聚糖酶（参见Cui等人，[1999]Wei Sheng Wu XueBao.（《微生物学报》）39(1):60–63）、枯草芽孢杆菌SA–22甘露聚糖酶（参见Sun等人，[2003]Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao.（《生物工程学报》）19(3):327–330）、枯草芽孢杆菌168甘露聚糖酶（参见Helow和Khattab,[1996]Acta Microbiol.Immunol.Hung.（《匈牙利微生物学与免疫学报》）43:289–299）、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)甘露聚糖酶（参见Gherardini等人，[1987]J.Bacteriol.（《细菌学杂志》）169:2038–2043）、栖瘤胃拟杆菌(Bacteroides ruminicola)甘露聚糖酶（参见Matsushita等人，[1991]J.Bacteriol.（《细菌学杂志》）173:6919–6926）、热解纤维素菌(Caldibacillus cellulovorans)甘露聚糖酶（参见Sunna等人，[2000]Appl.Environ.Microbiol.（《应用环境微生物学》）66:664–670）、Caldocellulosiruptor saccharolyticus甘露聚糖酶（参见Morris等人，[1995]Appl.Environ.Microbiol.（《应用环境微生物学》）61:2262–2269）、解糖热纤维菌(Caldocellum saccharolyticum)甘露聚糖酶（参见Bicho等人，[1991]Appl.Microbiol.Biotechnol.（《应用微生物学与生物技术》）36:337–343）、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)甘露聚糖酶（参见Stoll等人，[1999]Appl.Environ.Microbiol.（《应用环境微生物学》）65(6):2598–2605）、丁酸梭菌/拜氏梭菌(Clostridium butyricum/beijerinckii)甘露聚糖酶（参见Nakajima和Matsuura，[1997]Biosci.Biotechnol.Biochem.（《生物科学、生物技术与生物化学》）61:1739–1742）、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)甘露聚糖酶（参见Perret等人，[2004]Biotechnol.Appl.Biochem.（《生物技术与应用生物化学》）40:255–259）、第三梭菌(Clostridium tertium)甘露聚糖酶（参见Kataoka和Tokiwa，[1998]J.Appl.Microbiol.（《应用微生物学杂志》）84:357–367）、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)甘露聚糖酶（参见Halstead等人，[1999]Microbiol.（《微生物学》）145:3101–3108）、嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)甘露聚糖酶（参见Gibbs等人，[1999]Curr.Microbiol.（《当代微生物学》）39(6):351–357）、黄杆菌(Flavobacteriumsp)甘露聚糖酶（参见Zakaria等人，[1998]Biosci.Biotechnol.Biochem.（《生物科学、生物技术与生物化学》）62:655–660）、腹足纲肺螺亚纲(Gastropoda pulmonata)甘露聚糖酶（参见Charrier和Rouland，[2001]J.Expt.Zool.（《实验动物学杂志》）290:125–135）、短滨螺(Littorinabrevicula)甘露聚糖酶（参见Yamamura等人，[1996]Biosci.Biotechnol.Biochem.（《生物科学、生物技术与生物化学》）60:674–676）、番茄(Lycopersicon esculentum)甘露聚糖酶（参见Filichkin等人，[2000]PlantPhysiol.（《植物生理学》）134:1080–1087）、解凝乳类芽胞杆菌(Paenibacillus curdlanolyticus)甘露聚糖酶（参见Pason和Ratanakhanokchai，[2006]Appl.Environ.Microbiol.（《应用环境微生物学》）72:2483–2490）、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)甘露聚糖酶（参见Han等人，[2006]Appl.Microbiol Biotechnol.（《应用微生物学与生物技术》）73(3):618–630）、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)甘露聚糖酶（参见Wymelenberg等人，[2005]J.Biotechnol.（《生物技术杂志》）118:17–34）、厌气性瘤胃真菌(Piromyces sp.)甘露聚糖酶（参见Fanutti等人，[1995]J.Biol.Chem.（《生物化学杂志》）270(49):29314–29322）、Pomacea insulars甘露聚糖酶（参见Yamamura等人，[1993]Biosci.Biotechnol.Biochem.（《生物科学、生物技术与生物化学》）7:1316–1319）、荧光假单胞菌亚种纤维素甘露聚糖酶（参见Braithwaite等人，[1995]Biochem J.（《生物化学杂志》）305:1005–1010）、海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)甘露聚糖酶（参见Politz等人，[2000]Appl.Microbiol.Biotechnol.（《应用微生物学与生物技术》）53(6):715–721）、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)甘露聚糖酶（参见Sachslehner等人，[2000]J.Biotechnol.（《生物技术杂志》）80:127–134）、鲜黄链霉菌(Streptomyces galbus)甘露聚糖酶（参见Kansoh和Nagieb，[2004]Anton.van.Leeuwonhoek.85:103–114）、变铅青链霉菌甘露聚糖酶（参见Arcand等人，[1993]J.Biochem.（《生物化学杂志》）290:857–863）、嗜热厌氧解多糖杆菌(ThermoanaerobacteriumPolysaccharolyticum)甘露聚糖酶（参见Cann等人，[1999]J.Bacteriol.（《细菌学杂志》）181:1643–1651）、褐色高温单孢菌(Thermomonosporafusca)甘露聚糖酶（参见Hilge等人，[1998]Structure（《结构》）6:1433–1444）、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)甘露聚糖酶（参见Parker等人，[2001]Biotechnol.Bioeng.（生物技术与生物工程》）75(3):322–333）、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)甘露聚糖酶（参见Duffaud等人，[1997]Appl.Environ.Microbiol.（《应用环境微生物学》）63:169–177）、哈茨木霉(Trichoderma harzanium)菌株T4甘露聚糖酶（参见Franco等人，[2004]Biotechnol Appl.Biochem.（《生物技术与应用生物化学》）40:255–259）、里氏木霉甘露聚糖酶（参见Stalbrand等人，[1993]J.Biotechnol.（《生物技术杂志》）29:229–242）以及弧菌(Vibriosp.)甘露聚糖酶（参见Tamaru等人，[1997]J.Ferment.Bioeng.（《发酵与生物工程杂志》）83:201–205。

另外的合适内切-β-甘露聚糖酶包括市售内切-β-甘露聚糖酶，例如

（美国高锦公司(Chemgen)）；

和

（丹麦诺维信公司(Novozymes A/S,Denmark)）；

PURABRITE^TM和MANNASTAR^TM（加利福尼亚州帕罗奥图的丹尼斯克分公司杰能科公司(Genencor,A Danisco Division,Palo Alto,CA)；以及160和

200(Diversa)。

在本发明的一些实施例中，以组合物的重量计，本发明的清洁组合物还包含含量为约0.00001%至约10%的另外的内切-β-甘露聚糖酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的其他方面，以组合物的重量计，本发明的清洁组合物还包含含量为约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%的内切-β-甘露聚糖酶。

在本发明一些实施例中，可使用任何合适的蛋白酶。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的那些。在一些实施例中，其包括经化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。多种蛋白酶在PCT申请WO 95/23221和WO 92/21760；美国专利公布No.2008/0090747；以及美国专利No.5,801,039、5,340,735、5,500,364、5,855,625；U.S.RE34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936、6,482,628；以及多种其他专利中有所描述。在一些另外的实施例中，金属蛋白酶可用于本发明，其包括但不限于PCT申请WO 07/044993中所述的中性金属蛋白酶。可用于本发明的市售蛋白酶包括但不限于

PRIME和

（加利福尼亚州帕罗奥图的丹尼斯克分公司杰能科公司）。另外，可用于本发明的市售蛋白酶包括但不限于

和

（丹麦诺维信公司）。

在本发明一些实施例中，可使用任何合适的淀粉酶。在一些实施例中，也可使用适用于碱性溶液中的任何淀粉酶（例如α和/或β淀粉酶）。合适的淀粉酶包括但不限于来源于细菌或真菌的那些。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。可用于本发明的淀粉酶包括但不限于从地衣芽孢杆菌获得的α-淀粉酶（参见例如GB 1,296,839）。可用于本发明的市售淀粉酶包括但不限于

STAINZYME

和BAN^TM（丹麦诺维信公司）以及

POWERASE^TM、

和P（加利福尼亚州帕罗奥图的丹尼斯克分公司杰能科公司）。

在本发明的一些实施例中，以组合物的重量计，所公开的清洁组合物还包含含量为约0.00001%至约10%的另外的淀粉酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明其他方面，以组合物的重量计，清洁组合物还包含含量为约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%的淀粉酶。

在本发明的一些实施例中，可以使用任何合适的果胶降解酶。如本文所用，“果胶降解酶”涵盖阿拉伯聚糖酶(EC3.2.1.99)、半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)、外切-聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.67)、外切-聚-α-半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.82)、果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、果胶酯酶(EC3.2.1.11)、果胶酸裂解酶(EC4.2.2.2)、外切-聚半乳糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.9)和半纤维素酶如内切-1,3-β-木糖苷酶(EC3.2.1.32)、木聚糖-1,4-β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)和α-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC3.2.1.55)。果胶降解酶是上述酶活性的天然混合物。果胶酶因此包括水解果胶甲酯键的甲酯酶，裂解半乳糖醛酸分子之间的糖苷键的聚半乳糖醛酸酶，以及作用于果胶酸引起α-1,4糖苷键非水解裂解以形成半乳糖醛酸的不饱和衍生物的果胶反式消去酶或裂解酶。

合适的果胶降解酶包括来源于植物、真菌或微生物的那些。在一些实施例中，其包括经化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，果胶降解酶为碱性果胶降解酶，即在约7.0至约12的pH下具有其最大活性的至少10%、优选至少25%、更优选至少40%的酶活性的酶。在某些其他实施例中，果胶降解酶为在约7.0至约12的pH下具有其最大活性的酶。碱性果胶降解酶通过嗜碱微生物产生，例如细菌、真菌和酵母微生物，如芽孢杆菌属物种。在一些实施例中，微生物为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、环状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，如JP 56131376和JP 56068393中所述。碱性果胶分解酶可包括但不限于半乳聚糖-1,4-α-半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.67)、聚半乳糖醛酸酶活性(EC3.2.1.15)、果胶酯酶(EC3.1.1.11)、果胶酸裂解酶(EC4.2.2.2)以及它们的同工酶。碱性果胶分解酶可通过欧文氏菌属(Erwinia)物种产生。在一些实施例中，碱性果胶分解酶通过菊欧文氏菌(E.chrysanthemi)、胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora)、解淀粉欧文氏菌(E.amylovora)、草生欧文氏菌(E.herbicola)和溶解欧文氏菌(E.dissolvens)，如JP 59066588、JP 63042988和World J.Microbiol.Microbiotechnol.（《世界微生物学与微生物技术杂志》）(8,2,115-120)1992中所述。在某些其他实施例中，碱性果胶酶通过芽孢杆菌属物种产生，如JP 73006557和Agr.Biol.Chem.《农业与生物化学》(1972),36(2)285-93中所公开。

在本发明的一些实施例中，以组合物的重量计，所公开的清洁组合物还包含含量为约0.00001%至约10%的另外的果胶降解酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的其他方面，以组合物的重量计，清洁组合物还包含含量为约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%的果胶降解酶。

在一些其他实施例中，任何合适的木葡聚糖酶都可用于本发明的清洁组合物。合适的木葡聚糖酶包括但不限于来源于植物、真菌或细菌的那些。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。如本文所用，“木葡聚糖酶”涵盖瓦赫宁根大学(Wageningen University)的Vincken和Voragen所述的酶家族[Vincken等人(1994)Plant Physiol.（《植物生理学》），104,99-107]并且能够降解木葡聚糖，如Hayashi等人(1989)Plant.Physiol.Plant Mol.Biol.（《植物生理学与植物分子生物学》），40,139-168中所述。Vincken等人证实通过从绿色木霉(Trichoderma viride)纯化的木葡聚糖酶（内切-IV-葡聚糖酶）从分离的苹果细胞壁的纤维素中除去了木葡聚糖包覆物。该酶可增强细胞壁包埋的纤维素的酶降解并与果胶酶协同作用。得自吉斯特公司(Gist-Brocades)的Rapidase LIQ+含有木葡聚糖酶活性。

在本发明的一些实施例中，以组合物的重量计，所公开的清洁组合物还包含含量为约0.00001%至约10%的另外的木葡聚糖酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的其他方面，以组合物的重量计，清洁组合物还包含含量为约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%的木葡聚糖酶。在某些其他实施例中，用于具体应用的木葡聚糖酶为碱性木葡聚糖酶，即在7至12范围内的pH下酶活性为其最大活性的至少10%、优选至少25%、更优选至少40%的酶。在某些其他实施例中，木葡聚糖酶为在约7.0至约12的pH下具有其最大活性的酶。

在一些其他的实施例中，任何合适的纤维素酶都可用于本发明的清洁组合物。合适的纤维素酶包括但不限于来源于细菌或真菌的那些。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。合适的纤维素酶包括但不限于特异腐质霉纤维素酶（参见例如美国专利No.4,435,307）。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理有益效果的纤维素酶（参见例如EP 0 495 257）。可用于本发明的市售纤维素酶包括但不限于

（丹麦诺维信公司）。另外的市售纤维素酶包括

（加利福尼亚州帕罗奥图的丹尼斯克分公司杰能科公司和KAC-500(B)^TM（花王株式会社(Kao Corporation)）。在一些实施例中，纤维素酶作为成熟野生型纤维素酶或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中N末端的一部分缺失（参见例如美国专利No.5,874,276）。在一些实施例中，以组合物的重量计，本发明的清洁组合物还包含含量为约0.00001%至约10%的另外的纤维素酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明其他方面，以组合物的重量计，清洁组合物还包含含量为约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%的纤维素酶。

在另外的实施例中，任何适用于洗涤剂组合物的脂肪酶也可用于本发明。合适的脂肪酶包括但不限于来源于细菌或真菌的那些。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。可用的脂肪酶的例子包括柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶（参见例如EP 258 068和EP 305 216）、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶（参见例如EP 238 023）、假丝酵母(Candida)脂肪酶如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶（例如南极假丝酵母脂肪酶A或B；参见例如EP 214 761）、假单胞菌脂肪酶如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)脂肪酶和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶（参见例如EP 218 272）、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶（参见例如EP 331376）、施氏假单胞菌P.stutzeri)脂肪酶（参见例如GB 1,372,034）、荧光假单胞菌脂肪酶、芽孢杆菌脂肪酶（例如枯草芽孢杆菌脂肪酶[Dartois等人，(1993)Biochem.Biophys.Acta（《生物化学与生物物理学报》）1131:253-260]、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶[参见例如JP 64/744992]和短小芽孢杆菌(B.pumilus)脂肪酶[参见例如WO 91/16422]）。此外，多种克隆的脂肪酶可用于本发明的一些实施例，其包括但不限于沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶（参见Yamaguchi等人，[1991]Gene（《基因》）103:61-67）、白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶（参见Schimada等人，[1989]J.Biochem.（《生物化学杂志》）106:383-388）和多种根霉(Rhizopus)脂肪酶，如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶（参见Hass等人，[1991]Gene（《基因》）109:117-113）、雪白根霉(R.niveus)脂肪酶（Kugimiya等人，[1992]Biosci.Biotech.Biochem.（《生物科学、生物技术与生物化学》）56:716-719）以及米根霉(R.oryzae)脂肪酶。其他类型的脂解酶（如角质酶）也可用于本发明的一些实施例中，其包括但不限于：源自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶（参见WO88/09367）和源自豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solani pisi)的角质酶（参见WO 90/09446）。另外的合适脂肪酶包括市售的脂肪酶，如M1LIPASE^TM、LUMA FAST^TM和LIPOMAX^TM（加利福尼亚州帕罗奥图的丹尼斯克分公司杰能科公司）；

和

ULTRA（丹麦诺维信公司）；以及LIPASE P^TM“Amano”（日本天野制药株式会社(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.,Japan)）。

在一些实施例中，以组合物的重量计，所公开的清洁组合物还包含含量为约0.00001%至约10%的另外的脂肪酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的其他方面，以组合物的重量计，清洁组合物还包含含量为约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%的脂肪酶。

在一些实施例中，过氧化物酶与过氧化氢或其来源（例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐）组合用于本发明组合物中。在一些备选的实施例中，氧化酶与氧气联合使用。这两种类型的酶优选连同增强剂一起用于“溶液漂白”（即，当织物在洗涤液中一起洗涤时防止纺织物染料从染色的织物转移到另一织物）（参见例如WO 94/12621和WO 95/01426）。合适的过氧化物酶/氧化酶包括但不限于来源于植物、细菌或真菌的那些。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，以组合物的重量计，本发明的清洁组合物还包含含量为约0.00001%至约10%的另外的过氧化物酶和/或氧化酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的其他方面，以组合物的重量计，清洁组合物还包含含量为约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%的过氧化物酶和/或氧化酶。

在一些实施例中，可使用另外的酶，其包括但不限于过水解酶（参见例如WO 05/056782）。此外，在一些特别优选的实施例中，本文涵盖上述酶的混合物，尤其一种或多种另外的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一种纤维素酶。实际上，设想这些酶的多种混合物都可用于本发明。还设想Bsp Man4多肽与一种或多种另外的酶的不同水平都可独立地在约10%的范围内，该清洁组合物的余量为清洁辅助材料。易于通过考虑待清洁表面、物品或织物以及针对在使用（例如通过使用洗涤剂）期间清洁条件所需的组合物形式来具体选择清洁辅助材料。

合适的清洁辅助材料的例子包括但不限于表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定体系、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料转移剂、染料转移抑制剂、催化材料、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂、结构增弹性剂(elasticizing agent)、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂、颜料、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂（参见例如美国专利No.6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，所有这些专利均以引用方式并入本文）。特定清洁组合物材料的实施例在下文中举例说明。在清洁组合物中清洁辅助材料与所公开Bsp Man4多肽不相容的实施例中，则使用保持清洁辅助材料与内切-β-甘露聚糖酶分离（即，不彼此接触）直到两种组分的组合适宜时的合适方法。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法（例如软胶囊法、包封法、片剂法、物理分离法等）。

在一些优选的实施例中，在可用于清洁需要去除污渍的多种表面的组合物中包含有效量的一种或多种本文提供的Bsp Man4多肽。这些清洁组合物包括用于诸如清洁硬质表面、织物和餐具之类的应用的清洁组合物。实际上，在一些实施例中，本发明提供织物清洁组合物，而在其他实施例中，本发明提供非织物清洁组合物。值得注意的是，本发明还提供适于个人护理的清洁组合物，其包括口腔护理（包括洁牙剂、牙膏、漱口水等，以及假牙清洁组合物）、皮肤和毛发清洁组合物。另外，在其他实施例中，本发明提供织物软化组合物。预期本发明涵盖任何形式（即，液体、颗粒、条状、半固体、凝胶、乳液、片剂、胶囊等）的洗涤剂组合物。

举例来说，下文将更详细地描述可使用所公开的Bsp Man4多肽的若干清洁组合物。在所公开的清洁组合物被配制成适用于洗衣机洗涤方法中的组合物的一些实施例中，本发明组合物优选含有至少一种表面活性剂和至少一种助洗剂化合物，以及一种或多种清洁辅助材料，所述清洁辅助材料优选选自有机聚合化合物、漂白剂、另外的酶、抑泡剂、分散剂、钙皂分散剂、悬污剂和抗再沉积剂以及腐蚀抑制剂。在一些实施例中，洗衣组合物还含有软化剂（即作为额外的清洁辅助材料）。本发明组合物还可使用固体或液体形式的洗涤添加剂产品。所述添加剂产品旨在补充和/或提高常规洗涤剂组合物的性能，并且可在洗涤过程的任何阶段添加。在一些实施例中，在20℃下测量时，本文中衣物洗涤剂组合物的密度在约400至约1200g/L的范围内，而在其他实施例中，其在约500至约950g/L组合物的范围内。

在配制为用于人工餐具洗涤方法中的组合物的实施例中，本发明组合物优选含有至少一种表面活性剂和优选的至少一种另外的选自如下的清洁辅助材料：有机聚合化合物、泡沫增强剂、第II族金属离子、溶剂、水溶助长剂和另外的酶。

在一些实施例中，多种清洁组合物如美国专利No.6,605,458中提供的那些组合物可与本发明的Bsp Man4多肽一起使用。因此，在一些实施例中，包含至少一种本发明Bsp Man4多肽的组合物是紧凑的颗粒织物清洁组合物，而在其他实施例中，所述组合物是适用于清洗有色织物的颗粒织物清洁组合物，在另外的实施例中，所述组合物是通过洗涤能力提供软化作用的颗粒织物清洁组合物，在其他实施例中，所述组合物是重垢液体织物清洁组合物。在一些实施例中，包含至少一种本发明Bsp Man4多肽的组合物是织物清洁组合物，如美国专利No.6,610,642和6,376,450中所述的那些组合物。此外，本发明Bsp Man4多肽可用于在欧洲或日本洗涤条件下特别具有实用性的颗粒衣物洗涤组合物中（参见例如美国专利No.6,610,642）。

在一些备选的实施例中，本发明提供包含至少一种本文提供的BspMan4多肽的硬质表面清洁组合物。因此，在一些实施例中，包含至少一种本发明Bsp Man4多肽的组合物是硬质表面清洁组合物，如美国专利No.6,610,642、6,376,450和6,376,450中所述的那些组合物。

在其他实施例中，本发明提供包含至少一种本文提供的Bsp Man4多肽的餐具洗涤组合物。因此，在一些实施例中，包含至少一种本发明BspMan4多肽的组合物是硬质表面清洁组合物，如美国专利No.6,610,642和6,376,450中所述的那些组合物。在一些其他实施例中，本发明提供包含至少一种本文提供的Bsp Man4多肽的餐具洗涤组合物。在一些其他实施例中，包含至少一种本发明Bsp Man4多肽的组合物包含口腔护理组合物，如美国专利No.6,376,450和6,605,458中所述的那些组合物。上述美国专利No.6,376,450、6,605,458和6,610,642中所含的化合物和清洁辅助材料的配制和描述可用于本文提供的Bsp Man4多肽。

在另外的实施例中，包含本发明的至少一种Bsp Man4多肽的组合物包含织物软化组合物，如在GB-A1 400898、GB-A1 514 276、EP 0 011340、EP 0 026 528、EP 0 242 919、EP 0 299 575、EP 0 313 146和美国专利No.5,019,292中的那些。包含在前述GB-A1 400898、GB-A1 514 276、EP0 011 340、EP 0 026 528、EP 0 242 919、EP 0 299 575、EP 0 313 146和美国专利No.5,019,292中的化合物和软化剂的配制和说明可用于本文提供的Bsp Man4多肽。

本发明的清洁组合物可配制成任何合适的形式并通过配制人员选择的任何方法制备，其非限制性例子在美国专利No.5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,565,422、5,516,448、5,489,392和5,486,303中有所描述，所有这些专利都以引用方式并入本文中。当低pH清洁组合物是所需的时，通过添加诸如单乙醇胺或酸性材料（如HCl）之类的材料来调整此类组合物的pH。

尽管不是实现本发明目的所必需的，但下文示例的辅助材料的非限制性表单适用于本发明清洁组合物。在一些实施例中，掺入这些辅助材料，例如以帮助或增强清洁性能以便处理待清洁的基底，或改变清洁组合物的美观性，如利用香料、着色剂、染料等情形就是如此。应了解，此类辅助材料是除本发明Bsp Man4多肽外的物质。这些另外的组分的精确性质以及其掺入的水平将取决于组合物的物理形式和打算使用组合物的清洁操作的性质。合适的辅助材料包括但不限于：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、另外的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增强剂、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂/抗再沉积剂、增亮剂、抑泡剂、染料、香料、结构增塑剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂和/或颜料。除下文的公开内容外，此类其他辅助材料和使用水平的合适例子见于美国专利No.5,576,282、6,306,812和6,326,348（以引用方式并入）。上述辅助成分可构成本发明清洁组合物的余量。

在一些实施例中，根据本发明的清洁组合物包含至少一种表面活性剂和/或表面活性剂体系，其中所述表面活性剂选自：非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子型表面活性剂、半极性非离子型表面活性剂以及它们的混合物。在一些低pH清洁组合物实施例（例如净pH为约3至约5的组合物）中，组合物通常不含烷基乙氧基化硫酸盐，因为据信这种表面活性剂可能会被此类组合物的酸性内含物水解。在一些实施例中，以清洁组合物的重量计，表面活性剂以约0.1%至约60%的含量存在，而在备选的实施例中，所述含量为约1%至约50%，而在其他实施例中，所述含量为约5%至约40%。

在一些实施例中，本发明清洁组合物含有至少一种螯合剂。合适的螯合剂可包括但不限于：铜、铁和/或锰螯合剂以及它们的混合物。在使用至少一种螯合剂的实施例中，以本发明清洁组合物的重量计，本发明清洁组合物包含约0.1%至约15%或甚至约3.0%至约10%螯合剂。

在一些其他实施例中，本文中提供的清洁组合物含有至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括但不限于：聚乙二醇；聚丙二醇；聚羧酸(盐)；去污聚合物，如聚对苯二甲酸；粘土，如高岭土、蒙脱土、绿坡缕石(atapulgite)、伊利石、膨润土、多水高岭土以及它们的混合物。

如本文所指出的那样，在一些实施例中，抗再沉积剂可用于本发明的一些实施例中。在一些优选的实施例中，可使用非离子型表面活性剂。例如，在自动餐具洗涤实施例中，非离子型表面活性剂可用于表面修饰目的，尤其用于被单料子，以避免成膜和起斑以及用于改善光泽度。这些非离子型表面活性剂也可用于防止污垢再沉积。在一些优选的实施例中，抗再沉积剂是本领域已知的非离子型表面活性剂（参见例如EP 2 100949）。

在一些实施例中，本发明清洁组合物包含一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于：聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或它们的混合物。在使用至少一种染料转移抑制剂的实施例中，以本发明的清洁组合物的重量计，本发明清洁组合物包含约0.0001%至约10%、约0.01%至约5%或甚至约0.1%至约3%。

在一些实施例中，硅酸盐包括在本发明的组合物中。在一些此类实施例中，使用硅酸钠（例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐）。在一些实施例中，硅酸盐以约1%至约20%的含量存在。在一些优选的实施例中，以组合物的重量计，硅酸盐以约5%至约15%的含量存在。

在一些另外的实施例中，本发明清洁组合物还含有分散剂。合适的水溶性有机材料包括但不限于均聚酸或共聚酸或它们的盐，其中多聚羧酸包含至少两个羧基，彼此以不超过两个碳原子分开。

在一些其他实施例中，通过任何合适的技术使清洁组合物中使用的酶稳定。在一些实施例中，本文所用的酶由成品组合物中存在的可给该酶提供钙和/或镁离子的水溶性钙和/或镁离子源来稳定。在一些实施例中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐（包括碱土金属，如钙盐）。设想用于稳定酶的各种技术可用于本发明。例如，在一些实施例中，本文所用的酶通过在成品组合物中存在水溶性的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子源而稳定，这些源向酶提供此类离子，以及其他金属离子，例如钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV)。氯化物和硫酸盐也可用于本发明一些实施例中。合适的寡糖和多糖（例如糊精）的例子是本领域已知的（参见例如WO 07/145964）。在一些实施例中，也可使用可逆的蛋白酶抑制剂，如含硼化合物（例如硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸），以及/或者必要时，可使用三肽醛进一步提高稳定性。

在一些实施例中，漂白剂、漂白活化剂和/或漂白催化剂存在于本发明的组合物中。在一些实施例中，本发明清洁组合物包含无机和/或有机漂白化合物。无机漂白剂可包括但不限于过氧化氢合物盐（例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐）。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施例中，包括的无机过氧化氢合物盐为结晶固体形式，无额外保护，但在一些另外的实施例中，所述盐带涂层。本领域已知的任何适合的盐都可用于本发明（参见例如EP 2 100 949）。

在一些实施例中，将漂白活化剂用于本发明的组合物中。漂白活化剂通常为有机过酸前体，这些有机过酸前体在60℃和低于60℃温度下进行的清洁过程中会增强漂白作用。适用于本文的漂白活化剂包括在过氧化氢解条件下提供优选具有约1至约10个碳原子，尤其约2至约4个碳原子的脂族过氧羧酸的化合物，和/或任选取代的过苯甲酸。另外的漂白活化剂是本领域已知的并且可用于本发明（参见例如EP 2 100 949）。

此外，在一些实施例中以及如本文中进一步描述的，本发明清洁组合物还包含至少一种漂白催化剂。在一些实施例中，可使用三氮杂环壬烷锰及相关络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物。另外的漂白催化剂可用于本发明（参见例如美国专利No.4,246,612、美国专利No.5,227,084、美国专利No.4,810,410、WO 99/06521和EP 2 100 949）。

在一些实施例中，本发明清洁组合物含有一种或多种催化性金属络合物。在一些实施例中，可使用含金属漂白催化剂。在一些优选的实施例中，金属漂白催化剂包含催化剂体系，所述催化剂体系包含具有确定的漂白催化活性的过渡金属阳离子（例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子）、具有极低或无漂白催化活性的辅助性金属阳离子（例如锌或铝阳离子），和对催化性和辅助性金属阳离子具有确定的稳定性常数的多价螯合剂(sequestrate)，尤其可使用乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)以及它们的水溶性盐（参见例如美国专利No.4,430,243）。在一些实施例中，借助于锰化合物来催化本发明的清洁组合物。此类化合物及使用水平是本领域熟知的（参见例如美国专利No.5,576,282）。在另外的实施例中，钴漂白催化剂可用于本发明的清洁组合物中。各种钴漂白催化剂是本领域已知的（参见例如美国专利No.5,597,936和5,595,967）并易于通过已知程序制备。

在一些另外的实施例中，本发明清洁组合物包括大多环刚性配位体(MRL)的过渡金属络合物。作为一种实践（但绝非限制），在一些实施例中，对本发明提供的组合物和清洁方法进行调整以在水性洗涤介质中提供约至少1ppm的活性MRL物质，而在一些优选的实施例中在洗涤液中提供约0.005ppm至约25ppm，更优选约0.05ppm至约10ppm且最优选约0.1ppm至约5ppm的MRL。

在一些实施例中，本发明过渡金属漂白催化剂中的优选过渡金属包括但不限于锰、铁和铬。优选的MRL还包括但不限于交叉桥接的特异性超刚性配位体（例如5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷）。合适的过渡金属MRL易于通过已知程序制备（参见例如WO 2000/32601和美国专利No.6,225,464）。

在一些实施例中，本发明清洁组合物包含金属护理剂。金属护理剂可用于防止和/或减少包括铝、不锈钢和非铁金属（例如银和铜）在内的金属的锈污、腐蚀和/或氧化。合适的金属护理剂包括EP 2 100 949、WO94/26860和WO 94/26859中所述的那些。在一些实施例中，金属护理剂是锌盐。在一些其他实施例中，本发明清洁组合物包含约0.1重量%至约5重量%的一种或多种金属护理剂。

如上文所述，本发明清洁组合物可配制成任何合适的形式并由配制人员选择的任何方法制备，其非限制性例子在美国专利No.5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,516,448、5,489,392和5,486,303中有所描述，所有这些专利都以引用方式并入本文。在低pH清洁组合物是所需的一些实施例中，通过添加诸如HCl之类的酸性材料来调整此类组合物的pH。

本文所公开的清洁组合物可用于清洁位置(situs)（例如表面、餐具或织物）。通常，使所述位置的至少一部分与纯的形式的或在洗涤液中稀释的本发明清洁组合物实施例接触，随后任选洗涤和/或漂洗所述位置。对本发明来说，“洗涤”包括但不限于擦洗和机械搅动。在一些实施例中，清洁组合物在溶液中通常以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常在约5℃至约90℃的范围内，并且当所述位置包括织物时，水与织物的质量比通常为约1:1至约30:1。

VI.作为化学试剂的Bsp Man4多肽

Bsp Man4对包含甘露糖单元的多糖链（包括但不限于甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖）的偏好使得本发明的多肽尤其可用于进行涉及含有1,4-β-D-甘露糖苷键的多糖底物的甘露聚糖水解反应。

一般说来，在适于进行甘露聚糖水解反应的条件下，将供体分子在存在分离的Bsp Man4多肽或其片段或变体的情况下温育，随后任选从反应物中分离出产物。或者，在食品的情形中，产物可不经分离即变为食品的组分。在某些实施例中，供体分子是包含甘露糖单元的多糖链，包括但不限于甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。

VII.用于食品加工和动物饲料的Bsp Man4多肽

若干抗营养因子会限制特定植物材料在动物饲料和人类食物的制备中的用途。例如，含有寡甘露聚糖如甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的植物材料可减弱动物对营养化合物如矿物质、维生素、糖和脂肪的消化和吸收。该负面影响特别是由于含甘露聚糖的聚合物的高粘度以及含甘露聚糖的聚合物吸收营养化合物的能力。这些影响通过使用含甘露聚糖的聚合物的降解酶（即内切-β-甘露聚糖酶，如本文所述的Bsp Man4多肽）而减轻，这些酶允许将更高比例的含有含甘露聚糖的聚合物的廉价植物材料包含在饲料中，从而降低饲料成本。另外，通过BspMan4多肽的活性，含甘露聚糖的聚合物分解成更简单的糖，这些糖可更容易同化以提供额外的能量。因此，包含本文所述的Bsp Man4多肽任一者的组合物优选用于加工和/或制造食物或动物饲料。

在本发明的一个方面，提供包含本发明的Bsp Man4多肽任一者的面包改良剂组合物，其中任选存在甘露聚糖或葡甘露聚糖或半乳甘露聚糖源，还任选存在其他酶。

一般说来，将含有植物材料的动物饲料在适合分解含甘露聚糖的聚合物的条件下在存在分离的Bsp Man4多肽或其片段或变体的情况下温育。

本发明的Bsp Man4多肽可用作非人类动物的饲料的添加剂。术语“非人类动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在具体实施例中，非反刍动物选自但不限于马和单胃动物，例如但不限于猪、家禽和鱼。在另外的实施例中，猪可以为但不限于仔猪、生长猪和母猪；家禽可以为但不限于火鸡、鸭子和鸡（包括但不限于肉仔鸡、蛋鸡）；鱼包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；甲壳纲动物包括但不限于小虾和对虾，如家禽和猪。在另一个实施例，非人类动物为反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和印度大羚羊。本发明的Bag Man1多肽也可用作添加剂。本发明的Bsp Man4多肽也可用于人类食物。在一些实施例中，将Bsp Man4多肽用于对饲料进行预处理而不是作为饲料添加剂。在一些优选的实施例中，将Bsp Man4多肽添加到断奶仔猪、保育猪、仔猪、肥育猪、生长猪、商品猪、产蛋鸡、肉仔鸡、火鸡的饲料中或用于对其进行预处理。在一些实施例中，将Bsp Man4多肽添加至得自植物材料的饲料中或用于对其进行预处理，所述植物材料为例如棕榈仁、椰子、魔芋、刺槐豆胶、瓜耳胶、大豆、大麦、燕麦、亚麻、小麦、玉米、亚麻籽、柑橘渣、棉籽、落花生、油菜籽、向日葵、豌豆和羽扇豆。

由于本发明的Bsp Man4多肽为热稳定的酶，因此它们可用在生产颗粒饲料的工艺中，其中向饲料混合物施加热量，然后再进行制粒步骤，而在大多数商业制粒机中正是如此。将Bsp Man4多肽在制粒步骤前添加到其他饲料成分中，或在制粒步骤后添加到已形成的饲料颗粒中。

在预期用于食物加工或作为饲料补充剂的含有所公开Bsp Man4多肽任一者的组合物中，组合物任选含有其他成分，如着色剂、芳香化合物、稳定剂、维生素、矿物质、其他饲料或食物增强酶等。这尤其适用于所谓的预混物。根据本发明的食物添加剂可与其他食物组分组合以生产加工食品。将所得的组合食物添加剂以合适的量与其他食物组分如谷类或植物蛋白混合，以形成加工食品。

因此，本发明涉及包含Bsp Man4多肽的动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食物。

本发明还涉及用于制备此类动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食物的方法，包括将Bsp Man4多肽与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物食物成分混合。

此外，本发明涉及Bsp Man4多肽在动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食物的制备中的用途。

在本发明的背景下，预期的是，术语“宠物食物”应理解为意指以下动物的食物：家庭动物，例如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、南美栗鼠、褐鼠、豚鼠；鸟类宠物，例如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行类宠物，例如乌龟、蜥蜴和蛇；以及水生宠物，例如热带鱼和青蛙。

术语“动物饲料组合物”、“饲料”、“草料”可互换使用并可包含一种或多种选自以下的饲料材料：a)谷类，如小粒谷物（例如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合）和/或大粒谷物（如玉蜀黍或高粱）；b)谷类副产品，如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)（尤其是玉米干酒糟及可溶物(cDDGS)）、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)得自诸如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉粉及骨粉、马铃薯蛋白、乳清、椰子核、芝麻之类的来源的蛋白质；d)得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。

VIIIa.用于发酵饮料如啤酒的Bsp Man4多肽

在本发明的多个方面，食物组合物或添加剂可以为液体或固体。

在本发明的一个方面，食物组合物为包含本发明的Bsp Man4多肽任一者的饮料，其包括但不限于发酵饮料，如啤酒和葡萄酒。

在本发明的背景下，术语“发酵饮料”意在包含通过包括发酵工艺如微生物发酵（例如细菌和/或酵母发酵）的方法生产的任何饮料。

在本发明的一个方面，发酵饮料为啤酒。术语“啤酒”意在包含通过含淀粉的植物材料的发酵/酿造生产的任何发酵麦芽汁(wort)。通常，啤酒由麦芽或辅助材料产生，或由麦芽和作为含淀粉植物材料的辅助材料的任何组合产生。如本文所用，术语“麦芽”应被理解为任何发芽的谷物，如发芽大麦或小麦。

如本文所用，术语“辅助材料”是指不是麦芽如大麦或小麦麦芽的任何含淀粉和/或糖的植物材料。作为辅助材料的例子，可以提及可用作淀粉源的材料，如普通玉米粉、精制玉米粉、酿酒用碾磨酵母、水稻、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘焙谷类、谷类薄片、裸麦、燕麦、马铃薯、木薯粉、木薯以及浆液，如玉米浆、甘蔗浆、转化糖浆、大麦和/或小麦浆等。

如本文所用，术语“麦芽浆(mash)”是指任何含有淀粉和/或糖的植物材料如碎麦芽（例如包括压碎的大麦芽、压碎的大麦）和/或其他辅助材料或它们的组合的含水浆液，随后与水混合以分离成麦芽汁和废谷物。

如本文所用，术语“麦芽汁”是指在制浆过程中提取碎麦芽后的未发酵液体流出物。

在另一方面，本发明涉及制备发酵饮料，如啤酒的方法，包括将本发明的Bsp Man4多肽的任一者与麦芽或辅助材料混合。

啤酒的例子包括：全麦芽啤酒、在“纯净法(Reinheitsgebot)”下酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒(Happoshu)（第二啤酒）、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性啤酒(stout)、麦芽酒、无酒精啤酒、无酒精麦芽酒等，但是还有备选的谷类和麦芽饮料，如水果味麦芽饮料，例如柑橘味如柠檬、甜橙、酸橙或浆果味麦芽饮料；酒味麦芽饮料，例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒；或咖啡味麦芽饮料，如咖啡因味麦芽酒，等等。

本发明的一个方面涉及根据本发明的Bsp Man4多肽的任一者在生产发酵饮料，如啤酒中的用途。

另一方面涉及提供发酵饮料的方法，包括将麦芽浆和/或麦芽汁与本发明的Bsp Man4多肽的任一者接触的步骤。

另一方面涉及提供发酵饮料的方法，包括以下步骤：(a)制备麦芽浆，(b)过滤麦芽浆得到麦芽汁，以及(c)使麦芽汁发酵得到发酵饮料，如啤酒，其中将Bsp Man4多肽的任一者添加至：(i)步骤(a)的麦芽浆中和/或(ii)步骤(b)的麦芽汁中和/或(iii)步骤(c)的麦芽汁中。

根据又一个方面，诸如啤酒之类的发酵饮料通过包括以下步骤的方法产生或提供：(1)将麦芽浆和/或麦芽汁与本发明的Bsp Man4多肽的任一者接触；和/或(2)(a)制备麦芽浆，(b)过滤麦芽浆得到麦芽汁，以及(c)使麦芽汁发酵得到发酵饮料，如啤酒，其中将Bsp Man4多肽的任一者添加至：(i)步骤(a)的麦芽浆中和/或(ii)步骤(b)的麦芽汁中和/或(iii)步骤(c)的麦芽汁中。

特定实施例涉及上述用途、方法或发酵饮料的任一者，其中所述发酵饮料为啤酒，如全麦芽啤酒、在“纯净法”下酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒（第二啤酒）、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒、无酒精麦芽酒等，但是还有备选的谷类和麦芽饮料，如水果味麦芽饮料，例如柑橘味如柠檬、甜橙、酸橙或浆果味麦芽饮料；酒味麦芽饮料，例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒；或咖啡味麦芽饮料，如咖啡因味麦芽酒，等等。

VIII.用于处理咖啡提取物的Bsp Man4多肽

本文所述的Bsp Man4多肽还可用于水解存在于液体咖啡提取物中的半乳甘露聚糖。在某些优选的实施例中，将Bsp Man4多肽用于抑制液体咖啡提取物冷冻干燥期间的凝胶形成。提取物降低的粘度可减少干燥期间的能量消耗。在某些其他优选的实施例中，将Bsp Man4多肽以固定化形式应用以便减少酶消耗并避免污染咖啡提取物。该用途在EP 676 145中有进一步公开。

一般说来，将咖啡提取物在适合水解存在于液体咖啡提取物中的半乳甘露聚糖的条件下在存在分离的Bsp Man4多肽或其片段或变体的情况下温育。

VIIIc用于烘焙食品的Bsp Man4多肽

在另一方面，本发明涉及制备烘焙产品的方法，包括将本发明的BspMan4多肽的任一者添加至生面团，然后烘焙生面团。烘焙产品的例子是本领域技术人员熟知的，并包括面包、面包卷、松饼、甜发酵面团、小圆面包、蛋糕、咸饼干、曲奇、饼干、华夫饼干、薄饼、玉米粉圆饼、早餐谷类食品、挤出产品等。

可将本发明的Bsp Man4多肽的任一者作为面包改良剂组合物的一部分添加至生面团中。面包改良剂是含有多种成分的组合物，这些成分可改善生面团的性质和烘焙产品（例如面包和蛋糕）的质量。通常在工业烘焙过程中添加面包改良剂，因为它们具有有益的效果，例如生面团稳定性和面包纹理和体积。面包改良剂通常含有脂肪和油以及添加剂，如乳化剂、酶、抗氧化剂、氧化剂、稳定剂和还原剂。除了本发明的Bsp Man4多肽的任一者外，还可存在于面包改良剂中的或者可与本发明的Bsp Man4多肽的任一者结合使用的其他酶包括淀粉酶、半纤维素酶、淀粉分解复合物、脂肪酶、蛋白酶、木聚糖酶、果胶酶、支链淀粉酶、非淀粉多糖降解酶和氧化还原酶，如葡萄糖氧化酶、脂氧合酶或抗坏血酸氧化酶。

在本发明的优选烘焙方面，可将本发明的Bsp Man4多肽的任一者作为面包改良剂组合物的一部分添加至生面团中，所述面包改良剂组合物还包含葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖源，如魔芋胶、瓜耳胶、刺槐豆胶（长角豆(Ceratonia siliqua)）、椰子核粉、象牙椰子(Phyteleohas macrocarpa)甘露聚糖、海藻甘露聚糖提取物、椰子粕和酿酒酵母细胞壁（可进行干燥，或以酿酒酵母提取物的形式使用）。其他可接受用于本发明的甘露聚糖衍生物包括非支链β-1,4-连接的甘露聚糖均聚物和甘露寡糖（甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖和甘露五糖）。本发明的Bsp Man4多肽的任一者与葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖和/或半乳葡甘露聚糖的组合可进一步改善生面团耐性、生面团柔韧性和生面团粘性、改善面包屑状结构以及延迟面包老化，并且甘露聚糖酶水解产物通过促进当以有利的种群密度存在于结肠中时通常与身体健康相关的乳酸菌的生长而作为可溶性益生元发挥作用。

本发明的另一方面涉及本发明的Bsp Man4多肽的任一者在生面团中的用途以改善生面团耐性、柔韧性和粘性。优选地，可向其中添加本发明的Bsp Man4多肽的任一者的生面团不是纯白面粉生面团，而是除了纯小麦面粉外或代替纯小麦面粉包含麸皮或燕麦、水稻、小米、玉蜀黍或豆粉。

本发明的另一方面涉及本发明的Bsp Man4多肽的任一者在生面团中的用途以改善屑状结构并延迟最终烘焙产品如面包的老化。

VIIIc用于乳制食品的Bsp Man4多肽

在本发明的一个方面，可将本发明的Bsp Man4多肽的任一者添加至还已加入了葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖的奶或任何其他乳制品中。典型的葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖来源在上文的烘焙方面列出，并包括瓜耳胶或魔芋胶。本发明的Bsp Man4多肽的任一者与葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖的组合可释放甘露聚糖酶水解产物（甘露寡糖），这些水解产物通过促进当以有利的种群密度存在于大肠或结肠中时通常与身体健康相关的益生菌（尤其是双歧杆菌(Bifidobacteria)和乳杆菌(Lactobacillus)乳酸菌）的选择性生长和增殖而作为可溶性益生元发挥作用。

在另一方面，本发明涉及制备奶或乳制品的方法，包括添加本发明的Bsp Man4多肽的任一者以及添加任何葡甘露聚糖或半乳甘露聚糖或半乳葡甘露聚糖。

在本发明的另一方面，将本发明的Bsp Man4多肽的任一者在添加到乳类食品之前或之后与任何葡甘露聚糖或半乳甘露聚糖组合使用，以产生含有益生元甘露聚糖水解产物的乳类食品。在本发明的另一方面，因而产生的含甘露寡糖的乳制品能够增加有益的人类肠道微生物群的群体，在本发明的又一个方面，乳类食品可包含与任何葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖和/或半乳葡甘露聚糖源一起的本发明Bsp Man4多肽的任一者，并且剂量足以接种已知在人类大肠中具有有益效果的细菌（如双歧杆菌或乳杆菌）的至少一种菌株。优选地，所述乳类食品为酸奶或乳饮料。

IX.用于纸浆漂白的Bsp Man4多肽

本文所述的Bsp Man4多肽还可用于纸浆（如化学纸浆、半化学纸浆、牛皮纸浆、机械纸浆或通过亚硫酸盐法制备的纸浆）的酶辅助漂白。一般说来，将纸浆在适合漂白纸浆的条件下与分离的Bsp Man4多肽或其片段或变体温育。

在一些实施例中，纸浆是用氧、臭氧、过氧化物或过氧酸漂白的无氯纸浆。在一些实施例中，将Bsp Man4多肽用于表现出具有低木质素含量的通过改良或连续制浆方法产生的纸浆的酶辅助漂白中。在一些其他实施例中，将Bsp Man4多肽单独地或优选与木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶相结合地应用。

Ｘ.用于降解增稠剂的Bsp Man4多肽

诸如瓜耳胶和刺槐豆胶之类的半乳甘露聚糖例如在食品和用于织物印花（如T恤印花）的印花色浆中被广泛用作增稠剂。因此，本文所述的Bsp Man4多肽还可用于降低含甘露聚糖的底物的稠度或粘度。在某些实施例中，将本文所述的Bsp Man4多肽用于降低加工设备中残余食物的粘度并因而有利于加工后的清洁。在某些其他实施例中，将所公开的Bsp Man4多肽用于降低印花色浆的粘度，从而有利于在织物印花后洗出多余的印花色浆。一般说来，将含有甘露聚糖的底物在适合降低含有甘露聚糖的底物的粘度的条件下与分离的Bsp Man4多肽或其片段或变体温育。

根据前面的描述和以下的实例，本发明组合物和方法的其他方面和实施例将显而易见。

实例

提供以下实例以论证和说明本发明的某些优选实施例和方面，而不应该理解为限制。

在以下实验公开中，采用以下缩写：M（摩尔/升）、mM（毫摩尔/升）、μM（微摩尔/升）、nM（纳摩尔/升）、mol（摩尔）、mmol（毫摩尔）、μmol（微摩尔）、nmol（纳摩尔）、g和gm（克）、mg（毫克）、μg（微克）、pg（皮克）、L（升）、ml和mL（毫升）、μl和μL（微升）、cm（厘米）、mm（毫米）、μm（微米）、nm（纳米）、U（单位）、MW（分子量）、s（秒）、min（分钟）、h（小时）、℃（摄氏度）、QS（足量）、ND（未进行）、rpm（转/分钟）、H₂O（水）、dH₂O（去离子水）、HCl（盐酸）、aa（氨基酸）、bp（碱基对）、kb（千碱基对）、kD（千道尔顿）、MgCl₂（氯化镁）、NaCl（氯化钠）、Ca（钙）、Mg（镁）、HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）、CHES（N-环己基-2-氨基乙磺酸）、w/v（重量与体积比）、v/v（体积比）、g（重力）、OD（光密度）、ppm（份每百万份）、m-（间）、o-（邻）、p-（对）、PAHBAH（对羟基苯甲酸酰肼）、Bsp Man4（芽孢杆菌甘露聚糖酶4）、SRI（污渍去除指数）和%SR（污渍去除百分比）。

实例1

芽孢杆菌SWT81糖基水解酶Bsp Man4的克隆

将芽孢杆菌SWT81选择作为可用于工业应用的各种糖基水解酶和其他酶的潜在来源。首先将芽孢杆菌SWT81在GAM琼脂板（Jones等人，IJSEM（《国际系统与进化微生物学杂志》），55:1711-1714,2005）上在37℃下培养24小时而获得用于测序的基因组DNA。将细胞材料从板上刮下并用于使用得自Zymo的ZF真菌/细菌DNA小量提取试剂盒（目录号D6005）制备基因组DNA。将基因组DNA用于基因组测序以及扩增用于表达克隆的Bsp Man4基因。将芽孢杆菌SWT81菌株的整个基因组用

边合成边测序(SBS)技术(www.baseclear.com/sequencing/illumina-sequencing/)进行测序。通过BaseClear（荷兰莱顿公司(Leiden,TheNetherlands)）进行基因组测序和序列数据的组装。通过BioXpr（比利时那慕尔公司(Namur,Belgium)）对重叠群(Contig)进行注释。以此方式在芽孢杆菌SWT81中鉴定的基因之一编码与多种其他细菌的甘露聚糖酶具有同源性的糖基水解酶，所述同源性通过BLAST搜索（Altschul等人，J MolBiol（《分子生物学杂志》），215:403–410,1990）确定。该基因（称为Bsp Man4基因）的序列如SEQ ID NO.1所示。Bsp Man4基因编码的蛋白如SEQ ID NO.2所示。在N端，通过设置于SignalP-NN系统（Emanuelsson等人，Nature Protocols（《自然-实验手册》），2:953-971,2007）的SignalP-3.0程序(www.cbs.dtu/services/SignalP)预测，Bsp Man4具有29个氨基酸的信号肽。这表明Bsp Man4是分泌的糖基水解酶。

Bsp Man4编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。预测的信号肽序列的编码区以斜体显示。

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由Bsp Man4基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。预测的信号肽以斜体显示。

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。

实例2

芽孢杆菌糖基水解酶(Bsp Man4)的表达

使用以下引物从芽孢杆菌的基因组DNA扩增Bsp Man4基因：引物1(BssHII)5’-TGAGCGCGCA GGCAGCTGGT AAATCACAAGAAGGGCGTCA ACT-3’(SEQ ID NO:3)和引物2(XhoI)5’-CGCCTCGAGTTACACTGTTT TTCTTCTTTT AT-3’(SEQ ID NO:4)。在用BssHII/XhoI消化后，将PCR产物克隆进用相同的限制酶消化的p2JM103BBI表达载体（Vogtentanz,Protein Expr Purif（《蛋白质表达及纯化》），55:40-52,2007）中。将该DNA片段连接至PCR扩增的编码Bsp Man4成熟蛋白的基因导致将编码枯草芽孢杆菌AprE前肽的核酸3’端的三个密码子添加至Bsp Man4成熟形式的编码区的5’端。将所得的质粒标记为pZQ186(aprE-Bsp Man4)。pZQ186的质粒图谱如图1所示。在宿主中进行天然信号肽酶裂解后，以此方式产生的重组Bsp Man4蛋白在其氨基末端具有三个额外的氨基酸(Ala-Gly-Lys)。通过DNA测序进行确认了Bsp Man4基因的序列(SEQ ID NO:5)。

使用之前所述的方法（Vogtentanz,Protein Expr Purif（《蛋白质表达及纯化》），55:40-52,2007）在枯草芽孢杆菌细胞中产生Bsp Man4蛋白。该蛋白分泌进细胞外培养基，将过滤后的培养基用于进行清洁测定法以及pH和温度曲线实验。剂量是基于使用Biorad蛋白质测定法(500-0006EDU)通过Bradford型测定法测定的总蛋白质，并针对通过得自美国伯乐公司(Bio-Rad)的Criterion无染料系统进行SDS-PAGE测得的纯度进行了校正。

在SDS-PAGE凝胶上对培养上清液进行的分析揭示了三个独立而不同的蛋白质条带，它们落在Bsp Man4的预期分子量范围内。将表达BspMan4的芽孢杆菌细胞的浓缩培养上清液用于使用三根层析柱进行纯化。将在20mM Tris(pH7.5)中缓冲的浓缩培养上清液上样至用20mM Tris(pH7.5)平衡的阴离子交换琼脂糖柱(Sepharose-Q FF,XK16/10)。使用平衡/洗涤缓冲液的线性梯度（至含有0.5M NaCl的20mM Tris,pH7.5缓冲液）从柱子中洗脱蛋白质。将汇集的样品调节至1M(NH₄)₂SO₄的最终浓度，然后上样至用20mM磷酸钠(pH6.0)、1M(NH₄)₂SO₄缓冲液平衡的疏水相互作用层析柱(HiLoad Phenyl HP,16/10)。使用平衡/洗涤缓冲液的线性梯度（至20mM磷酸钠pH6.0）从柱子中洗脱蛋白质。单独地收集均具有甘露聚糖酶活性的三个级分：约100kD(α)、70kD(β)和50kD(γ)。将每个级分上样至凝胶过滤HiLoad Superdex75pg26/60柱（对于50kD和70kD级分）或HiLoad Superdex200pg26/60柱（对于100kD级分），所用的流动相为含有0.15M NaCl的20mM磷酸钠(pH7.0)。将得自凝胶过滤柱的汇集样品浓缩得到纯化的蛋白质样品。

来自表达质粒pZQ186的Bsp Man4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。aprE信号序列以斜体显示。

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tggttttgtttttgtagggattggatttagtctatttatttataaaagaagaaaaacagtg。

从质粒pZQ186表达的Bsp Man4的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。信号序列以斜体显示，而三个氨基酸氨基末端延伸以粗体显示。

AGKSQEGRQLNMADEDASKYTK

ELFAFLQDVSGSQVLFGQQHATDEGLTLTNPAPRTGSTQSEVFNAVGDYP

AVFGWDTNSLDGREKPGIAGNVEQSIKNTAQSMKVAHDLGGIITLSMHP

DNFVTGGPYGDTTGNVVKEILPGGSKHAEFNAWLDNIAALAHELKDENG

EPIPMIFRPFHEQTGSWFWWGASTTSPEQYKAIFRYTVEYLRDVKGVNNI

LYGFSPGAGPAGDVNRYLETYPGDDYVDIFGIDNYDNKDNAGSEAWLSG

MVKDLAMISRLAEQKEKVAAFTEYGYSATGINRQGNTLDWYTRVLDAIA

ADEDARKISYMLTWANFGWPNNMYVPYRDIHNELGGDHELLPDFEAFH

ADDYTAFRDEIKGKIYNTGKEYTVSPHEPFMYVISPITGSTVTSETVTIQA

KVANDEHARVTFRVDGSSLEEEMVFNDDTLYYTGSFTPDAAVNGGAVD

VIVAYYSSGEKVQEETIRLFVKIPEMSLLTLTFDDDINGIKSNGTWPEDGV

TSEIDHAIVDGDGKLMFSVQGMSPTETWQELKLELTELSDVNIDAVKKM

KFDALIPAGSEEGSVQGIVQLPPDWETKYGMNETTKSIKDLETVTVNGSD

YKRLEVTVSIDNQGGATGIALSLVGSQLDLLEPVYIDNIELLNSFEAPPAD

SFLVDDFEGYFGDDTLLHRNYSSNGDPITLSLTSEFKNNGEFGLKYDYSIG

SMGYAGRQTSLGPVDWSGANAFEFWMKHGQLEGNHLTVQIRIGDVSFE

KNLELMDAHEGVVTIPFSEFAPAAWENKPGVIIDEQKLKRVSQFALYTGG

ARQSGTIYFDDLRAVYDESLPSVPVPKEEEEEKEVAPIIYHFESGIDNWEG

GQATHSNGHLKVTVRLGEGQQTEVKKTSNYNLTGYNYIVANIKHDDTG

MFGSDPLQVKIFTKAGGWVWADSGNQPIYSDDYTQVVYDITTLANKNA

VQEIGFEFLAPSGSSGTTNPFIDSVAIVTSLDQLSEQPEQPEQPGTPDTDDN

KEDKDRRNVEVNEEGQKLPKTATSIFNYLLIGFVFVGIGFSLFIYKRRKTV

。

Bsp Man4的成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。三个氨基酸N端延伸以粗体显示。

AGKSQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQDVSGSQVLFGQQHATDEGL

TLTNPAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWDTNSLDGREKPGIAGNVEQSI

KNTAQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGGPYGDTTGNVVKEILPGGSK

HAEFNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFRPFHEQTGSWFWWGASTTSP

EQYKAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPGAGPAGDVNRYLETYPGDDY

VDIFGIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLAMISRLAEQKEKVAAFTEYG

YSATGINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDARKISYMLTWANFGWPNNMY

VPYRDIHNELGGDHELLPDFEAFHADDYTAFRDEIKGKIYNTGKEYTVSP

HEPFMYVISPITGSTVTSETVTIQAKVANDEHARVTFRVDGSSLEEEMVFN

DDTLYYTGSFTPDAAVNGGAVDVIVAYYSSGEKVQEETIRLFVKIPEMSL

LTLTFDDDINGIKSNGTWPEDGVTSEIDHAIVDGDGKLMFSVQGMSPTET

WQELKLELTELSDVNIDAVKKMKFDALIPAGSEEGSVQGIVQLPPDWETK

YGMNETTKSIKDLETVTVNGSDYKRLEVTVSIDNQGGATGIALSLVGSQL

DLLEPVYIDNIELLNSFEAPPADSFLVDDFEGYFGDDTLLHRNYSSNGDPI

TLSLTSEFKNNGEFGLKYDYSIGSMGYAGRQTSLGPVDWSGANAFEFWM

KHGQLEGNHLTVQIRIGDVSFEKNLELMDAHEGVVTIPFSEFAPAAWENK

PGVIIDEQKLKRVSQFALYTGGARQSGTIYFDDLRAVYDESLPSVPVPKEE

EEEKEVAPIIYHFESGIDNWEGGQATHSNGHLKVTVRLGEGQQTEVKKTS

NYNLTGYNYIVANIKHDDTGMFGSDPLQVKIFTKAGGWVWADSGNQPIY

SDDYTQVVYDITTLANKNAVQEIGFEFLAPSGSSGTTNPFIDSVAIVTSLD

QLSEQPEQPEQPGTPDTDDNKEDKDRRNVEVNEEGQKLPKTATSIFNYLL

IGFVFVGIGFSLFIYKRRKTV。

基于天然存在的基因序列的Bsp Man4的成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

SQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQDVSGSQVLFGQQHATDEGLTLTN

PAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWDTNSLDGREKPGIAGNVEQSIKNT

AQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGGPYGDTTGNVVKEILPGGSKHAE

FNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFRPFHEQTGSWFWWGASTTSPEQY

KAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPGAGPAGDVNRYLETYPGDDYVDIF

GIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLAMISRLAEQKEKVAAFTEYGYSAT

GINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDARKISYMLTWANFGWPNNMYVPYR

DIHNELGGDHELLPDFEAFHADDYTAFRDEIKGKIYNTGKEYTVSPHEPF

MYVISPITGSTVTSETVTIQAKVANDEHARVTFRVDGSSLEEEMVFNDDT

LYYTGSFTPDAAVNGGAVDVIVAYYSSGEKVQEETIRLFVKIPEMSLLTL

TFDDDINGIKSNGTWPEDGVTSEIDHAIVDGDGKLMFSVQGMSPTETWQE

LKLELTELSDVNIDAVKKMKFDALIPAGSEEGSVQGIVQLPPDWETKYGM

NETTKSIKDLETVTVNGSDYKRLEVTVSIDNQGGATGIALSLVGSQLDLLE

PVYIDNIELLNSFEAPPADSFLVDDFEGYFGDDTLLHRNYSSNGDPITLSLT

SEFKNNGEFGLKYDYSIGSMGYAGRQTSLGPVDWSGANAFEFWMKHGQ

LEGNHLTVQIRIGDVSFEKNLELMDAHEGVVTIPFSEFAPAAWENKPGVII

DEQKLKRVSQFALYTGGARQSGTIYFDDLRAVYDESLPSVPVPKEEEEEK

EVAPIIYHFESGIDNWEGGQATHSNGHLKVTVRLGEGQQTEVKKTSNYN

LTGYNYIVANIKHDDTGMFGSDPLQVKIFTKAGGWVWADSGNQPIYSDD

YTQVVYDITTLANKNAVQEIGFEFLAPSGSSGTTNPFIDSVAIVTSLDQLSE

QPEQPEQPGTPDTDDNKEDKDRRNVEVNEEGQKLPKTATSIFNYLLIGFV

FVGIGFSLFIYKRRKTV。

实例3

Bsp Man4的pH曲线

使用得自美格兹密公司(Megazyme)的β-甘露聚糖酶片剂测定法（Tmnz1/02，天青精交联角豆半乳甘露聚糖）通过对建议的方案进行细微修改测定Bsp Man4的pH曲线。在pH值调节至4至11之间的50mm醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液中进行该测定法。将酶溶液稀释进测定缓冲液中，将500μl酶溶液在40℃下平衡然后添加一片底物。10分钟后，通过添加10ml2%Tris(pH12)停止反应。将管保持在室温下5分钟，搅拌，然后将液体滤过Whatman No.1滤纸。通过测量590nm处的光密度定量从底物释放的蓝色染料。各pH下的酶活性以相对活性报告，其中将最佳pH下的酶活性设为100%。Bsp Man4的pH曲线在图2A中示出。据发现，Bsp Man4具有约6.5的最佳pH，还发现，在6.0至8.5的pH下保留最大活性的70%以上。

通过使用β-甘露聚糖酶片剂测定法（爱尔兰美格兹密公司）在4至11范围内的变化pH下测定甘露聚糖酶活性，对Mannastar^TM的pH曲线进行了研究。10分钟后在OD590下监测各pH值下的水溶性染料片段的生成。通过将活性的最高OD值设为100并相对于最高OD值测定其他pH值下的活性绘制pH曲线图。Mannastar^TM的pH曲线在图2B中示出。据发现，Mannastar^TM在4至7.5之间的pH下保留最大活性的70%以上。

实例4

Bsp Man4的温度曲线

通过在50mM柠檬酸钠缓冲液(pH6)中测定20℃至75℃之间变化的温度下的甘露聚糖酶活性10分钟，测定了纯化的Bsp Man4的最适温度。酶活性以相对活性记录，其中将最适温度下的酶活性设为100%。Bsp Man4的温度曲线在图3A中示出。据发现，Bsp Man4具有约60℃的最适温度，还发现，在55℃至65℃之间的温度下保留最大活性的70%以上。

通过在50mM柠檬酸钠缓冲液(pH6)中使用β-甘露聚糖酶片剂测定法（爱尔兰美格兹密公司）测定至20℃至75℃范围内变化的温度下的甘露聚糖酶活性，研究了Mannastar^TM的温度曲线。10分钟后在OD590下监测各温度下的水溶性染料片段的生成。通过将活性的最高OD值设为100并相对于最高值测定其他温度下的活性绘制温度曲线。Mannastar^TM的温度曲线在图3B中示出。据发现，Mannastar^TM在55℃至75℃之间保留最大活性的70%以上。

实例5

Bsp Man4的甘露聚糖酶活性

Bsp Man4（EC号为3.2.1.78）属于CAZy号为GH26的糖基水解酶家族。通过SDS-PAGE鉴定了三种形式的Bsp Man4：α(MW～100kDa)、β(MW～70kDa)和γ(MW～50kDa)。含有γ形式的Bsp Man4的样品为包含不相关蛋白质的混合物，其中Bsp Man4以30%w/w存在。在PAHBAH测定法（Lever,Anal Biochem（《分析生物化学》），47:248,1972）中使用1%Megazyme低粘度角豆半乳甘露聚糖（爱尔兰美格兹密国际公司）作为底物测量了三种形式的Bsp Man4的β1-4甘露聚糖酶活性。测定在50mM醋酸钠(pH5)、0.005%Tween-80缓冲液中在50℃下进行10分钟，或在50mM HEPES pH8.2、0.005%Tween-80缓冲液中在30℃下进行30分钟。对各缓冲液产生利用甘露糖的标准曲线，并用于计算酶活性单位。酶比活性单位定义：将一个甘露聚糖酶单位定义为在测定法条件下每分钟生成1摩尔甘露糖还原糖当量所需的酶的量。图4A示出了在pH8.2下三种形式的Bsp Man4展示的甘露聚糖酶活性。图4B示出了在pH5.0下三种形式的Bsp Man4展示的甘露聚糖酶活性。

实例6

Bsp Man4及其片段的清洁性能

在Launder-O-meter LP-2（伊利诺伊州芝加哥阿特拉斯电子设备公司(Atlas Electric Devices Co.,Chicago,IL)）或等同设备中使用购自荷兰测试材料中心(Center for Testmaterials,The Netherlands)的CS-43（瓜耳胶）、CS-73（刺槐豆胶）和PCS-43（颜料沾污的瓜耳胶）样本测试了Bsp Man4的清洁性能。测试了与蛋白酶（

或

Prime）组合的Bsp Man4的清洁性能。将样本切成3cm×3cm大小，在Konica Minolta CR-400反射计上读取洗涤前的RGB值，将每种污渍类型（包括压载污垢共12g）的4个样本与6个不锈钢球一起加到各测试烧杯中。将水硬度调节至100ppm的最终浓度并用于稀释洗涤剂。将市售洗涤剂奥妙洁彩洗衣粉（联合利华公司(Unilever)）加热失活并以5.25g/L的剂量使用。市售的Small and Mighty生物液体洗涤剂（联合利华公司）不含酶，在不热失活的情况下以2.33g/L的剂量使用。将不同剂量（0.25、1和2.5ppm）的BspMan4与0.5ppm用于液体洗涤剂的

Prime或0.8ppm用于粉末洗涤剂的

一起加至各烧杯中。洗涤循环时间为40℃下45分钟。洗涤后，将样本取出，在冷自来水中漂洗5分钟，在洗衣机中甩干，然后平放在加温柜中干燥。将干燥的样本在室温下覆盖上深色布，然后通过用Konica Minolta CR-400反射计测量RGB值来评估污渍去除。使用RGB颜色值以每个样本清洁前后的RGB颜色测量差值计算污渍去除。1ppm Bsp Man4剂量的%SR读数在图5A和5B中示出。

通过SDS-PAGE鉴定了三种形式的Bsp Man4：α(MW～100kDa)、β(MW～70kDa)和γ(MW～50kDa)。含有γ形式的Bsp Man4的样品为包含不相关蛋白质的混合物，其中Bsp Man4以30%w/w存在。在Launder-O-meter LP-2（伊利诺伊州芝加哥阿特拉斯电子设备公司）或等同设备中使用购自荷兰测试材料中心的CS-43（瓜耳胶）或CS-73（刺槐豆胶）样本测试了三种形式的Bsp Man4的清洁性能。测试了与蛋白酶（或

Prime）加上淀粉酶（如WO2010/115021中所述的ACEprime或）相组合的该蛋白质的清洁性能。将样本切成3cm×3cm大小，在Konica Minolta CR-400反射计上读取洗涤前的RGB值，将每种污渍类型（包括压载污垢共12g）的4个样本与6个不锈钢球一起加到各测试烧杯中。将水硬度调节至100ppm的最终浓度。将市售洗涤剂奥妙洁彩洗衣粉（联合利华公司）加热失活并以在50mM CAPS缓冲液(pH10.0)中稀释的5.25g/L的剂量使用。市售的Persil Small and Mighty生物液体洗涤剂（联合利华公司）不含酶，在不热失活的情况下以在50mM HEPES缓冲液(pH8.2)中稀释的2.33g/L的剂量使用。将不同剂量（0.25、0.5、1和2.5ppm）的Bsp Man4片段连同用于液体洗涤剂的0.5ppmPrime和0.1ppm ACE prime以及用于粉末洗涤剂的0.8ppm

和0.2ppm

一起加至各烧杯中。洗涤循环时间为40℃下45分钟。洗涤后，将样本取出，在冷自来水中漂洗5分钟，在洗衣机中甩干，然后平放在加温柜中干燥。将干燥的样本在室温下覆盖上深色布，然后通过用Konica Minolta CR-400反射计测量RGB值来评估污渍去除。0.25ppm Bsp Man4片段的%SR读数在图6A（奥妙洁彩洗衣粉）和6B（Persil Small&Mighty液体洗涤剂）中示出。

实例7

Bsp Man4与其他甘露聚糖酶的比较

A.同源甘露聚糖酶的鉴定

将Bsp Man4(SEQ ID NO:8)的成熟形式的氨基酸序列用作查询序列，通过对NCBI非冗余蛋白质数据库(nr)进行BLAST搜索（Altschul等人，Nucleic Acids Res.（《核酸研究》）25:3389-402,1997）鉴别同源物。只保留百分比同一性为40%或更高的序列。百分比同一性(PID)定义为逐对比对中相同残基的数目除以所比对的残基数目。表7-1提供了经鉴定与BspMan4的百分比同一性为40%或更高的序列的列表。表7-1提供了各同源物的NCBI和序列标识号，以及各序列的长度（氨基酸数）；还有PID（百分比同一性）。

B.同源甘露聚糖酶序列的比对

使用CLUSTALW软件（Thompson等人，Nucleic Acids Res（《核酸研究》），22:4673-4680,1994），采用默认参数对Bsp Man4和所选同源物的序列进行多重比对。将比对用MUSCLE（MUltiple SequenceComparison by Log-Expectation，Edgar,Nucleic Acids Res（《核酸研究》），32:1792-1797,2004），采用默认参数进行精修。对于同源序列，仅显示对应于种子序列的区域。PID为98%或更高的冗余序列不包括在进一步分析中。图7示出了Bsp Man4与同源甘露聚糖酶的比对。

C.系统树

基于上述精修比对，使用自展值(bootstrap)为10000的ClustalW软件用Neighbor-Joining算法建立Bsp Man4的系统树。将自展法用于评估树分支的可靠性（Felsenstein,Evolution（《进化》）39:783-791,1985）。将其他ClustalW参数设为默认值。使用www.phylowidget.org的程序PhyloWidget：web-based visualizations for the tree of life，网址为www.phylowidget.org（Jordan和Piel,Bioinformatics（《生物信息学》），24:1641-1642,2008）。Bsp Man4的系统树在图8中示出。

表7-1：与SEQ ID NO:8的成熟形式的百分比同一性为40或更高的 Bsp Man4同源物的列表

表7-2：与SEQ ID NO:9的催化结构域（296个残基）的百分比同一性 为40或更高的Bsp Man4同源物的列表

同源物	长度	PID(%)
			US6566114-0010	586	83.4
ZP_06365324	1121	70.8
			BAE80444	997	67.2
ZP_06625371	854	66.9
			AAT42241	510	64.9
Gte Man1	294	61.6
			YP_003850806	1410	55.3
ZP_06922280	786	51
			YP_003487354	667	51
2BVT_A	475	50.2

实例8

Bsp Man4的功能结构域的预测

使用NCBI网站的保守结构域搜索服务(Conserved Domain SearchService,CD Search)工具，用BLAST结果列表中的参考序列确定Bsp Man4的功能结构域如催化区和碳水化合物结合结构域的位置。CD-Search使用RPS-BLAST（反向位置特异性BLAST(Reverse Position-Specific BLAST)）针对已由存在于保守结构域数据库(CDD)中的保守结构域比对而准备的位置特异性评分矩阵来比较查询序列。CD-Search的结果作为注释蛋白质结构域显示在用户查询序列上。将同源物D2M1G9的蛋白质序列（TrEMBL，以前称为NCBI ZP_06365324）输入CD Search工具以鉴别Bsp Man4的催化结构域和碳水化合物结合结构域。D2M1G9的氨基酸序列与Bsp Man4具有54.2%同一性。

通过AlignX within Vector NTI（英杰公司）使用ClustalW比对预测功能结构域。基于与D2M1G9的比对，Bsp Man4的催化结构域预测为长296个氨基酸，从位置D11开始并以位置W306结束。结合模块CBM27预测为长161个氨基酸，从位置L493开始并以位置L653结束。结合模块CBM11预测为长160个氨基酸，从位置L666开始并以位置R825结束。糖类结合模块家族分类的完整描述可见于CAZy碳水化合物活性酶数据库(www.cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.html)。利用描述粪碱纤维单胞菌CfMan26A结构的参考文献（Le Nours等人，Biochemistry（《生物化学》）44:12700-8,2005），Bsp Man4的催化残基预测为位于E179和E289。所有位置均从成熟蛋白质序列的起点计算。图9示出了BspMan4的功能结构域。

Bsp Man4的催化结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示：

DEDASKYTKELFAFLQDVSGSQVLFGQQHATDEGLTLTNPAPRTGSTQSE

VFNAVGDYPAVFGWDTNSLDGREKPGIAGNVEQSIKNTAQSMKVAHDL

GGIITLSMHPDNFVTGGPYGDTTGNVVKEILPGGSKHAEFNAWLDNIAAL

AHELKDENGEPIPMIFRPFHEQTGSWFWWGASTTSPEQYKAIFRYTVEYL

RDVKGVNNILYGFSPGAGPAGDVNRYLETYPGDDYVDIFGIDNYDNKDN

AGSEAWLSGMVKDLAMISRLAEQKEKVAAFTEYGYSATGINRQGNTLD

W。

接着，通过将Bsp Man4的氨基酸序列穿线(threading)到粪碱纤维单胞菌甘露聚糖酶的三维结构上建立Bsp Man4的同源模型。使用由加拿大魁北克蒙特利尔的化学计算基团公司(Chemical Computing Group Inc.,Montreal,Quebec,Canada)提供的程序包“MOE”完成构建同源模型的以下步骤。第一步涉及使用Bsp Man4的蛋白质序列搜索蛋白质数据库(www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中已知结构的同源序列。从该搜索中，鉴定了粪碱纤维单胞菌甘露聚糖酶（pdb登录号为2X2Y），据发现，2X2Y与Bsp Man4之间的具有40.4%的同一性。下一步涉及将Bsp Man4的序列穿线到粪碱纤维单胞菌甘露聚糖酶的已知序列的相关元件上。穿线过程本身包括若干限制。一个这样的限制涉及保持保守残基的主链和侧链结构相同。另一个限制涉及保持主链原子固定，而搜索模型内与相邻原子的整体最相容的非保守残基的替换侧链的旋转异构体。当插入残基时，将环状结构文库用于对可能的插入建模。将整个穿线过程重复10次，从而可能选择不同的旋转异构体。使所有的模型均接受有限能量最小化，然后选择具有最低能量的模型。下面示出了基于同源模型的Bsp Man4的截短物种的氨基酸序列。

Bsp Man4的截短物种1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

RQLNMADEDASKYTKELFAFLQDVSGSQVLFGQQHATDEGLTLTNPAPR

TGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWDTNSLDGREKPGIAGNVEQSIKNTAQSM

KVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGGPYGDTTGNVVKEILPGGSKHAEFNAW

LDNIAALAHELKDENGEPIPMIFRPFHEQTGSWFWWGASTTSPEQYKAIF

RYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPGAGPAGDVNRYLETYPGDDYVDIFGID

NYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLAMISRLAEQKEKVAAFTEYGYSATGIN

RQGNTLDWYTRVLDAIAADEDARKISYMLTWANFGWPNNMYVPYRDIH

NELGGDHELLPDFEAFHADDYTAFRDEIKGKIYNTGKEYTVSPHEPFMYV

ISPITGSTVTSETVTIQAKVANDEHARVTFRVDGSSLEEEMVFNDDTLYYT

GSFTPDAAVNGGAVDVIVAYYSSGEK。

Bsp Man4的截短物种2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

RQLNMADEDASKYTKELFAFLQDVSGSQVLFGQQHATDEGLTLTNPAPR

TGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWDTNSLDGREKPGIAGNVEQSIKNTAQSM

KVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGGPYGDTTGNVVKEILPGGSKHAEFNAW

LDNIAALAHELKDENGEPIPMIFRPFHEQTGSWFWWGASTTSPEQYKAIF

RYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPGAGPAGDVNRYLETYPGDDYVDIFGID

NYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLAMISRLAEQKEKVAAFTEYGYSATGIN

RQGNTLDWYTRVLDAIAADEDARKISYMLTWANFGWPNNMYVPYRDIH

NELGGDHELLPDFEAFHADDYTAFRDEIKGKIYNTGKEYTV。

此外，通过埃德曼降解和质谱测定了重组Bsp Man4的α、β和γ形式的氨基酸序列。

Bsp Man4的α形式包含SEQ ID NO:7的残基1-849。Bsp Man4的α形式的氨基酸序列（通过SDS-PAGE测得的分子量为约100kDa，或通过质谱测得的分子量为约94kDa）如SEQ ID NO:12所示。

AGKSQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQDVSGSQVLFGQQHATDEGL

TLTNPAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWDTNSLDGREKPGIAGNVEQSI

KNTAQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGGPYGDTTGNVVKEILPGGSK

HAEFNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFRPFHEQTGSWFWWGASTTSP

EQYKAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPGAGPAGDVNRYLETYPGDDY

VDIFGIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLAMISRLAEQKEKVAAFTEYG

YSATGINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDARKISYMLTWANFGWPNNMY

VPYRDIHNELGGDHELLPDFEAFHADDYTAFRDEIKGKIYNTGKEYTVSP

HEPFMYVISPITGSTVTSETVTIQAKVANDEHARVTFRVDGSSLEEEMVFN

DDTLYYTGSFTPDAAVNGGAVDVIVAYYSSGEKVQEETIRLFVKIPEMSL

LTLTFDDDINGIKSNGTWPEDGVTSEIDHAIVDGDGKLMFSVQGMSPTET

WQELKLELTELSDVNIDAVKKMKFDALIPAGSEEGSVQGIVQLPPDWETK

YGMNETTKSIKDLETVTVNGSDYKRLEVTVSIDNQGGATGIALSLVGSQL

DLLEPVYIDNIELLNSFEAPPADSFLVDDFEGYFGDDTLLHRNYSSNGDPI

TLSLTSEFKNNGEFGLKYDYSIGSMGYAGRQTSLGPVDWSGANAFEFWM

KHGQLEGNHLTVQIRIGDVSFEKNLELMDAHEGVVTIPFSEFAPAAWENK

PGVIIDEQKLKRVSQFALYTGGARQSGTIYFDDLRAVYDESLPSVPVPKEE

EEEKE。

Bsp Man4的β形式包含SEQ ID NO:7的残基1-669。Bsp Man4的β形式的氨基酸序列（通过SDS-PAGE测得的分子量为约70kDa，或通过质谱测得的分子量为约74kDa）如SEQ ID NO:13所示。

AGKSQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQDVSGSQVLFGQQHATDEGL

TLTNPAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWDTNSLDGREKPGIAGNVEQSI

KNTAQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGGPYGDTTGNVVKEILPGGSK

HAEFNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFRPFHEQTGSWFWWGASTTSP

EQYKAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPGAGPAGDVNRYLETYPGDDY

VDIFGIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLAMISRLAEQKEKVAAFTEYG

YSATGINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDARKISYMLTWANFGWPNNMY

VPYRDIHNELGGDHELLPDFEAFHADDYTAFRDEIKGKIYNTGKEYTVSP

HEPFMYVISPITGSTVTSETVTIQAKVANDEHARVTFRVDGSSLEEEMVFN

DDTLYYTGSFTPDAAVNGGAVDVIVAYYSSGEKVQEETIRLFVKIPEMSL

LTLTFDDDINGIKSNGTWPEDGVTSEIDHAIVDGDGKLMFSVQGMSPTET

WQELKLELTELSDVNIDAVKKMKFDALIPAGSEEGSVQGIVQLPPDWETK

YGMNETTKSIKDLETVTVNGSDYKRLEVTVSIDNQGGATGIALSLVGSQL

DLLEPVYIDNIELLNSFEAPPADSFL。

Bsp Man4的γ形式包含SEQ ID NO:7的残基1-494。Bsp Man4的γ形式的氨基酸序列（通过SDS-PAGE测得的分子量为约50kDa，或通过质谱测得的分子量为约54kDa）如SEQ ID NO:14所示。

AGKSQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQDVSGSQVLFGQQHATDEGL

TLTNPAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWDTNSLDGREKPGIAGNVEQSI

KNTAQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGGPYGDTTGNVVKEILPGGSK

HAEFNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFRPFHEQTGSWFWWGASTTSP

EQYKAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPGAGPAGDVNRYLETYPGDDY

VDIFGIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLAMISRLAEQKEKVAAFTEYG

YSATGINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDARKISYMLTWANFGWPNNMY

VPYRDIHNELGGDHELLPDFEAFHADDYTAFRDEIKGKIYNTGKEYTVSP

HEPFMYVISPITGSTVTSETVTIQAKVANDEHARVTFRVDGSSLEEEMVFN

DDTLYYTGSFTPDAAVNGGAVDVIVAYYSSGEKVQEETIRLFVKIPEMS

。

在另外的实施例中，提供了的Bsp Man4的另外的截短形式。一种形式包含SEQ ID NO:8的残基1至350，另一种形式包含SEQ ID NO:8的残基1至475，另一种形式包含SEQ ID NO:8的残基1至675，而另一种形式包含SEQ ID NO:8的残基1至850（如下所述）。

实例9

芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4变体的克隆

通过PCR从芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4野生型质粒DNA pZQ186(aprE-Bsp Man4)获得不同长度的芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4变体。基于芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4全长基因序列和Bsp Man4Pfam结构域结构设计引物（The Pfam protein families database（Pfam蛋白家族数据库）:M.Punta,P.C.Coggill,R.Y.Eberhardt,J.Mistry,J.Tate,C.Boursnell,N.Pang,K.Forslund,G.Ceric,J.Clements,A.Heger,L.Holm,E.L.L.Sonnhammer,S.R.Eddy,A.Bateman,R.D.Finn,Nucleic Acids Research（《核酸研究》）(2012)Database Issue40:D290-D301）。截短的示意图可见于图10。该研究中所用的引物为：For：5’-ACTAGCCGACTAGTTCACAAGAAGGGCGTCAACTTAAC-3’(SEQ IDNO:25)，v1_Rev：5’-CTTACGGGCTCGAGTTAACCTAATTCATTGTGGATATCACG-3’(SEQ ID NO:26)，v2_Rev：5’-CTTACGGGCTCGAGTTATTGGACTTTTTCTCCACTAGAATAATAAG-3’(SEQ IDNO:27)，v3_Rev：5’-CTTACGGGCTCGAGTTACCCAAAATAACCTTCAAAATCATC-3’(SEQ ID NO:28)，v4_Rev：5’-CTTACGGGCTCGAGTTAAATAGGAGCGACCTCTTTTTCCTCTTC-3’(SEQ ID NO:29)。PCR引物包含Spe I限制酶位点和Xho I限制酶位点用于克隆目的。使用热循环仪采用KOD-plus聚合酶(TOYOBA)根据制造商的说明（58℃的退火温度）进行PCR。通过测序分析确认PCR产物的核酸序列。

将PCR产物用Spe I和Xho I（纽英伦生物技术公司(New EnglandBiolabs)）消化，然后连接进表达载体p2JM中。根据制造商方案（生命科技公司(Life Technology)）将连接混合物转化进大肠杆菌TOP10化学感受态细胞中。然后将转化的细胞涂布接种至Luria Broth琼脂板上，通过50ppm氨苄青霉素抗生素进行选择，在37℃下温育过夜。通过测序分析确认含有正确插入物的阳性克隆。

芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4v1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示。

TCACAAGAAGGGCGTCAACTTAACATGGCAGATGAGGATGCTTCAAA

GTATACGAAGGAGTTATTTGCTTTTCTTCAAGATGTAAGTGGTTCACA

AGTGTTATTTGGACAACAGCATGCAACAGATGAAGGATTAACTTTAAC

AAATCCAGCTCCAAGAACAGGTTCCACTCAATCTGAAGTTTTCAATGC

AGTTGGGGATTATCCAGCTGTGTTTGGATGGGACACGAATAGCCTAGA

TGGTCGTGAAAAGCCTGGCATTGCAGGTAATGTAGAACAAAGTATAA

AAAATACGGCTCAGTCCATGAAAGTGGCTCATGATTTAGGAGGGATT

ATTACACTAAGCATGCACCCAGATAATTTTGTAACAGGGGGTCCTTAT

GGTGATACAACAGGGAATGTTGTAAAAGAAATTCTTCCAGGTGGATC

AAAACATGCAGAGTTTAACGCGTGGTTGGACAATATTGCTGCGCTTGC

TCACGAGCTGAAAGATGAGAATGGTGAACCTATTCCGATGATTTTTCG

GCCATTCCATGAACAAACAGGATCTTGGTTTTGGTGGGGAGCAAGCA

CAACTTCACCCGAACAATATAAAGCGATTTTTCGTTATACAGTAGAAT

ATTTGCGAGATGTTAAAGGCGTAAATAATATTTTATATGGCTTTTCAC

CTGGGGCGGGACCTGCTGGAGATGTAAATCGCTATTTAGAAACATATC

CAGGGGATGATTACGTTGATATTTTCGGTATTGACAATTATGACAATA

AAGACAATGCAGGGTCAGAAGCTTGGTTAAGTGGTATGGTCAAAGAC

TTGGCGATGATTAGCCGATTAGCTGAACAAAAAGAAAAAGTAGCGGC

TTTTACTGAGTATGGGTACAGTGCAACCGGAATTAATCGTCAAGGGAA

TACATTAGACTGGTACACACGTGTATTAGATGCGATTGCTGCTGATGA

AGACGCACGTAAAATATCATACATGTTGACATGGGCGAACTTTGGTTG

GCCGAATAATATGTATGTTCCTTATCGTGATATCCACAATGAATTAGG

TTAA(SEQ ID NO:30)

芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4v1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示。信号肽以斜体和小写字母显示。在芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4v1的信号肽与第一密码子之间存在一个引入的限制酶位点，其以小写字母和下划线显示。

tsSQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQDVS

GSQVLFGQQHATDEGLTLTNPAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWDTNS

LDGREKPGIAGNVEQSIKNTAQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGGPYG

DTTGNVVKEILPGGSKHAEFNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFRPFH

EQTGSWFWWGASTTSPEQYKAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPGAGP

AGDVNRYLETYPGDDYVDIFGIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLAMIS

RLAEQKEKVAAFTEYGYSATGINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDARKIS

YMLTWANFGWPNNMYVPYRDIHNELG(SEQ ID NO:31)

Bsp Man4v1的成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示。

SQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQDVSGSQVLFGQQHATDEGLTLTN

PAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWDTNSLDGREKPGIAGNVEQSIKNT

AQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGGPYGDTTGNVVKEILPGGSKHAE

FNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFRPFHEQTGSWFWWGASTTSPEQY

KAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPGAGPAGDVNRYLETYPGDDYVDIF

GIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLAMISRLAEQKEKVAAFTEYGYSAT

GINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDARKISYMLTWANFGWPNNMYVPYR

DIHNELG(SEQ ID NO:32)

芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4v2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示。

TCACAAGAAGGGCGTCAACTTAACATGGCAGATGAGGATGCTTCAAA

GTATACGAAGGAGTTATTTGCTTTTCTTCAAGATGTAAGTGGTTCACA

AGTGTTATTTGGACAACAGCATGCAACAGATGAAGGATTAACTTTAAC

AAATCCAGCTCCAAGAACAGGTTCCACTCAATCTGAAGTTTTCAATGC

AGTTGGGGATTATCCAGCTGTGTTTGGATGGGACACGAATAGCCTAGA

TGGTCGTGAAAAGCCTGGCATTGCAGGTAATGTAGAACAAAGTATAA

AAAATACGGCTCAGTCCATGAAAGTGGCTCATGATTTAGGAGGGATT

ATTACACTAAGCATGCACCCAGATAATTTTGTAACAGGGGGTCCTTAT

GGTGATACAACAGGGAATGTTGTAAAAGAAATTCTTCCAGGTGGATC

AAAACATGCAGAGTTTAACGCGTGGTTGGACAATATTGCTGCGCTTGC

TCACGAGCTGAAAGATGAGAATGGTGAACCTATTCCGATGATTTTTCG

GCCATTCCATGAACAAACAGGATCTTGGTTTTGGTGGGGAGCAAGCA

CAACTTCACCCGAACAATATAAAGCGATTTTTCGTTATACAGTAGAAT

ATTTGCGAGATGTTAAAGGCGTAAATAATATTTTATATGGCTTTTCAC

CTGGGGCGGGACCTGCTGGAGATGTAAATCGCTATTTAGAAACATATC

CAGGGGATGATTACGTTGATATTTTCGGTATTGACAATTATGACAATA

AAGACAATGCAGGGTCAGAAGCTTGGTTAAGTGGTATGGTCAAAGAC

TTGGCGATGATTAGCCGATTAGCTGAACAAAAAGAAAAAGTAGCGGC

TTTTACTGAGTATGGGTACAGTGCAACCGGAATTAATCGTCAAGGGAA

TACATTAGACTGGTACACACGTGTATTAGATGCGATTGCTGCTGATGA

AGACGCACGTAAAATATCATACATGTTGACATGGGCGAACTTTGGTTG

GCCGAATAATATGTATGTTCCTTATCGTGATATCCACAATGAATTAGG

TGGAGACCATGAGTTATTACCGGACTTTGAAGCTTTCCATGCGGATGA

CTACACAGCATTTCGAGATGAGATAAAAGGAAAGATATATAATACTG

GAAAGGAATATACCGTTTCTCCTCATGAGCCGTTTATGTATGTTATATC

TCCGATTACAGGTTCTACAGTGACAAGCGAAACGGTAACAATCCAAG

CAAAAGTAGCGAATGACGAACACGCAAGAGTCACTTTCAGGGTCGAT

GGTTCTAGTTTGGAAGAAGAAATGGTTTTCAATGATGACACTTTATAT

TATACAGGTTCTTTTACACCAGATGCAGCAGTGAATGGCGGAGCTGTT

GATGTGATTGTAGCTTATTATTCTAGTGGAGAAAAAGTCCAATAA

(SEQ ID NO:33)

芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4v2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。信号肽以斜体和小写字母显示。在芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4v2的信号肽与第一密码子之间存在一个引入的限制酶位点，其以小写字母和下划线显示。

tsSQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQDVS

GSQVLFGQQHATDEGLTLTNPAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWDTNS

LDGREKPGIAGNVEQSIKNTAQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGGPYG

DTTGNVVKEILPGGSKHAEFNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFRPFH

EQTGSWFWWGASTTSPEQYKAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPGAGP

AGDVNRYLETYPGDDYVDIFGIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLAMIS

RLAEQKEKVAAFTEYGYSATGINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDARKIS

YMLTWANFGWPNNMYVPYRDIHNELGGDHELLPDFEAFHADDYTAFRD

EIKGKIYNTGKEYTVSPHEPFMYVISPITGSTVTSETVTIQAKVANDEHAR

VTFRVDGSSLEEEMVFNDDTLYYTGSFTPDAAVNGGAVDVIVAYYSSGE

KVQ(SEQ ID NO:34)

Bsp Man4v2的成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示。

SQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQDVSGSQVLFGQQHATDEGL

TLTNPAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWDTNSLDGREKPGIAGNVEQSI

KNTAQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGGPYGDTTGNVVKEILPGGSK

HAEFNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFRPFHEQTGSWFWWGASTTSP

EQYKAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPGAGPAGDVNRYLETYPGDDY

VDIFGIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLAMISRLAEQKEKVAAFTEYG

YSATGINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDARKISYMLTWANFGWPNNMY

VPYRDIHNELGGDHELLPDFEAFHADDYTAFRDEIKGKIYNTGKEYTVSP

HEPFMYVISPITGSTVTSETVTIQAKVANDEHARVTFRVDGSSLEEEMVFN

DDTLYYTGSFTPDAAVNGGAVDVIVAYYSSGEKVQ(SEQ ID NO:35)

芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4v3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示。

TCACAAGAAGGGCGTCAACTTAACATGGCAGATGAGGATGCTTCAAA

GTATACGAAGGAGTTATTTGCTTTTCTTCAAGATGTAAGTGGTTCACA

AGTGTTATTTGGACAACAGCATGCAACAGATGAAGGATTAACTTTAAC

AAATCCAGCTCCAAGAACAGGTTCCACTCAATCTGAAGTTTTCAATGC

AGTTGGGGATTATCCAGCTGTGTTTGGATGGGACACGAATAGCCTAGA

TGGTCGTGAAAAGCCTGGCATTGCAGGTAATGTAGAACAAAGTATAA

AAAATACGGCTCAGTCCATGAAAGTGGCTCATGATTTAGGAGGGATT

ATTACACTAAGCATGCACCCAGATAATTTTGTAACAGGGGGTCCTTAT

GGTGATACAACAGGGAATGTTGTAAAAGAAATTCTTCCAGGTGGATC

AAAACATGCAGAGTTTAACGCGTGGTTGGACAATATTGCTGCGCTTGC

TCACGAGCTGAAAGATGAGAATGGTGAACCTATTCCGATGATTTTTCG

GCCATTCCATGAACAAACAGGATCTTGGTTTTGGTGGGGAGCAAGCA

CAACTTCACCCGAACAATATAAAGCGATTTTTCGTTATACAGTAGAAT

ATTTGCGAGATGTTAAAGGCGTAAATAATATTTTATATGGCTTTTCAC

CTGGGGCGGGACCTGCTGGAGATGTAAATCGCTATTTAGAAACATATC

CAGGGGATGATTACGTTGATATTTTCGGTATTGACAATTATGACAATA

AAGACAATGCAGGGTCAGAAGCTTGGTTAAGTGGTATGGTCAAAGAC

TTGGCGATGATTAGCCGATTAGCTGAACAAAAAGAAAAAGTAGCGGC

TTTTACTGAGTATGGGTACAGTGCAACCGGAATTAATCGTCAAGGGAA

TACATTAGACTGGTACACACGTGTATTAGATGCGATTGCTGCTGATGA

AGACGCACGTAAAATATCATACATGTTGACATGGGCGAACTTTGGTTG

GCCGAATAATATGTATGTTCCTTATCGTGATATCCACAATGAATTAGG

TGGAGACCATGAGTTATTACCGGACTTTGAAGCTTTCCATGCGGATGA

CTACACAGCATTTCGAGATGAGATAAAAGGAAAGATATATAATACTG

GAAAGGAATATACCGTTTCTCCTCATGAGCCGTTTATGTATGTTATATC

TCCGATTACAGGTTCTACAGTGACAAGCGAAACGGTAACAATCCAAG

CAAAAGTAGCGAATGACGAACACGCAAGAGTCACTTTCAGGGTCGAT

GGTTCTAGTTTGGAAGAAGAAATGGTTTTCAATGATGACACTTTATAT

TATACAGGTTCTTTTACACCAGATGCAGCAGTGAATGGCGGAGCTGTT

GATGTGATTGTAGCTTATTATTCTAGTGGAGAAAAAGTCCAAGAAGAA

ACAATTCGTTTATTTGTAAAAATTCCTGAAATGTCTTTGTTAACATTAA

CGTTTGATGATGATATAAACGGAATCAAAAGCAATGGAACATGGCCT

GAAGATGGTGTAACATCTGAAATTGACCACGCTATTGTAGATGGAGA

CGGCAAGTTGATGTTCTCTGTTCAAGGAATGTCACCTACTGAAACATG

GCAAGAGCTCAAGTTAGAATTAACAGAACTATCAGATGTGAACATTG

ATGCGGTTAAGAAAATGAAGTTTGACGCGCTTATCCCAGCAGGTAGTG

AAGAAGGTTCAGTCCAAGGAATCGTACAACTTCCACCGGATTGGGAG

ACGAAATATGGGATGAATGAAACAACGAAGTCAATAAAAGACTTAGA

GACTGTTACTGTTAATGGAAGCGATTATAAACGGTTGGAAGTGACTGT

TTCTATCGACAATCAAGGAGGAGCTACAGGAATCGCTTTATCATTAGT

AGGATCCCAACTCGATTTGTTAGAACCTGTCTACATCGATAATATTGA

ACTTCTAAATTCCTTTGAAGCACCACCAGCAGATTCTTTTCTTGTTGAT

GATTTTGAAGGTTATTTTGGGTAA(SEQ ID NO:36)

芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4v3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示。信号肽以斜体和小写字母显示。在芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4v3的信号肽与第一密码子之间存在一个引入的限制酶位点，其以小写字母和下划线显示。

tsSQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQ

DVSGSQVLFGQQHATDEGLTLTNPAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWD

TNSLDGREKPGIAGNVEQSIKNTAQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGG

PYGDTTGNVVKEILPGGSKHAEFNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFR

PFHEQTGSWFWWGASTTSPEQYKAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPG

AGPAGDVNRYLETYPGDDYVDIFGIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLA

MISRLAEQKEKVAAFTEYGYSATGINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDAR

KISYMLTWANFGWPNNMYVPYRDIHNELGGDHELLPDFEAFHADDYTA

FRDEIKGKIYNTGKEYTVSPHEPFMYVISPITGSTVTSETVTIQAKVANDE

HARVTFRVDGSSLEEEMVFNDDTLYYTGSFTPDAAVNGGAVDVIVAYYS

SGEKVQEETIRLFVKIPEMSLLTLTFDDDINGIKSNGTWPEDGVTSEIDHAI

VDGDGKLMFSVQGMSPTETWQELKLELTELSDVNIDAVKKMKFDALIPA

GSEEGSVQGIVQLPPDWETKYGMNETTKSIKDLETVTVNGSDYKRLEVT

VSIDNQGGATGIALSLVGSQLDLLEPVYIDNIELLNSFEAPPADSFLVDDFE

GYFG(SEQ ID NO:37)

Bsp Man4v3的成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示。

SQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQDVSGSQVLFGQQHATDEGLTLTN

PAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWDTNSLDGREKPGIAGNVEQSIKNT

AQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGGPYGDTTGNVVKEILPGGSKHAE

FNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFRPFHEQTGSWFWWGASTTSPEQY

KAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPGAGPAGDVNRYLETYPGDDYVDIF

GIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLAMISRLAEQKEKVAAFTEYGYSAT

GINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDARKISYMLTWANFGWPNNMYVPYR

DIHNELGGDHELLPDFEAFHADDYTAFRDEIKGKIYNTGKEYTVSPHEPF

MYVISPITGSTVTSETVTIQAKVANDEHARVTFRVDGSSLEEEMVFNDDT

LYYTGSFTPDAAVNGGAVDVIVAYYSSGEKVQEETIRLFVKIPEMSLLTL

TFDDDINGIKSNGTWPEDGVTSEIDHAIVDGDGKLMFSVQGMSPTETWQE

LKLELTELSDVNIDAVKKMKFDALIPAGSEEGSVQGIVQLPPDWETKYGM

NETTKSIKDLETVTVNGSDYKRLEVTVSIDNQGGATGIALSLVGSQLDLLE

PVYIDNIELLNSFEAPPADSFLVDDFEGYFG(SEQ ID NO:38)

芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4v4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示。

TCACAAGAAGGGCGTCAACTTAACATGGCAGATGAGGATGCTTCAAA

GTATACGAAGGAGTTATTTGCTTTTCTTCAAGATGTAAGTGGTTCACA

AGTGTTATTTGGACAACAGCATGCAACAGATGAAGGATTAACTTTAAC

AAATCCAGCTCCAAGAACAGGTTCCACTCAATCTGAAGTTTTCAATGC

AGTTGGGGATTATCCAGCTGTGTTTGGATGGGACACGAATAGCCTAGA

TGGTCGTGAAAAGCCTGGCATTGCAGGTAATGTAGAACAAAGTATAA

AAAATACGGCTCAGTCCATGAAAGTGGCTCATGATTTAGGAGGGATT

ATTACACTAAGCATGCACCCAGATAATTTTGTAACAGGGGGTCCTTAT

GGTGATACAACAGGGAATGTTGTAAAAGAAATTCTTCCAGGTGGATC

AAAACATGCAGAGTTTAACGCGTGGTTGGACAATATTGCTGCGCTTGC

TCACGAGCTGAAAGATGAGAATGGTGAACCTATTCCGATGATTTTTCG

GCCATTCCATGAACAAACAGGATCTTGGTTTTGGTGGGGAGCAAGCA

CAACTTCACCCGAACAATATAAAGCGATTTTTCGTTATACAGTAGAAT

ATTTGCGAGATGTTAAAGGCGTAAATAATATTTTATATGGCTTTTCAC

CTGGGGCGGGACCTGCTGGAGATGTAAATCGCTATTTAGAAACATATC

CAGGGGATGATTACGTTGATATTTTCGGTATTGACAATTATGACAATA

AAGACAATGCAGGGTCAGAAGCTTGGTTAAGTGGTATGGTCAAAGAC

TTGGCGATGATTAGCCGATTAGCTGAACAAAAAGAAAAAGTAGCGGC

TTTTACTGAGTATGGGTACAGTGCAACCGGAATTAATCGTCAAGGGAA

TACATTAGACTGGTACACACGTGTATTAGATGCGATTGCTGCTGATGA

AGACGCACGTAAAATATCATACATGTTGACATGGGCGAACTTTGGTTG

GCCGAATAATATGTATGTTCCTTATCGTGATATCCACAATGAATTAGG

TGGAGACCATGAGTTATTACCGGACTTTGAAGCTTTCCATGCGGATGA

CTACACAGCATTTCGAGATGAGATAAAAGGAAAGATATATAATACTG

GAAAGGAATATACCGTTTCTCCTCATGAGCCGTTTATGTATGTTATATC

TCCGATTACAGGTTCTACAGTGACAAGCGAAACGGTAACAATCCAAG

CAAAAGTAGCGAATGACGAACACGCAAGAGTCACTTTCAGGGTCGAT

GGTTCTAGTTTGGAAGAAGAAATGGTTTTCAATGATGACACTTTATAT

TATACAGGTTCTTTTACACCAGATGCAGCAGTGAATGGCGGAGCTGTT

GATGTGATTGTAGCTTATTATTCTAGTGGAGAAAAAGTCCAAGAAGAA

ACAATTCGTTTATTTGTAAAAATTCCTGAAATGTCTTTGTTAACATTAA

CGTTTGATGATGATATAAACGGAATCAAAAGCAATGGAACATGGCCT

GAAGATGGTGTAACATCTGAAATTGACCACGCTATTGTAGATGGAGA

CGGCAAGTTGATGTTCTCTGTTCAAGGAATGTCACCTACTGAAACATG

GCAAGAGCTCAAGTTAGAATTAACAGAACTATCAGATGTGAACATTG

ATGCGGTTAAGAAAATGAAGTTTGACGCGCTTATCCCAGCAGGTAGTG

AAGAAGGTTCAGTCCAAGGAATCGTACAACTTCCACCGGATTGGGAG

ACGAAATATGGGATGAATGAAACAACGAAGTCAATAAAAGACTTAGA

GACTGTTACTGTTAATGGAAGCGATTATAAACGGTTGGAAGTGACTGT

TTCTATCGACAATCAAGGAGGAGCTACAGGAATCGCTTTATCATTAGT

AGGATCCCAACTCGATTTGTTAGAACCTGTCTACATCGATAATATTGA

ACTTCTAAATTCCTTTGAAGCACCACCAGCAGATTCTTTTCTTGTTGAT

GATTTTGAAGGTTATTTTGGGGATGACACGTTGTTACATCGCAATTATT

CTAGCAATGGAGATCCAATTACACTATCGTTAACAAGTGAGTTTAAAA

ATAATGGAGAATTTGGATTGAAGTATGATTATTCGATTGGCTCGATGG

GTTATGCAGGGAGGCAAACATCACTAGGACCTGTCGATTGGAGCGGA

GCTAATGCTTTTGAATTTTGGATGAAACATGGACAACTTGAAGGGAAT

CATTTAACTGTACAAATTCGAATAGGTGATGTTAGCTTTGAAAAAAAT

CTTGAATTAATGGATGCTCATGAAGGTGTAGTGACAATCCCGTTTTCT

GAATTTGCTCCAGCTGCTTGGGAAAATAAGCCTGGCGTTATCATTGAC

GAACAAAAATTGAAAAGAGTGAGTCAATTTGCTCTTTACACAGGCGG

GGCTAGACAATCTGGAACAATCTACTTTGATGATTTACGAGCGGTATA

TGATGAAAGTTTACCATCAGTTCCAGTTCCGAAAGAGGAGGAAGAGG

AAAAAGAGGTCGCTCCTATTTAA(SEQ ID NO:39)

芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4v4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。信号肽以斜体和小写字母显示。在芽孢杆菌甘露聚糖酶Bsp Man4v4的信号肽与第一密码子之间存在一个引入的限制酶位点，其以小写字母和下划线显示。

tsSQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQDVS

GSQVLFGQQHATDEGLTLTNPAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWDTNS

LDGREKPGIAGNVEQSIKNTAQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGGPYG

DTTGNVVKEILPGGSKHAEFNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFRPFH

EQTGSWFWWGASTTSPEQYKAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPGAGP

AGDVNRYLETYPGDDYVDIFGIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLAMIS

RLAEQKEKVAAFTEYGYSATGINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDARKIS

YMLTWANFGWPNNMYVPYRDIHNELGGDHELLPDFEAFHADDYTAFRD

EIKGKIYNTGKEYTVSPHEPFMYVISPITGSTVTSETVTIQAKVANDEHAR

VTFRVDGSSLEEEMVFNDDTLYYTGSFTPDAAVNGGAVDVIVAYYSSGE

KVQEETIRLFVKIPEMSLLTLTFDDDINGIKSNGTWPEDGVTSEIDHAIVDG

DGKLMFSVQGMSPTETWQELKLELTELSDVNIDAVKKMKFDALIPAGSE

EGSVQGIVQLPPDWETKYGMNETTKSIKDLETVTVNGSDYKRLEVTVSID

NQGGATGIALSLVGSQLDLLEPVYIDNIELLNSFEAPPADSFLVDDFEGYF

GDDTLLHRNYSSNGDPITLSLTSEFKNNGEFGLKYDYSIGSMGYAGRQTS

LGPVDWSGANAFEFWMKHGQLEGNHLTVQIRIGDVSFEKNLELMDAHE

GVVTIPFSEFAPAAWENKPGVIIDEQKLKRVSQFALYTGGARQSGTIYFDD

LRAVYDESLPSVPVPKEEEEEKEVAPI(SEQ ID NO:40)

Bsp Man4v4的成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示。

SQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQDVSGSQVLFGQQHATDEGLTLTN

PAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWDTNSLDGREKPGIAGNVEQSIKNT

AQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGGPYGDTTGNVVKEILPGGSKHAE

FNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFRPFHEQTGSWFWWGASTTSPEQY

KAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPGAGPAGDVNRYLETYPGDDYVDIF

GIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLAMISRLAEQKEKVAAFTEYGYSAT

GINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDARKISYMLTWANFGWPNNMYVPYR

DIHNELGGDHELLPDFEAFHADDYTAFRDEIKGKIYNTGKEYTVSPHEPF

MYVISPITGSTVTSETVTIQAKVANDEHARVTFRVDGSSLEEEMVFNDDT

LYYTGSFTPDAAVNGGAVDVIVAYYSSGEKVQEETIRLFVKIPEMSLLTL

TFDDDINGIKSNGTWPEDGVTSEIDHAIVDGDGKLMFSVQGMSPTETWQE

LKLELTELSDVNIDAVKKMKFDALIPAGSEEGSVQGIVQLPPDWETKYGM

NETTKSIKDLETVTVNGSDYKRLEVTVSIDNQGGATGIALSLVGSQLDLLE

PVYIDNIELLNSFEAPPADSFLVDDFEGYFGDDTLLHRNYSSNGDPITLSLT

SEFKNNGEFGLKYDYSIGSMGYAGRQTSLGPVDWSGANAFEFWMKHGQ

LEGNHLTVQIRIGDVSFEKNLELMDAHEGVVTIPFSEFAPAAWENKPGVII

DEQKLKRVSQFALYTGGARQSGTIYFDDLRAVYDESLPSVPVPKEEEEEK

EVAPI(SEQ ID NO:41)

实例10

Bsp Man4缺失变体的表达

将Bsp Man4v1、Bsp Man4v2、Bsp Man4v3和Bsp Man4v4PCR产物克隆进p2JM表达载体中，将所得的质粒标为pLL007(aprE-Bsp Man41-350)、pLL008(aprE-Bsp Man41-475)、pLL009(aprE-Bsp Man41-675)和pLL010(aprE-Bsp Man41-850)。质粒图谱在图11中提供。通过DNA测序确认该基因的缺失形式的序列。

在转化前，使用滚环扩增试剂盒（新泽西州通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences,NJ)）对质粒pLL007(aprE-Bsp Man41-350)、pLL008(aprE-Bsp Man41-475)、pLL009(aprE-Bsp Man41-675)和pLL010(aprE-Bsp Man41-850)进行扩增。将枯草芽孢杆菌（degUHy32、ΔnprB、Δvpr、Δepr、ΔscoC、ΔwprA、Δmpr、ΔispA、Δbpr）用扩增的质粒转化。然后将转化的细胞涂布接种至补充有10ppm卡那霉素的Luria琼脂板上。挑取单个集落，在摇瓶中培养。

来自表达质粒pLL007(aprE-Bsp Man41-350)的Bsp Man4v1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:42所示。信号序列以粗体显示。

GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTA

ATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGAGCGCGCAGGCAGCTGGTAA

AACTAGTTCACAAGAAGGGCGTCAACTTAACATGGCAGATGAGGATG

CTTCAAAGTATACGAAGGAGTTATTTGCTTTTCTTCAAGATGTAAGTG

GTTCACAAGTGTTATTTGGACAACAGCATGCAACAGATGAAGGATTA

ACTTTAACAAATCCAGCTCCAAGAACAGGTTCCACTCAATCTGAAGTT

TTCAATGCAGTTGGGGATTATCCAGCTGTGTTTGGATGGGACACGAAT

AGCCTAGATGGTCGTGAAAAGCCTGGCATTGCAGGTAATGTAGAACA

AAGTATAAAAAATACGGCTCAGTCCATGAAAGTGGCTCATGATTTAG

GAGGGATTATTACACTAAGCATGCACCCAGATAATTTTGTAACAGGGG

GTCCTTATGGTGATACAACAGGGAATGTTGTAAAAGAAATTCTTCCAG

GTGGATCAAAACATGCAGAGTTTAACGCGTGGTTGGACAATATTGCTG

CGCTTGCTCACGAGCTGAAAGATGAGAATGGTGAACCTATTCCGATG

ATTTTTCGGCCATTCCATGAACAAACAGGATCTTGGTTTTGGTGGGGA

GCAAGCACAACTTCACCCGAACAATATAAAGCGATTTTTCGTTATACA

GTAGAATATTTGCGAGATGTTAAAGGCGTAAATAATATTTTATATGGC

TTTTCACCTGGGGCGGGACCTGCTGGAGATGTAAATCGCTATTTAGAA

ACATATCCAGGGGATGATTACGTTGATATTTTCGGTATTGACAATTAT

GACAATAAAGACAATGCAGGGTCAGAAGCTTGGTTAAGTGGTATGGT

CAAAGACTTGGCGATGATTAGCCGATTAGCTGAACAAAAAGAAAAAG

TAGCGGCTTTTACTGAGTATGGGTACAGTGCAACCGGAATTAATCGTC

AAGGGAATACATTAGACTGGTACACACGTGTATTAGATGCGATTGCTG

CTGATGAAGACGCACGTAAAATATCATACATGTTGACATGGGCGAAC

TTTGGTTGGCCGAATAATATGTATGTTCCTTATCGTGATATCCACAATG

AATTAGGTTAA(SEQ ID NO:42)

来自表达质粒pLL007(aprE-Bsp Man41-350)的Bsp Man4v1蛋白的氨基酸如SEQ ID NO:43所示。信号序列以粗体显示。

AGKTSSQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQ

DVSGSQVLFGQQHATDEGLTLTNPAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWD

TNSLDGREKPGIAGNVEQSIKNTAQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGG

PYGDTTGNVVKEILPGGSKHAEFNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFR

PFHEQTGSWFWWGASTTSPEQYKAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPG

AGPAGDVNRYLETYPGDDYVDIFGIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLA

MISRLAEQKEKVAAFTEYGYSATGINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDAR

KISYMLTWANFGWPNNMYVPYRDIHNELG(SEQ ID NO:43)

来自表达质粒pLL008(aprE-Bsp Man41-475)的Bsp Man4v2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示。信号序列以粗体显示。

GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTA

ATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGAGCGCGCAGGCAGCTGGTAA

AACTAGTTCACAAGAAGGGCGTCAACTTAACATGGCAGATGAGGATG

CTTCAAAGTATACGAAGGAGTTATTTGCTTTTCTTCAAGATGTAAGTG

GTTCACAAGTGTTATTTGGACAACAGCATGCAACAGATGAAGGATTA

ACTTTAACAAATCCAGCTCCAAGAACAGGTTCCACTCAATCTGAAGTT

TTCAATGCAGTTGGGGATTATCCAGCTGTGTTTGGATGGGACACGAAT

AGCCTAGATGGTCGTGAAAAGCCTGGCATTGCAGGTAATGTAGAACA

AAGTATAAAAAATACGGCTCAGTCCATGAAAGTGGCTCATGATTTAG

GAGGGATTATTACACTAAGCATGCACCCAGATAATTTTGTAACAGGGG

GTCCTTATGGTGATACAACAGGGAATGTTGTAAAAGAAATTCTTCCAG

GTGGATCAAAACATGCAGAGTTTAACGCGTGGTTGGACAATATTGCTG

CGCTTGCTCACGAGCTGAAAGATGAGAATGGTGAACCTATTCCGATG

ATTTTTCGGCCATTCCATGAACAAACAGGATCTTGGTTTTGGTGGGGA

GCAAGCACAACTTCACCCGAACAATATAAAGCGATTTTTCGTTATACA

GTAGAATATTTGCGAGATGTTAAAGGCGTAAATAATATTTTATATGGC

TTTTCACCTGGGGCGGGACCTGCTGGAGATGTAAATCGCTATTTAGAA

ACATATCCAGGGGATGATTACGTTGATATTTTCGGTATTGACAATTAT

GACAATAAAGACAATGCAGGGTCAGAAGCTTGGTTAAGTGGTATGGT

CAAAGACTTGGCGATGATTAGCCGATTAGCTGAACAAAAAGAAAAAG

TAGCGGCTTTTACTGAGTATGGGTACAGTGCAACCGGAATTAATCGTC

AAGGGAATACATTAGACTGGTACACACGTGTATTAGATGCGATTGCTG

CTGATGAAGACGCACGTAAAATATCATACATGTTGACATGGGCGAAC

TTTGGTTGGCCGAATAATATGTATGTTCCTTATCGTGATATCCACAATG

AATTAGGTGGAGACCATGAGTTATTACCGGACTTTGAAGCTTTCCATG

CGGATGACTACACAGCATTTCGAGATGAGATAAAAGGAAAGATATAT

AATACTGGAAAGGAATATACCGTTTCTCCTCATGAGCCGTTTATGTAT

GTTATATCTCCGATTACAGGTTCTACAGTGACAAGCGAAACGGTAACA

ATCCAAGCAAAAGTAGCGAATGACGAACACGCAAGAGTCACTTTCAG

GGTCGATGGTTCTAGTTTGGAAGAAGAAATGGTTTTCAATGATGACAC

TTTATATTATACAGGTTCTTTTACACCAGATGCAGCAGTGAATGGCGG

AGCTGTTGATGTGATTGTAGCTTATTATTCTAGTGGAGAAAAAGTCCA

ATAA(SEQ ID NO:44)

来自表达质粒pLL008(aprE-Bsp Man41-475)的Bsp Man4v2蛋白的氨基酸如SEQ ID NO:45所示。信号序列以粗体显示。

AGKTSSQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQ

DVSGSQVLFGQQHATDEGLTLTNPAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWD

TNSLDGREKPGIAGNVEQSIKNTAQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGG

PYGDTTGNVVKEILPGGSKHAEFNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFR

PFHEQTGSWFWWGASTTSPEQYKAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPG

AGPAGDVNRYLETYPGDDYVDIFGIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLA

MISRLAEQKEKVAAFTEYGYSATGINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDAR

KISYMLTWANFGWPNNMYVPYRDIHNELGGDHELLPDFEAFHADDYTA

FRDEIKGKIYNTGKEYTVSPHEPFMYVISPITGSTVTSETVTIQAKVANDE

HARVTFRVDGSSLEEEMVFNDDTLYYTGSFTPDAAVNGGAVDVIVAYYS

SGEKVQ(SEQ ID NO:45)

来自表达质粒pLL009(aprE-Bsp Man41-675)的Bsp Man4v3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示。信号序列以粗体显示。

GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTA

ATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGAGCGCGCAGGCAGCTGGTAA

AACTAGTTCACAAGAAGGGCGTCAACTTAACATGGCAGATGAGGATG

CTTCAAAGTATACGAAGGAGTTATTTGCTTTTCTTCAAGATGTAAGTG

GTTCACAAGTGTTATTTGGACAACAGCATGCAACAGATGAAGGATTA

ACTTTAACAAATCCAGCTCCAAGAACAGGTTCCACTCAATCTGAAGTT

TTCAATGCAGTTGGGGATTATCCAGCTGTGTTTGGATGGGACACGAAT

AGCCTAGATGGTCGTGAAAAGCCTGGCATTGCAGGTAATGTAGAACA

AAGTATAAAAAATACGGCTCAGTCCATGAAAGTGGCTCATGATTTAG

GAGGGATTATTACACTAAGCATGCACCCAGATAATTTTGTAACAGGGG

GTCCTTATGGTGATACAACAGGGAATGTTGTAAAAGAAATTCTTCCAG

GTGGATCAAAACATGCAGAGTTTAACGCGTGGTTGGACAATATTGCTG

CGCTTGCTCACGAGCTGAAAGATGAGAATGGTGAACCTATTCCGATG

ATTTTTCGGCCATTCCATGAACAAACAGGATCTTGGTTTTGGTGGGGA

GCAAGCACAACTTCACCCGAACAATATAAAGCGATTTTTCGTTATACA

GTAGAATATTTGCGAGATGTTAAAGGCGTAAATAATATTTTATATGGC

TTTTCACCTGGGGCGGGACCTGCTGGAGATGTAAATCGCTATTTAGAA

ACATATCCAGGGGATGATTACGTTGATATTTTCGGTATTGACAATTAT

GACAATAAAGACAATGCAGGGTCAGAAGCTTGGTTAAGTGGTATGGT

CAAAGACTTGGCGATGATTAGCCGATTAGCTGAACAAAAAGAAAAAG

TAGCGGCTTTTACTGAGTATGGGTACAGTGCAACCGGAATTAATCGTC

AAGGGAATACATTAGACTGGTACACACGTGTATTAGATGCGATTGCTG

CTGATGAAGACGCACGTAAAATATCATACATGTTGACATGGGCGAAC

TTTGGTTGGCCGAATAATATGTATGTTCCTTATCGTGATATCCACAATG

AATTAGGTGGAGACCATGAGTTATTACCGGACTTTGAAGCTTTCCATG

CGGATGACTACACAGCATTTCGAGATGAGATAAAAGGAAAGATATAT

AATACTGGAAAGGAATATACCGTTTCTCCTCATGAGCCGTTTATGTAT

GTTATATCTCCGATTACAGGTTCTACAGTGACAAGCGAAACGGTAACA

ATCCAAGCAAAAGTAGCGAATGACGAACACGCAAGAGTCACTTTCAG

GGTCGATGGTTCTAGTTTGGAAGAAGAAATGGTTTTCAATGATGACAC

TTTATATTATACAGGTTCTTTTACACCAGATGCAGCAGTGAATGGCGG

AGCTGTTGATGTGATTGTAGCTTATTATTCTAGTGGAGAAAAAGTCCA

AGAAGAAACAATTCGTTTATTTGTAAAAATTCCTGAAATGTCTTTGTT

AACATTAACGTTTGATGATGATATAAACGGAATCAAAAGCAATGGAA

CATGGCCTGAAGATGGTGTAACATCTGAAATTGACCACGCTATTGTAG

ATGGAGACGGCAAGTTGATGTTCTCTGTTCAAGGAATGTCACCTACTG

AAACATGGCAAGAGCTCAAGTTAGAATTAACAGAACTATCAGATGTG

AACATTGATGCGGTTAAGAAAATGAAGTTTGACGCGCTTATCCCAGCA

GGTAGTGAAGAAGGTTCAGTCCAAGGAATCGTACAACTTCCACCGGA

TTGGGAGACGAAATATGGGATGAATGAAACAACGAAGTCAATAAAAG

ACTTAGAGACTGTTACTGTTAATGGAAGCGATTATAAACGGTTGGAAG

TGACTGTTTCTATCGACAATCAAGGAGGAGCTACAGGAATCGCTTTAT

CATTAGTAGGATCCCAACTCGATTTGTTAGAACCTGTCTACATCGATA

ATATTGAACTTCTAAATTCCTTTGAAGCACCACCAGCAGATTCTTTTCT

TGTTGATGATTTTGAAGGTTATTTTGGGTAA(SEQ ID NO:46)

来自表达质粒pLL009(aprE-Bsp Man41-675)的Bsp Man4v3蛋白的氨基酸如SEQ ID NO:47所示。信号序列以粗体显示。

AGKTSSQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQ

DVSGSQVLFGQQHATDEGLTLTNPAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWD

TNSLDGREKPGIAGNVEQSIKNTAQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGG

PYGDTTGNVVKEILPGGSKHAEFNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFR

PFHEQTGSWFWWGASTTSPEQYKAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPG

AGPAGDVNRYLETYPGDDYVDIFGIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLA

MISRLAEQKEKVAAFTEYGYSATGINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDAR

KISYMLTWANFGWPNNMYVPYRDIHNELGGDHELLPDFEAFHADDYTA

FRDEIKGKIYNTGKEYTVSPHEPFMYVISPITGSTVTSETVTIQAKVANDE

HARVTFRVDGSSLEEEMVFNDDTLYYTGSFTPDAAVNGGAVDVIVAYYS

SGEKVQEETIRLFVKIPEMSLLTLTFDDDINGIKSNGTWPEDGVTSEIDHAI

VDGDGKLMFSVQGMSPTETWQELKLELTELSDVNIDAVKKMKFDALIPA

GSEEGSVQGIVQLPPDWETKYGMNETTKSIKDLETVTVNGSDYKRLEVT

VSIDNQGGATGIALSLVGSQLDLLEPVYIDNIELLNSFEAPPADSFLVDDFE

GYFG(SEQ ID NO:47)

来自表达质粒pLL010(aprE-Bsp Man41-850)的Bsp Man4v4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:48所示。信号序列以粗体显示。

GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTA

ATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGAGCGCGCAGGCAGCTGGTAA

AACTAGTTCACAAGAAGGGCGTCAACTTAACATGGCAGATGAGGATG

CTTCAAAGTATACGAAGGAGTTATTTGCTTTTCTTCAAGATGTAAGTG

GTTCACAAGTGTTATTTGGACAACAGCATGCAACAGATGAAGGATTA

ACTTTAACAAATCCAGCTCCAAGAACAGGTTCCACTCAATCTGAAGTT

TTCAATGCAGTTGGGGATTATCCAGCTGTGTTTGGATGGGACACGAAT

AGCCTAGATGGTCGTGAAAAGCCTGGCATTGCAGGTAATGTAGAACA

AAGTATAAAAAATACGGCTCAGTCCATGAAAGTGGCTCATGATTTAG

GAGGGATTATTACACTAAGCATGCACCCAGATAATTTTGTAACAGGGG

GTCCTTATGGTGATACAACAGGGAATGTTGTAAAAGAAATTCTTCCAG

GTGGATCAAAACATGCAGAGTTTAACGCGTGGTTGGACAATATTGCTG

CGCTTGCTCACGAGCTGAAAGATGAGAATGGTGAACCTATTCCGATG

ATTTTTCGGCCATTCCATGAACAAACAGGATCTTGGTTTTGGTGGGGA

GCAAGCACAACTTCACCCGAACAATATAAAGCGATTTTTCGTTATACA

GTAGAATATTTGCGAGATGTTAAAGGCGTAAATAATATTTTATATGGC

TTTTCACCTGGGGCGGGACCTGCTGGAGATGTAAATCGCTATTTAGAA

ACATATCCAGGGGATGATTACGTTGATATTTTCGGTATTGACAATTAT

GACAATAAAGACAATGCAGGGTCAGAAGCTTGGTTAAGTGGTATGGT

CAAAGACTTGGCGATGATTAGCCGATTAGCTGAACAAAAAGAAAAAG

TAGCGGCTTTTACTGAGTATGGGTACAGTGCAACCGGAATTAATCGTC

AAGGGAATACATTAGACTGGTACACACGTGTATTAGATGCGATTGCTG

CTGATGAAGACGCACGTAAAATATCATACATGTTGACATGGGCGAAC

TTTGGTTGGCCGAATAATATGTATGTTCCTTATCGTGATATCCACAATG

AATTAGGTGGAGACCATGAGTTATTACCGGACTTTGAAGCTTTCCATG

CGGATGACTACACAGCATTTCGAGATGAGATAAAAGGAAAGATATAT

AATACTGGAAAGGAATATACCGTTTCTCCTCATGAGCCGTTTATGTAT

GTTATATCTCCGATTACAGGTTCTACAGTGACAAGCGAAACGGTAACA

ATCCAAGCAAAAGTAGCGAATGACGAACACGCAAGAGTCACTTTCAG

GGTCGATGGTTCTAGTTTGGAAGAAGAAATGGTTTTCAATGATGACAC

TTTATATTATACAGGTTCTTTTACACCAGATGCAGCAGTGAATGGCGG

AGCTGTTGATGTGATTGTAGCTTATTATTCTAGTGGAGAAAAAGTCCA

AGAAGAAACAATTCGTTTATTTGTAAAAATTCCTGAAATGTCTTTGTT

AACATTAACGTTTGATGATGATATAAACGGAATCAAAAGCAATGGAA

CATGGCCTGAAGATGGTGTAACATCTGAAATTGACCACGCTATTGTAG

ATGGAGACGGCAAGTTGATGTTCTCTGTTCAAGGAATGTCACCTACTG

AAACATGGCAAGAGCTCAAGTTAGAATTAACAGAACTATCAGATGTG

AACATTGATGCGGTTAAGAAAATGAAGTTTGACGCGCTTATCCCAGCA

GGTAGTGAAGAAGGTTCAGTCCAAGGAATCGTACAACTTCCACCGGA

TTGGGAGACGAAATATGGGATGAATGAAACAACGAAGTCAATAAAAG

ACTTAGAGACTGTTACTGTTAATGGAAGCGATTATAAACGGTTGGAAG

TGACTGTTTCTATCGACAATCAAGGAGGAGCTACAGGAATCGCTTTAT

CATTAGTAGGATCCCAACTCGATTTGTTAGAACCTGTCTACATCGATA

ATATTGAACTTCTAAATTCCTTTGAAGCACCACCAGCAGATTCTTTTCT

TGTTGATGATTTTGAAGGTTATTTTGGGGATGACACGTTGTTACATCGC

AATTATTCTAGCAATGGAGATCCAATTACACTATCGTTAACAAGTGAG

TTTAAAAATAATGGAGAATTTGGATTGAAGTATGATTATTCGATTGGC

TCGATGGGTTATGCAGGGAGGCAAACATCACTAGGACCTGTCGATTG

GAGCGGAGCTAATGCTTTTGAATTTTGGATGAAACATGGACAACTTGA

AGGGAATCATTTAACTGTACAAATTCGAATAGGTGATGTTAGCTTTGA

AAAAAATCTTGAATTAATGGATGCTCATGAAGGTGTAGTGACAATCCC

GTTTTCTGAATTTGCTCCAGCTGCTTGGGAAAATAAGCCTGGCGTTAT

CATTGACGAACAAAAATTGAAAAGAGTGAGTCAATTTGCTCTTTACAC

AGGCGGGGCTAGACAATCTGGAACAATCTACTTTGATGATTTACGAGC

GGTATATGATGAAAGTTTACCATCAGTTCCAGTTCCGAAAGAGGAGG

AAGAGGAAAAAGAGGTCGCTCCTATTTAA(SEQ ID NO:48)

来自表达质粒pLL009(aprE-Bsp Man41-850)的Bsp Man4v4蛋白的氨基酸如SEQ ID NO:49所示。信号序列以粗体显示。

AGKTSSQEGRQLNMADEDASKYTKELFAFLQ

DVSGSQVLFGQQHATDEGLTLTNPAPRTGSTQSEVFNAVGDYPAVFGWD

TNSLDGREKPGIAGNVEQSIKNTAQSMKVAHDLGGIITLSMHPDNFVTGG

PYGDTTGNVVKEILPGGSKHAEFNAWLDNIAALAHELKDENGEPIPMIFR

PFHEQTGSWFWWGASTTSPEQYKAIFRYTVEYLRDVKGVNNILYGFSPG

AGPAGDVNRYLETYPGDDYVDIFGIDNYDNKDNAGSEAWLSGMVKDLA

MISRLAEQKEKVAAFTEYGYSATGINRQGNTLDWYTRVLDAIAADEDAR

KISYMLTWANFGWPNNMYVPYRDIHNELGGDHELLPDFEAFHADDYTA

FRDEIKGKIYNTGKEYTVSPHEPFMYVISPITGSTVTSETVTIQAKVANDE

HARVTFRVDGSSLEEEMVFNDDTLYYTGSFTPDAAVNGGAVDVIVAYYS

SGEKVQEETIRLFVKIPEMSLLTLTFDDDINGIKSNGTWPEDGVTSEIDHAI

VDGDGKLMFSVQGMSPTETWQELKLELTELSDVNIDAVKKMKFDALIPA

GSEEGSVQGIVQLPPDWETKYGMNETTKSIKDLETVTVNGSDYKRLEVT

VSIDNQGGATGIALSLVGSQLDLLEPVYIDNIELLNSFEAPPADSFLVDDFE

GYFGDDTLLHRNYSSNGDPITLSLTSEFKNNGEFGLKYDYSIGSMGYAGR

QTSLGPVDWSGANAFEFWMKHGQLEGNHLTVQIRIGDVSFEKNLELMD

AHEGVVTIPFSEFAPAAWENKPGVIIDEQKLKRVSQFALYTGGARQSGTI

YFDDLRAVYDESLPSVPVPKEEEEEKEVAPI(SEQ ID NO:49)

实例11

Bsp Man4v2的纯化

通过疏水相互作用和阴离子交换层析纯化Bsp Man4v2。将硫酸铵加至来自摇瓶的700mL粗肉汤中达到1M的最终浓度。然后将溶液上样至150mL苯基琼脂糖FF（高取代）XK26/20柱上，柱子预先用20mM磷酸钠pH6.0（缓冲液A）与1M硫酸铵（缓冲液B）平衡。将目标蛋白质用3倍柱体积的100%-0缓冲液B然后用3倍柱体积的MilliQ H₂O洗脱。汇集含有目标蛋白质的级分，通过超滤脱盐。然后将脱盐的样品上样至150mlQ-Sepharose FF XK26/20柱上，柱子预先用20mM Tris-HCl,pH7.5（缓冲液C）平衡。上样后，将柱子用2倍柱体积的相同缓冲液洗涤，然后用8倍柱体积的0-80%梯度缓冲液C与1M NaCl（缓冲液D）洗涤。汇集含有目标蛋白质的级分，使用10K Amicon Ultra-15装置浓缩。样品纯度高于95%，保存在-80℃下的40%甘油中直至使用。

实例12

Bsp Man4和Bsp Man4v2的甘露聚糖酶活性

使用购自爱尔兰布雷美格兹密国际爱尔兰公司的半乳甘露聚糖（角豆；低密度）（P-GALML；批号10501）测量Bsp Man4和Bsp Man4v2的β1-4甘露聚糖酶活性。测定法在50mM醋酸钠(pH5.0)、0.005%Tween-80缓冲液中在50℃下进行10分钟，或在50mM HEPES(pH8.2)、0.005%Tween-80缓冲液中在30℃下进行30分钟。将释放的还原糖在PAHBAH（对羟基苯甲酸酰肼）测定法中定量（Lever,Anal.Biochem.（《分析生物化学》）47:248,1972）。生成了利用甘露糖的标准曲线，并用于计算酶活性单位。在该测定中，将一个甘露聚糖酶单位定义为在测定法条件下每分钟生成1微摩尔甘露糖还原糖当量所需的酶的量。使用上述方法针对低粘度角豆半乳甘露聚糖，纯化的Bsp Man4在pH5.0下的比活性测定为67个单位/mg，而Bsp Man4v2的比活性经测定为156个单位/mg。

实例13

Bsp Man4v2的pH曲线

使用得自美格兹密公司的β-甘露聚糖酶片剂测定法（Tmnz1/02，天青精交联角豆半乳甘露聚糖）通过对建议的方案进行细微修改测定BspMan4v2的pH曲线。在pH值调节至4至11之间的50mm醋酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液中进行该测定法。将酶溶液稀释进测定缓冲液中，将500μl酶溶液在55℃平衡然后添加一片底物。10分钟后，通过添加10ml2%Tris(pH12)停止反应。将管保持在室温下5分钟，搅拌，然后将液体滤过Whatman No.1滤纸。通过测量590nm处的光密度定量从底物释放的蓝色染料。各pH下的酶活性以相对活性报告，其中将最佳pH下的酶活性设为100%。Bsp Man4v2的pH曲线在图12中示出。

实例14

Bsp Man4和Bsp Man4v2的温度曲线

使用得自美格兹密公司的β-甘露聚糖酶片剂测定法（Tmnz1/02，天青精交联角豆半乳甘露聚糖）通过对建议的方案进行细微修改测定甘露聚糖酶活性而确定纯化的Bsp Man4v2的最适温度。测定法在40℃至69℃之间变化的温度下在50mM HEPES缓冲液pH8.2中进行10分钟。酶活性以相对活性记录，其中将最适温度下的酶活性设为100%。Bsp Man4v2的温度曲线在图13中示出。

实例15

Bsp Man4和Bsp Man4v2的热稳定性

在50mM HEPES缓冲液(pH8.2)中测定Bsp Man4和Bsp Man4v2的热稳定性。将酶在所需的温度下在Bio-Rad PCR仪中温育了2小时。使用得自美格兹密公司的偶氮角豆半乳甘露聚糖测定法（ACGLM03/07，雷玛唑亮蓝R染色的角豆半乳甘露聚糖）通过对建议的方案进行细微修改测量样品的剩余活性。将保持在冰上的样品的活性定义为100%活性。Bsp Man4和Bsp Man4v2的热稳定性结果在图14中显示。在低于55℃的温度下，在2小时的温育期间均未检测到Bsp Man4或Bsp Man4v2的活性损失。在升高的温度下，Bsp Man4v2保留的活性高于Bsp Man4。

实例16

包含Bsp Man4的洗衣液组合物

在该实例中，提供了洗衣液组合物的多种制剂。在这些制剂的每一者中，Bsp Man4都以约0.0001至约10重量%的浓度包含在内。在一些备选的实施例中，配制人员可根据其需求决定使用其他浓度。

#1：添加1N HCl水溶液以将制剂的净pH调到约3至约5的范围内。实例16(I)-(II)的pH为约5至约7，16(III)-(V)的pH为约7.5至约8.5。

实例17

包含Bsp Man4的手洗餐具洗涤液组合物

在该实例中，提供了多种手洗餐具洗涤液制剂。在这些制剂的每一者中，Bsp Man4都以约0.0001至约10重量%的浓度包含在内。在一些备选的实施例中，配制人员可根据其需求决定使用其他浓度。

实例17(I)-(VI)的pH为约8至约11。

实例18

包含Bsp Man4的机洗餐具洗涤液组合物

在该实例中，提供了多种机洗餐具洗涤液制剂。在这些制剂的每一者中，Bsp Man4多肽都以约0.0001至约10重量%的浓度包含在内。在一些备选的实施例中，配制人员可根据其需求决定使用其他浓度。

实例19

包含Bsp Man4的颗粒和/或片状洗衣组合物

该实例提供了颗粒和/或片状衣物洗涤剂的多种制剂。在这些制剂的每一者中，Bsp Man4都以约0.0001至约10重量%的浓度包含在内。在一些备选的实施例中，配制人员可根据其需求决定使用其他浓度。

^*香料、染料、增白剂/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO₄/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。

实例20

包含Bsp Man4的另外的洗衣液

本实例提供了洗衣液的其他制剂。在这些制剂的每一者中，Bsp Man4都以约0.0001至约10重量%的浓度包含在内。在一些备选的实施例中，配制人员可根据其需求决定使用其他浓度。

实例21

包含Bsp Man4的高密度餐具洗涤剂

该实例提供了高密度餐具洗涤剂的多种制剂。在这些紧凑制剂的每一者中，Bsp Man4都以约0.0001至约10重量%的浓度包含在内。在一些备选的实施例中，配制人员可根据其需求决定使用其他浓度。

^*增白剂/染料/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO₄/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。实例21(I)至(VI)的pH为约9.6至约11.3。

实例22

包含Bsp Man4的片状餐具洗涤剂组合物

本实例提供多种片状餐具洗涤剂制剂。本发明的以下片状洗涤剂组合物通过使用标准12冲头旋转式压片机在13KN/cm²的压力下压缩颗粒餐具洗涤剂组合物而制备。在这些制剂的每一者中，Bsp Man4都以约0.0001至约10重量%的浓度包含在内。在一些备选的实施例中，配制人员可根据其需求决定使用其他浓度。

^*增白剂/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO₄/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。实例22(I)至22(VII)的pH为约10至约11.5；22(VIII)的pH为8-10。实例22(I)至22(VIII)的片重为约20克至约30克。

实例23

包含Bsp Man4的硬质表面清洗液

该实例提供了液体硬质表面清洁剂的多种制剂。在这些制剂的每一者中，Bsp Man4都以约0.0001至约10重量%的浓度包含在内。在一些备选的实施例中，配制人员可根据其需求决定使用其他浓度。

实例23(I)至(VII)的pH为约7.4至约9.5。

Claims (39)

1.一种包含内切-β-甘露聚糖酶的催化结构域的重组多肽，其中所述催化结构域与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少85%的同一性。

2.一种包含内切-β-甘露聚糖酶的成熟形式的重组多肽，其中所述成熟形式与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少80%的同一性。

3.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其中所述多肽在存在洗涤剂的情况下具有甘露聚糖酶活性。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽在存在蛋白酶的情况下具有甘露聚糖酶活性。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽在6至8.5之间的pH下保留大于70%的甘露聚糖酶活性。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽在55℃至65℃的温度范围内保留大于70%的甘露聚糖酶活性。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽能够水解选自巧克力冰淇淋、瓜耳胶、刺槐豆胶以及它们的组合的底物。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的重组多肽，其中所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:6-14和30-49的序列具有至少95%的同一性。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的重组多肽，其还包含氨基末端延伸Ala-Gly-Lys。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的重组多肽，其还包含天然或非天然信号肽。

11.根据权利要求1和3-7中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽不进一步包含糖类结合模块。

12.一种洗涤剂组合物，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的重组多肽。

13.根据权利要求12所述的洗涤剂组合物，其还包含表面活性剂。

14.根据权利要求13所述的洗涤剂组合物，其中所述表面活性剂为离子型表面活性剂。

15.根据权利要求14所述的洗涤剂组合物，其中所述离子型表面活性剂选自阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂以及它们的组合。

16.根据权利要求12-15中任一项所述的洗涤剂组合物，其还包含选自以下的酶：蛋白酶、蛋白酶、过氧化物酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、酰基转移酶、磷脂酶、酯酶、漆酶、过氧化氢酶、芳基酯酶、淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、卡拉胶酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、阿拉伯糖酶、透明质酸酶、软骨素酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、其他内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶以及它们的组合。

17.根据权利要求16所述的洗涤剂组合物，其中所述组合包含蛋白酶和淀粉酶。

18.根据权利要求12-17中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂选自衣物洗涤剂、织物软化洗涤剂、餐具洗涤剂和硬质表面清洁剂。

19.根据权利要求12-18中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂选自液体、粉末、颗粒状固体和片剂。

20.一种水解存在于表面上的污垢或污渍中的甘露聚糖底物的方法，其包括：使所述表面与根据权利要求12-19中任一项所述的洗涤剂组合物接触以产生清洁的表面。

21.一种纺织物清洁方法，其包括：使沾污的纺织物与根据权利要求12-20中任一项所述的洗涤剂组合物接触以产生清洁的纺织物。

22.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据权利要求1-11中任一项所述的重组多肽。

23.一种表达载体，所述表达载体包含与调控序列有效组合的根据权利要求22所述的分离的核酸。

24.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求23所述的表达载体。

25.根据权利要求24所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞或真菌细胞。

26.一种产生内切-β-甘露聚糖酶的方法，其包括：将根据权利要求24或25所述的宿主细胞在适合的条件下，在培养基中培养以产生包含所述内切-β-甘露聚糖酶的培养物。

27.根据权利要求26所述的方法，其还包括通过离心从所述培养物移除所述宿主细胞，并通过过滤移除小于10kDa的碎片以产生富含内切-β-甘露聚糖酶的上清液。

28.一种水解多糖的方法，其包括：使包含甘露糖的多糖与根据权利要求27所述的上清液接触以产生包含甘露糖的寡糖。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述多糖选自甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖以及它们的组合。

30.一种食物或饲料组合物和/或食物添加剂，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的多肽。

31.一种制备食物或饲料组合物和/或食物或饲料添加剂的方法，其包括将本发明的所述多肽与一种或多种食物或饲料，和/或食物或饲料添加剂成分混合。

32.根据权利要求1-11中任一项所述的多肽的用途，其用于制备食物或饲料组合物，和/或食物或饲料添加剂，和/或食物或饲料和/或宠物食物。

33.根据权利要求30所述的食物或饲料组合物，其中所述食物或饲料组合物为发酵饮料，如啤酒。

34.根据权利要求31所述的方法，其中所述食物或饲料组合物为发酵饮料，如啤酒，并且其中所述一种或多种食物成分包含麦芽或辅助材料。

35.根据权利要求1-11中任一项所述的多肽的用途，其用于制备发酵饮料，如啤酒。

36.一种提供发酵饮料的方法，包括使麦芽浆和/或麦芽汁与根据权利要求1-11中任一项所述的多肽接触的步骤。

37.一种提供发酵饮料的方法，包括以下步骤：

a)制备麦芽浆，

b)过滤所述麦芽浆以得到麦芽汁，以及

c)使所述麦芽汁发酵而得到发酵饮料，如啤酒

其中将根据权利要求1-11中任一项的多肽添加至：

i.步骤(a)的所述麦芽浆和/或

ii.步骤(b)的所述麦芽汁和/或

iii.步骤(c)的所述麦芽汁。

38.一种发酵饮料，如啤酒，其通过根据权利要求34或36所述的方法制备。

39.根据权利要求35所述的用途、根据权利要求34或36所述的方法或根据权利要求38所述的发酵饮料，其中所述发酵饮料为啤酒，如全麦芽啤酒、在“纯净法”下酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒（第二啤酒）、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒、无酒精麦芽酒等，但是还有备选的谷类和麦芽饮料，如水果味麦芽饮料，例如柑橘味如柠檬、甜橙、酸橙或浆果味麦芽饮料；酒味麦芽饮料，例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒；或咖啡味麦芽饮料，如咖啡因味麦芽酒，等等。

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