CN108603183A - 类芽孢杆菌属物种和芽孢杆菌属物种甘露聚糖酶 - Google Patents

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Abstract

本文披露的是来自类芽孢杆菌属(Paenibacillus)物种或芽孢杆菌属(Bacillus)物种的甘露聚糖酶、编码所述甘露聚糖酶的多核苷酸、含有所述甘露聚糖酶的组合物、以及使用其的方法。含有甘露聚糖酶的组合物适合于用作洗涤剂和用于清洁织物和硬表面，以及用于各种其他工业应用中。

Description

类芽孢杆菌属物种和芽孢杆菌属物种甘露聚糖酶
相关申请的交叉引用
本申请涉及并要求于2015年11月5日提交的美国临时专利申请序列号62/251,516以及于2016年1月13日提交的美国临时专利申请序列号62/278,383的优先权权益，将这两个美国临时专利申请通过引用以其全文特此结合在此。
本文披露的是来自类芽孢杆菌属(Paenibacillus)物种或芽孢杆菌属(Bacillus)物种的甘露聚糖酶、编码这些甘露聚糖酶的多核苷酸、含有这些甘露聚糖酶的组合物、以及使用其的方法。含有甘露聚糖酶的组合物适合于用作洗涤剂和用于清洁织物和硬表面，以及用于各种其他工业应用中。
以电子方式提交的序列表的引用
作为ASCII文本文件(名称：NB40831WOPCT_ST25；大小59.3KB；创建于2016年11月2日)与本申请一起以电子方式提交的序列表的内容形成本申请的一部分，并且以其全文通过引用特此结合在此。
已经将甘露聚糖酶(包括内切-β-甘露聚糖酶)应用于洗涤剂清洁组合物中，该清洁组合物通过水解甘露聚糖用于去除胶质污渍。在自然界中发现多种甘露聚糖，如例如直链甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、和葡半乳甘露聚糖。此类甘露聚糖中的每一种由含有β-1,4-连接的甘露糖残基主链的多糖构成，这些甘露糖残基中的高达33％可以被葡萄糖残基取代(Yeoman等人，Adv Appl Microbiol[应用微生物学进展]，70:1，2010，Elsevier[爱思唯尔出版公司])。在半乳甘露聚糖或葡半乳甘露聚糖中，半乳糖残基以α-1,6-键连接至甘露聚糖主链(Moreira和Filho，Appl Microbiol Biotechnol[应用微生物学和生物技术]，79:165，2008)。因此，甘露聚糖水解为其组分糖需要将主链键水解产生短链甘露低聚糖的内切-1,4-β-甘露聚糖酶，这些短链甘露低聚糖被1,4-β-甘露糖苷酶进一步降解为单糖。尽管甘露聚糖酶(如例如内切-β-甘露聚糖酶)在工业酶领域中是已知的，但仍需要适合于特定条件和用途的另外的甘露聚糖酶。
本文披露的变体、组合物和方法涉及重组糖基水解酶家族5(GH5)甘露聚糖酶、或重组多肽或其活性片段。例如，类芽孢杆菌属物种PspMan4甘露聚糖酶(SEQ ID NO:2)是在2015年7月10日提交的PCT/US 15/40057(随后公开为WO 2016/007929)中更全面地描述的野生型甘露聚糖酶，是具有甘露聚糖酶的预期活性的GH5甘露聚糖酶，并且当比较三维结构时，展示出与其他GH5成员的高度的结构相似性。以下两种多重取代的PspMan4变体(PspMan118(SEQ ID NO:6)和PspMan148(SEQ ID NO:7))的三维结构与芽孢杆菌属物种JAMB-602(PDB条目1WKY_A)(SEQ ID NO:10)和黏琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)(PDB条目2WHL_A)(Q5YEX6的残基30-330)(SEQ ID NO:9)GH5甘露聚糖酶结构是同源的。GH5甘露聚糖酶：BspMan5(SEQ ID NO:16)、WO 2015022428-0015(SEQ ID NO:8)、US 6566114-002的残基32-330(SEQ ID NO:15)和US 6566114-002的残基32-340(SEQ ID NO:17)全部都与1WKY_A的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)具有大于90％的氨基酸序列同一性，并且因此在本文描述的甘露聚糖酶变体中探索的许多位点在例如2WHL_A(SEQ ID NO:9)、1WKY_A(SEQ ID NO:10)、PspMan4(SEQ ID NO:2)和其他NDL-进化枝甘露聚糖酶、BspMan5(SEQ ID NO:16)、WO2015022428-0015(SEQ ID NO:8)、US 6566114-002(残基32-330)(SEQ ID NO:15)和US6566114-002(残基32-340)(SEQ ID NO:17)氨基酸序列中的每个结构对应位置处具有相同的氨基酸。因此，在与2WHL_A(SEQ ID NO:9)、1WKY_A(SEQ ID NO:10)、PspMan4(SEQ ID NO:2)或其他NDL-进化枝甘露聚糖酶、BspMan5(SEQ ID NO:16)、WO 2015022428-0015(SEQ IDNO:8)、US 6566114-002(残基32-330)(SEQ ID NO:15)、和US 6566114-002(残基32-340)(SEQ ID NO:17)甘露聚糖酶结构相似的这些和其他GH5甘露聚糖酶中的取代预期赋予与参比多肽PspMan4(SEQ ID NO:2)、BspMan5(SEQ ID NO:16)、和US 6566114-002(残基32-340)(SEQ ID NO:17)相关的本文描述的那些取代相同的改进的性能和稳定性。
一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:2在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个变异：10、19、38、59、60、62、63、66、67、68、70、71、74、75、78、79、80、97、129、131、135、136、143、167、168、184、213、214、225、228、235、242、244、258、259、261、和283，其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的，并且其中该变体或其重组多肽或活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQID NO:2的一个或多个变异：X10Q/T、X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X59D/G/K/N/Q/T、X60F/M/V、X62E/I/Q/V、X63L、X66C/T/V、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X68L/M/R/S/W、X70R/V、X71D/H、X74E/C/Q/V、X75I、X78A/D/L/M、X79E/F/W、X80Q/T、X97E/L/P/Q、X129M、X131P、X135A/C/Q、X136E、X143Q/R、X167L/S/W/Y、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X213E、X214C/Q、X225A/C/P/W、X228A/G/H/I/K/S/V/Y、X235G/I/L/Q/S/V、X242S/E、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、X259A/E/R/S/W、X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y、和X283G/H/T，其中X是任何氨基酸；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。仍然另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异：(i)N/T10Q/T、P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、G/S59D/G/K/N/Q/T、L/Q60F/M/V、E/T62E/I/Q/V、K63L、I/L66C/T/V、D/H/N67A/D/E/G/P/Q/S/V、A/T68L/M/R/S/W、K/R70R/V、E/N71D/H、E/N/S74E/C/Q/V、L/V75I、D/Q78A/D/L/M、N79E/F/W、H/K80Q/T、A/N/S97E/L/P/Q、F/Y129M、S/T131P、D/S135A/C/Q、A136E、D/K/Q143Q/R、F/Y167L/S/W/Y、P168A/E/G/L/M/S/T、L/Q184D/F/H/L/M/P、D/N213E、K/Q214C/Q、G/H225A/C/P/W、T228A/G/H/I/K/S/V/Y、A/D/Y235G/I/L/Q/S/V、E/Q242S/E、K/R/Y244A/C/G/L/M/P/S、P/S/T258A/D/E/G/M/N/P/T、E/G/S259A/E/R/S/W、D/E/N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y、和D/G283G/H/T，或(ii)N10Q/T、P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、S59D/G/K/N/Q/T、L60F/M/V、T62E/I/Q/V、K63L、L66C/T/V、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、A68L/M/R/S/W、K70R/V、N71D/H、N74E/C/Q/V、V75I、Q78A/D/L/M、N79E/F/W、K80Q/T、N97E/L/P/Q、Y129M、T131P、S135A/C/Q、A136E、K143Q/R、F167L/S/W/Y、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、N213E、K214C/Q、G225A/C/P/W、T228A/G/H/I/K/S/V/Y、Y235G/I/L/Q/S/V、Q242S/E、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、G259A/E/R/S/W、N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y、和D283G/H/T；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
还另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽、或其活性片段，该氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:2在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个变异：(i)19、38、63、67、71、97、129、143、168、184、225、228、235、244、258、和261，或(ii)19、38、67、97、129、143、168、184、225、228、235、244、258、和261；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。甚至另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽、或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异：(i)X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X63L、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X71D/H、X97E/L/P/Q、X129M、X143Q/R、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X225A/C/P/W、X228A/G/H/I/K/S/V/Y、X235G/I/L/Q/S/V、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，或(ii)X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X97E/L/P/Q、X129M、X143Q/R、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X225A/C/P/W、X228A/G/H/I/K/S/V/Y、X235G/I/L/Q/S/V、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；其中X是任何氨基酸；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。甚至仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异：(i)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、K63L、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、N71D/H、N97E/L/P/Q、Y129M、K143Q/R、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、G225A/C/P/W、T228A/G/H/I/K/S/V/Y、Y235G/I/L/Q/S/V、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、和N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，(ii)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、D/H/N67A/D/E/G/P/Q/S/V、A/N/S97E/L/P/Q、F/Y129M、D/K/Q143Q/R、P168A/E/G/L/M/S/T、L/Q184D/F/H/L/M/P、G/H225A/C/P/W、T228A/G/H/I/K/S/V/Y、A/D/Y235G/I/L/Q/S/V、K/R/T244A/C/G/L/M/P/S、P/S/T258A/D/E/G/M/N/P/T、和D/E/N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，或(iii)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、N97E/L/P/Q、Y129M、K143Q/R、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、G225A/C/P/W、T228A/G/H/I/K/S/V/Y、Y235G/I/L/Q/S/V、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、和N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:2在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个变异：(i)19、38、67、129、168、184、225、244、258、和261，或(ii)19、38、67、97、129、168、184、244、258、和261；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。甚至还仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异：(i)X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X129M、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X225A/C/P/W、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，或(ii)X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X97E/L/P/Q、X129M、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；其中X是任何氨基酸；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。还仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异：(i)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、D/H/N67A/D/E/G/P/Q/S/V、F/Y129M、P168A/E/G/L/M/S/T、L/Q184D/F/H/L/M/P、G/H225A/C/P/W、K/R/T244A/C/G/L/M/P/S、P/S/T258A/D/E/G/M/N/P/T、和D/E/N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，(ii)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、Y129M、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、G225A/C/P/W、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、和N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，或(iii)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、N97E/L/P/Q、Y129M、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、和N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
甚至还仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:2在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个变异：(i)85、19-85、38-85、67-85、85-129、85-168、85-184、85-225、85-244、85-258、和85-261，或(ii)19-85、38-85、67-85、85-129、85-168、85-184、85-225、85-244、85-258、和85-261；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中所述变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异：(i)X85L、X19E/V-X85L、X38E/I/L/M/Q/R/V-X85L、X67A/D/E/G/P/Q/S/V-X85L、X85L-X129M、X85L-X168A/E/G/L/M/S/T、X85L-X184D/F/H/L/M/P、X85L-X225A/C/P/W、X85L-X244A/C/G/L/M/P/S、X85L-X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X85L-X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，(ii)X85L、X19E-X85L、X38E-X85L、X67D-X85L、X85L-X129M、X85L-X168S、X85L-X184L、X85L-X225P、X85L-X244L、X85L-X258D、和X85L-X261R，或(iii)X19E-X85L、X38E-X85L、X67D-X85L、X85L-X129M、X85L-X168S、X85L-X184L、X85L-X225P、X85L-X244L、X85L-X258D、和X85L-X261R；其中X是任何氨基酸；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中所述变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。还另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异：(i)P/V85L、P19E/V-P/V85L、T38E/I/L/M/Q/R/V-P/V85L、D/H/N67A/D/E/G/P/Q/S/V-P/V85L、P/V85L-F/Y129M、P/V85L-P168A/E/G/L/M/S/T、P/V85L-L/Q184D/F/H/L/M/P、P/V85L-G/H225A/C/P/W、P/V85L-K/R/T244A/C/G/L/M/P/S、P/V85L-P/S/T258A/D/E/G/M/N/P/T、和P/V85L-D/E/N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，(ii)P85L、P19E/V-P85L、T38E/I/L/M/Q/R/V-P85L、H67A/D/E/G/P/Q/S/V-P85L、P85L-F129M、P85L-P168A/E/G/L/M/S/T、P85L-Q184D/F/H/L/M/P、P85L-H225A/C/P/W、P85L-R244A/C/G/L/M/P/S、P85L-P258A/D/E/G/M/N/P/T、和P85L-E261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，(iii)P85L、P19E-P85L、T38E-P85L、N/H67D-P85L、P85L-F/Y129M、P85L-P168S、P85L-Q184L、P85L-G/H225P、P85L-K/R244L、P85L-S/P258D、和P85L-N/E261R，(iv)P85L、P19E-P85L、T38E-P85L、H67D-P85L、P85L-F129M、P85L-P168S、P85L-Q184L、P85L-H225P、P85L-R244L、P85L-P258D、和P85L-E261R，或(v)P19E-P85L、T38E-P85L、H67D-P85L、P85L-F129M、P85L-P168S、P85L-Q184L、P85L-H225P、P85L-R244L、P85L-P258D、和P85L-E261R；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
在另外的实施例中，甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少59％或至少80％的氨基酸序列同一性。在另一个实施例中，参比多肽包括在甘露聚糖酶(内切1,4β-甘露糖苷酶，EC 3.2.1.78)的GH5_8亚家族内的天然存在的和重组的甘露聚糖酶。甘露聚糖酶的GH5_8亚家族在以下文献中更全面地进行了描述：Aspeborg等人(2012)，Evolution,substrate specificity and subfamily classification of glycosyl hydrolasefamily 5(GH5)[糖基水解酶家族5(GH5)的进化、底物特异性和亚家族分类]，BMCEvolutionary Biology[BMC进化生物学]，12:186。在还另一个实施例中，参比多肽是GH5甘露聚糖酶。在仍还另一个实施例中，参比多肽选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、和SEQ ID NO:17。在还甚至仍另外的实施例中，甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段与参比多肽的氨基酸序列具有至少59％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列同一性。在甚至另外的实施例中，甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段是GH5甘露聚糖酶。在仍还另外的实施例中，甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段具有一个或多个超过参比多肽的改进的性质。在甚至仍还另外的实施例中，一个或多个超过参比多肽的改进的性质选自热稳定性、洗涤剂稳定性、针对甘露聚糖底物的比活性、以及用于衣物洗涤和餐具洗涤应用的对相关底物的清洁性能。在还仍另外的实施例中，一个或多个超过参比多肽的改进的性质选自热稳定性、针对甘露聚糖底物的比活性、以及用于衣物洗涤和餐具洗涤应用的对相关底物的清洁性能。
附图说明
图1描绘了1WKY_A甘露聚糖酶与PspMan118甘露聚糖酶变体的结构比较，其中1WKY_A甘露聚糖酶的主链显示为灰色，并且PspMan118甘露聚糖酶的主链显示为黑色。
图2描绘了PspMan118和1WKY_A结构在NDL区域和PspMan118的缺失基序中的结构比较。
图3A描绘了PspMan148(黑色)和2WHL_A(浅灰色)甘露聚糖酶的主链折叠的比较，其中与2WHL_A结合的甘露三糖基部分显示为灰色棒(以指示底物结合位点的相对位置)并且在PspMan148中存在的十八个氨基酸取代的侧链显示为黑色棒形图。
图3B描绘了PspMan148(黑色)和2WHL_A(浅灰色)甘露聚糖酶的主链折叠的比较，其中与2WHL_A结合的甘露三糖基部分显示为灰色棒(以指示底物结合位点的相对位置)并且在PspMan148中围绕和靠近底物结合位点的七个取代(S30T、S59V、L60Q、K63R、T228V、S258D和N261R)的位置显示为黑色球形。
图3C描绘了PspMan148(黑色)和2WHL_A(浅灰色)甘露聚糖酶的主链折叠的比较，其中与2WHL_A结合的甘露三糖基部分显示为灰色棒(以指示底物结合位点的相对位置)并且在PspMan148中的十一个表面取代显示为黑色球形。
图4A-B描绘了使用MUSCLE软件进行的PspMan4的(SEQ ID NO:2)、PspMan148(SEQID NO:7)、BspMan5(SEQ ID NO:16)、US 6566114-002(残基32-330)(SEQ ID NO:15)、US6566114-002(残基32-340)(SEQ ID NO:17)、WO 2015022428-0015(SEQ ID NO:8)、和2WHL_A(SEQ ID NO:9)的甘露聚糖酶催化结构域的多重序列比对，其中PspMan4中的生产性位置以下划线和粗体字体显示。
本文描述的是来自类芽孢杆菌属物种或芽孢杆菌属物种的内切-β-甘露聚糖酶、编码此类内切-β-甘露聚糖酶的多核苷酸、含有此类甘露聚糖酶的清洁组合物、以及使用其的方法。在一个实施例中，本文描述的类芽孢杆菌属物种或芽孢杆菌属物种内切-β-甘露聚糖酶具有糖基水解酶活性和/或在清洁组合物和/或蛋白酶存在的情况下是稳定的。本文描述的内切-β-甘露聚糖酶的这些特征使其适合用于各种清洁和其他工业应用中，例如，在这些工业应用中酶可以在表面活性剂、蛋白酶和/或在洗涤剂组合物中发现的其他组分存在的情况下水解甘露聚糖。
为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语和缩写应当符合本领域中所使用的常规含义。例如，本文未定义的技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常理解的相同的含义(参见，例如，Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology[微生物学和分子生物学字典]，第2版，John Wiley and Sons[约翰·威利父子出版公司]，纽约，1994以及Hale和Marham，The Harper Collins Dictionary ofBiology[哈珀柯林斯生物学词典]，Harper Perennial[哈珀永久出版社]，纽约，1991)。
除非上下文另有明确指示，单数“一个/一种”(a/an)和“该/所述”(the)包括复数引用。
术语“甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶”、“内切-1,4-β-甘露聚糖酶”、“内切-β-1,4-甘露聚糖酶”、“β-甘露聚糖酶B”、“β-1,4-甘露聚糖4-甘露糖水解酶”、“内切-β-甘露聚糖酶”、“β-D-甘露聚糖酶”、“1,4-β-D-甘露聚糖甘露糖水解酶”或“内切-β-甘露聚糖酶”(EC3.2.1.78)是指能够随机水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖、和葡甘露聚糖中的1,4-β-D-甘露糖苷键的酶。内切-1,4-β-甘露聚糖酶是糖基水解酶的几个家族(包括GH26和GH5)的成员。具体地，内切-β-甘露聚糖酶构成一组降解甘露聚糖的多糖酶，并且代表能够切割含有甘露糖单元的多糖链(即，能够切割甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖中的糖苷键)的酶。本文描述的“内切-β-甘露聚糖酶”可以具有另外的酶活性(例如，内切-1,4-β-葡聚糖酶、1,4-β-甘露糖苷酶、和纤维糊精酶活性)。
术语“甘露聚糖酶(mannanase)”、“甘露糖苷酶(mannosidic enzyme)”、“甘露糖水解酶(mannolytic enzyme)”、“甘露聚糖酶(mannanase enzyme)”、“甘露聚糖酶多肽”、或“甘露聚糖酶蛋白质”是指可以降解甘露聚糖的酶、多肽、或蛋白质。甘露聚糖酶可以例如是内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、或糖基水解酶。如本文所使用的，可以根据本领域已知的任何程序确定甘露聚糖酶活性(参见，例如，Lever，Anal.Biochem[分析生物化学]，47:273，1972；Eriksson和Winell，Acta Chem.Scand.[斯堪的纳维亚化学学报]，(1968)，22:1924；US 6602842；和WO 9535362A1)。
如本文所使用的，“甘露聚糖”是具有由β-1,4-连接的甘露糖构成的主链的多糖；“葡甘露聚糖”是具有或多或少规律交替的β-1,4连接的甘露糖和葡萄糖的主链的多糖；“半乳甘露聚糖”和“半乳葡甘露聚糖”是具有α-1,6连接的半乳糖侧枝的甘露聚糖和葡甘露聚糖。这些化合物可以是乙酰化的。通过半乳糖侧枝的全部或部分去除促进半乳甘露聚糖和半乳糖葡甘露聚糖的降解。此外，通过全部或部分脱乙酰化促进乙酰化的甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的降解。可以通过碱或通过甘露聚糖乙酰酯酶去除乙酰基基团。从甘露聚糖酶或通过甘露聚糖酶与α-半乳糖苷酶和/或甘露聚糖乙酰酯酶的组合释放的寡聚物可以通过β-甘露糖苷酶和/或β-葡糖苷酶进一步降解以释放游离的麦芽糖。
术语“修饰”是指氨基酸序列中的任何变化或改变，包括用与起始氨基酸不同的氨基酸对目的氨基酸序列的鉴定位置处的氨基酸进行的取代、在目的氨基酸序列的鉴定位置处的氨基酸的缺失、在目的氨基酸序列的鉴定位置处的氨基酸的插入、在目的氨基酸序列中的氨基酸侧链的替换、和/或目的氨基酸序列的化学修饰。
术语“催化活性”或“活性”定量地描述了给定底物在限定的反应条件下的转化。术语“残留活性”被定义为酶在某一组条件下的催化活性与在不同组条件下的催化活性的比率。术语“比活性”定量地描述了每单位酶量在限定的反应条件下的催化活性。
术语“pH稳定性”描述了蛋白质承受对与其稳定性为最佳的pH值显著地背离的pH值(例如高于或低于最佳pH值超过一个pH单位)的有限暴露，而不会在其活性为可测量的情况下丧失其活性的能力。
术语“洗涤剂稳定性”是指特定的洗涤剂组合物组分(如水解酶)在洗涤剂组合物混合物中的稳定性。
术语“过水解酶”是指能够催化如下反应的酶，该反应导致适合用于诸如清洁、漂白和消毒等应用的过酸的形成。
如在短语“水性组合物”和“水性环境”中使用的，术语“水性”是指由至少50％水构成的组合物。水性组合物可以含有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、或99％的水。
术语“表面活性剂”是指在本领域中通常被认为具有表面活性质量的任何化合物。表面活性剂通常包括阴离子、阳离子、非离子和两性离子化合物，其在本文中进一步描述。
术语“表面特性”用于指静电电荷、以及诸如通过蛋白质表面展现的疏水性和亲水性等特性。
术语“螯合剂稳定性”是指本披露的内切-β-甘露聚糖酶在本文披露的甘露糖苷、水解、清洁或其他过程期间盛行的条件下，例如当暴露于螯合剂或与螯合剂接触时，经给定时间段保留指定量的酶活性。在一些实施例中，在与螯合剂接触给定的时间段(例如至少约10分钟、约20分钟、约40分钟、约60分钟、约100分钟等)之后，甘露聚糖酶保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的甘露聚糖酶活性。
术语“热稳定性(thermal stability)”和“热稳定的(thermostable)”是指在甘露糖苷、水解、清洁或其他过程期间盛行的条件下，例如当暴露于升高的温度时，暴露于升高的温度经给定的时间段之后，甘露聚糖酶保留指定量的酶活性。在一些实施例中，在暴露于升高的温度(例如至少约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、或约70℃)经给定的时间段(例如至少约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、120分钟、180分钟、240分钟、300分钟等)之后，甘露聚糖酶保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％甘露聚糖酶活性。
术语“清洁活性”是指在本文披露的甘露糖苷、水解、清洁、或其他过程期间盛行的条件下，通过内切-β-甘露聚糖酶实现的清洁性能。在一些实施例中，通过应用涉及由食品产品、家用试剂或个人护理产品引起的酶敏感性污渍的各种清洁测定来确定清洁性能。如将使污渍经受标准洗涤条件后通过各种色谱法、分光光度法或其他定量方法确定的，这些污渍中的一些包括例如冰淇淋、番茄酱、烧烤酱、蛋黄酱、汤、巧克力奶、巧克力布丁、冷冻甜点、洗发水、润肤露、防晒产品、牙膏、刺槐豆胶或瓜尔豆胶。示例性测定包括但不限于描述于WO 99/34011、US 6,605,458、和US 6,566,114中的那些测定，以及描述于实例中的那些方法。
术语“清洁表面”和“清洁纺织品”分别是指分别具有弄脏的表面或纺织品的至少10％、优选地至少15％、20％、25％、30％、35％、或40％的污渍去除百分比的表面或纺织品。
当与甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段结合使用时，术语“有效量”是指在特定的清洁组合物中实现所希望的酶活性水平所需要的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的量。此类有效量由本领域的普通技术人员容易地确定，并且是基于许多因素的，例如所使用的具体的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段、清洁应用、清洁组合物的具体组成、以及是否需要液体或干的(例如颗粒状、棒状、粉末、固体、液体、片剂、凝胶、糊状、泡沫、薄片或单位剂量)组合物等。
当与清洁组合物结合使用时，术语“辅助成分”意指为所希望的特定类型的清洁组合物以及产品形式(例如液体、颗粒状、粉末、棒状、糊状、片剂、凝胶、单位剂量、薄片或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料还优选地与用于该组合物中的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段相容。在一些实施例中，颗粒状组合物处于“紧密”形式，而在其他实施例中，液体组合物处于“浓缩”形式。
术语“清洁组合物”和“清洁配制品”是指可用于从待清洁的物品或表面(如例如织物、餐具、隐形眼镜，固体表面、头发、皮肤和牙齿)去除不希望的化合物(例如污垢或污渍)的化学成分的混合物。取决于待清洁的表面或物品以及组合物或配制品的所希望的形式，组合物或配制品可以是处于液体、凝胶、颗粒状、粉末、棒状、糊状、喷雾片剂、凝胶、单位剂量、薄片或泡沫的形式。
术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”是指旨在用于洗涤介质(用于清洁弄脏的物体)中的化学成分的混合物。洗涤剂组合物/配制品通常包括至少一种表面活性剂，并且可以任选地包括水解酶、氧化还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、遮蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和增溶剂。
术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁餐具(dishware)和餐刀(cutlery)的所有形式的组合物，包括例如颗粒、单位剂量和液体形式。在一些实施例中，餐具洗涤组合物是可用于自动餐具洗涤机中的"自动餐具洗涤"组合物。术语“餐具”是指任何材料(包括但不限于陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃和丙烯酸树脂)的餐具(例如盘子、杯子、玻璃杯、碗和容器)和餐刀(例如，器皿用具(utensil)，包括但不限于勺子、刀和叉子)。
术语“漂白”是指处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面持续足够长的时间并且在适当的pH和温度条件下处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面以实现该材料的增白(即变白)和/或清洁。适合于漂白的化学品的实施例包括但不限于ClO2、H2O2、过酸、和NO2。
术语甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的“洗涤性能”是指变体或其重组多肽或活性片段对洗涤为洗涤剂组合物提供另外的清洁性能的贡献。在相关洗涤条件下比较洗涤性能。本文所使用的术语“相关洗涤条件”指示在餐具或衣物洗涤剂细分市场中实际用于家用的条件，具体是洗涤温度、时间、洗涤力学、肥皂水浓度、洗涤剂类型以及水硬度。
如本文所使用的，术语“消毒”是指从表面除去污染物，以及在物品表面上抑制或杀死微生物。
本文清洁组合物的“紧密”形式最好通过密度来反映，并且就组合物而言通过无机填料盐的量来反映。无机填料盐是处于粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐以相当大的量存在，典型地为总组合物的约17％至约35％(以重量计)。相比之下，在紧密的组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15％的量存在。在一些实施例中，填料盐以不超过组合物(以重量计)的约10％、或更优选地约5％的量存在。在一些实施例中，无机填料盐选自硫酸盐和氯化物的碱盐和碱土金属盐。在一些实施例中，优选的填料盐是硫酸钠。
术语“织物”是指例如机织物、针织物、和非机织材料，以及可以转化成例如纱线和机织物、针织物、和非机织材料的短纤维和长丝。该术语涵盖从天然的以及合成的(例如制造的)纤维制成的材料。
当核酸或多核苷酸至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、和细胞)分离时，该核酸或多核苷酸是“分离的”。类似地，当多肽、蛋白质或肽至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、和细胞)分离时，该多肽、蛋白质或肽是“分离的”。以摩尔计，在组合物中分离的种类比其他种类更丰富。例如，分离的种类可以包含存在的所有大分子种类的至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％(以摩尔计)。优选地，将感兴趣的种类纯化至基本均一性(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物种类)。可以分别使用本领域熟知的许多技术例如核酸或蛋白质样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着通过染色后可视化来确定纯度和均一性。如果需要，可以使用高分辨率技术例如高效液相色谱法(HPLC)或类似方法来纯化物质。
术语“纯化的”如应用于核酸或多肽时通常表示基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术确定的(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的培养基中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或更加纯的(例如，在摩尔基础上按重量计的百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子的浓度的大幅度增加时，对于该分子而言组合物被富集了。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他特定物质或组分以高于在起始组合物中的相对或绝对浓度存在于组合物中。
如本文所使用的，“多肽”是指包含通过肽键连接的多个氨基酸的分子。术语“多肽”、“肽”、和“蛋白质”可互换地使用。蛋白质可以任选地被修饰(例如，糖基化、磷酸化、酰化、法尼基化、异戊二烯化和磺化)以增加功能性。当此类氨基酸序列展现出活性时，它们可以被称为“酶”。使用针对氨基酸残基的常规单字母或三字母密码，采用标准氨基-至-羧基端取向(即N→C)表示的氨基酸序列。
术语“多核苷酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、异源双链体、以及合成分子。核酸可以是单链的或双链的，并且可以具有化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换地使用。由于遗传密码是简并的，可以使用多于一个密码子来编码特定的氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，核酸序列以5'至3'取向呈现。
关于多肽，术语“野生型”和“亲本”是指在一个或多个氨基酸位置处不包括人造的取代、插入或缺失的天然存在的多肽。相似地，关于多核苷酸，术语“野生型”和“亲本”是指在一个或多个核苷处不包括人造的取代、插入或缺失的天然存在的多核苷酸。然而，注意编码野生型或亲本多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型或亲本多肽的任何多核苷酸。
如本文所使用的，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如多肽或核酸序列)。相反，术语“非天然存在的”是指在自然界中没有发现的任何物质(例如，在实验室中生产的重组核酸和多肽序列、或野生型序列的修饰)。
关于多肽，术语“参比”是指在一个或多个氨基酸位置处不包括人造的取代、插入、或缺失的天然存在的多肽，以及在一个或多个氨基酸位置处包括一个或多个人造的取代、插入、或缺失的天然存在的或合成的多肽。相似地，关于多核苷酸，术语"参比"是指在一个或多个核苷处不包括人造的取代、插入、或缺失的天然存在的多核苷酸，以及在一个或多个核苷处包括一个或多个人造的取代、插入、或缺失的天然存在的或合成的多核苷酸。例如，编码野生型或亲本多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型或亲本多肽的任何多核苷酸。
当在短语“相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异”中使用时，术语“一个或多个变异”涵盖与存在于SEQ ID NO:2中相应位置处的氨基酸不同的每个氨基酸。例如，根据列于图4A-B中的比对将目的变体的序列与SEQ ID NO:2进行比对，并且将该变体中的每个位置与SEQ ID NO:2进行比较，以鉴定每个位置处与存在于SEQ ID NO:2中相应位置处的氨基酸不同的氨基酸，并且与SEQ ID NO:2中相应氨基酸不同的每个氨基酸为变异。
单字母密码“Z”标识亲本或参比氨基酸序列中的插入或缺失。对于相对于亲本或参比序列的插入，单字母密码“Z”位于位置编号的左侧并进一步包括在插入其中的每个氨基酸之前的数字(例如，.01)以指示插入的顺序。例如，在位置298处的一个氨基酸(谷氨酰胺(Q))的插入将被描绘为“Z298.01Q”；在位置298处的一个氨基酸X(其中X可以是任何氨基酸)的插入将被描绘为“Z298.01X”；并且在位置87与88之间的三个氨基酸(丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和酪氨酸(Y))的插入将被描绘为“Z87.01A/Z87.02S/Z87.03Y”。对于缺失，单字母密码“Z”位于位置编号的右侧。例如，丙氨酸(A)从位置100的缺失将被描绘为A100Z。以上插入和缺失的一些的组合将被描绘为：“G87S/Z87.01A/Z87.02S/Z87.03Y/A100Z”。
本文描述的氨基酸取代使用以下命名法中的一个或多个：位置或起始氨基酸:位置:一个或多个取代的氨基酸。对仅一个位置的提及涵盖可以存在于参比多肽、亲本或基准分子中在该位置处的任何起始氨基酸，以及此类起始氨基酸可以被其取代的任何氨基酸(即，经取代的氨基酸必须排除此类参比多肽、亲本或基准分子的起始氨基酸)。对经取代的氨基酸的提及可以进一步表示为由斜线(“/”)分开的若干个经取代的氨基酸。例如，X130A/N-209-213代表三个氨基酸取代组合，其中X是在位置130处的可以被丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)取代的任何起始氨基酸；209代表任何起始氨基酸可以被不是起始氨基酸的氨基酸取代的位置；并且213代表任何起始氨基酸可以被不是起始氨基酸的氨基酸取代的位置。通过另外的实例，S101F/G/H/T/V代表在位置101处的五个可能的取代，其中该起始氨基酸丝氨酸(S)可以被苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、苏氨酸(T)、或缬氨酸(V)取代。
术语“甘露聚糖酶变体”是指通过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸，典型地通过重组DNA技术衍生自参比多肽的多肽。甘露聚糖酶变体与参比多肽可以相差小数量的氨基酸残基并且可以通过与参比多肽在催化结构域的长度上的一级氨基酸序列同源性/同一性的水平来定义。例如，甘露聚糖酶变体与参比多肽具有至少59％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列同一性。参比多肽包括在甘露聚糖酶(内切-1,4β-甘露糖苷酶，EC 3.2.1.78)的GH5_8亚家族内的天然存在的和重组的甘露聚糖酶。该GH5_8亚家族在以下文献中更全面地进行了描述：Aspeborg等人(2012)，Evolution,substrate specificity and subfamily classification of glycosyl hydrolasefamily 5(GH5)[糖基水解酶家族5(GH5)的进化、底物特异性和亚家族分类]，BMCEvolutionary Biology[BMC进化生物学]，12:186。示例性GH5_8细菌甘露聚糖酶包括例如，NDL-进化枝甘露聚糖酶(如例如，PspMan4(SEQ ID NO:2))；以及其他甘露聚糖酶(如例如，BspMan5(SEQ ID NO:16))及其变体、芽孢杆菌属物种1WKY_A(BAD99527.1)(SEQ ID NO:10)、黏琼脂芽孢杆菌2WHL_A(Q5YEX6的残基30-330)(SEQ ID NO:9)、WO2015022428-0015(SEQ ID NO:8)、US 6566114-002的残基32-330(SEQ ID NO:15)、和US 6566114-002的残基32-340(SEQ ID NO:17))。甘露聚糖酶的NDL-进化枝在以下文献中更全面地进行了描述：于2015年7月10日提交的国际专利申请号PCT/US 15/40057，其随后公开为WO 2016/007929。
术语“变体多核苷酸”是指编码甘露聚糖酶变体、与亲本多核苷酸具有指定程度的同源性/同一性、或在严格条件下与亲本多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸。例如，变体多核苷酸与亲本多核苷酸具有至少59％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的核苷酸序列同一性。
可以使用已知的程序(如BLAST、ALIGN、和CLUSTAL)使用标准参数确定序列同一性。(参见，例如，Altschul等人，[1990]J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410；Henikoff等人，[1989]Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]89:10915；Karin等人，[1993]Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]90:5873；和Higgins等人，[1988]Gene[基因]73:237-244)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI))公开获得。也可以使用FASTA(Pearson等人，[1988]Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院学报]85:2444-2448)来搜索数据库。两种多肽实质上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，多肽与第二多肽实质上相同，例如，其中两个肽仅相差保守取代。另一个用于比较多个蛋白质序列的有用的算法是来自Geneious软件(生物物质有限公司(Biomatters Ltd.))的MUSCLE程序(Robert C.Edgar，“MUSCLE:Multi sequence alignment with high accuracy and high throughput[MUSCLE：具有高精确度和高通量的多重序列比对]”，Nucl.Acids Res.[核酸研究](2004)32(5)：1792-1797)。
术语“衍生自”涵盖术语“起源于”、“获得自”、“可获得自”、“分离自”和“产生自”，并且通常表示一种指定的材料在另一种指定的材料中找到其起源或具有可以参考另一种指定的材料来描述的特征。
术语“杂交”是指通过碱基配对将核酸链与互补链连接的过程，如本领域已知的。
术语“杂交条件”是指进行杂交反应的条件。这些条件典型地根据在其下测量杂交的条件的“严格”程度来分类。严格程度可以是基于例如结合复合物或探针的核酸的解链温度(Tm)。例如，“最大严格”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针的Tm 5℃)；“高严格”发生在低于Tm约5℃-10℃；“中等严格”发生在低于探针的Tm约10℃-20℃；并且“低严格”发生在低于Tm约20℃-25℃。可替代地，或另外地，杂交条件可以基于杂交的盐或离子强度条件，和/或一次或多次严格洗涤，例如：6X SSC＝非常低严格；3X SSC＝低至中严格；1X SSC＝中严格；以及0.5X SSC＝高严格。在功能上，最大严格条件可以用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近乎严格同一性的核酸序列；而高严格条件用于鉴定与探针具有约80％或更高序列同一性的核酸序列。对于需要高选择性的应用，通常希望使用相对严格的条件来形成杂交(例如，使用相对较低的盐和/或高温条件)。
在至少两种核酸或多肽的上下文中，术语“基本相似”和“基本上同一”意指多核苷酸或多肽包含与亲本或参比序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列，或者包括只是为了规避本说明书而不添加功能性的氨基酸取代、插入、缺失或修饰的序列。
术语“表达载体”是指包含编码特定多肽的DNA序列的DNA构建体，并且有效地连接至能够在合适的宿主中实现多肽表达的合适的控制序列。这样的控制序列包括影响转录的启动子，控制这种转录的任选的操纵子序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒，或简单地是潜在的基因组插入物。一旦转化入合适的宿主中，载体可以独立于宿主基因组复制和起作用，或者在某些情况下可以整合入基因组本身。
术语“重组”是指如通过以下各项被修饰以改变其序列或表达特征的遗传材料(即核酸、它们编码的多肽、以及包含此类多核苷酸的载体和细胞)：使编码序列突变以产生改变的多肽，将编码序列融合到另一基因的编码序列，将基因置于不同启动子的控制下，在异源生物体中表达基因，以降低或升高的水平表达基因，以与其天然表达谱不同的方式有条件地或组成地表达基因，等等。通常，基于此的重组核酸、多肽和细胞已被人为操纵，这样使得它们与自然界中发现的相关的核酸、多肽和细胞不相同。
术语“信号序列”是指与多肽的N末端部分结合的并且促进成熟形式的蛋白质从细胞中分泌的氨基酸序列。细胞外蛋白质的成熟形式缺乏在分泌过程中被切除的信号序列。
术语“选择性标记”或“可选择标记”是指能够在宿主细胞中表达的、允许对包含导入的核酸或载体的那些宿主容易地选择的基因。可选择标记的实例包括但不限于在宿主细胞上赋予代谢优势(如营养优势)的抗微生物物质(例如，潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或基因。术语“可选择基因产物”是指编码在表达可选择标记的细胞上赋予抗生素或药物抗性的酶活性的基因。
如本文所使用的，术语“调节元件”是指控制核酸序列的表达的一些方面的遗传元件。例如，启动子是有利于可操作地连接的编码区的转录的起始的调控元件。另外的调节元件包括剪接信号、聚腺苷酸化信号和终止信号。
术语“宿主细胞”通常是指用本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染的原核或真核宿主。转化的宿主细胞能够复制编码蛋白质变体的载体或表达所希望的蛋白质变体。在编码蛋白质变体预成型(pre-form)或形式(pro-form)的载体的情况下，当表达时，这些变体典型地从宿主细胞分泌到宿主细胞培养基中。
在将核酸序列插入细胞中的背景下，术语“引入”意指转化、转导或转染。转化手段包括本领域已知的原生质体转化、氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA等等。(参见，Chang和Cohen，[1979]，Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]168:111-115；Smith等人，[1986]，Appl.Env.Microbiol.[应用与环境微生物学]51:634；和Ferrari等人，在Harwood，Bacillus[芽孢杆菌属]，Plenum Publishing Corporation[普莱南出版公司]，第57-72页，1989中的评论文章)。
当与数值结合使用时，术语“约”是指数值的-10％至+10％的范围。例如，短语“约6的pH值”是指从5.4至6.6的pH值。
本文所使用的任何标题是为了方便提供的，而不应该被解释为限制。在一个标题下包括的描述可能适用于整个说明书。
本文所披露的变体、组合物和方法涉及在一个或多个位置处包含一个或多个取代的重组甘露聚糖酶、或重组多肽或其活性片段，其中此类变体通过常规分子生物学技术产生(参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:Cold Spring Harbor LaboratoryPress[分子克隆：冷泉港实验室出版社])。
一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个取代：10、19、38、59、60、62、63、66、67、68、71、74、75、78、79、80、97、129、131、135、136、143、167、168、184、213、214、225、228、235、242、244、258、259、261、和283，其中该变体或其重组多肽或活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个取代：X10T、X10Q、X19V、X19E、X38I、X38Q、X38R、X38V、X38E、X38M、X38L、X59N、X59G、X59D、X59K、X59T、X59Q、X60F、X60M、X60V、X62V、X62I、X62Q、X62E、X63L、X66T、X66V、X66C、X67Q、X67P、X67G、X67A、X67V、X67D、X67E、X67S、X68W、X68R、X68L、X68M、X68S、X70V、X70R、X71H、X71D、X74Q、X74V、X74C、X74E、X75I、X78L、X78D、X78M、X78A、X79E、X79W、X79F、X80Q、X80T、X97E、X97Q、X97L、X97P、X129M、X131P、X135A、X135Q、X135C、X136E、X143Q、X143R、X167S、X167Y、X167W、X167L、X168E、X168L、X168M、X168G、X168S、X168T、X168A、X184L、X184M、X184F、X184H、X184D、X184P、X213E、X214C、X214Q、X225P、X225W、X225C、X225A、X228G、X228K、X228A、X228V、X228S、X228I、X228Y、X228H、X235S、X235G、X235V、X235Q、X235I、X235L、X242S、X242E、X244S、X244A、X244G、X244L、X244C、X244M、X244P、X258T、X258G、X258N、X258A、X258E、X258M、X258D、X258P、X259A、X259W、X259R、X259E、X259S、X261M、X261W、X261P、X261T、X261V、X261I、X261Y、X261Q、X261R、X261S、X283H、X283T、和X283G，其中X是任何氨基酸；其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个取代：N10T、N10Q、P19V、P19E、T38I、T38Q、T38R、T38V、T38E、T38M、T38L、S59N、S59G、S59D、S59K、S59T、S59Q、L60F、L60M、L60V、T62V、T62I、T62Q、T62E、K63L、L66T、L66V、L66C、N67Q、N67P、N67G、N67A、N67V、N67D、N67E、N67S、A68W、A68R、A68L、A68M、A68S、K70V、K70R、N71H、N71D、N74Q、N74V、N74C、N74E、V75I、Q78L、Q78D、Q78M、Q78A、N79E、N79W、N79F、K80Q、K80T、N97E、N97Q、N97L、N97P、Y129M、T131P、S135A、S135Q、S135C、A136E、K143Q、K143R、F167S、F167Y、F167W、F167L、P168E、P168L、P168M、P168G、P168S、P168T、P168A、Q184L、Q184M、Q184F、Q184H、Q184D、Q184P、N213E、K214C、K214Q、G225P、G225W、G225C、G225A、T228G、T228K、T228A、T228V、T228S、T228I、T228Y、T228H、Y235S、Y235G、Y235V、Y235Q、Y235I、Y235L、Q242S、Q242E、K244S、K244A、K244G、K244L、K244C、K244M、K244P、S258T、S258G、S258N、S258A、S258E、S258M、S258D、S258P、G259A、G259W、G259R、G259E、G259S、N261M、N261W、N261P、N261T、N261V、N261I、N261Y、N261Q、N261R、N261S、D283H、D283T、和D283G；其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
还另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个取代：19、38、63、67、71、97、129、143、168、184、225、228、235、244、258、和261，其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。甚至另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个取代：X19E、X19V、X38E、X38I、X38L、X38M、X38Q、X38R、X38V、X63L、X67A、X67D、X67E、X67G、X67P、X67Q、X67S、X67V、X71D、X71H、X97E、X97L、X97P、X97Q、X129M、X143Q、X143R、X168A、X168E、X168G、X168L、X168M、X168S、X168T、X184D、X184F、X184H、X184L、X184M、X184P、X225A、X225C、X225P、X225W、X228A、X228G、X228H、X228I、X228K、X228S、X228V、X228Y、X235G、X235I、X235L、X235Q、X235S、X235V、X244A、X244C、X244G、X244L、X244M、X244P、X244S、X258A、X258D、X258E、X258G、X258M、X258N、X258P、X258T、X261I、X261M、X261P、X261Q、X261R、X261S、X261T、X261V、X261W、和X261Y，其中X是任何氨基酸；其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。甚至仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个取代：P19E、P19V、T38E、T38I、T38L、T38M、T38Q、T38R、T38V、K63L、N67A、N67D、N67E、N67G、N67P、N67Q、N67S、N67V、N71D、N71H、N97E、N97L、N97P、N97Q、Y129M、K143Q、K143R、P168A、P168E、P168G、P168L、P168M、P168S、P168T、Q184D、Q184F、Q184H、Q184L、Q184M、Q184P、G225A、G225C、G225P、G225W、T228A、T228G、T228H、T228I、T228K、T228S、T228V、T228Y、Y235G、Y235I、Y235L、Y235Q、Y235S、Y235V、K244A、K244C、K244G、K244L、K244M、K244P、K244S、S258A、S258D、S258E、S258G、S258M、S258N、S258P、S258T、N261I、N261M、N261P、N261Q、N261R、N261S、N261T、N261V、N261W、和N261Y；其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个取代：19、38、67、97、129、168、184、244、258、和261，其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。甚至还仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个取代：X19E、X19V、X38E、X38I、X38L、X38M、X38Q、X38R、X38V、X67A、X67D、X67E、X67G、X67P、X67Q、X67S、X67V、X97E、X97L、X97P、X97Q、X129M、X168A、X168E、X168G、X168L、X168M、X168S、X168T、X184D、X184F、X184H、X184L、X184M、X184P、X244A、X244C、X244G、X244L、X244M、X244P、X244S、X258A、X258D、X258E、X258G、X258M、X258N、X258P、X258T、X261I、X261M、X261P、X261Q、X261R、X261S、X261T、X261V、X261W、和X261Y，其中X是任何氨基酸；其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。还仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个取代：P19E、P19V、T38E、T38I、T38L、T38M、T38Q、T38R、T38V、N67A、N67D、N67E、N67G、N67P、N67Q、N67S、N67V、N97E、N97L、N97P、N97Q、Y129M、P168A、P168E、P168G、P168L、P168M、P168S、P168T、Q184D、Q184F、Q184H、Q184L、Q184M、Q184P、K244A、K244C、K244G、K244L、K244M、K244P、K244S、S258A、S258D、S258E、S258G、S258M、S258N、S258P、S258T、N261I、N261M、N261P、N261Q、N261R、N261S、N261T、N261V、N261W、和N261Y；其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:2在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个变异：10、19、38、59、60、62、63、66、67、68、70、71、74、75、78、79、80、97、129、131、135、136、143、167、168、184、213、214、225、228、235、242、244、258、259、261、和283，其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的，并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQID NO:2的一个或多个变异：X10Q/T、X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X59D/G/K/N/Q/T、X60F/M/V、X62E/I/Q/V、X63L、X66C/T/V、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X68L/M/R/S/W、X70R/V、X71D/H、X74E/C/Q/V、X75I、X78A/D/L/M、X79E/F/W、X80Q/T、X97E/L/P/Q、X129M、X131P、X135A/C/Q、X136E、X143Q/R、X167L/S/W/Y、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X213E、X214C/Q、X225A/C/P/W、X228A/G/H/I/K/S/V/Y、X235G/I/L/Q/S/V、X242S/E、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、X259A/E/R/S/W、X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y、和X283G/H/T，其中X是任何氨基酸；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。仍然另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异：(i)N/T10Q/T、P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、G/S59D/G/K/N/Q/T、L/Q60F/M/V、E/T62E/I/Q/V、K63L、I/L66C/T/V、D/H/N67A/D/E/G/P/Q/S/V、A/T68L/M/R/S/W、K/R70R/V、E/N71D/H、E/N/S74E/C/Q/V、L/V75I、D/Q78A/D/L/M、N79E/F/W、H/K80Q/T、A/N/S97E/L/P/Q、F/Y129M、S/T131P、D/S135A/C/Q、A136E、D/K/Q143Q/R、F/Y167L/S/W/Y、P168A/E/G/L/M/S/T、L/Q184D/F/H/L/M/P、D/N213E、K/Q214C/Q、G/H225A/C/P/W、T228A/G/H/I/K/S/V/Y、A/D/Y235G/I/L/Q/S/V、E/Q242S/E、K/R/Y244A/C/G/L/M/P/S、P/S/T258A/D/E/G/M/N/P/T、E/G/S259A/E/R/S/W、D/E/N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y、和D/G283G/H/T，或(ii)N10Q/T、P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、S59D/G/K/N/Q/T、L60F/M/V、T62E/I/Q/V、K63L、L66C/T/V、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、A68L/M/R/S/W、K70R/V、N71D/H、N74E/C/Q/V、V75I、Q78A/D/L/M、N79E/F/W、K80Q/T、N97E/L/P/Q、Y129M、T131P、S135A/C/Q、A136E、K143Q/R、F167L/S/W/Y、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、N213E、K214C/Q、G225A/C/P/W、T228A/G/H/I/K/S/V/Y、Y235G/I/L/Q/S/V、Q242S/E、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、G259A/E/R/S/W、N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y、和D283G/H/T；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
还另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:2在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个变异：(i)19、38、63、67、71、97、129、143、168、184、225、228、235、244、258、和261，或(ii)19、38、67、97、129、143、168、184、225、228、235、244、258、和261；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。甚至另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQID NO:2的一个或多个变异：(i)X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X63L、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X71D/H、X97E/L/P/Q、X129M、X143Q/R、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X225A/C/P/W、X228A/G/H/I/K/S/V/Y、X235G/I/L/Q/S/V、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，或(ii)X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X97E/L/P/Q、X129M、X143Q/R、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X225A/C/P/W、X228A/G/H/I/K/S/V/Y、X235G/I/L/Q/S/V、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；其中X是任何氨基酸；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。甚至仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异：(i)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、K63L、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、N71D/H、N97E/L/P/Q、Y129M、K143Q/R、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、G225A/C/P/W、T228A/G/H/I/K/S/V/Y、Y235G/I/L/Q/S/V、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、和N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，(ii)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、D/H/N67A/D/E/G/P/Q/S/V、A/N/S97E/L/P/Q、F/Y129M、D/K/Q143Q/R、P168A/E/G/L/M/S/T、L/Q184D/F/H/L/M/P、G/H225A/C/P/W、T228A/G/H/I/K/S/V/Y、A/D/Y235G/I/L/Q/S/V、K/R/T244A/C/G/L/M/P/S、P/S/T258A/D/E/G/M/N/P/T、和D/E/N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，或(iii)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、N97E/L/P/Q、Y129M、K143Q/R、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、G225A/C/P/W、T228A/G/H/I/K/S/V/Y、Y235G/I/L/Q/S/V、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、和N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:2在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个变异：(i)19、38、67、129、168、184、225、244、258、和261，或(ii)19、38、67、97、129、168、184、244、258、和261；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个取代：(i)19、38、67、129、168、184、225、244、258、和261；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。甚至还仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异：(i)X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X129M、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X225A/C/P/W、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，或(ii)X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X97E/L/P/Q、X129M、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；其中X是任何氨基酸；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的一个或多个取代：X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X129M、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X225A/C/P/W、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；其中X是任何氨基酸；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。还仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异：(i)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、D/H/N67A/D/E/G/P/Q/S/V、F/Y129M、P168A/E/G/L/M/S/T、L/Q184D/F/H/L/M/P、G/H225A/C/P/W、K/R/T244A/C/G/L/M/P/S、P/S/T258A/D/E/G/M/N/P/T、和D/E/N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，(ii)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、Y129M、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、G225A/C/P/W、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、和N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，或(iii)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、N97E/L/P/Q、Y129M、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、和N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。甚至另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的一个或多个取代：P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、Y129M、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、G225A/C/P/W、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、和N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
甚至还仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:2在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个变异：(i)85、19-85、38-85、67-85、85-129、85-168、85-184、85-225、85-244、85-258、和85-261，或(ii)19-85、38-85、67-85、85-129、85-168、85-184、85-225、85-244、85-258、和85-261；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个取代：(i)85、19-85、38-85、67-85、85-129、85-168、85-184、85-225、85-244、85-258、和85-261，或(ii)19-85、38-85、67-85、85-129、85-168、85-184、85-225、85-244、85-258、和85-261；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异：(i)X85L、X19E/V-X85L、X38E/I/L/M/Q/R/V-X85L、X67A/D/E/G/P/Q/S/V-X85L、X85L-X129M、X85L-X168A/E/G/L/M/S/T、X85L-X184D/F/H/L/M/P、X85L-X225A/C/P/W、X85L-X244A/C/G/L/M/P/S、X85L-X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X85L-X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，(ii)X85L、X19E-X85L、X38E-X85L、X67D-X85L、X85L-X129M、X85L-X168S、X85L-X184L、X85L-X225P、X85L-X244L、X85L-X258D、和X85L-X261R，或(iii)X19E-X85L、X38E-X85L、X67D-X85L、X85L-X129M、X85L-X168S、X85L-X184L、X85L-X225P、X85L-X244L、X85L-X258D、和X85L-X261R；其中X是任何氨基酸；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的一个或多个取代：(i)X85L、X19E/V-X85L、X38E/I/L/M/Q/R/V-X85L、X67A/D/E/G/P/Q/S/V-X85L、X85L-X129M、X85L-X168A/E/G/L/M/S/T、X85L-X184D/F/H/L/M/P、X85L-X225A/C/P/W、X85L-X244A/C/G/L/M/P/S、X85L-X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X85L-X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，(ii)X85L、X19E-X85L、X38E-X85L、X67D-X85L、X85L-X129M、X85L-X168S、X85L-X184L、X85L-X225P、X85L-X244L、X85L-X258D、和X85L-X261R，或(iii)X19E-X85L、X38E-X85L、X67D-X85L、X85L-X129M、X85L-X168S、X85L-X184L、X85L-X225P、X85L-X244L、X85L-X258D、和X85L-X261R；其中X是任何氨基酸；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。还另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异：(i)P/V85L、P19E/V-P/V85L、T38E/I/L/M/Q/R/V-P/V85L、D/H/N67A/D/E/G/P/Q/S/V-P/V85L、P/V85L-F/Y129M、P/V85L-P168A/E/G/L/M/S/T、P/V85L-L/Q184D/F/H/L/M/P、P/V85L-G/H225A/C/P/W、P/V85L-K/R/T244A/C/G/L/M/P/S、P/V85L-P/S/T258A/D/E/G/M/N/P/T、和P/V85L-D/E/N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，(ii)P85L、P19E/V-P85L、T38E/I/L/M/Q/R/V-P85L、H67A/D/E/G/P/Q/S/V-P85L、P85L-F129M、P85L-P168A/E/G/L/M/S/T、P85L-Q184D/F/H/L/M/P、P85L-H225A/C/P/W、P85L-R244A/C/G/L/M/P/S、P85L-P258A/D/E/G/M/N/P/T、和P85L-E261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，(iii)P85L、P19E-P85L、T38E-P85L、N/H67D-P85L、P85L-F/Y129M、P85L-P168S、P85L-Q184L、P85L-G/H225P、P85L-K/R244L、P85L-S/P258D、和P85L-N/E261R，(iv)P85L、P19E-P85L、T38E-P85L、H67D-P85L、P85L-F129M、P85L-P168S、P85L-Q184L、P85L-H225P、P85L-R244L、P85L-P258D、和P85L-E261R，或(v)P19E-P85L、T38E-P85L、H67D-P85L、P85L-F129M、P85L-P168S、P85L-Q184L、P85L-H225P、P85L-R244L、P85L-P258D、和P85L-E261R；其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ IDNO:2的氨基酸序列相对应来编号。还另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列包含选自以下的一个或多个取代：(i)P/V85L、P19E/V-P/V85L、T38E/I/L/M/Q/R/V-P/V85L、D/H/N67A/D/E/G/P/Q/S/V-P/V85L、P/V85L-F/Y129M、P/V85L-P168A/E/G/L/M/S/T、P/V85L-L/Q184D/F/H/L/M/P、P/V85L-G/H225A/C/P/W、P/V85L-K/R/T244A/C/G/L/M/P/S、P/V85L-P/S/T258A/D/E/G/M/N/P/T、和P/V85L-D/E/N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，(ii)P85L、P19E/V-P85L、T38E/I/L/M/Q/R/V-P85L、H67A/D/E/G/P/Q/S/V-P85L、P85L-F129M、P85L-P168A/E/G/L/M/S/T、P85L-Q184D/F/H/L/M/P、P85L-H225A/C/P/W、P85L-R244A/C/G/L/M/P/S、P85L-P258A/D/E/G/M/N/P/T、和P85L-E261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y，(iii)P85L、P19E-P85L、T38E-P85L、N/H67D-P85L、P85L-F/Y129M、P85L-P168S、P85L-Q184L、P85L-G/H225P、P85L-K/R244L、P85L-S/P258D、和P85L-N/E261R，(iv)P85L、P19E-P85L、T38E-P85L、H67D-P85L、P85L-F129M、P85L-P168S、P85L-Q184L、P85L-H225P、P85L-R244L、P85L-P258D、和P85L-E261R，或(v)P19E-P85L、T38E-P85L、H67D-P85L、P85L-F129M、P85L-P168S、P85L-Q184L、P85L-H225P、P85L-R244L、P85L-P258D、和P85L-E261R；并且其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
另一个实施例涉及甘露聚糖酶的NDL-进化枝，包括本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，其中所述变体、或重组多肽或其活性片段进一步包含选自以下的一个或多个基序：在位置31-40处的WXaKNDLXXAI(SEQ ID NO:11)基序，其中Xa是F或Y，并且X是任何氨基酸(“基序1”)；在位置263-274处的LDXXXGPXGXLT(SEQ ID NO:12)基序，其中X是任何氨基酸(“缺失基序1”)；在位置263-274处的LDX1V/AT/AGPX2GX3LT(SEQID NO:13)基序，其中X1是M或L，X2是N、A或S，并且X3是S、T或N(“缺失基序2”)；以及在位置263-274处的LDM/LATGPN/AGS/TLT(SEQ ID NO:14)基序(“缺失基序3”)，其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。还另外的实施例涉及甘露聚糖酶的NDL-进化枝，包括本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，其中所述变体、或重组多肽或其活性片段进一步包含选自以下的一个或多个基序：在位置31-40处的WXaKNDLXXAI(SEQ ID NO:11)基序，其中Xa是F或Y，并且X是任何氨基酸；在位置263-274处的LDXXXGPXGXLT(SEQ ID NO:12)基序，其中X是任何氨基酸；在位置263-274处的LDX1V/AT/AGPX2GX3LT(SEQ ID NO:13)基序，其中X1是M或L，X2是N、A或S，并且X3是S、T或N；以及在位置263-274处的LDM/LATGPN/AGS/TLT(SEQ ID NO:14)基序，其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU308431、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_053782127、PamMan2、PamMan3、PtuMan2、AAX87003、WP_046227931、WP_024633848、PpaMan2、WP_017813111、PspMan9、AEX60762、WP_046214462、YP_003868989、YP_003944884、WP_017427981、AAX87002、WP_009593769、YP_006190599、或WP_019912481。
另外的实施例涉及甘露聚糖酶的NDL-进化枝，包括本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，其中所述变体、或重组多肽或活性片段进一步包含在位置31-40处的WXaKNDLXXAI(SEQ ID NO:11)基序，其中Xa是F，并且X是任何氨基酸，其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU308431、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_053782127、WP_024633848、AAX87003、或AEX60762。仍另外的实施例涉及甘露聚糖酶的NDL-进化枝，包括本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，其中所述变体或重组多肽或其活性片段进一步包含在位置31-40处的WXaKNDLXXAI(SEQ ID NO:11)基序，其中Xa是F，并且X是任何氨基酸，其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU308431、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_053782127、WP_024633848、AAX87003、AEX60762、PamMan2、PamMan3、PtuMan2、PpaMan2、或PspMan9。
在仍另外的实施例中，甘露聚糖酶的NDL-进化枝包括本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，其中所述变体、或重组多肽或其活性片段进一步包含在位置263-274处的LDX1V/AT/AGPX2GX3LT(SEQ ID NO:13)或LDM/LATGPN/AGS/TLT(SEQID NO:14)基序，其中X1是M；X2是N、A或S；并且X3是S、T或N，其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、或WP_046214462。在还仍另外的实施例中，甘露聚糖酶的NDL-进化枝包括本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，其中所述变体、或重组多肽或其活性片段进一步包含在位置263-274处的LDX1V/AT/AGPX2GX3LT(SEQ ID NO:13)或LDM/LATGPN/AGS/TLT(SEQ ID NO:14)基序，其中X1是M；X2是N、A或S；并且X3是S、T或N，其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_046214462、或PamMan2。在仍另外的实施例中，甘露聚糖酶的NDL-进化枝包括本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，其中所述变体、或重组多肽或其活性片段进一步包含(i)在位置31-40处的WXaKNDLXXAI(SEQ ID NO:11)基序，其中Xa是F，并且X是任何氨基酸，以及(ii)在位置263-274处的LDX1V/AT/AGPX2GX3LT(SEQ ID NO:13)或LDM/LATGPN/AGS/TLT(SEQ ID NO:14)基序，其中X1是M；X2是N、A或S；并且X3是S、T或N，其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQID NO:2的氨基酸序列相对应来编号，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、或WP_017688745。在甚至仍另外的实施例中，甘露聚糖酶的NDL-进化枝包括本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，其中所述变体、或重组多肽或其活性片段进一步包含(i)在位置31-40处的WXaKNDLXXAI(SEQ ID NO:11)基序，其中Xa是F，并且X是任何氨基酸，以及(ii)在位置263-274处的LDX1V/AT/AGPX2GX3LT(SEQ ID NO:13)或LDM/LATGPN/AGS/TLT(SEQ ID NO:14)基序，其中X1是M；X2是N、A或S；并且X3是S、T或N，其中该变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、或PamMan2。
另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体或重组多肽或活性片段，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少59％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少80％或85％的氨基酸序列同一性，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_053782127、WP_024633848、AAX87003、WP_046227931、WP_017813111、AEX60762、或WP_046214462。甚至仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％或85％的氨基酸序列同一性，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_053782127、WP_024633848、AAX87003、WP_046227931、WP_017813111、AEX60762、WP_046214462、PamMan2、PamMan3、PtuMan2、PpaMan2、或PspMan9。甚至另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％或85％的氨基酸序列同一性，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_053782127、WP_024633848、AAX87003、WP_046227931、WP_017813111、AEX60762、WP_046214462、或EP2260105-0418。还另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％或85％的氨基酸序列同一性，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_053782127、WP_024633848、AAX87003、WP_046227931、WP_017813111、AEX60762、WP_046214462、EP2260105-0418、PamMan2、PamMan3、PtuMan2、PpaMan2、或PspMan9。仍还另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体或重组多肽或活性片段，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少88％的氨基酸序列同一性，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_053782127、WP_024633848、或AAX87003。另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体或重组多肽或活性片段，该氨基酸序列与SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有至少88％的氨基酸序列同一性，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_053782127、WP_024633848、AAX87003、PamMan2、PamMan3、PtuMan2、PpaMan2、或PspMan9。另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体或重组多肽或活性片段，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少88％的氨基酸序列同一性，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_053782127、WP_024633848、AAX87003、或EP2260105-0418。仍另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体或重组多肽或活性片段，该氨基酸序列与SEQID NO:2的氨基酸序列具有至少88％的氨基酸序列同一性，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_053782127、WP_024633848、AAX87003、EP2260105-0418、PamMan2、PamMan3、PtuMan2、PpaMan2、或PspMan9。甚至另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体或重组多肽或活性片段，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少92％的氨基酸序列同一性，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、或WP_017688745。还另外的实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体或重组多肽或活性片段，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少92％的氨基酸序列同一性，其条件是该变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、PamMan2、PamMan3、或PtuMan2。另一个实施例涉及包含如下氨基酸序列的甘露聚糖酶变体或重组多肽或活性片段，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％的氨基酸序列同一性。
在一个实施例中，参比多肽是GH5甘露聚糖酶。在另一个实施例中，本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体与参比多肽的氨基酸序列具有至少59％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列同一性。在还另一个实施例中，参比多肽选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IS NO:10、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、和SEQ ID NO:17。在仍另一个实施例中，参比多肽选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、和SEQ ID NO:10。
在另外的实施例中，SEQ ID NO:2是本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体从其衍生的参比多肽。在还另外的实施例中，本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体与SEQID NO:2的氨基酸序列具有至少59％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列同一性。在仍另外的实施例中，SEQ ID NO:8是本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体从其衍生的参比多肽。在还仍另外的实施例中，本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少59％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列同一性。在另一个实施例中，SEQ ID NO:9是本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体从其衍生的参比多肽。在还另一个实施例中，本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少59％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列同一性。在仍另一个实施例中，SEQID NO:10是本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体从其衍生的参比多肽。在仍还另外的实施例中，本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少59％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列同一性。在还仍另一个实施例中，SEQ ID NO:15或17是本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体从其衍生的参比多肽。在甚至仍还另一个实施例中，本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体与SEQID NO:15或17的氨基酸序列具有至少59％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列同一性。在另外的实施例中，SEQ ID NO:16是本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体从其衍生的参比多肽。在还另外的实施例中，本文所描述的一种或多种甘露聚糖酶变体与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少59％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列同一性。在甚至仍另外的实施例中，甘露聚糖酶变体是GH5甘露聚糖酶。
在一些实施例中，本文所描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段是分离的。在其他实施例中，本文所描述的甘露聚糖酶变体是内切-β-甘露聚糖酶。在另外的实施例中，本文所描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段具有甘露聚糖酶活性。在仍其他实施例中，本文所描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在表面活性剂存在的情况下具有甘露聚糖酶活性。在一些实施例中，甘露聚糖酶活性是对甘露聚糖胶、刺槐豆胶半乳甘露聚糖、和/或魔芋葡甘露聚糖的活性。在另外的实施例中，本文所描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在洗涤剂组合物中具有清洁活性。仍其他实施例涉及在蛋白酶存在的情况下具有甘露聚糖酶活性的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段。另外的实施例涉及水解选自下组的底物的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，该组由以下组成：瓜尔豆胶、刺槐豆胶、及其组合。在一些实施例中，本文所描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段不包含碳水化合物结合模块。
在一些实施例中，甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在宽范围的pH条件下具有酶活性。在某些实施例中，甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在从约4.0至约11.0的pH下具有酶活性。在另外的实施例中，甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在从约4.0至约11.0、约4.5至约9.0、约5.5至约8.5、或约6.0至约7.5的pH下具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％的甘露聚糖酶活性。
在仍另外的实施例中，甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在范围从20℃至约90℃、约30℃至约80℃、约20℃至约50℃、或约30℃至约66℃的温度下具有甘露聚糖酶活性。在某些实施例中，甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在范围从约20℃至约90℃、约30℃至约80℃、约20℃至约50℃、或约30℃至约66℃的温度下具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％的甘露聚糖酶活性。
还仍另外的实施例涉及本文所描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，其中该变体或重组多肽或其活性片段在4.5-9.0、5.5-8.5、或6.0-7.5的pH范围保留其最大甘露聚糖酶活性的至少70％。一些实施例涉及本文所描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，其中该变体或重组多肽或其活性片段在大于3.0、3.5、4.0或4.5的pH下或者在低于9.0、9.5或10.0的pH下保留其最大甘露聚糖酶活性的至少70％。在一些实施例中，甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在从约20℃-70℃、约30℃-70℃、约40℃-70℃、约45℃-65℃、约50℃-60℃、约60℃-70℃、或约60℃的温度下保留至少10％、20％、30％、40％或50％残留甘露聚糖酶活性。在甚至另外的实施例中，甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在约40-70℃、约45-75℃、约45-65℃、约50-60℃、或约60-70℃的温度范围下保留其最大甘露聚糖酶活性的至少70％。在其他实施例中，甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在高于20℃、25℃、30℃、35℃、或40℃的温度下或者在低于60℃、65℃、70℃、75℃、或80℃的温度下保留其最大甘露聚糖酶活性的至少70％。在仍另外的实施例中，保留的最大甘露聚糖酶活性的量经5分钟的时间段进行确定。
在某些其他实施例中，本文所描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段包括不实质上影响多肽的结构和/或功能的取代。示例性取代是保守突变，如表I中总结的。
表I.氨基酸取代
在一些实施例中，甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段具有1,4-β-D-甘露糖苷水解酶活性，其包括甘露聚糖酶、内切-1,4-β-D-甘露聚糖酶、外切-1,4-β-D-甘露聚糖酶半乳甘露聚糖酶、和/或葡甘露聚糖酶活性。使用本文描述的测定或通过本领域已知的其他测定可以确定和测量1,4-β-D-甘露糖苷水解酶活性。在一些实施例中，本发明的多肽在洗涤剂组合物存在的情况下具有活性。
在一些实施例中，本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段作为N-和/或C-末端融合蛋白产生，例如以帮助提取、检测和/或纯化和/或以增加变体或重组多肽或其活性片段的功能特性。融合蛋白伴侣的实例包括但不限于：谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6XHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)、FLAG、MYC、BCE103(WO 2010/044786)、或本领域技术人员熟知的其他标签。在一些实施例中，在融合蛋白伴侣与目的蛋白质序列之间提供蛋白水解切割位点以允许去除融合蛋白序列。优选地，融合蛋白不阻碍本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的活性。
在一些实施例中，本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段与包括前导肽、前肽、一个或多个结合结构域(模块)和/或催化结构域在内的功能结构域融合。合适的结合结构域包括但不限于具有各种特异性的碳水化合物结合模块(CBM)，在应用本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段期间对存在的碳水化合物组分提供增加的亲和力。如本文所描述的，本发明的多肽的CBM和催化结构域是有效连接的。
CBM被定义为碳水化合物活性酶内连续的氨基酸序列，该碳水化合物活性酶处于具有碳水化合物结合活性的独立折叠。一些例外是蛋白质中的纤维素酶体支架中的CBM和独立推定的CBM的罕见情况。CBM作为较大酶内的模块存在的需要将这类碳水化合物结合蛋白与其他非催化糖结合蛋白(如凝集素和糖转运蛋白)区分开。基于结合纤维素的若干个模块的最初发现，CBM先前被分类为纤维素结合结构域(CBD)(Tomme等人，Eur J Biochem[欧洲生物化学杂志]，170:575-581,1988；和Gilkes等人，J Biol Chem[生物化学杂志]，263:10401-10407,1988)。然而，不断发现碳水化合物活性酶中的另外的模块结合除纤维素以外的碳水化合物，但其他方面符合CBM标准，因此需要使用更具包容性的术语对这些多肽进行重新分类。纤维素结合结构域的先前分类是基于氨基酸相似性。CBD的分组被称为“类型”，并用罗马数字编号(例如I型或II型CBD)。为了与糖苷水解酶分类保持一致，这些分组现在被称为家族并用阿拉伯数字编号。家族1至13与I至XIII型相同(Tomme等人，在EnzymaticDegradation of Insoluble Polysaccharides[不溶性多糖的酶促降解](Saddler,J.N.和Penner,M.编辑)中，Cellulose-binding domains:classification and properties[纤维素结合结构域：分类和特性]，第142-163页，American Chemical Society[美国化学学会]，Washington[华盛顿]，1995)。关于CBM的结构和结合模式的详细综述可以在Boraston等人，Biochem J[生物化学杂志]，382:769-81,2004中找到。预期CBM的家族分类有助于鉴定CBM、预测结合特异性、帮助鉴定功能性残基、揭示进化关系，并可能预测多肽折叠。因为蛋白质的折叠比它们的序列更加保守，所以一些CBM家族可以分为超家族或宗族。目前的CBM家族是1-63。CBD在蛋白质的N-和C-末端发现或者是内部的。酶杂交体是本领域已知的(参见，例如，WO 9000609和WO 9516782)，并且可以通过以下方式来制备：将包含编码纤维素结合结构域的DNA的至少一个片段的DNA构建体转化到宿主细胞中，该纤维素结合结构域用或不用接头连接至编码本文所描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的DNA序列上，并且使宿主细胞生长以表达融合基因。
可以通过以下式描述酶杂交体：
CBM-MR-X或X-MR-CBM，其中CBM是氨基酸序列的N-末端或C-末端区域，该氨基酸序列对应于至少碳水化合物结合模块；MR是中部区域(接头)，并且可以是键，或从约2个至约100个碳原子、从约2个至约40个碳原子、从约2个至约100个氨基酸、或从约2个至约40个氨基酸的短连接基团；并且X是本文所描述的具有甘露聚糖酶催化活性的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的N-末端或C-末端区域。此外，甘露聚糖酶可以含有多于一个CBM或非糖分解功能的其他一个或多个模块/一个或多个结构域。术语“模块”和“结构域”在本披露中可互换地使用。
催化结构域的另外的非限制性实例包括：纤维素酶；半纤维素酶，如木聚糖酶；外切-甘露聚糖酶；葡聚糖酶；阿拉伯糖酶；半乳糖苷酶；果胶酶；和/或其他活性，如蛋白酶、脂肪酶、酸性磷酸酶和/或其他或其功能片段。融合蛋白通过接头序列任选地与本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段连接，该接头序列简单地连接甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段和融合结构域，而不显著影响任一组分的特性，或接头任选地具有对预期应用的功能重要性。
可替代地，将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段与一个或多个另外的目的蛋白质结合使用。目的蛋白质的非限制性实例包括：酰基转移酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪分解酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、金属蛋白酶和/或其他酶。
在其他实施例中，将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段融合至信号肽用于指导变体或多肽或其活性片段的胞外分泌。例如，在某些实施例中，信号肽是本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的天然信号肽。在其他实施例中，信号肽是非天然信号肽，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)AprE信号肽。
在一些实施例中，本发明的多肽在异源生物体(即有机体)而不是类芽孢杆菌属物种中表达。示例性异源生物体是革兰氏阳性(+)细菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus (先前为芽孢杆菌属)stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽胞杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、变铅青链霉菌(S.lividans)、或鼠灰链霉菌(S.murinus)；革兰氏阴性(-)细菌，如大肠杆菌(E.coli)；酵母菌，如酵母菌属物种(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母属物种(Schizosaccharomyces spp.)，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)；和丝状真菌，如曲霉属物种(Aspergillus spp.)，例如米曲霉(A.oryzae)或黑曲霉(A.niger)、和里氏木霉(T.reesei)。将核酸转化到这些生物体中的方法是本领域熟知的。用于转化曲霉属宿主细胞的合适的程序描述于EP 238023中。
在具体的实施例中，本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在异源生物中表达为分泌的多肽，在这种情况下，组合物和方法涵盖用于在异源生物体中将变体或重组多肽或其活性片段表达为分泌多肽的方法。
另外的实施例涉及生产本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的方法，这些方法包括：用包含编码甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的多核苷酸的表达载体稳定地转化宿主细胞；在合适的条件下培养该转化的宿主细胞，以产生甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段；并回收甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段。
还另一个实施例涉及编码本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的多核苷酸。在一个方面，该多核苷酸包含在表达载体中，该表达载体包含在异源生物体(如本文鉴定的那些)中。该多核苷酸可以有效地连接至调节元件(例如，启动子、终止子、增强子等)以辅助表达本文描述的编码的变体或重组多肽或其活性片段。
一些实施例涉及编码变体或重组多肽或其活性片段的多核苷酸，该变体或重组多肽或其活性片段与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少59％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。另外的实施例涉及多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少59％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施例中，将多核苷酸密码子优化用于在不同宿主中表达，突变以引入克隆位点，或另外改变以添加功能性。
在一些实施例中，将编码本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的多核苷酸融合至信号肽的编码序列的下游，该信号肽指导变体或重组多肽或其活性片段的胞外分泌。表达载体可以在异源宿主细胞中提供，该异源宿主细胞适合用于表达本文描述的变体或重组多肽或其活性片段、或者适合用于在将该表达载体引入合适的宿主细胞之前繁殖该表达载体。
在一些实施例中，编码变体或重组多肽或其活性片段的多核苷酸在特定的杂交条件下与SEQ ID NO:1的多核苷酸或其互补序列杂交。示例性条件是在本文中描述的严格条件和高度严格条件。
编码本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的DNA可以从公开的序列化学合成或直接从具有该基因的宿主细胞(例如通过cDNA文库筛选或PCR扩增)中获得。在一些实施例中，通过标准分子克隆技术将多核苷酸包含在表达盒中和/或克隆到合适的表达载体中。此类表达盒或载体含有辅助转录起始和终止的序列(例如启动子和终止子)，并且通常含有可选择标记。
将表达盒或载体引入合适的表达宿主细胞中，该表达宿主细胞饭后表达本文描述的相应的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段。特别合适的表达宿主是细菌表达宿主属，包括埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如萤光假单胞菌(P.fluorescens)或施氏假单胞菌(P.stutzerei))、变形杆菌属(Proteus)(例如奇异变形杆菌(P.mirabilis))、罗尔斯通菌属(Ralstonia)(例如富养罗尔斯通菌(R.eutropha))、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如肉葡萄球菌(S.carnosus))、乳球菌属(Lactococcus)(例如乳酸乳球菌(L.lactis)、或芽孢杆菌属(枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等)。还特别合适的是酵母表达宿主(如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)、多形汉逊酵母(H.polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)或毕赤酵母(P.pastoris))。尤其合适的是真菌表达宿主，如C.lucknowense、曲霉属(例如米曲菌、黑曲霉、构巢曲菌(A.nidulans)等)或里氏木霉。还合适的是哺乳动物表达宿主，如小鼠(例如，NS0)、中国仓鼠卵巢(CHO)或幼仓鼠肾(BHK)细胞系。其他真核生物宿主如昆虫细胞或病毒表达系统(例如，噬菌体如M13、T7噬菌体或λ，或病毒如杆状病毒)也适合用于生产本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段。
在特定感兴趣的宿主中与分泌的蛋白质相关的启动子和/或信号序列是在该宿主或在其他宿主中用于异源生产和分泌甘露聚糖酶的候选物。例如，在丝状真菌系统中，驱动纤维二糖水解酶I(cbh1)、葡糖淀粉酶A(glaA)、TAKA-淀粉酶(amyA)、木聚糖酶(exlA)的基因的启动子、gpd-启动子cbh1、cbhll、内切葡聚糖酶基因EGI-EGV、Cel61B、Cel74A、egl1-egl5、gpd启动子、Pgk1、pki1、EF-1α、tef1、cDNA1和hex1是特别合适的，并且可以衍生自许多不同的生物体(例如，黑曲霉、里氏木霉、米曲霉、泡盛曲霉(A.awamori)和构巢曲霉)。在一些实施例中，将多核苷酸与编码合适的同源或异源信号序列的多核苷酸重组缔合，该信号序列导致本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段分泌到细胞外(或周质)空间中，从而允许直接检测细胞上清液(或周质空间或裂解物)中的酶活性。大肠杆菌、其他革兰氏阴性细菌和本领域已知的其他生物体的特别合适的信号序列包括驱动HlyA、DsbA、Pbp、PhoA、PelB、OmpA、OmpT或M13噬菌体Gill基因的表达的那些。对于枯草芽孢杆菌、革兰氏阳性生物体和本领域已知的其他生物体，特别合适的信号序列进一步包括驱动AprE、NprB、Mpr、AmyA、AmyE、Blac、SacB的表达的那些，并且对于酿酒酵母或其他酵母，包括杀伤毒素、Bar1、Suc2、交配因子α、Inu1A或Ggplp信号序列。信号序列可以通过许多信号肽酶切割，从而将其从剩余的所表达的蛋白质中除去。在一些实施例中，剩下的多肽单独表达或作为与位于N-或C-末端的其他肽、标签或蛋白质(例如，6XHis、HA或FLAG标签)的融合物来表达。合适的融合物包括促进亲和纯化或检测的标签、肽或蛋白质(例如，BCE103、6XHis、HA、几丁质结合蛋白、硫氧还蛋白或FLAG标签)以及促进靶甘露聚糖酶表达、分泌或加工的那些。合适的加工位点包括肠激酶、STE13、Kex2或其他蛋白酶切割位点(用于体内或体外切割)。
通过多种转化方法可以将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段引入表达宿主细胞中，这些方法包括但不限于：电穿孔、脂质辅助转化或转染(“脂转染”)、化学介导的转染(例如CaCl和/或CaP)、乙酸锂介导的转化(例如，宿主细胞原生质体的)、生物射弹“基因枪”转化、PEG介导的转化(例如，宿主细胞原生质体的)、原生质体融合(例如，使用细菌或真核原生质体)、脂质体介导的转化、根癌农杆菌、腺病毒或其他病毒或噬菌体转化或转导。
可替代地，本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段可以进行细胞内表达。任选地，在酶变体的细胞内表达或使用信号序列(如上述那些)分泌到周质空间中之后，可以使用渗透化或裂解步骤将多肽释放到上清液中。膜屏障的破坏受机械手段如超声波、压力处理(弗氏压碎器)、空泡化的使用的影响，或受膜消化酶(如溶菌酶)或酶混合物的使用的影响。作为另外的替代方案，编码本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的多核苷酸可以通过使用合适的无细胞表达系统来表达。在无细胞系统中，目的多核苷酸典型地在启动子的帮助下转录，但形成环状表达载体的连接是任选的。在其他实施例中，RNA是经外源添加的或无需转录而生成的并且在无细胞系统中翻译。
另一个实施例涉及包含甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的清洁组合物，以及用于在清洁应用中使用此类组合物的方法。清洁应用包括但不限于衣物或纺织品清洁、衣物或纺织品软化、餐具洗涤(手动和自动)、污渍预处理等。具体的应用是其中甘露聚糖(例如刺槐豆胶、瓜尔豆胶等)是待去除污垢或污渍的组分的那些。
清洁组合物典型地包括有效量的本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，例如至少0.0001重量百分比、从约0.0001重量百分比至约1重量百分比、从约0.001重量百分比至约0.5重量百分比、从约0.01重量百分比至约0.1重量百分比、或甚至从约0.1重量百分比至约1重量百分比、或更多。清洁组合物中有效量的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段导致甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段具有足以水解含甘露聚糖的底物(如刺槐豆胶、瓜尔豆胶或其组合)的酶活性。
一些实施例涉及处于选自以下的形式的清洁组合物：粉末、液体、颗粒状、棒状、固体、半固体、凝胶、糊状、乳剂、片剂、胶囊、单位剂量、薄片和泡沫。在一些实施例中，清洁组合物是洗涤剂组合物。在其他实施例中，清洁组合物或洗涤剂组合物选自衣物洗涤剂、织物柔顺洗涤剂、餐具洗涤剂、和硬表面清洁洗涤剂。
除非另外指出，本文提供的所有组分或组合物水平参考该组分或组合物的活性水平给出，并且不包括可能存在于可商购的来源中的杂质，例如残留溶剂或副产品。酶组分重量是基于总的活性蛋白。除非另外指明，所有百分比和比率均按重量计算。除非另外指明，所有百分比和比率均基于总组合物计算。在示例性洗涤剂组合物中，通过按总组合物的重量计的纯酶表示酶水平，并且除非另外说明，按总组合物的重量计表示洗涤剂成分。
在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含表面活性剂。在一些实施例中，表面活性剂选自非离子、两性的、半极性、阴离子、阳离子、两性离子及其组合和混合物。在还另外的实施例中，表面活性剂选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、及其组合。在一些实施例中，本文描述的清洁组合物包含按组合物的重量计从约0.1％至约60％、约1％至约50％、或约5％至约40％的表面活性剂。示例性表面活性剂包括但不限于十二烷基苯磺酸钠、C12-14pareth-7、C12-15pareth-7、C12-15pareth硫酸钠、C14-15pareth-4、月桂醇醚硫酸钠(例如Steol CS-370)、氢化椰油酸钠、C12乙氧基化物(Alfonic 1012-6、Hetoxol LA7、Hetoxol LA4)、烷基苯磺酸钠(例如Nacconol 90G)、及其组合和混合物。阴离子表面活性剂包括但不限于直链烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)、醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)、仲链烷磺酸盐(SAS)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸、或皂。非离子表面活性剂包括但不限于醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺(例如在WO 9206154中描述的)、脂肪酸的聚氧乙烯酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(例如TWEEN)、聚氧乙烯醇、聚氧乙烯异构醇、聚氧乙烯醚(例如TRITON和BRIJ)、聚氧乙烯酯、聚氧乙烯-对-叔辛基苯酚或辛基苯基-环氧乙烷缩合物(例如Nonidet P40)、与脂肪醇的环氧乙烷缩合物(例如Lubrol)、聚氧乙烯壬基酚、聚亚烷基二醇(泊洛沙姆(Synperonic)F108)、糖基表面活性剂(例如葡吡喃糖苷、硫代葡吡喃糖苷)、及其组合和混合物。
在另外的实施例中，本文披露的洗涤剂组合物进一步包含表面活性剂混合物，包括但不限于5％-15％阴离子表面活性剂、<5％非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、膦酸酯、皂、酶、香料、丁基苯基甲基丙酸酯、香叶醇、沸石、聚羧酸酯、己基肉桂醛、柠檬烯、阳离子表面活性剂、香茅醇、和苯并异噻唑啉酮。
本文描述的清洁组合物可以另外地包括一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂系统、络合剂、聚合物、漂白系统、稳定剂、泡沫助剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、助氢剂、晦暗抑制剂、荧光增白剂、织物调理剂和香料。本文描述的清洁组合物也可以包括选自以下的另外的酶：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、果胶降解酶、木葡聚糖酶、或另外的碳酸酯水解酶。
在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含按清洁组合物的重量计从约1％、从约3％至约60％或甚至从约5％至约40％的助洗剂。助洗剂可以包括但不限于，聚磷酸盐的碱金属、铵和链烷醇铵盐；碱金属硅酸盐、碱土金属和碱金属碳酸盐；铝硅酸盐；聚羧酸化合物；醚羟基聚羧酸酯；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚、1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸、和羧基甲基氧基琥珀酸的共聚物；聚乙酸的各种碱金属、铵和取代的铵盐，例如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸；连同聚羧酸酯，例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧代二琥珀酸(oxydisuccinic acid)、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲基氧基琥珀酸及其可溶性盐。
在一些实施例中，助洗剂形成水溶性硬度离子络合物(例如螯合助洗剂)，例如柠檬酸盐和多磷酸盐(例如三聚磷酸钠和三聚磷酸钠六水合物、三聚磷酸钾、以及混合的三聚磷酸钠和三聚磷酸钾等)。任何合适的助洗剂可以用于本文描述的组合物中，包括本领域已知的那些(参见，例如，EP 2100949)。
如本文指示，在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含辅助成分，该辅助成分包括但不限于表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料转移剂、染料转移抑制剂、催化材料、过氧化氢、过氧化氢源、预成型过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂、结构弹性剂、分散剂、泡沫抑制剂、染料、香料、着色剂、填料盐、助水溶剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、溶剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、颜色点缀剂、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱性来源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料、和pH控制剂(参见例如US 6610642、US 6605458、US 5705464、US 5710115、US 5698504、US 5695679、US5686014、和US 5646101)。在一些实施例中，掺入一种或多种辅助剂例如以便辅助或增强清洁性能(用于处理待清洁的基材)，或者以便改良清洁组合物的美观性(例如用香料、着色剂、染料等的情况)。任何此类辅助成分是除了本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段以外的。这些另外的组分的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在使用组合物的清洁操作的性质。
在其中一种或多种辅助成分与甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段不相容的实施例中，可以采用合适的方法来保持清洁辅助成分和甘露聚糖酶分离(即彼此不接触)，直至两种组分的组合是适当的。此类分离方法包括本领域已知的任何合适的方法(例如，囊形片化、包封、片剂化、物理分离等)。通过考虑待清洁的表面、物品或织物，以及针对使用过程中(例如在整个洗涤剂洗涤使用中)的清洁条件所希望的组合物形式而容易地进行合适的辅助成分的具体选择。
本文描述的清洁组合物被有利地用于例如衣物洗涤应用、硬表面清洁、餐具洗涤应用、以及化妆品应用中。此外，本发明的多肽可以用于颗粒状和液体组合物中。
本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段也可以用于清洁添加剂产品中。在一些实施例中，添加剂被包封在适合用于添加至清洁过程中的剂型中。在一些实施例中，添加剂被包封在用于添加至清洁过程中的剂型中，在该清洁过程中使用过氧化物来源并且增加的漂白效果是希望的。本披露可使用任何合适的单一单位剂型，包括但不限于丸剂、片剂、囊形片、或其他单一单位剂型(如预先测量的粉末或液体)。在一些实施例中，包括一种或多种填料或一种或多种载体材料以增加此类组合物的体积。合适的填料或载体材料包括但不限于硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐的各种盐以及滑石、粘土等。用于液体组合物的合适的填料或载体材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇(包括多元醇和二元醇)。此类醇的实例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施例中，组合物包含从约5％至约90％的此类材料。酸性填料可用于降低pH值。可替代地，在一些实施例中，清洁添加剂包括一种或多种辅助成分。
在一个实施例中，清洁组合物或清洁添加剂含有任选地与其他甘露聚糖酶和/或另外的酶组合的、有效量的本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段。在某些实施例中，另外的酶包括但不限于，选自以下的至少一种酶：酰基转移酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪分解酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其组合。在另外的实施例中，本文描述的清洁组合物或清洁添加剂进一步包含蛋白酶和/或淀粉酶。
典型地本文的清洁组合物被配制使得在水性清洁操作中使用期间，洗涤水将具有从约3.0至约11的pH。液体产品配制品典型地被配制成具有从约5.0至约9.0的净pH。颗粒状洗衣产品典型地被配制成具有从约8.0至约11.0的pH。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且是本领域的普通技术人员熟知的。
合适的低pH清洁组合物典型地具有从约3.0至约5.0或甚至从约3.5至约4.5的净pH。低pH清洁组合物典型地不含在此类pH环境中水解的表面活性剂。此类表面活性剂包括烷基硫酸钠表面活性剂，这些烷基硫酸钠包含至少一个环氧乙烷部分或甚至从约1至约16摩尔的环氧乙烷。此类清洁组合物典型地包含足够量的pH调节剂(如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸)以提供净pH为从约3.0至约5.0的这样的清洁组合物。此类组合物典型地包含至少一种酸稳定的酶。在一些实施例中，组合物是液体，而在其他实施例中，组合物是固体。此类液体组合物的pH典型地以净pH进行测量。此类固体组合物的pH以该组合物的10％固体溶液进行测量，其中该溶剂是蒸馏水。在这些实施例中，除非另有说明，所有pH测量均在20℃进行。
合适的高pH清洁组合物典型地具有从约9.0至约11.0的净pH、或甚至从9.5至10.5的净pH。此类清洁组合物典型地包含足够量的pH调节剂(如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸)以提供净pH为从约9.0至约11.0的这样的清洁组合物。此类组合物典型地包含至少一种碱稳定的酶。在一些实施例中，组合物是液体，而在其他实施例中，组合物是固体。此类液体组合物的pH典型地以净pH进行测量。此类固体组合物的pH以所述组合物的10％固体溶液进行测量，其中该溶剂是蒸馏水。在这些实施例中，除非另有说明，所有pH测量均在20℃进行。
在一些实施例中，甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段是处于包封颗粒的形式，以在储存过程中保护其不受颗粒状组合物的其他组分的影响。另外，包封还是在清洁过程中控制甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的可用性的手段。在一些实施例中，包封增强甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段和/或另外的酶的性能。就这一点而言，将甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段用本领域已知的任何合适的包封材料进行包封。典型地，包封材料是水溶性和/或水分散性的。在一些实施例中，包封材料具有0℃或更高的玻璃化转变温度(Tg)。玻璃化转变温度在WO 9711151中有更详细的描述。该包封材料典型地选自：碳水化合物、天然或合成胶、甲壳素、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡及其组合。当包封材料是碳水化合物时，其典型地选自单糖、寡糖、多糖及其组合。在一些典型的实施例中，包封材料是淀粉(参见例如EP0922499和US 4977252、US 5354559、和US 5935826)。在一些实施例中，包封材料是由塑料(例如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物)制成的微球；可商购的微球包括但不限于由(Stockviksverken，瑞典)、以及PM6545、PM6550、PM7220、PM7228、和(PQ公司，宾夕法尼亚州福吉谷市(Valley Forge,PA))供应的那些。
术语“颗粒状组合物”是指离散的固体、宏观颗粒的聚集物。由于其小的颗粒尺寸，粉末是特殊类别的颗粒状材料，这使它们更具有粘性并更容易悬浮。
全世界典型的洗涤溶液中的洗涤剂组合物的浓度从洗涤剂组合物的小于约800ppm(“低洗涤剂浓度地理位置”)(例如在日本为约667ppm)变化至在约800ppm至约2000ppm之间(“中洗涤剂浓度地理位置”)(例如在美国为约975ppm和在巴西为约1500ppm)，变化至大于约2000ppm(“高洗涤剂浓度地理位置”)(例如在欧洲为约4500ppm至约5000ppm，在高泡沫磷酸盐助洗剂地理位置为约为6000ppm)。
在一些实施例中，本文描述的洗涤剂组合物可以在从约10℃至约60℃、或从约20℃至约60℃、或从约30℃至约60℃、从约40℃至约60℃、从约40℃至约55℃、或在10℃至60℃内的所有范围的温度下被利用。在一些实施例中，本文描述的洗涤剂组合物在“冷水洗涤”中在从约10℃至约40℃、或从约20℃至约30℃、从约15℃至约25℃、从约15℃至约35℃、或在10℃至40℃内的所有范围的温度下使用。
作为另外的实例，不同的地理位置典型地具有不同的水硬度。通常按照每加仑颗粒数混合的Ca2+/Mg2+来描述水硬度。硬度是水中钙(Ca2+)和镁(Mg2+)的量的量度。在美国，大部分水都是硬水，但是硬度不同。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181份/百万份(将份/百万份转化为颗粒/美国加仑是将ppm#除以17.1等于颗粒/加仑)的硬度矿物。
表II.水硬度水平
水 颗粒/加仑 份/百万份
软 小于1.0 小于17
略硬 1.0至3.5 17至60
中等硬 3.5至7.0 60至120
硬 7.0至10.5 120至180
非常硬 大于10.5 大于180
典型地，欧洲水硬度大于约10.5(例如约10.5至约20.0)颗粒/加仑混合的Ca2+/Mg2 +(例如约15颗粒/加仑混合的Ca2+/Mg2+)。典型地，北美水硬度大于日本水硬度、但低于欧洲水硬度。例如，北美水硬度可以在约3至约10颗粒之间、约3至约8颗粒或约6颗粒。典型地，日本水硬度低于北美水硬度，通常小于约4，例如约3颗粒/加仑混合的Ca2+/Mg2+。
在一些实施例中，本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在洗涤性能方面与可商购的甘露聚糖酶相当。在一些实施例中，本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段与可商购的甘露聚糖酶相比展现出增强的洗涤性能。在一些实施例中，本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段展现出增强的氧化稳定性、增强的热稳定性、在各种条件下增强的清洁能力、和/或增强的螯合剂稳定性。此外，本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段也可以单独地或与助洗剂和稳定剂组合地用于不含洗涤剂的清洁组合物中。
除了本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，任何其他合适的甘露聚糖酶可以单独地或与本文描述的变体或重组多肽或其活性片段组合用于本文描述的组合物中。合适的甘露聚糖酶包括但不限于糖基水解酶的GH26家族的甘露聚糖酶、糖基水解酶的GH5家族的甘露聚糖酶、酸性甘露聚糖酶、中性甘露聚糖酶、和碱性甘露聚糖酶。碱性甘露聚糖酶的实例包括描述在以下中的那些：US 6060299、US 6566114、和US 6602842；以及WO 9535362、WO 9964573、WO 9964619、和WO 2015022428。此外，合适的甘露聚糖酶包括但不限于动物、植物、真菌、或细菌起源的那些。在本披露中涵盖化学或遗传修饰的突变体。
有用的甘露聚糖酶的实例包括芽孢杆菌属内切-β-甘露聚糖酶(如枯草芽孢杆菌内切-β-甘露聚糖酶(参见例如US 6,060,299和WO 9964573)、芽孢杆菌属物种I633内切-β-甘露聚糖酶(参见例如US 6,566,114和WO 9964619)、芽孢杆菌属物种AAI12内切-β-甘露聚糖酶(参见例如US 6,566,114和WO 9964619)、芽孢杆菌属物种AA349内切-β-甘露聚糖酶(参见例如US 6,566,114和WO 9964619)、黏琼脂芽孢杆菌NCIMB40482内切-β-甘露聚糖酶(参见例如US 6,566,114和WO 9964619)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)内切-β-甘露聚糖酶、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)内切-β-甘露聚糖酶(参见例如US 6,566,114和WO9964619)、地衣芽孢杆菌内切-β-甘露聚糖酶(参见例如US 6,566,114和WO 9964619A1))、腐质霉属(Humicola)内切-β-甘露聚糖酶(如特异腐质霉(H.insolens)内切-β-甘露聚糖酶(参见例如US 6,566,114和WO 9964619))、和热解纤维素菌属(Caldocellulosiruptor)内切-β-甘露聚糖酶(如热解纤维素菌属物种内切-β-甘露聚糖酶(参见例如US 6,566,114和WO 9964619))。
此外，许多鉴定的甘露聚糖酶(即，内切-β-甘露聚糖酶和外切-β-甘露聚糖酶)可用于本披露的一些实施例中，包括但不限于双孢蘑菇(A.bisporus)甘露聚糖酶(参见，Tang等人，[2001]Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]67:2298-2303)、溜曲霉(A.tamarii)甘露聚糖酶(参见，Civas等人，[1984]Biochem.J.[生物化学杂志]219:857-863)、棘孢曲霉(A.aculeatus)甘露聚糖酶(参见，Christgau等人，[1994]Biochem.Mol.Biol.Int.[国际生物化学与分子生物学杂志]33:917-925)、泡盛曲霉甘露聚糖酶(参见，Setati等人，[2001]Protein Express Purif.[蛋白质表达与纯化]21:105-114)、烟曲霉(A.fumigatus)甘露聚糖酶(参见，Puchart等人，[2004]Biochimica etbiophysica Acta.[生物化学与生物物理学学报]1674:239-250)、黑曲霉甘露聚糖酶(参见，Ademark等人，[1998]J.Biotechnol.[生物技术杂志]63:199-210)、米曲霉NRRL甘露聚糖酶(参见，Regalado等人，[2000]J.Sci.Food Agric.[食品与农业科学杂志]80:1343-1350)、硫色曲霉(A.sulphureus)甘露聚糖酶(参见，Chen等人，[2007]J.Biotechnol.[生物技术杂志]128(3):452-461)、土曲霉(A.terrus)甘露聚糖酶(参见，Huang等人，[2007]WeiSheng Wu Xue Bao.[微生物学报]47(2):280-284)、类芽孢杆菌属物种和芽孢杆菌属物种甘露聚糖酶(参见，US 6,376,445.)、芽孢杆菌属AM001甘露聚糖酶(参见，Akino等人，[1989]Arch.Microbiol.[微生物学档案]152:10-15)、短芽孢杆菌甘露聚糖酶(参见，Araujo和Ward，[1990]J.Appl.Bacteriol.[应用细菌学杂志]68:253-261)、环状芽胞杆菌(B.circulans)K-1甘露聚糖酶(参见，Yoshida等人，[1998]Biosci.Biotechnol.Biochem.[生物科学、生物技术与生物化学]62(3):514-520)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)甘露聚糖酶(参见，Araujo和Ward，[1990]J.Appl.Bacteriol.[应用细菌学杂志]68:253-261)、芽孢杆菌属物种JAMB-750甘露聚糖酶(参见，Hatada等人，[2005]Extremophiles.[极端微生物]9:497-500)、芽孢杆菌属物种M50甘露聚糖酶(参见，Chen等人，[2000]Wei Sheng Wu XueBao.[微生物学报]40:62-68)、芽孢杆菌属物种N 16-5甘露聚糖酶(参见，Yanhe等人，[2004]Extremophiles[极端微生物]8:447-454)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)甘露聚糖酶(参见，Talbot和Sygusch，[1990]Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]56:3505-3510)、枯草芽孢杆菌甘露聚糖酶(参见，Mendoza等人，[1994]World J.Microbiol.Biotechnol.[世界微生物学与生物技术杂志]10:51-54)、枯草芽孢杆菌B36甘露聚糖酶(Li等人，[2006]Z.Naturforsch(C).[自然研究杂志(部分C)]61:840-846)、枯草芽孢杆菌BM9602甘露聚糖酶(参见，Cui等人，[1999]Wei Sheng Wu Xue Bao.[微生物学报]39(1):60-63)、枯草芽孢杆菌SA-22甘露聚糖酶(参见，Sun等人，[2003]Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao.[生物工程学报]19(3):327-330)、枯草芽孢杆菌168甘露聚糖酶(参见，Helow和Khattab，[1996]ActaMicrobiol.Immunol.Hung.[匈牙利微生物免疫学学报]43:289-299)、卵形芽孢杆菌(B.ovatus)甘露聚糖酶(参见，Gherardini等人，[1987]J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:2038-2043)、栖瘤胃芽孢杆菌(B.ruminicola)甘露聚糖酶(参见，Matsushita等人，[1991]J.Bacteriol.[细菌学杂志]173:6919-6926)、嗜纤维梭菌(C.cellulovorans)甘露聚糖酶(参见，Sunna等人，[2000]Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]66:664-670)、解糖梭菌(C.saccharolyticus)甘露聚糖酶(参见，Morris等人，[1995]Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]61:2262-2269)、解糖梭菌(C.saccharolyticum)甘露聚糖酶(参见，Bicho等人，[1991]Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]36:337-343)、粪肥梭菌(C.fimi)甘露聚糖酶(参见，Stoll等人，[1999]Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65(6):2598-2605)、丁酸梭菌(C.butyricum)/拜氏梭菌(C.beijerinckii)甘露聚糖酶(参见，Nakajima和Matsuura,[1997]Biosci.Biotechnol.Biochem.[生物科学、生物技术与生物化学]61:1739-1742)、解纤维梭菌(C.cellulolyticum)甘露聚糖酶(参见，Perret等人，[2004]Biotechnol.Appl.Biochem.[应用生物化学与生物技术]40:255-259)、第三梭菌(C.tertium)甘露聚糖酶(参见，Kataoka和Tokiwa，[1998]J.Appl.Microbiol.[应用微生物学杂志]84:357-367)、热纤维梭菌(C.thermocellum)甘露聚糖酶(参见，Halstead等人，[1999]Microbiol.[微生物学]145:3101-3108)、嗜热网团菌(D.thermophilum)甘露聚糖酶(参见，Gibbs等人，[1999]Curr.Microbiol.[现代微生物学]39(6):351-357)、黄杆菌属物种(Flavobacterium sp.)甘露聚糖酶(参见，Zakaria等人，
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示例性可商购的甘露聚糖酶包括但不限于内切-β-甘露聚糖酶，如(Chemgen公司)；和(诺维信公司(Novozymes A/S)，丹麦)；EFFECTENZTMM 1000、M 100、PURABRITETM和MANNASTARTM(杜邦公司(DuPont))；和160以及200(Diversa公司)。
在其他实施例中，本文描述的组合物包含本文描述的一种或多种甘露聚糖酶变体以及一种或多种另外的酶。该一种或多种另外的酶选自酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂加氧酶、另外的甘露聚糖酶、金属蛋白酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其任何组合和混合物。一些实施例涉及包含常规酶(如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶)的酶的组合(即“混合物”)，连同本文所述的一种或多种甘露聚糖酶变体和/或一种或多种另外的甘露聚糖酶。
在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含蛋白酶。在一些实施例中，组合物包含按组合物的重量计从约0.00001％至约10％的蛋白酶。在另一个实施例中，清洁组合物包含按组合物的重量计从约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的蛋白酶。
在一个实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的那些蛋白酶。在一些实施例中，蛋白酶是微生物蛋白酶。在其他实施例中，蛋白酶是是化学或遗传修饰的突变体。在另一个实施例中，蛋白酶是碱性微生物蛋白酶或胰蛋白样蛋白酶。示例性碱性蛋白酶包括衍生自例如芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶迟缓、枯草杆菌蛋白酶解淀粉、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。示例性另外的蛋白酶包括但不限于描述于以下中的那些：WO 9221760、WO 9523221、WO 2008010925、WO 09149200、WO 09149144、WO 09149145、WO 10056640、WO 10056653、WO 20100566356、WO 11072099、WO 201113022、WO 11140364、WO 12151534、WO 2015038792、WO 2015089447、WO 2015089441、WO 2015/143360、WO 2016 061438、WO 2016069548、WO 2016069544、WO 2016069557、WO2016069563、WO 2016 069569、WO 2016069552、WO 2016145428、美国公开号20080090747、US 5801039、US 5340735、US 5500364、US 5855625、RE 34606、US 5955340、US 5700676、US6312936、US 6482628、US 8530219、美国临时申请号62/331282、62/332417、62/343618、和62/351649、以及PCT申请号PCT/US 16/32514和PCT/US 2016/038245，以及描述于以下中的金属蛋白酶：WO 1999014341、WO 1999033960、WO 1999014342、WO 1999034003、WO2007044993、WO 2009058303、WO 2009058661、WO 2014071410、WO 2014194032、WO2014194034、WO 2014194054、和WO 2014194117。示例性蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶(例如，猪或牛起源的)和描述于WO 8906270中的镰刀菌属蛋白酶。示例性商业蛋白酶包括但不限于MAXACALTM、MAXAPEMTM、 OXP、PURAMAXTM、EXCELLASETM、PREFERENZTM蛋白酶(例如P100、P110、P280)、EFFECTENZTM蛋白酶(例如P1000、P1050、P2000)、EXCELLENZTM蛋白酶(例如P1000)、和PURAFASTTM(杜邦公司(DuPont))；ULTRA、 16L、 ULTRA、 DURAZYMTM、 LIQUANASEPROGRESS和(诺维信公司(Novozymes))；BLAPTM和BLAPTM变体(汉高公司(Henkel))；LAVERGYTMPRO 104L(巴斯夫公司(BASF))、和KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(花王公司(Kao))。
在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含合适的淀粉酶。在一个实施例中，该组合物包含按组合物的重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的淀粉酶。适合用于碱性溶液中的任何淀粉酶(例如，α淀粉酶和/或β淀粉酶)可以用于包含在此类组合物中。示例性淀粉酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性商业淀粉酶包括但不限于描述于以下中的淀粉酶：GB 1296839、WO 9100353、WO 9402597、WO 94183314、WO 9510603、WO 9526397、WO9535382、WO 9605295、WO 9623873、WO 9623874、WO 9630481、WO 9710342、WO 9741213、WO9743424、WO 9813481、WO 9826078、WO 9902702、WO 9909183、WO 9919467、WO 9923211、WO9929876、WO 9942567、WO 9943793、WO 9943794、WO 9946399、WO 0029560、WO 0060058、WO00 60059、WO 0060060、WO 0114532、WO 0134784、WO 0164852、WO 0166712、WO 0188107、WO0196537、WO 02092797、WO 0210355、WO 0231124、WO 2004055178、WO 2004113551、WO2005001064、WO 2005003311、WO 2005018336、WO 2005019443、WO 2005066338、WO2006002643、WO 2006012899、WO 2006012902、WO 2006 031554、WO 2006063594、WO 2006066594、WO 2006066596、WO 2006136161、WO 2008 000825、WO 2008088493、WO 2008092919、WO 2008101894、WO 2008112459、WO 2009 061380、WO 2009061381、WO 2009100102、WO 2009140504、WO 2009149419、WO 2010059413、WO 2010088447、WO 2010091221、WO 2010104675、WO 2010 115021、WO 10115028、WO 2010117511、WO 2011076123、WO 2011076897、WO 2011080352、WO 2011080353、WO 2011080354、WO 2011082425、WO2011082429、WO 2011087836、WO 2011098531、WO 2013063460、WO 2013184577、WO 2014099523、WO 2014164777、和WO 2015077126。示例性商业淀粉酶包括但不限于AMPLIFYBANTM、 ULTRA、STAINZYMESTAINZYME和STAINZYME(诺维信公司(Novozymes))；EFFECTENZTMS1000、POWERASETM、PREFERENZTMS 100、PREFERENZTMS 110、EXCELLENZTMS 2000、和P(杜邦公司(DuPont))。
在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含合适的果胶降解酶。如本文所使用的，“一种或多种果胶降解酶”涵盖阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)、半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外切-聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)、外切-聚-α-半乳糖醛酸酶(galacturonosidase)(EC 3.2.1.82)、果胶裂合酶(EC 4.2.2.10)、果胶酯酶(EC 3.1.1.11)、果胶酸裂合酶(EC 4.2.2.2)、外切-聚半乳糖醛酸裂合酶(EC4.2.2.9)和半纤维素酶(如内切-1,3-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.32)、木聚糖-1,4-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)。果胶降解酶是上文提及的酶活性物的天然混合物。因此，果胶酶包括水解果胶甲酯键的果胶甲基酯酶、切割半乳糖醛酸分子之间的糖苷键的聚半乳糖醛酸酶、以及对果胶酸起作用以带来α-1,4糖苷键的非水解性切割以形成半乳糖醛酸的不饱和衍生物的果胶反式消除酶(transeliminase)或裂合酶。
合适的果胶降解酶包括植物、真菌、或微生物起源的那些。在一些实施例中，包括化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，果胶降解酶是碱性果胶降解酶，即在从约7.0至约12的pH具有其最大活性的至少10％、至少25％、或至少40％的酶活性的酶。在某些其他实施例中，果胶降解酶是在从约7.0至约12的pH具有其最大活性的酶。碱性果胶降解酶由嗜碱微生物产生，这些嗜碱微生物是例如细菌、真菌、和酵母微生物，如芽孢杆菌属物种。在一些实施例中，这些微生物是坚强芽孢杆菌(B.firmus)、环状芽胞杆菌和枯草芽孢杆菌，如描述于JP 56131376和JP 56068393中的。碱性果胶分解酶可以包括但不限于半乳糖醛酸-1,4-α-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)、聚-半乳糖醛酸酶活性(EC 3.2.1.15)、果胶酯酶(EC3.1.1.11)、果胶酸裂合酶(EC 4.2.2.2)及其同工酶。可以通过欧文氏菌属(Erwinia)物种产生碱性果胶分解酶。在一些实施例中，通过菊欧文氏菌(E.chrysanthemi)、胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora)、解淀粉欧文氏菌(E.amylovora)、草生欧文氏菌(E.herbicola)、和溶解欧文氏菌(E.dissolvens)产生碱性果胶分解酶，如描述于JP 59066588、JP 63042988、以及在World J.Microbiol.Biotechnol.[世界微生物学与生物技术杂志](8,2,115-120)1992中的。在某些其他实施例中，通过芽孢杆菌属物种产生碱性果胶酶，如描述于JP73006557和Agr.Biol.Chem.[农业与生物化学](1972)，36(2)285-93中。在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含按组合物的重量计约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的果胶降解酶。
在一些其他实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含合适的木葡聚糖酶。合适的木葡聚糖酶包括但不限于植物、真菌、或细菌起源的那些。在一些实施例中包括化学或遗传修饰的突变体。如本文所使用的，“一种或多种木葡聚糖酶”涵盖由在瓦赫宁根大学(Wageningen University)的Vincken和Voragen描述的酶的家族[Vincken等人(1994)Plant Physiol.[植物生理学]，104,99-107]，并且能够降解木葡聚糖，如描述于Hayashi等人，(1989)Annu.Rev.Plant.Physiol.Plant Mol.Biol.[植物生理学和植物分子生物学年度评论]，40,139-168中。Vincken等人证明了通过从绿色木霉(Trichoderma viride)纯化的木葡聚糖酶(内切-IV-葡聚糖酶)从分离的苹果细胞壁的纤维素去除木葡聚糖外衣。此酶增强了细胞壁嵌入的纤维素的酶降解，并与果胶酶协同作用来起作用。来自DSM的RapidaseLIQ+含有木葡聚糖酶活性。在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含按组合物的重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的木葡聚糖酶。在某些其他实施例中，用于特定应用的木葡聚糖酶是碱性木葡聚糖酶，即在从7至12的pH范围具有其最大活性的至少10％、至少25％、或至少40％的酶活性的酶。在某些其他实施例中，木葡聚糖酶是在从约7.0至约12的pH具有最大活性的酶。
在一些另外的实施例中，本文描述的洗涤剂组合物进一步包含合适的纤维素酶。在一个实施例中，该组合物包含按组合物的重量计从约0.00001％至约10％、0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的纤维素酶。任何合适的纤维素酶可用于本文所述的组合物中。示例性纤维素酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性纤维素酶包括但不限于细菌或真菌起源的那些纤维素酶，例如像描述于WO2005054475、WO 2005056787、US 7,449,318、US 7,833,773、US 4,435,307；EP 0495257；和美国临时申请号62/296,678中。示例性商业纤维素酶包括但不限于 和PREMIUM(诺维信公司(Novozymes))；REVITALENZTM 100、REVITALENZTM200/220、和2000(杜邦公司(DuPont))；和KAC-500(B)TM(花王公司(Kao Corporation))。在一些实施例中，纤维素酶作为成熟野生型或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中N-末端的一部分被缺失(参见例如US 5,874,276)。
在仍另外的实施例中，本文描述的洗涤剂组合物进一步包含合适的脂肪酶。在一些实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的脂肪酶。示例性脂肪酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性脂肪酶包括但不限于例如细菌或真菌起源的那些，如例如绵毛状腐质菌(H.lanuginosa)脂肪酶(参见例如EP 258068和EP 305216)、疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)脂肪酶(参见例如WO 2014/059360和WO 2015/010009)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见例如EP 238023)、假丝酵母属(Candida)脂肪酶(如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如南极假丝酵母脂肪酶A或B)(参见例如EP 214761))、假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶(如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)和假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见例如EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见例如EP 331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶))、芽孢杆菌属脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois等人，Biochem.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学学报]1131:253-260(1993))、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(参见例如JP 64/744992)、和短小芽孢杆菌脂肪酶(参见例如WO 91/16422))。示例性经克隆的脂肪酶包括但不限于沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见Yamaguchi等人，Gene[基因]103:61-67(1991))；白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见Schimada等人，J.Biochem.[生物化学杂志]，106:383-388(1989))；以及各种根霉属脂肪酶例如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶(参见Hass等人，Gene[基因]109:117-113(1991))；雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.[生物科学、生物技术与生物化学]56:716-719(1992))和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。其他脂肪分解酶(如角质酶)也可以用于本文描述的一种或多种组合物中，包括但不限于例如衍生自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)(参见，WO 88/09367)和/或豌豆腐皮镰刀菌(Fusarium solani pisi)(参见，WO 90/09446)的角质酶。示例性商业脂肪酶包括但不限于M1LIPASETM、LUMA FASTTM、和LIPOMAXTM(杜邦公司)； 和ULTRA(诺维信公司)；和LIPASE PTM(日本天野制药有限公司(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.))。
在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含过氧化物酶与过氧化氢或其来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)的组合。在一些替代性实施例中，氧化酶与氧组合使用。两种类型的酶都用于“溶液漂白”，即当织物在洗涤液中一起洗涤时防止纺织染料从一种染色的织物转移到另一种织物上)，优选与增效剂一起使用(参见例如WO 94/12621和WO 95/01426)。适合的过氧化物酶/氧化酶包括但不限于植物、细菌或真菌起源的那些。在一些实施例中包括化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，本披露的清洁组合物进一步包含按组合物的重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％的过氧化物酶和/或氧化酶。
在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含另外的酶，包括但不限于过水解酶(参见例如WO 05/056782)。一些实施例涉及上文提及的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、和/或纤维素酶中的一种或多种的混合物。
一些实施例涉及清洁组合物，如例如描述于US 6,605,458中的那些。在一些实施例中，本文描述的清洁组合物是压缩颗粒状织物清洁组合物，而在其他实施例中，该组合物是在有色织物的衣物洗涤中有用的颗粒状织物清洁组合物。在另外的实施例中，该组合物是颗粒状织物清洁组合物，其通过洗涤容量提供软化，并且在另外的实施例中，该组合物是重垢液体(HDL)织物清洁组合物。在其他实施例中，本文描述的清洁组合物是织物清洁组合物，如例如描述于US 6,610,642和6,376,450中的那些。在替代性实施例中，本文描述的清洁组合物是合适的硬表面清洁组合物。合适的硬表面清洁组合物包括，例如，描述于US 6,610,642；6,376,450；和6,376,450中的那些。在还另外的实施例中，本文描述的清洁组合物是餐具洗涤组合物。在一些另外的实施例中，本文描述的组合物是口腔护理组合物，如例如描述于US 6,376,450和6,605,458中的那些。包含在上述US 6,376,450；6,605,458；和6,610,642中的化合物和清洁辅助剂材料的配制和描述可用于本发明的多肽。
在仍另外的实施例中，本文描述的清洁组合物是织物软化组合物如例如描述于以下中的那些：GB 400898、GB 514 276、EP 0011340、EP 0026528、EP 0242919、EP 0299575、EP 0313146、和US 5,019,292。
可以将本文描述的清洁组合物配制为任何合适的形式，并且通过配制者选择的任何过程制备，这些清洁组合物的非限制性实例描述于US 5,879,584；5,691,297；5,574,005；5,569,645；5,565,422；5,516,448；5,489,392；和5,486,303中。当希望低pH清洁组合物时，此类组合物的pH经由添加例如单乙醇胺或酸性物质例如HCl等物质来调节。
在一些实施例中，本文描述的清洁组合物以单位剂量形式提供，包括片剂、胶囊、药袋、小袋、薄片和多室袋。在一些实施例中，单位剂量形式被设计成在多隔室小袋(或其他单位剂量形式)内提供成分的控制释放。合适的单位剂量和控制释放形式是本领域已知的(参见例如，EP 2100949、EP 2100947、WO 02/102955、WO 04/111178、WO 2013/165725、以及US 4,765,916和4,972,017)。在一些实施例中，单位剂量形式通过用水溶性膜或水溶性小袋包裹的片剂提供。
在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含至少一种螯合剂。合适的螯合剂可以包括但不限于铜、铁和/或锰螯合剂及其混合物。在使用至少一种螯合剂的实施例中，本披露的清洁组合物包含按清洁组合物的重量计从约0.1％至约15％或甚至从约3.0％至约10％的螯合剂。
在一些仍另外的实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸盐、去污聚合物(例如聚对苯二甲酸)、粘土例如高岭土、蒙脱石、绿坡缕石、伊利石、膨润土、多水高岭土及其混合物。
在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含至少一种抗再沉积剂。在一些实施例中，该抗再沉积剂是非离子表面活性剂，如例如描述于EP 2100949中。在一些自动餐具洗涤实施例中，将非离子表面活性剂用作表面改性剂(特别是用于薄片)以避免成膜和沾上污渍并且改善光泽。
在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制试剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。在一些实施例中，本文描述的清洁组合物包含按清洁组合物的重量计从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％、或甚至从约0.1％至约3％的染料转移抑制剂。
在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含一种或多种硅酸盐。在一些此类实施例中，可使用硅酸钠(例如，二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)。在一些实施例中，本文描述的清洁组合物包含按组合物的重量计从约1％至约20％或从约5％至约15％的硅酸盐。
在还另外的实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含一种或多种分散剂。合适的水溶性有机材料包括但不限于均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个被不超过两个碳原子彼此分开的羧基自由基。
在一些进一步的实施例中，用于清洁组合物中的酶通过任何适合的技术来稳定。在一些实施例中，本文使用的酶通过在成品组合物中钙和/或镁离子的水溶性来源的存在来稳定。在一些实施例中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐，包括碱土金属，例如钙盐。预想用于酶稳定化的各种技术将在本披露中使用。例如，在一些实施例中，本文使用的酶通过在成品组合物中存在以下这些来稳定：锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源，以及其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)以及氧钒(IV))。氯化物和硫酸盐也可用于一些实施例中。合适的寡糖和多糖(例如糊精)的实例是本领域已知的(参见例如WO 07/145964)。在一些实施例中，还可使用可逆的蛋白酶抑制剂，如含硼化合物(例如硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸)和/或三肽醛来进一步改善稳定性。
在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含一种或多种漂白剂、漂白活化剂、和/或漂白催化剂。在一些实施例中，本文描述的清洁组合物包含一种或多种无机和/或有机漂白化合物。无机漂白剂可以包括但不限于过氧化氢合物盐(例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施例中，包括的无机过氧化氢合物盐为结晶固体，没有另外的保护，但是在一些其他实施例中，该盐被包被。合适的盐包括例如描述于EP 2100949中的那些。漂白活化剂典型地是在60℃及以下的温度在清洁过程中增强漂白作用的有机过酸前体。适合本文使用的漂白活化剂包括在过水解条件下给出优选具有从约1至约10个碳原子(尤其是从约2至约4个碳原子)的脂肪族过氧羧酸的化合物、和/或任选地取代的过氧苯甲酸。合适的漂白活化剂包括例如描述于EP 2100949中的那些。漂白催化剂典型地包括例如，锰三氮杂环壬烷及相关络合物、和钴、铜、锰、和铁络合物，以及描述于以下中的那些：US 4,246,612；5,227,084；4,810,410；和WO 99/06521和EP 2100949。
在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含一种或多种催化金属络合物。在一些实施例中，可使用含金属的漂白催化剂。在其他实施例中，金属漂白催化剂包含一种催化体系，该催化体系包括：具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，以及对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的螯合物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐(参见例如US 4,430,243)。在一些实施例中，本文描述的清洁组合物通过锰化合物来催化。此类化合物和使用水平是本领域熟知的(参见例如US 5,576,282)。在另外的实施例中，钴漂白催化剂可用于本文描述的清洁组合物中。各种钴漂白催化剂是本领域已知的(参见例如US 5,597,936和5,595,967)，并且通过已知的程序容易地制备。
在一些另外的实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含大多环刚性配体(macropolycyclic rigid ligand，MRL)的过渡金属络合物。作为实际问题而并非通过限制，在一些实施例中，对本文提供的组合物和清洁方法进行调节以在水性洗涤介质中提供至少0.01份/百万份数量级的活性MRL种类，并且在其他实施例中，在洗涤液中提供从约0.005ppm至约25ppm、从约0.05ppm至约10ppm、或从约0.1ppm至约5ppm的MRL。
在一些实施例中，在瞬时过渡金属漂白催化剂中的过渡金属包括但不限于锰、铁和铬。在其他实施例中，MRL包括但不限于形成交联桥接的特殊超刚性配体(例如5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷)。合适的过渡金属MRL通过已知的程序容易地制备(参见例如WO 2000/32601和US 6,225,464)。
在一些实施例中，本文描述的清洁组合物进一步包含金属护理剂。将金属护理剂用于预防和/或减少金属的锈蚀、腐蚀和/或氧化，该金属包括铝、不锈钢和非铁金属(例如银和铜)。合适的金属护理剂包括描述于EP 2100949、WO 94/26860和WO 94/26859中的那些。在一些实施例中，金属护理剂是锌盐。在一些另外的实施例中，本文描述的清洁组合物包含按重量计从约0.1％至约5％的一种或多种金属护理剂。
本文描述的清洁组合物可以用于清洁表面、餐具、或织物。典型地，将表面、餐具、或织物的至少一部分与(i)至少一种本文描述的变体或重组多肽或其活性片段、或(ii)至少一种本文描述的清洁组合物接触，然后任选地洗涤和/或漂洗表面、餐具、或织物。出于本披露的目的，“洗涤”包括但不限于擦洗和机械搅拌。在一些实施例中，清洁组合物典型地在溶液中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂为水时，水温典型地在从约5℃至约90℃的范围，并且当涉及织物时，水与织物的质量比典型地为从约1:1至约30:1。
一些实施例涉及清洁方法，该方法包括使有效量的(i)本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段、或(ii)本文描述的清洁组合物与包含污垢或污渍(含有甘露聚糖)的物品或表面接触以水解污垢或污渍中含有的甘露聚糖。
在一些实施例中，使用本文描述的一种或多种甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段来预防、减少和/或去除在一个或多个物品上的生物膜，该物品选自纺织品和织物。本文描述的一种或多种甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段水解含有甘露糖单元的多糖链，包括但不限于甘露聚糖、半乳甘露聚糖、和葡甘露聚糖，使得此类多肽特别适用于进行涉及含有1,4-β-D-甘露糖苷键的多糖底物的甘露聚糖水解反应。
一般来说，在适合于进行甘露聚糖水解反应的条件下，在本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段存在的情况下将供体分子孵育，接着任选地从该反应中分离产物。可替代地，在食品的上下文中，产物可以不经分离而成为食品的组分。在某些实施例中，供体分子是包含甘露糖单元的多糖链，包括但不限于甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。
在一个实施例中，将本文描述的一种或多种甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段用于提取棕榈仁油的方法中。另一个实施例涉及用于从棕榈仁或棕榈仁粕中提取棕榈仁油的方法，该方法包括提供棕榈仁和/或棕榈仁粕并用本文描述的一种或多种甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段处理所述种子或饼。
在一个实施例中，将包含本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的组合物用于加工和/或制造动物饲料或用于人类的食品。在还另外的实施例中，本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段可以是饲喂非人类动物的添加剂。在另一个实施例中，本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段可以用于人类食物，如例如作为人类食物的添加剂。
若干种营养因子可能限制可以用于制备动物饲料或用于人类的食品的廉价植物材料的量。例如，含有寡甘露聚糖(如甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的植物材料可以降低动物消化和吸收营养化合物(如矿物质、维生素、糖和脂肪)的能力。具体地，这些负面影响是由于含甘露聚糖的聚合物的高粘度以及含甘露聚糖的聚合物吸收营养化合物的能力。可以通过在饲料中包括降解含甘露聚糖的聚合物的酶(本文描述的内切-β-甘露聚糖酶)来降低这些影响，从而使得典型地在将包括在饲料中的廉价植物材料中发现的含甘露聚糖的聚合物的比例更高，这最终降低了饲料的成本。此外，本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段可以将含甘露聚糖的聚合物分解成更简单的糖，这些更简单的糖可以更容易地被同化以提供另外的能量。
在另外的实施例中，将含有植物材料的动物饲料在本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段存在的情况下、在适合用于分解含甘露聚糖的聚合物的条件下孵育。
在另一个实施例中，面包改良剂组合物包含本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，任选地与甘露聚糖或葡甘露聚糖或半乳甘露聚糖组合，并且进一步任选地与一种或多种其他酶组合。
术语“非人类动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在具体的实施例中，非反刍动物选自由以下组成的组，但不限于：马和单胃动物，例如但不限于猪(pig)、家禽、猪(swine)和鱼。在另外的实施例中，猪可以是但不限于小猪、生长猪和母猪；家禽可以是但不限于火鸡、鸭和小鸡，这些小鸡包括但不限于肉仔鸡和蛋鸡；并且鱼可以是但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳纲动物，包括但不限于小虾和对虾。在另外的实施例中，反刍动物选自由以下组成的组，但不限于：牛、幼小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。
在一些实施例中，将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段用于预处理饲料而不是作为饲料添加剂。在一些实施例中，添加或使用本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段来预处理用于断奶仔猪、保育仔猪、小猪、育肥猪、生长猪、肥育猪、蛋鸡、肉仔鸡、和火鸡的饲料。
在另一个实施例中，添加或使用本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段来预处理来自植物材料(如棕榈仁、椰子、魔芋、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、大豆、大麦、燕麦、亚麻、小麦、玉米、亚麻籽、柑橘渣、棉籽、落花生、油菜籽、向日葵、豌豆和羽扇豆)的饲料。
本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段是热稳定的，并因此本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段可以用于生产粒状饲料的方法中，其中在造粒步骤之前向饲料混合物施加热。在另一个实施例中，在造粒步骤之前或在造粒步骤之后(即，至已经形成的饲料粒料)，将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段添加至其他饲料成分中。
在还另一个实施例中，含有本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的食品加工或饲料补充组合物可以任选地进一步含有其他取代物，这些取代物选自着色剂、芳香化合物、稳定剂、维生素、矿物质和其他饲料或食品增强酶。这尤其适用于所谓的预混合物。
在仍另外的实施例中，根据本发明的食品添加剂可以按适当的量与其他食品组分(如例如谷物或植物蛋白质)组合以形成加工的食品产品。
在一个实施例中，动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品包含本文描述的多肽。
另一个实施例涉及用于制备动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的方法，该方法包括将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物食品成分混合。
另外的实施例涉及本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在制备动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品中的用途。短语“宠物食品”意指用于以下家庭动物的食品，该家庭动物例如但不限于狗；猫；沙鼠；仓鼠；南美栗鼠；褐鼠；豚鼠；鸟类宠物，如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行动物宠物，如海龟、蜥蜴和蛇；以及水生宠物，如热带鱼和青蛙。
术语“动物饲料组合物”、“饲料”和“喂养料”可互换地使用，并且可以包含选自下组的一种或多种饲料原料，该组包括：a)谷物，例如小粒谷粒(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷粒(例如玉蜀黍或高粱)；b)来自谷物的副产品，例如玉米谷蛋白粉、干酒糟谷物可溶物(Distillers Dried Grain Solubles，DDGS)(特别是基于玉米的干酒糟谷物可溶物(cDDGS))、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获自以下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、和芝麻；d)获自植物和动物来源的油和脂肪；以及e)矿物质和维生素。
在一个方面，食品组合物或添加剂可以是液体或固体。
在本发明的一个方面，食品组合物是饮料，包括但不限于发酵饮料(如啤酒和葡萄酒)。
在本发明的上下文中，术语“发酵饮料”意指包括通过包括发酵工艺(如微生物发酵(如细菌和/或酵母发酵))的方法生产的任何饮料。
在本发明的一个方面，发酵的饮料是啤酒。术语“啤酒”意指包括通过发酵/酿造含淀粉的植物材料生产的任何发酵的麦芽汁。通常，啤酒生产自麦芽或作为含淀粉植物材料的辅料、或麦芽与辅料的任何组合。如本文所使用的，术语“麦芽”被理解为任何发芽的谷物颗粒，如发芽的大麦或小麦。
如本文所使用的，术语“辅料”是指不是麦芽(如大麦或小麦麦芽)的任何含淀粉和/或糖的植物材料。辅料的实例包括，例如普通玉米糁、精制玉米糁、制啤酒用研磨酵母、稻、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘焙谷物、谷物片、黑麦、燕麦、马铃薯、树薯、木薯和糖浆，例如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖浆、大麦和/或小麦糖浆等可以用作淀粉的来源。
如本文所使用的，术语“醪液”是指任何含淀粉和/或糖的植物材料如谷粉(例如包括压碎的大麦麦芽、压碎的大麦)和/或其他辅料或其组合与水混合、随后被分离成麦芽汁和废糟的水性浆液。
如本文所使用的，术语“麦芽汁”是指在淀粉糖化期间提取谷粉后未发酵的液体流出物(run-off)。
在另一个方面，本发明涉及制备发酵饮料(如啤酒)的方法，该方法包括将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段与麦芽和/或辅料混合。
示例性啤酒包括但不限于全麦芽啤酒、根据“纯净法(Reinheitsgebot)”酿造的啤酒、爱尔啤酒、IPA、贮藏啤酒、苦啤酒、发泡酒(次级啤酒)、三级啤酒、干啤、薄啤酒、淡啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒、波特啤酒、黑啤酒、司陶特啤酒(stout)、麦芽酒、无醇啤酒、无醇麦芽酒；以及替代性谷物和麦芽饮料，例如果味麦芽饮料，例如柑橘味(如柠檬-、橙-、酸橙味)，或浆果风味的麦芽饮料；酒调味的麦芽饮料，例如伏特加-、浪姆酒-、或特奎拉酒-风味的麦芽酒；或咖啡风味的麦芽饮料，如咖啡风味的麦芽酒。
本发明的一个方面涉及本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在生产发酵饮料(如啤酒)中的用途。
另一个方面涉及提供发酵饮料的方法，该方法包括使醪液和/或麦芽汁与本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段接触的步骤。
另外的方面涉及提供发酵饮料的方法，该方法包括以下步骤：(a)制备醪液、(b)将该醪液过滤以获得麦芽汁，以及(c)将该麦芽汁发酵以获得发酵饮料(如啤酒)，其中将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段添加至：(i)步骤(a)的醪液中、和/或(ii)步骤(b)的麦芽汁中、和/或(iii)步骤(c)的麦芽汁中。
根据还另一个方面，通过包含以下一个或多个步骤的方法产生或提供发酵饮料(如啤酒)：(1)使醪液和/或麦芽汁与本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段接触；和/或(2)(a)制备醪液、(b)将该醪液过滤以获得麦芽汁，以及(c)将该麦芽汁发酵以获得发酵饮料(如啤酒)，其中将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段添加至：(i)步骤(a)的醪液中、和/或(ii)步骤(b)的麦芽汁中、和/或(iii)步骤(c)的麦芽汁中。
本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段也可以用于水解存在于液体咖啡提取物中的半乳甘露聚糖。在一个方面，将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段用于在液体咖啡提取物的冷冻干燥期间抑制凝胶形成。提取物的粘度降低减少了干燥期间的能量消耗。在某些其他方面，本发明的多肽以固定化形式应用以减少酶消耗并避免咖啡提取物的污染。此用途进一步披露于EP 676145中。
一般来说，在适合用于水解存在于液体咖啡提取物中的半乳甘露聚糖的条件下，在本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段存在的情况下孵育咖啡提取物。
在另一个方面，本发明涉及制备烘焙产品的方法，该方法包括将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段添加至生面团中，接着烘焙该生面团。烘焙产品的实例对于本领域技术人员来说是熟知的，并且包括面包、面包卷、千层饼、甜发酵面团、小圆面包、蛋糕、咸饼干、饼干、小面包、华夫饼、薄饼、玉米粉圆饼、早餐谷物、挤压制品等。
可以将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段作为面包改良剂组合物的部分添加至生面团中。面包改良剂是含有多种成分的组合物，其改善了生面团特性和烘焙产品(例如，面包和蛋糕)的质量。由于其有益效果(例如生面团稳定性和面包质地和体积)，通常将面包改良剂添加至工业烘焙过程中。面包改良剂通常含有脂肪和油以及添加剂，像乳化剂、酶、抗氧化剂、氧化剂、稳定剂和还原剂。除了本发明的任何多肽之外，也可以存在于面包改良剂中或者可以与本发明的任何多肽一起使用的其他酶包括淀粉酶、半纤维素酶、淀粉分解复合物、脂肪酶、蛋白酶、木聚糖酶、果胶酶、支链淀粉酶、非淀粉多糖降解酶和氧化还原酶(像葡萄糖氧化酶)、脂氧合酶或抗坏血酸氧化酶。
在一个实施例中，可以将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段作为面包改良剂组合物的部分添加至生面团中，该面包改良剂组合物还包含葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖源，如魔芋胶、瓜尔豆胶、刺槐豆胶(长角豆(Ceratonia siliqua))、干椰肉粕、象牙坚果甘露聚糖(象牙椰子(Phytelephas macrocarpa))、海藻甘露聚糖提取物、椰子粕和啤酒酵母的细胞壁(可以是干燥的，或以啤酒酵母提取物的形式使用)。用于本发明的其他可接受的甘露聚糖衍生物包括无支链的β-1,4-连接的甘露聚糖均聚物和甘露寡糖(甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖和甘露戊糖)。本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段可以进一步单独使用或与葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖和/或半乳糖葡甘露聚糖组合使用以改善生面团耐受性；生面团柔韧性和/或生面团黏性；和/或面包屑结构，以及延缓面包老化。在另一个方面，甘露聚糖酶水解产物用作可溶性益生元(如甘露寡糖(MOS))，其在结肠中以有利的群体密度发现时促进通常与良好健康相关的乳酸菌的生长。在一个方面，添加了本发明的任何多肽的生面团包含麸皮或燕麦、稻、粟、玉蜀黍或豆类粉(除了纯小麦粉之外或代替纯小麦粉)(即，不是纯白面粉面团)。
在另一个实施例中，可以将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段添加至已经添加了葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖的奶或任何其他奶制品中。典型的葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖源在上文在烘焙方面列出，并包括瓜尔豆胶或魔芋胶。本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段与葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖的组合释放甘露聚糖酶水解产物(甘露寡糖)，该甘露聚糖酶水解产物作为可溶性益生元通过促进益生菌(特别是双歧杆菌(Bifidobacteria)和乳酸杆菌(Lactobacillus)乳酸菌)的选择性生长和增殖起作用，该益生菌当在大肠或结肠中以有利的群体密度发现时通常与良好健康相关。
另一个方面涉及制备奶或奶制品的方法，该方法包括添加本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段以及任何葡甘露聚糖或半乳甘露聚糖或半乳葡甘露聚糖。
在另一个方面，在添加至基于奶制品的食品之前或之后，将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段与任何葡甘露聚糖或半乳甘露聚糖组合使用，以产生包含益生元甘露聚糖水解产物的基于奶制品的食品。在另外的方面，如此产生的含甘露寡糖的奶制品能够增加有益的人类肠道微生物群落群体，并且在还另外的方面，基于奶制品的食品可以包含本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段连同任何来源的葡甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖和/或半乳葡甘露聚糖，并且剂量足以用于接种已知在人类大肠中有益的至少一种细菌菌株(例如双歧杆菌或乳酸杆菌)。在一个方面，基于奶制品的食品是酸奶或乳饮料。
本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段可进一步用于纸浆(例如化学纸浆、半化学纸浆、牛皮纸浆、机械纸浆或通过亚硫酸盐法制备的纸浆)的酶辅助漂白。一般来说，将纸浆与本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在适合于漂白纸浆的条件下一起孵育。
在一些实施例中，纸浆是不含氯的纸浆，该纸浆经氧、臭氧、过氧化氢或过氧酸进行漂白。在一些实施例中，本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段用于展示出低木质素含量的、通过经改良的或连续制浆方法生产的纸浆的酶辅助漂白。在一些其他实施例中，本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段单独应用或优选地与木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶组合应用。
半乳甘露聚糖(如瓜尔豆胶和刺槐豆胶)被广泛用作例如食品(例如冰淇淋)中的增稠剂和用于纺织品印花(如T恤上的印花)的印染浆。因此，本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段也可用于降低含甘露聚糖底物的稠度或黏度。在一些实施例中，将本文描述的一种或多种甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段用于水解食品(例如冰淇淋)制造废物流中的半乳甘露聚糖。在某些实施例中，将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段用于降低加工设备中残留食品的粘度，从而促进加工后的清洁。在某些其他实施例中，将本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段用于降低印染浆的粘度，从而有助于在纺织品印花后洗掉多余的印染浆。一般来说，将含甘露聚糖的底物与本文描述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在适合于降低含甘露聚糖的底物的粘度的条件下孵育。
在还另外的实施例中，本文描述的一种或多种甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段可以用于石油和天然气工业中，以例如控制钻井液的粘度；增加水力压裂中使用的流体产生从井眼延伸到岩石中的地下裂缝的速率；清洁井眼滤饼；及其组合。
本发明组合物和方法的其他方面和实施例将从前面的描述和以下实例中显而易见。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在实践本发明时采用超出本文所描述的实施例的各种替代性实施例。因此，权利要求书，而不是本文描述的具体实施例，限定了本发明的范围，并且正因为如此，在权利要求书的范围内的方法和结构及其等同物因此被覆盖。
实例1
测定
以下测定是在下述实例中使用的标准测定。有时特定的方案要求偏离这些标准测定。在这些情况下，在实例中鉴定了与以下这些标准测定方案的偏离。
性能指数
酶的性能指数(PI)比较了在相同的蛋白质浓度下，变体(测量值)与亲本酶(理论值或测量值)的性能。可以使用从亲本酶标准曲线的朗缪尔(Langmuir)拟合提取的参数来计算亲本酶的清洁性能的理论值。PI大于1(PI>1)表明与特定亲本(如例如，PspMan4(SEQID NO:2)或BspMan5(SEQ ID NO:16))相比变体的性能得到改进，而PI为1(PI＝1)鉴定出与特定亲本具有相同性能的变体，并且PI小于1(PI<1)鉴定出性能不如特定亲本的变体。
蛋白质测定分析
使用高效液相色谱(HPLC)法(测量积分的峰面积)进行蛋白质浓度测定，以确定来自在96孔微量滴定板(MTP)中生长的培养物的上清液中的蛋白质表达水平。从过滤的培养上清液中获得样品，并将其制备成在25mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中的4倍稀释液。在配备有Poroshell 300SB-C8柱(2.1x 75mm)的安捷伦(Agilent)1200系列HPLC系统上使用由水和乙腈溶剂构成的梯度洗脱液(各自补充有0.1％TFA)进行反相HPLC。在50℃以2mL/min的流速洗脱样品。通过测量220nm处的吸光度来检测蛋白质，并且使用化学工作站软件(ChemStation software)(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))对峰进行积分。基于纯化的亲本蛋白质(例如PspMan4(SEQ ID NO:2)或BspMan5(SEQ ID NO:16))的标准曲线确定样品的蛋白质浓度。
甘露聚糖酶活性测定
通过测量溶液(大约0.3％(w/v)LBG底物)中的刺槐豆胶(LBG)半乳甘露聚糖(西格玛公司(Sigma)G0753)的水解来测量以下实例中描述的甘露聚糖酶变体的甘露聚糖酶活性。使用的试剂溶液是pH 7.5的50mM Tris-HCl缓冲液(底物稀释缓冲液)和pH 7.2的含有0.005％的50mM MOPS缓冲液(酶稀释缓冲液)。为了制备工作底物溶液，在搅拌下将LBG粉末(产品编号G0753，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州)溶解于50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)的加热溶液中。在冷却至室温后，将溶液离心并将澄清的上清液用作底物溶液。
将酶稀释在酶稀释缓冲液(50mM MOPS，pH 7.2，0.005％)中，并将稀释的酶溶液的等分试样添加至含有LBG底物溶液的平底透明聚苯乙烯MTP的孔中。将这些板密封并在40℃伴随900rpm搅拌孵育10分钟(例如，在iEMS培养箱/振荡器中，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。
在孵育之后，使用BCA试剂测定法(目录号23225，赛默科技公司(ThermoScientific Pierce)，罗克福德，伊利诺伊州)对释放的还原糖定量。具体而言，将来自LBG测定板的每个孔的等分试样添加至含有BCA工作试剂溶液(根据制造商的说明书制备)的PCR板中；样品与工作试剂的比例为1:9(v/v)。将这些板密封并在95℃在热循环仪(例如Tetrad2Peltier热循环仪，伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories)，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亚州)中孵育2-3分钟。
在板冷却至30℃之后，将反应溶液转移至新鲜的平底透明聚苯乙烯MTP(例如Costar 9017)中，并在酶标仪分光光度计(例如SpectraMax Plus 384，分子设备公司(Molecular Devices)，森尼维耳市(Sunnyvale)，加利福尼亚州)中测量在562nm处的吸光度。从含甘露聚糖酶的样品的吸光度值中减去不含甘露聚糖酶的样品(空白)的吸光度值。将所得的吸光度作为甘露聚糖酶活性的量度。亲本甘露聚糖酶及其变体的比活性通过将所得的吸光度除以从蛋白质测定分析计算出的蛋白质浓度来计算。甘露聚糖酶活性PI值通过将变体的甘露聚糖酶比活性除以亲本酶的比活性来计算。
稳定性测定
通过测量在升高的温度孵育5分钟后样品的残留活性，在57℃在50mM MOPS缓冲液(pH 7.2)、0.005％中在应激条件下测试以下实例中描述的甘露聚糖酶变体的稳定性。为了测量初始(无应激)活性，将酶样品稀释在50mM MOPS缓冲液(pH 7.2)、0.005％中，并使用上文“甘露聚糖酶活性测定”部分中描述的测定立即测定对LBG的活性。为了测量应激的活性，将在50mM MOPS缓冲液(pH 7.2)、0.005％中的稀释的酶样品在热循环仪(Tetrad2Peltier热循环仪，伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories)，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亚州)中在密封的PCR板中在57℃孵育5分钟，然后如上文“甘露聚糖酶活性测定”部分中描述的测定活性。
残留活性计算
一旦通过如上所述的LBG底物的水解来测量应激和无应激活性值，则通过取应激与未应激活性的比率并乘以100来计算％残留活性。通过将变体的残留活性除以亲本的残留活性而获得稳定性PI值。
使用微型布样测定获得的甘露聚糖酶变体的清洁性能
测试变体相对于亲本性能对LBG微型布样(CFT C-S-73，测试材料中心(Centerfor Testmaterials)，弗拉尔丁恩(Vlaardingen)，荷兰)的清洁性能。
使用开发用于测量从工业污垢中去除半乳甘露聚糖的高通量测定来测量清洁性能。该测定法测量从含有LBG的工业污垢中LBG的释放。将使用可商购的试剂(目录号23225，赛默科技公司(Thermo Scientific Pierce)，罗克福德，伊利诺伊州)的BCA反应用于测量与空白对照相比，在酶存在的情况下溶液中寡糖的还原末端。该测量与酶的清洁性能相关。当甘露聚糖酶水解半乳甘露聚糖时，可以从棉布布样中释放出具有还原末端的不同长度的寡糖。然后，BCA试剂中的二喹啉甲酸允许高灵敏度比色检测通过还原Cu2+形成的Cu1+。
将两个5.5cm直径的LBG微型布样(CFT C-S-73，测试材料中心(Center forTestmaterials)，弗拉尔丁恩(Vlaardingen)，荷兰)置于平底非结合96孔测定板(例如科宁(Corning)3641)的每个孔中。将酶稀释到含有0.005％的50mM MOPS缓冲液(pH 7.2)中。微型布样测定缓冲液(25mM HEPES，pH 8，2mM CaCl2，0.005％)和稀释的酶的等分试样添加至96孔微型布样测定板的每个孔中，合并体积为100μL。将板密封并在25℃伴随1150rpm搅拌孵育20分钟(例如，在iEMS培养箱/振荡器中，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。
在孵育之后，如上文“甘露聚糖酶活性测定”部分描述的，使用BCA试剂测定法对释放的还原糖定量。将所得的吸光度作为清洁性能的量度。在相同的蛋白质浓度下通过将变体的清洁性能除以亲本的清洁性能来计算清洁性能PI值。如上文“性能指标”部分描述的，使用从亲本标准曲线的测量值的的朗缪尔拟合中提取的参数计算相关蛋白质浓度下亲本的清洁性能的理论值。
实例2
生成PspMan4的位点评价文库
使用标准分子生物学方案产生PspMan4的位点评价文库(SEL)，以将单个氨基酸取代引入PspMan4蛋白质序列中。构建含有PspMan4基因(SEQ ID NO:1)的模板质粒。在PspMan4的成熟区(SEQ ID NO:2)的预选位置产生SEL。SEL中每个氨基酸位点的正向和反向NNS寡聚体和外部引物(与表达盒的起始或末端杂交)从Eurofins Genomics公司(亨茨维尔(Huntsville)，阿拉巴马州，美国)订购。
表达盒由来自枯草芽孢杆菌aprE基因的启动子(SEQ ID NO:3)和信号肽(SEQ IDNO:4)、PspMan4基因(SEQ ID NO:1)、以及来自解淀粉芽孢杆菌BPN'基因的终止子(SEQ IDNO:5)组成。进行具有合适的引物对和模板质粒的聚合酶链式反应(PCR)以产生变体基因。
装配PCR片段并用装配的DNA转化合适的枯草芽孢杆菌菌株。将转化的细胞接种在具有5ppm氯霉素的卢里亚(Luria)琼脂上。对于每个文库，挑取单个细菌菌落并在具有5ppm氯霉素选择的卢里亚肉汤中生长，用于随后的DNA分离和基因序列分析。通过下一代DNA分析(Next Generation DNA analysis)(依诺米那公司(Illumina)，圣地亚哥，加利福尼亚州)确认每种变体的核苷酸序列。
为了产生用于生物化学表征的PspMan4亲本及其变体的样品，甘露聚糖酶的选择性生长在96孔MTP中在每个孔中含有的培养介质(基于MOP缓冲液的富集的半定义培养基，以尿素为主要氮源，以葡萄糖为主要碳源，并补充有1％大豆蛋白胨用于稳健的细胞生长)中在37℃进行68小时。通过以3600rpm离心45分钟收获培养物，并使用密理博公司(Millipore)真空系统通过过滤器(EMD密理博公司(EMD Millipore)，比尔里卡，马萨诸塞州，美国)进行过滤。将过滤的培养上清液用于以上实例1中描述的测定。
用于产生SEL的PspMan4基因的核酸序列如SEQ ID NO:1列出。由PspMan4基因编码的PspMan4蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2列出。来自枯草芽孢杆菌的aprE启动子的核酸序列如SEQ ID NO:3列出。来自枯草芽孢杆菌的aprE信号肽的核酸序列如SEQ ID NO:4列出。来自枯草芽孢杆菌的aprE终止子的核酸序列如SEQ ID NO:5列出。
实例3
PspMan4突变的评价
可以将可组合突变描述为可以用于制造组合变体的分子中的那些取代。可组合突变是改善分子的至少一种所希望的特性而不显著降低表达、活性或稳定性中任意一者的那些。生产性位置被描述为分子内最适用于制备表现改进的特征的组合变体的那些位置，其中位置本身允许至少一种可组合突变。
使用实例1中描述的方法测试澄清的培养上清液样品的PspMan4变体：甘露聚糖酶活性测定、稳定性测定、清洁性能测定、和蛋白质浓度。如实例1描述的计算PI值，使用PspMan4作为亲本(SEQ ID NO:2)进行比较。
使用以下标准鉴定PspMan4中的可组合突变：a)蛋白质表达>140ppm；b)对于所有甘露聚糖酶活性、清洁性能、和稳定性，PI≥0.7；以及c)对于甘露聚糖酶活性、清洁性能、和稳定性中的至少一种，PI≥1.0。表1中列出了PspMan4中满足可组合突变标准的位点。PspMan4中的生产性位置包括：10、19、38、59、60、62、63、66、67、68、70、71、74、75、78、79、80、97、129、131、135、136、143、167、168、184、213、214、225、228、235、242、244、258、259、261、和283，其中PspMan4的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
如表1中所示，在几乎所有这些位点处观察到在一种或多种特性方面有益的多个取代。在许多情况下，当将多个可组合的取代(如表1中列出的那些取代)引入PspMan4序列中时，与亲本分子相比，所得的甘露聚糖酶显示出改进的稳定性和清洁性能。包含两个或更多个这些位点的组合变体进一步描述在2015年11月5日提交的专利申请号62/251,516和2016年1月13日提交的专利申请号62/278,387中。
实例4
PspMan4变体的晶体结构
使用X射线晶体学方法确定两种PspMan4变体(PspMan118和PspMan148)的三维结构。
具有突变：P19E/T38E/N67D/N97D/Y129M/P168S/Q184L/K244L/S258D/N261R的PspMan118(SEQ ID NO:6)(其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号)使用悬滴法结晶，以50mM MES缓冲液(pH 6.0)和50mM氯化钠中的1％蛋白质溶液开始。储备溶液含有0.7M磷酸钠、0.8M磷酸钾和0.1M HEPES(pH 7.5)。晶体在具有单位晶胞尺寸以及的不对称单元中具有一个分子的空间群P212121中生长。
具有突变：N10T/P19E/S30T/T38E/S59V/L60Q/K63R/N67D/N97D/Y129M/K143Q/P168S/Q184L/G225P/T228V/Y235L/K244L/S258D/N261R/Z298.01Q的PspMan148(SEQ IDNO:7)(其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号)使用悬滴法结晶，以50mM MES缓冲液(pH 6.0)和50mM氯化钠中的1％蛋白质溶液开始。储备溶液含有16％2-丙醇、0.16M氯化钙和80mM乙酸钠(pH 4.6)。晶体在具有单位晶胞尺寸以及的不对称单元中具有一个分子的空间群P212121中生长。
在Bruker X8Proteum衍射系统上收集PspMan118和PspMan148晶体的数据，分辨率分别为和表2中呈现了数据收集的另外的统计。
使用芽孢杆菌属物种JAMB-602甘露聚糖酶(登录号BAD99527.1，PDB条目1WKY_A)的残基27-326的坐标作为起始模型，使用分子置换确定PspMan118的结构。该模型使用Coot软件包进行拟合[Emsley,P.等人(2010)，Acta Cryst.D[晶体学报D]；66:486-501]。
使用PspMan118的坐标作为起始模型，使用分子置换确定PspMan148的结构。调整坐标以适应另外的取代的电子密度，并使用Coot软件包进行拟合。对于在PspMan148的C-末端插入的另外的残基Q，观察到稀疏的弱的密度。在拟合和重新拟合调整之后，两种结构的坐标都使用CCP4软件套件中的REFMAC程序(用标准默认设置)进行精化化。
最终的模型具有良好的立体化学，如表3所报道的。作为参考，可以将PspMan118和PspMan148变体的坐标进行比对，其中对于1954个共同原子总的rms(均方根)偏差为
*括号中给出了外层的值
PspMan118单体的坐标与两种其他甘露聚糖酶结构(芽孢杆菌属物种菌株JAMB-602甘露聚糖酶(PDB条目1WKY_A)和黏琼脂芽孢杆菌菌株NCIMB 40482甘露聚糖酶(PDB条目2WHL_A))的催化结构域叠加，其中使用所有共同的原子，总的均方根偏差分别为和 因此，尽管这三种酶与PspMan4的残基1至295仅共享约60％的氨基酸序列同一性，但所有三种甘露聚糖酶都共享催化结构域的共同的折叠。
图1描绘了1WKY_A甘露聚糖酶与PspMan118甘露聚糖酶变体的结构比较，其中1WKY_A的主链折叠(以灰色显示)与PspMan118的主链折叠(以黑色显示)进行比较。图1显示PspMan118与1WKY_A共享一个共同的阳离子结合位点，并且1WKY_A具有另外的碳水化合物结合结构域。PspMan118与1WKY_A共享的阳离子结合位点由Gly225残基的羰基氧、Asp231的侧链、Thr232的羰基氧、和Glu234的侧链形成。
PspMan118和PspMan148可以进一步通过相对于其他GH5甘露聚糖酶序列(如由1WKY_A和2WHL_A示例的那些)的两个基序(i)在位置N34D35L36的NDL基序、和(ii)跨越位置263-274的缺失基序(其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号)来表征。图2描述了PspMan118与1WKY_A的进一步结构比较，其中此比较显示涵盖PspMan118的NDL和缺失基序的残基彼此非常接近。
已经报道了黏琼脂芽孢杆菌2WHL_A甘露聚糖酶结构为甘露三糖基-酶复合物。将PspMan148的结构与2WHL_A进行比对以研究变体位点相对于活性位点中结合的甘露三糖的位置。选择PspMan148进行比较，因为它包括存在于PspMan118中的全部10个取代，以及在C-末端的九个另外的取代和一个插入。与PspMan118一样，可以将PspMan148的结构与2WHL_A的结构进行比对，导致1660个共同原子的总的均方根偏差为图3A-3C中描绘了PspMan148和2WHL结构的叠加。
在图3A中，2WHL_A的主链折叠用浅灰色示意性表示，并且甘露三糖显示为浅灰色棒。PspMan148的主链以黑色显示，十九个经取代的氨基酸的侧链显示为黑色棒状图。插入PspMan148中的氨基酸Z298.01Q在电子密度图中无序，未包括在该图中。
PspMan148中十九个取代中的七个位于底物结合位点。这些包括S30T、S59V、L60Q、K63R、T228V、S258D和N261R(其中氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号)。图3B显示了PspMan148和2WHL_A结构与显示为黑色球形的底物结合位点取代的叠加。在这些取代中，L60Q在1WKY_A和2WHL_A两种结构中引入了在同源位置处可见的侧链。
在图3B中，与2WHL_A结构中的甘露聚糖酶结合的甘露三糖基部分显示为灰色棒，以表明底物结合位点的相对位置。PspMan148中底物结合位点周围和附近的七个取代(S30T、S59V、L60Q、K63R、T228V、S258D和N261R)的位置显示为黑色球形。
如在图3C中所见，PspMan148中剩余的十二个取代分布在分子的表面上(显示为黑色球形)。在这十二个取代中，Q184L和G225P是特别感兴趣的。Q184L取代引入亮氨酸侧链，该亮氨酸侧链屏蔽在Arg149与Glu182之间的盐桥，从而稳定该蛋白质。G225P取代引入刚性化脯氨酸残基，其中主链羰基氧与阳离子(PspMan148中的钙离子)形成配体，从而潜在地稳定结合的钙，这将使得酶对洗涤剂配制品中存在的螯合剂不太敏感。
图4A-B描绘了使用MUSCLE软件进行的PspMan4的(SEQ ID NO:2)、PspMan148(SEQID NO:7)、BspMan5(SEQ ID NO:16)、US6566114-002(残基32-330)(SEQ ID NO:15)、US6566114-002(残基32-340)(SEQ ID NO:17)、WO2015022428-0015(SEQ ID NO:8)、和2WHL_A(SEQ ID NO:9)的甘露聚糖酶结构域的多重序列比对，其中PspMan4中的生产位置以下划线和粗体字体显示。考虑到这些甘露聚糖酶之间的强结构相似性，可以预期的是，在其他同源GH5甘露聚糖酶(如1WKY_A或2WHL_A甘露聚糖酶)中的结构同源位点处引入赋予PspMan4改进的取代可以赋予这些分子的性能和/或稳定性方面的类似改进。
为了评价在PspMan4主链中被鉴定为生产性的取代在其他主链中的效果，将相同取代：P19E、T38E、H67D、F129M、P168S、Q184L、H225P、R244L、P258D、E261R引入BspMan5甘露聚糖酶(SEQ ID NO:16)主链中，如下面实例5中描述的。
实例5
BspMan5及其变体的克隆和异源表达
BspMan5(SEQ ID NO:16)是US6566114-002(残基32-340)(SEQ ID NO:17)的变体，其中BspMan5的氨基酸序列具有突变：P85L和氨基酸AGK插入N-末端处，其中该氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
通过捷瑞公司(Generay)(上海，中国)合成编码BspMan5(SEQ ID NO:16)甘露聚糖酶的基因并将其插入表达载体p2JM103BBI(Vogtentanz，Protein Expr Purif[蛋白质表达和纯化]，55:40-52,2007)，得到含有以下的表达载体：aprE启动子、aprE信号序列(用于指导枯草芽孢杆菌中的靶蛋白的分泌)、编码肽Ala-Gly-Lys以促进靶蛋白分泌的被称为AGK-proAprE的寡核苷酸、以及编码甘露聚糖酶目的基因的成熟区域的合成核苷酸序列。捷瑞公司(Generay)(上海，中国)产生了BspMan 5亲本基因的十个单点变体，并将它们克隆进相同的表达载体中。
用每种表达质粒转化合适的枯草芽孢杆菌宿主菌株，并将转化的细胞涂布在补充有5ppm氯霉素的卢里亚琼脂板上。为了产生每种甘露聚糖酶，将含有质粒的枯草芽孢杆菌转化体在250ml摇瓶中在补充有另外的5mM CaCl2的MOPS基的限定培养基中生长。
插入表达质粒中的亲本BspMan5甘露聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:18列出。该基因具有替代性起始密码子(GTG)和在基因的5'端处的编码三个残基添加(AGK)的寡核苷酸。从p2JM质粒表达的BspMan5前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:19列出。从质粒表达的预测成熟蛋白质BspMan5的氨基酸序列如SEQ ID NO:16列出。
使用本领域已知的分子生物学技术通过在BspMan5基因上进行点突变来产生BspMan5变体。在随后的实例中探讨了每个变体的特性。表4列出了BspMan5变体的列表，其中列出了相对于每个特定亲本的取代，其中该氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。成熟的BspMan5变体：BspMan 6-15的氨基酸序列列于SEQ ID NO:20-29中。
BspMan5及其变体的纯化
从澄清的枯草芽孢杆菌培养肉汤中纯化BspMan 5-15。使用包括离子交换、疏水相互作用或尺寸分级树脂的组合柱色谱法。经由PAHBAH(对羟基苯甲酸酰肼)测定通过测试其对LBG的活性来鉴定含有甘露聚糖酶的级分(Lever，Anal Biochem[分析生物化学]，47:248,1972)。汇集目的级分，使用10K Amicon Ultra装置浓缩，并将样品调整至40％甘油并储存于-20℃用于长期储存。
实例6
BspMan5及其变体的热稳定性
通过确定T50值来评价热稳定性，该T50值被定义为在测定条件下酶保留50％活性时的温度。将每种酶在热循环仪中在含有0.005％Tween-80的50mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中在以下温度孵育2小时：40℃、41.7℃、44.7℃、49.4℃、55℃、59.7℃、63℃、65℃、67℃、和70℃。使用LBG作为底物(在50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中的0.45％LBG溶液)，在50℃孵育10分钟之后测量酶的活性。在PAHBAH(对羟基苯甲酸酰肼)测定中定量释放的还原糖(Lever，Anal Biochem[分析生物化学]，47:273,1972)。测试保存在冰上的每种酶样品的等分试样以确定100％活性值。在孵育2小时后测量T50温度值以确定剩余的活性。绘制数据以确定每种酶样品的T50值，显示在表5中。
实例7
BspMan5及其变体的清洁性能
BspMan 5-15甘露聚糖酶的清洁性能在测量LBG从工业污垢中的释放的微型布样测定中进行评估。使用PAHBAH(对羟基苯甲酸酰肼)测定来定量释放的还原糖(Lever，AnalBiochem[分析生物化学]，47:273,1972)。将两个CS-73微型布样(直径5.5cm)(CFT，弗拉尔丁恩(Vlaardingen)，荷兰)放入平底非结合96孔测定板的每个孔中。将酶样品稀释在去离子水中。表6列出了使用的洗涤剂、和购买地点。表7列出了所使用的洗涤剂条件，包括：用于清洁测定的剂量、pH、缓冲系统(如果使用)、硬度(3:1Ca:Mg；ppm)、温度(℃)和洗涤时间(分钟)。将最终剂量为2.5ppm的稀释酶、和洗涤剂溶液添加至每个孔中至100μl的总体积。将板密封并在洗涤剂各自的清洁条件下孵育。在清洗评价时间结束后，将10μl的每个反应混合物转移至每孔含有100μl PAHBAH溶液的PCR板中。将板密封并在PCR仪中在95℃孵育5分钟。之后，将板冷却至25℃，将80μl的上清液转移至新鲜的平底MTP中，并在分光光度计中测量405nm处的吸光度。405nm处的吸光度的增加用作基于甘露聚糖的CS-73微型布样上清洁性能的量度。结果在表8中显示为PI值，其通过取变体的吸光度与观察到的BspMan5亲本酶的值的比率来计算。

Claims (32)

1.一种甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，所述甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:2在一个或多个选自以下的位置处的一个或多个变异：
(i)10、19、38、59、60、62、63、66、67、68、70、71、74、75、78、79、80、97、129、131、135、136、143、167、168、184、213、214、225、228、235、242、244、258、259、261、和283；
(ii)19、38、63、67、71、97、129、143、168、184、225、228、235、244、258、和261；
(iii)19、38、67、97、129、143、168、184、225、228、235、244、258、和261；
(iv)19、38、67、129、168、184、225、244、258、和261；
(v)19、38、67、97、129、168、184、244、258、和261；
(vi)85、19-85、38-85、67-85、85-129、85-168、85-184、85-225、85-244、85-258、和85-261；或
(vii)19-85、38-85、67-85、85-129、85-168、85-184、85-225、85-244、85-258、和85-261；
其条件是所述变异中的一个或多个是非天然存在的；并且
其中所述变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号。
2.如权利要求1所述的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，其中所述变体或重组多肽或其活性片段包含选自以下的相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异：
(i)X10Q/T、X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X59D/G/K/N/Q/T、X60F/M/V、X62E/I/Q/V、X63L、X66C/T/V、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X68L/M/R/S/W、X70R/V、X71D/H、X74E/C/Q/V、X75I、X78A/D/L/M、X79E/F/W、X80Q/T、X97E/L/P/Q、X129M、X131P、X135A/C/Q、X136E、X143Q/R、X167L/S/W/Y、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X213E、X214C/Q、X225A/C/P/W、X228A/G/H/I/K/S/V/Y、X235G/I/L/Q/S/V、X242S/E、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、X259A/E/R/S/W、X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y、和X283G/H/T；
(ii)X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X63L、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X71D/H、X97E/L/P/Q、X129M、X143Q/R、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X225A/C/P/W、X228A/G/H/I/K/S/V/Y、X235G/I/L/Q/S/V、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；
(iii)X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X97E/L/P/Q、X129M、X143Q/R、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X225A/C/P/W、X228A/G/H/I/K/S/V/Y、X235G/I/L/Q/S/V、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；
(iv)X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X129M、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X225A/C/P/W、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；
(v)X19E/V、X38E/I/L/M/Q/R/V、X67A/D/E/G/P/Q/S/V、X97E/L/P/Q、X129M、X168A/E/G/L/M/S/T、X184D/F/H/L/M/P、X244A/C/G/L/M/P/S、X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；
(vi)X85L、X19E/V-X85L、X38E/I/L/M/Q/R/V-X85L、X67A/D/E/G/P/Q/S/V-X85L、X85L-X129M、X85L-X168A/E/G/L/M/S/T、X85L-X184D/F/H/L/M/P、X85L-X225A/C/P/W、X85L-X244A/C/G/L/M/P/S、X85L-X258A/D/E/G/M/N/P/T、和X85L-X261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；
(vii)X85L、X19E-X85L、X38E-X85L、X67D-X85L、X85L-X129M、X85L-X168S、X85L-X184L、X85L-X225P、X85L-X244L、X85L-X258D、和X85L-X261R；或
(viii)X19E-X85L、X38E-X85L、X67D-X85L、X85L-X129M、X85L-X168S、X85L-X184L、X85L-X225P、X85L-X244L、X85L-X258D、和X85L-X261R；并且
其中X是任何氨基酸。
3.如权利要求1或2所述的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，其中所述变体或重组多肽或其活性片段包含选自以下的相对于SEQ ID NO:2的一个或多个变异：
(i)N/T10Q/T、P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、G/S59D/G/K/N/Q/T、L/Q60F/M/V、E/T62E/I/Q/V、K63L、I/L66C/T/V、D/H/N67A/D/E/G/P/Q/S/V、A/T68L/M/R/S/W、K/R70R/V、E/N71D/H、E/N/S74E/C/Q/V、L/V75I、D/Q78A/D/L/M、N79E/F/W、H/K80Q/T、A/N/S97E/L/P/Q、F/Y129M、S/T131P、D/S135A/C/Q、A136E、D/K/Q143Q/R、F/Y167L/S/W/Y、P168A/E/G/L/M/S/T、L/Q184D/F/H/L/M/P、D/N213E、K/Q214C/Q、G/H225A/C/P/W、T228A/G/H/I/K/S/V/Y、A/D/Y235G/I/L/Q/S/V、E/Q242S/E、K/R/Y244A/C/G/L/M/P/S、P/S/T258A/D/E/G/M/N/P/T、E/G/S259A/E/R/S/W、D/E/N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y、和D/G283G/H/T；
(ii)N10Q/T、P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、S59D/G/K/N/Q/T、L60F/M/V、T62E/I/Q/V、K63L、L66C/T/V、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、A68L/M/R/S/W、K70R/V、N71D/H、N74E/C/Q/V、V75I、Q78A/D/L/M、N79E/F/W、K80Q/T、N97E/L/P/Q、Y129M、T131P、S135A/C/Q、A136E、K143Q/R、F167L/S/W/Y、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、N213E、K214C/Q、G225A/C/P/W、T228A/G/H/I/K/S/V/Y、Y235G/I/L/Q/S/V、Q242S/E、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、G259A/E/R/S/W、N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y、和D283G/H/T；
(iii)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、K63L、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、N71D/H、N97E/L/P/Q、Y129M、K143Q/R、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、G225A/C/P/W、T228A/G/H/I/K/S/V/Y、Y235G/I/L/Q/S/V、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、和N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；
(iv)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、D/H/N67A/D/E/G/P/Q/S/V、A/N/S97E/L/P/Q、F/Y129M、D/K/Q143Q/R、P168A/E/G/L/M/S/T、L/Q184D/F/H/L/M/P、G/H225A/C/P/W、T228A/G/H/I/K/S/V/Y、A/D/Y235G/I/L/Q/S/V、K/R/T244A/C/G/L/M/P/S、P/S/T258A/D/E/G/M/N/P/T、和D/E/N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；
(v)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、N97E/L/P/Q、Y129M、K143Q/R、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、G225A/C/P/W、T228A/G/H/I/K/S/V/Y、Y235G/I/L/Q/S/V、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、和N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；
(vi)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、D/H/N67A/D/E/G/P/Q/S/V、F/Y129M、P168A/E/G/L/M/S/T、L/Q184D/F/H/L/M/P、G/H225A/C/P/W、K/R/T244A/C/G/L/M/P/S、P/S/T258A/D/E/G/M/N/P/T、和D/E/N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；
(vii)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、Y129M、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、G225A/C/P/W、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、和N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；
(viii)P19E/V、T38E/I/L/M/Q/R/V、N67A/D/E/G/P/Q/S/V、N97E/L/P/Q、Y129M、P168A/E/G/L/M/S/T、Q184D/F/H/L/M/P、K244A/C/G/L/M/P/S、S258A/D/E/G/M/N/P/T、和N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；
(ix)P/V85L、P19E/V-P/V85L、T38E/I/L/M/Q/R/V-P/V85L、D/H/N67A/D/E/G/P/Q/S/V-P/V85L、P/V85L-F/Y129M、P/V85L-P168A/E/G/L/M/S/T、P/V85L-L/Q184D/F/H/L/M/P、P/V85L-G/H225A/C/P/W、P/V85L-K/R/T244A/C/G/L/M/P/S、P/V85L-P/S/T258A/D/E/G/M/N/P/T、和P/V85L-D/E/N261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；
(x)P85L、P19E/V-P85L、T38E/I/L/M/Q/R/V-P85L、H67A/D/E/G/P/Q/S/V-P85L、P85L-F129M、P85L-P168A/E/G/L/M/S/T、P85L-Q184D/F/H/L/M/P、P85L-H225A/C/P/W、P85L-R244A/C/G/L/M/P/S、P85L-P258A/D/E/G/M/N/P/T、和P85L-E261I/M/P/Q/R/S/T/V/W/Y；
(xi)P85L、P19E-P85L、T38E-P85L、N/H67D-P85L、P85L-F/Y129M、P85L-P168S、P85L-Q184L、P85L-G/H225P、P85L-K/R244L、P85L-S/P258D、和P85L-N/E261R；
(xii)P85L、P19E-P85L、T38E-P85L、H67D-P85L、P85L-F129M、P85L-P168S、P85L-Q184L、P85L-H225P、P85L-R244L、P85L-P258D、和P85L-E261R；或
(xiii)P19E-P85L、T38E-P85L、H67D-P85L、P85L-F129M、P85L-P168S、P85L-Q184L、P85L-H225P、P85L-R244L、P85L-P258D、和P85L-E261R。
4.如任一前述权利要求所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，所述甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少59％或至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
5.如任一前述权利要求所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，所述甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其条件是所述变体或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_053782127、WP_024633848、AAX87003、WP_046227931、WP_017813111、AEX60762、或WP_046214462，或任选地，PamMan2、PamMan3、PtuMan2、PpaMan2、或PspMan9。
6.一种甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，所述甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其条件是所述变体或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_053782127、PamMan2、PamMan3、PtuMan2、WP_024633848、PpaMan2、AAX87003、WP_046227931、WP_017813111、PapMan9、AEX60762、WP_046214462、或EP2260105-0418。
7.如任一前述权利要求所述的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，其中所述变体或重组多肽或其活性片段进一步包含一个或多个选自以下的基序：
(i)在位置31-40处的WXaKNDLXXAI(SEQ ID NO:11)基序，其中Xa是F或Y，并且X是任何氨基酸；(ii)在位置263-274处的LDXXXGPXGXLT(SEQ ID NO:12)基序，其中X是任何氨基酸；(iii)在位置263-274处的LDX1V/AT/AGPX2GX3LT(SEQ ID NO:13)基序，其中X1是M或L，X2是N、A或S，并且X3是S、T或N；以及(iv)在位置263-274处的LDM/LATGPN/AGS/TLT(SEQ ID NO:14)基序。
8.如任一前述权利要求所述的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，其中所述变体或重组多肽或其活性片段进一步包含一个或多个选自以下的基序：
(i)在位置31-40处的WXaKNDLXXAI(SEQ ID NO:11)基序，其中Xa是F或Y，并且X是任何氨基酸；(ii)在位置263-274处的LDXXXGPXGXLT(SEQ ID NO:12)基序，其中X是任何氨基酸；(iii)在位置263-274处的LDX1V/AT/AGPX2GX3LT(SEQ ID NO:13)基序，其中X1是M或L，X2是N、A或S，并且X3是S、T或N；以及(iv)在位置263-274处的LDM/LATGPN/AGS/TLT(SEQ ID NO:14)基序；
其中所述变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号，其条件是所述变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU308431、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_053782127、AAX87003、WP_046227931、WP_024633848、WP_017813111、PspMan9、AEX60762、WP_046214462、YP_003868989、YP_003944884、WP_017427981、AAX87002、WP_009593769、YP_006190599、或WP_019912481，或任选地，PamMan2、PamMan3、PtuMan2、或PpaMan2。
9.如权利要求8所述的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，其中所述变体或重组多肽或其活性片段进一步包含在位置31-40处的WXaKNDLXXAI(SEQ ID NO:11)基序，其中Xa是F，并且X是任何氨基酸，其中所述变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号，其条件是所述变体或重组多肽或其活性片段不是ACU308431、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、WP_053782127、WP_024633848、AAX87003、或AEX60762，或任选地，PamMan2、PamMan3、PtuMan2、PpaMan2、或PspMan9。
10.如权利要求8所述的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，其中所述变体或重组多肽或其活性片段进一步包含在位置263-274处的LDX1V/AT/AGPX2GX3LT(SEQ ID NO:13)或LDM/LATGPN/AGS/TLT(SEQ ID NO:14)基序，其中X1是M；X2是N、A或S；并且X3是S、T或N，其中所述变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号，其条件是所述变体或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、WP_017688745、或WP_046214462，或任选地，PamMan2。
11.如权利要求8所述的甘露聚糖酶变体、或重组多肽或其活性片段，其中所述变体或重组多肽或其活性片段进一步包含(i)在位置31-40处的WXaKNDLXXAI(SEQ ID NO:11)基序，其中Xa是F，并且X是任何氨基酸，以及(ii)在位置263-274处的LDX1V/AT/AGPX2GX3LT(SEQ ID NO:13)或LDM/LATGPN/AGS/TLT(SEQ ID NO:14)基序，其中X1是M；X2是N、A或S；并且X3是S、T或N，其中所述变体或重组多肽或其活性片段的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相对应来编号，其条件是所述变体、或重组多肽或其活性片段不是ACU30843、ETT37549、WP_036608478、WP_036670707、或WP_017688745，或任选地，PamMan2。
12.如任一前述权利要求所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，其中所述甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段衍生自参比多肽，其中所述参比多肽选自SEQ IDNO:2、8、9、10、15、16、和17。
13.如权利要求12所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，其中所述甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段与所述参比多肽的氨基酸序列具有至少59％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列同一性。
14.如任一前述权利要求所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，其中所述甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段衍生自参比多肽，其中所述参比多肽是GH5甘露聚糖酶，并且所述甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段任选地是GH5甘露聚糖酶或内切-β-甘露聚糖酶。
15.如任一前述权利要求所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，其中所述甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段具有甘露聚糖酶活性。
16.如权利要求15所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，其中所述甘露聚糖酶活性是在表面活性剂和/或蛋白酶存在的情况下。
17.如任一前述权利要求所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，其中所述甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段具有一个或多个超过参比多肽的改进的特性。
18.如权利要求17所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，其中所述改进的特性选自热稳定性、洗涤剂稳定性、对甘露聚糖底物的比活性、和清洁性能。
19.如任一前述权利要求所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段，其中所述甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段没有进一步包含碳水化合物结合模块。
20.一种清洁组合物，其包含如权利要求1-19中任一项所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段。
21.如权利要求20中任一项所述的清洁组合物，其进一步包含至少一种表面活性剂；至少一种选自钙和锌的离子；至少一种辅助成分；至少一种稳定剂；从约0.001％至约1.0重量％的如权利要求1-19中任一项所述的所述甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段；至少一种漂白剂；和/或至少一种选自以下的酶或酶衍生物：酰基转移酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪分解酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、金属蛋白酶、及其组合。
22.如权利要求20或21所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物是选自以下的洗涤剂组合物：衣物洗涤剂、织物柔顺洗涤剂、餐具洗涤剂、和硬表面清洁洗涤剂。
23.如权利要求20-22中任一项所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物呈选自以下的形式：液体、粉末、颗粒状固体、片剂、薄片、和单位剂量。
24.如权利要求20-23中任一项所述的清洁组合物，其中所述组合物含有磷酸盐或不含磷酸盐和/或含有硼或不含硼。
25.一种清洁方法，所述方法包括使包含含有甘露聚糖的污垢或污渍的表面或物品与(i)如权利要求1-19中任一项所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段、或(ii)如权利要求20-24中任一项所述的清洁组合物接触，其中在所述污垢或污渍中包含的甘露聚糖被水解。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述物品是餐具或织物。
27.一种多核苷酸，其包含编码如权利要求1-19中任一项所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的核酸序列。
28.一种表达载体，其包含如权利要求27所述的多核苷酸。
29.一种宿主细胞，其包含如权利要求28所述的表达载体。
30.一种用于生产如权利要求1-19中任一项所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的方法，所述方法包括：
(a)用如权利要求28所述的表达载体稳定地转化如权利要求29所述的宿主细胞；
(b)在适合于所述宿主细胞产生所述甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段的条件下培养所述转化的宿主细胞；和
(c)回收所述甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段。
31.一种食品或饲料组合物和/或食品添加剂，其包含如权利要求1-19中任一项所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段。
32.如权利要求1-19中任一项所述的甘露聚糖酶变体或重组多肽或其活性片段在制备食品或饲料组合物和/或食品或饲料添加剂和/或食品或饲料原料和/或宠物食品中的用途。
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