CN103068975B - α‑淀粉酶变体和编码该变体的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及亲本α‑淀粉酶的变体。本发明还涉及编码该变体的多核苷酸和包含该多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及使用该变体酶的方法。

Description

α-淀粉酶变体和编码该变体的多核苷酸
涉及序列表
本申请含有计算机可读形式的序列表，该序列表通过提述并入本文。
发明背景
发明领域
本发明涉及具有改善的性质例如改善的稳定性的α-淀粉酶变体，编码该变体的多核苷酸，生产该变体的方法以及使用该变体的方法。
相关技术描述
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组催化淀粉和其它直链及支链1,4-糖苷寡糖和多糖水解的酶。
α-淀粉酶在商业上用于多种目的，例如在淀粉处理(例如液化)的起始阶段；在湿磨过程中；以及在从碳水化合物来源进行的乙醇生产中。它们还被用作去污剂基质中的清洁剂或佐剂；在纺织工业中用于淀粉脱浆；在烘烤应用中；在饮料工业中；在油田的钻孔过程中；在再循环过程中，例如纸张的脱墨；以及在动物饲料中。
发明内容
本发明提供与亲本酶相比具有改善性质的α-淀粉酶变体，例如改善的热稳定性。
本发明涉及分离的亲本α-淀粉酶变体，其包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427的三个或更多个(数个)位置的取代。
本发明还涉及分离的编码α-淀粉酶变体的多核苷酸，包含该多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及生产亲本α-淀粉酶变体的方法。
本发明还涉及该变体在淀粉处理(例如液化)；湿磨过程；从碳水化合物来源进行的乙醇生产；去污剂；用于餐具洗涤的组合物；纺织工业的淀粉脱浆；烘烤应用；饮料工业；油田的钻孔过程；再循环过程，例如纸张的脱墨；和动物饲料中的用途。
附图说明
图1显示了α-淀粉酶的催化结构域与SEQ ID NOs:1,2,3,4,5和7的氨基酸序列的比对。SEQ ID NO:1是嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)α-淀粉酶；SEQID NO:2是黄热芽孢杆菌(Bacillus flavothermus)淀粉酶，由WO 2005/001064描述的AMY1048；SEQ ID NO:3是芽孢杆菌属(Bacillus)α-淀粉酶TS-22；SEQ ID NO:4是在J.Appl.Microbiology,1997,82:325-334(SWALL:q59222)中描述的芽孢杆菌属α-淀粉酶TS-23；SEQ ID NO:5是在WO 2004/091544中描述的α-淀粉酶；以及SEQ ID NO:7是另一种嗜热脂肪芽胞杆菌α-淀粉酶。
发明详述
本发明涉及分离的亲本α-淀粉酶变体，其包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427的三个或更多个(数个)位置的取代，其中所述变体与SEQ IDNO:1的至少一个成熟多肽具有至少65％且小于100％的序列同一性；并且该变体具有α-淀粉酶活性。
定义
等位变体(Allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态现象。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)是一组催化淀粉和其它直链及支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解的酶。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定其多肽产物氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放读码框决定，该开放读码框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并以终止密码子如TAA,TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA,cDNA,合成或重组的多核苷酸。
调控序列(Control sequences)：术语“调控序列”意指编码本发明变体的多核苷酸表达所必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述变体的多核苷酸可以是天然或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和目的为引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码变体的多核苷酸序列编码区的连接。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞：术语"宿主细胞"意指任何对用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等等易感的(susceptible)细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不完全相同的亲本细胞的任何后代。
改善的性质：术语“改善的性质”意指与亲本α-淀粉酶相比改善了的变体有关性质。这些改善的性质包括但不限于变更的依赖于温度的活性谱、热稳定性、pH活性、pH稳定性、底物特异性、产物特异性和化学稳定性。
分离的变体：术语“分离的”和“纯化的”意指从至少一种与其天然结合的组分移出的多肽或多核苷酸。例如通过SDS-PAGE测定的，变体可以是至少1％纯，如至少5％纯，至少10％纯，至少20％纯，至少40％纯，至少60％纯，至少80％纯和至少90％纯以及通过琼脂糖电泳测定的，多核苷酸可以是至少1％纯，如至少5％纯，至少10％纯，至少20％纯，至少40％纯，至少60％纯，至少80％纯和至少90％纯。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(例如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等等)之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，成熟多肽是SEQ IDNO:1的氨基酸1-483、1-486或1-493。本领域中已知宿主细胞可产生由同一多核苷酸表达的两种或更多个种不同的成熟多肽(即具有不同的C末端和/或N末端的氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。
核酸构建体：术语"核酸构建体"意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或以天然本不存在的方式修饰以含有核酸的区段或其为合成的。当所述核酸构建体含有编码序列表达所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指一种将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置的构型，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。
亲本：术语“亲本”α-淀粉酶意指进行了变更以产生本发明变体的α-淀粉酶。所述亲本可以是天然产生(野生型)的多肽或由合适的方法制备的其变体。所述亲本也可以是等位变体。
多肽片段：术语“多肽片段”意指具有从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(数个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有α-淀粉酶活性。在一个方面，片段含有SEQ ID NO:1的成熟多肽的至少483个氨基酸残基，例如至少486和至少493个氨基酸残基。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列同一性”来描述。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trendsin Genetics 16:276-277)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定的。使用的可选参数是：缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用–nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：
(相同的残基x 100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)
就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000，见上)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，见上)测定。使用的可选参数是：缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用–nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5'和/或3'端缺失了一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有α-淀粉酶活性的多肽片段。
变体：术语“变体”意指具有α-淀粉酶活性的包含在一个或多个(数个)位置的一个或多个(数个)氨基酸残基的变更，即取代、插入和/或缺失的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某位置的氨基酸；缺失意指除去占据某位置的氨基酸；而插入意指在占据某位置的氨基酸邻接处且在之后添加1-5个氨基酸。
野生型：术语“野生型”意指天然产生的微生物表达的α-淀粉酶，例如自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌。
变体的命名规则
就本发明而言，SEQ ID NO:1公开的成熟多肽用于确定另一种α-淀粉酶的相应的氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中公开的成熟多肽比对，且基于此比对，使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Rice等,2000,Trends in Genetics 16:276-277)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)，可以确定对应于SEQ ID NO:1公开的成熟多肽中任意氨基酸残基的氨基酸位置编号。
通过使用“ClustalW”(Larkin等,2007,Bioinformatics 23:2947-2948)的多个多肽序列的比对，可以确认对另一种α-淀粉酶中相应的氨基酸残基的鉴定。
当其它酶已经从SEQ ID NO:1中的成熟多肽分支出来以致传统的基于序列的比对不能检测它们之间的关系(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)时，可以使用其它的配对序列比较算法。使用利用了多肽家族(谱(profile))的概率表现(probabilistic representations)的搜索程序来搜索数据库，可以在基于序列的搜索中获得更高的敏感性。例如，PSI-BLAST程序通过迭代的数据库搜索过程来生成谱，并且能够检测远程同源物(Atschul等,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个(数个)代表，可以实现甚至更高的敏感性。例如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics 19:874-881)的程序利用多种来源的信息(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱和溶解电势(solvation potential))作为预测查询序列的结构性折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等,2000,J.Mol.Biol.313:903-919的方法可以用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型比对。这些比对可以继而用于生成多肽的同源性模型，且可以使用多种为此开发的工具来估定这类模型的精确性。
对于已知结构的蛋白质，已经有数种用于检索(retrieve)和生成其结构性比对的工具和资源。例如，已经结构性比对了蛋白质的SCOP超家族，并且可以进入和下载那些比对。可以使用多种算法来比对两种或更多个的蛋白质结构，例如距离比对矩阵(distancealignment matrix)(Holm和Sander,1998,Proteins 33:88-96)或组合延伸(combinatorial extension)(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Eng.11:739-747)，且还可以利用这些算法的执行在结构数据库中查询目标结构，以发现可能的结构性同源物(如Holm和Park,2000,Bioinformatics 16:566-567)。这些结构性比对可以用于预测同一结构性超家族的蛋白质中结构和功能上对应的氨基酸残基。该信息，连同从同源性建模及谱搜索得来的信息一起，可用于预测在将目标突变从某蛋白质移动到其近程或远程同源物时，应突变哪些残基。
在描述本发明的α-淀粉酶变体时，改编了下述命名法以便于参考。在所有情况下，使用了公认的IUPAC单字符或三字符氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用了下列命名法：原始氨基酸、位置、取代氨基酸。相应地，在位置226用丙氨酸(alanine)取代苏氨酸(threonine)被命名为“Thr226Ala”或“T226A”。通过加号(“+”)来分开多个突变，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表分别在位置205和411用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)的突变。
缺失。对于氨基酸缺失，使用了下列命名法：原始氨基酸、位置、*。相应地，在位置195上甘氨酸的缺失被命名为“Gly195*”或“G195*”。通过加号(“+”)来分开多个缺失，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入。对于氨基酸插入，使用了下列命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、新插入的氨基酸。相应地，在位置195上的甘氨酸之后插入赖氨酸被命名为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被命名为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、新插入的氨基酸#1、新插入的氨基酸#2等等]。例如，在位置195上的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被指示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在这类情况下，通过在插入氨基酸残基之前的氨基酸残基位置号上添加小写字母，来对插入氨基酸残基编号。如此，在上述实例中序列为：
亲本： 变体：
195 195 195a 195b
G G-K-A
多种变更。含有多种变更的变体用加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表分别在位置170和195用酪氨酸取代精氨酸及用谷氨酸取代甘氨酸。
不同的变更。在可以引入不同变更的某一个位置处，用逗号分开不同的变更，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170用酪氨酸或谷氨酸取代精氨酸。由此“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”命名了下列变体：
Tyr167Gly+Arg170Gly,Tyr167Gly+Arg170Ala,Tyr167Ala+Arg170Gly,和Tyr167Ala+Arg170Ala。
亲本α-淀粉酶
在第一个方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％的序列同一性。
在第二个方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％的序列同一性。
在第三个方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％的序列同一性。
在第四个方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％的序列同一性。
在第五个方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％的序列同一性。
在第六个方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％的序列同一性。
在第七个方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:7的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％的序列同一性。
亲本α-淀粉酶优选包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在另一个方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:1的成熟多肽或由SEQ ID NO:1的成熟多肽组成。在另一个方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:1的1-486或1-493的氨基酸或由SEQ ID NO:1的1-486或1-493的氨基酸组成。
亲本α-淀粉酶优选包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一个方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由SEQ ID NO:2的成熟多肽组成。在另一个方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:2的1-482的氨基酸或由SEQ ID NO:2的1-482的氨基酸组成。SEQ IDNO:2的483-584的氨基酸代表了CBM20结合域。
亲本α-淀粉酶优选包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在另一个方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:3的成熟多肽或由SEQ ID NO:3的成熟多肽组成。在另一个方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:3的1-484的氨基酸或由SEQ ID NO:3的1-484的氨基酸组成。SEQ IDNO:3的485-586的氨基酸代表了CBM20结合域。
亲本α-淀粉酶优选包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在另一个方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:4的成熟多肽或由SEQ ID NO:4的成熟多肽组成。在另一个方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:4的1-484的氨基酸或由SEQ ID NO:4的1-484的氨基酸组成。SEQ IDNO:4的485-583的氨基酸代表了CBM20结合域。
亲本α-淀粉酶优选包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在另一个方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:5的成熟多肽或由SEQ ID NO:5的成熟多肽组成。在另一个方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:5的1-484的氨基酸或由SEQ ID NO:5的1-484的氨基酸组成。SEQ IDNO:5的485-583的氨基酸代表了CBM20结合域。
亲本α-淀粉酶优选包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。
亲本α-淀粉酶优选包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在另一个方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:7的成熟多肽或由SEQ ID NO:7的成熟多肽组成。在另一个方面，亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:7的1-486的氨基酸或由SEQ ID NO:7的1-486的氨基酸组成。
在一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是含有至少483个氨基酸残基的SEQ ID NO:1的成熟多肽的片段。
在一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是含有至少482个氨基酸残基的SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段。
在一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是含有至少484个氨基酸残基的SEQ ID NO:3的成熟多肽的片段。
在一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是含有至少484个氨基酸残基的SEQ ID NO:4的成熟多肽的片段。
在一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是含有至少484个氨基酸残基的SEQ ID NO:5的成熟多肽的片段。
在一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是含有至少486个氨基酸残基的SEQ ID NO:6的成熟多肽的片段。
在一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是含有至少486个氨基酸残基的SEQ ID NO:7的成熟多肽的片段。
在另一个实施方案中，亲本酶是SEQ ID NO:1成熟多肽的等位变体。
在另一个实施方案中，亲本酶是SEQ ID NO:2成熟多肽的等位变体。
在另一个实施方案中，亲本酶是SEQ ID NO:3成熟多肽的等位变体。
在另一个实施方案中，亲本酶是SEQ ID NO:4成熟多肽的等位变体。
在另一个实施方案中，亲本酶是SEQ ID NO:5成熟多肽的等位变体。
在另一个实施方案中，亲本酶是SEQ ID NO:6成熟多肽的等位变体。
在另一个实施方案中，亲本酶是SEQ ID NO:7成熟多肽的等位变体。
亲本α-淀粉酶可以从任何属的微生物中获得。就本发明而言，如在本文中与给定的来源联合使用的术语“获得”意指多核苷酸编码的亲本α-淀粉酶由此来源产生，或由插入了来自此来源的多核苷酸的细胞产生。在一个方面，亲本α-淀粉酶在细胞外分泌。
亲本α-淀粉酶可以是细菌α-淀粉酶。例如，α-淀粉酶可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)或链霉菌属(Streptomyces)α-淀粉酶；或革兰氏阴性细菌多肽如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)α-淀粉酶。
在一个方面，所述亲本α-淀粉酶为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)α-淀粉酶。
在另一个方面，所述亲本α-淀粉酶是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)α-淀粉酶。
在另一个方面，所述多肽是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)α-淀粉酶。
亲本α-淀粉酶可以是真菌α-淀粉酶。在另一个方面，真菌α-淀粉酶是酵母α-淀粉酶例如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)α-淀粉酶。在另一个方面，真菌α-淀粉酶是丝状真菌α-淀粉酶例如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、栗疫菌(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、Holomastigotoides、腐质霉属(Humicola)、耙菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小球腔菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、Trichophaea、轮枝孢属(Verticillium)、Volvariella或炭角菌属(Xylaria)α-淀粉酶.
在另一个方面，所述亲本α-淀粉酶是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)α-淀粉酶。
在另一个方面，所述亲本α-淀粉酶是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporiummerdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、Irpex lacteus、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、Thielavia australeinsis、Thielavia fimeti、Thielaviamicrospora、Thielavia ovispora、Thielavia peruviana、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)α-淀粉酶。
可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect和imperfectstates)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域的技术人员会容易地识别适合的等同物的身份(identity)。
这些种的菌株在许多培养物保藏机构对于公众能够容易地取得，所述保藏机构如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service PatentCulture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。
也可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物和直接从自然物质(例如，土壤、堆肥、水等)中获得的DNA样本鉴定和获得亲本α-淀粉酶。用于从天然生境(habitat)分离微生物和直接分离DNA的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选另外的微生物或混合的DNA样本的基因组或cDNA文库来衍生出所述编码α-淀粉酶的多核苷酸。一旦用此处所述的合适的探针检测到编码α-淀粉酶的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将其序列分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上)。
亲本α-淀粉酶还可包括杂合多肽，其中将多肽的一部分融合到另一个多肽一部分的N末端或C末端。
亲本α-淀粉酶还可包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将一个多肽融合到另一个多肽的N末端或C末端。通过将编码另外的多肽的多核苷酸(或其部分)融合于本发明的多核苷酸(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使所述融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。融合蛋白也可以使用内蛋白技术构建，该技术中融合是翻译后创建的(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583；Dawson等,1994,Science 266:776-779)。
融合多肽还可以进一步包含切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，从融合蛋白释放变体。切割位点的实例包括但不限于，Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-576；Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等,1995,Biotechnology 13:498-503；Contreras等,1991,Biotechnology 9:378-381；Eaton等,1986,Biochem.25:505-512)；Collins-Racie等,1995,Biotechnology 13:982-987；Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics 6:240-248)和Stevens,2003,Drug Discovery World 4:35-48中公开的切割位点。
变体的制备
本发明还涉及用于获得具有α-淀粉酶活性的变体方法，其包括：(a)在亲本α-淀粉酶中引入对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427的三个或更多个(数个)位置的取代，其中所述变体具有α-淀粉酶活性；并(b)回收该变体。
变体可以依照本领域中已知的任意诱变操作来制备，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、重排等等。
定点诱变是在编码亲本α-淀粉酶的多核苷酸分子的确定的位点创建一个或多个(数个)突变的技术。该技术可以在体外或体内施行。
合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子来编码目标多肽分子。基因合成可以利用许多技术施行，例如Tian等,2004,Nature 432:1050-1054描述的多路基于微芯片的技术(multiplex microchip-based technology)，及类似的技术，其中所述寡核苷酸在光程序可控(photo-programable)的微流体芯片上合成和组装。
定点诱变可以在体外通过PCR完成，PCR牵涉到使用含有期望突变的寡核苷酸引物。定点诱变还可以在体外通过盒诱变施行，盒诱变牵涉到在含有编码亲本α-淀粉酶的多核苷酸的质粒的某一位点用限制性酶切割及随后将含有突变的寡核苷酸连接至多核苷酸上。通常消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是同一个，由此允许质粒有黏性末端且插入以互相连接。参见，例如Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955；和Barton等,1990,Nucleic Acids Research 18:7349-4966。
定点诱变可以通过本领域中已知方法在体内完成。参见，例如，U.S.PatentApplication Publication No.2004/0171154；Storici等,2001,Nature Biotechnology19:773-776；Kren等,1998,Nat.Med.4:285-290；和Calissano和Macino,1996,FungalGenet.Newslett.43:15-16。
任何定点诱变操作都可以用于本发明。现有多种可用于制备亲本α-淀粉酶变体的商业试剂盒。
可以使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后用相关的筛选操作，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625公开的，来进行和测试单个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入。其它可用方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991,Biochemistry 30:10832-10837；U.S.Patent No.5,223,409；WO92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等,1986,Gene 46:145；Ner等,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以和高通量的、自动的筛选方法联合，以检测宿主细胞表达的克隆的、诱变处理的多肽的活性。编码活性多肽的诱变处理的DNA分子可以从宿主细胞回收并使用本领域标准方法快速测序。这些方法允许目标多肽中单个氨基酸残基重要性的快速确定。
半合成基因构建通过合成基因构建和/或定点诱变和/或随机诱变和/或改组方面的联合完成。典型的半合成构建是联合利用合成的多核苷酸片段与PCR技术的过程。基因的特定区域可以由此从头合成，而其它区域可以使用定点诱变引物扩增，而其余的区域可经由易错PCR或不易错PCR扩增。随后可以改组多核苷酸片段。
变体
本发明涉及包含对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427的三个或更多个(数个)位置的取代的变体，其中所述变体具有α-淀粉酶活性。
在一个实施方案中，该变体与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少65％，例如至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。
在另一个实施方案中，该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。
在另一个实施方案中，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。
在另一个实施方案中，该变体与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。
在另一个实施方案中，该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。
在另一个实施方案中，该变体与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。
在另一个实施方案中，该变体与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。
在另一个实施方案中，该变体与SEQ ID NO:7的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置59的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp或Tyr，特别是用Ala,Gln,Glu,Gly,Ile,Leu,Prot或Thr。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置89的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Arg,His或Lys。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置91的位置的取代，该取代用Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ile,Leu或Val。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置96的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ile,Leu或Val。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置108的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ala。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置112的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ala,Asp或Glu。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置129的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ala,Thr或Val。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置157的位置的取代，该取代用Ala,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用His,Lys,Phe或Tyr。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置165的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Asn。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置166的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Tyr或Val，特别是用Phe。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置168的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ala。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置171的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Glu。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置177的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Arg,Leu或Met。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置179的位置的取代，该取代用Ala,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Gln,Glu,Ile,Leu,Lys或Val。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置180的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Glu或Val。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置181的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Glu,Gly或Val。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置184的位置的取代，该取代用Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ser。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置208的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Phe或Tyr。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置220的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Pro。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置224的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Leu。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置242的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ala,Asp,Glu,Gln或Met。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置254的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ala,Ser或Thr。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置269的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Gln或Glu。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置270的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Leu,Thr或Val。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置274的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Arg,Gln,Glu,Lys或Phe。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置276的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp或Val，特别是用Phe。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置281的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Asn或Ser。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置284的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用His,Thr或Val。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置416的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ala,Asn,Asp,Ser,Thr或Val。
在一个实施方案中，该变体包含在对应于位置427的位置的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ile,Met或Val。
在一个方面，该变体包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427中任意三个位置的取代。特别地，该变体包含在对应于位置129,177和179或位置220,242和254的位置的取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427中任意四个位置的取代。特别地，该变体包含在对应于位置129,177,179和208；位置129,177,179和242；位置129,177,179和284；位置208,220,224和254；位置220,224,242和254；或位置220,224,254和284的位置的取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427中任意五个位置的取代。特别地，该变体包含在对应于位置129,177,179,208和242；位置129,177,179,208和284；位置208,220,224,242和254或位置208,220,224,254和284的位置的取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427中任意六个位置的取代。特别地，该变体包含在对应于位置129,177,179,208,242和284；或位置129,177,179,220,224和254的位置的取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427中任意七个位置的取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427中任意八个位置的取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427中任意九个位置的取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427中任意十个位置的取代。
所述变体优选有3-20，例如3-10和6-10项变更，如3,4,5,6,7,8,9或10项变更。在一个实施方案中，所述变更为取代。
在一个实施方案中，该变体α-淀粉酶包含选自下组的一个取代集或由选自下组的一个取代集组成：
V59A+G108A；
S242Q+M284V；
V59A+M284V；
G108A+M284V；
V59A+G108A+M284V；
V59A+G108A+S242Q+M284V；
E129V+K177L+R179E；
K220P+N224L+Q254S；
E129V+K177L+R179E+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+M284V；
V59A+H208Y+K220P+N224L+Q254S+M284V；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284V；
V59A+Q89R+G108A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S+M284V；和
V59A+G108A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284V。
所述变体可进一步包含在对应于在位置179,180,181和182的一个或多个(例如两个、三个或四个)位置的缺失。例如，该变体可以包含在对应于位置181和182的位置的缺失。
所述变体还可进一步包含一项变更，优选为在对应于位置193的位置上的取代。例如，在对应于位置193的位置上的变更可以是用Phe取代。
所述变体还可进一步包含在对应于位置376和/或377的位置上的氨基酸的缺失。
在另一个方面，该变体进一步包含另外的变更，优选为在对应于位置200的位置上的取代，例如在对应于位置200的位置上用Leu、Ile或Thr取代。
本发明所述变体优选由483-515、483-493或483-486个氨基酸组成。
多核苷酸
本发明还涉及分离的编码本发明任意变体的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个(数个)调控序列，所述调控序列在与其相容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
可以多种方式操作分离的编码变体的多核苷酸以供该变体的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入到载体之前对其操作可能是期望的或必需的。利用重组DNA方法来修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
调控序列可以是启动子序列，其由宿主细胞识别，用于多核苷酸表达。启动子序列含有介导变体表达的转录性调控序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，其包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体转录的合适的启动子的实例，特别是在细菌宿主细胞中的，是从下列酶的基因获得的启动子：解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽胞杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25)。在Scientific American,1980,242:74-94的"Useful proteins from recombinant bacteria"和Sambrook等,1989,见上中描述了其它的启动子。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适的启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉素中性α-淀粉酶、黑曲霉素酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉素或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖镰孢类胰蛋白酶蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米赫根毛霉脂肪酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一个修饰过的启动子，其包括曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，该基因中不翻译的前导序列已被曲霉中编码磷酸丙糖异构酶的基因的不翻译的前导序列所取代；不局限的实例包括修饰过的启动子，其包括在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，该基因中不翻译的前导序列已被构巢曲霉或米曲霉中编码磷酸丙糖异构酶的基因的不翻译的前导序列所取代)；及它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、磷酸丙糖异构酶3磷酸甘油酸酯激酶。在Romanos等,1992,Yeast 8:423-488中描述了其它对酵母宿主细胞有用的启动子。
调控序列还可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列可操作地连接于编码变体的多核苷酸的3’末端。可以将在宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。在Romanos等,1992,见上中描述了其它对于酵母宿主细胞有用的终止子。
调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码变体的多核苷酸序列的5’-末端。可以将在宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因获得。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸酯激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列还可以是聚腺苷酸化序列，该序列可操作地连接于编码多肽的序列的3’末端，并且在转录时，被宿主细胞识别为向转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号。可以将在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，黑曲霉α-葡糖苷酶，米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990中描述了对于酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列的5’端可以固有地含有信号肽的编码区，该信号肽编码区与编码分泌变体的编码区区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列的5’端可含有对于所述编码区为外源的信号肽编码区。当编码序列不天然地含有信号肽编码区时，外源的信号肽编码区可能是必需的。或者，外源的信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以增强变体分泌。然而，指导表达的多肽进入宿主细胞分泌途径的任何信号肽编码区可在本发明中使用。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase)、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽胞杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽胞杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。更多的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews 57:109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶(invertase)的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上描述。
调控序列还可以是编码位于变体氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。产生的多肽被称为酶原或多肽原(在某些情况下或称为酵素原(zymogen))。多肽原一般无活性并且通过催化或自身催化将前肽从多肽原分裂，可以转化为成熟的有活性的多肽。前肽编码区可以从嗜热毁丝霉漆酶(laccase)(WO 95/33836)、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子的基因获得。
在信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基末端处的情况下，前肽区位于紧靠多肽的氨基末端，并且信号肽区位于紧靠前肽区域的氨基末端。
可能也期望添加调节序列以允许与宿主细胞生长有关的变体表达的调节。调节系统的实例是那些应答化学或物理的刺激(包括调节化合物的存在)而引起基因的表达开启或关闭的。原核系统中的调节系统包括lac,tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以将黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子用作调节序列。其它调节序列的实例是那些允许基因扩增的。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨喋呤(methotrexate)存在时扩增的二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolate reductase)，和有重金属时扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸应可操作地连接于调节序列。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体，其包含编码本发明变体的多核苷酸、启动子和转录及翻译停止信号。上述各种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个(数个)方便的限制性位点以允许在这些位点插入或取代编码变体的多核苷酸。或者，可以通过在用于表达的合适载体中插入多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体来表达该多核苷酸。在创建表达载体时，将编码序列置于载体中，从而将编码序列可操作地连接于合适的表达用调控序列。
重组表达载体可以是任何载体(如质粒或病毒)，其能方便地接受重组DNA操作且可以产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，如质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自我复制的工具。或者，载体可以是一种在引入宿主细胞中时，整合到基因组上并且和整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
本发明的载体优选含有一个或多个(数个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四环素抗性的标记。用于酵母宿主细胞的合适标记为ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于，amdS(乙酰胺酶)、arg B(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)以及它们的等价物。在曲霉属细胞中优选使用构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合到宿主细胞基因组或允许载体独立于基因组在细胞中自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可含有另外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了提高在该精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有充足数目的核酸，例如100-10,000个碱基对，优选400-10,000个碱基对，并且最优选800-10,000个碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以提高同源重组的概率。整合元件可以是任何与宿主细胞的基因组中目标序列同源的序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组上。
为了自主复制，载体还可包含复制起点，其使载体在所述宿主细胞中自主复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为在体内使质粒或载体复制的核苷酸序列。
细菌复制起点的实例是如下质粒的复制起点：允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177，和pACYC184，和允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060，和pAMβ1。
用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2μm复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene 98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Research 15:9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加α-淀粉酶变体的产生。多核苷酸拷贝数的增加可以通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或者在多核苷酸中包括可扩增的选择性标记，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)的存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，从而含有多核苷酸额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如Sambrook等,1989,见上)，该方法用于获得基本上纯的α-淀粉酶变体。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，其包含编码变体的多核苷酸，有利地用于变体的重组产生。在宿主细胞中引入包含本发明的多核苷酸的载体，从而将载体作为染色体整合体或自复制的染色体外载体保持，如前文所述。宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码多肽的基因和其来源。
宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核或真核生物。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，其包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，其包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，其包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞可以通过如下方式，例如原生质体转化(参见，例如Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)、使用感受态细胞(参见，例如Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)、电穿孔(参见，例如Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques 6:742-751)或接合(参见，例如Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞可以通过以下方式，例如原生质体转化(参见，例如Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞可以通过以下方式，例如原生质体和电穿孔(参见，例如Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)、接合(参见，例如Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)、或转导(参见，例如Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289-6294)。将DNA引入假单胞菌属细胞可以通过以下方式，例如电穿孔(参见，例如Choi等,2006,J.Microbiol.Methods 64:391-397)或接合(参见，例如Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞可以通过以下方式，例如自然感受态(参见，例如Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如Catt和Jollick,1991,Microbios 68:189-2070)、电穿孔(参见，例如Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本领域中任何已知方法来将DNA引入宿主细胞。
宿主细胞可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
在一个方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)，和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等，在Ainsworth和Bisby’s Dictionary of The Fungi，第八版，1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)。
在另一个方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，会将酵母定义为如Biology和Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
在另一个方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。
在另一个方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维属(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母细胞细胞或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
在另一个方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
在另一个方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
在另一个方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、Trametes villosa、Trametes versicolor、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to YeastGenetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，194，182-187，AcademicPress，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153:163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生变体的方法，其包括：(a)在适合变体表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)从培养基中回收所述变体。
使用本领域已知的方法在适合于变体产生的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过在合适的培养基中和允许表达和/或分离多肽的条件下进行的摇瓶培养，或实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
在另一个方面，变体未被回收，而是使用表达该变体的本发明的宿主细胞作为该变体的来源。
可以使用本领域中已知的对于所述变体是特异性的方法来检测该变体。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验可用于测定如本文实例中描述的多肽的活性。
变体可通过本领域中已知方法回收。例如，多肽可通过常规方法从营养培养基中回收，所述方法包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的变体可通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的变体，所述方法包括但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和大小排阻)，电泳方法(例如，制备型等电聚焦)，差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。
植物
本发明还涉及植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明所述变体，从而以可回收的量表达和生产该变体。变体可以从植物或植物部分中回收。或者，为改进食品或饲料的质量，可如此使用含有重组变体的植物或植物部分，例如改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheologicalproperties)，或破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如为了促进本发明的应用而分离的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。
同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的子代。
表达本发明变体的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽的一个或多个(数个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体便利地是包含编码本发明变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该核苷酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定在其中整合了该表达构建体的宿主细胞有用的选择性标记和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。
调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达变体而确定。例如，编码本发明变体的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等,1988,PlantPhysiology 86:506所述。
对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等,1980,Cell 21:285-294,Christensen等,1992,Plant Mo.Biol.18:675-689；Zhang等,1991,Plant Cell 3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storagesink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards&Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24:863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等,1998,Plant和Cell Physiology 39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,Journal of PlantPhysiology152:708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plant和Cell Physiology 39:935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其它种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,Plant Physiology 102:991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins,1994,PlantMolecular Biology 26:85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Molecular和General Genetics 248:668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant Molecular Biology 22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。
启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。
将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science 244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology 8:535；Shimamoto等,1989,Nature 338:274)。
目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的所选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort,1992,Plant Molecular Biology 19:15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物常常使用其它的转化方法。目前，产生转基因单子叶植物的选择的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou,1992,Plant Journal 2:275-281；Shimamoto,1994,Current Opinion Biotechnology 5:158-162；Vasil等,1992,Bio/Technology 10:667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等,1993,Plant Molecular Biology 21:415-428所描述的。另外的依照目前公开可用的转化方法包括在U.S.Patent Nos.6,395,966和7,151,204(都通过完整提述并入本文)中描述的那些。
转化之后，根据本领域熟知的方法选择并入了表达构建体的转化体并且再生成为完整植株。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除了用依照本发明制备的构建体指导特定植物基因型的转化外，可以通过将具有本发明构建体的植物与缺少该构建体的第二种植物杂交以产生转基因植物。例如，编码变体或其部分的构建体可以通过杂交引入特定植物品种，而没有任何直接的对该植物品种进行转化的需要。因此，本发明不仅包括从已依照本发明转化的细胞直接再生的植物，还包括这类植物的子代。如本文使用的，子代可以指依据本发明制备的亲本植物的任意代的后代。这类子代可以包括依照本发明制备的DNA构建体，或依照本发明制备的DNA构建体的一部分。通过向起始系(line)杂交授粉包括本发明的转基因的供体植物，杂交使得本发明的转基因被引入植物系。这类步骤的非局限性实例在U.S.Patent No.7,151,204中有进一步详述。
可通过回交转变(backcross conversion)的过程产生植物。例如，植物包括称为回交转变的基因型、系、近交或杂交的植物。
可以使用遗传标记来帮助一个或多个本发明的转基因从一个遗传背景渗入到另一个遗传背景。由标记帮助的选择相对于常规的育种提供的优势在于其能用于避免表型变化引起的错误。此外，遗传标记可提供关于特定杂交的个体子代中优质种质(germplasm)的相关度的数据。例如，当具有期望性状而另具有非农艺学期望的遗传背景的植物与优质亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有目标性状，并且具有相对高比例的期望种质的子代。通过这种方式，一个或多个性状基因渗入到特定的遗传背景所需的世代数量最小化。
本发明还涉及生产本发明变体的方法，其包括：(a)在有助于变体产生的条件下，培养包含编码本发明变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述变体。
组合物
本发明还涉及组合物，其包含α-淀粉酶变体和至少一种额外的酶。额外的酶可以选自下组：β-淀粉酶、纤维素酶(β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶)、葡糖淀粉酶、半纤维素酶(如木聚糖酶)、异淀粉酶、异构酶、脂肪酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、 普鲁兰酶(pullulanase)和/或其它与α-淀粉酶一起用于商业工艺的酶。额外的酶也可以是第二种α-淀粉酶。这些酶在本领域中的淀粉处理、糖转化、醇发酵和其它有用的终产物、商业去污剂和清洁助剂、染色去除、纺织品处理或脱浆等中已知。
使用α-淀粉酶变体的方法-工业应用
本发明的变体具有宝贵的性质，允许多种工业应用。特别地，所述变体可用于去污剂特别是洗衣去污剂组合物和餐具洗涤去污剂组合物，硬表面清洁组合物，和用于纺织品、纺织品或衣物的脱浆，纸浆和纸张的生产，啤酒制造，乙醇生产和淀粉转变工艺。
α-淀粉酶变体可用于淀粉处理，特别是淀粉转化中，尤其是淀粉的液化(参见，例如U.S.Patent No.3,912,590,EP 252730和EP 063909，WO 99/19467和WO 96/28567，其都通过提述据此并入)。还考虑用于淀粉转化目的的组合物，其除了本发明的变体外还包含AMG、 普鲁兰酶(pullulanase)和其它α-淀粉酶。
此外，所述变体在增甜剂和乙醇的生产中特别有用(参见，例如U.S.Patent No.5,231,017，其通过提述据此并入)，例如从淀粉或全谷物(whole grains)得到的燃料、饮料和工业乙醇。
变体还可以用于纺织品、纺织品和衣物的脱浆(参见，例如WO 95/21247,U.S.Patent No.4,643,736和EP 119920，其通过提述并入本文)，啤酒的制造或酿造和纸浆及纸张的生产或相关工艺。
淀粉处理
天然淀粉由微观颗粒(microscopic granule)组成，其在室温不溶于水。当加热淀粉水浆料(aqueous starch slurry)时，所述颗粒泡胀并最终爆裂，将淀粉分子分散到溶液中。在该“糊化”工艺中，粘度急剧增加。因为在一般的工业工艺中固体水平为30-40％，所以必须将淀粉稀化(thin)或“液化”，使其可适于加工。这种粘度的降低目前在商业实践中主要是通过酶降解来得到的。
常规的淀粉转化工艺，例如液化和糖化工艺，由如U.S.Patent No.3,912,590,EP252730和EP 063909，其通过提述并入本文。
在一个实施方案中，将淀粉降解为低分子量碳水化合物组分如糖或脂肪替代物的转变过程包括脱支步骤。
在将淀粉转化为糖的情况下，淀粉被解聚。这种解聚过程由例如，预处理步骤和两个或三个连续的过程步骤组成，即液化过程、糖化过程和依据期望终产物的可选的异构化过程。
当期望的最终糖产物是如高果糖浆时，葡萄糖浆可以转化为果糖。在糖化工艺之后，pH值提高到6-8的范围内，例如pH 7.5，且通过离子交换除去钙。然后使用如固定的葡萄糖异构酶来将葡萄糖浆转化为高果糖浆。
发酵产物的产生
从全谷物产生醇(乙醇)一般可以分为4个主要步骤：碾磨、液化、糖化和发酵。
碾磨谷物以打开结构并允许后续处理。使用的两种工艺是湿磨或干磨。在干磨中，碾磨完整的麦粒并在剩余的处理部分中使用。湿磨能很好地分离胚芽(germ)和谷物粗粉(meal)(淀粉颗粒和蛋白)，除了少数例外，还在具有糖浆的并行生产之处应用。
在液化过程中，淀粉颗粒通过水解溶解成麦芽糊精，该麦芽糊精大部分DP高于4。水解可以通过酸处理或用α-淀粉酶的酶法来进行。酸水解在有限基础上使用。原材料可以是碾磨的全谷物或淀粉处理中的支流。
在典型的酶法液化中，α-淀粉酶将长链淀粉降解为支链和直链的更短的单元(麦芽糊精)。酶法液化通常以三步骤的热浆料过程进行。将浆料加热到60-95℃之间(例如,77-86℃,80-85℃或83-85℃)并加入所述酶。液化过程在85℃进行1-2小时。pH通常在5.5和6.2之间。为了确保在这些条件下最优的酶稳定性，添加1mM的钙(以提供大约40ppm的游离钙离子)。在此处理之后，液化淀粉的"葡糖当量(dextrose equivalent)"(DE)将为10-15。
随后在95-140℃例如105-125℃喷煮(jet-cook)浆料，降温至60-95℃并添加更多酶以获得最终水解。液化过程在pH 4.5-6.5进行，典型地在pH 5-6。碾磨并液化的谷物也被称为醪。
在糖化酶如葡糖淀粉酶的存在下，糖化液化的含淀粉材料。糖化过程可持续12-120小时(例如12-90小时、12-60小时和12-48小时)。
然而，通常在温度30-65℃，典型地约60℃，预糖化步骤实施约30分钟至2小时(例如30-90分钟)，该步骤之后是发酵时的完全糖化，其被称为同时糖化和发酵(simultaneoussaccharification and fermentation)(SSF)。pH通常在4.2-4.8之间，例如pH 4.5。在同时糖化和发酵(SSF)的过程中，对于糖化没有保温阶段(holding stage)，而是将酵母和酶一起加入。
在典型的糖化过程中，通过添加葡糖淀粉酶和脱支酶，例如异构淀粉酶(U.S.Patent No.4,335,208)或 普鲁兰酶(pullulanase)，将液化中产生的麦芽糊精转化为葡萄糖。在添加葡糖淀粉酶和脱支酶之前，将温度降至60℃。糖化过程进行24-72小时。
在添加糖化酶之前，pH降至低于4.5，同时保持高温(高于95℃)，以失活液化的α-淀粉酶。该过程减少称为"潘糖前体(panose precursor)"的短寡聚糖的形成，该寡聚糖不能被脱支酶正确水解。正常地，约0.2-0.5％的糖化产物是支链三糖潘糖(branchedtrisaccharide panose)(Glc pα16Glc pα14Glc)，其不能被 普鲁兰酶 (pullulanase)降解。如果糖化时液化中的活性淀粉酶仍然存在(即，未变性)，潘糖量可以高达1-2％，由于其显著降低了糖化产量，这是很不期望的。
可发酵的糖(例如糊精、单糖特别是葡萄糖)产自酶法糖化。可进一步将这些可发酵糖纯化和/或转化为有用的糖产物。此外，所述糖还可以在微生物发酵过程中用作发酵原料来生产终产物，例如醇(如乙醇和丁醇)、有机酸(如琥珀酸和乳酸)、糖醇(如甘油)、抗坏血酸中间物(如葡糖酸、2-酮-D-葡糖酸、2,5-二酮-D-葡糖酸和2-酮-L-古洛糖酸)、氨基酸(如赖氨酸)、蛋白质(如抗体和其片段)。
在一个实施方案中，液化过程步骤中获得的可发酵糖用于生产醇，特别是乙醇。在乙醇生产中，通常使用SSF过程，该过程中一起添加糖化酶和发酵生物(如酵母)，随后在30-40℃的温度进行。
发酵中使用的生物依赖于期望的终产物。典型地，如果乙醇是期望的终产物，将使用酵母作为发酵生物。在一些优选的实施方案中，产生乙醇的微生物是酵母并且特别是酵母属如酿酒酵母(U.S.Patent No.4,316,956)的菌株。多种酿酒酵母可以商业获得，其包括但不限于FALI(Fleischmann's Yeast),SUPERSTART(Alltech),FERMIOL(DSMSpecialties),RED STAR(Lesaffre)和Angel醇酵母(Angel Yeast Company,China)。方法中使用的起始酵母(starter yeast)量是能在合适的时间长内有效产生商业上显著量乙醇的量(如在少于72小时内从具有25-40％DS的底物产生至少10％的乙醇)。酵母细胞一般以约104到约1012的量供应，且优选每mL的发酵液中从约107到约1010的活性酵母数。在向醪中加入酵母后，其通常接受约24-96小时的发酵，如35-60小时。温度介于约26-34℃之间，通常为约32℃，且pH从3-6，例如约pH 4-5。
除了发酵微生物(如酵母)之外，发酵可包括营养素和额外的酶，包括肌醇六磷酸酶。本领域中熟知酵母在发酵中的用途。
在另外的实施方案中，使用如本领域中已知的适当的发酵微生物，能产生发酵终产物，所述终产物包括如甘油、1,3-丙二醇、葡糖酸、2-酮-D-葡糖酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、2-酮-L-葡糖酸、琥珀酸、乳酸、氨基酸和它们的衍生物。更具体地，当乳酸是期望的终产物时，可以使用乳杆菌属的种(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1,3-丙二醇是期望的终产物时，可以使用大肠杆菌；以及当2-酮-D-葡糖酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、2-酮-L-葡糖酸是期望的终产物时，可以使用柠檬泛菌(Pantoea citrea)作为发酵微生物。上面列举的名称仅是实例，且本领域中技术人员知道许多可用于获得期望的终产物的发酵微生物。
用于从未经糊化的含淀粉处理产生发酵产物的工艺
本发明涉及从未进行含淀粉材料的糊化(即未烹制)的含淀粉材料产生发酵产物的工艺。发酵产物如乙醇，可不经液化含有含淀粉材料和水的含水浆料而产生。在一个实施方案中，本发明的工艺包括在起始糊化温度以下，优选在α-淀粉酶和/或糖源生成酶的存在下糖化(例如磨制的)含淀粉材料，例如粒状淀粉，以产生糖，其可由合适的发酵生物发酵为发酵产物。在该实施方案中，所述所需的发酵产物，例如乙醇，从未经糊化的(即未烹制的)、优选磨制的谷物谷粒如玉米产生。相应地，在第一个方面，本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的工艺，其包括使用糖源生成酶和发酵生物在低于含淀粉材料的起始糊化温度以下同时糖化和发酵含淀粉材料。在一个实施方案中，亦存在蛋白酶。所述蛋白酶可为任何真菌淀粉酶或金属蛋白酶。发酵产物，例如乙醇，可任选地在发酵之后例如通过蒸馏来回收。通常淀粉酶，如葡糖淀粉酶，和/或其他糖源生成酶，和/或α-淀粉酶，在发酵过程中存在。葡糖淀粉酶和其他糖源生成酶的实例包括水解生淀粉的淀粉酶。α-淀粉酶的实例包括酸性α-淀粉酶，如酸性真菌α-淀粉酶。发酵生物的实例包括酵母，例如酿酒酵母的菌株。术语“起始糊化温度”意指淀粉糊化开始的最低温度。一般而言，在水中加热的淀粉在约50℃至75℃之间开始糊化。；糊化的确切温度取决于具体的淀粉，且可方便地由本领结构域技术人员确定。因此，所述起始糊化温度可随植物物种，随植物物种的具体品种，以及生长条件而变化。在本发明的上下文中，给定含淀粉材料的起始糊化温度可使用Gorinstein和Lii,1992,44(12):461-466所述的方法确定为在5％的淀粉颗粒中双折射丧失的温度。在起始工艺之前，可制备含淀粉材料如粒状淀粉的浆料，其具有按含淀粉材料计10-55w/w-％干固体(DS)，优选25-45w/w-％干固体，更优选30-40w/w-％干固体。所述浆料可含有水和/或工艺水，如釜馏物(逆流)、洗涤水(scrubber water)、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水(side-stripper water)或其他发酵产物设备(plant)的工艺水。因为本发明的方法在起始糊化温度以下进行因而不发生显著的粘度增加，所以如果需要，可使用高水平的釜馏物。在一个实施方案中，含水浆料包含约1至约70vol％，优选15-60vol％，特别是约30至50vol％的水和/或工艺水，如釜馏物(逆流)、洗涤水(scrubberwater)、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水(side-stripper water)或其他发酵产物设备(plant)的工艺水，或其组合等。可通过优选以干磨或湿磨将其粒度减小到0.05至3.0mm，优选0.1至0.5mm来制备含淀粉材料。在进行本发明的工艺后，含淀粉材料的至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或者优选至少99％的干固体转化为可溶的淀粉水解物。本发明的该方面中的工艺在低于起始糊化温度的温度进行，这意指该温度通常在30至75℃，优选45至60℃的范围。在一个优选实施方案中，该工艺在25至40℃，如28至35℃，如30℃至34℃，优选约32℃的温度进行。在一个实施方案中，进行该工艺从而使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如6w/w-％以下，如约3w/w-％以下，如约w/w-％以下，如约1w/w-％以下，如约0.5w/w-％以下，或0.25w/w-％以下，如约0.1w/w-％以下。所述低水平的糖可通过简单的使用经调整量的酶和发酵生物来实现。本领结构域技术人员可方便地确定使用的酶和发酵生物的剂量数量。酶和发酵生物的使用量也可经选择以保持麦芽糖在发酵液中的低浓度。举例而言，麦芽糖水平可保持为约0.5w/w-％以下，或约0.2w/w-以下。本发明的方法可在约3至7，优选pH 3.5至6，或更优选pH 4至5的pH进行。在一个实施方案中，发酵持续6至120小时，特别是24至96小时。
用于从经糊化的含淀粉材料产生发酵产物的工艺
在该方面本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物特别是乙醇的工艺，该工艺包括液化步骤和顺序或同时进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的工艺，其包括下述步骤：
(a)在α-淀粉酶变体的存在下液化含淀粉材料，或；
(b)使用糖源生成酶糖化步骤(a)中获得的液化材料；
(c)使用发酵生物进行发酵。
在一个方面， 普鲁兰酶(pullulanase)如家族GH57 普鲁 兰酶(pullulanase)亦用于液化步骤。在一个实施方案中，在液化之前、之中和/或之后添加蛋白酶如酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。在一个实施方案中，所述金属蛋白酶来源于嗜热子囊菌属(Thermoascus)的菌株，例如橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株，例如橙橘嗜热子囊菌CGMCC No.0670。所述α-淀粉酶可为任何下文“α-淀粉酶”部分提及的α-淀粉酶。在一个实施方案中，所述糖源生成酶是来源于曲霉属例如黑曲霉(Aspergillus niger)或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的菌株，踝节菌属(Talaromyces)例如埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)的菌株，或阿太菌属(Athelia)例如罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)的菌株；栓菌属(Trametes)例如瓣环栓菌(Trametes cingulata)的菌株；大纹饰孢菌属(Pachykytospora)例如纸质大纹饰孢菌(Pachykytospora papyracea)的菌株；或白桩菇属(Leucopaxillus)例如大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)的菌株；或隔孢伏革菌属(Peniophora)例如菌种红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)的菌株，或其组合的糖源生成酶。糖化步骤(b)和发酵步骤(c)可顺序或同时进行。当工艺作为顺序糖化和发酵工艺进行时， 普鲁兰酶 (pullulanase)和/或金属蛋白酶可在糖化和/或发酵过程中添加，当步骤(b)和(c)同时进行(SSF工艺)时，它们可在发酵之前或之中添加。 普鲁兰酶(pullulanase)和/或金属蛋白酶亦可有利地在液化之前(液化前处理)，即在步骤(a)之前或之中添加，和/或在液化之后(液化后处理)，即在步骤(a)之后添加。 普鲁兰酶(pullulanase)最有利地在液化之前或之中，即在步骤(a)之前或之中添加。发酵产物，如特别是乙醇，可任选地在发酵之后例如通过蒸馏回收。发酵生物优选为酵母，优选酿酒酵母的菌株。
在一个具体实施方案中，本发明的工艺进一步在步骤(a)之前包括下述步骤：
x)减小含淀粉材料的粒度，优选通过磨制(milling)(例如，使用锤式粉碎机(hammer mill))；
y)形成包含含淀粉材料和水的浆料。
在一个实施方案中，粒度小于#7筛网，例如#6筛网。#7筛通常用于常规的现有技术工艺。含水浆料可含有10-55w/w-％含淀粉材料的干固体(DS)，例如25-45和30-40w/w-％的干固体(DS)。将浆料加热到糊化温度以上，并可添加α-淀粉酶变体以起始液化(稀化(thinning))。在一个实施方案中，在进行步骤(a)中的α-淀粉酶处理前，浆料可经喷射蒸煮(jet-cooked)以进一步使其糊化。在一个实施方案中，液化可作为三步热浆方法来进行。在pH 4-6，优选4.5-5.5，将浆料加热至60-95℃，优选70-90℃，如优选80-85℃，并添加α-淀粉酶变体，以及任选地 普鲁兰酶(pullulanase)体和/或蛋白酶，优选金属蛋白酶以起始液化(稀化)。在一个实施方案中，然后可将浆料在95-140℃，优选100-135℃，如105-125℃的温度喷射蒸煮约1-15分钟，优选约3-10分钟，特别是约5分钟左右。使浆料冷却至60-95℃并添加更多的α-淀粉酶和任选地 普鲁兰酶(pullulanase)变体和/或蛋白酶，优选金属蛋白酶以完成水解(二次液化)。液化工艺通常在pH 4.0-6.5，特别是在pH4.5-6进行。糖化步骤(b)可使用本领结构域公知的条件进行。举例而言，完全的糖化工艺可持续长至约24至约72小时，然而，通常仅在30-65℃，通常约60℃的温度进行通常40-90分钟的预糖化，接着在同时发酵和糖化工艺(SSF工艺)中在发酵过程中进行完全糖化。糖化通常在20-75℃，优选40-70℃，通常约60℃的温度，在pH 4-5的pH，通常在约pH 4.5进行。最广泛用于发酵产物特别是乙醇产生中的工艺是同时糖化和发酵(SSF)工艺，其中对于糖化没有保持阶段，意思是发酵生物(如酵母)和酶可一起添加。SSF可通常在25℃至40℃，如28℃至35℃，如30℃至34℃，优选约32℃左右的温度进行。在一个实施方案中，发酵持续6至120小时，特别是24至96小时。
啤酒制备
α-淀粉酶变体亦可用于啤酒制备工艺和类似的发酵；所述α-淀粉酶通常在制醪工艺中添加。该工艺基本上类似于上述的磨制、液化、糖化和发酵工艺。
用釜馏物的淀粉浆料加工
将磨制的含淀粉材料与水和再循环的稀釜馏物合并，得到水浆料。该浆料可包含15至55％ds w/w(例如20至50％，25至50％，25至45％，25至40％，20至35％和30-36％ds)。在一些实施方案中，再循环的稀釜馏物(回流)在约10至70％v/v(例如10至60％，10至50％，10至40％，10至30％，10至20％，20至60％，20至50％，20至40％以及20至30％)的范围。
一旦将经磨制的含淀粉材料与水和回流合并，则不调整浆料的pH。此外，在将植酸和任选的α-淀粉酶添加至浆料之后，不调整pH。在一个实施方案中，浆料的pH会在约pH 4.5至少于约6.0(例如pH 4.5至5.8，pH 4.5至5.6，pH 4.8至5.8，pH 5.0至5.8，pH 5.0至5.4，pH 5.2至5.5和pH 5.2至5.9)的范围。浆料的pH可为约pH 4.5至5.2，取决于添加至浆料的稀釜馏物的量和包含所述稀釜馏物的材料的类型。举例而言，稀釜馏物的pH可为pH 3.8至pH 4.5。
在乙醇产生过程中，添加酸以在发酵池(beer well)中降低pH，以减少蒸馏之前微生物污染的风险。
在一些实施方案中，将肌醇六磷酸酶添加至浆料。在其他实施方案中，除了肌醇六磷酸酶外，将α-淀粉酶添加至浆料。在一些实施方案中，肌醇六磷酸酶和α-淀粉酶顺序添加至浆料。在其他实施方案中，肌醇六磷酸酶和α-淀粉酶同时添加。在一些实施方案中，将包含肌醇六磷酸酶和任选地包含α-淀粉酶的浆料温育(预处理)约5分钟至约8小时(例如，5分钟至6小时，5分钟至4小时，5分钟至2小时，和15分钟至4小时)的期间。在其他实施方案中，将浆料在约40至115℃(例如45至80℃，50至70℃，50至75℃，60至110℃，60至95℃，70至110℃，70至85℃和77至86℃)的范围的温度温育。
在其他实施方案中，将浆料在比含淀粉材料的淀粉糊化温度低约0至约30℃(例如0至25℃，0至20℃，0至15℃，0至10℃和0至5℃)的温度温育。在一些实施方案中，所述温度低于约68℃，低于约65℃，低于约62℃，低于约60℃，和低于约55℃。在一些实施方案中，温度高于约45℃，高于约50℃，高于约55℃和高于约60℃。在一些实施方案中，在淀粉糊化唯独以下的温度温育包含肌醇六磷酸酶和α-淀粉酶的浆料称作初级(1°)液化。
在一些实施方案中，经磨制的含淀粉材料是玉米或买罗高粱。所述浆料包含25至40％DS，pH在4.8至5.2的范围，且浆料用肌醇六磷酸酶和任选的α-淀粉酶在60至75℃的温度范围温育5分钟至2小时。
目前，认为用于液化工艺中的商业上可获得的微生物α-淀粉酶一般不够稳定到在高于约80℃的温度在低于pH 5.6的pH从使用完全磨碎的谷粒的干法磨制工艺产生液化淀粉物质。许多商业上可获得的α-淀粉酶的稳定性在低于约4.0的pH减少。
在另一种液化步骤中，将经温育或预处理的含淀粉材料在约4.0至5.5的pH，暴露于温度增加如约0至约45℃高于含淀粉材料的淀粉糊化温度(例如，70℃至120℃，70℃至110℃，和70℃至90℃)约2分钟至约6小时(例如2分钟至4小时，90分钟，140分钟和90至140分钟)，更优选1小时至2小时的一段时间。温度可通过短时间期间(例如1至15分钟)的常规高温喷射蒸煮系统来增加。然后淀粉可在约75℃至95℃(例如80℃至90℃和80℃至85℃)范围的温度进一步水解约15至150分钟(例如30至120分钟)的期间。在一个优选实施方案中，在这些工艺步骤中不调整pH，且液化醪的pH为约pH 4.0至pH 5.8(例如pH 4.5至5.8，pH4.8至5.4，和pH 5.0至5.2)的范围。在一些实施方案中，将第二剂的热稳定性α-淀粉酶添加至次级液化步骤，但在其他实施方案中并不进一步添加α-淀粉酶的剂量。
所述温育和液化步骤可继以本领结构域中公知的糖化和发酵步骤。
蒸馏
任选地，在发酵之后，可通过例如蒸馏并任选地继以一个或多个工艺步骤来提取醇(例如乙醇)。
在一些实施方案中，通过本文中提供的方法产生的乙醇的产量为至少8％，至少10％，至少12％，至少14％，至少15％，至少16％，至少17％和至少18％(v/v)和至少23％v/v。根据本文中提供的工艺获得的乙醇可用作，例如燃料乙醇、饮用乙醇，即可饮用的中性酒(neutral spirits)或工业乙醇。
副产物
发酵剩余物质为谷粒，其通常以液体或干燥形式用作动物饲料。在进一步的实施方案中，终产物可包括发酵副产物如蒸馏干酒糟(DDG)和蒸馏干酒糟加上可溶物(DDGS)，其可例如用作动物饲料。
对于如何进行液化、糖化、发酵、蒸馏和乙醇回收的细节对于本领结构域技术人员是公知的。
根据本文中提供的工艺，糖化和发酵可同时或分别进行。
纸浆和纸产生
α-淀粉酶变体亦可用于从增强淀粉的废纸和纸板产生木素纤维素材料如纸浆、纸和纸板，特别是当重新制浆在高于7的pH且当淀粉酶通过降解增强的淀粉来协助废品材料的崩解时。α-淀粉酶变体可特别用于从淀粉上浆的打印纸产生造纸纸浆。所述工艺可如WO95/14807中所述进行，包括下述步骤：
a)崩解纸以产生纸浆，
b)在步骤a)之前、之中或之后用淀粉降解酶处理，和
c)在步骤a)和b)之后从纸浆分离墨水颗粒。
α-淀粉酶变体亦可用于改性淀粉，其中酶法改性的淀粉与碱性填充剂如碳酸钙、高岭土和黏土一同用于造纸。用α-淀粉酶变体可在填充的存在下改性淀粉，因此允许更简单的整合工艺。
纺织品、织物和衣物的脱浆
α-淀粉酶变体亦可非常有用于纺织品、织物或衣物的脱浆。在纺织品加工工业中，α-淀粉酶传统上在脱浆工艺中用作助剂以协助含淀粉材料的去除，其在纺织中用作保护织品(weft)纱的上浆。在纺织之后上浆涂层(size coating)的完全去除对于确保对织品进行洗刷、漂白和染色的后续工艺中的最优结果是重要的。优选酶法淀粉降解，因为这不涉及对纤维材料的任何有害作用。为了减少加工成本和增加工厂处理量(mill throughput)，有时将脱浆工艺与洗涤和漂白步骤合并。在此种情况下，通常使用非酶助剂如碱或氧化剂以降解淀粉，因为传统的α-淀粉酶与高pH水平和漂白剂不是非常相容。淀粉上浆的非酶法降解因为使用的比较攻击性的化学品导致一些纤维损伤。相应地，应需要使用α-淀粉酶变体，因为其在碱性溶液中具有改善的性能。α-淀粉酶可单独使用或在对含纤维素织物或纺织品脱浆时与纤维素酶组合使用。
脱浆和漂白工艺在本领结构域中是公知的。举例而言，此种工艺描述于，例如WO95/21247，美国专利号4,643,736，EP 119920，其通过提述并入本文。
清洁工艺和去污剂组合物
α-淀粉酶变体可作为用于多种清洁和洗涤包括洗衣和餐具洗涤工艺的去污剂组合物的组分添加。举例而言，变体可用于WO 96/23874和WO 97/07202中所述的去污剂组合物。
α-淀粉酶变体可以以常规采用的浓度掺入去污剂。举例而言，本发明的变体可以以对应于0.00001-10mg(作为纯、活性酶蛋白计算)α-淀粉酶每升使用常规给药水平的去污剂的洗涤/餐具洗涤液的量掺入。
举例而言，所述去污剂组合物可配制为手动或机器洗衣去污剂组合物，包含适用于预处理沾污的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物柔顺剂组合物，或配制为适用于一般家庭硬表面清洁操作的去污剂组合物，或配制用于手动或机器餐具洗涤操作。
去污剂组合物可进一步包含一种或多种其他酶，如脂肪酶、过氧化物酶、蛋白酶、其他淀粉分解酶例如其他α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、CGT酶、纤维素酶、甘露聚糖酶(如来自Novozymes,Denmark的MannawayTM)、果胶酶、果胶酸裂合酶、角质酶和/或漆酶。
一般而言，所选酶的性质应与所选去污剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分相容等)，且所述酶应以有效量存在。
去污剂可通过添加含有一种或几种酶的不同添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂包含于去污剂组合物。去污剂添加剂，例如不同的添加剂或组合的添加剂，可配制为例如，颗粒、液体、浆料等。优选的去污剂添加剂配制物为颗粒，特别是无尘颗粒，液体，特别是稳定化的液体，或浆料。
可产生无尘颗粒，例如，如公开于美国专利号4,106,991和4,661,452，且其可任选地通过本领结构域已知方法涂覆。蜡状涂覆材料为具有1000至20000的摩尔质量的聚环氧乙烷产品(聚乙二醇，PEG)，具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基酚；其中醇含有12至20个碳原子并具有15至80个环氧乙烷单元的乙氧化脂族醇；脂族醇；脂肪酸；和脂肪酸的甘油一酯、二酯和三酯。适用于通过流体床技术施用的薄膜形成涂覆材料的实例在GB1483591中给出。液体酶制备物可例如通过根据已确立的方法添加多元醇如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸来稳定化。受保护的酶可根据EP 238216中公开的方法制备。
去污剂组合物可为任何方便的形式，例如，条(bar)，片，粉末，颗粒，糊剂或液体。液体去污剂可为水性的，通常含有多至约70％水和0至约30％有机溶剂，或非水性的。
所述去污剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其可为非离子型的，包括半极性和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子型。表面活性剂通常以按重量计约0.1％至60％的水平存在。
当包含其中时，去污剂通常含有约1％至约40％阴离子型表面活性剂，如直链烷基苯磺酸，α-链烯基磺酸，烷基硫酸盐(脂族醇硫酸酯)，醇乙氧化硫酸酯，仲烷基磺酸，α-磺基脂肪酸甲酯，烷基或烯基琥珀酸或皂类。
当包含其中时，去污剂会通常含有约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，如醇乙氧化物，壬基酚乙氧化物，烷基聚糖苷，烷基二甲基胺氧化物，乙氧化脂肪酸单乙醇胺，脂肪酸单乙醇胺，多羟基烷基脂肪酸胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“glucamide”)。
去污剂可含有0至约65％去污剂助洗剂或络合剂如沸石，二磷酸盐，三磷酸盐，膦酸盐，碳酸盐，柠檬酸盐，氮三乙酸，乙二胺四乙酸，二乙三胺五乙酸，烷基或烯基琥珀酸，可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。
去污剂可包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素，聚乙烯基吡咯烷酮，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯基吡啶-N-氧化物，聚乙烯基咪唑，聚碳酸酯，聚聚丙烯酸酯，马来酸-丙烯酸共聚物，和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
去污剂可包含漂白系统，所述系统可包含H2O2源如过硼酸或过碳酸，其可与过酸形成漂白激活剂如四乙酰基乙二胺(tetraacetylethylenediamine)或壬酰氧苯磺酸。或者，所述漂白系统可包含例如胺、亚胺或砜类型的过氧酸。
去污剂组合物的酶可使用常规稳定剂例如多元醇如丙二醇或甘油，倘或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物例如芳族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸来稳定化，且组合物可如例如WO 92/19708和WO 92/19709中所述配制。
去污剂亦可含有其他常规去污剂成分如例如织物调节剂包括黏土、泡沫增强剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污物悬剂、抗污物重沉积剂、燃料、杀细菌剂、光学增亮剂、助水溶物、晦暗抑制剂或香料。
去污剂组合物可包含对应于0.01-100mg的酶蛋白每升洗液，优选0.055mg的酶蛋白每升洗液，特别是0.1-1mg的酶蛋白每升洗液的量存在的任何酶。
本文中所述的一种或多种变体酶还可组入WO 97/07202(通过提述并入本文)中公开的去污剂配制物。
本公开在下述实施例中包括进一步的细节，其不以任何方式旨在限制要求保护的范围。因此，下述实例提供说明，但并不限制要求保护的范围。
实施例
用于鉴定α-淀粉酶残余活性(residual activity)的试验
可以通过使用底物的方法来测定α-淀粉酶残余活性。在UltraAmylase Assay Kit(E33651,Invitrogen,La Jolla,CA,USA)中的所述底物，是玉米淀粉衍生物DQTM淀粉，其为用FL染料标记到使荧光淬灭(quench)的程度的玉米淀粉。
将瓶中含有的约1mg冻干的底物溶解于100微升50mM的醋酸钠(pH4.0)。摇晃该瓶20秒并避光置于室温下，并不时混合直到溶解。然后添加900微升100mM醋酸、0.01％(W/v)X100、0.12mM CaCl2,pH 5.5，充分涡旋振荡并在室温中避光保存直到可以使用。给定底物浓度为100微克/ml时，底物工作溶液通过在残余活性缓冲液(100mM醋酸，0.01％(w/v)X100,0.12mM CaCl2,pH 5.5)中稀释10倍来制备。在温育之后立即将酶稀释到浓度为在100mM醋酸,0.01％(W/v)X100,0.12mM CaCl2,pH 5.5中15ng酶蛋白/mL。
对于该试验，将25微升的底物工作溶液与25微升的稀释酶在黑色384孔微孔滴定板上混合10秒钟。在25℃，每分钟测定(激发光：485nm，发射光：555nm)一次每个孔的荧光强度，测定15分钟，且Vmax计算为荧光强度对时间所作图的斜率。所作图应为线性且已调整残余活性试验以使稀释的参照酶溶液在活性试验的线性范围内。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
一个葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在标准条件37℃、pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：醋酸盐0.1M，反应时间5分钟，每分钟水解1微摩麦芽糖的酶量。
可以使用自动分析器系统。在葡萄糖脱氢酶试剂中添加变旋酶(mutarotase)以使任何存在的α-D-葡萄糖变成β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在上述反应中与β-D-葡萄糖特异地反应，形成NADH，其用光度计(photometer)在340nm测定作为原始的葡萄糖浓度的量度。
AMG温育:
底物： 麦芽糖23.2mM
缓冲液： 醋酸盐0.1M
pH: 4.30±0.05
温育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
酶工作范围： 0.5-4.0AGU/mL
显色反应：
GlucDH: 430U/L
变旋酶： 9U/L
NAD: 0.21mM
缓冲液： 磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
pH: 7.60±0.05
温育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
实施例1
α-淀粉酶变体的稳定性
通过在pH 4.5和5.5，75℃和85℃的温度下，将参照α-淀粉酶和变体与0.12mMCaCl2温育，随后使用底物(Ultra Amylase assay kit,E33651,Molecular Probes)测定剩余活性，来测定参照α-淀粉酶(具有突变I181*+G182*+N193F截短至491个氨基酸(SEQ ID NO:6)的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶)和其α-淀粉酶变体的稳定性。
纯化的酶样本在酶稀释缓冲液(10mM醋酸,0.01％Triton X100,0.12mM CaCl2,pH5.0)中稀释到工作浓度为0.5和1或5和10ppm(微克/ml)。将20微升的酶样本转移到48孔PCRMTP，并在每孔添加180微升稳定缓冲液(150mM醋酸,150mM MES,0.01％Triton X100,0.12mM CaCl2,pH 4.5或5.5)并混合。该试验使用两种浓度的酶一式两份实施。在75℃或85℃温育之前，取出20微升并存于冰上作为对照样本。在PCR仪器上以75℃和85℃实施温育。
温育之后，将样本在残余活性缓冲液(100mM醋酸,0.01％Triton X100,0.12mMCaCl2,pH 5.5)中稀释为15ng/ml，将25微升稀释的酶转移到黑色384-MTP。通过向各孔添加25微升底物溶液(100微克/ml)，使用EnzChek底物来测定残余活性。使用在485-P nm的激发滤光片和555nm的发射滤光片(荧光度数器为Polarstar,BMG)每分钟测定荧光，测定15分钟。对于每一方案(setup)，将残余活性与对照样本归一化。
假定对数衰变半寿期(T1/2(min))使用等式：T1/2(min)＝T(min)*LN(0.5)/LN(％RA/100)来计算，其中T为以分钟计算的试验温育时间，％RA是在试验中测定的％残余活性。
使用该试验方案，测定了参照α-淀粉酶和其变体的半寿期，如下表1所示。
表1
ND：未鉴定
结果表明α-淀粉酶变体具有比参照α-淀粉酶显著高的半寿期和稳定性。
实施例2
使用α-淀粉酶变体生产乙醇
实施例1描述的四种小规模的参照α-淀粉酶和两个α-淀粉酶变体的醪如下制备：将约54g研磨的玉米(corn ground),约51g自来水，和约45g回流在一个250mL的塑料瓶中混合成总重量为150g的浆料。将玉米浆的pH调整为4.5。以每克干固体中两微克淀粉酶在醪中添加酶。对于液化，在瓶中添加α-淀粉酶，且充分混合该瓶并置于预热的85℃水浴。将样本在水浴中在pH 4.5放置2小时，同时在前30分钟内每10分钟摇晃瓶子，其后剩余的2小时的液化中每30分钟摇晃瓶子。然后将样本在冰浴中降温；pH调整为5.0，并添加0.75mL尿素和0.45mL青霉素以达到在最终的醪中浓度分别为1000和3ppm。样本随后用Sprizyme Fuel(诺维信售的一种葡糖淀粉酶产品)进行同时糖化和发酵(SSF)。
将5克醪份转移到预称重的圆锥离心管，每种醪重复5次。然后使用Sprizyme Fuel作为葡糖淀粉酶，对这些醪在32℃水浴中实施SSF 54小时。对于所有发酵，葡糖淀粉酶剂量为0.50AGU/g DS。在54小时的SSF之后，测定CO2在SSF中的重量损失，使用HPLC对乙醇定量。在下表2提供了54小时的HPLC SSF的平均数据。
表2
54小时发酵后的乙醇产量
结果显示相对于参照α-淀粉酶，使用α-淀粉酶变体产生了显著更高的乙醇产量。
在本文中描述和要求保护的发明在范围上并不受本文公开的特定方面所限，这是因为这些方面的意图为说明本发明的数个方面。任何等价的方面应认为在本发明的范围内。事实上，除本文中显示和描述的那些之外，数种对本发明的修改从前述的描述而言对本领域技术人员将显而易见。上述修改亦意欲符合所附权利要求的范围。在出现冲突的情况下，以包括定义在内的本公开为准。
本发明进一步通过下列段落定义：
段落1.分离的变体α-淀粉酶，其包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427中的任何三个或更多个(数个)位置上的取代，其中所述变体与SEQ IDNO:1,2,3,4,5,6和/或7的成熟多肽具有至少65％且小于100％的序列同一性，并且该变体具有α-淀粉酶活性。
段落2.段落1的变体，其包含在对应于位置59的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp或Tyr，特别是用Ala,Gln,Glu,Gly,Ile,Leu,Pro或Thr。
段落3.段落1或2的变体，其包含在对应于位置89的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Arg,His或Lys。
段落4.段落1-3中任一项的变体，其包含在对应于位置91的位置上的取代，该取代用Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ile,Leu或Val。
段落5.段落1-4中任一项的变体，其包含在对应于位置96的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ile,Leu或Val。
段落6.段落1-5中任一项的变体，其包含在对应于位置108的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ala。
段落7.段落1-6中任一项的变体，其包含在对应于位置112的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ala,Asp或Glu。
段落8.段落1-7中任一项的变体，其包含在对应于位置129的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ala,Thr或Val。
段落9.段落1-8中任一项的变体，其包含在对应于位置157的位置上的取代，该取代用Ala,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用His,Lys,Phe或Tyr。
段落10.段落1-9中任一项的变体，其包含在对应于位置165的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Asn。
段落11.段落1-10中任一项的变体，其包含在对应于位置166的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Tyr或Val，特别是用Phe。
段落12.段落1-11中任一项的变体，其包含在对应于位置168的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ala。
段落13.段落1-12中任一项的变体，其包含在对应于位置171的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Glu。
段落14.段落1-13中任一项的变体，其包含在对应于位置177的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Arg,Leu或Met。
段落15.段落1-14中任一项的变体，其包含在对应于位置179的位置上的取代，该取代用Ala,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Gln,Glu,Ile,Leu,Lys或Val。
段落16.段落1-15中任一项的变体，其包含在对应于位置180的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Glu或Val。
段落17.段落1-16中任一项的变体，其包含在对应于位置181的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Glu,Gly或Val。
段落18.段落1-17中任一项的变体，其包含在对应于位置184的位置上的取代，该取代用Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ser。
段落19.段落1-18中任一项的变体，其包含在对应于位置208的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Phe或Tyr。
段落20.段落1-19中任一项的变体，其包含在对应于位置220的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Pro。
段落21.段落1-20中任一项的变体，其包含在对应于位置224的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Leu。
段落22.段落1-21中任一项的变体，其包含在对应于位置242的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ala,Asp,Glu,Gln或Met。
段落23.段落1-22中任一项的变体，其包含在对应于位置254的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ala,Ser或Thr。
段落24.段落1-23中任一项的变体，其包含在对应于位置269的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Gln或Glu。
段落25.段落1-24中任一项的变体，其包含在对应于位置270的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Leu,Thr或Val。
段落26.段落1-25中任一项的变体，其包含在对应于位置274的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Arg,Gln,Glu,Lys或Phe。
段落27.段落1-26中任一项的变体，其包含在对应于位置276的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp或Val，特别是用Phe。
段落28.段落1-27中任一项的变体，其包含在对应于位置281的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Asn或Ser。
段落29.段落1-28中任一项的变体，其包含在对应于位置284的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用His,Thr或Val。
段落30.段落1-29中任一项的变体，其包含在对应于位置416的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ala,Asn,Asp,Ser,Thr或Val。
段落31.段落1-30中任一项的变体，其包含在对应于位置427的位置上的取代，该取代用Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr或Val，特别是用Ile,Met或Val。
段落32.段落1-31中任一项的变体，其包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427中的任意三个位置上的取代，特别是对应于位置129,177和179或位置220,242和254的位置上的取代。
段落33.段落32的变体，其中所述三个位置选自下组：
位置59,89和129；
位置59,89和177；
位置59,89和179；
位置59,89和180；
位置59,89和181；
位置59,89和220；
位置59,89和224；
位置59,89和242；
位置59,89和254；
位置59,108和284；
位置59,129和177；
位置59,129和179；
位置59,129和180；
位置59,129和181；
位置59,129和220；
位置59,129和224；
位置59,129和242；
位置59,129和254；
位置59,177和179；
位置59,177和180；
位置59,177和181；
位置59,177和220；
位置59,177和224；
位置59,177和242；
位置59,177和254；
位置59,179和181；
位置59,179和220；
位置59,179和224；
位置59,179和242；
位置59,179和254；
位置59,180和181；
位置59,180和220；
位置59,180和224；
位置59,180和242；
位置59,180和254；
位置59,181和220；
位置59,181和224；
位置59,181和242；
位置59,181和254；
位置59,220和224；
位置59,220和242；
位置59,220和254；
位置59,224和242；
位置59,224和254；
位置59,242和254；
位置89,129和177；
位置89,129和179；
位置89,129和180；
位置89,129和181；
位置89,129和220；
位置89,129和224；
位置89,129和242；
位置89,129和254；
位置89,177和179；
位置89,177和180；
位置89,177和181；
位置89,177和220；
位置89,177和224；
位置89,177和242；
位置89,177和254；
位置89,179和181；
位置89,179和220；
位置89,179和224；
位置89,179和242；
位置89,179和254；
位置89,180和181；
位置89,180和220；
位置89,180和224；
位置89,180和242；
位置89,180和254；
位置89,181和220；
位置89,181和224；
位置89,181和242；
位置89,181和254；
位置89,220和224；
位置89,220和242；
位置89,220和254；
位置89,224和242；
位置89,224和254；
位置89,242和254；
位置129,177和179；
位置129,177和180；
位置129,177和181；
位置129,177和220；
位置129,177和224；
位置129,177和242；
位置129,177和254；
位置129,179和181；
位置129,179和220；
位置129,179和224；
位置129,179和242；
位置129,179和254；
位置129,180和181；
位置129,180和220；
位置129,180和224；
位置129,180和242；
位置129,180和254；
位置129,181和220；
位置129,181和224；
位置129,181和242；
位置129,181和254；
位置129,220和224；
位置129,220和242；
位置129,220和254；
位置129,224和242；
位置129,224和254；
位置129,242和254；
位置177,179和181；
位置177,179和220；
位置177,179和224；
位置177,179和242；
位置177,179和254；
位置177,180和181；
位置177,180和220；
位置177,180和224；
位置177,180和242；
位置177,180和254；
位置177,181和220；
位置177,181和224；
位置177,181和242；
位置177,181和254；
位置177,220和224；
位置177,220和242；
位置177,220和254；
位置177,224和242；
位置177,224和254；
位置177,242和254；
位置179,181和220；
位置179,181和224；
位置179,181和242；
位置179,181和254；
位置179,220和224；
位置179,220和242；
位置179,220和254；
位置179,224和242；
位置179,224和254；
位置179,242和254；
位置180,181和220；
位置180,181和224；
位置180,181和242；
位置180,181和254；
位置180,220和224；
位置180,220和242；
位置180,220和254；
位置180,224和242；
位置180,224和254；
位置180,242和254；
位置181,220和224；
位置181,220和242；
位置181,220和254；
位置181,224和242；
位置181,224和254；
位置181,242和254；
位置220,224和242；
位置220,224和254；以及
位置224,242和254。
段落34.段落1-31中任一项的变体，其包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427的任何四个位置上的取代，特别是在对应于位置129,177,179和208；位置129,177,179和242；位置129,177,179和284；位置208,220,224和254；位置220,224,242和254；或位置220,224,254和284的位置上的取代。
段落35.段落34的变体，其中所述四个位置选自下组：
位置59,89,129和177；
位置59,89,129和179；
位置59,89,129和180；
位置59,89,129和181；
位置59,89,129和220；
位置59,89,129和224；
位置59,89,129和242；
位置59,89,129和254；
位置59,89,177和179；
位置59,89,177和180；
位置59,89,177和181；
位置59,89,177和220；
位置59,89,177和224；
位置59,89,177和242；
位置59,89,177和254；
位置59,89,179和181；
位置59,89,179和220；
位置59,89,179和224；
位置59,89,179和242；
位置59,89,179和254；
位置59,89,180和181；
位置59,89,180和220；
位置59,89,180和224；
位置59,89,180和242；
位置59,89,180和254；
位置59,89,181和220；
位置59,89,181和224；
位置59,89,181和242；
位置59,89,181和254；
位置59,89,220和224；
位置59,89,220和242；
位置59,89,220和254；
位置59,89,224和242；
位置59,89,224和254；
位置59,89,242和254；
位置59,108,242和284；
位置59,129,177和179；
位置59,129,177和180；
位置59,129,177和181；
位置59,129,177和220；
位置59,129,177和224；
位置59,129,177和242；
位置59,129,177和254；
位置59,129,179和181；
位置59,129,179和220；
位置59,129,179和224；
位置59,129,179和242；
位置59,129,179和254；
位置59,129,180和181；
位置59,129,180和220；
位置59,129,180和224；
位置59,129,180和242；
位置59,129,180和254；
位置59,129,181和220；
位置59,129,181和224；
位置59,129,181和242；
位置59,129,181和254；
位置59,129,220和224；
位置59,129,220和242；
位置59,129,220和254；
位置59,129,224和242；
位置59,129,224和254；
位置59,129,242和254；
位置59,177,179和181；
位置59,177,179和220；
位置59,177,179和224；
位置59,177,179和242；
位置59,177,179和254；
位置59,177,180和181；
位置59,177,180和220；
位置59,177,180和224；
位置59,177,180和242；
位置59,177,180和254；
位置59,177,181和220；
位置59,177,181和224；
位置59,177,181和242；
位置59,177,181和254；
位置59,177,220和224；
位置59,177,220和242；
位置59,177,220和254；
位置59,177,224和242；
位置59,177,224和254；
位置59,177,242和254；
位置59,179,181和220；
位置59,179,181和224；
位置59,179,181和242；
位置59,179,181和254；
位置59,179,220和224；
位置59,179,220和242；
位置59,179,220和254；
位置59,179,224和242；
位置59,179,224和254；
位置59,179,242和254；
位置59,180,181和220；
位置59,180,181和224；
位置59,180,181和242；
位置59,180,181和254；
位置59,180,220和224；
位置59,180,220和242；
位置59,180,220和254；
位置59,180,224和242；
位置59,180,224和254；
位置59,180,242和254；
位置59,181,220和224；
位置59,181,220和242；
位置59,181,220和254；
位置59,181,224和242；
位置59,181,224和254；
位置59,181,242和254；
位置59,220,224和242；
位置59,220,224和254；
位置59,220,242和254；
位置59,224,242和254；
位置89,129,177和179；
位置89,129,177和180；
位置89,129,177和181；
位置89,129,177和220；
位置89,129,177和224；
位置89,129,177和242；
位置89,129,177和254；
位置89,129,179和181；
位置89,129,179和220；
位置89,129,179和224；
位置89,129,179和242；
位置89,129,179和254；
位置89,129,180和181；
位置89,129,180和220；
位置89,129,180和224；
位置89,129,180和242；
位置89,129,180和254；
位置89,129,181和220；
位置89,129,181和224；
位置89,129,181和242；
位置89,129,181和254；
位置89,129,220和224；
位置89,129,220和242；
位置89,129,220和254；
位置89,129,224和242；
位置89,129,224和254；
位置89,129,242和254；
位置89,177,179和181；
位置89,177,179和220；
位置89,177,179和224；
位置89,177,179和242；
位置89,177,179和254；
位置89,177,180和181；
位置89,177,180和220；
位置89,177,180和224；
位置89,177,180和242；
位置89,177,180和254；
位置89,177,181和220；
位置89,177,181和224；
位置89,177,181和242；
位置89,177,181和254；
位置89,179,181和220；
位置89,179,181和224；
位置89,179,181和242；
位置89,179,181和254；
位置89,179,220和224；
位置89,179,220和242；
位置89,179,220和254；
位置89,179,224和242；
位置89,179,224和254；
位置89,179,242和254；
位置89,180,181和220；
位置89,180,181和224；
位置89,180,181和242；
位置89,180,181和254；
位置89,180,220和224；
位置89,180,220和242；
位置89,180,220和254；
位置89,180,224和242；
位置89,180,224和254；
位置89,180,242和254；
位置89,181,220和224；
位置89,181,220和242；
位置89,181,220和254；
位置89,181,224和242；
位置89,181,224和254；
位置89,181,242和254；
位置89,220,224和242；
位置89,220,224和254；
位置89,220,242和254；
位置89,224,242和254；
位置129,177,179和181；
位置129,177,179和220；
位置129,177,179和224；
位置129,177,179和242；
位置129,177,179和254；
位置129,177,179和284；
位置129,177,180和181；
位置129,177,180和220；
位置129,177,180和224；
位置129,177,180和242；
位置129,177,180和254；
位置129,177,181和220；
位置129,177,181和224；
位置129,177,181和242；
位置129,177,181和254；
位置129,177,220和224；
位置129,177,220和242；
位置129,177,220和254；
位置129,177,224和242；
位置129,177,224和254；
位置129,177,242和254；
位置129,179,181和220；
位置129,179,181和224；
位置129,179,181和242；
位置129,179,181和254；
位置129,179,220和224；
位置129,179,220和242；
位置129,179,220和254；
位置129,179,224和242；
位置129,179,224和254；
位置129,179,242和254；
位置129,180,181和220；
位置129,180,181和224；
位置129,180,181和242；
位置129,180,181和254；
位置129,180,220和224；
位置129,180,220和242；
位置129,180,220和254；
位置129,180,224和242；
位置129,180,224和254；
位置129,180,242和254；
位置129,181,220和224；
位置129,181,220和242；
位置129,181,220和254；
位置129,181,224和242；
位置129,181,224和254；
位置129,181,242和254；
位置129,220,224和242；
位置129,220,224和254；
位置129,220,242和254；
位置129,224,242和254；
位置177,179,181和220；
位置177,179,181和224；
位置177,179,181和242；
位置177,179,181和254；
位置177,179,220和224；
位置177,179,220和242；
位置177,179,220和254；
位置177,179,224和242；
位置177,179,224和254；
位置177,179,242和254；
位置177,180,181和220；
位置177,180,181和224；
位置177,180,181和242；
位置177,180,181和254；
位置177,180,220和224；
位置177,180,220和242；
位置177,180,220和254；
位置177,180,224和242；
位置177,180,224和254；
位置177,180,242和254；
位置177,181,220和224；
位置177,181,220和242；
位置177,181,220和254；
位置177,181,224和242；
位置177,181,224和254；
位置177,181,242和254；
位置177,220,224和242；
位置177,220,224和254；
位置177,220,242和254；
位置177,224,242和254；
位置179,181,220和224；
位置179,181,220和242；
位置179,181,220和254；
位置179,181,224和242；
位置179,181,224和254；
位置179,181,242和254；
位置179,220,224和242；
位置179,220,224和254；
位置179,220,242和254；
位置179,224,242和254；
位置180,181,220和224；
位置180,181,220和242；
位置180,181,220和254；
位置180,181,224和242；
位置180,181,224和254；
位置180,181,242和254；
位置180,220,224和242；
位置180,220,224和254；
位置180,220,242和254；
位置180,224,242和254；
位置181,220,224和242；
位置181,220,224和254；
位置181,220,242和254；
位置181,224,242和254；以及
位置220,224,242和254。
段落36.段落1-31中任一项的变体，其包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427的任何的五个位置上的取代，特别是在对应于位置129,177,179,208和242；位置129,177,179,208和284；位置208,220,224,242和254；或位置208,220,224,254和284的位置上的取代。
段落37.段落36的变体，其中所述五个位置选自下组：
位置59,89,129,177和179；
位置59,89,129,177和180；
位置59,89,129,177和181；
位置59,89,129,177和220；
位置59,89,129,177和224；
位置59,89,129,177和242；
位置59,89,129,177和254；
位置59,89,129,179和181；
位置59,89,129,179和220；
位置59,89,129,179和224；
位置59,89,129,179和242；
位置59,89,129,179和254；
位置59,89,129,180和181；
位置59,89,129,180和220；
位置59,89,129,180和224；
位置59,89,129,180和242；
位置59,89,129,180和254；
位置59,89,129,181和220；
位置59,89,129,181和224；
位置59,89,129,181和242；
位置59,89,129,181和254；
位置59,89,129,220和224；
位置59,89,129,220和242；
位置59,89,129,220和254；
位置59,89,129,224和242；
位置59,89,129,224和254；
位置59,89,129,242和254；
位置59,89,177,179和181；
位置59,89,177,179和220；
位置59,89,177,179和224；
位置59,89,177,179和242；
位置59,89,177,179和254；
位置59,89,177,180和181；
位置59,89,177,180和220；
位置59,89,177,180和224；
位置59,89,177,180和242；
位置59,89,177,180和254；
位置59,89,177,181和220；
位置59,89,177,181和224；
位置59,89,177,181和242；
位置59,89,177,181和254；
位置59,89,177,220和224；
位置59,89,177,220和242；
位置59,89,177,220和254；
位置59,89,177,224和242；
位置59,89,177,224和254；
位置59,89,177,242和254；
位置59,89,179,181和220；
位置59,89,179,181和224；
位置59,89,179,181和242；
位置59,89,179,181和254；
位置59,89,179,220和224；
位置59,89,179,220和242；
位置59,89,179,220和254；
位置59,89,179,224和242；
位置59,89,179,224和254；
位置59,89,179,242和254；
位置59,89,180,181和220；
位置59,89,180,181和224；
位置59,89,180,181和242；
位置59,89,180,181和254；
位置59,89,180,220和224；
位置59,89,180,220和242；
位置59,89,180,220和254；
位置59,89,180,224和242；
位置59,89,180,224和254；
位置59,89,180,242和254；
位置59,89,181,220和224；
位置59,89,181,220和242；
位置59,89,181,220和254；
位置59,89,181,224和242；
位置59,89,181,224和254；
位置59,89,181,242和254；
位置59,89,220,224和242；
位置59,89,220,224和254；
位置59,89,220,242和254；
位置59,89,224,242和254；
位置59,129,177,179和181；
位置59,129,177,179和220；
位置59,129,177,179和224；
位置59,129,177,179和242；
位置59,129,177,179和254；
位置59,129,177,180和181；
位置59,129,177,180和220；
位置59,129,177,180和224；
位置59,129,177,180和242；
位置59,129,177,180和254；
位置59,129,177,181和220；
位置59,129,177,181和224；
位置59,129,177,181和242；
位置59,129,177,181和254；
位置59,129,177,220和224；
位置59,129,177,220和242；
位置59,129,177,220和254；
位置59,129,177,224和242；
位置59,129,177,224和254；
位置59,129,177,242和254；
位置59,129,179,181和220；
位置59,129,179,181和224；
位置59,129,179,181和242；
位置59,129,179,181和254；
位置59,129,179,220和224；
位置59,129,179,220和242；
位置59,129,179,220和254；
位置59,129,179,224和242；
位置59,129,179,224和254；
位置59,129,179,242和254；
位置59,129,180,181和220；
位置59,129,180,181和224；
位置59,129,180,181和242；
位置59,129,180,181和254；
位置59,129,180,220和224；
位置59,129,180,220和242；
位置59,129,180,220和254；
位置59,129,180,224和242；
位置59,129,180,224和254；
位置59,129,180,242和254；
位置59,129,181,220和224；
位置59,129,181,220和242；
位置59,129,181,220和254；
位置59,129,181,224和242；
位置59,129,181,224和254；
位置59,129,181,242和254；
位置59,129,220,224和242；
位置59,129,220,224和254；
位置59,129,224,242和254；
位置59,177,179,181和220；
位置59,177,179,181和224；
位置59,177,179,181和242；
位置59,177,179,181和254；
位置59,177,179,220和224；
位置59,177,179,220和242；
位置59,177,179,220和254；
位置59,177,179,224和242；
位置59,177,179,224和254；
位置59,177,179,242和254；
位置59,177,180,181和220；
位置59,177,180,181和224；
位置59,177,180,181和242；
位置59,177,180,181和254；
位置59,177,180,220和224；
位置59,177,180,220和242；
位置59,177,180,220和254；
位置59,177,180,224和242；
位置59,177,180,224和254；
位置59,177,180,242和254；
位置59,177,181,220和224；
位置59,177,181,220和242；
位置59,177,181,220和254；
位置59,177,181,224和242；
位置59,177,181,224和254；
位置59,177,181,242和254；
位置59,177,220,224和242；
位置59,177,220,224和254；
位置59,177,224,242和254；
位置59,179,181,220和224；
位置59,179,181,220和242；
位置59,179,181,220和254；
位置59,179,181,224和242；
位置59,179,181,224和254；
位置59,179,181,242和254；
位置59,179,220,224和242；
位置59,179,220,224和254；
位置59,179,220,242和254；
位置59,180,181,220和224；
位置59,180,181,220和242；
位置59,180,181,220和254；
位置59,180,181,224和242；
位置59,180,181,224和254；
位置59,180,181,242和254；
位置59,180,220,224和242；
位置59,180,220,224和254；
位置59,180,220,242和254；
位置59,181,220,224和242；
位置59,181,220,224和254；
位置59,181,220,242和254；
位置59,220,224,242和254；
位置89,129,177,179和181；
位置89,129,177,179和220；
位置89,129,177,179和224；
位置89,129,177,179和242；
位置89,129,177,179和254；
位置89,129,177,180和181；
位置89,129,177,180和220；
位置89,129,177,180和224；
位置89,129,177,180和242；
位置89,129,177,180和254；
位置89,129,177,181和220；
位置89,129,177,181和224；
位置89,129,177,181和242；
位置89,129,177,181和254；
位置89,129,177,220和224；
位置89,129,177,220和242；
位置89,129,177,220和254；
位置89,129,177,224和242；
位置89,129,177,224和254；
位置89,129,177,242和254；
位置89,129,179,181和220；
位置89,129,179,181和224；
位置89,129,179,181和242；
位置89,129,179,181和254；
位置89,129,179,220和224；
位置89,129,179,220和242；
位置89,129,179,220和254；
位置89,129,179,224和242；
位置89,129,179,224和254；
位置89,129,179,242和254；
位置89,129,180,181和220；
位置89,129,180,181和224；
位置89,129,180,181和242；
位置89,129,180,181和254；
位置89,129,180,220和224；
位置89,129,180,220和242；
位置89,129,180,220和254；
位置89,129,180,224和242；
位置89,129,180,224和254；
位置89,129,180,242和254；
位置89,129,181,220和224；
位置89,129,181,220和242；
位置89,129,181,220和254；
位置89,129,181,224和242；
位置89,129,181,224和254；
位置89,129,180,242和254；
位置89,177,179,181和220；
位置89,177,179,181和224；
位置89,177,179,181和242；
位置89,177,179,181和254；
位置89,177,179,220和224；
位置89,177,179,220和242；
位置89,177,179,220和254；
位置89,177,179,224和242；
位置89,177,179,224和254；
位置89,177,179,242和254；
位置89,177,180,181和220；
位置89,177,180,181和224；
位置89,177,180,181和242；
位置89,177,180,181和254；
位置89,177,180,220和224；
位置89,177,180,220和242；
位置89,177,180,220和254；
位置89,177,180,224和242；
位置89,177,180,224和254；
位置89,177,180,242和254；
位置89,177,181,220和224；
位置89,177,181,220和242；
位置89,177,181,220和254；
位置89,177,181,224和242；
位置89,177,181,224和254；
位置89,177,181,242和254；
位置89,177,220,224和242；
位置89,177,220,224和254；
位置89,177,220,242和254；
位置89,179,181,220和224；
位置89,179,181,220和242；
位置89,179,181,220和254；
位置89,179,181,224和242；
位置89,179,181,242和254；
位置89,179,220,224和242；
位置89,179,220,224和254；
位置89,179,220,242和254；
位置89,180,181,220和224；
位置89,180,181,220和242；
位置89,180,181,220和254；
位置89,180,181,224和242；
位置89,180,181,242和254；
位置89,180,220,224和242；
位置89,180,220,224和254；
位置89,180,220,242和254；
位置89,181,220,224和242；
位置89,181,220,224和254；
位置89,181,220,242和254；
位置89,220,224,242和254；
位置129,177,179,181和220；
位置129,177,179,181和224；
位置129,177,179,181和242；
位置129,177,179,181和254；
位置129,177,179,220和224；
位置129,177,179,220和242；
位置129,177,179,220和254；
位置129,177,179,224和242；
位置129,177,179,224和254；
位置129,177,179,242和254；
位置129,177,180,181和220；
位置129,177,180,181和224；
位置129,177,180,181和242；
位置129,177,180,181和254；
位置129,177,180,220和224；
位置129,177,180,220和242；
位置129,177,180,220和254；
位置129,177,180,224和242；
位置129,177,180,224和254；
位置129,177,180,242和254；
位置129,177,181,220和224；
位置129,177,181,220和242；
位置129,177,181,220和254；
位置129,177,181,224和242；
位置129,177,181,224和254；
位置129,177,181,242和254；
位置129,179,181,220和224；
位置129,179,181,220和242；
位置129,179,181,220和254；
位置129,179,181,224和242；
位置129,179,181,224和254；
位置129,179,181,242和254；
位置129,179,220,224和242；
位置129,179,220,224和254；
位置129,179,220,242和254；
位置129,179,224,242和254；
位置129,180,181,220和224；
位置129,180,181,220和242；
位置129,180,181,220和254；
位置129,180,181,224和242；
位置129,180,181,224和254；
位置129,180,181,242和254；
位置129,180,220,224和242；
位置129,180,220,224和254；
位置129,180,220,242和254；
位置129,180,224,242和254；
位置129,181,220,224和242；
位置129,181,220,224和254；
位置129,181,220,242和254；
位置129,181,224,242和254；
位置129,220,224,242和254；
位置177,179,181,220和224；
位置177,179,181,220和242；
位置177,179,181,220和254；
位置177,179,181,224和242；
位置177,179,181,224和254；
位置177,179,181,242和254；
位置177,179,220,224和242；
位置177,179,220,224和254；
位置177,179,220,242和254；
位置177,179,224,242和254；
位置177,180,181,220和224；
位置177,180,181,220和242；
位置177,180,181,220和254；
位置177,180,181,224和242；
位置177,180,181,224和254；
位置177,180,181,242和254；
位置177,180,220,224和242；
位置177,180,220,224和254；
位置177,180,224,242和254；
位置177,181,220,224和242；
位置177,181,220,224和254；
位置177,181,224,242和254；
位置177,220,224,242和254；
位置179,181,220,224和242；
位置179,181,220,224和254；
位置179,181,220,242和254；
位置179,181,224,242和254；
位置179,220,224,242和254；
位置180,181,220,224和242；
位置180,181,220,224和254；
位置180,181,220,242和254；
位置180,181,224,242和254；
位置180,220,224,242和254；以及
位置181,220,224,242和254。
段落38.段落1-31中任一项的变体，其包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427的任何的六个位置上的取代，特别是在对应于位置129,177,179,208,242和284或位置129,177,179,220,224和254的位置上的取代。
段落39.段落38的变体，其中所述六个位置选自下组：
位置59,89,129,177,179和181；
位置59,89,129,177,179和220；
位置59,89,129,177,179和224；
位置59,89,129,177,179和242；
位置59,89,129,177,179和254；
位置59,89,129,177,180和181；
位置59,89,129,177,180和220；
位置59,89,129,177,180和224；
位置59,89,129,177,180和242；
位置59,89,129,177,180和254；
位置59,89,129,177,181和220；
位置59,89,129,177,181和224；
位置59,89,129,177,181和242；
位置59,89,129,177,181和254；
位置59,89,129,177,220和224；
位置59,89,129,177,220和242；
位置59,89,129,177,220和254；
位置59,89,129,177,224和242；
位置59,89,129,177,224和254；
位置59,89,129,177,242和254；
位置59,89,129,179,181和220；
位置59,89,129,179,181和224；
位置59,89,129,179,181和242；
位置59,89,129,179,181和254；
位置59,89,129,179,220和224；
位置59,89,129,179,220和242；
位置59,89,129,179,220和254；
位置59,89,129,179,224和242；
位置59,89,129,179,224和254；
位置59,89,129,179,242和254；
位置59,89,129,180,181和220；
位置59,89,129,180,181和224；
位置59,89,129,180,181和242；
位置59,89,129,180,181和254；
位置59,89,129,180,220和224；
位置59,89,129,180,220和242；
位置59,89,129,180,220和254；
位置59,89,129,180,224和242；
位置59,89,129,180,224和254；
位置59,89,129,180,242和254；
位置59,89,129,181,220和224；
位置59,89,129,181,220和242；
位置59,89,129,181,220和254；
位置59,89,129,181,224和242；
位置59,89,129,181,224和254；
位置59,89,129,181,242和254；
位置59,89,129,220,224和242；
位置59,89,129,220,224和254；
位置59,89,129,220,242和254；
位置59,89,129,224,242和254；
位置59,89,177,179,181和220；
位置59,89,177,179,181和224；
位置59,89,177,179,181和242；
位置59,89,177,179,181和254；
位置59,89,177,179,220和224；
位置59,89,177,179,220和242；
位置59,89,177,179,220和254；
位置59,89,177,179,224和242；
位置59,89,177,179,224和254；
位置59,89,177,179,242和254；
位置59,89,177,180,181和220；
位置59,89,177,180,181和224；
位置59,89,177,180,181和242；
位置59,89,177,180,181和254；
位置59,89,177,180,220和224；
位置59,89,177,180,220和242；
位置59,89,177,180,220和254；
位置59,89,177,180,224和242；
位置59,89,177,180,224和254；
位置59,89,177,180,242和254；
位置59,89,177,181,220和224；
位置59,89,177,181,220和242；
位置59,89,177,181,220和254；
位置59,89,177,181,224和242；
位置59,89,177,181,224和254；
位置59,89,177,181,242和254；
位置59,89,177,220,224和242；
位置59,89,177,220,224和254；
位置59,89,177,220,242和254；
位置59,89,179,181,220和224；
位置59,89,179,181,220和242；
位置59,89,179,181,220和254；
位置59,89,179,181,224和242；
位置59,89,179,181,224和254；
位置59,89,179,181,242和254；
位置59,89,179,220,224和242；
位置59,89,179,220,224和254；
位置59,89,179,220,242和254；
位置59,89,180,181,220和224；
位置59,89,180,181,220和242；
位置59,89,180,181,220和254；
位置59,89,180,181,224和242；
位置59,89,180,181,224和254；
位置59,89,180,181,242和254；
位置59,89,180,220,224和242；
位置59,89,180,220,224和254；
位置59,89,180,220,242和254；
位置59,89,181,220,224和242；
位置59,89,181,220,224和254；
位置59,89,181,220,242和254；
位置59,89,220,224,242和254；
位置59,129,177,179,181和220；
位置59,129,177,179,181和224；
位置59,129,177,179,181和242；
位置59,129,177,179,181和254；
位置59,129,177,179,208和284；
位置59,129,177,179,220和224；
位置59,129,177,179,220和242；
位置59,129,177,179,220和254；
位置59,129,177,179,224和242；
位置59,129,177,179,224和254；
位置59,129,177,179,242和254；
位置59,129,177,180,181和220；
位置59,129,177,180,181和224；
位置59,129,177,180,181和242；
位置59,129,177,180,181和254；
位置59,129,177,180,220和224；
位置59,129,177,180,220和242；
位置59,129,177,180,220和254；
位置59,129,177,180,224和242；
位置59,129,177,180,224和254；
位置59,129,177,180,242和254；
位置59,129,177,181,220和224；
位置59,129,177,181,220和242；
位置59,129,177,181,220和254；
位置59,129,177,181,224和242；
位置59,129,177,181,224和254；
位置59,129,177,181,242和254；
位置59,129,177,220,224和242；
位置59,129,177,220,224和254；
位置59,129,177,224,242和254；
位置59,129,179,181,220和224；
位置59,129,179,181,220和242；
位置59,129,179,181,220和254；
位置59,129,179,220,224和242；
位置59,129,179,220,224和254；
位置59,129,179,220,242和254；
位置59,129,179,224,242和254；
位置59,129,180,181,220和224；
位置59,129,180,181,220和242；
位置59,129,180,181,220和254；
位置59,129,180,220,224和242；
位置59,129,180,220,224和254；
位置59,129,180,220,242和254；
位置59,129,180,224,242和254；
位置59,129,181,220,224和242；
位置59,129,181,220,224和254；
位置59,129,181,220,242和254；
位置59,129,181,224,242和254；
位置59,129,220,224,242和254；
位置59,177,179,181,220和224；
位置59,177,179,181,220和242；
位置59,177,179,181,220和254；
位置59,177,179,181,224和242；
位置59,177,179,181,224和254；
位置59,177,179,181,242和254；
位置59,177,179,220,224和242；
位置59,177,179,220,224和254；
位置59,177,179,220,242和254；
位置59,177,179,224,242和254；
位置59,177,180,181,220和224；
位置59,177,180,181,220和242；
位置59,177,180,181,220和254；
位置59,177,180,181,224和242；
位置59,177,180,181,224和254；
位置59,177,180,181,242和254；
位置59,177,180,220,224和242；
位置59,177,180,220,224和254；
位置59,177,180,220,242和254；
位置59,177,180,224,242和254；
位置59,177,181,220,224和242；
位置59,177,181,220,224和254；
位置59,177,181,220,242和254；
位置59,177,181,224,242和254；
位置59,177,220,224,242和254；
位置59,179,181,220,224和242；
位置59,179,181,220,224和254；
位置59,179,181,220,242和254；
位置59,179,181,224,242和254；
位置59,179,220,224,242和254；
位置59,180,181,220,224和242；
位置59,180,181,220,224和254；
位置59,180,181,220,242和254；
位置59,180,181,224,242和254；
位置59,180,220,224,242和254；
位置59,181,220,224,242和254；
位置59,208,220,224,254和284；
位置89,129,177,179,181和220；
位置89,129,177,179,181和224；
位置89,129,177,179,181和242；
位置89,129,177,179,181和254；
位置89,129,177,179,220和224；
位置89,129,177,179,220和242；
位置89,129,177,179,220和254；
位置89,129,177,179,224和242；
位置89,129,177,179,224和254；
位置89,129,177,179,242和254；
位置89,129,177,180,181和220；
位置89,129,177,180,181和224；
位置89,129,177,180,181和242；
位置89,129,177,180,181和254；
位置89,129,177,180,220和224；
位置89,129,177,180,220和242；
位置89,129,177,180,220和254；
位置89,129,177,180,224和242；
位置89,129,177,180,224和254；
位置89,129,177,180,242和254；
位置89,129,177,181,220和224；
位置89,129,177,181,220和242；
位置89,129,177,181,220和254；
位置89,129,177,181,224和242；
位置89,129,177,181,224和254；
位置89,129,177,181,242和254；
位置89,129,177,220,224和242；
位置89,129,177,220,224和254；
位置89,129,177,220,242和254；
位置89,129,177,224,242和254；
位置89,129,179,181,220和224；
位置89,129,179,181,220和242；
位置89,129,179,181,220和254；
位置89,129,179,181,224和242；
位置89,129,179,181,224和254；
位置89,129,179,181,242和254；
位置89,129,179,220,224和242；
位置89,129,179,220,224和254；
位置89,129,179,220,242和254；
位置89,129,179,224,242和254；
位置89,129,180,220,224和242；
位置89,129,180,220,224和254；
位置89,129,180,220,242和254；
位置89,129,180,224,242和254；
位置89,129,181,220,224和242；
位置89,129,181,220,224和254；
位置89,129,181,220,242和254；
位置89,129,181,224,242和254；
位置89,129,220,224,242和254；
位置89,177,179,181,220和224；
位置89,177,179,181,220和242；
位置89,177,179,181,220和254；
位置89,177,179,181,224和242；
位置89,177,179,181,224和254；
位置89,177,179,181,242和254；
位置89,177,179,220,224和242；
位置89,177,179,220,224和254；
位置89,177,179,220,242和254；
位置89,177,179,224,242和254；
位置89,177,180,181,220和224；
位置89,177,180,181,220和242；
位置89,177,180,181,220和254；
位置89,177,180,181,224和242；
位置89,177,180,181,224和254；
位置89,177,180,181,242和254；
位置89,177,180,220,224和242；
位置89,177,180,220,224和254；
位置89,177,180,220,242和254；
位置89,177,180,224,242和254；
位置89,177,181,220,224和242；
位置89,177,181,220,224和254；
位置89,177,181,220,242和254；
位置89,177,181,224,242和254；
位置89,177,220,224,242和254；
位置89,179,181,220,224和242；
位置89,179,181,220,224和254；
位置89,179,181,220,242和254；
位置89,179,181,224,242和254；
位置89,179,220,224,242和254；
位置89,180,181,220,224和242；
位置89,180,181,220,224和254；
位置89,180,181,220,242和254；
位置89,180,181,224,242和254；
位置89,180,220,224,242和254；
位置89,181,220,224,242和254；
位置129,177,179,181,220和224；
位置129,177,179,181,220和242；
位置129,177,179,181,220和254；
位置129,177,179,181,224和242；
位置129,177,179,181,224和254；
位置129,177,179,181,242和254；
位置129,177,179,220,224和242；
位置129,177,179,220,224和254；
位置129,177,179,220,242和254；
位置129,177,179,224,242和254；
位置129,177,180,181,220和224；
位置129,177,180,181,220和242；
位置129,177,180,181,220和254；
位置129,177,180,181,224和242；
位置129,177,180,181,224和254；
位置129,177,180,181,242和254；
位置129,177,180,220,224和242；
位置129,177,180,220,224和254；
位置129,177,180,220,242和254；
位置129,177,180,224,242和254；
位置129,177,181,220,224和242；
位置129,177,181,220,224和254；
位置129,177,181,220,242和254；
位置129,177,181,224,242和254；
位置129,177,200,224,242和254；
位置129,179,181,220,224和242；
位置129,179,181,220,224和254；
位置129,179,181,220,242和254；
位置129,179,181,224,242和254；
位置129,179,220,224,242和254；
位置129,180,181,220,224和242；
位置129,180,181,220,224和254；
位置129,180,181,220,242和254；
位置129,180,181,224,242和254；
位置129,180,220,224,242和254；
位置129,181,220,224,242和254；
位置177,179,181,220,224和242；
位置177,179,181,220,224和254；
位置177,179,181,224,242和254；
位置177,179,220,224,242和254；
位置177,180,181,220,224和242；
位置177,180,181,220,224和254；
位置177,180,181,224,242和254；
位置177,180,220,224,242和254；
位置177,181,220,224,242和254；
位置179,181,220,224,242和254；以及
位置180,181,220,224,242和254。
段落40.段落1-31中任一项的变体，其包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427的任何的七个位置上的取代。
段落41.段落40的变体，其中所述七个位置选自下组：
位置59,89,129,177,179,181和220；
位置59,89,129,177,179,181和224；
位置59,89,129,177,179,181和242；
位置59,89,129,177,179,181和254；
位置59,89,129,177,179,220和224；
位置59,89,129,177,179,220和242；
位置59,89,129,177,179,220和254；
位置59,89,129,177,179,224和242；
位置59,89,129,177,179,224和254；
位置59,89,129,177,179,242和254；
位置59,89,129,177,180,181和220；
位置59,89,129,177,180,181和224；
位置59,89,129,177,180,181和242；
位置59,89,129,177,180,181和254；
位置59,89,129,177,180,220和224；
位置59,89,129,177,180,220和242；
位置59,89,129,177,180,220和254；
位置59,89,129,177,180,224和242；
位置59,89,129,177,180,224和254；
位置59,89,129,177,180,242和254；
位置59,89,129,177,181,220和224；
位置59,89,129,177,181,220和242；
位置59,89,129,177,181,220和254；
位置59,89,129,177,181,224和242；
位置59,89,129,177,181,224和254；
位置59,89,129,177,181,242和254；
位置59,89,129,177,220,224和242；
位置59,89,129,177,220,224和254；
位置59,89,129,177,224,242和254；
位置59,89,129,179,181,220和224；
位置59,89,129,179,181,220和242；
位置59,89,129,179,181,220和254；
位置59,89,129,179,181,224和242；
位置59,89,129,179,181,224和254；
位置59,89,129,179,181,242和254；
位置59,89,129,179,220,224和242；
位置59,89,129,179,220,224和254；
位置59,89,129,179,220,242和254；
位置59,89,129,179,224,242和254；
位置59,89,129,180,181,220和224；
位置59,89,129,180,181,220和242；
位置59,89,129,180,181,220和254；
位置59,89,129,180,181,224和242；
位置59,89,129,180,181,224和254；
位置59,89,129,180,181,242和254；
位置59,89,129,180,220,224和242；
位置59,89,129,180,220,224和254；
位置59,89,129,180,220,242和254；
位置59,89,129,180,224,242和254；
位置59,89,129,181,220,224和242；
位置59,89,129,181,220,224和254；
位置59,89,129,181,220,242和254；
位置59,89,129,181,224,242和254；
位置59,89,129,220,224,242和254；
位置59,89,177,179,181,220和224；
位置59,89,177,179,181,220和242；
位置59,89,177,179,181,220和254；
位置59,89,177,179,181,224和242；
位置59,89,177,179,181,224和254；
位置59,89,177,179,181,242和254；
位置59,89,177,179,220,224和242；
位置59,89,177,179,220,224和254；
位置59,89,177,179,224,242和254；
位置59,89,177,180,181,220和224；
位置59,89,177,180,181,220和242；
位置59,89,177,180,181,220和254；
位置59,89,177,180,181,224和242；
位置59,89,177,180,181,224和254；
位置59,89,177,180,181,242和254；
位置59,89,177,180,220,224和242；
位置59,89,177,180,220,224和254；
位置59,89,177,180,224,242和254；
位置59,89,177,181,220,224和242；
位置59,89,177,181,220,224和254；
位置59,89,177,181,220,242和254；
位置59,89,177,181,224,242和254；
位置59,89,177,220,224,242和254；
位置59,89,179,181,220,224和242；
位置59,89,179,181,220,224和254；
位置59,89,179,181,220,242和254；
位置59,89,179,220,224,242和254；
位置59,89,180,181,220,224和242；
位置59,89,180,181,220,224和254；
位置59,89,180,181,220,242和254；
位置59,89,180,220,224,242和254；
位置59,89,181,220,224,242和254；
位置59,129,177,179,181,220和224；
位置59,129,177,179,181,220和242；
位置59,129,177,179,181,220和254；
位置59,129,177,179,181,224和242；
位置59,129,177,179,181,224和254；
位置59,129,177,179,181,242和254；
位置59,129,177,179,220,224和242；
位置59,129,177,179,220,224和254；
位置59,129,177,179,220,242和254；
位置59,129,177,179,224,242和254；
位置59,129,177,180,181,220和224；
位置59,129,177,180,181,220和242；
位置59,129,177,180,181,220和254；
位置59,129,177,180,181,224和242；
位置59,129,177,180,181,224和254；
位置59,129,177,180,181,242和254；
位置59,129,177,180,220,224和242；
位置59,129,177,180,220,224和254；
位置59,129,177,180,220,242和254；
位置59,129,177,180,224,242和254；
位置59,129,177,181,220,224和242；
位置59,129,177,181,220,224和254；
位置59,129,177,181,220,242和254；
位置59,129,177,181,224,242和254；
位置59,129,177,220,224,242和254；
位置59,177,179,181,220,224和242；
位置59,177,179,181,220,224和254；
位置59,177,179,181,220,242和254；
位置59,177,179,181,224,242和254；
位置59,177,179,220,224,242和254；
位置59,177,180,181,220,224和242；
位置59,177,180,181,220,224和254；
位置59,177,180,181,220,242和254；
位置59,177,180,181,224,242和254；
位置59,177,180,220,224,242和254；
位置59,177,181,220,224,242和254；
位置59,179,181,220,224,242和254；
位置59,180,181,220,224,242和254；
位置89,129,177,179,181,220和224；
位置89,129,177,179,181,220和242；
位置89,129,177,179,181,220和254；
位置89,129,177,179,181,224和242；
位置89,129,177,179,181,224和254；
位置89,129,177,179,181,242和254；
位置89,129,177,179,220,224和242；
位置89,129,177,179,220,224和254；
位置89,129,177,179,220,242和254；
位置89,129,177,179,224,242和254；
位置89,129,177,180,181,220和224；
位置89,129,177,180,181,220和242；
位置89,129,177,180,181,220和254；
位置89,129,177,180,181,224和242；
位置89,129,177,180,181,224和254；
位置89,129,177,180,181,242和254；
位置89,129,177,180,220,224和242；
位置89,129,177,180,220,224和254；
位置89,129,177,180,220,242和254；
位置89,129,177,180,224,242和254；
位置89,129,177,181,220,224和242；
位置89,129,177,181,220,224和254；
位置89,129,177,181,220,242和254；
位置89,129,177,181,224,242和254；
位置89,129,177,220,224,242和254；
位置89,129,179,181,220,224和242；
位置89,129,179,181,220,224和254；
位置89,129,179,181,220,242和254；
位置89,129,179,181,224,242和254；
位置89,129,179,220,224,242和254；
位置89,129,180,181,220,224和242；
位置89,129,180,181,220,224和254；
位置89,129,180,181,220,242和254；
位置89,129,180,181,224,242和254；
位置89,129,180,220,224,242和254；
位置89,129,181,220,224,242和254；
位置89,177,179,181,220,224和242；
位置89,177,179,181,220,224和254；
位置89,177,179,181,220,242和254；
位置89,177,179,181,224,242和254；
位置89,177,179,220,224,242和254；
位置89,177,180,181,220,224和242；
位置89,177,180,181,220,224和254；
位置89,177,180,181,220,242和254；
位置89,177,180,181,224,242和254；
位置89,177,180,220,224,242和254；
位置89,177,181,220,224,242和254；
位置89,179,181,220,224,242和254；
位置89,180,181,220,224,242和254；
位置129,177,179,181,220,224和242；
位置129,177,179,181,220,224和254；
位置129,177,179,181,220,242和254；
位置129,177,179,181,224,242和254；
位置129,177,179,220,224,242和254；
位置129,177,180,181,220,224和242；
位置129,177,180,181,220,224和254；
位置129,177,180,181,220,242和254；
位置129,177,180,181,224,242和254；
位置129,177,180,220,224,242和254；
位置129,177,181,220,224,242和254；
位置129,179,181,220,224,242和254；
位置129,180,181,220,224,242和254；
位置177,179,181,220,224,242和254；以及
位置177,180,181,220,224,242和254。
段落42.段落1-31中任一项的变体，其包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427的任何的八个位置上的取代。
段落43.段落42的变体，其中所述八个位置选自下组：
位置59,89,129,177,179,181,220和224；
位置59,89,129,177,179,181,220和242；
位置59,89,129,177,179,181,220和254；
位置59,89,129,177,179,181,224和242；
位置59,89,129,177,179,181,224和254；
位置59,89,129,177,179,181,242和254；
位置59,89,129,177,179,220,224和242；
位置59,89,129,177,179,220,224和254；
位置59,89,129,177,179,220,242和254；
位置59,89,129,177,179,224,242和254；
位置59,89,129,177,180,181,220和224；
位置59,89,129,177,180,181,220和242；
位置59,89,129,177,180,181,220和254；
位置59,89,129,177,180,181,224和242；
位置59,89,129,177,180,181,224和254；
位置59,89,129,177,180,181,242和254；
位置59,89,129,177,180,220,224和242；
位置59,89,129,177,180,220,224和254；
位置59,89,129,177,180,220,242和254；
位置59,89,129,177,180,224,242和254；
位置59,89,129,177,181,220,224和242；
位置59,89,129,177,181,220,224和254；
位置59,89,129,177,181,220,242和254；
位置59,89,129,177,181,224,242和254；
位置59,89,129,177,220,224,242和254；
位置59,89,129,179,181,220,224和242；
位置59,89,129,179,181,220,224和254；
位置59,89,129,179,181,220,242和254；
位置59,89,129,179,181,224,242和254；
位置59,89,129,179,220,224,242和254；
位置59,89,129,180,181,220,224和242；
位置59,89,129,180,181,220,224和254；
位置59,89,129,180,181,220,242和254；
位置59,89,129,180,181,224,242和254；
位置59,89,129,180,220,224,242和254；
位置59,89,129,181,220,224,242和254；
位置59,89,177,179,181,220,224和242；
位置59,89,177,179,181,220,224和254；
位置59,89,177,179,181,220,242和254；
位置59,89,177,179,181,224,242和254；
位置59,89,177,179,220,224,242和254；
位置59,89,177,180,181,220,224和242；
位置59,89,177,180,181,220,224和254；
位置59,89,177,180,181,220,242和254；
位置59,89,177,180,181,224,242和254；
位置59,89,177,180,220,224,242和254；
位置59,89,177,181,220,224,242和254；
位置59,89,179,181,220,224,242和254；
位置59,89,180,181,220,224,242和254；
位置59,129,177,179,181,220,224和242；
位置59,129,177,179,181,220,224和254；
位置59,129,177,179,181,224,242和254；
位置59,129,177,179,220,224,242和254；
位置59,129,177,180,181,220,224和242；
位置59,129,177,180,181,220,224和254；
位置59,129,177,180,181,224,242和254；
位置59,129,177,180,220,224,242和254；
位置59,129,177,181,220,224,242和254；
位置59,129,179,181,220,224,242和254；
位置59,129,180,181,220,224,242和254；
位置59,177,179,181,220,224,242和254；
位置59,177,180,181,220,224,242和254；
位置89,129,177,179,181,220,224和242；
位置89,129,177,179,181,220,224和254；
位置89,129,177,179,181,224,242和254；
位置89,129,177,179,220,224,242和254；
位置89,129,177,180,181,220,224和242；
位置89,129,177,180,181,220,224和254；
位置89,129,177,180,181,224,242和254；
位置89,129,177,180,220,224,242和254；
位置89,129,177,181,220,224,242和254；
位置129,177,179,181,220,224,242和254；以及
位置129,177,180,181,220,224,242和254。
段落44.段落1-31中任一项的变体，其包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427的任何的九个位置上的取代。
段落45.段落44的变体，其中所述九个位置选自下组：
位置59,89,129,177,179,181,220,224和242；
位置59,89,129,177,179,181,220,224和254；
位置59,89,129,177,179,181,220,242和254；
位置59,89,129,177,179,181,224,242和254；
位置59,89,129,177,179,220,224,242和254；
位置59,89,129,177,180,181,220,224和242；
位置59,89,129,177,180,181,220,224和254；
位置59,89,129,177,180,181,220,242和254；
位置59,89,129,177,180,181,224,242和254；
位置59,89,129,177,180,220,224,242和254；
位置59,89,129,177,181,220,224,242和254；
位置59,89,129,179,181,220,224,242和254；
位置59,89,129,180,181,220,224,242和254；
位置59,89,177,179,181,220,224,242和254；
位置59,89,177,180,181,220,224,242和254；
位置59,129,177,179,181,220,224,242和254；
位置59,129,177,179,208,220,224,254和284；
位置89,129,177,179,181,220,224,242和254；以及
位置89,129,177,180,181,220,224,242和254。
段落46.段落1-31中任一项的变体，其包含在对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427的任何的10个位置上的取代。
段落47.段落46的变体，其中所述10个位置对应于：
位置59,89,129,177,179,181,220,224,242,254；
位置59,89,129,177,179,208,220,224,254,284；
位置59,89,129,177,180,181,220,224,242,254；以及
位置59,129,177,179,208,220,224,242,254,284。
段落48.段落1-47中任一项的变体，其具有3-20，例如3-10和6-10项变更，诸如3,4,5,6,7,8,9或10项变更。
段落49.分离的变体α-淀粉酶，其包含选自下组的取代集或由选自下组的取代集组成：
V59A+G108A；
S242Q+M284V；
V59A+M284V；
G108A+M284V；
V59A+G108A+M284V；
V59A+G108A+S242Q+M284V；
E129V+K177L+R179E；
K220P+N224L+Q254S；
E129V+K177L+R179E+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+M284V；
V59A+H208Y+K220P+N224L+Q254S+M284V；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284V；
V59A+Q89R+G108A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S+M284V；以及
V59A+G108A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284V；
其中所述变体与SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6和/或7的成熟多肽具有至少65％且小于100％的序列同一性并且变体具有α-淀粉酶活性。
段落50.段落1-49中任一项的变体，其具有3-20，例如3-10和6-10项变更，诸如3,4,5,6,7,8,9或10项变更。
段落51.段落50的变体，其中所述变更为取代。
段落52.段落1-50中任一项的变体，其进一步包含在对应于位置179,180,181和182的一个或多个(例如两个，三个或四个)位置的缺失。
段落53.段落52的变体，其中所述缺失的位置对应于位置180和181。
段落54.段落1-53中任一项的变体，其进一步包含在对应于位置193的位置上的取代。
段落55.段落54的变体，其中所述对应于位置193的位置上的取代是用Phe。
段落56.段落1-55中任一项的变体，其进一步包含在对应于位置376和/或377的位置的缺失。
段落57.段落1-56中任一项的变体，其为选自下组的亲本α-淀粉酶的变体：
a.与SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6或7的成熟多肽具有至少60％的序列同一性的多肽；或
b.SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6或7的成熟多肽的片段，其具有α-淀粉酶活性。
段落58.段落57的变体，其中所述亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6或7的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％以及100％的序列同一性。
段落59.段落57的变体，其中所述亲本α-淀粉酶包含或其组成为SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6或7的成熟多肽的氨基酸序列。
段落60.段落57的变体，其中所述亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6或7的成熟多肽的氨基酸序列的片段，其中所述片段具有α-淀粉酶活性。
段落61.段落1-60中任一项的变体，其为亲本野生型α-淀粉酶的变体。
段落62.段落61的变体，其中所述亲本α-淀粉酶是芽孢杆菌属α-淀粉酶。
段落63.段落62的变体，其中所述亲本α-淀粉酶是解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌α-淀粉酶。
段落64.段落1-63中任一项的变体，其与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少65％，例如至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％但小于100％的序列同一性。
段落65.段落1-63中任一项的变体，其与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％但小于100％的序列同一性。
段落66.段落1-63中任一项的变体，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％但小于100％的序列同一性。
段落67.段落1-63中任一项的变体，其与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％但小于100％的序列同一性。
段落68.段落1-63中任一项的变体，其与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％但小于100％的序列同一性。
段落69.段落1-63中任一项的变体，其与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％但小于100％的序列同一性。
段落70.段落1-63中任一项的变体，其与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％但小于100％的序列同一性。
段落71.段落1-63中任一项的变体，其与SEQ ID NO:7的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％但小于100％的序列同一性。
段落72.段落1-71中任一项的变体，其中所述变体由483-515,483-493或483-486个氨基酸组成。
段落73.包含段落1-72中任一项的变体和表面活性剂的去污剂组合物。
段落74.一种组合物，其包含段落1-72中任一项的变体和一种或多种选自下组的酶：β-淀粉酶、纤维素酶(β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶)葡糖淀粉酶、半纤维素酶(例如木聚糖酶)、异淀粉酶、异构酶、脂肪酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶和 普 鲁兰酶(pullulanase)。
段落75.段落1-72中任一项的变体用于洗涤和/或餐具洗涤的用途。
段落76.段落1-72中任一项的变体用于脱浆纺织品的用途。
段落77.段落1-72中任一项的变体用于生产烘焙产品的用途。
段落78.段落1-72中任一项的变体用于液化含淀粉材料的用途。
段落79.一种生产液化淀粉的方法，其包括用段落1-72中任一项的变体液化含淀粉材料。
段落80.一种生产发酵产物的方法，其包括：
a.用段落1-72中任一项的变体液化含淀粉材料来生产液化醪；
b.糖化该液化醪以生产可发酵糖；且
c.在发酵生物的存在下发酵该可发酵糖。
段落81.段落80的方法，其中所述含淀粉材料用所述变体和 普鲁兰 酶(pullulanase)如GH57 普鲁兰酶(pullulanase)液化。
段落82.段落81的方法，其中所述 普鲁兰酶(pullulanase)从热球菌属(Thermococcus)获得，其包括热球菌属菌种AM4、热球菌属菌种HJ21、Thermococcusbarophilus、Thermococcus gammatolerans、Thermococcus hydrothermalis、Thermococcus kodakarensis、Thermococcus litoralis和Thermococcus onnurineus；或从火球菌属(Pyrococcus)获得，例如Pyrococcus abyssi和Pyrococcus furiosus。
段落83.段落80-82中任一项的方法，其进一步包括在液化之前、过程中和/或之后加入蛋白酶，例如酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。
段落84.段落83的方法，其中所述金属蛋白酶从热子囊菌属的菌株获取,优选Thermoascus aurantiacus的菌株，特别是Thermoascus aurantiacus CGMCC No.0670。
段落85.生产发酵产物的方法，其包括将淀粉底物与段落1-72中任一项的变体、葡糖淀粉酶和发酵生物接触。
段落86.段落80-85中任一项的方法，其中所述发酵产物选自下组：醇(如乙醇和丁醇)、有机酸(如琥珀酸和乳酸)、糖醇(如甘油)、抗坏血酸中间物(如葡糖酸、2-酮-D-葡糖酸、2,5-二酮-D-葡糖酸和2-酮-L-葡糖酸)、氨基酸(如赖氨酸)、蛋白质(如抗体和其片段)。
段落87.一种分离的多核苷酸，其编码段落1-72中任一项的变体。
段落88.包含段落87的多核苷酸的核酸构建体。
段落89.包含段落88的核酸构建体的表达载体。
段落90.包含段落88的核酸构建体的宿主细胞。
段落91.一种生产变体α-淀粉酶的方法，其包括：
a.在适合该变体表达的条件下培养段落90的宿主细胞；且
b.从培养基中回收该变体。
段落92.用段落87的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。
段落93.一种获得变体α-淀粉酶的方法，其包括：
a.在亲本α-淀粉酶中对应于位置59,89,91,96,108,112,129,157,165,166,168,171,177,179,180,181,184,208,220,224,242,254,269,270,274,276,281,284,416和427的三个或更多个(数个)位置引入取代，其中所述变体与SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6和7的至少一个成熟多肽具有至少65％且小于100％的序列同一性，并且所述变体具有α-淀粉酶活性；以及
b.回收所述变体。

Claims (44)

1.一种分离的变体α-淀粉酶，其在三个或更多个位置上的取代选自于V59A,Q89R,G112D,E129V,D165N,W166F,E168A,K171E，K177L,R179E,A184S,H208Y,K220P,N224L,S242Q,Q254S,D269E,I270L,H274K,Y276F,D281N,M284V,G416V,L427M，其中亲本α-淀粉酶由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成，所述变体与亲本α-淀粉酶具有至少98％且小于100％的序列同一性，并且该变体具有α-淀粉酶活性，而且所述变体含有下述取代：E129V+K177L+R179E。
2.权利要求1中的变体，与亲本α-淀粉酶相比，其具有选自下组的取代集：
V59A+Q89R+E129V+D165N+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+W166F+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S+M284V；
V59A+E129V+D165N+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+E168A+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+E168A+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+E129V+K171E+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+A184S+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284V；
V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F；
V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；
A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；E129V+K177L+R179E+S242Q。
3.权利要求1的变体，与亲本α-淀粉酶相比，其具有4项变更。
4.权利要求1的变体，与亲本α-淀粉酶相比，其具有5项变更。
5.权利要求1的变体，与亲本α-淀粉酶相比，其具有6项变更。
6.权利要求1的变体，与亲本α-淀粉酶相比，其具有7项变更。
7.权利要求1的变体，与亲本α-淀粉酶相比，其具有8项变更。
8.权利要求1的变体，与亲本α-淀粉酶相比，其具有9项变更。
9.权利要求1-8中任一项的变体，其与亲本α-淀粉酶具有至少99％但小于100％的序列同一性。
10.权利要求1-8中任一项的变体，其中所述变体由483-515个氨基酸组成。
11.权利要求1-8中任一项的变体，其中所述变体由483-493个氨基酸组成。
12.权利要求1-8中任一项的变体，其中所述变体由483-486个氨基酸组成。
13.分离的变体α-淀粉酶，其亲本α-淀粉酶由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成，与亲本α-淀粉酶相比，其取代选自下组：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+D165N+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+W166F+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S+M284V；
V59A+E129V+D165N+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+E168A+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+E168A+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+E129V+K171E+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+A184S+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284V；
V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F；
V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；
A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；
E129V+K177L+R179E+S242Q。
14.包含权利要求1-13中任一项的变体和表面活性剂的去污剂组合物。
15.一种组合物，其包含权利要求1-13中任一项的变体和一种或多种选自下组的酶：β-淀粉酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、异淀粉酶、异构酶、脂肪酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶和普鲁兰酶。
16.一种组合物，其包含权利要求1-13中任一项的变体和一种或多种选自下组的酶：β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和木聚糖酶。
17.权利要求1-13中任一项的变体用于洗涤的用途。
18.权利要求1-13中任一项的变体用于餐具洗涤的用途。
19.权利要求1-13中任一项的变体用于脱浆纺织品的用途。
20.权利要求1-13中任一项的变体用于生产烘焙产品的用途。
21.权利要求1-13中任一项的变体用于液化含淀粉材料的用途。
22.一种生产液化淀粉的方法，其包括用权利要求1-13中任一项的变体液化含淀粉材料。
23.一种生产发酵产物的方法，其包括：
a.用权利要求1-13中任一项的变体液化含淀粉材料来生产液化醪；
b.糖化该液化醪以生产可发酵糖；且
c.在发酵生物的存在下发酵该可发酵糖。
24.权利要求23的方法，其中所述含淀粉材料用所述变体和普鲁兰酶液化。
25.权利要求23的方法，其中所述含淀粉材料用所述变体和GH57普鲁兰酶液化。
26.权利要求24或25的方法，其中所述普鲁兰酶从热球菌属(Thermococcus)获得；或从火球菌属(Pyrococcus)获得。
27.权利要求24或25的方法，其中所述普鲁兰酶从热球菌属菌种AM4、热球菌属菌种HJ21、Thermococcus barophilus、Thermococcus gammatolerans、Thermococcushydrothermalis、Thermococcus kodakarensis、Thermococcus litoralis和Thermococcusonnurineus获得；或从Pyrococcus abyssi和Pyrococcus furiosus获得。
28.权利要求23-25中任一项的方法，其进一步包括在液化之前、过程中和/或之后加入蛋白酶。
29.权利要求23-25中任一项的方法，其进一步包括在液化之前、过程中和/或之后加入酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。
30.权利要求29的方法，其中所述金属蛋白酶从热子囊菌属的菌株获取。
31.权利要求29的方法，其中所述金属蛋白酶从Thermoascus aurantiacus 的菌株获取。
32.权利要求29的方法，其中所述金属蛋白酶从Thermoascus aurantiacus CGMCCNo.0670的菌株获取。
33.权利要求23-25中任一项的方法，其中所述发酵产物选自下组：醇、有机酸、抗坏血酸中间物、氨基酸、蛋白质。
34.权利要求33的方法，其中所述醇为糖醇。
35.权利要求23-25中任一项的方法，其中所述发酵产物选自下组：乙醇、丁醇、琥珀酸、乳酸、甘油、葡糖酸、2-酮-D-葡糖酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、2-酮-L-葡糖酸、赖氨酸、抗体和其片段。
36.生产发酵产物的方法，其包括将淀粉底物与权利要求1-13中任一项的变体、葡糖淀粉酶和发酵生物接触。
37.权利要求36的方法，其中所述发酵产物选自下组：醇、有机酸、抗坏血酸中间物、氨基酸、蛋白质。
38.权利要求37的方法，其中所述醇为糖醇。
39.权利要求36的方法，其中所述发酵产物选自下组：乙醇、丁醇、琥珀酸、乳酸、甘油、葡糖酸、2-酮-D-葡糖酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、2-酮-L-葡糖酸、赖氨酸、抗体和其片段。
40.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-13中任一项的变体。
41.包含权利要求40的多核苷酸的核酸构建体。
42.包含权利要求41的核酸构建体的表达载体。
43.包含权利要求41的核酸构建体的宿主细胞。
44.一种生产变体α-淀粉酶的方法，其包括：
a.在适合该变体表达的条件下培养权利要求43的宿主细胞；且
b.从培养基中回收该变体。
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