CN106170545A - α‑淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及α‑淀粉酶变体，该α‑淀粉酶变体在葡萄糖存在下具有改进的稳定性和/或对长链底物比短链底物具有相对更高的活性。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸

对序列表的引用

本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及α-淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。

相关技术说明

α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)构成催化淀粉、糖原以及相关多糖以及低聚糖的水解的一组酶。

α-淀粉酶在商业上用于各种用途，如在淀粉加工(例如液化)的初始阶段中；在湿磨过程中；以及在从碳水化合物来源的乙醇产生中。α-淀粉酶还用作清洗剂或在洗涤剂基质中的辅助物；在纺织工业中用于淀粉脱浆；用于烘焙应用中；用于饮料行业中；用于油田的钻探过程中；在回收过程中例如用于使纸去墨；以及用于动物饲料中。

例如用于淀粉液化的一些商业α-淀粉酶来源于细菌，例如地衣芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌。已经开发了蛋白质工程化变体来克服在低pH和高温下，特别是在低钙浓度下的稳定性问题。现今，一些此类液化在低钠离子浓度下运行。因此，对于在加工过程(例如，液化)中具有改进的稳定性的α-淀粉酶存在需要，这些过程在低钠离子浓度、低pH和高温下，特别是在低钙浓度下进行。

WO 2013/057141和WO 2013/057143描述了在低pH和高温下，特别是在低钙浓度下具有改进的稳定性的细菌α-淀粉酶变体。

本发明的目的是提供α-淀粉酶变体。

发明概述

本发明涉及α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体在葡萄糖存在下具有改进的稳定性和/或对长链底物比短链底物具有相对更高的活性。

在一方面，本发明涉及亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体包括使用SEQ ID NO:1进行编号的一个或多个取代，或者组a)和b)中的对应的取代：

组a)K176、E185、I201、H205、K213、Q360、D416、R437；

组b)另外的赖氨酸残基至非天然氨基酸的取代；其中该变体与以下各项具有至少80％，但小于100％序列一致性：

(i)SEQ ID NO:1或14中的任何一个所述的成熟多肽，或

(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483或SEQ ID NO:14的氨基酸1至481；并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

该α-淀粉酶可以具有任何来源，如细菌来源，尤其是芽胞杆菌属来源，如地衣芽孢杆菌来源。

在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶变体包括或具有以下取代或对应的组a)和组b)取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和

组b)中以下取代中的一个或多个：

K136、K154、K170、K234、K237、K251、K315、K319、K392(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶变体包括或具有以下取代或对应的组a)和组b)取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和

组b)中以下取代中的一个或多个：K136R、K154A、K154H、K154S、K170R、K170S、K234T、K237R、K251Q、K315M、K319Q、K319L、K392V(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

如可从图1中的比对中所看到的，SEQ ID NO:1中的组a)位置，即，K176、E185、I201、H205、K213、Q360、D416、R437，对应于SEQ ID NO:14中的K174、E183、F199、H203、K211、Q358、D414、R435W。

在一个实施例中，该α-淀粉酶变体包括或具有以下取代或对应的组a)和组b)取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211T+Q358S+D414V+R435W；和

组b)中以下取代中的一个或多个：

K134、K152、K168、K232、K235、K249、K313、K317、K390(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

在一个实施例中，该α-淀粉酶变体包括或具有以下取代或对应的组a)和组b)取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211T+Q358S+D414V+R435W；和

组b)中以下取代中的一个或多个：

K134R、K152A、K152H、K152S、K168R、K168S、K232T、K235R、K249Q、K313M、K317Q、K317L、K390V(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

分别与SEQ ID NO:1或14的成熟多肽相比，本发明的变体具有改进的稳定性，具体地在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。分别与SEQ ID NO:1或14的成熟多肽相比，本发明的变体对长链底物比对短链底物具有相对更高的活性。

在一方面，本发明涉及编码本发明变体的分离的多核苷酸。

在一方面，本发明涉及包括本发明的多核苷酸的核酸构建体。

在一方面，本发明涉及包括本发明的多核苷酸或构建体的表达载体。

在一方面，本发明涉及一种包括本发明的多核苷酸的宿主细胞。

在一方面，本发明涉及生产α-淀粉酶变体的方法，该方法包括：

a.在适于表达该变体的条件下培养本发明的宿主细胞；并且

b.回收该变体。

在一方面，本发明涉及用于获得本发明的α-淀粉酶变体的方法，该方法包括(a)向亲本α-淀粉酶中引入如以上所定义的取代；并且(b)回收该变体。

在一方面，本发明涉及组合物，该组合物包括本发明的变体和选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：β-淀粉酶、纤维素酶(β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、和内切葡聚糖酶)、葡糖淀粉酶、半纤维素酶(例如，木聚糖酶)、异淀粉酶、异构酶、脂肪酶、植酸酶、蛋白酶和支链淀粉酶。在一个实施例中，可以添加另外的α-淀粉酶，即，第二α-淀粉酶。在一个实施例中，该另外的α-淀粉酶可以是另一种来源的α-淀粉酶。当本发明的α-淀粉酶变体是SEQ ID NO:1中所示的亲本α-淀粉酶(即，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶)时，该另外的α-淀粉酶可以是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。当本发明的α-淀粉酶变体是SEQ ID NO:14中所示的亲本α-淀粉酶(即，SEQ ID NO:6中所示的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的杂合α-淀粉酶和SEQ IDNO:1中所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的变体或LE399)时，该另外的/第二α-淀粉酶可以是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，如WO 2002/010355中披露为SEQ ID NO:6的α-淀粉酶的成熟部分，或其变体。

在一方面，本发明涉及生产液化淀粉的方法，该方法包括用本发明的变体或本发明的组合物液化一种含淀粉材料。

在一方面，本发明涉及生产一种发酵产物特别是乙醇的工艺，该工艺包括：

(a)用本发明的变体来液化一种含淀粉材料，以产生一种液化醪液；

(b)将该液化醪液糖化，以产生可发酵的糖；并且

(c)使用发酵有机体对可发酵的糖进行发酵。

在一方面，本发明涉及生产糖的工艺，该工艺包括：

(a)用本发明的变体来液化一种含淀粉材料，以产生一种液化醪液；

(b)将该液化醪液糖化，以产生可发酵的糖。

在一个实施例中，可以回收所产生的糖。还可以将这些糖转化为其他最终产物，如糖浆。在一个实施例中，将这些糖异构化成果糖或含果糖的产物，如高果糖糖浆，尤其是高果糖玉米糖浆(HFCS)和/或麦芽糖糖浆。

在一方面，本发明涉及本发明的变体用于洗涤和/或餐具洗涤的用途。

在一方面，本发明涉及本发明的变体用于使纺织品退浆的用途。

在一方面，本发明涉及本发明的变体用于生产烘焙产品的用途。

在一方面，本发明涉及本发明的变体用于液化含淀粉材料的用途。

在一方面，本发明涉及本发明的变体在生产糖浆的工艺中用于液化含淀粉材料的用途。

在一方面，本发明涉及本发明的变体在生产一种发酵产物如乙醇的工艺中用于液化含淀粉材料的用途。

附图简述

图1示出具有以下氨基酸序列的α-淀粉酶的比对：

SEQ ID NO:1是地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。

SEQ ID NO:2是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。

SEQ ID NO:3是应用微生物学杂志(J.Appl.Microbiology)，1997,82:325-334(SWALL：q59222)中所描述的芽胞杆菌属α-淀粉酶TS-23。

SEQ ID NO:4是在WO 2005/001064中描述的黄热芽孢杆菌(Bacillusflavothermus)α-淀粉酶AMY1048。

SEQ ID NO:5是在WO 04/113511中描述为SEQ ID NO:21的芽孢杆菌属α-淀粉酶TS-22。

SEQ ID NO:6是解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶。

SEQ ID NO:7是在WO 95/26397中描述为SEQ ID NO 1的芽孢杆菌碱性物种SP690淀粉酶。

SEQ ID NO:8是在WO 95/26397中描述为SEQ ID NO 2的盐敏芽孢杆菌(Bacillushalmapalus)α-淀粉酶。

SEQ ID NO:9是在WO 00/60060中描述为SEQ ID NO 4的芽孢杆菌碱性属AA560淀粉酶。

SEQ ID NO:10是在WO 200210356中描述为SEQ ID NO 2的芽孢杆菌碱性属A7-7淀粉酶。

SEQ ID NO:11是冢本(Tsukamoto)等人，1988，生物化学和生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)151:25-33中所描述的芽胞杆菌属碱性属SP707淀粉酶。

SEQ ID NO:12是在EP 1022334中描述为SEQ ID NO 2的芽孢杆菌碱性属K-38淀粉酶。

SEQ ID NO:13是在李(Lee)等人，2006，生物化学杂志(J.Biochem)，139:997-1005中描述的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。

SEQ ID NO:14是以前在例如WO 2002/010355中披露的变体α-淀粉酶LE399。

SEQ ID NO:15是变体α-淀粉酶：LE2488。

定义

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

α-淀粉酶：α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)是催化淀粉以及其他线性和分支1,4糖苷寡糖和多糖的水解的一组酶。本领域技术人员将知道如何确定α-淀粉酶活性。它可根据在实例中描述的程序例如通过PNP-G7测定来确定。在一方面，本发明的变体具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:14的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性。在另一方面，本申请的变体具有其亲本的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”意指一种多核苷酸，该多核苷酸直接规定了一种变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指为编码本发明的一种变体的一种多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或者外源的(即，来自不同基因)，或者相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及一种变体的产生的任何步骤，包括(但不限于)转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指一种线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺少一个或多个(例如若干个)氨基酸的一种多肽；其中该片段具有α-淀粉酶活性。在一方面，一个片段含有至少300个氨基酸残基、至少350个氨基酸残基、至少400个氨基酸残基、至少450个氨基酸残基、至少470个氨基酸残基或至少480个氨基酸残基。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

分离的：术语“分离的”意指在自然界中不存在的一种形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或者(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。成熟形式的一些α-淀粉酶(例如，一些细菌α-淀粉酶)包括含有用于底物水解的活性位点的催化结构域以及用于结合碳水化合物底物(淀粉)的一个或多个碳水化合物结合模块(CBM)以及任选地将一个或多个CBM与催化结构域连接的多肽，后一类型的区域通常称为“接头”。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包括一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下配置，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列放置在适当位置处，以使得控制序列指导编码序列的表达。

亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”意指进行变化以产生本发明的α-淀粉酶变体的α-淀粉酶。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的参数为空位开放罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gapextension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸用不同氨基酸来置换；缺失意指除去占据一个位置的氨基酸；并且插入意指与占据一个位置的氨基酸相邻来添加一个或多个(例如，数个)氨基酸，例如1-5个氨基酸。在一方面，本发明的变体具有SEQ ID NO:1的成熟多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。在另一方面，本申请的变体具有其亲本的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。α-淀粉酶活性可通过在实例中描述的PNP-G7测定来确定。

野生型α-淀粉酶：术语“野生型”α-淀粉酶意指由自然界中发现的天然存在的微生物(如一种细菌、酵母或丝状真菌)表达的α-淀粉酶。

术语“颗粒状淀粉”被理解为生的未煮过的淀粉，即尚未经历糊化的淀粉。淀粉是在植物体内作为不溶于水的微小颗粒而形成。这些颗粒在低于初始糊化温度的温度下被保存为淀粉。当放入冷水中时，这些颗粒可以吸收少量的液体。高达50℃至70℃，膨胀是可逆的，可逆性程度取决于具体的淀粉。在更高温度下，开始不可逆膨胀，称为“糊化”。

术语“初始糊化温度”被理解为淀粉糊化开始时的最低温度。淀粉在60℃与70℃之间开始糊化，准确温度取决于具体淀粉。初始糊化温度取决于有待加工的淀粉的来源。小麦淀粉的初始糊化温度为约52℃，对于马铃薯淀粉为大约56℃，并且对于玉米淀粉为大约62℃。然而，初始淀粉的品质可以根据植物物种的具体品种以及随生长条件而变化，并且因此应该针对每个单独的淀粉批次确定初始糊化温度。

术语“可溶性淀粉水解物”被理解为本发明的方法的可溶性产物并且可以包括单糖、二糖和寡糖，例如葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精、环糊精以及这些的任何混合物。优选地，颗粒状淀粉的干固体的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％被转化为可溶性淀粉水解物。

术语“特制糖浆”是本领域公认的术语并且根据DE和碳水化合物谱进行表征(参见由G.G.伯奇(G.G.Birch)和L.F.格林(L.F.Green)编辑的教科书“食品碳水化合物的分子结构与功能(Molecular Structure and Function of Food Carbohydrate)”中的第50+页的文章“新特制葡萄糖糖浆(New Speciality Glucose Syrups)”，应用科学出版社有限公司(Applied Science Publishers LTD.)，伦敦)。典型地，特制糖浆的DE范围是从35至45。

葡糖淀粉酶活性：术语“葡糖淀粉酶活性”意指催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶活性(EC 3.2.1.3)。出于本发明的目的，根据下文的“材料与方法”部分所述的程序来确定葡糖淀粉酶活性。Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量：37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。

β-淀粉酶活性：术语“β-淀粉酶活性”意指催化多糖中的(1->4)-α-D-糖苷键水解以便从链的非还原端除去连续的麦芽糖单位直到分子被降解、或在支链淀粉的情况下直到到达分支点的4-α-D-葡聚糖麦芽糖水解酶活性(EC 3.2.1.2)。释放的麦芽糖具有β端基异构构型，因此名称为β-淀粉酶。β-淀粉酶是传统地给予外切作用的产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中的1,4-α-糖苷键水解。出于本发明的目的，根据下文的“材料与方法”部分所述的程序来确定β-淀粉酶活性。

变体命名规则

出于本发明的目的，将SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽用来确定其他α-淀粉酶中的对应的氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定与SEQ ID NO:1中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的参数为空位开放罚分(gapopen penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。

另一种α-淀粉酶中相对应的氨基酸残基的鉴别可以通过使用若干计算机程序使用其对应的缺省参数比对多个多肽序列来确定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望值的多序列比较；3.5版或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(NucleicAcids Research)32：1792-1797)；MAFFT(6.857版或更新版本；加藤(Katoh)和库玛(Kuma)，2002，核酸研究30：3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33：511-518；加藤和朝都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23：372-374；加藤等人，2009，分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)537：39-64；加藤和朝都，2010，生物信息学26：1899-1900)；以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83版或更新版本；汤普森等人，1994，核酸研究22：4673-4680)。

例如，图1显示出SEQ ID NO:1中的K176、E185、I201、H205、K213、Q360、D416、R437对应于SEQ ID NO:14中的K174、E183、F199、H203Y、K211、Q358、D414、R435。

当其他酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过一个迭代数据库搜索过程来产生多个特征曲线并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。使用多种算法(例如距离比对矩阵(赫尔姆(Holm)和桑德尔(Sander)，1998，蛋白杂志(Proteins)33:88-96)或者组合扩展(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程学11:739-747))可以比对两个或更多个蛋白结构，并且可以另外地利用这些算法的实施来随所感兴趣的结构查询结构数据库以便发现可能的结构同源物(例如，赫尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学16:566-567)。

在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用了已接受的IUPAC单个字母和三字母的氨基酸缩写。

取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。在本申请的实例中，多个突变由空格分开，例如，G205R S411F代表G205R+S411F。

缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195*”或者“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或者“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入氨基酸#1、插入氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。

在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：

亲本：	变体：
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多种改变。包括多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。

不同的改变。可以在一个位置上引入不同的变化时，这些不同的变化由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

发明详细说明

本发明涉及α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体在葡萄糖存在下具有改进的稳定性和/或对长链底物比短链底物具有相对更高的活性。

变体

在一方面，本发明涉及亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体包括使用SEQ ID NO:1进行编号的一个或多个取代，或者组a)和b)中的对应的取代：

组a)K176、E185、I201、H205、K213、Q360、D416、R437；

组b)赖氨酸至非天然氨基酸的取代；

其中该变体与以下各项具有至少80％，但小于100％序列一致性：

(i)SEQ ID NO:1或14中的任何一个的成熟多肽，或

(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483或SEQ ID NO:14的氨基酸1至481；

并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

不希望受理论约束，申请人认为当被用于淀粉加工中时，α-淀粉酶的稳定性受自发的美拉德反应负面地影响，这些自发的美拉德反应发生在像葡萄糖的还原糖和存在于多肽的氨基末端或精氨酸和赖氨酸的侧链上的游离氨基基团之间。随着温度升高，反应速率增加。赖氨酸残基比精氨酸残基和N-末端氨基更具有反应性。在糖和例如赖氨酸侧链末端处的氨基基团之间的最初的美拉德反应可以延续到一连串的继发反应，但是它们都导致了修饰的赖氨酸残基，这些修饰的赖氨酸残基在酶的背景下可能已经失去了其功能，对稳定性和/或活性的产生作用。因此，据信与(i)SEQ ID NO:14的成熟多肽、或(ii)SEQ ID NO:14的氨基酸1至481具有至少80％序列一致性的亲本α-淀粉酶的变体(如亲本α-淀粉酶，其中赖氨酸被取代为非天然氨基酸)，在葡萄糖存在下，与该亲本相比具有改进的稳定性。

该α-淀粉酶可以具有任何来源，如细菌来源，尤其是芽胞杆菌属来源，如地衣芽孢杆菌来源。

在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶变体包括或具有以下取代或对应的组a)和组b)取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和

组b)中以下取代中的一个或多个：K136、K154、K170、K234、K237、K251、K315、K319、K392(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在又一个优选的实施例中，该α-淀粉酶变体包括或具有使用SEQ ID NO:1进行编号的一个或多个取代，或者组a)和b)中的对应的取代：

组a)K176、E185、I201、H205、K213、Q360、D416、R437；

组b)K136、K154、K170、K234、K237、K251、K306、K315、K319、K392；其中该变体与以下各项具有至少80％，但少于100％的序列一致性：

(i)SEQ ID NO:1或14中的任何一个的成熟多肽，或

SEQ ID NO:1的氨基酸1至483或SEQ ID NO:14的氨基酸1至481；并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶变体包括或具有以下取代或对应的组a)和组b)取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和

组b)中以下取代中的一个或多个：K136R、K154A、K154H、K154S、K170R、K170S、K234T、K237R、K251Q、K315M、K319Q、K319L、K392V(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在其他优选的实施例中，该变体包括或具有以下取代或对应的组a)和组b)取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；或

K176L+I201Y+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W

和

组b)中以下取代中的一个或多个：

K136、K154、K170、K234、K237、K251、K306、K315、K319、K392(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个实施例中，该组b)取代是K136R(使用SEQ ID NO:1进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K154A、H、S(使用SEQ ID NO:1进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K170R、S(使用SEQ ID NO:1进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K234T(使用SEQID NO:1进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K237R(使用SEQ ID NO:1进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K251Q(使用SEQ ID NO:1进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K315A、N、C、Q、E、G、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y、V(使用SEQ ID NO:1进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K319Q、L(使用SEQ ID NO:1进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K392V(使用SEQ ID NO:1进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代选自下组，该组由以下各项组成：

·K136R；

·K154A；

·K154H；

·K154S；

·K170R；

·K170S；

·K234T；

·K237R；

·K251Q；

·K306M

·K315M；

·K319Q；

·K319L；

·K392V；

·K392V+Q393D；

·H133Y+K136R(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个实施例中，本发明的变体进一步包括在以下位置中任一处的取代：H68、H133、H142、Y156、Y158、H316、L318，这些位置使用SEQ ID NO:1进行编号。在一个优选的实施例中，该取代是一种或多种以下取代：H68W、H133Y、H142Y、Y156W、Y158W、H316W、L318W。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和

组b)：K316R(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和

组b)：K154A、H、S(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和

组b)：K170R、S(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和

组b)：K234T(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和

组b)：K237R(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和

组b)：K306M或K251Q(使用SEQ ID NO:1进行编号)。在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和组b)：K315A、N、C、Q、E、G、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y、V(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和

组b)：K315M(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和

组b)：K319Q、L(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和

组b)：K392V(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和

组b)：K392V+Q393D(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；和

组b)：H133Y+K136R(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

在一个实施例中，本发明的变体与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽或(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％，但小于100％的序列一致性。

根据本发明，该变体是一种亲本α-淀粉酶的变体，该亲本α-淀粉酶与(i)SEQ IDNO:1的成熟多肽或(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。

在另一个实施例中，本发明的变体包括或具有以下取代或对应的组a)和组b)取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211+Q358S+D414V+R435W；和

组b)中以下取代中的一个或多个：K134、K152、K168、K232、K235、K249、K313、K317、K390(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

在又一个实施例中，该变体包括或具有以下取代或对应的组a)和组b)取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211+Q358S+D414V+R435W；或

K174L+F199Y+H203Y+K211T+E253P+Q358S+D414V+R435W

和

组b)中以下取代中的一个或多个：

K134、K152、K168、K232、K235、K249、K304M、K313、K317、K390(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

在一个实施例中，该组b)取代是K134R(使用SEQ ID NO:14进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K152A、H、S(使用SEQ ID NO:14进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K168R、S(使用SEQ ID NO:14进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K232T(使用SEQ ID NO:14进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K235R(使用SEQ ID NO:14进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K249Q(使用SEQ ID NO:14进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K313A、N、C、Q、E、G、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y、V(使用SEQ ID NO:14进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K317Q、L(使用SEQ ID NO:14进行编号)。在一个实施例中，该组b)取代是K390V(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

在一个优选实施例中，该组b)取代选自下组，该组由以下各项组成：

·K134R；

·K152A；

·K152H；

·K152S；

·K168R；

·K168S；

·K232T；

·K235R；

·K249Q；

·K304M

·K313M；

·K317Q；

·K317L；

·K390V；

·K390V+Q391D；

H131Y+K134R(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

在一个实施例中，本发明的变体进一步包括在以下位置中任一处的取代：H66、H131、H140、Y154、Y156、H314、L316，这些位置使用SEQ ID NO:14进行编号。在一个优选的实施例中，该取代是一种或多种以下取代：H66W、H131Y、H140Y、Y154W、Y156W、H314W、L316W。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211T+Q358S+D414V+R435W；和

组b)：K134R(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211T+Q358S+D414V+R435W；和

组b)：K152A、H、S(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211T+Q358S+D414V+R435W；和

组b)：K168R、S(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211T+Q358S+D414V+R435W；和

组b)：K232T(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211T+Q358S+D414V+R435W；和

组b)：K235R(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211T+Q358S+D414V+R435W；和

组b)：K249Q(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211T+Q358S+D414V+R435W；和

组b)：K313A、N、C、Q、E、G、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y、V(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211T+Q358S+D414V+R435W；和

组b)：K313M(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211T+Q358S+D414V+R435W；和

组b)：K317Q、L(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体包括或具有其他亲本α-淀粉酶中的以下组a)和组b)取代或对应取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211T+Q358S+D414V+R435W；和

组b)：K390V(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

在一个优选的实施例中，本发明的变体与(i)SEQ ID NO:14的成熟多肽或(ii)SEQID NO:14的氨基酸1-481具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％，但小于100％的序列一致性。

根据本发明，该变体是一种亲本α-淀粉酶的变体，该亲本α-淀粉酶与(i)SEQ IDNO:14的成熟多肽或(ii)SEQ ID NO:14的氨基酸4至481具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。

在一个实施例中，本发明的这些变体中的取代的总数是2-30个，例如，2-25或2-20或9-30个，如9-25，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个取代。

改进的稳定性和/或活度比

分别与SEQ ID NO:1或14的成熟多肽相比，本发明的变体具有改进的稳定性，具体地在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。

在具体的实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％，但小于100％的序列一致性，并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽相比，具有改进的稳定性，具体地在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。

另外的实施例提供了一种变体，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸1至483具有至少80％、如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％，但小于100％的序列一致性，并且与SEQ ID NO:1的氨基酸1至483相比，具有改进的稳定性，具体地在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。

其他实施例提供了一种变体，该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％，但小于100％的序列一致性，并且与SEQ ID NO:14的成熟多肽相比，具有改进的稳定性，具体地在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。

在甚至另外的实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸1至483具有至少80％，如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％，但小于100％的序列一致性，并且与SEQ ID NO:14的氨基酸1至481相比，具有改进的稳定性，具体地在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。

该变体的稳定性可以通过将残余活性计算为以下两者之间的比率来确定：所述变体用10％(w/w)葡萄糖在60℃下孵育6小时后所呈现的α-淀粉酶活性与所述变体用10％(w/w)葡萄糖在4℃下孵育6小时后所呈现的活性。

确定α-淀粉酶活性在技术人员能力范围之内，例如，通过使用本文所描述的使用Phadebas底物(例如来自麦戈尔生命科学(Magle Life Sciences)，隆德(Lund)，瑞典(Sweden))的方案来确定，使用本文材料和方法部分中所描述的方案。可以将类似的方案与来自麦格梅(Megazyme)公司，爱尔兰的Amylazym^TM底物一起使用。

根据一些实施例，本发明提供一种变体，其中所述变体的稳定性当被确定为以下两者：该变体用10％(w/w)葡萄糖在60℃下孵育6小时后所呈现的α-淀粉酶活性与该变体用10％(w/w)葡萄糖在4℃下孵育6小时后所呈现的活性之间的比率时，是至少35％，如至少36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％。分别与SEQ ID NO:1或14的成熟多肽相比，本发明的变体对长链底物比对短链底物具有相对更高的活性。

另外的取代

本发明的这些变体可以进一步包括一个或多个(例如，数个)额外变化，例如，一个或多个(例如，数个)额外取代。

另外的氨基酸改变可以具有次要性质，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸残基；至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原性表位或结合结构域。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及蛋氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样的性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的α-淀粉酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如德沃斯(deVos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；沃德弗(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟简讯(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴别必需氨基酸。

这些变体可以由300至500个，例如，350至495个、400至490个、450至485个氨基酸组成。

亲本α-淀粉酶

变体优选地是选自下组的亲本α-淀粉酶的变体，该组由以下各项组成：

(a)与(i)SEQ ID NO:1或2中的任何一个的成熟多肽，或(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483、SEQ ID NO:14的氨基酸1至481具有至少80％序列一致性的多肽；或

(b)SEQ ID NO:1或14中的任何一个的成熟多肽的片段，其具有α-淀粉酶活性。

在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与(i)SEQ ID NO:1或2中的任何一个的成熟多肽，或(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483或SEQ ID NO:14的氨基酸1至481具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。

在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO:1或14中的任何一个的成熟多肽或由其组成。

在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:1或14中的任何一个的成熟多肽的片段，其中该片段具有α-淀粉酶活性。

该亲本可以是杂合多肽，其中一个多肽的区域融合在另一多肽的区域的N末端或C末端。

例如，SEQ ID NO:14(LE399)中所示的亲本α-淀粉酶是杂合多肽，该杂合多肽之前已被披露于，例如，WO 2002/010355中。SEQ ID NO:14(Le399)包括来自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(SEQ ID NO:6)的氨基酸1-37和来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶(SEQ ID NO:1)的氨基酸40-483，其中具有以下取代G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N末端或C末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。

融合多肽可以在两种多肽之间进一步包括切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(Drug Discovery World)4:35-48。

该亲本可以从任何属类的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一方面，该亲本是胞外分泌的。

该亲本可以是细菌α-淀粉酶。例如，该亲本可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)α-淀粉酶，或者革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、或脲原体属(Ureaplasma)α-淀粉酶。

在一个方面中，该亲本是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌α-淀粉酶。

在一个优选的实施例中，该亲本是地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。

将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于直接地从自然生活环境分离微生物和DNA的技术是本领域中熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样本的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测了编码一种亲本的一种多核苷酸后，可以将多核苷酸通过利用本领域普通技术人员已知的技术来分离或克隆(参见例如萨姆布鲁克等人，1989，同上)。

变体的制备

本发明还涉及用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，该方法包括：

(a)向亲本α-淀粉酶中引入使用SEQ ID NO:1进行编号的一个或多个取代，或者组a)和b)中的对应的取代：

组a)K176、E185、I201、H205、K213、Q360、D416、R437；

组b)K136、K154、K170、K234、K237、K251、K315、K319、K392；并且

(b)回收该变体。

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。

通过使用涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究(Nucleic Acids Res.)18:7349-4966。

还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如美国专利申请公开号2004/0171154；斯托西(Storici)等人，2001，自然生物技术(Nature Biotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及卡利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学通讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。

在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种所感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。

可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。另外的启动子描述于“来自重组细菌的有用蛋白(Usefulproteins from recombinant bacteria)”，吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)，242:74-94；以及萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子是从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，同上，描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

酵母宿主细胞的适合的前导子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH2/GAP)。

该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。

丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。

该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。该多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，该编码序列的5’-末端可以包含对于该编码序列来说是外来的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增加变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，同上，描述了其他有用的信号肽编码序列。

该控制序列还可以是编码位于变体的N末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N末端。

还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。在原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他例子是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的可选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO 00/24883中的方法完成。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员而言是熟知的(参见，例如萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在重组产生一个变体中有用的任何细胞，例如一个原核细胞或一个真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括，但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括，但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟球菌属、假单胞菌属、沙门菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌的细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌的细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属的细胞，包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种的细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志(J.Bacteriol.)169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见，例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia Microbiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见，例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64：391-397)或接合(参见，例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71：51-57)。可以通过天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，卡特(Catt)和卓林克(Jollick)，1991，微生物(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学65:3800-3804)或者共轭(参见，例如，克利威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)实现DNA到链球菌细胞中的引入。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在将来可能有变化，出于本发明的目的，酵母应如酵母生物学和活动性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或亚罗酵母属细胞，例如乳酸克鲁弗酵母、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酶母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母、或亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞菌属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、白腐菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属的细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉菌、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023，约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474，和克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methodsin Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。生产方法

本发明还涉及产生一种变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养本发明的一种宿主细胞；并且(b)回收该变体。

使用本领域已知的方法在适合于产生该变体的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。

使用本领域已知的对这些变体特异的方法可以检测该变体。例如，可以使用酶测定来确定该变体的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。

可以通过本领域已知的多种程序来纯化该变体，以获得基本上纯的变体，这些程序包括，但不局限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、有差别的溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如蛋白纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。

在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的来源。

组合物

本发明还涉及包含一种α-淀粉酶变体以及至少一种额外酶的组合物。额外酶可选自下组，该组由以下各项组成：β-淀粉酶、纤维素酶(β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶以及内切葡聚糖酶)、葡糖淀粉酶、半纤维素酶(例如木聚糖酶)、异淀粉酶、异构酶、脂肪酶、植酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、和/或在商业过程中结合α-淀粉酶使用的其他酶。

额外酶还可以是第二α-淀粉酶。这类酶在淀粉处理、糖转化、醇以及其他有用最终产物的发酵、商业洗涤剂以及净化助剂、去污、织物处理或脱浆等等的领域中是已知的。

在一个实施例中，该另外的α-淀粉酶可以是另一种来源的α-淀粉酶。当本发明的α-淀粉酶变体是SEQ ID NO:1中所示的亲本α-淀粉酶(即，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶)时，该另外的α-淀粉酶可以是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，如WO 2002/010355中披露为SEQ ID NO:6的α-淀粉酶的成熟部分，或其变体。

当本发明的α-淀粉酶变体是SEQ ID NO:14中所示的亲本α-淀粉酶(即，SEQ IDNO:6中所示的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的杂合α-淀粉酶和SEQ ID NO:1中所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的变体或LE399)时，该另外的/第二α-淀粉酶可以是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，如WO 2002/010355中披露为SEQ ID NO:6的α-淀粉酶的成熟部分，或其变体。

用途

本发明的变体具有允许各种工业应用的有价值特性。α-淀粉酶变体可用于淀粉过程，尤其淀粉转化、特别是淀粉液化(参见例如，美国专利号3,912,590、EP 252730以及EP063909、WO 99/19467以及WO96/28567，这些专利全部通过引用结合在此)。还涵盖用于淀粉转化目的的组合物，除了本发明的变体以外，这些组合物还可包括葡糖淀粉酶、支链淀粉酶以及其他α-淀粉酶。

本发明的变体特别适用于从淀粉或全谷粒中生产糖(包括甜味剂和糖浆)以及乙醇(参见，例如，美国专利号5,231,017，该专利通过引用结合在此)，如燃料乙醇、饮用乙醇以及工业乙醇。

本发明的变体还可用于洗涤剂，尤其洗衣洗涤剂组合物以及餐具洗涤剂组合物、硬表面清洗组合物，以及用于使纺织品、织物或服装脱浆、生产纸浆以及纸张、啤酒制造、乙醇生产以及淀粉转化过程。

这些变体还可用于使纺织品、织物以及服装退浆(参见例如，WO95/21247、美国专利号4,643,736以及EP 119920，这些专利通过引用结合在此)、啤酒制造或酿造、以及纸浆和纸张生产或相关过程。

淀粉加工

天然淀粉由室温下不溶于水的微观颗粒组成。加热水性淀粉浆料时，颗粒膨胀并且最后破裂，将淀粉分子分散至溶液中。在此“糊化(gelatinization)”过程中，粘度有显著地增加。由于典型工业过程中的固体水平为30％-40％，因此不得不稀释或“液化”淀粉以使其能够被适当加工。在当前商业做法中，粘度的这种降低主要通过酶法降解来实现。

常规淀粉转化过程如液化以及糖化过程描述于包括美国专利号3,912,590、EP252730、EP 063909、和WO 2002/010355的大量的文献中，这些专利通过引用结合在此。

在实施例中，转化方法将淀粉降解为较低分子量的碳水化合物成分，如糖或脂肪替代物，该方法包括一个脱支步骤。

当将淀粉转化为糖时，淀粉被解聚。这类解聚过程由例如一个预处理步骤以及两个或三个连续过程步骤组成，即，液化过程、糖化过程并且取决于所需最终产物，任选的异构化过程。

当所需的最终糖产物是例如高果糖糖浆时，葡萄糖糖浆可被转化为果糖。在液化醪液的糖化后，使用例如一种固定化葡萄糖异构酶将葡萄糖糖浆转化成高果糖糖浆。

在一方面，本发明涉及生产糖的工艺，该工艺包括：

(a)用本发明的α-淀粉酶变体来液化一种含淀粉材料，以产生一种液化醪液；

(b)将该液化醪液糖化，以产生可发酵的糖。

任选地回收这些糖，和/或例如使用固定化葡萄糖异构酶进一步加工成，例如，高果糖糖浆，如以上所描述的。

工艺条件是本领域中技术人员所熟知的。在以下“含淀粉材料”部分中列出了多种适合的含淀粉的起始材料。在一个实施例中，该含淀粉材料是玉米或小麦。在以下“酶”部分中列出了多种所考虑的酶。在本发明α-淀粉酶变体或本发明组合物的存在下进行液化。

在液化步骤(a)期间的温度高于初始糊化温度，如从70-120℃，优选地80-100℃，特别是在80-90℃之间，如约85℃。在一个实施例中，在pH 4-6下进行步骤(a)，优选地4.2-5.5，如约4.5。在一个实施例中，步骤(a)中的液化进行0.1-12小时，如0.5-5小时。在一个实施例中，在步骤(b)或预糖化期间的温度是在30-70℃的范围内，如55-65℃，典型地约60℃。糖化步骤(b)典型地使用产碳水化合物源的酶，如葡糖淀粉酶，来完成。可以回收从糖化步骤(b)获得的糖，和/或可以例如使用固定化葡萄糖异构酶将其进一步加工成，例如，高果糖糖浆，如HFCS。

由含经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法

在这一方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物、尤其是乙醇的方法，这些方法包括：液化步骤，以及依序地或同时地进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物的方法，这些方法包括以下步骤：

(a)用本发明的α-淀粉酶变体来液化一种含淀粉材料，以产生一种液化醪液；

(b)将该液化醪液糖化，以产生可发酵的糖；并且

(c)使用发酵有机体对可发酵的糖进行发酵。

发酵产物，如尤其是乙醇，能可任选地在发酵之后，例如通过蒸馏来回收。在以下“含淀粉材料”部分中列出了多种适合的含淀粉的起始材料。在一个实施例中，该含淀粉材料是玉米或小麦。在以下“酶”部分中列出了多种所考虑的酶。在本发明α-淀粉酶变体或本发明组合物的存在下进行液化。

该发酵微生物优选地是酵母，优选酵母属菌株，尤其是酿酒酵母菌株。在以下“发酵有机体”部分中列出了多种适合的发酵有机体。在一个优选的实施例中，连续或同时进行步骤(b)和(c)(即，作为SSF工艺)。在一个具体的实施例中，在液化步骤i)之前，本发明的工艺进一步包括以下步骤：

x)优选地通过碾磨来减小含淀粉材料的粒度；

y)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。

该水性浆料可以包含含淀粉材料的从10-55wt.％干固体，优选25-45wt.％干固体，更优选30-40wt.％干固体。将该浆料加热至高于初始糊化温度。可以将本发明的α-淀粉酶变体，或本发明的组合物添加到该浆料中。在一个实施例中，在液化步骤(a)中经受本发明的α-淀粉酶变体之前，还将该浆料喷射蒸煮以进一步使该浆料糊化。

在液化步骤(a)期间的温度高于初始糊化温度，如从70-120℃，优选地80-100℃，特别是在80-90℃之间，如约85℃。

在一个实施例中，液化以一个三步热浆料工艺进行。该浆料被加热到介于60-95℃之间，优选地在80-90℃之间，如85℃左右，并且添加本发明的α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。然后，该浆料在介于95℃到140℃，优选地105℃到125℃之间的温度下进行喷射烹饪1-15分钟，优选地3-10分钟，尤其是约5分钟。该浆料被冷却到60-95℃，优选地80-90℃，并且再添加α-淀粉酶以结束水解(二次液化)。通常在pH 4-6下进行液化工艺，优选地4.2-5.5，如4.5左右。研磨并且液化的淀粉称为醪液(mash)。

可使用本领域熟知的条件来进行步骤(b)中的糖化。糖化典型地在从30℃-70℃、如55℃-65℃，典型地60℃左右的温度下，在4与5之间的pH下、一般在约pH 4.5下进行。

例如，全部糖化工艺可以持续长达从约24小时至约72小时。

在一个实施例中，在30-70℃之间的温度下，如55-65℃，典型地约60℃，在40-90分钟完成了预糖化步骤，随后在同时糖化发酵步骤(SSF)中的发酵过程中进行完全的糖化。

发酵产物生产，特别是乙醇生产中最广泛使用的方法为同时糖化和发酵(SSF)方法，其中没有糖化的保持阶段。SSF典型地可以在25℃和40℃之间的温度下，如在28℃和36℃之间，如在30℃和34℃之间，如约32℃下进行，特别然后发酵微生物是酵母，如酿酒酵母的菌株，并且该所希望的发酵产物是乙醇。

在实施例中，发酵进行6至120小时，尤其24至96小时。

其它发酵产物可以在本领域技术人员熟知的、适合于所讨论的发酵生物的条件和温度发酵。根据本发明，可以在发酵过程中向上或向下调节温度。

在一个实施例中，在发酵过程中添加蛋白酶。蛋白酶的实例可在以下的“蛋白酶”部分中找到。

含淀粉材料

根据本发明，可根据本发明使用任何合适的含淀粉起始材料。通常基于希望的发酵产物来选择起始材料。适合用于本发明的工艺中的含淀粉起始材料的实例包括整谷粒、玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁(milo)、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻米、豆类、菜豆和甘薯，或其混合物，或者谷类、或含糖原料，如糖蜜、果实材料、糖甘蔗或糖甜菜、马铃薯。考虑了糯与非糯类型的玉米与大麦两者。

该原材料(如整谷物)经过研磨以便展开结构并且允许进一步加工。根据本发明，以下两种研磨方法是优选的：湿式和干式研磨。在干式研磨中，整个谷粒被研磨并且使用。湿式研磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)良好分离，并且时常应用于使用淀粉水解产物生产糖浆的场所。干式和湿式研磨两者是本领域中众所周知的淀粉加工法并且同等地被涵盖用于本发明的方法。

发酵生物体

术语“发酵生物”是指适于生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，包括酵母和丝状真菌。尤其是合适的依照本发明的发酵生物能够将糖，如葡萄糖、果糖、麦芽糖，直接地或间接地发酵(即转变)成期望的发酵产物。发酵有机体的实例包括真菌有机体，例如酵母。优选的酵母包括酵母属(Saccharomyces)菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)的菌株。

在一个实施例中，将发酵有机体添加至发酵中，这样使得每mL的发酵培养基的活发酵有机体(例如酵母)计数在从10⁵至10¹²个的范围内，优选从10⁷至10¹⁰个，尤其是约5x10⁷。

可商购的酵母包括例如RED STAR^TM和ETHANOL RED酵母(可获得自富酶泰斯/乐斯富(Fermentis/Lesaffre)，美国)，FALI(可获得自弗莱施曼酵母(Fleischmann’s Yeast)，美国)，SUPERSTART和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可获得自乙醇技术(Ethanol Technology)，威斯康星州(WI)，美国)，BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物产品集团(NABC-NorthAmerican Bioproducts Corporation)，佐治亚州(GA)，美国)，GERT STRAND(可获得自格特·斯特兰德公司(Gert Strand AB)，瑞典)以及FERMIOL(可获得自帝斯曼食品配料部(DSM Specialties))。

发酵产物

术语“发酵产物”意思指在包括使用发酵有机体进行的发酵步骤在内的工艺生产的产物。根据本发明预期的发酵产物包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氛酸)；气体(例如，H₂和CO₂)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶类；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。

在一个优选的实施例中，该发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，(即，可饮用的中性含酒精饮料)，或工业乙醇。

用于水解淀粉的低温工艺

如显而易见的，在以上描述的传统葡萄糖加工中，使淀粉浆液经受初次液化和二次液化，包括调节pH和在pH 5.5，105℃下蒸汽喷射处理0.1小时，随后在95℃下处理1-2小时。这之后传统地是经30-60小时冷却至60℃并将pH调节至pH 4.0-4.5的步骤，用于分开的糖化步骤。因此，传统的方法需要分开的液化和糖化步骤，并且需要能源和化工成本。

此外，本发明还包括α-淀粉酶变体在淀粉水解工艺(包括针对单一低温工艺)中的用途，由于例如在较低的温度下使用较少的蒸汽并且使用较少的化学品调节pH以及其他益处，该方法可以降低能源和化学品成本。本发明的此类工艺消除了对在传统加工中所需的单独的初次和二次液化步骤以及单独的碳柱过滤的需求。

此类工艺还可以提供高程度的淀粉溶解作用，产生高纯度右旋糖糖浆，并且可以降低水解时间从而整体降低整个加工时间。另外的益处可以包括糖浆中的美拉德(Maillard)产物和蛋白质溶解作用降低。

这些工艺涉及在低于或恰好高于淀粉的初始糊化温度的温度(例如，60-70℃，如60-66℃)下对粗淀粉的活性，这特别适用于玉米淀粉。通过增加低温下淀粉溶解作用来显示出对粗淀粉的活性。

在一方面，预期一种用于产生可溶性淀粉水解物的一步工艺，该工艺包括使水性颗粒状淀粉浆液在低于或恰好高于所述颗粒状淀粉的初始糊化温度的温度下经受如在此描述的α-淀粉酶变体的作用。

在一个另外的方面，该工艺用于产生高果糖淀粉基糖浆(HFSS)，该工艺包括通过本发明的前述方面所述的工艺产生一种可溶性淀粉水解物，并且进一步包括将该可溶性淀粉水解物转化为高果糖淀粉基糖浆(HFSS)的步骤。在一些实施例中，可以在水解淀粉的同时产生右旋糖糖浆，即在单一步骤中或在与添加α-淀粉酶变体几乎同时的过程中。

在一个另外的方面，该工艺用于产生麦芽糖糖浆，该工艺包括通过本发明的前述方面所述的工艺产生一种可溶性淀粉水解物，并且进一步包括将该可溶性淀粉水解物转化为麦芽糖糖浆的步骤。在一些实施例中，可以在水解淀粉的同时产生麦芽糖糖浆，即在单一步骤中或在与添加α-淀粉酶变体几乎同时的过程中。

例如，麦芽糖糖浆可以通过在温度50℃-60℃和pH 5下使用产麦芽糖酶进行糖化而制备自5-20DE部分水解的淀粉底物。使用产麦芽糖酶(例如提取自发芽大麦的β-淀粉酶，或微生物β-淀粉酶或来源于米曲霉的真菌α淀粉酶)产生包含约40-55wt％麦芽糖的水解物。通过使用β-淀粉酶、产麦芽糖酶和脱支酶(例如支链淀粉酶)的组合进行糖化而产生较高水平的麦芽糖(即55-85wt％)。在一些实施例中，还产生了包含中间水平的麦芽糖和右旋糖的60-70DE的高转化糖浆。

有待经受本发明的方法的淀粉浆液可以具有20％-55％干固体颗粒状淀粉，优选25％-40％干固体颗粒状淀粉，更优选30％-35％干固体颗粒状淀粉。

经受此类工艺之后，颗粒状淀粉的干固体的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或优选99％被转化为可溶性淀粉水解物。

这些工艺在低于起始糊化温度的温度下进行。在这个实施例中，进行这些方法的温度是至少30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或优选至少60℃。

在低于或恰好高于淀粉的初始糊化温度的温度下进行这些方法。在一个具体实施例中，在约60-70℃，例如约60-66℃，并且特别是在约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃和/或约66℃的温度下进行该方法。这些温度范围是特别相关的，其中该淀粉是玉米淀粉。如所提及的，本领域技术人员应认识到不同淀粉将具有可以根据植物物种、植物物种的具体品种和/或根据生长条件而变化的初始糊化温度，并且可以相应地调节温度条件。

进行这些工艺的pH可以是在3.0至7.0，优选从3.5至6.0或更优选从4.0-5.0或优选从4.5-5.5的范围内，例如约4.5。

产生的可溶性淀粉水解物的准确组成取决于应用的酶的组合以及加工的颗粒状淀粉的类型。优选地，该可溶性水解物是纯度为至少85％、90％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％或99.5％的麦芽糖。甚至更优选地，该可溶性淀粉水解物是葡萄糖，并且最优选地，该淀粉水解物的DX(总溶解的干固体的葡萄糖百分比)为至少85％、90％、91.0％、91.5％、92.0％、92.5％、93.0％、93.5％、94.0％、94.5％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5、99.0％或99.5％。然而，同样考虑的是以下方法，其中本发明的方法的产物(可溶性淀粉水解物)是一种特制糖浆，例如包含葡萄糖、麦芽糖(DP2)、DP3和DPn的混合物以用于在制造冰淇淋、糕点、糖果、水果罐头中使用的特制糖浆。

啤酒制造

本发明的α-淀粉酶变体还可用于啤酒制造工艺以及类似发酵中。在醪液形成(mashing)工艺期间，典型地添加α-淀粉酶。该工艺大致上类似于如上所述的碾磨、液化、糖化以及发酵工艺。

纸浆以及纸张生产

本发明的α-淀粉酶变体还可用于从淀粉增强废纸以及纸板来生产木质纤维素材料如纸浆、纸张以及纸板，尤其当再浆化在高于7的pH下发生以及当淀粉酶经由增强淀粉的降解来促进废弃材料的分解时。α-淀粉酶变体尤其适用于从淀粉涂布的印刷纸来生产造纸纸浆的过程。该工艺可如WO 95/14807描述来执行，包括以下步骤：

a)使纸张分解以产生纸浆，

b)在步骤a)之前、期间或之后用淀粉降解酶进行处理，并且

c)在步骤a)和b)之后，从纸浆中分离油墨颗粒。

α-淀粉酶变体还可适用于对淀粉改性，其中酶改性的淀粉与碱性填充剂如碳酸钙、高岭土以及粘土一起用于造纸。通过使用α-淀粉酶变体，有可能在填充剂存在下将淀粉改性，从而允许一种更简单的整合过程。

纺织品、织物以及服饰的脱浆

本发明的α-淀粉酶变体在纺织品，织物或衣服脱浆中也非常有用。在纺织加工工业中，传统上使用α-淀粉酶作为脱浆过程中的助剂，以促进在织造过程中作为纬纱上的保护涂层的含淀粉胶料的去除。织造之后彻底去除胶料涂层对于确保后续过程(其中所述织物被擦洗、漂白和染色)中的最佳效果是至关重要的。酶法淀粉分解是优选的，因为它不对纤维材料产生任何有害的作用。为了减少加工成本并增加研磨机处理量，有时将脱浆过程与擦洗和漂白步骤结合。在这类情况下，非酶助剂如碱或氧化剂典型用于分解淀粉，因为传统α-淀粉酶并不与高pH水平以及漂白剂非常相容。由于使用具有相当腐蚀性的化学品，因此淀粉胶料的非酶分解导致一些纤维损伤。在使含纤维素的织物或纺织品脱浆时，α-淀粉酶变体可单独或与纤维素酶组合使用。

脱浆以及漂白过程在本领域中是熟知的。例如，这类工艺描述于例如WO 95/21247、美国专利号4,643,736、EP 119920中，这些文献通过引用结合在此。

清洁过程和洗涤剂组合物

本发明的α-淀粉酶变体可作为用于各种清洗或洗涤过程，包括洗衣以及餐具洗涤的洗涤剂组合物的组分来添加。例如，这些变体可用于WO 96/23874以及WO 97/07202中描述的洗涤剂组合物中。

α-淀粉酶变体可以常规使用的浓度来并入洗涤剂中。例如，本发明的变体可使用常规计量水平的洗涤剂以对应于0.00001-10mg(以纯的、活性酶类蛋白质来计算)α-淀粉酶/升洗涤液/餐具洗涤液的量来并入。

该洗涤剂组合物可以例如配制成手洗或机洗洗衣添加剂组合物，其中包括适用于污染织物的预处理的洗衣添加剂组合物以及加入了漂洗剂的织物软化剂组合物，或配制成用于在一般家用硬表面清洁操作中使用的洗涤剂组合物，或配制成用于手洗或机洗餐具洗涤操作的洗涤剂组合物。

洗涤剂组合物可进一步包括一种或多种其他酶，如脂肪酶、过氧化物酶、蛋白酶、另一种淀粉水解酶，例如另一种α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、CGT酶、纤维素酶、甘露聚糖酶(如Mannaway^TM，来自诺维信公司(Novozymes)，丹麦(Denmark))、果胶酶、果胶裂合酶、果胶酸裂解酶(如XPect^TM，来自诺维信公司，丹麦)、角质酶和/或漆酶。

一般而言，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。

该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。可配制一种洗涤剂添加剂，例如独立添加剂或组合添加剂，例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂剂型是颗粒，具体为非粉化性(non-dusting)颗粒，液体，具体为稳定的液体，或浆液。

可以产生非粉尘颗粒，如美国专利号4,106,991以及4,661,452中所披露，并且这些颗粒可任选地通过在本领域中已知的方法来涂布。蜡样涂布材料的例子有平均分子量1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；其中的醇具有从12至20个碳原子且其中有15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制品可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238216中披露的方法来制备。

洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如棒状、片状、粉末、颗粒、糊或液体。液体洗涤剂可以是水性的，典型地含有多达约70％的水和0％至约30％的有机溶剂，或者是非水性的。

所述洗涤剂组合物包括一种或多种表面活性剂，表面活性剂可以是非离子型(包括半极性)和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型。这些表面活性剂典型地以按重量计0.1％到60％的水平存在。

当包含在其中时，洗涤剂通常将含有约1％至约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或肥皂。

当包含在所述洗涤剂中时，洗涤剂通常包含从约0.2％到约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

所述洗涤剂可以包含0％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐、或层状硅酸盐(例如购自赫司特公司(Hoechst)的SKS-6)。

洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可以包含漂白系统，其可以包含H₂O₂源，如过硼酸或过碳酸，其可以与形成过酸的漂白活化剂(如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐)组合。可替代地，漂白体系可以包括例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。

洗涤剂组合物中的一种或多种酶可以使用常规稳定剂进行稳定：例如，多元醇如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物如芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，并且该组合物可以按例如WO 92/19708和WO 92/19709中所述进行配制。

该洗涤剂还可以包含其他的常规洗涤剂成分，像例如织物调理剂，这些织物调理剂包括粘土、泡沫促进剂、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污物再沉淀剂、染料、杀菌剂、光学增亮剂、水溶助长剂、晦暗抑制剂、或香料。

洗涤剂组合物可包含对应于0.01-100mg酶类蛋白质每升洗涤液、优选地0.055mg酶类蛋白质每升洗涤液、尤其0.1-1mg酶类蛋白质每升洗涤液的量的任何酶。

另外，可以将在此描述的一种或多种变体酶掺入WO 97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，该文献在此引入作为参考。

本发明的实施例

1.一种亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体包括使用SEQ ID NO:1进行编号的一个或多个取代，或者组a)和b)中的对应的取代：

组a)K176、E185、I201、H205、K213、Q360、D416、R437；

组b)另外的赖氨酸残基至非天然氨基酸的取代；

其中该变体与以下各项具有至少80％，但小于100％序列一致性：

(i)SEQ ID NO:1或14中的任何一个的成熟多肽，或

(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483或SEQ ID NO:14的氨基酸1至481；

并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

2.一种亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体包括使用SEQ ID NO:1进行编号的一个或多个取代，或者组a)和b)中的对应的取代：

组a)K176、E185、I201、H205、K213、Q360、D416、R437；

组b)K136、K154、K170、K234、K237、K251、K306、K315、K319、K392；其中该变体与以下各项具有至少80％，但少于100％的序列一致性：

(ii)SEQ ID NO:1或14中的任何一个的成熟多肽，或

SEQ ID NO:1的氨基酸1至483或SEQ ID NO:14的氨基酸1至481；并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

3.如实施例1或2所述的变体，该变体是一种分离的α-淀粉酶变体。

4.如以上实施例中任一项所述的变体，其中该变体包括或具有以下取代或对应的组a)和组b)取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；或

K176L+I201Y+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W

和

组b)中以下取代中的一个或多个：

K136、K154、K170、K234、K237、K251、K306、K315、K319、K392(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

5.如实施例4所述的变体，其中该组b)取代是K136R(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

6.如实施例4所述的变体，其中该组b)取代是K154A、H、S(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

7.如实施例4所述的变体，其中该组b)取代是K170R、S(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

8.如实施例4所述的变体，其中该组b)取代是K234T(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

9.如实施例4所述的变体，其中该组b)取代是K237R(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

10.如实施例4所述的变体，其中该组b)取代是K306M或K251Q(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

11.如实施例4所述的变体，其中该组b)取代是K315A、N、C、Q、E、G、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y、V(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

12.如实施例4所述的变体，其中该组b)取代是K319Q、L(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

13.如以上实施例中任一项所述的变体，其中该组b)取代选自下组，该组由以下各项组成：

·K136R；

·K154A；

·K154H；

·K154S；

·K170R；

·K170S；

·K234T；

·K237R；

·K251Q；

·K306M

·K315M；

·K319Q；

·K319L；

·K392V；

·K392V+Q393D；和

·H133Y+K136R(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

14.如以上实施例中任一项所述的变体，其中该变体进一步包括以下位置中任一个处的取代：H68、H133、H142、Y156、Y158、H316、L318；优选H68W、H133Y、H142Y、Y156W、Y158W、H316W、L318W；这些取代使用SEQ ID NO:1进行编号。

15.如以上实施例中任一项所述的变体，其中该变体与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽或(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％，但小于100％的序列一致性。

16.如以上实施例中任一项所述的变体，该变体是一种亲本α-淀粉酶的变体，该亲本α-淀粉酶与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽或(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。

17.如实施例1-3中任一项所述的变体，其中该变体包括或具有以下取代或对应的组a)和组b)取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211+Q358S+D414V+R435W；或

K174L+F199Y+H203Y+K211T+E253P+Q358S+D414V+R435W

和

组b)中以下取代中的一个或多个：

K134、K152、K168、K232、K235、K249、K304M、K313、K317、K390(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

18.如实施例17所述的变体，其中该组b)取代是K134R(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

19.如实施例17所述的变体，其中该组b)取代是K152A、H、S(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

20.如实施例17所述的变体，其中该组b)取代是K168R、S(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

21.如实施例17所述的变体，其中该组b)取代是K232T(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

22.如实施例17所述的变体，其中该组b)取代是K235R(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

23.如实施例17所述的变体，其中该组b)取代是K249Q(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

24.如实施例17所述的变体，其中该组b)取代是K313A、N、C、Q、E、G、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y、V(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

25.如实施例17所述的变体，其中该组b)取代是K317Q、L(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

26.如实施例17所述的变体，其中该组b)取代是K390V(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

27.如实施例17-26中任一项所述的变体，其中该组b)取代选自下组，该组由以下各项组成：

·K134R；

·K152A；

·K152H；

·K152S；

·K168R；

·K168S；

·K232T；

·K235R；

·K249Q；

·K304M

·K313M；

·K317Q；

·K317L；

·K390V；

·K390V+Q391D；

·H131Y+K134R(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

28.如实施例17-27中任一项所述的变体，该变体进一步包括以下位置中任一个处的取代：H66、H131、H140、Y154、Y156、H314、L316；优选以下取代中的一种或多种：H66W、H131Y、H140Y、Y154W、Y156W、H314W、L316W；这些取代使用SEQ ID NO:14进行编号。

29.如实施例1、2、和17-28中任一项所述的变体，其中该变体与(i)SEQ ID NO:14的成熟多肽或(ii)SEQ ID NO:14的氨基酸14-481具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％，但小于100％的序列一致性。

30.如实施例1、2、和17-28中任一项所述的变体，该变体是一种亲本α-淀粉酶的变体，该亲本α-淀粉酶与(i)SEQ ID NO:14的成熟多肽或(ii)SEQ ID NO:14的氨基酸1至481具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。

31.如以上实施例中任一项所述的变体，其中该亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:1或14的成熟多肽的片段，其中该片段具有α-淀粉酶活性。

32.如以上实施例中任一项所述的变体，分别与SEQ ID NO:1或14的成熟多肽相比，该变体具有改进的稳定性，具体地在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。

33.如以上实施例中任一项所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％，但少于100％序列一致性，并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽相比，具有改进的稳定性，特别是在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。

34.如以上实施例中任一项所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸1至483具有至少80％，但少于100％序列一致性，并且与SEQ ID NO:1的氨基酸1至483相比，具有改进的稳定性，特别是在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。

35.如以上实施例中任一项所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％，但少于100％序列一致性，并且与SEQ ID NO:14的成熟多肽相比，具有改进的稳定性，特别是在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。

36.如以上实施例中任一项所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸1至483具有至少80％，但少于100％序列一致性，并且与SEQ ID NO:14的氨基酸1至481相比，具有改进的稳定性，特别是在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。

37.如以上实施例中任一项所述的变体，其中该稳定性是通过将残余活性计算为所述变体用10％(w/w)葡萄糖在60℃下孵育6小时后所呈现的α-淀粉酶活性与所述变体用10％(w/w)葡萄糖在4℃下孵育6小时后所呈现的活性两者之间的比率来确定的。

38.如以上实施例中任一项所述的变体，其中当被确定为所述变体用10％(w/w)葡萄糖在60℃下孵育6小时后所呈现的α-淀粉酶活性与所述变体用10％(w/w)葡萄糖在4℃下孵育6小时后所呈现的活性两者之间的比率时，所述变体的稳定性是至少35％，如至少36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％。

39.如以上实施例中任一项所述的变体，分别与SEQ ID NO:1或14的成熟多肽相比，该变体对长链底物比对短链底物具有相对更高的活性。

40.一种编码如实施例1-39中任一项所述的变体的分离的多核苷酸。

41.一种包含如实施例40所述的多核苷酸的核酸构建体。

42.一种包括如实施例40所述的多核苷酸或如实施例41所述的构建体的表达载体。

43.一种包含如实施例42所述的多核苷酸的宿主细胞。

44.一种生产α-淀粉酶变体的方法，该方法包括：

a.在适合于表达该变体的条件下培养如实施例43所述的宿主细胞；并且

b.回收该变体。

45.一种用于获得α-淀粉酶变体的方法，该方法包括(a)向亲本α-淀粉酶中引入如实施例1-39中任一项所定义的取代；并且(b)回收该变体。

46.一种包含如实施例1至39中任一项所述的变体以及一种或多种选自下组的酶的组合物，该组由以下各项组成：β-淀粉酶、纤维素酶(β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶以及内切葡聚糖酶)、葡糖淀粉酶、半纤维素酶(例如，木聚糖酶)、异淀粉酶、异构酶、脂肪酶、植酸酶、蛋白酶以及支链淀粉酶。

47.一种生产液化淀粉的工艺，该工艺包括用如实施例1至39中任一项所述的变体或如实施例46所述的组合物来液化一种含淀粉材料。

48.一种生产发酵产物的方法，该方法包括

(a)用如实施例1至39中任一项所述的变体来液化一种含淀粉材料，以产生一种液化醪液；

(b)将该液化醪液糖化，以产生可发酵的糖；并且

(c)使这些可发酵的糖在一种发酵生物存在下发酵。

49.如实施例48所述的工艺，其中在步骤(a)中的液化期间温度高于初始糊化温度，如在80℃-90℃之间，例如约85℃。

50.如实施例47-49中任一项所述的工艺，其中在pH 4-6下进行步骤(a)，优选4.2-5.5，例如约4.5。

51.如实施例47-50中任一项所述的工艺，其中步骤(a)中的液化进行0.1-12小时，如0.5-5小时。

52.如实施例47-51中任一项所述的工艺，其中在步骤(b)或预糖化期间的温度在30-70℃的范围内，例如55-65℃，典型地约60℃。

53.如实施例47-52中任一项所述的工艺，其中使用一种产碳水化合物源的酶，如葡糖淀粉酶，来完成步骤(b)中的糖化或同时糖化发酵。

54.如实施例47-53中任一项所述的工艺，其中步骤(b)中的糖化和步骤(c)中的发酵顺序完成或同时完成。

55.如实施例47-54中任一项所述的工艺，其中步骤(c)或同时步骤(b)和(c)期间的温度是从25℃至40℃，例如从28℃至35℃，例如从30℃至34℃，优选约32℃。

56.如实施例47-55中任一项所述的工艺，其中发酵是步骤(c)，或者使用酵母，如酵母菌属，如特别是酿酒酵母完成同时步骤(b)和(c)。

57.如实施例47所述的工艺，其中在步骤(a)中的液化期间的温度处于低于或略高于所述颗粒状淀粉的初始糊化温度的温度，如至少58℃，如约60℃-70℃。

58.如实施例47-57中任一项所述的工艺，其中该pH是在3.0至7.0，优选从3.5至6.0，优选从4.0-5.0，优选4.5-5.5的范围内，更优选4.5。

59.一种生产糖的工艺，该工艺包括：

(a)用如实施例1至33中任一项所述的α-淀粉酶变体来液化一种含淀粉材料，以产生一种液化醪液；

(b)将该液化醪液糖化，以产生可发酵的糖。

60.如实施例59所述的工艺，其中在步骤(a)期间的温度高于初始糊化温度，如在80℃-90℃之间，例如约85℃。

61.如实施例59或60所述的工艺，其中在pH 4-6下进行步骤(a)，例如pH 4.5-5.5，例如pH 4-5。

62.如实施例59-61中任一项所述的工艺，其中步骤(a)中的液化进行0.1-12小时，例如0.5-5小时。

63.如实施例59-62中任一项所述的工艺，其中在步骤(b)或预糖化期间的温度是在30℃-70℃之间的范围内，例如55℃-65℃，典型地约60℃。

64.如实施例59-63中任一项所述的工艺，其中使用一种产碳水化合物源的酶，如葡糖淀粉酶，来完成步骤(b)中的糖化或同时糖化发酵。

65.如实施例59-64中任一项所述的工艺，其中在糖化步骤(b)后回收糖。

66.如实施例59-65中任一项所述的工艺，其中将步骤(b)中所获得的糖例如使用固定的葡糖异构酶进一步加工为，例如，高果糖糖浆。

67.如实施例59所述的工艺，其中在步骤(a)中的液化期间的温度处于低于或略高于所述颗粒状淀粉的初始糊化温度的温度，例如至少58℃，例如约60℃-70℃。

68.如实施例59-67中任一项所述的工艺，其中该pH是在3.0至7.0，优选从3.5至6.0，优选从4.0-5.0，优选4.5-5.5的范围内，更优选4.5。

69.如实施例1-39中任一项所述的变体用于洗涤和/或餐具洗涤的用途。

70.如实施例1-39中任一项所述的变体用于使纺织品退浆的用途。

71.如实施例1-39中任一项所述的变体用于产生烘焙产品的用途。

72.如实施例1-39中任一项所述的变体用于液化一种含淀粉材料的用途。

73.如实施例1-39中任一项所述的变体在生产糖浆的过程中用于液化一种含淀粉材料的用途。

74.如实施例1-39中任一项所述的变体在生产发酵产物如乙醇的过程中用于液化一种含淀粉材料的用途。

酶

产碳水化合物源的酶

术语“产碳水化合物源的酶”包括葡糖淀粉酶(为葡萄糖生产者)、β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(为麦芽糖生产者)。产碳水化合物源的酶能够产生可以被讨论中的一种或多种发酵生物用作能源的碳水化合物，例如，当在用于生产发酵产物(例如乙醇)的本发明的方法中使用时。产生的碳水化合物可以被直接或间接地转化为所希望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可以使用产碳水化合物源的酶的混合物。特别预期的混合物是至少葡糖淀粉酶以及α-淀粉酶的混合物，尤其是酸性淀粉酶，甚至更优选的是酸性真菌α-淀粉酶。在本发明的一个实施例中，酸性真菌α-淀粉酶活性(AFAU)与葡糖淀粉酶活性(AGU)的比例(AFAU比AGU)可以为至少0.1，或至少0.16，如在0.12-0.50或更多的范围内。

在本发明的一个实施例中，酸性真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)和葡糖淀粉酶活性(AGU)间的比例(即，FAU-F比AGU)可以在0.1到100之间，特别是2到50之间，如10-40的范围内。

葡糖淀粉酶

根据本发明所使用的葡糖淀粉酶可以来源于任何适合的来源，例如来源于微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌起源的，选自下组，该组由以下各项组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(博埃尔(Boel)等人，1984，欧洲分子生物学学会杂志3(5):1097-1102)，或其变体，例如披露于WO 92/00381、WO00/04136和WO 01/04273中的那些(来自诺维信，丹麦)；披露于WO84/02921中的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(农业、生物学与化学(Agric.Biol.Chem.)，1991，55(4):941-949)，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(陈(Chen)等人，1996，蛋白质工程(Prot.Eng.)9:499-505)；D257E和D293E/Q(陈等人，1995，蛋白质工程8:575-582)；N182(陈等人，1994，生物化学杂志(Biochem.J.)301:275-281)；二硫键，A246C(费艾洛伯(Fierobe)等人，1996，生物化学(Biochemistry)35:8698-8704)；以及在位置A435和S436中引入Pro残基(李(Li)等人，1997，蛋白质工程(Protein Eng.)10:1199-1204)。

其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(以前命名为罗尔伏革菌)葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和长坂(Nagasaka)等人，1998，“来自罗尔伏革菌的生淀粉降解葡糖淀粉酶的纯化和特性”(“Purification and properties of the raw-starch-degradingglucoamylases from Corticium rolfsii”)应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)50:323-330)，篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森篮状菌(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利登记号32,153)、和Talaromyces duponti、以及嗜热篮状菌(美国专利号4,587,215)。

考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭状芽孢杆菌属，具体地是嗜热解淀粉梭状芽孢杆菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和嗜热硫化氢梭状芽孢杆菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。

考虑到的真菌葡糖淀粉酶包括瓣环栓菌(Trametes cingulata)，纸质厚孢孔菌(Pachykytospora papyracea)以及大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)，全部披露于WO2006/069289中；和披露于WO2007/124285中的红边隔孢伏革菌(Peniophorarufomarginata)；或其混合物。根据本发明，还考虑了杂合葡糖淀粉酶。实例包括披露于WO2005/045018中的杂合体葡糖淀粉酶。具体实例包括披露于实例1的表1和4中的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用而特此结合)。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶来源于密孔菌属的菌株，具体地如WO 2011/066576中所描述的密孔菌属菌株(SEQ ID NO 2、4或6)；或来源于褐褶茵属的菌株，具体地如WO 2011/068803中所描述的褐褶茵属的菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)或黑层孔属的菌株，具体地如WO 2012/064351中所披露的黑层孔属的菌株(SEQ ID NO:2)(所有参考文献通过引用并入本文)。还考虑了以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶展现与上述葡糖淀粉酶的任一种的高一致性，即，与上述酶序列的成熟部分中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、例如100％的一致性。

可商购的包括葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SAN^TMSUPER，SAN^TMEXTRA L，SPIRIZYME^TMPLUS，SPIRIZYME^TMFUEL，SPIRIZYME^TMB4U，SPIRIZYME ULTRA^TM和AMG^TME(来自诺维信公司，丹麦)；OPTIDEX^TM300，GC480^TM和GC147^TM(来自杰能科国际公司(Genencor Int.)，美国)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TMPLUS(来自DSM)；G-ZYME^TMG900，G-ZYME^TM和G990ZR(来自杰能科国际公司)。

在一个实施例中，葡糖淀粉酶以0.02-20AGU/g DS，优选0.1-10AGU/g DS，特别是在1-5AGU/g DS之间，如0.1-2AGU/g DS、0.5AGU/gDS的量或以0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，特别是在0.01-5AGU/g DS，如0.1-2AGU/g DS的量添加。

β-淀粉酶

至少根据本发明，β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)是传统地给予外切作用的麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中的1,4-α-糖苷键水解。麦芽糖单位以逐步方式依次从非还原链末端去除，直到该分子被降解，或在支链淀粉的情况下，直到到达分支点。释放的麦芽糖具有β端基异构构型，因此名称为β-淀粉酶。

β-淀粉酶已经从多种植物和微生物中分离((W.M.福格蒂((W.M.Fogarty)和C.T.凯利(C.T.Kelly)，1979，工业微生物学进展(Progress in Industrial Microbiology)15:112-115)。这些β-淀粉酶表征为具有从40℃至65℃范围内的最适温度并且具有从4.5至7范围内的最适pH。来自大麦的可商购β-淀粉酶是来自丹麦的诺维信公司的NOVOZYM^TMWBA和来自美国的杰能科国际公司SPEZYME^TMBBA 1500。

麦芽糖淀粉酶

淀粉酶也可以是产麦芽糖α-淀粉酶。一种“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成处于α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的麦芽糖淀粉酶可商购自诺维信公司。麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048、4,604,355和6,162,628中，将其通过引用而结合在此。

在一个优选实施例中，该产麦芽糖淀粉酶可以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加。

蛋白酶

根据本发明所使用的蛋白酶可以是任何蛋白酶，如微生物或植物来源的。在一个优选的实施例中，该蛋白酶是微生物源的，优选真菌或细菌源的酸性蛋白酶。

适合的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即由在低于pH 7的酸性条件下水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。

考虑到的酸性真菌蛋白酶包括来源于曲霉属，毛霉属、根霉属、假丝酵母属、革盖菌属、内座壳属、虫霉属、耙齿菌属、青霉属、丝核菌属和球拟酵母属的真菌蛋白酶。特别考虑到的是源自黑曲霉(参见，例如，快禅(Koaze)等人，1964，日本农业、生物学与化学(Agr.Biol.Chem.Japan)，28，216)，斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如，吉田(Yoshida)，1954，日本农业、化学与社会学杂志(J.Agr.Chem.Soc.Japan)，28，66)，泡盛曲霉(林田(Hayashida)等人，1977，生物学与化学(Agric.Biol.Chem.)，42(5):927-933)，棘孢曲霉(WO95/02044)或米曲霉的蛋白酶，如pepA蛋白酶，以及来自微小毛霉(Mucorpusillus)和米黑毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。

还考虑到中性或碱性蛋白酶，如源自芽孢杆菌属的菌株的蛋白酶。打算用于本发明的具体蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌并且具有作为登录号P06832可在Swissprot获得的序列。

还考虑到与作为登录号P06832可在Swissprot获得的氨基酸序列具有至少90％一致性，如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或具体地址至少99％一致性。

进一步考虑的是与WO 2003/048353中作为SEQ.ID.No：1公开的氨基酸序列具有至少90％一致性，如至92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或特别至少99％的同一性的蛋白酶。

还涵盖木瓜蛋白酶样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)内的蛋白酶，如EC3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC3.4.22.7(萝蘼蛋白酶(asclepain))、EC3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。

在一个实施例中，该蛋白酶为来源于曲霉属，如米曲霉菌株的蛋白酶制品。在另一个实施例中，该蛋白酶来源于根毛霉属，优选是米黑根毛霉的菌株。在另一个考虑的实施例中，该蛋白酶是蛋白酶制品，优选是来源于曲霉属的菌株(如米曲霉)的蛋白质分解制品和来源于根毛霉属的菌株(优选米黑根毛霉)的蛋白酶的混合物。

天冬氨酸蛋白酶描述于例如蛋白水解酶手册(Handbook of ProteolyticEnzymes)中，由巴雷特(Barrett)、罗林斯(Rawlings)和沃森纳(Woessner)编辑，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥，1998，第270章。天冬氨酸蛋白酶的适合的实例包括例如披露于以下各项中的那些：贝尔卡(Berka)等人，1990，基因96:313；贝尔卡等人，1993，基因125:195-198；和戈米(Gomi)等人，1993，生物科学、生物科技与生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)57:1095-1100，将其通过引用而结合在此。

可商购产品包括ESPERASE^TM、FLAVOURZYME^TM、PROMIX^TM、NOVOZYM^TMFM 2.0L及NOVOZYM^TM50006(可获得自诺维信公司，丹麦)以及来自美国的杰能科国际公司(Genencor Int.,Inc.)的GC106^TM和SPEZYME^TMFAN。

该蛋白酶能以0.0001-1mg酶蛋白/g DS，优选0.001至0.1mg酶蛋白/g DS的量存在。可替代地，该蛋白酶可以0.0001到1LAPU/g DS，优选0.001到0.1LAPU/g DS和/或0.0001到1mAU-RH/g Ds，优选地0.001到0.1mAU-RH/g DS或0.1-1000AU/kg DS，优选地1-100AU/kgDs和最优选地5-25AU/kg DS的量存在。

材料和方法

测量淀粉分解活性(α-淀粉酶活性)的测定

PNP-G7测定：

α-淀粉酶活性通过使用PNP-G7底物的方法来确定。PNP-G7是4,6-亚乙基(G₇)-对硝基苯基(G₁)-α,D-麦芽庚糖苷的缩写，为一种可以由内切淀粉酶如α-淀粉酶裂解的嵌段寡糖。裂解之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶进一步消化水解底物以释放游离PNP分子，该分子具有黄颜色并且因而可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)处测量。含有PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏/日立公司(Roche/Hitachi)制造(目录号11876473)。

试剂：

来自此试剂盒的G7-PNP底物含有22mM 4,6-亚乙基-G7-PNP以及52.4mM HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH 7.0。

α-葡糖苷酶试剂含有52.4mM HEPES、87mM NaCl、12.6mM MgCl₂、0.075mM CaCl₂、>4kU/L的α-葡糖苷酶。

通过将1mlα-葡糖苷酶试剂与0.2ml G7-PNP底物混合来制成底物工作溶液。此底物工作溶液在使用之前立即制成。

稀释缓冲液：50mM EPPS、0.01％(w/v)Triton X100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C₁₄H₂₂O(C₂H₄O)_n(n＝9-10)))、1mM CaCl₂，pH 7.0。

程序：

将有待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的pH是7。将20μl稀释酶样品转移至96孔微量滴定板并且添加80μl底物工作溶液来进行测定。将溶液混合并且在室温预孵育1分钟并且在OD 405nm下在5分钟内每20秒测量吸收。

在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比例。淀粉酶样品应稀释至其中斜率低于0.4吸光度单位/分钟的水平。

Phadebas活性测定：

α-淀粉酶活性还可通过使用Phadebas底物(例如来自麦戈尔生命科学(MagleLife Sciences)，隆德(Lund)，瑞典(Sweden))的方法来确定。Phadebas片剂包括互联淀粉聚合物，这些聚合物呈不溶于水的球状微球形式。将一种蓝色染料共价结合至这些微球。微球中的互联淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可通过在620nm下测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。

将有待分析的淀粉酶样品稀释于具有所需pH的稀释缓冲液中。将一个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并且在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴定板(MTP)或PCR-MTP。将30μl稀释淀粉酶样品添加至150μl底物并且混合。在37℃下孵育15分钟。通过添加30μl 1M NaOH并且混合来停止反应。在4000xg下离心MTP 5分钟。将100μl转移至新MTP并且测量620nm下的吸光度。

淀粉酶样品应稀释以使得620nm下的吸光度在0与2.2之间。

可以将类似的方法与来自Megazyme公司，爱尔兰的Amylazym^TM底物一起使用。

测定：

为了确定残余淀粉酶活性，使用Ultra淀粉酶测定试剂盒(E33651，英杰公司(Invitrogen)，拉霍亚(La Jolla)，加州(CA)，美国(USA))。

底物是玉米淀粉衍生物，DQ^TM淀粉，它是用FL染料标记以使得荧光被淬灭的玉米淀粉。含有大约1mg冻干底物的一个小瓶溶解于100微升50mM乙酸钠(pH 4.0)中。将小瓶涡旋20秒并且在室温下、黑暗中保持，并偶尔混合直到溶解为止。然后添加900微升100mM乙酸盐、0.01％(w/v)X100、0.125mM CaCl₂，pH 5.5，充分涡旋并且在室温下、黑暗中储存直到准备使用为止。通过以10倍稀释于残余活性缓冲液(100mM乙酸盐、0.01％(w/v)X100、0.125mM CaCl₂，pH 5.5)中来制备储备底物工作溶液。孵育之后立即将酶在100mM乙酸盐、0.01％(W/v)X100、0.125mM CaCl₂，pH 5.5中稀释至10-20ng酶蛋白/ml的浓度。

为了测定，在黑色384孔微量滴定板中，将25微升底物工作溶液与25微升稀释酶混合10秒。在每个孔中在25℃于15分钟内每分钟测量荧光强度(激发：485nm，发射：555nm)并且将V_max计算作为荧光强度相对于时间的曲线的斜率。曲线应是线性的，并且调整了残余活性测定以使得稀释的参照酶溶液在活性测定的线性范围内。

葡糖淀粉酶活性(AGU)

可以按葡糖淀粉酶单位(AGU)来测量葡糖淀粉酶活性。

Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量：37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。

可以使用自动分析仪系统。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，这样使得存在的任何α-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在以上提到的反应中与β-D-葡萄糖特异性反应，形成NADH，在340nm下使用光度计测定该NADH作为原始葡萄糖浓度的量度。

AMG孵育：
		底物：	麦芽糖23.2mM
缓冲液：	乙酸盐0.1M
		pH:	4.30±0.05
孵育温度：	37℃±1
		反应时间：	5分钟
酶工作范围：	0.5-4.0AGU/mL

颜色反应：
		GlucDH:	430U/L
变旋酶：	9U/L
		NAD:	0.21mM
缓冲液：	磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
		pH：	7.60±0.05
孵育温度：	37℃±1
		反应时间：	5分钟
波长：	340nm

β-淀粉酶活性(BAMU)

相对于诺维信β-淀粉酶标准品测量BAMU中的β-淀粉酶活性。β-淀粉酶作用于麦芽六糖(G6)的非还原端以形成麦芽糖(G2)和麦芽四糖(G4)。产生的G4在乳糖氧化酶和O2的存在下比G6反应强烈以形成H2O2。形成的H2O2在过氧化物酶的存在下激活4-氨基安替比林(AA)和N-乙基-N-磺丙基-间甲苯胺(TOPS)的氧化缩合，以形成可以在540nm下定量其吸光度的紫色产物。

α-淀粉酶活性(KNU)

可釆用马铃薯淀粉作为底物来测定α-淀粉酶活性。此方法是基于由酶分解改性的马铃薯淀粉，并且该反应随后是将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合。最初形成微黑蓝色，但淀粉分解过程中蓝色变弱并且逐渐变为红褐色，将其与有色玻璃标准品比较。

将一个Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；和pH 5.6下)糊精化5260mg淀粉干物质Merck可溶性淀粉(Merck Amylumsolubile)的酶量。

FAU活性的测定

1真菌α-淀粉酶单位(FAU)定义为基于下列标准条件下每小时分解5.26g淀粉(MerckAmylum的可溶性Erg.B.6，批号9947275)所需要的酶的量：

酸性α-淀粉酶活性(AFAU)的确定

以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，相对于酶标准品而确定AFAU。

使用的标准品是AMG 300L(来自诺维信公司，葡糖淀粉酶野生型黑曲霉G1，还披露于博埃尔(Boel)等人(1984)，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)3(5)，第1097-1102页和WO 92/00381中)。在室温下存储3周后，此AMG中的中性α-淀粉酶从大约1FAU/mL降至低于0.05FAU/mL。

根据以下描述确定此AMG标准品中的酸性α-淀粉酶活性。在此方法中，1AFAU被定义为在标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。

碘与淀粉形成蓝色复合物，但不与其降解产物形成蓝色复合物。颜色的强度因此与淀粉的浓度成正比。使用反向比色法在指定分析条件下确定淀粉酶活性为淀粉浓度的减少。

α-淀粉酶

淀粉+碘→糊精+寡糖

40℃，pH 2.5

蓝色/紫色 t＝23秒 脱色

标准条件/反应条件：(每分钟)

麦芽糖淀粉酶活性(MANU)的确定

一个MANU(产麦芽糖淀粉酶Novo单位)可以被定义为在10mg麦芽三糖(西格玛M8378)底物/ml的0.1M柠檬酸盐缓沖液(pH 5.0)的浓度下，在37℃下持续30分钟，每分钟释放一微摩尔麦芽糖所需要的酶量。

支链淀粉酶活性(NPUN)的确定

相对于诺维信支链淀粉酶标准品测量NPUN中的内切-支链淀粉酶活性。一个支链淀粉酶单位(NPUN)定义为在标准条件下(0.7％红色普鲁兰(red pullulan)(麦格酶公司(Megazyme)，pH 5，40℃，20分钟)每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。使用红色普鲁兰以NPUN/ml测量该活性。

将1ml稀释的样品或标准品在40℃下孵育2分钟。添加0.5ml 2％红色普鲁兰、0.5MKCl、50mM柠檬酸(pH 5)并混合。将这些管在40℃下孵育20分钟并且通过添加2.5ml 80％乙醇终止。将这些管在室温下静置10-60分钟，随后以4000rpm离心10分钟。然后在510nm处测量上清液OD并且使用标准品曲线计算活性。

糖谱和溶解的干固体的确定

通过HPLC确定淀粉水解物的糖组成并且将葡萄糖产率随后计算为DX。通过测量折射率而确定淀粉水解物的溶解(可溶性)的干固体的BRIX(白利糖度)。

蛋白酶测定法-AU(RH)

可以用变性的血红蛋白作为底物确定蛋白水解活性。在用于确定蛋白水解活性的安森-血红蛋白(Anson-Hemoglobin)方法中，变性血红蛋白被消化，并且用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白。用酚试剂确定TCA可溶产物的量，酚试剂可以与酪氨酸和色氨酸一起给出蓝色。

将一个安森(Anson)单位(AU-RH)定义为在标准条件(即，25℃，pH 5.5和10min反应时间)下以初始速率消化血红蛋白，以使得每分钟释放的TCA可溶性产物的量与酚试剂给出与一毫当量的酪氨酸相同的颜色的酶量。

蛋白水解活性(AU)

可以用变性的血红蛋白作为底物确定蛋白水解活性。在用于确定蛋白水解活性的安森-血红蛋白(Anson-Hemoglobin)方法中，变性血红蛋白被消化，并且用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白。用酚试剂确定TCA可溶产物的量，酚试剂可以与酪氨酸和色氨酸一起给出蓝色。

将一个安森(Anson)单位(AU)定义为在标准条件(即，25℃，pH 7.5和10min反应时间)下以初始速率消化血红蛋白，以使得每分钟释放的TCA可溶性产物的量与酚试剂给出与一毫当量的酪氨酸相同的颜色的酶量。

蛋白酶测定法(LAPU)

1个亮氛酸氛肽酶单位(LAPU)为在下述条件下每分钟分解1microM底物的酶量：26mM的L-亮氨酸-对硝基苯胺作为底物，0.1M Tris缓沖液(pH 8.0)，37℃，10分钟反应时间。

材料

α-淀粉酶变体

测试的α-淀粉酶变体是LE399的变体(SEQ ID NO:14，先前披露于例如WO 2002/010355中)。LE399包括来自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(SEQ ID NO:6)的氨基酸1-37以及来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶(SEQ ID NO:1)的氨基酸40-483，其中具有以下取代G48AT49I G107A H156Y A181T N190F I201F A209V Q264S。如下文列出的每个变体中的取代是与LE399相比的取代。位置编号是根据SEQ ID NO:1。

LE399在N-末端中比SEQ ID NO:1短两个氨基酸，即在LE399中，没有对应于SEQ IDNO:1的位置1和2的氨基酸。表中表示为*2aH的改变是指在LE399的N-末端V之前插入H。SEQID NO:1中的类似改变是氨基酸N2用H来取代，即N2H(或者，缺失氨基酸A1并组合氨基酸N2用H取代，即A1*N2H)。同样地，表中表示为*2aH*2bW的改变是指在VLE399的N-末端之前插入HW。SEQ ID NO:1中的类似改变是取代A1H N2W。

α-淀粉酶变体E：

K176L+E185P+F201Y+H205Y+K213T+K315M+Q360S+D416V+R437W

α-淀粉酶变体F：

K176L+F201Y+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W

葡糖淀粉酶

葡糖淀粉酶A：来自瓣环栓菌的葡糖淀粉酶(WO 2006/069289)。

葡糖淀粉酶B：来自黑曲霉的葡糖淀粉酶(披露于博埃尔(Boel)等人(1984)，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)3(5),1097-1102中的来源于黑曲霉的葡糖淀粉酶G1，可获得自诺维信公司)。

葡糖淀粉酶C：在申请号EP 13165995中披露为具有双取代S95P,A121P的变体的来自密粘褶菌的葡糖淀粉酶。

β-淀粉酶

β-淀粉酶A：Optimalt BBA(可获得自杜邦公司(DuPont))。

β-淀粉酶B：来自弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶(USPN 8,486,682)。

对比性α-淀粉酶

比较的α-淀粉酶变体还是如描述于例如WO 2013/057143中的LE399的变体(SEQID NO:14，先前披露于例如WO 2002/010355中)。LE399包括来自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(SEQ ID NO:6)的氨基酸1-37以及来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶(SEQ ID NO:1)的氨基酸40-483，其中具有以下取代G48A T49I G107A H156Y A181T N190F I201F A209V Q264S。如下文列出的每个变体中的取代是与LE399相比的取代。位置编号是根据SEQ ID NO:1。

LE399在N-末端中比SEQ ID NO:1短两个氨基酸，即在LE399中，没有对应于SEQ IDNO:1的位置1和2的氨基酸。表中表示为*2aH的改变是指在LE399的N-末端V之前插入H。SEQID NO:1中的类似改变是氨基酸N2用H来取代，即N2H(或者，缺失氨基酸A1并组合氨基酸N2用H取代，即A1*N2H)。同样地，表中表示为*2aH*2bW的改变是指在VLE399的N-末端之前插入HW。SEQ ID NO:1中的类似改变是取代A1H N2W。

对比性α-淀粉酶1：

H68W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W

实例1

通过在搅拌下向水中添加普通玉米淀粉而制备具有30％干固体(DS)颗粒状淀粉的浆液。用HCl将pH调节至4.5。将颗粒状淀粉浆液分配到100ml蓝帽烧瓶中，其中每个烧瓶中75g。将烧瓶在60℃水浴中在磁搅拌下进行孵育。在零时，将0.05mg/g DSα-淀粉酶变体和0.1mg/g DS葡糖淀粉酶加到烧瓶中。在4、24和48小时之后取出样品，如所指示的。

使用以下方法确定总干固体淀粉。通过添加过量的α-淀粉酶(300KNU/Kg干固体)并且随后将样品在95℃下在油浴中放置45分钟而将淀粉完全水解。在通过0.22微米过滤器过滤之后，通过测量折射率而测量干固体。

在通过0.22微米过滤器过滤之后对样品确定淀粉水解物中的可溶性干固体。通过测量折射率确定可溶性干固体并且通过HPLC确定糖谱。将葡萄糖量计算为％DX。

实例2

在塑料烧瓶中将粉状玉米淀粉与自来水合并，以产生31.5％固体淀粉浆液。使用0.1M HCl溶液将浆液调节至pH为4.5。将此浆液的20mL等分部分添加至30mL耐洁(Nalgene)螺旋盖塑料瓶中并且记录重量。向每个酶处理的瓶给予0.05mg酶蛋白/克的淀粉干物质(mgEP/g DS)剂量的α淀粉酶和0.1mg EP/g DS剂量的葡糖淀粉酶。未加料的两个瓶作为对照。一旦加料，便将瓶放置于两个分别设定为60℃或66℃的烤肉烘箱中。

在不同时间点(T＝4、24和48小时)，从每个瓶中取出2mL等分部分并将其放置于预称重的15mL锥形旋管中，然后对这些旋管再称重。用18μL的1M HCl使每个样品失活。失活后，将样品彻底涡旋。将每个管中的上清液通过0.45μm滤片过滤进微量离心管中，以用于HPLC分析。然后将这些微量离心管在沸水中放置10分钟，以使任何酶活性完全失活。通过将50μL的过滤样品稀释于每个具有950μL的0.005M H2SO4的艾本德(Eppendorf)管中以产生20:1的稀释因子而在小瓶中制备HPLC样品。

一旦将上清液从每个样品中取出，便将管用自来水填充至10mL标记处。然后将管如上涡旋和离心，然后倾析。将这个过程用自来水重复第二次，随后用80％乙醇溶液重复第三次和最后一次，以从每个管的固体中除去残余可溶物。将这些管在55℃烘箱中放置最少24小时，之后在105℃烘箱中放置24小时，以完全干燥。在从烘箱中拿出之后，立即将管帽密封，以阻止管内容物吸收水份。然后将管在分析天平上称重，以确定内容物的重量。

通过FIS分析确定溶解作用

如下计算溶解的固体分数：

HPLC分析

HPLC系统 具有化学工作站(Chem station)软件的安捷伦(Agilent)

1100/1200系列

脱气装置，四元泵，自动进样器，柱室w/加热器

折射率检测器(RI)

柱 伯乐(Bio-Rad)HPX-87H离子排斥柱，300mm x 7.8mm，

零件号125-0140

伯乐保护柱阳离子H，零件号125-0129，支架零件号125-0131

方法 0.005M H2SO4流动相

流速：0.6ml/min

柱温：65℃

RI检测器温度：55℃

该方法使用针对DP4+、DP3、DP2、葡萄糖、果糖、乙酸、乳酸、甘油以及乙醇(％w/v)的校准标准品对分析物进行定量。使用四点校准(包括来源)进行定量。

对于此实验，没有在处理之间比较有机酸和果糖HPLC结果。

实例3

在塑料烧瓶中将粉状玉米淀粉与DI水合并，以产生40.5％固体淀粉浆液。使用0.1M HCl溶液将浆液调节至pH为4.5。将此浆液的10mL等分部分添加至30mL耐洁(Nalgene)螺旋盖塑料瓶中并且记录重量。根据表1，根据其重量向每个瓶中加入α淀粉酶和葡糖淀粉酶。向每个瓶中添加足够的水，以达到30％干固体。瓶1和2未加料并且作为空白处理。一旦加料，便根据表5将瓶放置于两个设定为60℃或66℃的烤肉烘箱中。将空白放置于60℃中，以避免淀粉糊化。

表1.α–淀粉酶(AA)和葡糖淀粉酶(AMG)的加料表。

在24和48小时时间点，从每个烧瓶中取出2mL等分部分并将其放置于预称重的15mL锥形旋管中，然后对这些旋管再称重。用18μL的1M HCl使每个样品失活。失活后，将样品涡旋并在3500rpm下在离心机中放10分钟。将每个管中的上清液通过0.45μm滤片过滤进小微量离心管中，以用于水解物的HPLC分析。然后将这些微量离心管在沸水中放置10分钟，以使任何酶活性完全失活。通过将50μL的过滤样品用950μL的流动相(5mM H₂SO₄)稀释以产生20:1的稀释因子而在小瓶中制备HPLC样品。根据描述于实例2中的程序分析HPLC样品。还根据描述于实例2中的程序确定淀粉溶解作用。

表2.以总干物质的百分比计的可溶性干固体(重复的平均值)。

*n.d.＝未确定

表3.可溶性水解物的DX(重复的平均值)。

*n.d.＝未确定

此实例证实测试的α-淀粉酶变体组合葡糖淀粉酶有效地溶解淀粉(在48小时内大于70％)并且给出相当高的％DX(>95％)。

实例4

在塑料烧瓶中将粉状玉米淀粉与DI水合并，以产生40.5％固体淀粉浆液。使用0.1M HCl溶液将浆液调节至pH为4.5。将此浆液的10mL等分部分添加至30mL耐洁(Nalgene)螺旋盖塑料瓶中并且记录重量。根据表4，根据其重量向每个瓶中加入α淀粉酶和β淀粉酶。向每个瓶中添加足够的水，以达到30％干固体。瓶21和22未加料并且作为空白处理。一旦加料，便根据表4将瓶放置于两个设定为60℃或66℃的烤肉烘箱中。将空白放置于60℃中，以避免淀粉糊化。

表4.α-淀粉酶和β-淀粉酶的加料表。

在24和48小时时间点，从每个烧瓶中取出2mL等分部分并将其放置于预称重的15mL锥形旋管中，然后对这些旋管再称重。用18μL的1M HCl使每个样品失活。失活后，将样品涡旋并在3500rpm下在离心机中放10分钟。将每个管中的上清液通过0.45μm滤片过滤进小微量离心管中，以用于水解物的HPLC分析。然后将这些微量离心管在沸水中放置10分钟，以使任何酶活性完全失活。通过将50μL的过滤样品用950μL的流动相(5mM H₂SO₄)稀释以产生20:1的稀释因子而在小瓶中制备HPLC样品。根据描述于实例2中的程序分析HPLC样品。还根据描述于实例2中的程序确定淀粉溶解作用。

表5.以总干物质的百分比计的可溶性干固体(重复的平均值)。

表6.可溶性水解物的DP2％(重复的平均值)。

此实例证实测试的α-淀粉酶变体组合β-淀粉酶有效地溶解淀粉并且甚至可以在66℃的较高温度下有效地发挥作用。

实例5

通过标准定向位点方法，将两个氨基酸取代，W68H和K315M，引入α-淀粉酶变体F(SEQ ID NO:15)。在产生的α-淀粉酶变体，将天然赖氨酸用如下表7中所指示的非天然氨基酸残基取代。位置编号是根据SEQ ID NO:1。将这些淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且在与葡萄糖溶液混合至10％葡萄糖的终浓度之前，将包含淀粉酶的上清液分离并且在50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中稀释50倍。然后将这些样品一分为二，并且同时将一半在4℃下储存，将另一半在60℃下孵育6小时。紧接着，将这些样品在100mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸，pH 7.3+0.12mM CaCl2+0.01％Brij，pH调节至pH 7.3)中稀释50倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为在60℃下孵育的样品中的活性与在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。

表7.在葡萄糖中孵育后α-淀粉酶变体的剩余活性。

该实例证实可以通过用非天然氨基酸残基取代赖氨酸残基来生产在葡萄糖存在下具有增加的稳定性的α-淀粉酶变体。

在此描述并且要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

在此引用了不同的参考，其披露通过引用以其全部内部结合在此。

Claims (74)

1.一种亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体包括使用SEQ ID NO:1进行编号的一个或多个取代，或者组a)和b)中的对应的取代：

组a)K176、E185、I201、H205、K213、Q360、D416、R437；

组b)另外的赖氨酸残基至非天然氨基酸的取代；

其中该变体与以下各项具有至少80％，但小于100％序列一致性：

(i)SEQ ID NO:1或14中的任何一个的成熟多肽，或

(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483或SEQ ID NO:14的氨基酸1至481；

并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

2.一种亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体包括使用SEQ ID NO:1进行编号的一个或多个取代，或者组a)和b)中的对应的取代：

组a)K176、E185、I201、H205、K213、Q360、D416、R437；

组b)K136、K154、K170、K234、K237、K251、K306、K315、K319、K392；其中该变体与以下各项具有至少80％，但少于100％的序列一致性：

(i)SEQ ID NO:1或14中的任何一个的成熟多肽，或

SEQ ID NO:1的氨基酸1至483或SEQ ID NO:14的氨基酸1至481；并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。

3.如权利要求1或2所述的变体，该变体是一种分离的α-淀粉酶变体。

4.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该变体包括或具有以下取代或对应的组a)和组b)取代：

组a)：K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W；或

K176L+I201Y+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W

和

组b)中以下取代中的一个或多个：

K136、K154、K170、K234、K237、K251、K306、K315、K319、K392(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

5.如权利要求4所述的变体，其中该组b)取代是K136R(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

6.如权利要求4所述的变体，其中该组b)取代是K154A、H、S(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

7.如权利要求4所述的变体，其中该组b)取代是K170R、S(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

8.如权利要求4所述的变体，其中该组b)取代是K234T(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

9.如权利要求4所述的变体，其中该组b)取代是K237R(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

10.如权利要求4所述的变体，其中该组b)取代是K306M或K251Q(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

11.如权利要求4所述的变体，其中该组b)取代是K315A、N、C、Q、E、G、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y、V(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

12.如权利要求4所述的变体，其中该组b)取代是K319Q、L(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

13.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该组b)取代选自下组，该组由以下各项组成：

·K136R；

·K154A；

·K154H；

·K154S；

·K170R；

·K170S；

·K234T；

·K237R；

·K251Q；

·K306M

·K315M；

·K319Q；

·K319L；

·K392V；

·K392V+Q393D；和

·H133Y+K136R(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

14.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该变体进一步包括以下位置中任一个处的取代：H68、H133、H142、Y156、Y158、H316、L318；优选H68W、H133Y、H142Y、Y156W、Y158W、H316W、L318W；这些取代使用SEQ ID NO:1进行编号。

15.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该变体与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽或(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％，但小于100％的序列一致性。

16.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体是一种亲本α-淀粉酶的变体，该亲本α-淀粉酶与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽或(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。

17.如权利要求1-3中任一项所述的变体，其中该变体包括或具有以下取代或对应的组a)和组b)取代：

组a)：K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211+Q358S+D414V+R435W；或

K174L+F199Y+H203Y+K211T+E253P+Q358S+D414V+R435W

和

组b)中以下取代中的一个或多个：

K134、K152、K168、K232、K235、K249、K304M、K313、K317、K390(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

18.如权利要求17所述的变体，其中该组b)取代是K134R(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

19.如权利要求17所述的变体，其中该组b)取代是K152A、H、S(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

20.如权利要求17所述的变体，其中该组b)取代是K168R、S(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

21.如权利要求17所述的变体，其中该组b)取代是K232T(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

22.如权利要求17所述的变体，其中该组b)取代是K235R(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

23.如权利要求17所述的变体，其中该组b)取代是K249Q(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

24.如权利要求17所述的变体，其中该组b)取代是K313A、N、C、Q、E、G、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y、V(使用SEQ IDNO:14进行编号)。

25.如权利要求17所述的变体，其中该组b)取代是K317Q、L(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

26.如权利要求17所述的变体，其中该组b)取代是K390V(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

27.如权利要求17-26中任一项所述的变体，其中该组b)取代选自下组，该组由以下各项组成：

·K134R；

·K152A；

·K152H；

·K152S；

·K168R；

·K168S；

·K232T；

·K235R；

·K249Q；

·K304M

·K313M；

·K317Q；

·K317L；

·K390V；

·K390V+Q391D；

·H131Y+K134R(使用SEQ ID NO:14进行编号)。

28.如权利要求17-27中任一项所述的变体，该变体进一步包括以下位置中任一个处的取代：H66、H131、H140、Y154、Y156、H314、L316；优选以下取代中的一种或多种：H66W、H131Y、H140Y、Y154W、Y156W、H314W、L316W；这些取代使用SEQ ID NO:14进行编号。

29.如权利要求1、2、和17-28中任一项所述的变体，其中该变体与(i)SEQ ID NO:14的成熟多肽或(ii)SEQ ID NO:14的氨基酸1-481具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％，但小于100％的序列一致性。

30.如权利要求1、2、和17-28中任一项所述的变体，该变体是一种亲本α-淀粉酶的变体，该亲本α-淀粉酶与(i)SEQ ID NO:14的成熟多肽或(ii)SEQ ID NO:14的氨基酸1至481具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。

31.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:1或14的成熟多肽的片段，其中该片段具有α-淀粉酶活性。

32.如以上权利要求中任一项所述的变体，分别与SEQ ID NO:1或14的成熟多肽相比，该变体具有改进的稳定性，特别是在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。

33.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％，但少于100％序列一致性，并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽相比，具有改进的稳定性，特别是在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。

34.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸1至483具有至少80％，但少于100％序列一致性，并且与SEQ ID NO:1的氨基酸1至483相比，具有改进的稳定性，特别是在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。

35.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％，但少于100％序列一致性，并且与SEQ ID NO:14的成熟多肽相比，具有改进的稳定性，特别是在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。

36.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸1至483具有至少80％，但少于100％序列一致性，并且与SEQ ID NO:14的氨基酸1至481相比，具有改进的稳定性，特别是在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。

37.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该稳定性是通过将残余活性计算为所述变体用10％(w/w)葡萄糖在60℃下孵育6小时后所呈现的α-淀粉酶活性与所述变体用10％(w/w)葡萄糖在4℃下孵育6小时后所呈现的活性两者之间的比率来确定的。

38.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中当被确定为所述变体用10％(w/w)葡萄糖在60℃下孵育6小时后所呈现的α-淀粉酶活性与所述变体用10％(w/w)葡萄糖在4℃下孵育6小时后所呈现的活性两者之间的比率时，所述变体的稳定性是至少35％，如至少36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％。

39.如以上权利要求中任一项所述的变体，分别与SEQ ID NO:1或14的成熟多肽相比，该变体对长链底物比对短链底物具有相对更高的活性。

40.一种编码如权利要求1-39中任一项所述的变体的分离的多核苷酸。

41.一种包括如权利要求40所述的多核苷酸的核酸构建体。

42.一种包括如权利要求40所述的多核苷酸或如权利要求41所述的构建体的表达载体。

43.一种包括如权利要求42所述的多核苷酸的宿主细胞。

44.一种生产α-淀粉酶变体的方法，该方法包括：

c.在适合于表达该变体的条件下培养如权利要求43所述的宿主细胞；并且

d.回收该变体。

45.一种用于获得α-淀粉酶变体的方法，该方法包括(a)向亲本α-淀粉酶中引入如权利要求1-39中任一项所定义的取代；并且(b)回收该变体。

46.一种包含如权利要求1至39中任一项所述的变体以及一种或多种选自下组的酶的组合物，该组由以下各项组成：β-淀粉酶、纤维素酶(β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶以及内切葡聚糖酶)、葡糖淀粉酶、半纤维素酶(例如，木聚糖酶)、异淀粉酶、异构酶、脂肪酶、植酸酶、蛋白酶以及支链淀粉酶。

47.一种生产液化淀粉的工艺，该工艺包括用如权利要求1至39中任一项所述的变体或如权利要求46所述的组合物来液化一种含淀粉材料。

48.一种生产发酵产物的方法，该方法包括

(a)用如权利要求1至39中任一项所述的变体来液化一种含淀粉材料，以产生一种液化醪液；

(b)将该液化醪液糖化，以产生可发酵的糖；并且

(c)使这些可发酵的糖在一种发酵生物存在下发酵。

49.如权利要求48所述的工艺，其中在步骤(a)中的液化期间温度高于初始糊化温度，例如在80℃-90℃之间，例如约85℃。

50.如权利要求47-49中任一项所述的工艺，其中在pH 4-6下进行步骤(a)，优选4.2-5.5，例如约4.5。

51.如权利要求47-50中任一项所述的工艺，其中步骤(a)中的液化进行0.1-12小时，例如0.5-5小时。

52.如权利要求47-51中任一项所述的工艺，其中在步骤(b)或预糖化期间的温度在30℃-70℃的范围内，例如55℃-65℃，典型地约60℃。

53.如权利要求47-52中任一项所述的工艺，其中使用一种产碳水化合物源的酶，如葡糖淀粉酶，来完成步骤(b)中的糖化或同时糖化发酵。

54.如权利要求47-53中任一项所述的工艺，其中步骤(b)中的糖化和步骤(c)中的发酵顺序完成或同时完成。

55.如权利要求47-54中任一项所述的工艺，其中步骤(c)或同时步骤(b)和(c)期间的温度是从25℃至40℃，例如从28℃至35℃，例如从30℃至34℃，优选约32℃。

56.如权利要求47-55中任一项所述的工艺，其中发酵是步骤(c)，或者使用酵母，例如酵母菌属，例如特别是酿酒酵母完成同时步骤(b)和(c)。

57.如权利要求47所述的工艺，其中在步骤(a)中的液化期间的温度处于低于或略高于所述颗粒状淀粉的初始糊化温度的温度，例如至少58℃，例如约60℃-70℃。

58.如权利要求47-57中任一项所述的工艺，其中该pH是在3.0至7.0，优选从3.5至6.0，优选从4.0-5.0，优选4.5-5.5的范围内，更优选4.5。

59.一种生产糖的工艺，该工艺包括：

(a)用如权利要求1至33中任一项所述的α-淀粉酶变体来液化一种含淀粉材料，以产生一种液化醪液；

(b)将该液化醪液糖化，以产生可发酵的糖。

60.如权利要求59所述的工艺，其中在步骤(a)期间的温度高于初始糊化温度，例如在80℃-90℃之间，例如约85℃。

61.如权利要求59或60所述的工艺，其中在pH 4-6下进行步骤(a)，例如pH 4.5-5.5，例如pH 4-5。

62.如权利要求59-61中任一项所述的工艺，其中步骤(a)中的液化进行0.1-12小时，例如0.5-5小时。

63.如权利要求59-62中任一项所述的工艺，其中在步骤(b)或预糖化期间的温度是在30℃-70℃之间的范围内，例如55℃-65℃，典型地约60℃。

64.如权利要求59-63中任一项所述的工艺，其中使用一种产碳水化合物源的酶，如葡糖淀粉酶，来完成步骤(b)中的糖化或同时糖化发酵。

65.如权利要求59-64中任一项所述的工艺，其中在糖化步骤(b)后回收糖。

66.如权利要求59-65中任一项所述的工艺，其中将步骤(b)中所获得的糖例如使用固定的葡糖异构酶进一步加工为，例如，高果糖糖浆。

67.如权利要求59所述的工艺，其中在步骤(a)中的液化期间的温度处于低于或略高于所述颗粒状淀粉的初始糊化温度的温度，例如至少58℃，例如约60℃-70℃。

68.如权利要求59-67中任一项所述的工艺，其中该pH是在3.0至7.0，优选从3.5至6.0，优选从4.0-5.0，优选4.5-5.5的范围内，更优选4.5。

69.如权利要求1-39中任一项所述的变体用于洗涤和/或餐具洗涤的用途。

70.如权利要求1-39中任一项所述的变体用于使纺织品退浆的用途。

71.如权利要求1-39中任一项所述的变体用于产生烘焙产品的用途。

72.如权利要求1-39中任一项所述的变体用于液化一种含淀粉材料的用途。

73.如权利要求1-39中任一项所述的变体在生产糖浆的过程中用于液化一种含淀粉材料的用途。

74.如权利要求1-39中任一项所述的变体在生产发酵产物如乙醇的过程中用于液化一种含淀粉材料的用途。