MX2008013100A

MX2008013100A - Polipeptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleotidos que los codifican.

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Publication number: MX2008013100A
Application number: MX2008013100A
Authority: MX
Inventors: Jeppe Wegener Tams; Jiyin Liu; Chee-Leong Soong; Sara Landvik; Carsten Horslev Hansen
Original assignee: Novozymes North America Inc
Priority date: 2006-04-19
Filing date: 2007-04-13
Publication date: 2008-10-27
Also published as: EP2010653A2; WO2007124285A2; US7871800B2; CN101443447A; RU2008145591A; CA2645006A1; EP2010653A4; US20100120108A1; WO2007124285A3

Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos aislados que codifican dichos polipéptidos preferiblemente derivados de una cepa de Peniphora rufomarginata. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores, y células hospederas, que comprenden los polinucleótidos así como métodos para producción y uso de los polipéptidos. La invención también se refiere a la composición que comprende una glucoamilasa de la invención así como el uso de dichas composiciones para los procedimientos de conversión de almidón, fabricación de cerveza, incluyendo procedimientos para producir, productos o jarabes de fermentación.

Description

POLIPEPTIDOS QUE TIENEN ACTIVIDAD DE GLUCOAMILASA Y POLINUCLEOTIDOS QUE LOS CODIFICAN Campo de la invención La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores y células hospederas que comprenden los polinucleótidos asi como métodos para la producción y el uso de los polipéptidos, y para el uso de glucoamilasas de la invención para la conversión del almidón para producir productos de fermentación, tales como etanol, y jarabes, tal como glucosa. La invención también se refiere a una composición que comprende una glucoamilasa de la invención.

Antecedentes de la invención La glucoamilasa ( 1, 4-alfa-D-glucan glucoamilasa, EC 3.2.1.3) es una enzima, que cataliza la liberación de la D-glucosa de los extremos no de reducción del almidón o las moléculas oligo- y polisacáridos relacionadas. Las glucoamilasas se producen a través de varios hongos filamentos y levaduras, con aquellas de Aspergillus siendo comercialmente las más importantes. Comercialmente, las glucoamilasas se utilizan para ef. 195977 convertir el material de almidón, que ya está parcialmente hidrolizado por un alfa-amilasa, a glucosa. La glucosa después se puede convertir directa o indirectamente en un producto de fermentación utilizando un organismo de fermentación. Los ejemplos de productos de fermentación comerciales incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol, 1,3-propandiol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico, gluconato, ácido láctico, ácido succínico, ácido 2 , 5-diceto-D-glucónico ) ; cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico) ; gases (por ejemplo, H2 y C02) y compuestos más complejos, incluyendo, por ejemplo, antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina ) ; enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, Bi2, beta-caroteno); hormonas, y otros compuestos que son difíciles de producir sintéticamente. Los procedimientos de fermentación también son comúnmente utilizados en el alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), productos lácteos (por ejemplo, en la producción de yogurt y queso), piel y las industria del tabaco. El producto final también puede ser un jarabe. Por ejemplo, el producto final puede ser glucosa, pero también puede convertirse, por ejemplo, a través de glucosa isomerasa en fructosa o una mezcla compuesta casi igualmente de glucosa a fructosa. Esta mezcla, o una mezcla adicional enriquecida con fructosa, es el jarabe de maíz alto en fructosa más comúnmente utilizado (HFCS, por sus siglas en inglés) comercializado en todo el mundo. Boel y otros (1984), EMBO J. 3(5), p. 1097-1102 describen la glucoamilasa Aspergillus niger Gl o G2. La Patente de E. U. A. No. 4, 727, 046 describe un glucoamilasa derivada de Corticium rolfsii que también es referida como Athelia rolfsii. WO 84/02921 describe un derivado de glucoamilasa de Aspergillus awamori . WO 99/28248 describe un derivado de glucoamilasa de Talaromices emersonil. WO 00/75296 describe un derivado de glucoamilasa de Thermoascus crustaceus . WO 2006/069289 describe derivados de glucoamilasas de Trametes cingulata , Pachykytospora papyracea , y Leucopaxillus giganteus . Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos y que proporcionan un alto rendimiento en los procedimientos de producción de productos de fermentación, tales como los procedimientos para la producción de etanol, incluyendo los procedimientos de fermentación de etanol en un solo paso de un almidón bruto no gelatinizado (o crudo) .

Breve descripción de la invención La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa seleccionados del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 60% de identidad con aminoácidos para aminoácidos de polipéptido maduro 1 a 558 de SEC ID NO: 2; (b) un polipéptido que se codifica a través de una secuencia de nucleótido (i) que hibridiza bajo por lo menos condiciones de bajo rigor con nucleótidos 61 a 2301 de SEC ID NO:l; o (ii) que hibridiza bajo por lo menos condiciones de bajo rigor con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 61 a 1734 de SEC ID NO: 3; o (iii) una estructura de cadena complementaria de (i) o (ii); (c) una variante que comprende una sustitución, eliminación, y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 558 de SEC ID NO: 2. La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen la actividad de glucoamilasa, seleccionados del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos de polipéptido maduro 1 a 558 de SEC ID N0:2; (b) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 61 a 2301 de SEC ID NO : 2 ; o (c) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 61 a 1734 de SEC ID NO : 3 ; (d) un polipéptido que se codifica mediante una secuencia de nucleótido (i) que hibridiza bajo por lo menos condiciones de bajo rigor con los nucleótidos 61 a 2301 de SEC ID NO:l; o (ii) que hibridiza bajo por lo menos condiciones de bajo rigor con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 61 a 1734 de SEC ID NO: 3; o (iii) una estructura de cadena complementaria de (i) o (ii) . En una modalidad preferida el polipéptido puede derivarse de una cepa del género Peniphora , preferiblemente una cepa de las especies Peniphora rufomarginata o una cepa E. coli depositada en DSMZ el 3 de abril del 2006 bajo los términos del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del depósito de microorganismos para los propósitos del procedimiento de patentes Deutshe Sannnlung von Microorganismen y Zellkulfuren GMBH (DSMZ), Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunscheweig DE. Al clon se le dio el número DSM 18150, la cepa DSM 18150 depositada hospeda al plásmido pENI2516 que comprende una secuencia que, según la ideología de los inventores es idéntica a SEC ID NO:l. Un polipéptido específico de la invención es el polipéptido maduro obtenido cuando se expresa en el plásmido pENI2516 en una sola célula hospedera fúngica adecuada. La presente invención también se refiere a métodos para producir dichos polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa que comprenden (a) cultivar una célula hospedera recombinante que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido bajo condiciones conductivas para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. La presente invención también se refiere a procedimientos para producir productos de fermentación o j árabes . Definiciones Actividad de Glucoamilasa: El término glucoamilasa ( 1, 4-alfa-D-glucan glucohidrolasa , EC 3.2.1.3) se define como una enzima, que cataliza la liberación de la D-glucosa de los extremos no de reducción del almidón o moléculas de oligo- y polisacáridos relacionadas. Para propósitos de la presente invención, la actividad de glucoamilasa se determina de acuerdo con el procedimiento descrito en la sección "materiales y métodos" siguiente. Los polipéptidos de la presente invención tienen por lo menos 20%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 50, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, aún más preferiblemente 90%, más preferiblemente al menos 95%, y aún más preferiblemente al menos 100%, de la actividad de glucoamilasa del polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácido mostrada como los aminoácidos 1 a 558 de SEC ID NO: 2. Polipéptido: El término "polipéptido" como se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido aislado que es al menos 20% puro, preferiblemente al menos 40% puro, más preferiblemente al menos 60% puro, aún más preferiblemente al menos 80% puro, más de preferencia al menos 90% puro, y aún más de preferencia por lo menos 95% puro, como se determina a través de SDS-PAGE. Polipéptido sustancialmente puro: El término "polipéptido sustancialmente puro" denota en la presente una preparación de polipéptido que contiene cuando mucho 10%, preferiblemente cuando mucho 8%, más preferiblemente cuando mucho 6%, más preferiblemente cuando mucho 5%, más preferiblemente cuando mucho 4%, aún más preferiblemente cuando mucho 2%, más preferiblemente cuando mucho 1%, y aún más preferiblemente cuando mucho 0.05% en peso del otro material de polipéptido con el cual está nativamente asociado. Por consiguiente, se prefiere que el polipéptido sustancialmente puro sea al menos 92% puro, preferiblemente al menos 94% puro, más preferiblemente al menos 95% puro, más preferiblemente por lo menos 96% puro, más preferiblemente al menos 96% puro, más preferiblemente 97% puro, más preferiblemente 98% puro, aún más preferiblemente 99% puro, más preferiblemente 99.5% puro, y aún más preferiblemente 100% puro en peso del material polipéptido presente en la preparación. Los polipéptidos de la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polipéptidos estén en "forma esencialmente pura", es decir que la preparación del polipéptido este esencialmente libre de otros materiales de polipéptido con los cuales están nativamente asociados. Esto se puede lograr, por ejemplo, preparando el polipéptido por medio de métodos recombinantes bien conocidos o a través de métodos de purificación clásicos. En la presente, el término "polipéptido sustancialmente puro" es sinónimo de los términos "polipéptido aislado" y "polipéptido en forma aislada" Identidad: La relación entre las dos secuencias de aminoácido o entre las dos secuencias de nucleótido se describe mediante el parámetro "identidad". Para propósitos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácido se determina a través del método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) utilizando el software LASERGENE™ EGALIGN™ (DNASTAR, INC., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineación múltiples: penalidad de longitud de hueco de 10. Parámetros de alineación por pares son Ktupla =1, penalidad de hueco = 3, ventanas = 5 y diagonales = 5. Para propósitos de la presente invención, el grado de identidad entre las dos secuencias de nucleótido se determina a través del método Wilbur-Lipman (Wilbur and Pipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730) utilizando el software LASERGENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineación múltiples: penalidad de hueco de 10 y penalidad de longitud de hueco de 10. Los parámetros de alineación en pares son Ktupla = 3, penalidad de hueco = 3, y ventanas = 20. Fragmento de Polipéptido: El término "fragmento de polipéptido" se define en la presente como un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos eliminados del término amino y/o carboxilo de SEC ID NO: 2; o secuencias homologas de los mismos, en donde el fragmento tiene actividad de glucoamilasa . Subsecuencia : El término "subsecuencia" se define en la presente como una secuencia de nucleótido que tiene uno o más nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o 3' de SEC ID NO:l ó 3, o la secuencias homologas de las mismas, en donde la subsecuencia codifica un fragmento de polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa. Variante Alélica: El término "variante alélica" denota en la presente cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo sitio cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede dar como resultado el polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones de gen pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácido alteradas. Una variante alélicas de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen. Polinucleótido sustancialmente puro: El término "polinucleótido sustancialmente puro" como se utiliza en la presente se refiere a una preparación de polinucleótido sin otros nucleótidos extraños o indeseados y en una forma adecuada para utilizarse con sistemas de producción de proteina genéticamente modificados. De esta forma, un polinucleótido sustancialmente puro contiene cuando mucho 10%, preferiblemente cuando mucho 8%, más preferiblemente cuando mucho 6%, más preferiblemente cuando mucho 5%, más preferiblemente cuando mucho 4%, más preferiblemente cuando mucho 3%, más preferiblemente cuando mucho 2%, más preferiblemente cuando mucho 1%, y aún más preferiblemente cuando mucho 0.5% en peso de otro material de polinucleótido con el cual está nativamente asociado. Un polinucleótido sustancialmente puro puede, sin embargo, incluir regiones no traducidas 5' y 3' de existencia natural, tales como promotores y terminadores . Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro sea al menos 90% puro, preferiblemente al menos 92% puro, más preferiblemente al menos 94% puro, más preferiblemente al menos 95% puro, más preferiblemente al menos 96% puro, más preferiblemente al menos 97% puro, más preferiblemente 98% puro, más preferiblemente 99%, y aún más preferiblemente al menos 99.5% puro en peso. Los polinucleótidos de la presente invención preferiblemente están en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polinucleótidos descritos en la presente estén en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación del polinucleótido está esencialmente libre de otro material de polinucleótido con el cual está nativamente asociado. En la presente, el término "polinucleótido sustancialmente puro" es sinónimo de los términos "polinucleótido aislado"; y "polinucleótido en forma aislada". Los polinucleótidos pueden ser de origen genómico, de ADNc de ARN, semi-sintético , sintético, o cualquier combinación de éstos. ADNc: El término "ADNc" se define en la presente como una molécula de ADN que se puede preparar a través de transcripción inversa de una molécula de ARNm dividida madura obtenida de una célula eucariótica. El ADNc carece de secuencias de intrón que usualmente están presentes en el ADN genómico correspondiente. La transcripción de ARN primaria, inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de 1 una serie de pasos antes de aparecer como un ARNm dividido maduro. Estos pasos incluyen la remoción de las secuencias de intrón a través de un procedimiento denominado empalme. El ADNc derivado del ARNm carece, por consiguiente, de cualquier secuencia de intrón. Construcción de ácido nucleico: El término "construcción de ácido nucleico" como se utiliza en la presente se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea de estructura de cadena individual o doble, que se aisla de un gen de existencia natural o que se modifica para contener segmentos de ácido nucleico en una forma que por el contrario no existiría en naturaleza. El término construcción de ácido nucleico es sinónimo del término "cásete de expresión" cuando la construcción del ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para expresión de una secuencia de codificación de la presente invención. Secuencia de control: El término "secuencias de control" se define en la presente para incluir todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o foránea a la secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido. Dichas secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, una secuencia de poliadenilación líder, una secuencia pro-péptido, un promotor, una secuencia de señal de péptido, y un terminador de transcripción. Cuando menos, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de detención de transcripción y de traducción. Las secuencias de control pueden ser provistas con enlazadores para los propósitos de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la ligación de las secuencias de control con la región de codificación de la secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido. Operablemente enlazado: El término "operablemente enlazado" denota en la presente una configuración en donde la secuencia de control se coloca en una posición apropiada con relación a la secuencia de codificación de la secuencia de polinucleótido de tal forma que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia de codificación de un polipéptido. Secuencia de codificación: Cuando se utiliza en la presente el término "secuencia de codificación" significa una secuencia de nucleótido, que directamente especifica la secuencia de aminoácido de su producto de proteína. Los límites de la secuencia de codificación generalmente se determinan a través de un marco de lectura abierto, que usualmente inicia con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG o TTG. La secuencia de codificación puede ser una secuencia de ADN, ADNc, o de nucleótido recombinante .

Expresión: El término "expresión" incluye cualquier paso involucrado en la producción del polipéptido incluyendo, pero no limitándose a, transcripción, modificación posttranscripción, traducción, modificación post-traducción, y secreción. Vector de expresión: El término "vector de expresión" se define en la presente como una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención, y que está operablemente enlazada a nucleótidos adicionales para proporcionar su expresión . Célula hospedera: El término "células hospedera" como se utiliza en la presente incluye cualquier tipo de célula que sea susceptible de transformación, transíección , transducción, y similar con una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la presente invención. Modificación: El término "modificación" significa en la presente cualquier modificación química del polipéptido que consiste de los aminoácidos 1 a 558 de SEC ID NO: 2, así como cualquier manipulación genética del ADN que codifica los polipéptidos . La(s) modificación ( s ) puede ser sustitución ( es ) , eliminación (es ) y/o inserción ( es ) del aminoácido ( s ) , así como reemplazo (s) de la cadena (s) lateral del aminoácido. Variante artificial: Cuando se utiliza en la presente, el término "variante artificial" significa un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa producida por un organismo que expresa una secuencia de nucleótido modificada de SEC ID NOS: 1 (ADN genómico) o 3 (ADNc) . La secuencia de nucleótido modificada se obtiene a través de la intervención humana mediante la modificación de la secuencia de nucleótido descrita en SEC ID NO: 1 ó 3.

Descripción detallada de la invención Polipéptidos que tienen Actividad de Glucoamilasa En un primer aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos que una secuencia de aminoácido que tiene un grado de identidad de aminoácido 1 a 558 de SEC ID NO: 2 (es decir, polipéptido maduro). En una modalidad el polipéptido es una variante que comprende una sustitución, eliminación, y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 558 de SEC ID NO: 2. En una modalidad la secuencia de aminoácido tiene actividad de glucoamilasa y es por lo menos 60%, preferiblemente al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 96%, aún más preferiblemente al menos 97%, aún más preferiblemente al menos 98%, aún más preferiblemente al menos 99%, idéntica a la parte madura de SEC ID NO: 2 (en lo sucesivo "polipéptidos homólogos). En un aspecto preferido, los polipéptidos homólogos tiene una secuencia de aminoácido que difiere en 10 aminoácidos, preferiblemente en 5 aminoácidos, más preferiblemente en 4 aminoácidos, aún más preferiblemente en 3 aminoácidos, más preferiblemente en 2 aminoácidos, y aún más preferiblemente en 1 aminoácidos de los aminoácidos 1 a 558 de SEC ID NO: 2. Un polipéptido de la presente invención preferiblemente comprende las secuencias de aminoácido maduras de SEC ID NO: 2, o variantes alélicas de las mismas; o fragmentos de los mismas que tienen actividad de glucoamilasa , por ejemplo, el dominio catalítico. Dominio Catalítico En un aspecto, la invención se refiere a polipéptidos que comprenden la región/dominio catalítico de las secuencias de aminoácido de SEC ID NO: 2. La región/dominio catalítico de la invención exhibe actividad de glucoamilasa, preferiblemente derivada de una cepa de Peniophora , especialmente una cepa de preferiblemente Peniophora rufomarginata, localizada en los aminoácidos 1 a 448 en SEC ID NO: 2. En una modalidad la región puede considerarse incluyendo una región enlazadora de aminoácidos 449 a 463 de SEC ID NO: 2, o parte de la misma. El dominio de enlace putativo se codifica a través de los polinucleótidos 1845 a 2301 en SEC ID NO: 1, o los polinucleótidos 1450-1734 de SEC ID NO: 3. En una modalidad preferida la invención se refiere a una región catalítica que tiene por lo menos 60% de identidad, preferiblemente al menos 65% de identidad, más preferiblemente al menos 70% de identidad, más preferiblemente al menos 75% de identidad, más preferiblemente al menos 80% de identidad, más preferiblemente al menos 85% de identidad, más preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, más preferiblemente al menos 96% de identidad, aún más preferiblemente al menos 97% de identidad, aún más preferiblemente al menos 98% de identidad, aún más preferiblemente al menos 99% de identidad, especialmente 100% de identidad a los aminoácidos la 448 en SEC ID NO: 2, y en donde tiene actividad de glucoamilasa (en lo sucesivo "polipéptidos homólogos"). En un aspecto preferido, las regiones catalíticas homologas tienen secuencias de aminoácido que difieren en 10 aminoácidos preferiblemente en 5 aminoácidos, más preferiblemente en 4 aminoácidos, aún más preferiblemente en 3 aminoácidos, más preferiblemente en 2 aminoácidos, y aún preferiblemente en 2 aminoácidos de los aminoácidos 1 a 448 de SEC ID NO: 2. Dominio de Enlace En otro aspecto, la invención se refiere a polipéptidos que tienen afinidad de enlace a carbohidrato, preferiblemente afinidad de enlace a almidón. El dominio de unión en la glucoamilasa Peniophora rufomarginata se localiza de los aminoácidos 464 a 558 de SEC ID NO: 2, y se codifica por los polinucleótidos 1845-2301 en SEC ID NO: 1 o 1450-1734 de SEC ID NO: 3. En consecuencia en este aspecto la invención se refiere a un polipéptido que tiene una afinidad de unión a carbohidrato seleccionada del grupo que consiste: (a) i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos 464 a 558 de SEC ID NO: 2; (b) un polipéptido que se codifica mediante una secuencia de nucleótido que hibridiza bajo condiciones de rigor bajas con una sonda de polinucleótido que tiene la estructura de cadena complementaria de los nucleótidos 1845 a 2301 de SEC ID NO: 1 o los nucleótidos 1450 a 1734 de SEC ID NO. 3, respectivamente. (c) un fragmento de (a) o (b) que tiene afinidad de unión a carbohidrato. En una modalidad preferida, la afinidad de unión a carbohidrato es afinidad de unión a almidón. En una modalidad preferida la invención se refiere a un polipéptido que tiene afinidad de unión a carbohidrato que tiene por lo menos 60% de identidad, preferiblemente al menos 70% de identidad, más preferiblemente al menos 75% de identidad, más preferiblemente al menos 80% de identidad, más preferiblemente al menos 85% de identidad, más preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, más preferiblemente al menos 96% de identidad, aún más preferiblemente al menos 97% de identidad, aún más preferiblemente al menos 98% de identidad, aún más preferiblemente al menos 99% de identidad, especialmente 100% de identidad a los aminoácidos a los aminoácidos 464 a 558 en SEC ID NO: 2. En un aspecto preferido, los dominios de unión homólogos tienen secuencias de aminoácidos que difieren en 10 aminoácidos, preferiblemente en 5 aminoácidos, más preferiblemente en 4 aminoácidos, aún más preferiblemente en 3 aminoácidos, más preferiblemente en 2 aminoácidos y aún más preferiblemente en 1 aminoácido de los aminoácidos 464 a 558 de SEC ID NO: 2. La invención también se refiere a un polipéptido que tiene afinidad de unión a carbohidrato, en donde el polipéptido es una variante artificial que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos una sustitución, eliminación y/o inserción de un aminoácido cuando se compara con aminoácidos 464 a 558 de SEC ID NO: 2. La invención también se refiere a un polipéptido que tiene afinidad de unión a carbohidrato, en donde el polipéptido es una variante artificial que comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos una sustitución, eliminación y/o inserción de un aminoácido cuando se compara con la secuencia de aminoácido codificada por el dominio de unión a carbohidrato que codifica parte de las secuencias de polinucleótidos mostradas en las posiciones 1845-2301 en SEC ID NO:l o 1450 a 1734 en SEC ID NO: 3. Híbridos Las glucoamilasas o regiones catalíticas de la invención se pueden enlazar, a través de una secuencia enlazadora o directamente, a uno o más dominios de unión foráneos (también referidos como módulos de unión (CBM) ) . Un dominio de unión "foráneo" es un dominio de unión que se deriva de la glucoamilasa de tipo silvestre de la invención. El dominio de unión es preferiblemente un dominio de unión de carbohidrato (es decir, que tiene una afinidad para la unión a un carbohidrato) , especialmente un dominio de unión a almidón o un dominio de unión a celulosa. Los dominios de unión preferidos son de origen fúngico o bacteriano. Los ejemplos de dominios de unión a almidón específicamente contemplados se describen en WO 2005/003311, que se incorpora aquí por referencia . En una modalidad preferida el enlazador en una glucoamilasa de la invención está reemplazado por un enlazador más estable, es decir, un enlazador que es más difícil de cortar que el enlazador padre. Esto se hace para evitar que el dominio de unión se divida. Los enlazadores estables específicamente contemplados incluyen el enlazador Aspergillus kawachii: TTTTTTAAAT STSKATTSSSSSSAAATTSSS (SEC ID NO: 4) De esta forma, en una modalidad preferida de la invención se refiere a una glucoamilasa híbrida que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en SEC ID NO: 2, en donde el enlazador nativo localizado de los aminoácidos 449 a 463 de SEC ID NO: 2, o partes de los mismos, se reemplaza con el enlazador Aspergillus Kawachii mostrado en SEC ID NO: 4. De esta forma, la invención también se refiere a híbridos que consisten de una glucoamilasa de la invención o dominio catalítico de la invención con actividad de glucoamilasa fusionada a un enlazador estable (por ejemplo, el enlazador Aspergillus kawachii) y uno o más dominios de enlace a carbohidrato, por ejemplo, un módulo de enlace a carbohidrato por ejemplo, un módulo de enlace a carbohidrato (CBM) descrito en WO 2005/003311 en la página 5, línea 30 a página 8, línea 12, incorporada aquí por referencia. Hibridación En otro aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa que están codificados por polinucleótidos (i) que hibridizan bajo por lo menos condiciones de bajo rigor, preferiblemente condiciones de rigor medio, más preferiblemente condiciones de rigor medio-alto, aún más preferiblemente condiciones de rigor alto, y más de preferiblemente condiciones de rigor muy alto con una secuencia de nucleótido con los nucleótidos 61 a 2301 de SEC ID NO: 1 (ADN genómico de Peniophora) o los nucleótidos 61 a 1734 de SEC ID NO: 3 (ADNc de Peniophora) o (ii) una secuencia de (i) o (iii) una estructura de cadena complementaria de (i) o (ii) (J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor, New York). Una subsecuencia de SEC ID NOS: 1 ó 3 contiene por lo menos 10 nucleótidos contiguos o preferiblemente por lo menos 200 nucleótidos contiguos. Además, la subsecuencia puede codificar un fragmento de polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa . La secuencia de nucleótido de SEC ID NOS: 1 ó 3, o una subsecuencia de las mismas asi como la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2, o un fragmento de la misma, se puede utilizar para diseñar una sonda de ácido nucleico para identificar y ADN de clon que codifica polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa de cepas de diferentes géneros o especies de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. En particular, dichas sondas se pueden utilizar para la hibridación del genómico o ADNc después de los procedimientos de tinción Southern con el fin de identificar y de aislar el gen correspondiente en el mismo. Dichas sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deberán ser al menos 14, preferiblemente al menos 25, más preferiblemente al menos 35, y más preferiblemente al menos 70 nucleótidos en longitud. Sin embargo, se prefiere que la sonda de ácido nucleico se al menos de 100 nucleótidos. Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico puede ser al menos de 200 nucleótidos, preferiblemente al menos 300 nucleótidos, más preferiblemente por lo menos 400 nucleótidos, o más preferiblemente por lo menos 500 nucleótidos en longitud. Las sondas aún más largas pueden utilizarse, por ejemplo, sondas de ácido nucleico que son al menos de 600 nucleótidos, al menos preferiblemente al menos 700 nucleótidos, más preferiblemente al menos 800 nucleótidos, o más preferiblemente al menos 900 nucleótidos en longitud. Tanto la sonda de ADN como de ARN se puede utilizar. Las sondas típicamente se etiquetan para la detección del gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina, o avidita) . Dichas sondas están abarcadas por la presente invención . Una colección de ADN o de ADNc genómica preparada de dichos otros organismos, puede por consiguiente, clasificarse para ADN que hibridiza con las sondas descritas anteriormente, y que codifica un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa . El ADN genómico u otros ADN de dichos otros organismos se pueden separar a través electroforesis de gel de agarosa o de poliacrilamida u otras técnicas de separación. El ADN de las colecciones o el ADN separado se pueden transferir e inmovilizar en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Con el fin de identificar un clon o ADN que es homólogo con SEC ID NOS: 1 ó 3, o una subsecuencia de la misma, el material portador se utiliza en una tinción Southern . Para propósitos de la presente invención, la hibridación indica que las secuencias de nucleótido hibridizan sondas de ácido nucleico etiquetadas correspondientes a la secuencia de nucleótido mostrada en SEC ID NOS: 1 ó 3. Sus estructuras de cadena complementarias o subsecuencias de las mismas, bajo condiciones de rigor de muy baja a muy alta. Las moléculas a las cuales la sonda de ácido nucleico hibridiza bajo estas condiciones se pueden detectar utilizando la película de rayos X. En una modalidad preferida, la sonda de ácido nucleico son nucleótidos 61 a 2301 de SEC ID NO: 1, o los nucleótidos 61 a 1734 de SEC ID NO: 3. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es una secuencia de polinucleótido que codifica la región catalítica entre los aminoácidos 1-448 de SEC ID NO: 2. En otro aspecto la invención se refiere a sondas de ácido nucleico que codifican el dominio de unión de los aminoácidos 464 a 558 de SEC ID NO: 2. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es el polipéptido maduro que codifica la región de SEC ID NOS: 1 ó 3, respectivamente. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es la parte de las secuencias en el plásmido pENI2516 que codifica los polipéptidos maduros de la invención. El plásmido pENl2616 que está contenido en DSM 18150 de Escherichía coli que codifica polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa . Para sondas largas de por lo menos 100 nucleótidos en longitud, las condiciones de bajo a muy alto rigor se definen como la prehibridación y la hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% de SDS, 200 micro g/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y ya sea 25% de formamida para rigores bajos, 35% de formamida para rigor medio a medio alto o 50% de formamida para rigores altos o muy altos, después de los procedimientos de tinción Southern estándares durante 12 a 24 horas óptimamente. Para sondas largas de por lo menos 100 nucleótidos en longitud, el material portador finalmente se lava tres veces cada una de 15 minutos utilizando 2X SSC, 0.2% de SDS preferiblemente al menos a 50°C (rigor bajo) , más preferiblemente al menos a 55°C (rigor medio) , más preferiblemente al menos a 60°C (rigor medio-alto), aún más preferiblemente a 65°C (rigor alto) y más preferiblemente al menos 70°C (rigor muy alto) .

Para sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos en longitud, las condiciones de rigor se definen como la prehibridación, hibridación, hibridación, y post-hibridación de lavado a aproximadamente 5°C a alrededor de 10°C por debajo del Tm utilizando el cálculo de acuerdo con Botton y MacCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en 0.9 M de NaCl, 0.09 M de Tris-HCl pH 7.6, 6 mM de EDTA, 0.5% de NP-40, IX de solución de Denhardt, un 1 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de fosfato monobásico de sodio, 0.1 mM de ATP y 0.2 mg de ARN de levadura por mililitro siguiendo los procedimientos de tinción Southern estándar. Para sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos en longitud, el material portador se lava una vez en 6X SCC plus 0.1% de SDS durante 15 minutos y dos veces durante 15 utilizando 6X SSC a 5°C a 10°C por debajo del Tm calculado. Bajo condiciones de hibridación que contienen sal, el Tm efectivo es el que el controla el grado de identidad requerido entre la sonda y el ADN enlazada al filtro para un hibridación exitosa. El Tm efectivo puede determinarse utilizando la fórmula siguiente para determinar el grado de identidad requerido por los dos ADN para hibridizar bajo varias condiciones de rigor. Tm efectivo = 81.5 + 16.6 (log [Na+] ) + 0.41 (%G+C) - 0.72 (% de formamida) (ver www . ndsu . nodak . edu/instruct /mcclean/pisc731 /dna/dna 6.htm) Variantes En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a variantes artificiales que comprenden una sustitución, eliminación, y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos en SEC ID NO: 2, o el polipéptido maduro de los mismos. Preferiblemente, los cambios del aminoácido son de naturaleza menor, es decir sustituciones de aminoácido conservadoras o inserciones que no afectan significativamente el plegado y/o actividad a la proteina. Pequeñas eliminaciones, típicamente de 1 a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino- o carboxi-terminal , tales como un residuo de metionina amino-terminal , un pequeño péptido enlazador de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación mediante el cambio de la carga neta a otra función, tal como el tracto de poli-histidina o un epitomo antigénico, o un dominio de unión. Los ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro del grupo aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina) , aminoácidos aromáticos ( fenilalanina , triptófano o tirosina) , aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) . Las sustituciones de aminoácido que generalmente no alteran la actividad especifica son conocidas en la técnica y se despliegan, por ejemplo, por H. Neurath y R. L. Hill. 1979, In, The Proteins, Academic Press. New York. Los intercambios que ocurren más comúnmente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly. Además de los 20 aminoácidos estándares, los aminoácidos no estándares (tal como 4 -hidroxiporlina , 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutirico, isovalina, y alfa-metilserina) se pueden sustituir por residuo de aminoácido de un polipéptido de tipo silvestre, un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no están codificados por el código genético, y aminoácidos no naturales pueden sustituir por residuos de aminoácido. Los "Aminoácidos no naturales" han sido modificados después de la síntesis de proteína, y/o tienen una estructura química en su(s) cadena (s) lateral diferente de la de los aminoácidos estándares. Los aminoácidos no naturales pueden químicamente sintetizarse, y preferiblemente, están comercialmente disponibles, e incluyen ácido pipecólico, ácido tiazolidin carboxílico, dihidroprolina , 3- y -metilprolina , y 3 , 3-dimetilprolina . Alternativamente, los cambios de los aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades físico-químicas de los polipéptidos se alteren. Por ejemplo, los cambios en el aminoácido pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad del sustrato, cambiar el pH óptimo, y similares. Los aminoácidos esenciales en el polipéptido padre se pueden identificar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la técnica anterior, las mutaciones de alanina individuales se introducen en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se ensayan para actividad biológica (es decir, actividad de glucoamilasa ) para identificar los residuos de aminoácido que son críticos para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton y otros, 1996, J. Biol. Chem. 271:4699-4708. El sitio activo de las enzimas u otra interacción biológica también se pueden determinar a través del análisis físico de la estructura, como se determina por dichas técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrón, o marcación de fotoafinidad, en conclusión con la mutación de los aminoácidos del sitio de contacto putativo. Ver, por ejemplo, de Vos y otros, 1992, Science 255: 306-312, Smith y otros, 1992, J. Mol. Buik, 224:899-904; Wlodaver y otros., 1992, FEBS Lett . 309:59-64. Las identidades de los aminoácidos esenciales también se pueden inferir del análisis de las identidades con polipéptidos que están relacionados con un polipéptido de acuerdo con la invención. Las sustituciones de aminoácido individuales o múltiples se pueden hacer probar utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación, y/o de cambio de sitio, seguido por un procedimiento de clasificación relevante tales como aquellos descritos por Reodhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden utilizar incluyen PCR propenso al error, despliegue de fago (por ejemplo, 92/06204), y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire y otros, 1986, Gene 46:145; Ner y otros, 1988, DNA 7 : 127) . Los métodos de mutagénesis/cambio de sitio se pueden combinar con métodos de clasificación automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de los polipéptidos mutagenizados, clonados expresados por las células hospederas. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células hospederas y rápidamente secuenciar utilizando métodos estándares en la técnica. Estos métodos permiten la rápida determinación de la importancia de los residuos de aminoácido individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida.

El número total de sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos en la posición 1 a 558 de SEC ID NO: 2, es 10, preferiblemente 9, más preferiblemente 8, más preferiblemente 7, más preferiblemente cuando mucho 6, más preferiblemente cuando mucho 5, más preferiblemente 4, aún más preferible 3, más preferiblemente 2, y aún más preferiblemente 1. Fuentes de Polipéptidos que tienen Actividad de Glucoamilasa Un polipéptido de la presente invención se puede obtener de microorganismos de cualquier género. Para propósitos de la presente invención, el término "obtenido de" se utiliza en la presente en conexión con una fuente dada que debía significar que el polipéptido codificado por una secuencia de nucleótido se produce a través de la fuente en donde la estructura de cadena en donde la secuencia de nucleótido de la fuente ha sido insertada. En un aspecto preferido, el polipéptido obtenido de una fuente dada se secreta extracelularmente . En una modalidad preferida, la glucoamilasa de la invención se deriva de la clase Basidiomyceles . En una modalidad más preferida una glucoamilasa de la invención se deriva de una cepa del género Peniophora , más preferiblemente de una cepa de las especies Peniophora refomarginata, o depositado como Escherichia coli o depositado como el clon DSM18150 de Escherichia coli.

Se entenderá que para las especies antes mencionadas, la invención abarca tanto los estados perfectos como imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo anamorfos, independientemente del nombre de las especies a través de las cuales se conocen. Los expertos en la técnica fácilmente reconocerán la identidad de los equivalentes apropiados. La cepa Peniophora refomarginata se recolectó en Dinamarca en 1997. Además, dicho polipéptidos pueden identificarse y obtenerse de otras fuentes incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, tierra, composta, agua, etc.) utilizando las sondas antes mencionadas. Las técnicas para aislar microorganismos de sus hábitats naturales son bien conocidas en la técnica. El polinucleótido después se puede obtener mediante clasificación similar a la colección genómica o de ADNc de otro microorganismo. Una vez que la secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido ha sido detectada con la(s) sonda (s) el polinucleótido puede aislarse o clonarse utilizando técnicas que son bien conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, Sambrook y otros, 1989, supra). Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión divisibles en donde se fusiona otro polipéptido en el término N o en el término C del polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado se produce a través de la fusión de una secuencia de nucleótido (o una porción de la misma) que codifica otro polipéptido a una secuencia (o una porción de la misma) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas en la técnica, e incluyen la ligación de las secuencias de codificación que codifican los polipéptidos de tal forma que están una estructura y que la expresión del polipéptido fusionado está bajo el control del mismo promotor (s) y terminador. Polinucleótidos La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que tienen una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. En un aspecto preferido, la secuencia de nucleótido se establece en cualquiera de SEC ID NO: 1 (ADN genómico) o 3 (ADNc) , respectivamente. En otro aspecto más preferido, la secuencia de nucleótido es la secuencia contenida en el plásmido pENI2516 que está contenido en DSM 18150 de Escherichia coli. En otro aspecto preferido, la secuencia de nucleótido es la región de codificación del polipéptido maduro de cualquiera de las SEC ID NO: 1 ó 3, respectivamente. La presente invención también abarca secuencias de nucleótido que codifican un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2 o el polipéptido maduro del mismo, que difiere de SEC ID NO: 1 ó 3, respectivamente, en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se refiere a subsecuencias de cualquiera de SEC ID NOS: 1 ó 3, respectivamente, que codifica al fragmento de SEC ID NO: 2, que tienen actividad de glucoamilasa . La presente invención también se refiere a polinucleótidos mutantes que comprende por lo menos una mutación de la secuencia de codificación del polipéptido maduro de cualquiera de SEC ID NOS 1 ó 3, respectivamente, en donde la secuencia del nucleótido mutante codifica un polipéptido que consiste de los aminoácidos 1 a 558 de SEC ID NO: 2. Las técnicas utilizadas para aislar o clonar un polinucleótido que codifica un polipéptido son conocidos en la técnica e incluyen el aislamiento del ADN genómico, la preparación del ADNc o una combinación de éstos. La clonación de los polinucleótidos de la presente invención de dicho ADN genómico se puede efectuar, por ejemplo, a través del uso de la reacción de cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) bien conocida o la clasificación del anticuerpo de las colecciones de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados, con características estructurales compartidas. Ver, por ejemplo, Innis y otros, 1990, PCR: A Guide to Methods and Application. Academic Press. Press. New York. Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico tales como la reacción de cadena de ligasa (LCR, por sus siglas en inglés), transcripción activada ligada (LAT, por sus siglas en inglés) y la amplificación a base de secuencia de nucleótido (NASBA, por sus siglas en inglés) se pueden utilizar. Los polinucleótidos se pueden clonar de cualquier organismo, especialmente una cepa del género Peniophora u otros organismos relacionados y de esta forma, por ejemplo, puede ser una variante alélicas o de especie de la región que codifica al polipéptido de las secuencias de nucleótido. La presente invención también se refiere a polinucleótidos que tienen secuencias nucleótido que tienen un grado de identidad con la secuencia de codificación del polipéptido maduro de SEC ID NO: 1 (es decir, nucleótidos 61 a 2301) o SEC ID NO: 3 (es decir, nucleótidos 61 a 1734), respectivamente, o al menos 60%, preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente 96%, aún más 97%, aún más 98%, y más preferiblemente al menos 99% de identidad, que codifica un polipéptido activo. La modificación de una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de los polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas de polipéptido no de existencia natural. Estos polipéptidos pueden diferir en alguna forma de modificación del polipéptido aislado de su origen nativo, por ejemplo, variantes artificiales que difieren en actividad especifica, termo estabilidad, pH óptimo o similar. La secuencia variable puede construir sobre las bases de una secuencia de nucleótido presentada como la región de codificación del polipéptido maduro de cualquiera de SEC ID NOS: 1 ó 3, respectivamente, por ejemplo, subsecuencias de los mismos, y/o a través de una introducción de las sustituciones del nucleótido, que no dan origen a otra secuencia de aminoácido del polipéptido codificado con la secuencia de nucleótido, pero que corresponde al uso del codón del organismo hospedero previsto para la prevención de la enzima, o a través de la introducción de las sustituciones del nucleótido que pueden dar origen a una secuencia de aminoácido diferente. Para una descripción general de la sustitución del nucleótido, ver, por ejemplo, Ford y otros, 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107. Será evidente para los expertos en la técnica que dichas sustituciones se pueden hacer afuera de las regiones criticas para la función de la molécula y aún dar como resultado un polipéptido activo. Los residuos de aminoácido esenciales para la actividad del polipéptido codificado por un polinucleótido aislado de la invención, y por consiguiente preferiblemente no sujeto a sustitución, puede identificarse de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigido al sitio o a mutagénesis de exploración de alanina (por ejemplo, Cunningham and Wells, 1989, Science 244; 1081-1085) . En la técnica anterior, las mutaciones se introducen en cada recibo positivamente cargado en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se ensayan para actividad de glucoamilasa para identificar los residuos de aminoácido que son críticos a la actividad de la molécula. Los sitios de interacción de sustrato-enzima también se pueden determinar a través del análisis de la estructura tridimensional como se determina por dichas técnicas como análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcación de fotoafinidad (ver, por ejemplo, de Vos y otros, 1992, Science 255: 306-312, Smith y otros, 1992, Journal of Molecular Biology, 224:899-904; Wlodaver y otros., 1992, FEBS Letters 309: 59-64) . La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido de la presente invención, (i) que hibridizan bajo condiciones de bajo rigor, más preferiblemente condiciones de rigor medio, más preferiblemente condiciones de rigor medio-alto, aún más preferiblemente condiciones de alto rigor, y más preferiblemente condiciones de muy alto rigor con nucleótidos 61 a 2301 de SEC ID NO: 1 o los nucleótidos 61 a 1734 de SEC ID NO: 3, respectivamente, o (ii) una cepa complementaria de (i); o variantes alélicas y subsecuencias de los mismos (Sambrook y otros, 1989, (supra); como se definió aqui. La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados obtenidos a través de (a) la hibridación de una población de ADN bajo condiciones de rigor bajas, medias, medias-altas, altas o muy altas con (i) los nucleótidos 61 a 2301 de SEC ID NOl o los nucleótidos 61 a 1734 de SEC ID NO: 3, respectivamente, o (ii) una cepa complementaria de (i); y (b) aislar el polinucleótido hibridizante, que codifica un polipéptido que tiene la actividad de glucoamilasa . Construcciones de Acido Nucleico La presente invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido aislado de la presente invención operablemente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia de codificación en una célula hospedera adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de la presente invención puede manipularse en una variedad de formas para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia de polinucleótido antes de su iniciación en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar las secuencias de polinucleótido utilizan los métodos de ADN recombinante son bien conocidos en la técnica. La secuencia de control puede ser una secuencia promotor apropiada, una secuencia de nucleótido que se reconoce por la célula hospedera por la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. La secuencia promotora contiene secuencias de control de transcripción que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótido que muestra la actividad de transcripción en la célula hospedera de elección incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y puede obtenerse de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sea homólogos o heterólogos a la célula hospedera. Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedera fúngica filamentosa son los promotores obtenidos de los genes para Aspergillus orizae TAKA amilasa, Rhizomucor miehei proteinasa aspártica, Aspergillys Niger alfa-amilasa neutral, Aspergillus niger alfa-amilasa estable ácida, Aspergillus niger o Aspergillus awamori glucoamilasa (glaA) , Rhizomucor miehei lipasa, Aspergillus orizae proteasa alcalina, Aspergillus orizae triosa fosfato isomerasa, Aspergillus nidulans acetamidasa , Fusarium venenalum glucoamilasa (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900) , Fusarium venenatum Quinn ( O 00/56900), Fusarium oxysporum proteasa de tipo tripsina (WO 96/00787), Trichoderma reesei beta-glucosidasa , Trichoderma reesei celobiohidrolasa I, Trichoderma reesei endoglucanasa I, Trichoderma reeselendoglucanasa II, Trichoderma reesei endoglucanasa III, Trichoderma reesei endoglucanasa IV. Trichoderma ressei endoglucanasa V, Trichoderma reesei xilanasa I, Trichoderma reesei xilanasa II, Trichoderma reesei beta-xilosidasa, asi como el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para Aspergillus niger alfa-amilasa neutral y Aspergillus oryzae triosa fosfato isomerasa); y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos. En un hospedero de levadura, los promotores útiles se obtienen de los géneros para Saccharomuces cerevisiae enolasa (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae galactocinasa (GAL1), Saccharomyces cerevisiae alcohol de deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP) , Saccharomuces cerevisiae triosa fosfato isomerasa (TPI), Saccharomyces cervisíae metalotionina (CUP) , y Saccharomyces cerevisiae 3-fosfoglicerato de cinasa. Otros promotores útiles para células hospederas de levadura se describen en Romanos y otros, 1992, Yeast 8:423-488.

La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula hospedera para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está operablemente enlazada al término 3' de la secuencia de nucleótido que codifica al polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula hospedera de elección puede utilizarse en la presente invención. Los terminadores preferidos para células hospederas fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para Aspergillus oryzae TAKA amilasa, Aspergillus niger glucoamilasa, Aspergillus nidulans antranilato sintasa, Aspergillus niger alfa-glucosidasa , y Fusarium oxisporum proteasa de tipo tripsina. Los terminadores preferidos para células hospederas de levadura se obtienen de los genes para Sa echaromyees cerevisiae enolasa, saccharomyees cerevisiae citocromo C (CYC1), y Saccharomyees cerevisiae gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa . Otros terminadores útiles para células hospederas de levadura se describen en Romanos y otros, 1992, supra . La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de una ARNm que es importante para la traducción a través de la célula hospedera. La secuencia líder está operablemente enlazada al término 5' de la secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia líder que es funcional en la célula hospedera de elección puede utilizarse en la presente invención . Los líderes preferidos para células hospederas fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para Aspergillus orizae TAKA amilasa y Aspergillus nidulans triosa fosfato isomerasa. Los líderes adecuados para células hospederas de levadura se obtienen de los genes para Saccharomyces cerevisiae enolasa (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae 3-fosfoglicerato cinasa, Saccharomyces cerevisiae alfa-factor, y Saccharomyces cerevisiae alcohol de deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) . La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilacion, una secuencia operablemente enlazada al término 3' y una secuencia de nucleótido y la cual, cuando se transcribe, es reconocida por la célula hospedera como una señal para agregar residuos de poliadenosina al ARNm transcrita. Cualquier secuencia de poliadenilacion que es funcional en la célula hospedera de elección puede utilizarse en la presente invención. Las secuencias de poliadenilacion preferidas para células hospedera fúngicas filamentosas se obtienen de los 4 genes para Aspergillus orizae TAKA amilasa, Aspergillus niger glucoamilasa glucoamilasa , Aspergillus nidulans antranilato sintasa, Fusarium oxisporum proteasa de tipo tripsina, y Aspergillus Nigel alfa-glucidasa . Las secuencias de poliadenilación útiles para células hospederas de levadura se describen en Gluo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15:5983-5990. La secuencia de control también puede ser un péptido de señal que codifica la región que codifica una secuencia de aminoácido enlazada al término amino de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado en la trayectoria de secreción de la célula. El extremo 5' de la secuencia de codificación de la secuencia de nucleótido puede inherentemente contener una región de codificación de péptido de señal naturalmente enlazada en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región de codificación que codifica el polipéptido secretado. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia de codificación puede contener una región de codificación del péptido de señal que es foráneo a la secuencia de codificación. La región de codificación del péptido de señal foránea puede requerirse cuando la secuencia de codificación no contiene naturalmente una región de codificación de péptido de señal. Alternativamente, la región de codificación del péptido de señal foránea puede simplemente reemplazar la región de codificación del péptido de señal natural con el fin de mejorar la secreción del polipéptido. Sin embargo, cualquier región de codificación de péptido de señal que dirige el polipéptido expresado en la trayectoria de secreción de la célula hospedera de elección puede utilizarse en la presente invención. Las regiones de codificación de péptido de señal efectivas para células hospedera fúngicas filamentosas son las regiones de codificación de péptido de señal obtenidas de los genes Aspergillus oryzae TAKA amilasa, Aspergillus niger amilasa neutral, Aspergillus niger glucoamilasa, Rhizomucor miehel proteinasa aspártica, Humicola isolens celulasa, y Humicola lanuginosa lipasa. Los péptidos de señal útiles para células hospederas de levadura se obtienen de los genes para Saccharo yces cerevisiae factor alfa y Saccharomyces cerevisiae invertasa. Otras elecciones de codificaciones de péptido de señal útiles se describen en Romanos y otros, 1992, supra. La secuencia de control también puede ser una región de codificación de propéptido que codifica una secuencia de aminoácido colocada en el término amino de un polipéptido. El polipéptido resultante es conocido como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un polipéptido está generalmente inactivo y puede convertirse en un polipéptido activo maduro a través división catalítica o autocatalítica del propéptido a partir del propolipéptido. La región de codificación del propéptido se puede obtener de los genes para Bacillus subtilis proteasa alcalina (AprE) , Bacíllus subtilis proteasa neutral (North) , Saccharomyces cerevisiae factor alfa, Rhizomucor miehel proteinasa aspártica, y Myceliophthora thermophila lacasa (WO 95/33836) . Cuando ambas regiones de péptido y propéptido de señal están presente en el término amino de un polipéptido, la región de propéptido se coloca en seguida del término amino de un polipéptido y la región de péptido de señal se coloca en seguida del término amino de la región de propéptido. También puede ser deseable adicionar secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido con relación al crecimiento de la célula hospedera. Los ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causan la expresión del gen a ser activado o desactivado en respuesta a un estimulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. En levadura, el sistema ADH2 o el sistema GAL1 se pueden utilizar. En el hongo filamentoso, el promotor alfa-amilasa TAKA, el promotor Aspergillus niger de glucoamilasa , y el promotor Aspergillus oryzae de glucoamilasa pueden utilizarse como secuencias reguladora. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación del gen. En sistemas eucarióticos , estas incluyen el gen de reductasa de hidrofolato que se amplifica en la presencia de metotrexato y los genes de raetalotioenina que se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido estaría operablemente enlazada a la secuencia reguladora. Vectores de Expresión La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor, y señales de detención de transcripción y traducción. Las varias secuencias de ácido nucleico y de control descritas anteriormente, pueden unirse para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido en dichos sitios. Alternativamente, una secuencia de nucleótido de la presente invención puede expresarse a través de la inserción de la secuencia de nucleótido o una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia de codificación se localiza en el vector de tal forma que la secuencia de codificación está operablemente enlazada a las secuencias de control apropiadas para la expresión . El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede convenientemente someterse a procedimientos de ADN recombinantes y puede producir la expresión de la secuencia de nucleótido. La selección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula hospedera en donde el vector se va a introducir. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados. El vector puede ser un vector de replicación autónomo, es decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación de la cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma , o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la auto-replicación . Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedera, se integra en el genoma y replica junto con el (los) cromosoma (s) dentro del cual ha sido integrado. Además, un vector individual o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen en ADN total a ser introducido en el genoma de la célula hospedera, o un transposon puede utilizarse. Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores que permiten la fácil selección de las células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen el producto del cual proporciona un biocida o resistencia viral, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares. Los ejemplos de marcadores adecuados para células hospederas de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Los marcadores adecuados para utilizarse en una célula hospedera fúngica filamentosa incluye, pero no se limitan a, amdS ( acetamidasa ) , argB (ornitina carbamoiltransferasa) , bar ( fosfinotricin acetiltransferasa ) , hph (higromicin fosfotransferasa ) , niaD (nitrato reductasa) , pyrG (orotidin-5' -fosfato de decarboxilasa ) , Se (sulfato adeniltransfersa ) , y trpC (antranilato sintasa), asi como equivalentes de los mismos. El preferido para utilizarse en la célula Aspergillus son los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus . Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen un (unos) elemento (s) que permite la integración del vector dentro del genoma de la célula hospedera o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma. Para la integración dentro del genoma de la célula hospedera, el vector puede basarse en la secuencia de codificación del polinucleótido al péptido o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma a través de la recombinación homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleótido adicionales para dirigir la integración a través de la combinación homologa dentro del genoma de la célula hospedera en una (s) ubicación (s) precisa en el (los) cromosoma ( s ) . Para incrementar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deberán preferiblemente contener una cantidad suficiente de ácidos nucleicos, tales como de 100 a 10,000 pares base, preferiblemente de 400 a 10,000 pares base, y más preferiblemente de 800 a 10,000 pares base, que tienen un alto grado de identidad con la secuencia objetivo correspondiente para mejorar la probabilidad de la recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que es homologa con la secuencia objetivo en el genoma de la célula hospedera. Además, los elementos de integración pueden secuencias de nucleótido no de codificación o codificación, Por el otro lado, el vector puede integrarse dentro del genoma de la célula hospedera a través de recombinación no homologa. Para la replicación autónoma, el vector además puede comprender un origen de replicación que permite que el vector replique autónomamente en la célula hospedera en cuestión. El origen de la replicación puede ser cualquier replicación autónoma mediada por el replicador de plásmido que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" se define en la presente como una secuencia de nucleótido que permite que un plásmido o vector repliquen in vivo.

Los ejemplos de orígenes de replicación para utilizarse en una célula hospedera de levadura son el origen de replicación 2 mieras ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6. Los ejemplos de orígenes de replicación útiles en la célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANSI (Gems y otros, 1991 Gene 98:61-67; Cullen y otros, 1987, Nucleic Acids Research 15:9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de los plásmidos o vectores comprende el gen que puede lograrse de acuerdo con los métodos descritos en WO 00/24883. Se puede insertar más de una copia de polinucleótido de la presente invención dentro de la célula hospedera para incrementar la producción del producto de gen. Un incremento en el número de copias de los polinucleótidos se pueden obtener a través de la integración de por lo menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la células o a través de la inclusión de un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido en donde las células contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por lo tanto copias adicionales del polinucleótido se pueden seleccionar a través del cultivo de las células en la presencia de un agente seleccionable apropiado. Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son también conocidos por lo expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y otros, 1989, supra) . Células Hospederas La presente invención también se refiere a células hospederas recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención, que ventajosamente se utiliza en la producción recombinante de los polipéptidos . Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una hospedera de tal forma que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o un vector extra-cromosómico de autorreplicación como se describió anteriormente. El término "célula hospedera" abarca cualquier progenie de una célula padre que no es idéntica a la célula padre debido a las mutaciones que ocurren durante la replicación. La selección de la célula hospedera será a tal grado que depende del gen que codifica el polipéptido y su origen . La célula hospedera puede ser una célula eucariótica tal como una célula de mamífero, de insecto, de planta, o fúngica. En un aspecto preferido, la célula hospedera es una célula fúngica. "Hongo" como se utiliza en la presente incluye filo Ascomycota , Basidiomycota , Chytridiomycota , y Zygomycota (como se define por Hawksworth y otros, en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a. edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) asi como Oomycota (como se cita en Hawksworth y otros, 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth y otros, 1995, supra). En un aspecto más preferido, la célula hospedera fúngica es una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza en la presente incluye la levadura del género ascosporogénico {Endomycetales) , levadura del género basidiospórica , y levadura que pertenece al hongo imperfecto (Blastomycetos) . Ya que la clasificación de la levadura puede cambiar en el futuro, para el propósito de esta invención, la levadura deberá definirse como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A. Passmore, S. M . , and Davenport, R. R., eds . Soc. App. Bacteriol Symposium Series No. 9, 1980) . En aún un aspecto más preferido, la célula hospedera de levadura es una célula Candida, Hansenula, Kluyveromyces , Pichia, Saccharomyces , Schizosaccharomyces , o Yarrowia. En un aspecto más preferido, la célula hospedera de levadura es una célula Saccharomyces carlsbergensis , Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces diastaticus , Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformes . En otro aspecto más preferido, la célula hospedera de levadura es una célula Klyveromyces lactis. En otro aspecto más preferido, la célula hospedera de levadura es una célula Yarrowia lipolitica.

En otro aspecto más preferido, la célula hospedera fúngica es una célula fúngica filamentosa. "Hongo filamentoso" incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth y otros, 1995, supra). El hongo filamentoso generalmente se caracteriza por una pared de micela compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosán, mañana, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es a través del alargamiento de la hifa y el catabolismo de carbono es obligatoriamente aeróbico. En contraste, el crecimiento vegetativo mediante levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es a través de la reproducción asexual de un tallo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo. En aún otro aspecto más preferido, la célula hospedera fúngica filamentosa es una célula Acremonium , Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera , Ceriporiopsis , Coprinus , Coriolus, Cryptococcus , Filobasidium , Fusarium , Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora , Neocaliimastix , Neurospor, Paecilomyces , Peniciiliu , Phanerochaete, Phtebia, Piromyces , Pleurotus , Schizophyltum , Talaromyces , Thermoascus , Thieiavia, Tolypociadium , Trametes, o Trichoderma . En un aspecto más preferido, la célula hospedera fúngica filamentosa es una célula Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus , Aspergillus foetidus , Aspergillus j aponicus , Aspergillus nidulans , Aspergillus niger, Aspergillus kawachii o Aspergillus oryzae. En otro aspecto más preferido, la célula hospedera fúngica filamentosa es una célula Fusarium bactridioides , Fusarium cerealis , Fusarium crookwellense , Fusarium culmorum , Fusarium graminearum , Fusarium graminum, Fusarium heterosporum , Fusarium negundi , Fusarium oxysporum , Fusarium reticulatum , Fusarium roseum, Fusarium sambucinum , Fusarium sarcochroum , Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum , Fusarium torulosum , Fusarium irichothedoides , o Fusarium venenatum . En otro aspecto más preferido, la célula hospedera fúngica filamentosa es una célula de la cepa Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivuiosa, Ceriporiopsis subrufa, o Ceriporiopsis subvermispora , Coprinus cinereus, Conolus hirsutus, Humicola insotens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Peniciilium purpurogenum , Phanerochaete chrysosporium , Phiebia radiata, Pleurotus eryngii, Thieiavia terrestris, Trameies villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum , Trichoderma reesei, o Trichoderma viride . Las células fúngicas pueden transformarse mediante un procedimiento que involucra la formación de protoplasto, la transformación de los protoplastos , y la regeneración de la pared celular en una forma conocida per se. Los procedimientos adecuados para la trasformación de las células hospederas Aspergillus y Trichoderma se describen en EP 238 023 and Yelton y otros, 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81; 1470-1474. Los métodos adecuados para transformar las especies Fusarium se describen por Malardier y otros, 1989, Gene 78: 147-158, y WO 96/00787. La levadura puede ser transformada utilizando los procedimientos descritos por Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simón, MJ. , editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito y otro, 1983. Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen y otros, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920. Métodos de Producción La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende (a) cultivar una célula, que está en su forma de tipo silvestre capaz de producir el polipéptido, bajo condiciones conductivas para la producción del polipéptido; (b) recuperar el polipéptido. Preferiblemente, la célula es una cepa del género Peniophora , más preferiblemente una cepa de las especies Peniophora rufomarginata. La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende (a) cultivar una célula hospedera bajo condiciones conductivas para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende (a) cultivar una célula hospedera bajo condiciones conductivas para la producción del polipéptido, en donde la célula hospedera comprende una secuencia de nucleótido que tiene la región de codificación de polipéptido madura de SEC ID NOS: 1 ó 3, respectivamente, en donde la secuencia de nucleótido codifica un polipéptido que consiste de los aminoácidos 1 a 558 de SEC ID NO: 2, y (b) recuperar el polipéptido . En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción del polipéptido utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar a través de cultivo de matraz de agitación, o fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas de lote, de alimentación por lote, o de estado sólido) en laboratorio o fermentadores industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten el polipéptido se exprese y/o se aisle. El cultivo toma lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, en los catálogos de la colección de cultivo de tipo americano) . Si el polipéptido se secreta en un medio nutriente, el polipéptido puede recuperarse directamente del medio. Si el polipéptido no se secreta, puede recuperarse de los lisatos de célula. Los polipéptidos pueden detectarse utilizando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto de enzima, o la desaparición de un sustrato de enzima. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo de enzima para determinar la actividad del polipéptido como se describe en la presente. El polipéptido resultante se puede recuperar utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede recuperarse del medio nutriente a través de procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitándose a, centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación, o precipitación. Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar a través de una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitándose a, cromatografía (por ejemplo, intercambio de ión, afinidad, hidrofóbico, cromatoenfoque, y exclusión de tamaño) , procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato de amonio) , SDS-PAGE, o extracción (ver, por ejemplo, purificación de Proteina, J-C Janson and Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989). Plantas La presente invención también se refiere a plantas transgénicas , partes de plantas, o células vegetales que han sido transformadas por una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa de la presente invención para asi expresar y producir el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido se puede recuperar de la planta o de la parte vegetal. Alternativamente, la planta o la parte vegetal que contienen el polipéptido recombinante se pueden utilizar como tales para mejorar la calidad de un alimento o alimentación, por ejemplo, mejorando el valor nutricional, la palatabilidad, y las propiedades biológicas, o para destruir un factor anti-nutriente. La planta transgénica puede ser una dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot). Los ejemplos de plantas monocotiledóneas son pastos, tales como el pasto de la pradera (pasto azul, Poa) , pasto para forraje tal como Festuca, Lolium, pasto templado, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y maíz (maíz) . Los ejemplos de plantas dicotiledóneas son tabaco, leguminosas tales como lupino, papa, remolacha, chícharo, frijol, frijol de soya y plantas cruciferas (familia Brassicaceae ) , tales como coliflor, semilla de colza y el organismo modelo cercanamente relacionado Arabidopsis thaliana . Los ejemplos de plantas vegetales son el tallo, el callo, las hojas, la raíz, las frutas, las semillas, y los tubérculos así los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo, epidermis, mesófila, parénquima, tejidos vasculares, meristemos. Los compartimentos de célula vegetal específicos, tales como cloroplastos , apoplastos, mitocondria, vacuola, peroxisomas, y citoplasma también se consideran como siendo una parte vegetal. Además, cualquier célula vegetal, sin importar el origen tisular, se considera como siendo un aparte vegetal. Igualmente, las partes vegetales tales como tejidos y células específicos aislados para facilitar la optimización de la invención también se consideran partes vegetales, por ejemplo, embriones, endospermos, aleurona y cubiertos de semillas. También se incluyen dentro del alcance de la presente invención la progenie de dichas plantas, partes vegetales, y células vegetales.

La planta transgénica o célula vegetal que expresa un polipéptido de la presente invención puede construirse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. En breve, la planta o célula vegetal se construye a través de la incorporación de una o más construcciones de expresión que codifican un polipéptido de la presente invención dentro del genoraa hospedero de la planta y propagan la planta o célula vegetal modificada resultante en una planta transgénica o célula vegetal. La construcción de expresión es convenientemente una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención operablemente enlazado a las secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia de nucleótido en la planta o planta vegetal de elección. Además, la construcción puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar las células hospederas dentro de las cuales la construcción de la expresión se ha integrado y las secuencias de ADN necesarias para la introducción de construcción en la planta en cuestión (lo anterior depende del método de introducción de ADN a ser utilizado) . La elección de las secuencias reguladoras, tales como la secuencia promotora y terminadora y opcionalmente secuencias de señal o de tránsito, se determinan, por ejemplo, sobre las base de cuándo, en dónde, y cómo el polipéptido desea ser expresado. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido de la presente invención o puede ser constitutivo o inducible, o puede ser desarróllatele, especifico de etapa o de tejido, y el producto de gen pueden activarse a un tejido especifico o parte vegetal tales como semillas u hojas. Las secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague y otros, 1988, Plant Physiology 86:506. Para la expresión constitutiva, el promotor 35S-CaMV, ubiquitina 1 de maíz, y actina 1 de arroz pueden utilizarse (Franck y otros, 1980, Cell 21: 285-294, Christensen y otros, 1992, Plant Mo . Biol. 18: 675-689; Zhang y otros, 1991, Plant Cell 3: 1155-1165) . Los promotores específicos de órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejido de depósito de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de papa, y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann . Rev. Genet 24; 275-303), o de tejidos de depósito metabólico tales como meristemos (Ito y otros, 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico de semilla tal como la glutelina, prolamina, globulina o el promotor de albúmina de raíz (Wu y otros, 1998, Plant and Cell Physiology 39:885-889), un promotor Vicia faba de legumina B4 y el gen de la proteína y semilla desconocida Vicia faba (Conrad y otros, 1998, Journal of Plant Physiology 152:708-711), un promotor de una proteína de cuerpo oleoso de semilla (Chen y otros, 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), el promotor napA de la proteína de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en O 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el promotor rbcs de arroz o jitomate (Kyozuka y otros, 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, el promotor del gen de metiltransferasa de adenina del virus de cólera (Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), o el promotor del gen aldP de raíz (Kagaya y otros, 1995, Molecular and General Genetics 248:668-674), o un promotor inducible de heridas tal como el promotor pin2 de papa (Xu y otros, 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Igualmente, el promotor puede ser inducible a través de tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía, o alteraciones en la salinidad o inducirse a través de una sustancia exogénicamente aplicada que activa el promotor, por ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas de planta tales como etileno, ácido abscísico, y ácido giberélico, y metales pesados. Un elemento mej orador del promotor también puede utilizarse para lograr una expresión mayor de un polipéptido de la presente invención en la planta. Por ejemplo, el elemento mejorador del promotor puede ser un intrón que se coloca entre el promotor y la secuencia de nucleótido y codifica un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu y otros, 1993, supra, describe el uso del primer intrón del gen de actina 1 de arroz para mejorar la expresión. El gen marcador seleccionable y cualquier otra parte de la construcción de expresión pueden seleccionarse de las disponibles en la técnica. La construcción de ácido nucleico se incorpora en el genoma de la planta de acuerdo con técnica convencionales conocidas en la técnica, incluyendo la transformación mediada por Agrobacterium, la transformación mediada por virus, la microinyección, el bombardeo de partículas, la transformación biolística y la electroporación (Gasser y otros, 1990, Science 244: 1293: Potrykus, 1990, Bio/Technology 8:535; Shimamoto y otros, 1989, Nature 338:274). Actualmente, la transferencia de gen mediado por Agrobacterium turnefaciens es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión ver Hooykas and Schilperoort , 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38) y también puede utilizarse para la transformación de monocotiledóneas aunque otros métodos de transformación también se utilizan para estas plantas. Actualmente, el método de elección para la generación de monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (poro microscópico o partículas de tungsteno recubiertas con ADN de transformación) de callo embriónico o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281: Shimamoto, 1994, Current Opinión Biotechnology 5: 158-162; Vasil y otros, 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación del protoplasto como se describe en Omirulleh y otros, 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428. Después de la transformación, los transformantes que han incorporado la construcción de expresión se seleccionan y se regeneran en plantas completas de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Por lo general el procedimiento de transformación se designa para la eliminación selectiva de genes de selección ya sea durante la regeneración o en las siguientes generaciones mediante el uso de, por ejemplo, la co-transformación con dos construcciones de ADN-T separados o excisión especifica de sitio del gen de selección a través de una recombinasa especifica. La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa de la presente invención bajo condiciones conductivas para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. Composiciones La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones se enriquecen en dicho polipéptido. El término "enriquecido" indica que la actividad de glucoamilasa de la composición ha sido incrementa, por ejemplo, a través de un factor de enriquecimiento de 1.1. La composición puede comprender un polipéptido de la presente invención como el componente enzimático principal, por ejemplo, una composición mono-componente.

Alternativamente, la composición puede comprender múltiples actividades enzimáticas, tales como aminopeptidasa , amilasa, carbohidrasa , carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina , glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa , esterasa, alfa-galactosidasa , beta-galactosidasa , glucoamilasa, alfa-glucosidasa , beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinulitica , péptidoglutaminasa , peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa , enzima proteolitica , ribonucleasa , transglutaminasa , o xilanasa. La(s) enzima (s) adicional puede producirse por ejemplo, a través de un microorganismo que pertenece al género Aspergillus , preferiblemente Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus , Aspergillus foetidus , Aspergillus japonicus , Aspergillus nidulans , Aspergillus niger, o Aspergillus oryzae; Fusarium , preferiblemente Fusariu bactridioides , Fusarium cerealis , Fusarium crookwellense , Fusarium culmorum , Fusarium graminearum , Fusarium graminum , Fusarium heterosporuim , Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum , Fusarium roseum, Fusarium sambucinum , Fusarium sarcochroum , Fusarium sulphureum , Fusarium toruloseum , Fusarium trichothecioides , o Fusarium venenatum; Humicola, preferiblemente Humicola insolens o Humicola lanuginosa ; o Trichoderma , preferiblemente Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachsatum , Trichoderma reesei, o Trichoderma viride. Las composiciones de polipéptido se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y pueden estar en la forma de una composición liquida o seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede estar en la forma de un granulado o un microgranulado . El polipéptido a ser incluido en la composición puede estabilizarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Combinación de glucoamilasas y alfa-amilasa ácida De acuerdo con este aspecto de la invención una glucoamilasa de la invención puede combinarse con una alfa-amilasa, preferiblemente alfa-amilasa ácida en una relación de entre 0.3 a 5.0 AFAU/AGU. Más preferiblemente la proporción entre la actividad de la alfa-amilasa ácida y la actividad de la glucoamilasa es al menos 0.35, al menos 0.40, al menos 0.50, al menos 0.60, al menos 0.7, al menos 0.8, al menos 0.9, al menos 1.0, al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.85, o aún al menos 1.9 AFAU/AGU. Sin embargo, la proporción entre la actividad de la alfa-amilasa ácida y la actividad de la glucoamilasa deberán preferiblemente ser menor de 4.5, menor de 4.0, menor de 3.5, menor de 3.0, menor de 2.5 o aún menor de 2.25 AFAU/AGU. En las actividades AUU/AGI de la alfa-amilasa ácida y la glucoamilasa están preferiblemente presentes en una relación de entre 0.4 a 6.5 AUU/AGI. Más preferiblemente la proporción entre la actividad de la alfa-amilasa de ácida y la actividad de la glucoamilasa es de al menos 0.45, al menos 0.50, al menos 0.60, al menos 0.7, al menos 0.8, al menos 0.9, al menos 1.0, al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0, al menos 2.1, al menos 2.2, al menos 2.3, al menos 2.4, o aún al menos 2.5 AUU/AGI. Sin embargo, la proporción entre la actividad de la alfa-amilasa ácida y la actividad de la glucoamilasa es preferiblemente menor de 6.0, menor de 5.5, menor de 4.5, menor de 4.0, menor de 3.5, o aún menor de 3.0 AUU/AGI . La composición anterior es adecuada para utilizarse en un procedimiento de conversión de almidón mencionado más adelante para producir jarabe y productos de fermentación, tales como etanol. Se dan a continuación ejemplos de usos preferidos de las composiciones de polipéptido de la presente invención. La dosificación de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones bajo las cuales la composición se utiliza se utiliza se pueden determinar sobre las bases de métodos conocidos en la técnica. Usos La presente invención también está dirigida a procedimientos/métodos para utilizar los polipéptidos que tiene actividad de glucoamilasa de la invención. Los usos de acuerdo con la invención incluyen la conversión de almidón a por ejemplo, jarabe y productos de fermentación, incluyendo etanol y bebida. Los ejemplos de los procedimientos en donde la glucoamilasa de la invención puede utilizarse incluyen los descritos en WO 2004/081193, WO 2004/080923, WO 2003/66816, WO 2003/66826, y WO 92/20777 las cuales se incorporan aquí por referencia. Producción de Productos de Fermentación Procedimientos para producir productos de fermentación de material que contiene almidón gelatinizado En este aspecto la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un producto de fermentación, especialmente etanol, de un material que contiene almidón, cuyos procedimientos incluyen un paso de licuefacción y secuencial o simultáneamente llevar a cabo la sacarificación y los pasos de fermentación. La invención se refiere a un procedimiento para producir un producto de fermentación de material que contiene almidón que comprende los pasos de: (a) licuar el material que contiene almidón; (b) sacarificar el material licuado obtenido en el paso (a) utilizando una glucoamilasa de la invención; (c) fermentar el material sacarificado utilizando el organismo de fermentación. El producto de fermentación, tal como especialmente etano, puede opcionalmente recuperarse después de la fermentación, por ejemplo, a través de destilación. Los materiales de partida que contienen almidón adecuados se enumeran en la sección "materiales que contienen almidón" en la sección siguiente. Las enzimas contempladas se enumeran en la sección siguiente de "enzima" la licuefacción preferiblemente se lleva a cabo en la presencia de una alfa-amilasa. La fermentación preferiblemente se lleva a cabo en la presencia de levadura, preferiblemente una cepa de Saecharomyees . Los organismo de fermentación adecuados se enumeran en la sección . siguiente de "organismos de fermentación". En modalidades preferidas, el paso (b) y (c) se llevan a cabo secuencial o simultáneamente (es decir, como un procedimiento SSG) . En una modalidad particular, el procedimiento de la invención además comprende, antes del paso (a), los pasos de: x) reducir el tamaño de partícula del material que 7 contiene almidón, preferiblemente a través de molienda; y y) formar una lechada que comprende el material que contiene almidón y agua. La lechada acuosa puede contener de 10-40% en peso, preferiblemente 25-35% en peso de material que contiene almidón. La lechada se calienta por arriba de la temperatura de gelatinización y se puede agregar una alfa-amilasa , preferiblemente una alfa-amilasa bacteriana y/o fúngica ácida, para iniciar la licuefacción (adelgazamiento) . La lechada puede en una modalidad cocinarse a chorro para proporcionar para demás gelatinizar la lechada antes de someterse a la alfa-amilasa en el paso (a) de la invención. Más específicamente, la licuefacción puede llevarse a cabo con un procedimiento de lechada caliente de tres pasos. La lechada se calienta de entre 60-95°C, preferiblemente 80-85°C, y se agrega la alfa-amilasa para iniciar la licuefacción (adelgazamiento) . Después la lechada puede cocinarse a chorro a una temperatura de entre 95-140°C, preferiblemente 105-125°C, durante 1-15 minutos preferiblemente durante 3-10 minutos, especialmente alrededor de 5 minutos. La lechada se enfría a 60-95°C y se agrega más alfa-amilasa para finalizar la hidrólisis (segunda licuefacción). El procedimiento de licuefacción usualmente se lleva a cavo a un pH de 4.5-6.5, en particular a un pH de entre 5 y 6. Los granos completos molidos y licuados son conocidos como una masa.

La sacarificación en el paso (b) se puede llevar a cabo utilizando condiciones bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento de sacarificación completo puede durar hasta de aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas, sin embargo, es común solamente hacer una pre-sacarificación de típicamente 40-90 minutos a una temperatura de entre 30-65°C, típicamente alrededor de 60°C, seguido por una sacarificación completa durante la fermentación en un procedimiento de sacarificación fermentación simultánea (procedimiento SSF) . La sacarificación típicamente se lleva a cabo a temperaturas de 30-65°C, típicamente alrededor 60°C, y a un pH de entre 4 y 5, normalmente alrededor de un pH de 4.5. El procedimiento más ampliamente utilizado en el producto de fermentación, especialmente etanol, la producción es el procedimiento de sacarificación y fermentación simultáneo (SSF), en donde no hay una etapa de control para la tarificación, significando que el organismo de fermentación, tal como la levadura, y la(s) enzima (s) pueden adicionarse juntas. SSF puede típicamente llevarse a cabo a una temperatura entre 25°C y 40°C, tal como entre 20°C y 35°C, tal como entre 30°C y 34°C, tal como alrededor 32°C. De acuerdo con la invención la temperatura puede ajustarse hasta o disminuirse durante la fermentación. De acuerdo con la presente invención el paso de fermentación (c) incluye, sin limitación, los procedimientos de fermentación utilizados para producir alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico) ; cetonas (por ejemplo, cetonas); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico) ; gases (por ejemplo, H2 y C02) ; antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina) ; enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); y hormonas. Los procedimientos de fermentación preferidos incluyen los procedimientos de fermentación de alcohol, que son bien conocidos en la técnica. Los procedimientos de fermentación preferidos son procedimientos de fermentación anaeróbicos, que son bien conocidos en la técnica. Procedimientos para la producción de productos de fermentación que contienen almidón no gelatinizado En este aspecto la invención se refiere a procedimientos para producir un producto de fermentación de un material que contiene almidón sin gelatinización del material que contiene almidón. En una modalidad solamente una glucoamilasa de la invención se utiliza durante la sacarificación la fermentación. De acuerdo con la invención el producto de fermentación deseado, tal como etanol, puede producir sin licuar la lechada acuosa que contiene el material que contiene almidón. En una modalidad un procedimiento de la invención incluye la sacarificación (molienda) del material que contiene almidón, por ejemplo, almidón granular, por debajo de la temperatura de gelatinización en la presencia de una glucoamilasa de la invención para producir azúcares que se pueden fermentar en el producto de fermentación deseado a través de un organismo de fermentación adecuado. El Ejemplo 4 siguiente describe la producción de etanol de maíz molido no gelatinizado (crudo utilizando glucoamilasas de la invención derivadas de Peniphora rufomarginata para una fermentación de un solo paso sola y en combinación con alfa-amilasa . Por consiguiente, en este aspecto la invención se refiere a un procedimiento para producir un producto de fermentación de un material que contiene almidón que comprende : (a) sacarificar el material que contiene almidón con una glucoamilasa que tiene la secuencia mostrada como los aminoácidos 1 a 558 en SEC ID NO: 2, o una glucoamilasa que contiene por lo menos 60% de identidad en el mismo, a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial de dicho material que contiene almidón. (b) fermentar utilizando un organismo de fermentación . Los pasos (a) y (b) del procedimiento de la invención pueden llevarse a cabo secuencial o simultáneamente. En una modalidad una lechada que comprende agua y el material que contiene almidón se prepara antes del paso (a) . El procedimiento de fermentación puede llevarse a cabo durante un periodo de 1 a 250 horas, preferiblemente de 25 a 190 horas, más preferiblemente de 30 a 180 horas, más preferiblemente de 40 a 170 horas, aún más preferiblemente de 50 a 160 horas, aún más preferiblemente de 60 a 150 horas, aún preferible de 70 a 140 horas, y de preferencia de 80 a 130 horas . El término "temperatura de gelatinización inicial" significa la temperatura más baja a la cual la gelatinización del almidón comienza. El almidón calentado en agua inicia a gelatinizarse entre 50°C y 75°C; la temperatura exacta de la gelatinización depende del almidón especifico, y puede fácilmente determinarse con un experto en la técnica. De esta forma, la temperatura de gelatinización inicial puede variar de acuerdo con la especie de planta, con la variedad particular de la especie de planta asi como las condiciones crecimiento. En el contexto de esta invención, la temperatura de gelatinización inicial de un material que contiene almidón dado es la temperatura a la cual se pierde la doble refracción en 5% de los granos de almidón que utilizan el método descrito por Gorinstein, S, y Lii, C, Starch/Starke , Vol. 44 (12) pp . 461-466 (1992) . Antes del paso (a) una lechada de material que contiene almidón, tal como almidón granular, que tiene 10-55% en peso de sólidos secos, preferiblemente 25-40% en peso de sólidos secos, más preferiblemente 30-35% de sólidos secos de material que contiene almidón se puede preparar. La lechada puede incluir agua y/o aguas de procedimiento, tales como depósito (volumen anterior) , agua de torre de lavado, condensado o destilado evaporador, limpiador de agua lateral de destilación, u otra agua de procedimiento de planta de producto de fermentación. Debido a que el procedimiento de la invención se lleva a cabo por debajo de la temperatura de gelatinización y de esta forma no toma lugar un incremento de viscosidad significativo, los altos niveles de depósito puede utilizarse si se desea. En una modalidad la lechada acuosa contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 70% en volumen de depósito, preferiblemente 15-60% de volumen de porcentaje de depósito, especialmente de aproximadamente 30 a 50 de porcentaje en volumen de depósito. El material que contiene almidón puede preparase a través de la reducción del tamaño de partícula, preferiblemente a través de molienda seca o en húmedo, a 0.05 a 3.0 mm, preferiblemente 0.1-0.5 mm. Después de someterse al procedimiento de la invención por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o preferiblemente al menos 99% 7 de los sólidos secos del material que contiene almidón se convierten en un hidrolisato de almidón soluble. El procedimiento de la invención se conduce a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial. Preferiblemente la temperatura en donde lleva a cabo el paso (a) es entre 30-75°C, preferiblemente entre 45-60°C. En una modalidad preferida el paso (a) y el paso (b) se llevan a cabo como un procedimiento de sacarificación y fermentación secuencial o simultánea. En dicha modalidad preferida el procedimiento típicamente se lleva a cabo a una temperatura entre 25°C y 40°C, tal como entre 29°C y 35°C, tal como entre 30°C y 34°C, tal como alrededor 32°C. De acuerdo con la invención la temperatura puede ajustarse hacia arriba o hacia abajo durante la fermentación. En una modalidad la sacarificación y fermentación simultánea se lleva a cabo de tal forma que el nivel de azúcar, tal como el nivel de glucosa, se mantiene a un nivel bajo tal como por debajo de 6% en peso, preferiblemente por debajo de aproximadamente 3% en peso, preferiblemente por debajo de aproximadamente 2% en peso, más preferiblemente por debajo de aproximadamente 1% en peso, aún más de preferencia por debajo de aproximadamente 0.5%, o aún más preferido de 0.25% en peso, tal como por debajo de aproximadamente 0.1% en peso. Dichos bajos niveles de azúcar pueden lograrse simplemente utilizando cantidades ajustadas de enzimas y organismos de fermentación. Un experto en la técnica puede fácilmente determinar que cantidades de enzima y organismos de fermentación utilizar. Las cantidades utilizadas de enzima y organismo de fermentación también pueden seleccionarse para mantener bajas concentraciones de maltosa en el caldo de fermentación. Por ejemplo, el nivel de maltosa puede mantenerse por debajo de aproximadamente 0.5% en peso o por debajo de aproximadamente 0.2% en peso. El procedimiento de la invención puede llevarse a cabo a un pH en la escala de entre 3 y 7, preferiblemente a un pH de 3.5 a 6, o más preferiblemente- un pH de 4 a 5. Materiales que contienen almidón Cualquier material de partida que contiene almidón adecuado, incluyendo almidón granular, puede utilizarse de acuerdo con la presente invención. El material de partida generalmente se selecciona con base en el producto de fermentación deseado. Los ejemplos de materiales de partida que contienen almidón, adecuados para utilizarse en un procedimiento de la presente invención, incluyen tubérculos, raices, tallos, granos completos, maíz, mazorcas, trigo, cebada, centeno, milo, sagú, yuca, tapioca, sorgo, guisante de arroz, frijol, o papas dulces, o mezclas de los mismos, o cereales, materias primas que contienen azúcar, tales como molasas, materiales de fruta, caña de azúcar, remolacha, papas, y materiales que contiene celulosa, tales como residuos de madera o planta, o mezclas de los mimos. Se contemplan tanto los tipos ceroso y no ceroso de maíz y cebada. El término "almidón granular" significa almidón bruto, es decir, almidón en su forma natural encontrada en cereales, tubérculos o granos. El almidón se forma dentro de la célula vegetal como pequeños gránulos insolubles en agua. Cuando se pone en agua, los gránulos de almidón pueden absorber una pequeña cantidad de liquido e hincharse. A temperaturas de hasta 50°C a 75°C, el abultamiento puede ser reversible. Sin embargo, con temperaturas más altas un abultamiento irreversible denominado "gelatinización" inicia. El almidón granular a ser procesado puede ser de una calidad de almidón altamente refinado, preferiblemente al menos 90%, al menos 95%, al menos 97% o por lo menos 99.5% puro o puede ser un material que contiene almidón más crudo que comprende un grano completo molido incluyendo fracciones no de almidón tales como residuos de germen y fibra. La materia prima, tal como grano completo, se muele con el fin de abrir la estructura y permitir un procesamiento adicional. Los dos procedimientos de molienda son preferidos de acuerdo con la invención: molienda seca y en húmedo. En la molienda seca los agrupamientos completos se muelen y se utilizan. La molienda en húmedo da una buena separación del germen y el alimento (gránulos de almidón y proteina) y por lo general se aplica en ubicaciones en donde se utilizan hidrolisatos de almidón en la producción de jarabe. Ambas moliendas seca y húmeda son bien conocidas en la técnica del procesamiento de almidón y son igualmente contempladas para los procedimientos de la invención . El material que contiene almidón se reduce en tamaño de partícula, preferiblemente a través de molienda seca o húmeda, con el fin de exponer mayor área de superficie. En una modalidad el tamaño de partícula está entre 0.5 a 3.0 mm, preferiblemente 0.1-0.5 mm, etc., de tal forma que por lo menos 30%, preferiblemente por lo menos 50%, más preferiblemente por lo menos 70%, aún más preferiblemente por lo menos 90% del material que contiene almidón se ajusta a través de un tamiz molecular con una malla de 0.5 a 3.0 mm, preferiblemente una malla de 0.1-0.5 mm. Productos de Fermentación El término "producto de fermentación" significa un producto producido a través de un procedimiento que incluye un paso de fermentación utilizando un organismo de fermentación. Los productos de fermentación contemplados de acuerdo con la invención incluyen alcoholes (por ejemplo, etano, metanol, butanol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico) ; cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico) ; gases (por ejemplo, H2 y C02) ; antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina ) ; enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, Bi2, beta-caroteno); y hormonas. En una modalidad preferida el producto de fermentación es etano, por ejemplo, etanol de combustible, etanol para beber; es decir, alcoholes neutrales potables; o etanol o productos industriales utilizados en la industrial del alcohol consuele (por ejemplo, cerveza y vino); industria de productos lácteos (por ejemplo, productos lácteos fermentados), la industria de la piel y la industria del tabaco. Los tipos de cerveza preferidos incluyen ales, stouts, porters, lagers bitters, licores de malta, happoushu, cerveza alta en alcohol, cerveza baja en alcohol, cerveza baja en calorías o cerveza ligera. Los procedimientos de fermentación preferidos incluyen los procedimientos de fermentación de alcohol, como son bien conocidos en la técnica. Los procedimientos de fermentación preferidos son procedimientos de fermentación anaeróbicos, como es bien conocido en la técnica. Organismos de Fermentación "Organismo de fermentación" se refiere a cualquier organismo, incluyendo organismos bacterianos y fúngicos, adecuados para utilizarse en un procedimiento de fermentación y capaces de producir un producto de fermentación deseado. Los organismos de fermentación especialmente adecuados son capaces de fermentar, es decir, convertir, azúcares, tales como glucosa o maltosa, directa o indirectamente en un producto de fermentación deseado. Los ejemplos de organismos de fermentación incluyen organismos fúngicos, tales como levadura. La levadura preferida incluye cepas de Saccharomyces spp., en particular, Saccharomyces cerevisiae. La levadura comercialmente disponible incluye, por ejemplo, Red Star™/Lesaffre Ethanol Red (disponible de Red Star/Lesaffre, USA) FALI (disponible de Fleischmann' s Yeast, una división de Burns Philp Food Inc., USA), SUPERSTART (disponible de Alltech) , GERT STRAND (disponible de Gert Strand AB, Suecia) y FERMOL (disponible de DSM Specialties) . ENZIMAS Glucoamilasa La glucoamilasa es preferiblemente una glucoamilasa de la invención. Sin embargo, se mencionó anteriormente una glucoamilasa de la invención también puede combinarse con otras glucoamilasas . La glucoamilasa puede adicionarse en una cantidad de 0.001 a 10 AGU/g DS, preferiblemente de 0.01 a 5 AGU/g DS, tal como alrededor de 0.1, 0.3, 0.5, 1 ó 2 AGU/g DS, especialmente 0.1 a 0.5 AGU/g DS ó 0.02-20 AGU/g DS, preferiblemente 0.1-10 AGU/g DS. Alfa-Amilasa La alfa-amilasa puede de acuerdo con la invención ser de cualquier origen. Las alfa-amilasas preferidas son de origen fúngico o bacteriano. En una modalidad preferida la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida, por ejemplo, alfa-amilasa ácido fúngica o alfa-amilasa ácida bacteriana. El término "alfa-amilasa ácida" significa una alfa-amilasa E. C. 3.2.1.1), que se adiciona en una cantidad efectiva una actividad óptima a un pH en la escala de 3 a 7 , preferiblemente de 3.5 a 6, o más preferiblemente de 4-5. Alfa-Amilasas Bacterianas De acuerdo con la invención una alfa-amilasa bacteriana puede preferiblemente derivarse del género Bacillus. En una modalidad preferida la alfa-amilasa Bacillus se deriva de una cepa de B. licheniformis, B, amiloliquefaciens, B. subtilis o B. stearothermophilus, pero también puede derivarse de otros Bacillus sp. Los ejemplos específicos de alfa-amilasas contempladas incluyen la alfa-amilasa Bacillus licheniformis (BLA) mostrada en SEC ID NO: 4 en WO 99/19467, la alfa-amilasa Bacillus amiloliquefaciens (BAN) mostrada en SEC ID NO: 5 en WO 99/19467, y la alfa-amilasa Bacillus stearothermophilus (BSG) , mostrada en SEC ID NO: 3 en WO 99/19467. En una modalidad de la invención la alfa-amilasa en una enzima que tiene un grado identidad de al menos 50%, preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, aún más preferiblemente al menos 90%, tal como por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias mostradas en SEC ID NOS: 1, 2, 3, 4, ó 5, respectivamente, en WO 99/19467. La alfa-amilasa Bacillus también puede ser una variante y/o híbrido, especialmente uno descrito en cualquiera de WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059, y WO 02/10355 (todos los documentos se incorporan aquí por referencia). Las variantes de alfa-amilasas específicamente contempladas se describen en las patentes de E. U. A. Nos. 6, 093, 6, 297, 038 o patente de E. U. A. No. 6,187,576 (incorporada aquí por referencia) e incluye variantes de alfa-amilasa Bacillus stearothermophillus (alfa-amilasa BSG) que tienen una eliminación de uno o más aminoácidos en la posición 179 a 182, preferiblemente una doble eliminación descrita en WO 1996/023873) - ver por ejemplo, pág. 20, líneas 1-10 (incorporada aquí por referencia), preferiblemente correspondiente a delta (181-182) comparado con la secuencia de aminoácido de alfa-amilasa BSG de tipo silvestre establecida en SEC ID NO: 3 descrita en WO 99/19467 o la eliminación de los aminoácidos 179 y 180 utilizando SEC ID NO: 3 en WO 99/19467 para la numeración (cuya referencia se incorpora aquí por referencia) . Aún más preferidas son las alfa-amilasas Bacillus, especialmente alfa-amilasa Bacillus stearothermophillus, que tiene una doble eliminación correspondiente a delta (181-182) y además comprende una sustitución N193F (también denotada 1181*+G182*+N193F) comparado con la secuencia de aminoácido de alfa-amilasa BSG de tipo silvestre establecida en SEC ID NO: 3 descrita en WO 99/19467. La alfa-amilasa también puede ser una alfa-amilasa maltogénica. Una "alfa-amilasa patogénica" (glucan 1,4-alfa-maltohidrolasa, E. C. 3.2.1.133) es capaz de hidrolizar amilasa y amilopectina a maltosa en la configuración alfa. Una alfa-amilasa maltogénica de la cepa Bacillus stearothermophillus NCIB 11837 está comercialmente disponible de Novozymes A/S, Dinamarca. La alfa-amilasa maltogénica se describe en las patentes de E. U. A. Nos. 4,598,048, 4,604,355 y 6,162,628, las cuales se incorporan aquí por referencia. Alfa-Amilasas Híbridas Bacterianas Una alfa-amilasa híbrida específicamente contemplada comprende 445 residuos de aminoácido C-terminal de la alfa-amilasa Bacillus licheniformis (mostrada como SEC ID NO: 4 en SO 99/19467) y 37 residuos de aminoácido N-terminal de la alfa-amilasa derivada de Bacillus amuloliquefaciens (mostrada como SEC ID NO: 3 en WO 99/194676), con uno más, especialmente todos, de la siguiente sustitución: G48A+T491+G107A+H156y+A181T+N190F+1201F+A209V+Q264S (utilizando la numeración Bacillus lichenformis) . También se prefieren las variantes que tienen una o más de las siguientes mutaciones (o mutaciones correspondientes en otras estructuras de alfa-amilasa Bacillus) : H154Y, A181T, N190F, A209V y Q264S y/o en la eliminación de dos residuos entre las posiciones 176 y 179, preferiblemente la eliminación E178 y G179 (utilizando la numeración de SEC ID NO: 5 de O 99/19467). La alfa-amilasa bacteriana puede agregarse en cantidades que son bien conocidas en la técnica. Cuando se miden en unidades KNU (descrita a continuación en la sección de "Materiales y Métodos") la actividad de la alfa-amilasa está preferiblemente presente en una cantidad de 0.5-5,000 NU/g de DS, en una cantidad de 1-500 NU/g de DS, o más preferiblemente en una cantidad de 5-1,000 NU/g de DS, tales como 10-100 NU/g de DS . Alfa-Amilasas Fúngicas Las alfa-amilasas ácidas fúngicas incluyen alfa-amilasas ácidas derivadas de una cepa del género Aspergillus, tal como alfa-amilasas Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, o Aspergillus kawachii. Un alfa-amilasa fúngica ácida preferida es una alfa-amilasa de tipo Fungamilo que preferiblemente se deriva de una cepa de Aspergillus Oryzae. En la presente descripción, el término "alfa-amilasa de tipo fungamilo" indica una alfa-amilasa que exhibe una alta identidad, es decir, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, más de 96%, más de 97%, más de 98%, más de 99% o aún 100% de identidad a la parte madura de la secuencia de aminoácido mostrada en SEC ID NO: 10 en WO 96/23874.

Otra alfa-amilasa ácida preferida se deriva de una cepa Aspergillus niger. En una modalidad preferida la alfa-amilasa fúngica ácida es una de la forma A. niger descrita como "AMYA_ASPNG" en la base de datos Swiss-prot /TeEMBL bajo el número de acceso primario P56271 y descrita con más detalle en WO 89/01969 (Ejemplo 3) . La alfa-amilasa ácida de Aspergillus niger ácido también se muestra en SEC ID NO: 1 en WO 2004/080923 (Novozymes) la cual se incorpora aquí por referencia. También las variantes de dicha amilasa fúngica ácida tienen al menos 70% de identidad, tal como por lo menos 80%, o aún al menos 90% de identidad, tal como al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad con SEC ID NO: 1 en WO 2004/080923 se contemplan. Una alfa-amilasa fúngica ácida comercialmente disponible derivada de Aspergillus niger es SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca. En una modalidad preferida, la alfa-amilasa se deriva de Aspergillus kawachii y se describe por Kaneko y otros, J. Ferment, Bioeng. 81:292-298 (1996) "Molecular-cloning amylase from Aspergillus kawachii": y además como EMBL : #AB008370. La alfa-amilasa ácida fúngica también puede una enzima de tipo silvestre que comprende una molécula de unión a carbohidrato (CBM) y un dominio catalítico alfa-amilasa (es decir, ningún híbrido), o una variante del mismo. En una modalidad la alfa-amilasa ácida de tipo silvestre se deriva de una cepa de Aspergillus kawachii. Alfa-Amilasas Híbridas Fúngicas En una modalidad preferida la alfa-amilasa ácida fúngica es una alfa-amilasa híbrida. Los ejemplos preferidos de alfa-amilasa híbridas fúngicas incluyen las descritas en WO 2005/003311 o publicación de patente de E. U. A. No. 2005/0054071 (Novozymes) o la solicitud de patente de E. U. A. No. 60/638.614 (Novozymes) que se incorpora aquí por referencia. Una alfa-amilasa híbrida puede comprender un dominio catalítico alfa-amilasa (CD) y un dominio/módulo de unión a carbohidrato (CB ) y un enlazador opcional. Los ejemplos específicos de alfa-amilasas híbridas contempladas incluyen aquellas descritas en la solicitud de patente de E. U. A. No. 60/638, 614 incluyendo la variante de fungamilo con el dominio catalítico JA118 y Athelia rolfsii SBD (SEC ID NO: 100 en la solicitud de E. U. A. No. 60/638,614), alfa-amilasa Rhizomucor pusillus con el enlazador AMG de Athelia rolfsii y SBD (SEC ID NO: 101 en la solicitud de E. U. A. No. 60/638, 614) y la alfa-amilasa Meripilus giganteus con el enlazador de glucoamilasa Athelia roltsii y SBD (SEC ID NO: 102 en la solicitud de E. U. A. No. 69/638, 614) . Otros ejemplos específicos de alfa-amilasa híbridas contempladas incluyen aquellas descritas en la publicación de patente de E. U. A. No. 2005/0054071, incluyendo aquellas descritas en la Tabla en la página 15, tales como la alfa-amilasa Aspergillus niger, con el enlazador Aspergillus kawachii y un dominio de enlace de almidón. Productos de Alfa-Amilasa Comerciales Las composiciones comerciales preferidas comprenden alfa-amilasas que incluyen MYCOLASE de DSM (Gist Brocades) , BAN™, TERMAMYL™ SC, FUNGA YL™, LIQUOZYME™ X y SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) y CLARASE™ 1-40,000 DEX-LO™, SPEZYME™ FRED, SPEZYME™ AA, SPEZYME™ Etilo, y SPEZUME™ DELTA AA (Genencor Int.), y la alfa-amilasa fúngica ácida vendida bajo el nombre comercial de SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca) . Una alfa-amilasa ácida puede de acuerdo con la invención adicionarse en una cantidad de 0.1 a 10 AFAU/g DS, preferiblemente de 0.10 a 5 AFAU/g DS, especialmente 0.3 a 2 AFAU/g DS. Producción de Jarabe La presente invención también proporciona un procedimiento para utilizar una glucoamilasa de la invención para producir jarabe, tal como glucosa y similar, del material contiene almidón. Los materiales de partida adecuados se ejemplifican en la sección de "materiales que contienen almidón" anterior. Generalmente, el procedimiento comprende los pasos de hidrolizar el material que contiene almidón parcialmente (licuefacción) en la presencia de la alfa-amilasa y después sacarificar la liberación de la glucosa de los extremos no de reducción del almidón o las moléculas oligo- y polisacárido relacionadas en la presencia de glucoamilasa de la invención. La licuefacción y la sacarificación pueden llevarse a cabo como se describió anteriormente para la producción del producto de fermentación. La glucoamilasa de la invención también puede utilizarse en forma inmovilizada. Esto es adecuado y por lo general utilizado para producir especialmente jarabes, tales como jarabes de maltosa, y además para una corriente refinada de oligosacáridos en conexión con la producción de jarabes de fructosa, por ejemplo, jarabe alto en fructosa (HFS). En consecuencia, este aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para producir jarabe de material que contiene almidón, que comprende: (a) licuar el material que contiene almidón en la presencia de una alfa-amilasa, (b) sacarificar el material obtenido en el paso (a) utilizando una glucoamilasa de la invención. Un jarabe se puede recubrir del material sacarificado obtenido en el paso (b) . Los detalles de las condiciones adecuadas se pueden encontrar anteriormente.

Elaboración de Cerveza Una glucoamilasa de la invención también puede utilizarse en el procedimiento para la elaboración de cerveza. Las glucoamilasas de la invención se agregan en cantidad efectivas que pueden fácilmente ser determinadas por un experto en la técnica. La invención descrita y reivindicada en la presente no se limitará en el alcance de las modalidades especificas descritas en la presente, ya que estas modalidades están previstas como ilustraciones de los varios aspectos de la invención. Cualquier modalidad equivalente se previene que esté dentro del alcance de esta invención. Ciertamente, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Dichas modificaciones también pretenden caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En el caso de conflicto, se controlará la presente descripción incluyendo las definiciones. Se citan varias referencias en la presente, las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad. La presente invención además se escribe a través de los siguientes ejemplos que deberán construirse como limitante del alcance de la invención.

Materiales y Métodos Glucoamilasas : Glucoamilasa A : Glucoamilasa derivada de Aspergillus niger descrita en (Boel y otros, (1984), EMBO J, 3 (5) p. 1097-1102) y disponible de Novozymes A/S, Dinamarca. Alfa-Amilasa : Alfa-Amilasa A: Alfa-amilasa híbrida que consiste de la alfa-amilasa Rhizomucor pusillus (SEC ID NO: 6 en la presente) con el enlazador de glucoamilasa Aspergillus niger (SEC ID NO: 8 en la presente) y SBD (SEC ID NO: 10 en la presente) descrito como V039 en la Tabla 5 en la solicitud Internacional co-pendiente No. PCT/US05/ 6725 (WO 2006/069290) . Levadura : RED STAR™ disponible de Red Star/Lesaffre, USA. Otros materiales pENI2516 se describe en WO 2004/069872 MBin 118 Aspergillus niger se describe en WO 2004/090155 (ver, por ejemplo, Ejemplo 11) . Depósito de Material Biológico El siguiente material biológico ha sido depositado bajo los términos del Tratado de Budapest de Deutshe Sammmlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig DE, y dado el siguiente número de acceso : Depósito No. de Acceso Fecha de Depósito Escherichia coli NN49873 DSM 18150 3 de abril, 2006 La cepa ha sido depositada bajo condiciones que aseguran el acceso al cultivo que estará disponible durante la espera de esta solicitud de patente a uno determinado por el Comisionado de patentes y marcas a ser intitulado en la misma bajo 37 C.F.R. §1.14 y 35 U.S.C. §122. El depósito representa un cultivo sustancialmente puro de la cepa depositada. El depósito está disponible según se requiera a través de las leyes de patente foráneas en países en donde se presentan las contrapartes de la solicitud principal, o su progenie. Sin embargo, se debe entender que la disponibilidad de un depósito de no constituye una licencia para practicar la invención principal en derogación de los derechos de patente otorgados por la acción gubernamental. Medios y reactivos: Los químicos utilizados como reguladores de pH y sustratos fueron productos comerciales de por lo menos un grado reactivo. PDA: 39 g/1 de Agar de Dextrosa de Para 20 g/1 de agar, 50 ml/1 de glicero. Métodos A menos que se manifieste lo contrario, las manipulaciones y transformaciones de ADN se llevaron a cabo utilizando métodos estándares de biología molecular como se describe en Sambrook y otros, (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. y otros, (eds.) "Current protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus", John Wiley and Sons, 1990. Actividad de Glucoamilasa La actividad de glucoamilasa puede medirse en unidades AGI o en Unidades de Glucoamilasa (AGU) . Actividad de glucoamilasa (AGI) La glucoamilasa (equivalente a amiloglucosidasa) convierte el almidón en glucosa. La cantidad de glucosa de determina en la presente a través del método de glucosa oxidasa para la determinación de la actividad. El método descrito en la sección 76-11 Almidón-Método de Glucoamilasa con Medición Subsiguiente de Glucosa con Glucosa Oxidasa en "Métodos Aprobados de la Asociación Americana de Químicos de Cereal", Vol . 1-2 AACC, de la Asociación Americana de Químicos de Cereal (2000) ; ISBN: 1-891127-12-8. Una unidad de glucoamilasa (AGI) y la cantidad de enzima que formará un micromol de glucosa por minuto bajo condiciones estándares del método. Condiciones estándares/condiciones de reacción: Sustrato : Almidón soluble , concentración aproximada de 16 g de material seca/L. Regulador de pH : Acetato, aproximadamente 0.04 M, pH=4.3 pH: 4.3 Temp. de incubación: 60°C Tiempo de Reacción: 15 minutos Terminación de la reacción: NaOH a una concentración de aproximadamente 0.2 g/1 (pH~9) Concentración de enzima: 0.15-0.55 AAU/ml. El almidón debe ser un almidón Lintner, que es un almidón de ebullición delgada utilizado en el laboratorio como indicador colorimétrico . El almidón Lintner se obtiene a través de la dilución de tratamiento con ácido clorhídrico de almidón nativo de tal forma que retiene la habilidad para colorear en azul con yodo. Actividad de glucoamilasa (AGU) La Unidad de Glucoamilasa Novo (AGU) se define como la cantidad de enzima, la cual hidroliza 1 micromol de maltosa por unidad bajo condiciones estándares a 37°C, pH 4.3, sustrato: maltosa 23.2 m , regulador de pH : acetato 0.1 M, tiempo de reacción 5 minutos. Se puede utilizar un sistema autoanali zador . La mutarotasa se agregó al reactivo de glucosa deshidrogenasa de tal forma que cualquier alfa-D-glucosa presente se convierte en beta-D-glucosa . La glucosa deshidrogenasa reacciona específicamente con beta-D-glucosa en la reacción mencionada anteriormente, formando NADH que se determina utilizando un fotómetro a 340 nm como una medición de la concentración de glucosa adicional.

Una carpeta (EB-SM-0131.02/01) describe este método analítico con mayor detalle y está disponible sobre solicitud de Novozymes A/S, Dinamarca, cuya carpeta se incorpora aquí por referencia. Activad alfa-amilasa (KNU) La actividad de la alfa-amilasa puede determinarse utilizando almidón de papa como sustrato. Este método se basa en la ruptura del almidón de papa modificado a través de la enzima, y la reacción es seguida por el mezclado de muestras de la solución de almidón/enzima con una solución de yodo. Inicialmente , se formó un color negrusco-azul , pero durante la ruptura del almidón el color azul se hizo más débil y gradualmente se convirtió en rojizo-café, que se compara con un estándar de vidrio de color. Se definió una unidad de alfa-amilasa Novo Kilo (KNU) como la cantidad de enzima la cual, bajo condiciones estándares (es decir, a 37°C +/-0.05; 0.0003 M Ca2+ y un pH de 5.6) dextriniza 5260 mg de sustancia seca de almidón Merck Amylum soluble. Una carpeta EB-SM-0009.02/01 que describe este método analítico con mayor detalle está disponible sobre solicitud en Novozymes A/S, Dinamarca, cuya carpeta se incorpora aquí por referencia. Actividad alfa-amilasa ácida Cuando se utiliza de acuerdo con la presente invención la actividad de cualquier alfa-amilasa ácido puede medirse en AFAU (Unidades de Alfa-Amilasa Fúngica Acida) . Alternativamente la actividad de la alfa-amilasa ácida puede merite en AAU (Unidades de Alfa-Amilasa Acida) . Unidades de Alfa-Amilasa Acida (AAU) La actividad de la alfa-amilasa ácida puede medirse en AAU (Unidades de Alfa-Amilasa Acida), que es un método absoluto. Una unidad de amilasa ácida (AAU) es la cantidad de enzima que convierte 1 g de almidón (100% de material seca), por hora bajo condiciones estandarizadas en producto que tiene una transmisión a 620 nm después de la reacción con una solución de yodo de resistencia conocida igual a la de una referencia de color . Condiciones estándares /condiciones de reacción: Sustrato : Almidón soluble. Concentración aproximadamente de 20 g DS/1. Regulador de pH: Citrato, aproximadamente 0.13M, pH=4.2 Solución de yodo: 40.176 g de yoduro de potasio 0.088 g de yodo/1 Agua Municipal : 15°-20°dH (grado de dureza Alemán ) pH : 4.2 Temp. de Incubación: 30°C Tiempo de reacción: 11 minutos Longitud de onda: 620 nm Concentración de enzima: 0.13-0.19 AAU/ml Rango operativo de la enzima: 0.13-0.19 AAU/ml El almidón debe ser almidón Lintner, el cual es un almidón con ebullición delgada utilizado en el laboratorio como un indicador colorimétrico . El almidón Lintner se obtiene a través del tratamiento con ácido clorhídrico diluido del almidón nativo de tal forma que retiene la habilidad de colorear en azul con yodo. Los detalles adicionales pueden encontrarse en EP 0140410 B2, cuya descripción se incorpora aquí por referencia. Actividad alfa-amilasa acida (AFAU) La actividad alfa-amilasa ácida puede medirse en AFAU (Unidades de Alfa-Amilasa Fúngica Acida) que se determinan con relación a una enzima estándar. 1 AFAU se define como la cantidad de enzima que degrada 5.260 mg de materia seca de almidón por hora bajo las condiciones estándares mencionadas a continuación. La alfa-amilasa ácida, una endo-a 1 fa -ami 1 a sa ( 1 , 4-f-D-glucan-glucanohidrolasa, E.C. 3.2.1.1) hidroliza los enlaces de al fa- 1 , -glucos í dicos en las regiones internas de la molécula de almidón para formar dextrinas y oligosacáridos con diferentes longitudes de cadena. La intensidad del color formado con yodo es directamente proporcional a la concentración de almidón. La actividad de la amilasa se determina utilizando colorímetro inversa con una reducción en la concentración del almidón bajo condiciones analíticas especificadas . AL FA-AM I LASA ALMIDON + YOD^ DEXTRINAS + OLIGOSACARIDOS 40° pH 2.5 ? = 590 nm azul/violeta t = 23 segundos decoloración Condiciones estándares/condiciones de reacción: Sustrato: Almidón soluble, aproximadamente de 0.17 g/1. Regulador de pH: Citrato, aproximadamente 0.03M, Yodo (12) : 0.03 g/1 CaC12 : 1.85 mM pH: 2.50 + 0.05 Temp. de Incubación: 40°C Tiempo de reacción: 23 segundos Longitud de onda: 590 nm Concentración de enzima: 0.025 AFAU/ml Rango operativo de la enzima: 0.01-0.04 AFAU/ml Una carpeta EB-SM-0259.02/01 que describe este método analítico con mayor detalle está disponible sobre solicitud en Novozymes A/S, Dinamarca, cuya carpeta se incorpora aquí por referencia. EJEMPLOS Ejemplo 1 Extracción de ADN y amplificación PCR del Gen Glucoamilasa Peniophora rufomarginata La hifa aérea de Peniophora rufomarginata cultivada en una placa de PDS (Agar Dextrosa de Papa) se raspo de la placa y se utilizó para la extracción de ADN genómico utilizando el kit SPIN de ADN rápido para cultivo (Qbiogene, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción PCR se hizo en el ADN de genoma con los iniciadores degenerados EuAMFl y EuAMR4 : EuAMFl 5'- ACGTACGGATCCAYTWCTAYWCBTGGACHCGYGA -3' (SEC ID NO: 11) EuAMR4 5' GTACGTAAGCTTRTCYTCRGGGTAVCGDCC -3' (SEC ID NO: 12) En donde D = A o G o T; R = A o G; S = C o G; V = A o C o G; Y = C o T; W= A o T; B= G o C o T; H= A o T o C. La reacción de amplificación (13 microlitros) se compuso de una solución 1 microlitro de ADN de genoma, 1 microM del iniciador EuAMFl (25 pmoles/microl), 1 microM del iniciador EuAMR4 (25 pmoles/microl) 11 microl del Extentor de la Mezcla Maestra de PCR de alta fidelidad del extensor (ABgene, UK) . La reacción se incubó en un motor de ADN Dyad PTC-0220 (MJ Research, USA) programado como sigue: 1 ciclo a 94°C durante 5 minutos; 20 ciclos cada uno a 94°C durante 45 segundos, 65°C durante 45 segundos, con una temperatura de templado que declina de 1°C por ciclo, y 72°C durante 1 minutos; seguido por 20 ciclos a 94°C durante 45 segundos, 48°C durante 45 segundos y 72°C durante 1 minuto; y 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos; y un control a 4°C. El producto PCR se purificó utilizando ExoSAP-IT (USB, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se secuenció utilizando los iniciadores como se utilizaron en la reacción de amplificación. La secuencia subsiguientemente se comparó con el gen de glucoamilasa Aspergillus niger, mostrando que el producto PCR codificó una parte de una glucoamilasa. EJEMPLO 2 Clonación del gen de glicoamilasa de Peniophora rufornarqina ta A partir de la secuencia parcial de la glucoamilasa Peniophora rufomarginata más la secuencia del gen se obtuvo con el recorrido del gen basado en PCR utilizando el kit Vectorette de SIGMA-Genosys . Este recorrido del gen se hizo básicamente como se describe en el protocolo del fabricante, 0.15 micro g de ADN genómico de Peniophora ruf omarginata se digirió con EcoRI, BamHI, Hindlll, y Clal independientemente. El ADN digerido se ligó con las unidades Vectorette correspondientes suministrados por el fabricante utilizando un motor de ADN Dyad PTC-0220 (MJ Research, USA) programado como sigue: 1 ciclo a 16°C durante 60 minutos; 4 ciclos cada uno a 37°C durante 20 minutos, 16°C durante 60 minutos, 37°C durante 10 minutos; seguido por un ciclo a 16°C durante 60 minutos y un control a 4°C. Las reacciones de ligación subsecuentemente se diluyeron 5 veces con agua estéril Las reacciones PCR con el ADN de genoma ligado al enlazador de Peniophora rufomarginata como plantilla se llevaron a cabo con el motor Dyad PTC-0220 de ADN (MJ Research, USA) programado como sigue: 1 ciclo a 94°C durante 5 minutos; 40 ciclos cada uno a 94°C durante 15 segundos, 72°C durante 1 minuto, 72°C durante 1 minutos, l ciclo a 72°C durante 7 minutos; y control a 4°C utilizando el iniciador Vectorette suministrado y los iniciadores de AMG Peniophora rufomarginata 50311F1 y 50311R2, respectivamente, como se mostró a continuación. 50311F1: 5'- CGATTCACACCTGGGACATCAAGG -3' (SEC ID NO: 13) 50311R2: 5'- AAGACACAGTACCAGACGGGTTGG -3' (SEC ID NO : 14 ) Las reacciones de amplificación (12.5 microl) estuvieron compuestas de 0.5 microl de ADN de genoma ligado al enlazador, 400 nM del iniciador de Vectorette, 400 nM del iniciador especifico Peniophora rufomarginata, 11 microl de una mezcla maestra de PCR de alta afinidad de extensor (ABgene, UK) . Después de la reacción de PCR los productos PCR se purificaron utilizando ExoSAP-IT (USB, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se secuenciaron y subsecuentemente se compararon con el gen de glucoamilasa Aspergillus niger. Se obtuvo una banda amplificada de 1.5 kb a través de la reacción PCR del ADN del genoma digerido BamHI amplificado con el iniciador 50311R2. La secuenciación del producto PCR utilizando este iniciador demostró que codifica los 350 pares bases restantes del gen de glucoamilasa en la dirección 5' (N-terminal de la proteina codificada) . Se obtuvo una banda amplificada de 1.1 a través de la reacción PCR del ADN de genoma digerido Clal amplificado con el iniciador 50311F1. La secuenciación del producto PCR utilizando este iniciador mostró que codifica 550 pares bases adicionales del gen de glucoamilasa en la dirección 3', sin embargo no se llevó al extremo del gen. Por consiguiente, un iniciador de secuenciación adicional 50311F2, se designó con base en la secuencia adicional recientemente obtenida del gen de glucoamilasa. La ligación del nuevo ADN-Vectorette y después de la configuración de la amplificación como se describió anteriormente se configuró. Un producto PCR de 2 kb obtenido de la ligación del genoma digerido Hindlll se secuenció con el iniciador 50311F2. y demostró que codifica la parte restante de gen de glucoamilasa en la dirección 3' (C-terminal de la proteina codificada) . 50311F2 5' GGTGGCAGCACCGTCGCTGTAACC (SEC ID NO: ) Ejemplo 3 Expresión del gen de glucoamilasa de Peniophora rufornargina ta El gen glucoamilasa de Peniophora rufomarginata se clonó a través de PCR utilizando ADNg como plantilla, la mezcla maestra PCR Reddy (ABgene, UK) y los iniciadores 50311F3 y 50311R3 como se muestra a continuación . 50311F3 : 5' CAGCACGGATCCAAGATGCGTCTCCCACAACTTG 3' (SEC ID NO: 16) 50311R3: ' GCATCAAGGCGGCCGCCTAGCGCCAGGAATCGTTGGC 3' ( SEC ID NO : 17 ) El iniciador 50311F3 y 50311R3 introdujeron un sitio de restricción BamHl y Notl en el fragmento de ADN amplificado y subsecuentemente se ligó en los sitios de restricción BamHl y Notl del vector del expresión pENl2516 Aspergillus . La mezcla de ligación se transformó en E. coli TOP10 (Invitrogen, USA) para crear el plásmido de expresión ??? 12516AMGNN 50311 E 1. El plásmido amplificado se recuperó utilizando un kit QlAprep Spin Miniprep (QlAGEn, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La glucoamilasa de pEN12516A GNN50311El se secuenció. Desafortunadamente, ocurrió un error PCR en la región de codificación del gen de glucoamilasa. El error PCR se removió a través de un segundo paso de clonación como se describe a continuación . Se llevaron a cabo dos reacciones PCR. La reacción de PCR 1 contuvo 10 ng/microl de pEN12516AMGNN50311El como plantilla 0.2 mM de dNTP, IX de regulador de pH, 1.5 mM de MgCl2, una unidad de DyNAzyme EXT (New England Biolabs, UK) y 1 Pmol/microl de cada uno de los iniciadores NN50311fwl y NN50311bw2 (ver a continuación) . El volumen total fue de 50 microl. NN50311fwl: ' GCGGATCCACCATGCGTCTCCCACAACTTGGAGTC (SEC ID NO: 18) NN50311bw2 : 5' AGCTTGATTACGGGCCAGAGCGTGTTCGTGAC (SEC ID NO: 19) La reacción PCR 2 contuvo 10 ng/microl de pEN12516AMGNN50311El como plantilla 0.2 mM de dNTP, IX de regulador de pH, 1.5 mM de MgCl2, una unidad de DyNAzyme EXT (New England Biolabs, UK) , y 1 Pmol/microl de cada uno de los iniciadores NN50311fw2 y NN50311bwl (ver más adelante) , el volumen total fue de 50 raicrol. NN50311fw2 : 5' CGAACACGCTCTGGCCCGTAATCAAGCTTG (SEC ID NO: ) NN50311bwl: 5' GGGCGGCCGCTAGCGCCAGGAATCGTTGGCAGTA (SEC ID NO: 21) Ambas reacciones de PCR 1 y la reacción de PCR 2 se llevaron a cabo en un motor Dyad PTC-0220 de AND (MJ Research, USA) programado como sigue: 1 ciclo a 94°C durante 3 minutos; 15 ciclos cada uno a 94°C durante 20 segundos, 50°C durante 20 segundos y 72°C durante 1 minuto, 1 ciclo a 72°C durante 5 minutos. Una banda de ADN de 0.7 kbp y una banda de ADN de 1.5 kbp se purificaron de la reacción PCR 1 y de la reacción PCR 2, respectivamente, utilizando un kit de Purificación de Banda de Gel de ADN PCR GFX (Amersham Biosciences, UK) . Se hizo una tercera reacción de PCR conteniendo 1 microgramo de banda de ADN de 0.7 kbp purificada y 1 microgramo de la banda de ADN de 1.5 kbp purificada como plantilla, 0.2 mM de dNTP, IX de regulador de pH, 1.5 mM de MgCl2, 1 unidad de DyNAzyme EXT (New England Biolabs, UK) y 1 1 pmol/microl de cada uno de los iniciadores NN50311fwl (SEC ID NO: 20) y NN50311bwl (SEC ID NO: 21) . El volumen total fue de 50 microl. La reacción PCR se llevó a cabo en un motor de ADN Dyad PTC-0220 (MJ Research, USA) programado como sigue: 1 ciclo a 94°C durante 3 minutos; 9 ciclos cada uno a 94°C durante 20 segundos, 54°C durante 20 segundos y 42°C durante 2 minutos, 1 ciclo a 72°C durante 5 minutos. El AND se purificó de la reacción PCR utilizando un kit de purificación de banda de gel de AND PCR GFX (Amersham Biosciences, UK) y subsecuentemente se digirió con BamHl y No ti y se ligó en los sitios de restricción BamHl y Notl del vector de expresión pEN12516 de Aspergillus. La mezcla de ligación se transformó en E. coli TOP10 (Invitrogen, USA) para crear el plásmido de expresión pENl 2516AMGNN 50311. El plásmido amplificado se recuperó utilizando un kit Miniprep Spin de plásmido JETQUICK 50 1 (Genoraed, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante . El gen de glucoamilasa de pE 12516AMGNN50311 se secuenció y se verificó para ser idéntico a la secuencia del genoma. pEN12516AMGNN50311 se transformó en Aspergillus niger MBin 118 y la glucoamilasa se expresó utilizando el método estándar bien conocido en la técnica. Ej emplo 4 Propagación de Levadura La levadura se propagó antes de la fermentación. Se molió maíz (amarillo de diente No. 2) para pasar a través de una pantalla separadora del #45. Se mezclaron 200 mi de agua de la llave 1 g de urea con 300 g de pasta de maíz. Se agregó Penicilen a 3 mg/litro. En 50 g de la lechada de la masa, se agregaron 6.4 microl de glucoamilasa AN y 0.024 g de levadura seca (de RED STAR™ ) y el pH se ajustó a 5.0. La lechada de levadura se incubó a 32°C con una agitación constante a 300 rpm durante 7 horas en un matras parcialmente abierto . Fermentación en un paso utilizando glucoamilasa Peniophora rufomarginata Todos los tratamientos de maíz molido en un paso a etanol se evaluaron a través de fermentaciones mini-escala. Brevemente, se agregaron 400 g de maíz de diente amarillo molido (con tamaño de partícula alrededor de 0.5 mm) a 590 g de agua del grifo. Esta mezcla se suplemento con 3.0 mi 1 g/1 de penicilina y 1 g de urea. El pH de esta lechada se ajustó a 4.5 con 5 N de NaoH. El nivel DS se determinó como siendo alrededor de 35% en peso (el DS actual se midió con un analizador de humedad IR-200 de Denver Instrument Co.) . Aproximadamente se agregaron 5 g de esta lechada a frascos de 20 mi. Cada frasco se dosificó con una cantidad de apropiada de enzima seguido por la adición de 200 microlitros de levadura propagada por 5 g de lechada. Las dosificaciones de enzima actuales se basaron en el peso exacto de la lechada de maíz en cada frasco. Los frascos se cerraron y se incubaron a 32°C inmediatamente, se corrieron 9 fermentaciones por duplicado de cada tratamiento. Se seleccionaron 3 duplicados para análisis de punto en el tiempo de 24 horas, 49 horas y 70 horas. Los frascos se sometieron a vórtice a 24 , 48 y 70 horas y se analizaron a través de HPLC. La preparación HPLC consistió de detener la reacción a través de la adición de 50 microlitros de H2S04 al 40%, centrifugación y filtración a través de un filtro de 0.45 micrómetros. Las muestras se almacenaron a 4°C antes del análisis.

Se utilizó el sistema HPLC Agilent 1100 acoplados en un detector RI para determinar el etanol y los azúcares. El sistema HPLC consiste de un gasificador, una bomba cuatro, un auto-muestreador enfriado y un compartimiento de columna calentado. La columna de separación fue una columna de exclusión del ión aminex HPX-87H (300 mm x 7.8 mm) de BioRad™ que se unió a una columna de guardia de cartucho de catión H de micro-guardia de 30 mm x 4.6 mm. Se inyectaron 10 microl de muestra a una velocidad de flujo de 0.6 ml/min. La fase móvil fue 5mM H2S04. La columna se mantuvo a 66°C y el detector RI a 50°C. El tiempo de corrida total fue de 25 minutos por muestra . Los resultados se muestran en la siguiente tabla. El incremento de la glucoamilasa P. rufomarginata da como resultado un incremento en el rendimiento de etanol. El alto rendimiento de etanol se logró cuando se utilizó glucoamilasa P. rufomarginata junto con alfa-amilasa, Alfa-7Amilasa A en un procedimiento de un paso a etanol.

AMG P. Alfa-Amilasa A Etanol (% v/v) rufomargina ta (mg enzima/g DS) 24 horas 48 horas 70 horas (mg de enzima/g DS) 1 0 - 1.75 2.07 2.34 2 0.02 - 2.47 3.52 4.55 3 0.04 - 2.98 4.25 5.62 4 0.08 3 79 5.75 7.28 0 0 04 6 78 10 .90 13 .25 6 0 .02 0 04 7 47 11 .72 14 .57 7 0 .04 0 04 7 77 12 .49 14 .66 8 0 .06 0 04 8 46 13 .14 15 .50 hace constar que con relación a esta fecha, mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1.- Un polipéptido que tiene actividad glucoami lasa , caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos para los aminoácidos de polipéptido maduro 1 a 558 de SEC ID NO: 2 ; (b) un polipéptido que se codifica a través de una secuencia de nucleótido (i) que hibridiza bajo por lo menos condiciones de bajo rigor con los nucleótidos 61 a 2301 de SEC ID NO: 1, o (ii) que hibridiza bajo por lo menos condiciones de rigor bajo con una secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 61 a 1734 de SEC ID NO: 3, o (iii) una estructura de cadena complementaria de (i) o (ü) ; (c) una variante que comprende una sustitución, eliminación, y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 558 de SEC ID NO: 2.
2.- Un polipéptido que tiene una afinidad de unión a carbohidrato, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste: (a) i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos 60% de identidad con los aminoácidos 464 a 558 de SEC ID NO: 2 ; (b) un polipéptido que se codifica a través de una secuencia de nucleótido que hibridiza bajo condiciones de rigor bajo con una sonda de polinucleótido seleccionada del grupo de: (i) la estructura de cadena complementaria de los nucleótidos 1845-2301 de SEC ID NO: 1 ; (ii) la estructura de cadena complementaria de los nucleótidos 1450-1734 de SEC ID NO: 3; (c) un fragmento de (a) o (b) que tiene una afinidad de unión a carbohidrato.
3. - Un polinucleótido caracterizado porque tiene una secuencia de nucleótido que codifica para el polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1-2.
4. - Una construcción de ácido nucleico caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3 operablemente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un hospedero de expresión.
5. - Un vector de expresión recombinante caracterizado porque comprende la construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4.
6.- Una célula hospedera recombinante caracterizada porque comprende la construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4 o el vector de expresión recombinante de conformidad con la reivindicación 5.
7. - Un método para la producción de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una célula, que está en su forma de tipo silvestre capaz de producir el polipéptido, bajo condiciones conducentes para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.
8. - Un método para producir un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque comprende (a) cultivar una célula hospedera que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido bajo condiciones conducentes para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.
9. - Un polinucleót ido que codifica un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa , caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido que tiene al menos 60% de identidad con los aminoácidos del polipéptido maduro 1 a 558 de SEC ID NO: 2 ; (b) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 61-2301 de SEC ID NO: 1 ; o (c) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 61-1734 de SEC ID NO: 3 ; (d) un polinucleótido que se codifica mediante una secuencia de nucleótido (i) que hibridiza bajo por lo menos condiciones de rigor bajo con los nucleótidos 61 a 2301 de SEC ID NO: 1, o (ii) que hibridiza bajo por lo menos condiciones de rigor medio con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 61 a 1734 de SEC ID NO: 3, o (iii) una estructura de cadena complementaria de (i) o (ü) ·
10.- Un procedimiento para la producción de un producto de fermentación a partir del material que contiene almidón caracterizado porque comprende los pasos de: (a) licuar el material que contiene almidón; (b) sacarificar el material licuado utilizando la glucoamilasa de la reivindicación 1: (c) fermentar el material sacarificado utilizando un organismo de fermentación.
11.- Un procedimiento para la producción de un producto de fermentación de material que contiene almidón caracterizado porque comprende: (a) sacarificar el material que contiene almidón con un glucoamilasa de la reivindicación 1, a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial del material que contiene almidón; (b) fermentar utilizando un organismo de fermentación .
12.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el material que contiene almidón es almidón granular.
13. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28-39, caracterizado porque la glucoamilasa está presente en una cantidad de 0.001 a 10 AGU/g DS, preferiblemente de 0.01 a 5 AGU/g DS, especialmente de 0.1 a 0.5 AGU/g DS .
14. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, caracterizado porque está presente una alfa-amilasa .
15. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-14, caracterizado porque la temperatura durante la sacarificación en el paso (a) es de 30°C a 75°C, preferiblemente entre 45 a 60°C.
16.- El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-15, caracterizado porque el paso (a) y (b) se lleva a cabo secuencial o simultáneamente (es decir, fermentación de un paso) .
17. - Un procedimiento para la producción de jarabe a partir de material que contiene almidón, caracterizado porque comprende: (a) licuar el material que contiene almidón, preferiblemente en la presencia de una al fa-amilasa , (b) sacarificar el material obtenido en el paso (a) utilizando una glucoamilasa de la reivindicación.
18. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque además comprende la refinación, conversión y/o recuperación del jarabe.
19. - El uso de una glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para la producción de jarabe y/o un producto de fermentación.
20. - El uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde el material de partida es un material que contiene almidón gelatinizado y/o no gelatinizado.
21.- El uso de una glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para la fabricación de cerveza.
22.- Una composición caracterizada porque comprende una glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
23. - La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque además comprende una alfa-amilasa .
24. - La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida preferiblemente una alfa-amilasa ácida fúngica.
25. - La composición de conformidad con la reivindicación 23 ó 24, caracterizada porque la alfa-amilasa es de origen fúngico.
26. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-25, caracterizada porque la alfa-amilasa se deriva del género, Aspergillus , preferiblemente una cepa de A. niger, A. oryzae, Aspergillus awamori, o A. kawachii, del género Rhizomucor, preferiblemente una cepa de Rhi zomucor pusillus , o el género Meripilus , preferiblemente una cepa de Meripi lus gigan teus .
27. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-25, caracterizada porque la alfa-amilasa es una alfa-amilasa preferiblemente Rhizomucor pusi llus híbrida, con el enlazador AMG Athelia rolfsii y SBD; alfa-amilasa Rhizomucor pusillus con el enlazador de glucoamilasa Aspergillus niger y SBD; o alfa-amilasa Aspergí llus niger con el enlazador Aspergillus kawachii y el dominio de enlace de almidón (SBD) .
28. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-27, caracterizada porque además comprende otra glucoami lasa .
29. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la glucoamilasa se deriva del género Aspergillus , preferiblemente una cepa de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, o del género Athelia , preferiblemente una cepa de Athelia rolfsii, el género Talaromyces , preferiblemente una cepa de Talaromyces emersonii , o una cepa del género Trametes, preferiblemente una cepa de Trametes cingulata; o una cepa del género Rhi zopus , tal como una cepa de Rhizopus nivius; o una cepa del género Humicola , preferiblemente una cepa de Humicola grísea var thermoidea .