BR112020024347A2 - processos para aumentar o crescimento e a produtividade de levedura - Google Patents

Abstract

A invenção se refere a processos para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura usando peroxidase ou uma composição compreendendo peroxidase.

Description

“PROCESSOS PARA AUMENTAR O CRESCIMENTO E A PRODUTIVIDADE DE LEVEDURA” REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências em formato legível por computador, que é incorporada no presente documento por referência.

ÁREA DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção se refere a processos para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura, por exemplo, durante a produção de levedura e/ou durante a propagação de levedura, por contato da levedura com uma quantidade eficaz de uma peroxidase ou composição de peroxidase. A presente invenção também se refere a processos para a produção de produtos de fermentação, tais como especialmente etanol, em que uma peroxidase ou composição de peroxidase é usada para acelerar o crescimento da levedura e aumentar os títulos de etanol no início do processo de fermentação, e reduzir os títulos de ácido láctico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Os produtos de fermentação, tais como etanol, são tipicamente produzidos por trituração em primeiro lugar de material contendo amido em um processo de trituração a seco ou moagem a úmido, depois degradação do material em açúcares fermentáveis usando enzimas e finalmente conversão dos açúcares diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado usando um organismo fermentador. Os produtos de fermentação líquida são recuperados do mosto fermentado (muitas vezes chamado de “mosto de cerveja”), por exemplo, por destilação, que separa o produto de fermentação desejado, por exemplo etanol, de outros líquidos e/ou sólidos. A fração restante é chamada de “vinhaça completa”. A vinhaça completa contém tipicamente cerca de 10 a 20% de sólidos. A vinhaça completa é separada em uma fração sólida e uma líquida, por exemplo, por centrifugação. A fração sólida separada é chamada de “bolo úmido” (ou “grãos úmidos”) e a fração líquida separada é chamada de “vinhaça fina”. O bolo úmido e a vinhaça fina contêm cerca de 35 e 7% de sólidos, respectivamente. O bolo úmido, com desidratação adicional opcional, é usado como um componente em ração animal ou é seco para fornecer “Grãos Secos de Destilaria” (GSD) usados como um componente em ração animal. A vinhaça fina é tipicamente evaporada para fornecer condensado do evaporador e xarope ou pode ser alternativamente reciclada para o tanque de pasta semifluida como “contracorrente”. O condensado do evaporador tanto pode ser direcionado para um metanador antes de ser descarregado e/ou pode ser reciclado para o tanque de pasta semifluida como “água de cozimento”. O xarope pode ser combinado com os GSD ou adicionado ao bolo úmido antes ou durante o processo de secagem, que pode compreender um ou mais secadores em sequência, para produzir GSDS (Grãos Secos de Destilaria com Solúveis). O xarope contém tipicamente cerca de 25 a 35% de sólidos. Óleo pode ser também extraído da vinhaça fina e/ou xarope como um subproduto para uso na produção de biocombustível, como um aditivo ou produto de ração ou alimentar ou outros produtos biorrenováveis.

[0004] As leveduras que são usadas para a produção de etanol para uso como combustível, como na indústria do etanol de milho, requerem várias características para assegurar produção rentável do etanol. Estas características incluem tolerância ao etanol, baixo rendimento de subprodutos, fermentação rápida e a capacidade de limitar a quantidade de açúcares residuais que permanecem no fermento. Tais características têm um efeito pronunciado na viabilidade do processo industrial.

[0005] Apesar da melhoria significativa dos processos de produção de etanol na última década, ainda existe um desejo e necessidade de se fornecerem processos melhorados de fermentação de etanol a partir de material contendo amido em uma escala economicamente e comercialmente relevante.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] O desempenho da fermentação de etanol de açúcares fermentáveis produzidos a partir de material contendo amido liquefeito pode ser prejudicado se a levedura for desafiada por ácido láctico ou outros compostos inibidores produzidos por organismos infecciosos. Para que a levedura seja a mais produtiva possível na fermentação, é imperativo encurtar a fase de latência da levedura e iniciar a produção de etanol em um ritmo mais rápido.

[0007] A presente invenção fornece uma solução para esses problemas usando uma peroxidase para acelerar o crescimento e/ou a produtividade da levedura, por exemplo, para aumentar os títulos de etanol no início do processo de fermentação, resultando em uma redução geral dos títulos de ácido láctico durante a fermentação, especialmente quando uma fermentação é desafiada por uma infecção. Os processos e composições da invenção também podem ser usados para a cultura, o cultivo, a propagação ou a produção de levedura aumentando o crescimento e/ou a produtividade da levedura.

[0008] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um processo para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura, em que o processo compreende colocar a levedura em contato com uma quantidade eficaz de uma peroxidase ou composição de peroxidase.

[0009] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um processo para a produção de levedura, compreendendo o cultivo de levedura na presença de uma quantidade eficaz de uma peroxidase ou composição de peroxidase sob condições conducentes ao crescimento da levedura.

[0010] Em algumas modalidades, o crescimento da levedura é aumentado em 10% a 50% em comparação com o crescimento de levedura que não foi colocada em contato com o polipeptídeo. Em algumas modalidades, a produtividade da levedura é aumentada em 10% a 50% em comparação com a produtividade de levedura que não foi colocada em contato com o polipeptídeo.

[0011] Em um aspecto, a presente invenção se refere a uma composição que compreende levedura produzida de acordo com um processo presentemente divulgado e um componente selecionado de um tensoativo, um emulsificante, uma goma, um agente de inchamento, um antioxidante, um auxiliar de processamento e/ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a composição é formulada como uma levedura em creme, uma levedura desintegrada, uma levedura comprimida ou uma levedura seca ativa. Em uma modalidade, a composição é formulada como uma levedura seca inativa (por exemplo, levedura nutricional).

[0012] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um recipiente que compreende uma composição de levedura presentemente divulgada. Em algumas modalidades, o recipiente é selecionado de uma bolsa, um skid de dosagem, um pacote, um saco ou um recipiente de fermentação.

[0013] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um processo para a propagação de levedura para a produção de bioproduto em um sistema de fermentação de biocombustível, em que o processo compreende a introdução de uma peroxidase ou composição de peroxidase em um sistema de fermentação de biocombustível, em que o sistema de fermentação compreende um ou mais recipientes de fermentação, tubos e/ou componentes. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada em uma concentração suficiente para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura no sistema de fermentação de biocombustível.

[0014] Em uma modalidade, pelo menos um dos recipientes de fermentação é um tanque de fermentação e a peroxidase ou composição de peroxidase é introduzida no tanque de fermentação. Em algumas modalidades, a peroxidase ou composição de peroxidase é introduzida no tanque de fermentação dentro das primeiras 6 horas de fermentação. Em algumas modalidades, a taxa na qual etanol é produzido nas primeiras 24 horas de fermentação é aumentada em 10% a 50% em comparação com a taxa na qual etanol é produzido nas primeiras 24 horas sem a peroxidase ou composição de peroxidase. Em algumas modalidades, o crescimento de levedura nas primeiras 24 horas de fermentação é aumentado em 10% a 50% em comparação com o crescimento de levedura nas primeiras 24 horas de fermentação sem a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0015] Em uma modalidade, pelo menos um dos recipientes de fermentação é um tanque de propagação de levedura e a peroxidase ou composição de peroxidase é introduzida no tanque de propagação de levedura. Em algumas modalidades, a taxa na qual etanol é produzido nas primeiras 24 horas de fermentação é aumentada em 10% a 50% em comparação com a quantidade de etanol produzido nas primeiras 24 horas sem a peroxidase. Em algumas modalidades, o crescimento de levedura após 24 horas de propagação é aumentado em 10% a 50% na presença da peroxidase em comparação com o crescimento de levedura durante o mesmo período de propagação sem a peroxidase.

[0016] Em uma modalidade, o processo inclui uma etapa de adição de levedura ao tanque de propagação ou ao recipiente de fermentação. Em algumas modalidades, a levedura é colocada em contato com uma peroxidase antes de ser adicionada ao tanque de propagação ou ao recipiente de fermentação.

[0017] Em uma modalidade, o biocombustível é etanol.

[0018] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um processo para a produção de um produto de fermentação a partir de um material contendo amido, em que o processo compreende: a) liquefação de um material contendo amido na presença de uma alfa-amilase de modo a formar um mosto liquefeito; b) sacarificação do mosto liquefeito usando uma enzima geradora de fonte de carboidrato para produzir um açúcar fermentável; c) fermentação do açúcar usando um organismo fermentador sob condições adequadas para produzir o produto de fermentação, em que uma peroxidase é adicionada antes ou durante a etapa de sacarificação b) e/ou a etapa de fermentação c).

[0019] Em algumas modalidades, as etapas b) e c) são realizadas simultaneamente. Em algumas modalidades, uma pasta semifluida do material contendo amido é aquecida até acima da temperatura de gelatinização. Em algumas modalidades, uma peroxidase é adicionada durante a liquefação. Em algumas modalidades, uma peroxidase é adicionada durante a sacarificação, em que a peroxidase é opcionalmente adicionada nas primeiras duas horas de sacarificação. Em algumas modalidades, uma peroxidase é adicionada durante a fermentação, em que a peroxidase é opcionalmente adicionada nas primeiras seis horas de fermentação. Em uma modalidade, a peroxidase é introduzida logo após a liquefação e antes do tanque de fermentação ou tanque de propagação. Em uma modalidade, a peroxidase é introduzida em qualquer ponto do sistema de resfriamento do mosto. Em uma modalidade, a peroxidase é adicionada a um trocador de calor. Em uma modalidade, a peroxidase é adicionada a um tanque de mistura. Em algumas modalidades, o produto de fermentação é um álcool, preferencialmente etanol.

[0020] Em algumas modalidades, o organismo fermentador é levedura.

[0021] Em algumas modalidades, a levedura pertence a um gênero selecionado de Saccharomyces, Rhodotorula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Rhodosporidium,

Candida, Yarrowia, Lipomyces, Cryptococcus ou Dekkera. Em algumas modalidades, a levedura é Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus (carlsbergiensis), Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Fusarium oxysporum ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, a levedura compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima selecionada de uma alfa-amilase, uma glucoamilase ou uma protease.

[0022] Em algumas modalidades, a peroxidase é uma peroxidase ou enzimas de decomposição de peróxido selecionadas de: E.C.

1.11.1.1 NADH peroxidase; E.C. 1.11.1.2 NADPH peroxidase; E.C. 1.11.1.3 ácido graxo peroxidase; E.C. 1.11.1.5 citocromo-c peroxidase; E.C. 1.11.1.5; E.C. 1.11.1.6 catalase; E.C. 1.11.1.7 peroxidase; E.C. 1.11.1.8 iodeto peroxidase; E.C. 1.11.1.9 glutationa peroxidase; E.C. 1.11.1.10 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.11 L-ascorbato peroxidase; E.C. 1.11.1.12 Fosfolipídeo-hidroperóxido glutationa peroxidase; EC 1.11.1.13 manganês peroxidase; E.C. 1.11.1.14 lignina peroxidase; E.C. 1.11.1.15 peroxirredoxina; E.C. 1.11.1.16 peroxidase versátil; E.C. 1.11.1.B2 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.B6 iodeto peroxidase (contendo vanádio); E.C.

1.11.1.B7 brometo peroxidase; E.C. 1.11.1.B8 iodeto peroxidase. Em algumas modalidades, a peroxidase é derivada de um microrganismo, tal como um organismo fúngico, tal como uma levedura ou fungos filamentosos, ou bactérias; ou planta. Em algumas modalidades, a peroxidase é selecionada de: (i) uma peroxidase derivada de uma cepa de Thermoascus, tal como uma cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 1 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 no presente documento; (ii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Mycothermus, tal como uma cepa de Mycothermus thermophilus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 2 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 no presente documento; ou (iii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Coprinus, tal como uma cepa de Coprinus cinereus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 3 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 no presente documento.

[0023] Em um aspecto, a invenção se refere ao uso de uma peroxidase para a propagação de levedura. Em um aspecto, a invenção se refere ao uso de uma peroxidase para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura.

[0024] Em um aspecto, a invenção se refere ao uso de uma peroxidase para aumentar a taxa na qual o etanol é produzido nas primeiras

24 horas de fermentação durante um processo de produção de biocombustível (por exemplo, etanol).

[0025] Em um aspecto, a invenção se refere ao uso de uma peroxidase para reduzir os títulos de ácido láctico durante as etapas de fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas de um processo de produção de biocombustível (por exemplo, etanol).

[0026] Em um aspecto, a presente invenção se refere ao uso de uma peroxidase para reduzir os níveis de ácido láctico durante a fermentação em um processo de produção de etanol.

[0027] Em um aspecto, a presente invenção se refere ao uso de uma peroxidase para reduzir os níveis de ácido láctico durante a propagação de levedura.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0028] A FIG. 1 mostra um processo de produção de etanol de moagem a seco exemplificativo.

[0029] A FIG. 2 mostra os títulos de etanol (g/L) após 24 horas de fermentação de um mosto de milho liquefeito com 20% de conteúdo de sólidos secos (SS) na presença de várias peroxidases em comparação com um controle sem peroxidase e um controle no qual apenas penicilina foi usada.

[0030] A FIG. 3 mostra os títulos de ácido láctico (g/L) após 24 horas de fermentação de um mosto de milho liquefeito com 20% de conteúdo de sólidos secos (SS) na presença de várias peroxidases em comparação com um controle sem peroxidase e um controle no qual apenas penicilina foi usada.

[0031] A FIG. 4 mostra os títulos de etanol (g/L) após 24 horas de fermentação de um mosto de milho liquefeito com 20% de conteúdo de sólidos secos (SS) na presença de várias peroxidases em comparação com um controle sem peroxidase e um controle no qual apenas penicilina foi usada.

[0032] A FIG. 5 mostra os títulos de ácido láctico (g/L) após 24 horas de fermentação de um mosto de milho liquefeito com 20% de conteúdo de sólidos secos (SS) na presença de várias peroxidases em comparação com um controle sem peroxidase e um controle no qual apenas penicilina foi usada.

[0033] A FIG. 6 mostra os títulos de etanol (g/L) após 60 horas de fermentação de um mosto de milho liquefeito com 32% de conteúdo de sólidos secos (SS) na presença de várias peroxidases em comparação com um controle sem peroxidase e um controle no qual apenas penicilina foi usada.

[0034] A FIG. 7 mostra os títulos de ácido láctico (g/L) após 60 horas de fermentação de um mosto de milho liquefeito com 32% de conteúdo de sólidos secos (SS) na presença de várias peroxidases em comparação com um controle sem peroxidase e um controle no qual apenas penicilina foi usada.

[0035] A FIG. 8A, FIG. 8B, FIG. 8C, FIG. 8D e FIG. 8E são imagens de Cytation que mostram o crescimento de células de levedura em um meio nutriente estéril sem peroxidase (controle; FIG. 8A) e na presença de concentrações crescentes de peroxidase (5 uL de Catalase de T.a. (FIG. 8B); 25 uL de Catalase de T.a. (FIG. 8C); 50 uL de Catalase de T.a. (FIG. 8D); e 200 uL de Catalase de T.a. (FIG. 8E)).

[0036] A FIG. 9 é um gráfico que mostra a contagem média de células da levedura mostrada na FIG. 8A, FIG. 8B, FIG. 8C, FIG. 8D e FIG. 8E, conforme contada usando o programa Cytation.

[0037] A FIG. 10 é um gráfico que mostra os efeitos de determinadas peroxidases no crescimento de levedura em uma propagação de 14 L em comparação com um controle de linha de base sem peroxidase.

[0038] A FIG. 11A é um gráfico que mostra os títulos de glicose (g/L) após 6 horas de propagação em 20% de SS com e sem tratamento com peroxidase.

[0039] A FIG. 11B é um gráfico que mostra os títulos de etanol (g/L) após 6 horas de propagação em 20% de SS com e sem tratamento com peroxidase.

[0040] A FIG. 12 é um gráfico que mostra a cinética de fermentação inicial de levedura tratada com concentrações crescentes (10 uL, 50 uL, 100 uL e 450 uL) de uma peroxidase em comparação com os controles, conforme medida por um monitor de pressão da Ankom.

[0041] A FIG. 13A é um gráfico que mostra os títulos de ácido láctico (g/L) após 60 horas de fermentação a 32% de SS, após a propagação de levedura na presença de várias concentrações de peroxidase.

[0042] A FIG. 13B é um gráfico que mostra os títulos de etanol (g/L) após 60 horas de fermentação a 32% de SS, após a propagação de levedura na presença de várias concentrações de peroxidase.

[0043] A FIG. 13C é um gráfico que mostra os títulos de DP2 (g/L) após 60 horas de fermentação a 32% de SS, após a propagação de levedura na presença de várias concentrações de peroxidase. Definições

[0044] A não ser que definidos de outro modo ou claramente indicado pelo contexto, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

[0045] Alfa-amilases: As alfa-amilases (E.C. 3.2.1.1) são um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise do amido e outros oligo- e polissacarídeos 1,4-glicosídicos lineares e ramificados. O especialista na técnica saberá como determinar a atividade de alfa-amilase. Pode ser determinada de acordo com o procedimento descrito nos Exemplos, por exemplo, pelo ensaio PNP-G7 ou pelo ensaio EnzCheck.

[0046] Beta-glucosidase: O termo “beta-glucosidase” significa uma beta-D-glucosídeo gluco-hidrolase (E.C. 3.2.1.21) que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glicose não redutores terminais com a liberação de beta-D-glicose. A atividade de beta-glucosidase pode ser determinada usando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo como substrato de acordo com o procedimento de Venturi et al., 2002, J. Basic Microbiol. 42: 55 a 66. Uma unidade de beta-glucosidase é definida como 1,0 µmol de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 25 °C, pH 4,8 a partir de p-nitrofenil- beta-D-glucopiranosídeo 1 mM como substrato em citrato de sódio 50 mM contendo 0,01% de TWEEN® 20.

[0047] Beta-xilosidase: O termo “beta-xilosidase” significa uma beta-D-xilosídeo xilo-hidrolase (E.C. 3.2.1.37) que catalisa a exo- hidrólise de beta (1→4)-xilo-oligossacarídeos curtos para remover resíduos de D-xilose sucessivos de terminais não redutores. A atividade de beta- xilosidase pode ser determinada usando p-nitrofenil-beta-D-xilosídeo 1 mM como substrato em citrato de sódio 100 mM contendo 0,01% de TWEEN® 20, a pH 5, 40 °C. Uma unidade de beta-xilosidase é definida como 1,0 µmol de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 40 °C, pH 5 a partir de p- nitrofenil-beta-D-xilosídeo 1 mM em citrato de sódio 100 mM contendo 0,01% de TWEEN® 20.

[0048] Catalase: O termo “catalase” significa uma peróxido de hidrogênio:peróxido de hidrogênio oxidorredutase (EC 1.11.1.6) que catalisa a conversão de 2 H2O2 em O2 + 2 H2O. Para propósitos da presente invenção, a atividade de catalase é determinada de acordo com a Patente dos E.U.A. N.º 5.646.025. Uma unidade de atividade de catalase é igual à quantidade de enzima que catalisa a oxidação de 1 µmol de peróxido de hidrogênio sob as condições de teste.

[0049] cDNA: O termo “cDNA” é definido no presente documento como uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de RNAm madura, encadeada, obtida de uma célula eucariótica. O cDNA não tem sequências intrônicas que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA inicial, primário, é um precursor de RNAm que é processado através de uma série de etapas antes de aparecer como RNAm encadeado maduro. Essas etapas incluem a remoção de sequências intrônicas por um processo denominado splicing. Em consequência, cDNA derivado de RNAm está desprovido de quaisquer sequências intrônicas.

[0050] Celobio-hidrolase: O termo “celobio-hidrolase” significa uma 1,4-beta-D-glucana celobio-hidrolase (E.C. 3.2.1.91 e E.C.

3.2.1.176) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celo-oligossacarídeos ou qualquer polímero contendo glicose ligada em beta-1,4, liberando celobiose da extremidade redutora (celobio- hidrolase I) ou extremidade não redutora (celobio-hidrolase II) da cadeia (Teeri, 1997, Trends in Biotechnology 15: 160 a 167; Teeri et al., 1998, Biochem. Soc. Trans. 26: 173 a 178). A atividade de celobio-hidrolase pode ser determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273 a 279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152 a 156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283 a 288; e Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575 a 581.

[0051] Atividade intensificadora de atividade celulolítica: O termo “atividade intensificadora de atividade celulolítica” é definido no presente documento como uma atividade biológica que aumenta a hidrólise de um material celulósico por polipeptídeos com atividade celulolítica. Para propósitos da presente invenção, a atividade intensificadora de atividade celulolítica é determinada por medição do aumento de açúcares redutores ou do aumento do total de celobiose e glicose da hidrólise de um material celulósico por proteína celulolítica sob as seguintes condições: 1 a 50 mg de proteína total/g de celulose em PMP, em que a proteína total é compreendida de 50 a 99,5% p/p de proteína celulolítica e 0,5 a 50% p/p de proteína com atividade intensificadora de atividade celulolítica por 1 a 7 dias a 50 a 65 °C em comparação com uma hidrólise de controle com carga igual de proteína total sem atividade intensificadora de atividade celulolítica (1 a 50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PMP). Em um aspecto preferencial, uma mistura de CELLUCLAST 1,5 L (Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca) na presença de 3% do peso de proteína total de beta- glucosidase de Aspergillus oryzae (produzida de forma recombinante em Aspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014) ou 3% do peso de proteína total de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (produzida de forma recombinante em Aspergillus oryzae como descrito em WO 02/095014) de carga de proteína celulase é usada como a fonte da atividade celulolítica.

[0052] Os polipeptídeos que têm atividade intensificadora de atividade celulolítica aumentam a hidrólise de um material celulósico catalisada por proteínas com atividade celulolítica ao reduzirem a quantidade de enzima celulolítica necessária para alcançar o mesmo grau de hidrólise em preferencialmente pelo menos 1,01 vezes, mais preferencialmente pelo menos 1,05 vezes, mais preferencialmente pelo menos 1,10 vezes, mais preferencialmente pelo menos 1,25 vezes, mais preferencialmente pelo menos 1,5 vezes, mais preferencialmente pelo menos 2 vezes, mais preferencialmente pelo menos 3 vezes, mais preferencialmente pelo menos 4 vezes, mais preferencialmente pelo menos 5 vezes, ainda mais preferencialmente pelo menos 10 vezes e muito preferencialmente pelo menos 20 vezes.

[0053] Enzima celulolítica, composição celulolítica ou celulase: O termo “enzima celulolítica”, “composição celulolítica” ou “celulase” significa uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas que hidrolisam um material celulósico. Tais enzimas incluem endoglucanase(s),

celobio-hidrolase(s), beta-glucosidase(s) ou combinações das mesmas. As duas abordagens básicas para medição da atividade celulolítica incluem: (1) medição da atividade celulolítica total, e (2) medição das atividades celulolíticas individuais (endoglucanases, celobio-hidrolases e beta- glucosidases) como revisto em Zhang et al., Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452 a 481. A atividade celulolítica total é normalmente medida usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman N.º 1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de algas, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio mais comum de atividade celulolítica total é o ensaio de papel de filtro usando papel de filtro Whatman N.º 1 como o substrato. O ensaio foi estabelecido pela International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257 a 268).

[0054] A atividade de enzimas celulolíticas é determinada por medição do aumento da hidrólise de um material celulósico por enzima(s) celulolítica(s) sob as seguintes condições: 1 a 50 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulose em Palha de Milho Pré-Tratada (“PMP”) (ou outro material celulósico pré-tratado) durante 3 a 7 dias a uma temperatura adequada, por exemplo, 50 ºC, 55 ºC ou 60 ºC, em comparação com uma hidrólise de controle sem adição de proteína de enzima celulolítica. Condições típicas são reações de 1 mL, PMP lavada ou não lavada, 5% de sólidos insolúveis, acetato de sódio 50 mM pH 5, MnSO4 1 mM, 50 °C, 55 °C ou 60 °C, 72 horas, análise de açúcares por coluna HPX-87H AMINEX® (Bio- Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, E.U.A.).

[0055] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” ou “região codificante” significa uma sequência polinucleotídica que especifica a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma fase de leitura aberta, que normalmente começa com o códon de iniciação ATG ou códons de iniciação alternativos, tais como GTG e TTG, e termina com um códon de terminação, tal como TAA, TAG e TGA. A sequência codificante pode ser uma sequência de DNA genômico, cDNA, um polinucleotídeo sintético e/ou um polinucleotídeo recombinante.

[0056] Sequência de controle: O termo “sequência de controle” significa uma sequência de ácido nucleico necessária para expressão do polipeptídeo. As sequências de controle podem ser nativas ou estranhas ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo e nativas ou estranhas entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, uma sequência líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, sequência promotora, sequência de peptídeo sinal e sequência terminadora da transcrição. As sequências de controle podem ser dotadas de ligantes para a finalidade de introdução de sítios de restrição específicos, facilitando a ligação das sequências de controle com a região codificante do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

[0057] Endoglucanase: O termo “endoglucanase” significa uma 4-(1,3;1,4)-beta-D-glucana 4-glucano-hidrolase (E.C. 3.2.1.4) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas na celulose, derivados da celulose (tais como carboximetilcelulose e hidroxietilcelulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3-1,4 glucanas mistas, tais como beta- D-glucanas ou xiloglucanas de cereais, e outro material vegetal contendo componentes celulósicos. A atividade de endoglucanase pode ser determinada por medição da redução da viscosidade do substrato ou aumento das extremidades redutoras determinado por um teste de açúcares redutores (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452 a 481). A atividade de endoglucanase pode ser também determinada usando carboximetilcelulose (CMC) como substrato de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257 a 268, a pH 5, 40 °C.

[0058] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional e secreção. A expressão pode ser medida — por exemplo, para se detectar expressão aumentada — por técnicas conhecidas na técnica, tais como medição dos níveis de RNAm e/ou polipeptídeo traduzido.

[0059] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam sua expressão.

[0060] Glicosídeo hidrolase da Família 61: O termo “glicosídeo hidrolase da Família 61” ou “Família GH61” ou “GH61” significa um polipeptídeo da Família 61 de glicosídeo hidrolases de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino- acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309 a 316, e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695 a 696. As enzimas desta família foram originalmente classificadas como uma família de glicosídeo hidrolases com base na medição de atividade de endo-1,4-beta-D-glucanase muito fraca em um membro da família. A estrutura e modo de ação destas enzimas não são canônicos e estas não podem ser consideradas glicosidases verdadeiras. No entanto são mantidas na classificação CAZy com base na sua capacidade de intensificar a degradação de lignocelulose quando usadas em conjunto com uma celulase ou uma mistura de celulases.

[0061] Meio fermentável: O termo “meio fermentável” ou “meio de fermentação” se refere a um meio que compreende um ou mais (por exemplo, dois, vários) açúcares, tais como glicose, frutose, sacarose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose e/ou oligossacarídeos solúveis, em que o meio é capaz, em parte, de ser convertido (fermentado) por uma célula hospedeira em um produto desejado, tal como etanol. Em alguns casos, o meio de fermentação é derivado de uma fonte natural, tal como cana-de-açúcar, amido ou celulose. O termo meio de fermentação é entendido no presente documento como se referindo a um meio antes do organismo fermentador ser adicionado, tal como um meio que resulta de um processo de sacarificação, bem como um meio usado em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SFS).

[0062] Organismo fermentador: O termo “organismo fermentador” se refere a qualquer organismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, tais como levedura e fungos filamentosos, adequado para a produção de um produto de fermentação desejado. Os organismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, isto é, converter, açúcares fermentáveis, tais como arabinose, frutose, glicose, maltose, manose ou xilose, diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado.

[0063] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo que tem um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro principal; em que o fragmento tem atividade enzimática. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos 90% ou pelo menos 95% dos resíduos de aminoácidos do polipeptídeo maduro de uma enzima.

[0064] Glucoamilase: O termo “glucoamilase” (1,4-alfa-D- glucana gluco-hidrolase, EC 3.2.1.3) é definido como uma enzima que catalisa a liberação de D-glicose a partir das extremidades não redutoras de amido ou moléculas oligo- e polissacarídicas relacionadas. Para propósitos da presente invenção, a atividade de glucoamilase é determinada de acordo com o procedimento descrito nos Exemplos no presente documento. A Unidade de Glucoamilase (UGA) é definida como a quantidade de enzima que hidrolisa 1 micromol de maltose por minuto sob as condições padrão de 37 °C, pH 4,3, substrato: maltose 23,2 mM, tampão: acetato 0,1 M, tempo de reação 5 minutos.

[0065] Enzima hemicelulolítica ou hemicelulase: O termo “enzima hemicelulolítica” ou “hemicelulase” significa uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico. Veja, por exemplo, Shallom e Shoham, 2003, Current Opinion In Microbiology 6(3): 219 a 228. As hemicelulases são componentes-chave na degradação de biomassa vegetal. Exemplos de hemicelulases incluem, mas não estão limitados a, uma acetilmanana esterase, uma acetilxilana esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido cumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glucuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase. Os substratos para estas enzimas, hemiceluloses, são um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados e lineares que estão ligados através de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede celular vegetal, reticulando as mesmas em uma rede robusta. As hemiceluloses estão também covalentemente ligadas à lignina, formando em conjunto com a celulose uma estrutura altamente complexa. A estrutura variável e a organização das hemiceluloses requerem a ação combinada de várias enzimas para a sua degradação completa. Os módulos catalíticos de hemicelulases são glicosídeo hidrolases (GH) que hidrolisam ligações glicosídicas ou carboidrato esterases (CE), que hidrolisam ligações de éster de grupos laterais de acetato ou ácido ferúlico. Estes módulos catalíticos, com base na homologia de sua sequência primária, podem ser atribuídos às famílias GH e CE. Algumas famílias, com um dobramento similar global, podem ser adicionalmente agrupadas em clãs, marcados alfabeticamente (por exemplo, GH-A). Uma classificação mais informativa e atualizada destas e outras enzimas ativas em carboidratos está disponível no banco de dados

Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy). As atividades de enzimas hemicelulolíticas podem ser medidas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & AppI. Chem. 59: 1739 a 1752, a uma temperatura adequada, tal como 40 °C a 80 °C, por exemplo, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C ou 70 °C, e a um pH adequado, tal como 4 a 9, por exemplo, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 ou 7,0.

[0066] Polinucleotídeo heterólogo: O termo “polinucleotídeo heterólogo” é definido no presente documento como um polinucleotídeo que não é nativo da célula hospedeira; um polinucleotídeo nativo no qual modificações estruturais foram feitas na região codificante; um polinucleotídeo nativo cuja expressão está quantitativamente alterada em resultado de uma manipulação do DNA por técnicas de DNA recombinante, por exemplo, um promotor diferente (estranho); ou um polinucleotídeo nativo em uma célula hospedeira que tem uma ou mais cópias extras do polinucleotídeo para alterar quantitativamente a expressão. Um “gene heterólogo” é um gene que compreende um polinucleotídeo heterólogo.

[0067] Condições de alta estringência: O termo “condições de alta estringência” significa, para sondas de, pelo menos, 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 50%, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando SSC 0,2X, SDS a 0,2% a 65 °C.

[0068] Sequência homóloga: O termo “sequência homóloga” é definido no presente documento como uma proteína prevista como tendo um valor de E (ou pontuação de expectativa) menor do que 0,001 em uma busca tfasty (Pearson, W.R., 1999, em Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener e S. A. Krawetz, editores, páginas 185 a 219) com um polipeptídeo de interesse.

[0069] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula suscetível de transformação, transfecção, transdução e similar, com uma construção de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo descrito no presente documento (por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma alfa-amilase, glucoamilase ou protease). O termo “célula hospedeira” engloba qualquer progênie de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. O termo “célula recombinante” é definido no presente documento como uma célula hospedeira de ocorrência não natural que compreende um ou mais (por exemplo, dois, vários) polinucleotídeos heterólogos.

[0070] Identidade: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências nucleotídicas é descrita pelo parâmetro “identidade”.

[0071] Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453), como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276 a 277), de preferência a versão

3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade para abertura de lacuna de 10, penalidade para extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a porcentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento) Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências desoxirribonucleotídicas é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), de preferência, versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade para abertura de lacuna de 10, penalidade para extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a porcentagem de identidade e é calculado como se segue:

[0072] (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento).

[0073] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que está pelo menos parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes de ocorrência natural aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0074] Condições de baixa estringência: O termo

“condições de baixa estringência” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25%, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando SSC 0,2X, SDS a 0,2% a 50 °C.

[0075] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” é definido no presente documento como um polipeptídeo com atividade biológica que está em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncamento C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro consiste nos aminoácidos 20 a 717 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Os aminoácidos 1 a 19 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 são um peptídeo sinal previsto. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro consiste nos aminoácidos 23 a 351 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3. Os aminoácidos 1 a 22 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 são um peptídeo sinal previsto.

[0076] É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. É também conhecido na técnica que diferentes células hospedeiras processam polipeptídeos de forma diferente e, assim, uma célula hospedeira que expressa um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (por exemplo, tendo um aminoácido C- terminal e/ou N-terminal diferente) em comparação com outra célula hospedeira que expressa o mesmo polinucleotídeo.

[0077] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo “sequência codificante de polipeptídeo maduro” é definido no presente documento como uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo maduro.

[0078] Condições de média estringência: O termo “condições de média estringência” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35%, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando SSC 0,2X, SDS a 0,2% a 55 °C.

[0079] Condições de média-alta estringência: O termo “condições de média-alta estringência” significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35%, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando SSC 0,2X, SDS a 0,2% a 60 °C.

[0080] Modificação: O termo “modificação” significa, no presente documento, qualquer modificação química de um polipeptídeo, bem como manipulação genética do DNA que codifica o polipeptídeo. A modificação pode ser uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção de um ou mais (vários) aminoácidos, bem como substituições de uma ou mais (várias) cadeias laterais de aminoácidos.

[0081] Mutante: O termo “mutante” significa um polinucleotídeo que codifica uma variante.

[0082] Construção de ácido nucleico: O termo “construção de ácido nucleico” como usado no presente documento refere-se a uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou que é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiriam de outro modo na natureza ou que são sintéticos. O termo construção de ácido nucleico é sinônimo do termo “cassete de expressão” quando a construção de ácido nucleico contém as sequências de controle necessárias para expressão de uma sequência codificante.

[0083] Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.

[0084] Peroxidase: O termo “Peroxidase” é definido no presente documento de modo a incluir enzimas que têm atividade de peroxidase e enzimas de decomposição de peróxido.

[0085] Atividade de peroxidase: O termo “atividade de peroxidase” é definido no presente documento como uma atividade enzimática que converte um peróxido, por exemplo, peróxido de hidrogênio, em uma espécie menos oxidativa, por exemplo, água. Entende-se no presente documento que um polipeptídeo com atividade de peroxidase engloba uma enzima de decomposição de peróxido (definida abaixo) e é usado de forma intercambiável no presente documento com “peroxidase”.

[0086] Enzima de decomposição de peróxido: O termo “enzima de decomposição de peróxido” é definido no presente documento como uma doador:peróxido oxidorredutase (número E.C. 1.11.1.x) que catalisa a reação substrato reduzido(2e-) + ROOR' → substrato oxidado + ROH + R'OH; tal como peroxidase de raiz forte que catalisa a reação fenol + H2O2 → quinona + H2O, e catalase que catalisa a reação H2O2 + H2O2 → O2 + 2H2O. Adicionalmente ao peróxido de hidrogênio, outros peróxidos podem ser também decompostos por estas enzimas.

[0087] Fragmento polipeptídico: O termo “fragmento polipeptídico” é definido no presente documento como um polipeptídeo que tem um ou mais (vários) aminoácidos eliminados do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro ou de uma sequência homóloga do mesmo, em que o fragmento tem atividade biológica.

[0088] Palha de milho pré-tratada: O termo “Palha de Milho Pré-tratada” ou “PMP” significa um material contendo celulose derivado de palha de milho por tratamento com calor e ácido sulfúrico diluído, pré- tratamento alcalino, pré-tratamento neutro ou qualquer pré-tratamento conhecido na técnica.

[0089] Protease: O termo “protease” é definido no presente documento como uma enzima que hidrolisa ligações peptídicas. O termo inclui qualquer enzima que pertence ao grupo de enzimas EC 3.4 (incluindo cada uma das suas treze subclasses). O número EC se refere à Nomenclatura de Enzimas de 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, Califórnia, incluindo os suplementos 1 a 5 publicados em Eur. J. Biochem. 223: 1 a 5 (1994); Eur. J. Biochem. 232: 1 a 6 (1995); Eur. J. Biochem. 237: 1 a 5 (1996); Eur. J. Biochem. 250: 1 a 6 (1997); e Eur. J. Biochem. 264: 610 a 650 (1999); respectivamente. O termo “subtilases” refere-se a um subgrupo de serina proteases de acordo com Siezen et al., 1991, Protein Engng. 4: 719 a 737 e Siezen et al., 1997, Protein Science 6: 501 a 523.

[0090] As proteases são classificadas com base no seu mecanismo catalítico nos seguintes grupos: Serina proteases (S), Cisteína proteases (C), Proteases aspárticas (A), Metaloproteases (M) e Proteases desconhecidas, ou ainda não classificadas, (U) veja Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (eds), Academic Press (1998), em particular a parte da introdução geral.

[0091] Os polipeptídeos que têm atividade de protease, ou proteases, são por vezes também designados peptidases, proteinases, peptídeo hidrolases ou enzimas proteolíticas. As proteases podem ser do tipo exo (exopeptidases) que hidrolisam peptídeos começando em qualquer uma das suas extremidades, ou do tipo endo que atuam internamente em cadeias polipeptídicas (endopeptidases).

[0092] Em modalidades particulares, as proteases para uso nos processos da invenção são selecionadas do grupo que consiste em: (a) proteases pertencentes às metaloendopeptidases EC

3.4.24; (b) metaloproteases pertencentes ao grupo M do Handbook acima; (c) metaloproteases ainda não atribuídas a clãs (designação: Clã MX), ou pertencentes a qualquer um dos clãs MA, MB, MC, MD, ME, MF, MG, MH (tal como definidas nas páginas 989 a 991 do Handbook acima); (d) outras famílias de metaloproteases (tal como definidas nas páginas 1448 a 1452 do Handbook acima); (e) metaloproteases com um motivo HEXXH; (f) metaloproteases com um motivo HEFTH; (g) metaloproteases pertencentes a qualquer uma das famílias M3, M26, M27, M32, M34, M35, M36, M41, M43 ou M47 (como definidas nas páginas 1448 a 1452 do Handbook acima); e (h) metaloproteases pertencentes à família M35 (como definidas nas páginas 1492 a 1495 do Handbook acima).

[0093] Atividade de protease: O termo “atividade de protease” significa atividade proteolítica (EC 3.4). Existem vários tipos de atividade de protease tais como proteases tipo tripsina que clivam do lado carboxi-terminal de resíduos Arg e Lys e proteases tipo quimotripsina que clivam do lado carboxi-terminal de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos.

[0094] A atividade de protease pode ser medida usando qualquer ensaio, no qual um substrato é empregue, que inclua ligações peptídicas relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH do ensaio e a temperatura do ensaio devem ser, do mesmo modo, adaptados para a protease em questão. Exemplos de valores de pH do ensaio são pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Exemplos de temperaturas do ensaio são 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 ou 95 °C. Exemplos de substratos de protease gerais são caseína, albumina de soro bovino e hemoglobina. No método clássico de Anson e Mirsky é usada hemoglobina desnaturada como substrato e, após a incubação do ensaio com a protease em questão, a quantidade de hemoglobina solúvel em ácido tricloroacético é determinada como uma medição da atividade de protease (Anson, M.L. e Mirsky, A.E., 1932, J. Gen. Physiol. 16: 59 e Anson, M.L., 1938, J. Gen. Physiol. 22: 79).

[0095] Para o propósito da presente invenção, a atividade de protease pode ser determinada usando ensaios que são descritos em “Materiais e Métodos”, tais como o ensaio Cinético de Suc-AAPF-pNA, Ensaio de Protazyme AK, Ensaio cinético de Suc-AAPX-pNA e o- Ftaldialdeído (OPA). Para o ensaio de Protazyme AK, o substrato insolúvel de Protazyme AK (Caseína Reticulada com Azurina) libera uma cor azul quando incubado com a protease e a cor é determinada como uma medida da atividade de protease. Para o ensaio de Suc-AAPF-pNA, o substrato incolor de Suc-AAPF-pNA libera para-nitroanilina amarela quando incubado com a protease e a cor amarela é determinada como uma medida da atividade de protease.

[0096] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências nucleotídicas é descrita pelo parâmetro “identidade de sequência”.

[0097] Para propósitos descritos no presente documento, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 1970, 48, 443 a 453) como implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., Trends Genet 2000, 16, 276 a 277), preferencialmente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade para abertura de lacuna de 10, penalidade para extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a porcentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento da Sequência Referenciada – Número Total de Lacunas no Alinhamento)

[0098] Para propósitos descritos no presente documento, o grau de identidade de sequência entre duas sequências desoxirribonucleotídicas é determinado usando o algoritmo de Needleman- Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão

3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade para abertura de lacuna de 10, penalidade para extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a porcentagem de identidade e é calculado como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento da Sequência Referenciada – Número Total de Lacunas no Alinhamento)

[0099] Peptídeo sinal: O termo “peptídeo sinal” é definido no presente documento como um peptídeo ligado (fundido) em fase ao terminal amino de um polipeptídeo que tem atividade biológica e direciona o polipeptídeo para a via secretora da célula.

[0100] Subsequência: O termo “subsequência” é definido no presente documento como uma sequência nucleotídica que tem um ou mais (vários) nucleotídeos eliminados da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante do polipeptídeo maduro ou de uma sequência homóloga da mesma, em que a subsequência codifica um fragmento polipeptídico com atividade biológica.

[0101] Trealase: O termo “trealase” significa uma enzima que degrada a trealose nos seus monossacarídeos unitários (isto é, glicose). As trealases são classificadas em EC 3.2.1.28 (alfa,alfa-trealase) e EC. 3.2.1.93 (alfa,alfa-fosfotrealase). As classes de EC são baseadas nas recomendações do Nomenclature Committee da International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). Uma descrição das classes de EC pode ser encontrada na internet, por exemplo, em “http://www.expasy.org/enzyme/”. As trealases são enzimas que catalisam as seguintes reações: EC 3.2.1.28: Alfa,alfa-trealose + H2O  2 D-glicose; EC 3.2.1. 93: Alfa,alfa-trealose 6-fosfato + H2O  D-glicose + D-glicose 6- fosfato.

[0102] Para propósitos da presente invenção, a atividade de trealase pode ser determinada de acordo com o procedimento do ensaio de trealase descrito abaixo. PRINCÍPIO: Trealose + H2O Trealase > 2 Glicose T = 37 °C, pH = 5,7, A340 nm, Percurso óptico = 1 cm Determinação da Taxa de Paragem Espectrofotométrica

Definição de unidade:

[0103] Uma unidade irá converter 1,0 mmol de trealose em 2,0 mmols de glicose por minuto a pH 5,7 a 37 °C (glicose liberada determinada a pH 7,5).

[0104] (Veja Dahlqvist, A. (1968) Analytical Biochemistry 22, 99 a 107)

[0105] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo com atividade enzimática ou atividade intensificadora de enzima que compreende uma alteração, isto é, uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Uma substituição significa a troca do aminoácido que ocupa uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa a remoção do aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa a adição de um aminoácido adjacente ao e imediatamente após o aminoácido que ocupa uma posição. Variantes da invenção podem ter pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de referência (por exemplo, uma enzima descrita no presente documento). Em algumas modalidades, a variante tem menos de 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de referência (por exemplo, uma enzima descrita no presente documento).

[0106] Condições de muito alta estringência: O termo “condições de muito alta estringência” significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 50%, seguindo procedimentos padrão de Southern blotting durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando SSC 0,2X, SDS a 0,2% a 70 °C.

[0107] Condições de muito baixa estringência: O termo “condições de muito baixa estringência” significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25%, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando SSC 0,2X, SDS a 0,2% a 45 °C.

[0108] Xilanase: O termo “xilanase” significa uma 1,4-beta- D-xilana-xilo-hidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-xilosídicas em xilanas. A atividade de xilanase pode ser determinada com AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em TRITON® X-100 a 0,01% e fosfato de sódio 200 mM pH 6 a 37 °C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 μmol de azurina produzido por minuto a 37 °C, pH 6 a partir de AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em fosfato de sódio 200 mM pH 6.

[0109] A referência a “cerca de” um valor ou parâmetro no presente documento inclui modalidades que são dirigidas a esse valor ou parâmetro propriamente dito. Por exemplo, uma descrição que se refere a “cerca de X” inclui a modalidade “X”. Quando usado em combinação com valores medidos, “cerca de” inclui uma faixa que engloba pelo menos a incerteza associada ao método de medição do valor particular e pode incluir uma faixa de mais ou menos dois desvios padrão em torno do valor mencionado.

[0110] Do mesmo modo, a referência a um gene ou polipeptídeo que é “derivado de” outro gene ou polipeptídeo X inclui o gene ou polipeptídeo X.

[0111] Como usadas no presente documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um(a)”, “ou” e “o/a” incluem suas referentes plurais a não ser que o contexto dite claramente de outro modo.

[0112] É entendido que as modalidades descritas no presente documento incluem as modalidades “que consistem” e/ou “que consistem essencialmente em”. Como usada no presente documento, exceto onde o contexto requeira de outro modo devido à linguagem expressa ou implicação necessária, a palavra “compreendem” ou variações tais como “compreende” ou “compreendendo” é usada em um sentido inclusivo, isto é, para especificar a presença das características indicadas, mas não para excluir a presença ou a adição de características adicionais em várias modalidades.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0113] A presente invenção refere-se ao uso de peroxidases para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura, por exemplo, durante a propagação de levedura, tal como especialmente durante a propagação de levedura para a produção de bioproduto em um sistema de fermentação de biocombustível. A presente invenção também se refere a processos para a produção de um produto de fermentação a partir de um material contendo amido usando um organismo fermentador, em que uma peroxidase é adicionada durante a propagação de levedura e/ou durante a fermentação.

[0114] Os inventores descobriram surpreendentemente que o crescimento de levedura aumenta quando a levedura é cultivada na presença de peroxidase. Os dados apresentados no presente documento demonstram inesperadamente que peroxidases melhoram a cinética inicial da levedura durante a propagação e/ou fermentação e, em particular, que a levedura propagada com peroxidase consome mais glicose e aumenta significativamente os títulos de etanol nas primeiras seis horas de propagação em comparação com propagações de controle sem peroxidase. Surpreendentemente, quando tal levedura propagada foi transferida para fermentação e a levedura foi desafiada com infecção, a levedura tratada com peroxidase foi capaz de vencer a infecção de forma mais produtiva, conforme medido por títulos de ácido láctico reduzidos. I. AUMENTO DO CRESCIMENTO E/OU DA PRODUTIVIDADE

DO ORGANISMO FERMENTADOR

[0115] Em um aspecto, a invenção se refere a um processo para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de um organismo fermentador, em que o processo compreende colocar um organismo fermentador em contato com uma quantidade eficaz de uma peroxidase ou uma composição compreendendo um polipeptídeo com atividade de peroxidase.

[0116] Em uma modalidade, a invenção se refere a um processo para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura, em que o processo compreende colocar a levedura em contato com uma quantidade eficaz de uma peroxidase ou uma composição compreendendo um polipeptídeo com atividade de peroxidase.

[0117] Como usadas no presente documento, as expressões “aumentar o crescimento e/ou a produtividade de um organismo fermentador” e “aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura” abrangem aumentar o crescimento de um organismo fermentador/crescimento de levedura, aumentar a produtividade de um organismo fermentador/produtividade de levedura ou tanto aumentar o crescimento de um organismo fermentador/crescimento de levedura como aumentar a produtividade de um organismo fermentador/produtividade de levedura.

[0118] A expressão “aumentar o crescimento de levedura” abrange aumentar a taxa de crescimento e o rendimento de biomassa (por exemplo, aumentar o número de células de levedura em uma população) durante fermentação tanto aeróbica como anaeróbica. Deve ser apreciado que “aumentar a taxa de crescimento” envolve um aumento na taxa de crescimento sustentado e/ou um aumento da taxa de crescimento instantâneo máximo. Deve ser entendido que a definição e a seguinte descrição de “aumentar o crescimento de levedura” é igualmente aplicável à expressão “aumentar o crescimento de um organismo fermentador”, exceto que a seguinte descrição é focada em levedura por uma questão de brevidade. Deve ser ainda entendido no contexto dos processos divulgados que o aumento da taxa de crescimento e/ou rendimento de biomassa de levedura colocada em contato com uma peroxidase ou composição de peroxidase é avaliado em relação a levedura nas mesmas condições ou condições similares, mas sem contato com uma peroxidase ou composição de peroxidase da invenção.

[0119] As peroxidases, composições e processos que compreendem a peroxidase podem resultar em um aumento detectável do rendimento de biomassa de levedura. Em vários aspectos da invenção, o rendimento de biomassa de levedura colocada em contato com a peroxidase ou composição de peroxidase é aumentado em pelo menos 1%, 3%, 5%, 10%, 11%, 13%, 15%, 17%, 21%, 24%, 26%, 32%, 35%, 40%, 45%, 50%, 54%, 58%, 61%, 63%, 66%, 70%, 75%, 77%, 80%, 85%, 90%, 1 vez, 1,1 vezes, 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 1,6 vezes, 1,7 vezes, 1,8 vezes, 1,9 vezes, 2,0 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes em comparação com o crescimento de levedura sob as mesmas condições ou condições similares, mas sem contato com a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0120] As peroxidases, composições e processos que compreendem a peroxidase podem resultar em um aumento detectável da taxa de crescimento da levedura. Em vários aspectos da invenção, a taxa de crescimento de levedura colocada em contato com a peroxidase ou composição de peroxidase é aumentada em pelo menos 1%, 3%, 5%, 10%, 11%, 13%, 15%, 17%, 21%, 24%, 26%, 32%, 35%, 40%, 45%, 50%, 54%, 58%, 61%, 63%, 66%, 70%, 75%, 77%, 80%, 85%, 90%, 1 vez, 1,1 vezes, 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 1,6 vezes, 1,7 vezes, 1,8 vezes, 1,9 vezes, 2,0 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes em comparação com a taxa de crescimento de levedura sob as mesmas condições ou condições similares, mas sem contato com a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0121] O termo “aumentar a produtividade de levedura” abrange um aumento da taxa na qual um produto de fermentação é produzido pela levedura, um aumento dos títulos absolutos do produto de fermentação produzido pela levedura, bem como um aumento da taxa ou quantidade de nutriente consumido pela levedura. Por exemplo, as peroxidases, composições e processos que compreendem peroxidase podem aumentar a taxa de produção de metabólitos pela levedura e/ou produção de enzimas pela levedura (por exemplo, expressão de enzimas heterólogas). Deve ser entendido que a definição e a seguinte descrição de “aumentar a produtividade de levedura” é igualmente aplicável à expressão “aumentar a produtividade de um organismo fermentador”, exceto que a seguinte descrição é focada em levedura por uma questão de brevidade. Deve ser ainda entendido no contexto dos processos divulgados que os aumentos da taxa e títulos absolutos do produto de fermentação de levedura, bem como o aumento da taxa ou quantidade de nutriente consumido pela levedura, são avaliados em relação à taxa e títulos absolutos do produto de fermentação de levedura e taxa ou quantidade de nutriente consumido por levedura sob as mesmas condições ou condições similares, mas sem contato com uma peroxidase da invenção. As peroxidases e composições e processos envolvendo as peroxidases resultam em um aumento estatisticamente significativo da produtividade da levedura.

[0122] Em vários aspectos da invenção, a produtividade da levedura colocada em contato com a peroxidase ou composição de peroxidase é aumentada em 1%, 3%, 5%, 10%, 11%, 13%, 15%, 17%, 21%, 24%, 26%, 32%, 35%, 40%, 45%, 50%, 54%, 58%, 61%, 63%, 66%, 70%, 75%, 77%, 80%, 85%, 90%, 1 vez, 1,1 vezes, 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 1,6 vezes, 1,7 vezes, 1,8 vezes, 1,9 vezes, 2,0 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes em comparação com a produtividade de levedura sob as mesmas condições ou condições similares, mas sem contato com a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0123] Em aspectos da invenção, a taxa na qual um produto de fermentação é produzido por levedura colocada em contato com uma peroxidase ou composição de peroxidase da invenção é aumentada em 1%, 3%, 5%, 10%, 11%, 13%, 15%, 17%, 21%, 24%, 26%, 32%, 35%, 40%, 45%, 50%, 54%, 58%, 61%, 63%, 66%, 70%, 75%, 77%, 80%, 85%, 90%, 1 vez, 1,1 vezes, 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 1,6 vezes, 1,7 vezes, 1,8 vezes, 1,9 vezes, 2,0 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou 10 vezes em comparação com a taxa na qual o produto de fermentação é produzido por levedura sob as mesmas condições ou condições similares, mas sem contato com a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0124] Em aspectos da invenção, o título absoluto do produto de fermentação produzido por levedura colocada em contato com uma peroxidase ou composição de peroxidase da invenção é aumentado em 1%, 3%, 5%, 10%, 11%, 13%, 15%, 17%, 21%, 24%, 26%, 32%, 35%, 40%, 45%, 50%, 54%, 58%, 61%, 63%, 66%, 70%, 75%, 77%, 80%, 85%, 90%, 1 vez, 1,1 vezes, 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 1,6 vezes, 1,7 vezes, 1,8 vezes, 1,9 vezes, 2,0 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou 10 vezes em comparação com o título do produto de fermentação produzido por levedura sob as mesmas condições ou condições similares, mas sem contato com a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0125] Em uma modalidade, a taxa na qual etanol é produzido por levedura colocada em contato com uma peroxidase ou composição de peroxidase da invenção é aumentada em 1%, 3%, 5%, 10%, 11%, 13%, 15%, 17%, 21%, 24%, 26%, 32%, 35%, 40%, 45%, 50%, 54%, 58%, 61%, 63%, 66%, 70%, 75%, 77%, 80%, 85%, 90%, 1 vez, 1,1 vezes, 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 1,6 vezes, 1,7 vezes, 1,8 vezes, 1,9 vezes, 2,0 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou 10 vezes em comparação com a taxa na qual o etanol é produzido por levedura sob as mesmas condições ou condições similares, mas sem contato com a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0126] Em uma modalidade, a taxa na qual glicose é consumida, ou a quantidade de glicose consumida, por levedura colocada em contato com uma peroxidase ou composição de peroxidase da invenção é aumentada em 1%, 3%, 5%, 10%, 11%, 13%, 15%, 17%, 21%, 24%, 26%, 32%, 35%, 40%, 45%, 50%, 54%, 58%, 61%, 63%, 66%, 70%, 75%, 77%, 80%, 85%, 90%, 1 vez, 1,1 vezes, 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 1,6 vezes, 1,7 vezes, 1,8 vezes, 1,9 vezes, 2,0 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou 10 vezes em comparação com a taxa na qual glicose é consumida, ou a quantidade de glicose consumida, por levedura sob as mesmas condições ou condições similares, mas sem contato com a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0127] O termo “contato” abrange qualquer método no qual uma peroxidase ou composição compreendendo uma peroxidase é colocada em contato físico com a levedura ou com um ambiente no qual a levedura reside. Por exemplo, a peroxidase ou composição de peroxidase pode ser formulada com uma composição de levedura (por exemplo, uma formulação de levedura em creme), a peroxidase ou composição de peroxidase pode ser adicionada a um meio compreendendo levedura (por exemplo, um meio nutriente), a peroxidase ou composição de peroxidase pode ser adicionada a um recipiente de fermentação compreendendo levedura (por exemplo, um tanque de propagação de levedura, um biorreator, etc.), ou a peroxidase ou composição de peroxidase pode ser adicionada a um recipiente compreendendo levedura (por exemplo, uma bolsa, um skid de dosagem, etc.).

[0128] O termo “quantidade eficaz” significa uma quantidade que irá aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura colocada em contato com a peroxidase ou composição de peroxidase em pelo menos uma quantidade estatisticamente significativa em comparação com o crescimento e/ou a produtividade de levedura nas mesmas condições, mas sem contato com a peroxidase ou composição de peroxidase. A quantidade eficaz dependerá de vários fatores conhecidos pelas pessoas de habilidade comum na técnica. Tais fatores incluem, mas não estão limitados a, a escala de fermentação ou propagação, o número de ciclos de propagação, a densidade de levedura inicial, a densidade de levedura final desejada, o conteúdo do meio de cultivo ou fermentação, o volume do biorreator ou recipiente de fermentação, o tipo de fermentação (por exemplo, modo de batelada, modo de batelada alimentada, etc.), o tempo de reação, a temperatura de reação e o pH de reação. Quantidades eficazes de peroxidase variam de 0,01 µg a 5000 µg de produto concentrado, de preferência de 0,10 µg a 2500 µg de produto concentrado, mais preferencialmente de 1 µg a 1000 µg de produto concentrado e ainda mais preferencialmente de 10 µg a 500 µg de produto concentrado. Em uma modalidade, uma quantidade eficaz de peroxidase varia de 10 µg a 450 µg de produto concentrado.

[0129] Qualquer organismo fermentador, tal como especialmente os organismos fermentadores descritos no presente documento sob o título “Organismo fermentador”, pode ser usado nos processos para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de um organismo fermentador. Em uma modalidade, o organismo fermentador é levedura. Em uma modalidade, a levedura pertence a um gênero selecionado de Saccharomyces, Rhodotorula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Rhodosporidium, Candida, Yarrowia, Lipomyces, Cryptococcus ou Dekkera. Em uma modalidade, a levedura é Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus (carlsbergiensis), Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Fusarium oxysporum ou qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em uma modalidade, a levedura compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima selecionada de uma alfa-amilase, uma glucoamilase ou uma protease.

[0130] Em uma modalidade, a peroxidase é uma peroxidase ou enzimas de decomposição de peróxido selecionadas de: E.C. 1.11.1.1 NADH peroxidase; E.C. 1.11.1.2 NADPH peroxidase; E.C. 1.11.1.3 ácido graxo peroxidase; E.C. 1.11.1.5 citocromo-c peroxidase; E.C. 1.11.1.5; E.C.

1.11.1.6 catalase; E.C. 1.11.1.7 peroxidase; E.C. 1.11.1.8 iodeto peroxidase; E.C. 1.11.1.9 glutationa peroxidase; E.C. 1.11.1.10 cloreto peroxidase; E.C.

1.11.1.11 L-ascorbato peroxidase; E.C. 1.11.1.12 Fosfolipídeo-hidroperóxido glutationa peroxidase; EC 1.11.1.13 manganês peroxidase; E.C. 1.11.1.14 lignina peroxidase; E.C. 1.11.1.15 peroxirredoxina; E.C. 1.11.1.16 peroxidase versátil; E.C. 1.11.1.B2 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.B6 iodeto peroxidase (contendo vanádio); E.C. 1.11.1.B7 brometo peroxidase; E.C. 1.11.1.B8 iodeto peroxidase. Em uma modalidade, a peroxidase é derivada de um microrganismo, tal como um organismo fúngico, tal como uma levedura ou fungos filamentosos, ou bactérias; ou planta. Em uma modalidade, a peroxidase é selecionada de: (i) uma peroxidase derivada de uma cepa de

Thermoascus, tal como uma cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 1 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 no presente documento; (ii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Mycothermus, tal como uma cepa de Mycothermus thermophilus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 2 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 no presente documento; ou (iii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Coprinus, tal como uma cepa de Coprinus cinereus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 3 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 no presente documento.

II. PRODUÇÃO DE ORGANISMOS FERMENTADORES

[0131] Aspectos da invenção referem-se a processos para a produção de organismos fermentadores que compreendem o cultivo de organismos fermentadores na presença de uma peroxidase ou composição compreendendo um polipeptídeo com atividade de peroxidase sob condições conducentes ao crescimento do organismo fermentador.

[0132] Em um aspecto, a invenção se refere a um processo para a produção de levedura que compreende o cultivo de levedura na presença de uma peroxidase ou composição compreendendo um polipeptídeo com atividade de peroxidase sob condições conducentes ao crescimento de levedura. O processo contempla a produção de levedura em qualquer escala (por exemplo, escala comercial). Os especialistas na técnica apreciarão que há uma variedade de condições conducentes ao crescimento de levedura que podem ser otimizadas para garantir o crescimento ideal de uma cepa de levedura particular (por exemplo, para produção comercial). Por exemplo, uma cultura de levedura pura pode ser cultivada em vários estágios de vários aumentos de escala antes de atingir o estágio de produção principal. Ao longo de cada estágio sucessivo, tamanhos de biorreator podem ser usados dependendo da quantidade desejada de levedura a ser produzida. Os exemplos abaixo descrevem condições exemplificativas para a produção de levedura em pequena escala. Em uma modalidade, a produção principal é realizada como uma propagação em batelada alimentada sob condições aeróbicas em um meio de cultura aquoso contendo uma fonte assimilável de nitrogênio, vitaminas, metais traço, sais e uma adição contínua de uma fonte de carboidrato. De preferência, o pH do caldo é controlado de 4,0 a 6,0 com amônia aquosa e/ou base diluída. A temperatura pode ser mantida entre 25 °C e 38 °C durante a propagação. As taxas de alimentação de carboidratos são selecionadas para atingir uma alta taxa de crescimento específico de modo que as taxas de alimentação não excedam a transferência de oxigênio ou a capacidade de resfriamento do propagador. A propagação pode levar entre 30 e 50 horas e termina com um caldo contendo entre 60 e 120% de sólidos secos de levedura. Após a propagação, as células de levedura são concentradas para processamento adicional no produto desejado (por exemplo, levedura em creme, levedura desintegrada, levedura seca ativa ou inativa, levedura comprimida, etc.), dependendo da aplicação (por exemplo, cozimento, produção de cerveja, fermentação de biocombustível, etc.). III. COMPOSIÇÕES DE ORGANISMO FERMENTADOR

[0133] Aspectos da invenção referem-se a composições que compreendem um organismo fermentador (por exemplo, um organismo fermentado descrito no presente documento) e um componente de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural. Em uma modalidade, a invenção se refere a uma composição que compreende uma cepa de levedura (por exemplo, uma cepa de levedura produzida de acordo com um processo descrito no presente documento) e um componente selecionado de um tensoativo, um emulsificante, uma goma, um agente de inchamento, um antioxidante, um auxiliar de processamento e/ou qualquer combinação dos mesmos. Em vários aspectos e modalidades, o organismo fermentador na composição é um organismo fermentador produzido por contato, cultivo, cultura, produção e/ou propagação do organismo fermentador com uma peroxidase ou uma composição de peroxidase. Em vários aspectos e modalidades, o organismo fermentador na composição é uma cepa de levedura produzida por contato, cultivo, cultura, produção e/ou propagação da levedura com uma peroxidase ou composição de peroxidase. Em vários aspectos e modalidades, a composição compreendendo o organismo fermentador (por exemplo, cepa de levedura descrita no presente documento) e o componente selecionado de um tensoativo, emulsificante, goma, agente de inchamento, antioxidante, auxiliar de processamento e/ou qualquer combinação dos mesmos, compreende adicionalmente uma peroxidase.

[0134] O organismo fermentador da composição pode estar em qualquer forma viável, incluindo forma desintegrada, seca, incluindo seca ativa e instantânea, comprimida, creme (líquido), etc. Em uma modalidade, o organismo fermentador (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) é levedura seca, tal como levedura seca ativa ou levedura instantânea. Em uma modalidade, o organismo fermentador (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) é uma levedura desintegrada. Em uma modalidade, o organismo fermentador (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) é uma levedura comprimida. Em uma modalidade, o organismo fermentador (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) é uma levedura em creme.

[0135] Em uma modalidade, há uma composição que compreende um organismo fermentador descrito no presente documento (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) e um ou mais componentes selecionados de um tensoativo, um emulsificante, uma goma, um agente de inchamento, um antioxidante, um auxiliar de processamento e/ou qualquer combinação dos mesmos.

[0136] As composições descritas no presente documento podem compreender um organismo fermentador descrito no presente documento (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) e quaisquer tensoativos adequados. Em algumas modalidades, a composição compreendendo o organismo fermentador e o tensoativo inclui adicionalmente uma peroxidase. Em uma modalidade, o(s) tensoativo(s) é/são (um) tensoativo(s) aniônico(s), tensoativo(s) catiônico(s) e/ou tensoativo(s) não iônico(s).

[0137] As composições descritas no presente documento podem compreender um organismo fermentador descrito no presente documento (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) e qualquer emulsificante adequado. Em algumas modalidades, a composição compreendendo o organismo fermentador e o emulsificante inclui adicionalmente uma peroxidase. Em uma modalidade, o emulsificante é um éster de ácidos graxos de sorbitana. Em uma modalidade, o emulsificante é selecionado do grupo de monoestearato de sorbitana (SMS), ésteres de ácido cítrico de monodiglicerídeos, éster de poliglicerol, ésteres de ácidos graxos de propilenoglicol.

[0138] Em uma modalidade, a composição compreende um organismo fermentador descrito no presente documento (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) e Olindronal SMS, Olindronal SK ou Olindronal SPL incluindo a composição em causa na Patente Europeia N.º 1.724.336 (por meio deste incorporada por referência). Estes produtos estão comercialmente disponíveis da Bussetti, Áustria, para leveduras secas ativas.

[0139] As composições descritas no presente documento podem compreender um organismo fermentador descrito no presente documento (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) e qualquer goma adequada. Em algumas modalidades, a composição compreendendo o organismo fermentador e a goma inclui adicionalmente uma peroxidase. Em uma modalidade, a goma é selecionada do grupo de gomas de alfarroba, guar, tragacanto, arábica, xantana e acácia, em particular para leveduras em creme, comprimidas e secas.

[0140] As composições descritas no presente documento podem compreender um organismo fermentador descrito no presente documento (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) e qualquer agente de inchamento adequado. Em algumas modalidades, a composição compreendendo o organismo fermentador e o agente de inchamento inclui adicionalmente uma peroxidase. Em uma modalidade, o agente de inchamento é metilcelulose ou carboximetilcelulose.

[0141] As composições descritas no presente documento podem compreender um organismo fermentador descrito no presente documento (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) e qualquer antioxidante adequado. Em algumas modalidades, a composição compreendendo o organismo fermentador e o antioxidante inclui adicionalmente uma peroxidase. Em uma modalidade, o antioxidante é hidroxianisol butilado (BHA) e/ou hidroxitolueno butilado (BHT) ou ácido ascórbico (vitamina C), particular para leveduras secas ativas. IV. RECIPIENTES

[0142] Aspectos da invenção se referem a um recipiente que compreende uma composição de organismo fermentador descrita no presente documento, tal como, especialmente, uma composição de levedura descrita na Seção III no presente documento.

[0143] A presente invenção contempla o uso de qualquer recipiente no qual um organismo fermentador (por exemplo, um organismo fermentador descrito no presente documento, por exemplo, uma composição de levedura compreendendo levedura colocada em contato, cultivada, mantida em cultura, produzida e/ou propagada na presença de uma peroxidase). Exemplos de recipientes adequados incluem, sem limitação, uma bolsa, um skid de dosagem, um pacote, um saco e um recipiente de fermentação, tal como um tanque de propagação ou fermentação. Em uma modalidade, o recipiente é uma bolsa. Em uma modalidade, o recipiente é um skid de dosagem. Em uma modalidade, o recipiente é um pacote. Em uma modalidade, o recipiente é um saco. Em uma modalidade, o recipiente é um tanque de propagação. Em uma modalidade, o recipiente é um tanque de fermentação.

V. PROPAGAÇÃO DE LEVEDURA PARA A PRODUÇÃO DE BIOPRODUTO EM UM SISTEMA DE FERMENTAÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEL

[0144] Em um aspecto, a invenção se refere a um processo para a propagação de levedura para a produção de bioproduto em um sistema de fermentação de biocombustível, em que o processo compreende a introdução de uma peroxidase ou composição de peroxidase em um sistema de fermentação de biocombustível. Os termos “bioproduto” e “produto de fermentação” são usados de forma intercambiável no presente documento. A peroxidase pode ser adicionada em uma concentração suficiente para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura no sistema de fermentação de biocombustível (ou seja, uma quantidade eficaz).

[0145] Os sistemas e métodos para a fermentação de biocombustível são bem conhecidos na técnica. O sistema de fermentação pode incluir um ou mais recipientes, tubos e/ou componentes de fermentação, que são configurados de modo a executarem um processo de produção de produto de fermentação, tal como o processo de produção de etanol de moagem a seco exemplificativo mostrado na FIG. 1.

[0146] Os especialistas na técnica apreciarão que a peroxidase ou peroxidase pode ser introduzida no, ou antes do, sistema de propagação ou de fermentação em uma variedade de diferentes localizações.

[0147] Em uma modalidade, pelo menos um dos recipientes de fermentação no sistema de fermentação é um tanque de fermentação e a peroxidase ou composição de peroxidase é introduzida no tanque de fermentação. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é introduzida no tanque de fermentação antes do início da sacarificação. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é introduzida no tanque de fermentação antes do início da fermentação. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é introduzida no tanque de fermentação antes do início da sacarificação e fermentação simultâneas. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada dentro do primeiro minuto, primeiros cinco minutos, primeiros 10 minutos, primeiros 15 minutos, primeiros 20 minutos, primeiros 25 minutos, primeiros 30 minutos, primeiros 45 minutos, primeira hora, primeiros 90 minutos ou primeiras 2 horas de sacarificação. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada dentro do primeiro minuto, primeiros cinco minutos, primeiros 10 minutos, primeiros 15 minutos, primeiros 20 minutos, primeiros 25 minutos, primeiros 30 minutos, primeiros 45 minutos, primeira hora, primeiros 90 minutos, primeiras 2 horas, primeiras 3 horas, primeiras 4 horas, primeiras 5 horas ou primeiras 6 horas de fermentação. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada dentro do primeiro minuto, primeiros cinco minutos, primeiros 10 minutos, primeiros 15 minutos, primeiros 20 minutos, primeiros 25 minutos, primeiros 30 minutos, primeiros 45 minutos, primeira hora, primeiros 90 minutos, primeiras 2 horas, primeiras 3 horas, primeiras 4 horas, primeiras 5 horas ou primeiras 6 horas de sacarificação e fermentação simultâneas.

[0148] Em uma modalidade, pelo menos um dos recipientes de fermentação é um tanque de propagação de levedura e a peroxidase ou composição de peroxidase é introduzida no tanque de propagação de levedura. De preferência, a peroxidase é adicionada dentro do primeiro minuto, primeiros cinco minutos, primeiros 10 minutos, primeiros 15 minutos, primeiros 20 minutos, primeiros 25 minutos, primeiros 30 minutos, primeiros 45 minutos, primeira hora, primeiros 90 minutos, primeiras 2 horas, primeiras 3 horas, primeiras 4 horas, primeiras 5 horas ou primeiras 6 horas de propagação de levedura.

[0149] A peroxidase ou composição de peroxidase pode ser adicionada durante a sacarificação, fermentação, sacarificação e fermentação simultâneas ou propagação de levedura como um único bolo, uma dose dividida ou titulada ao longo do tempo dentro da primeira hora, primeiros 90 minutos ou primeiras 2 horas, primeiras 3 horas, primeiras 4 horas, primeiras 5 horas ou primeiras 6 horas de sacarificação, fermentação, sacarificação e fermentação simultâneas ou propagação de levedura.

[0150] Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é introduzida logo após a liquefação e antes do tanque de fermentação ou tanque de propagação. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é introduzida em qualquer ponto do sistema de resfriamento do mosto. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada a um trocador de calor. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada a um tanque de mistura.

[0151] A adição da peroxidase ou composição de peroxidase ao tanque de propagação de levedura aumenta o crescimento e/ou a produtividade da levedura durante a propagação em comparação com levedura propagada sem a peroxidase. O crescimento e/ou a produtividade da levedura propagada na presença da peroxidase dentro da primeira hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas ou 24 horas de propagação é aumentado em pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 7%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 33%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 66%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 12 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos

20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes, em comparação com o crescimento e/ou a produtividade da levedura propagada durante os mesmos períodos de tempo sem peroxidase. Em uma modalidade, o crescimento de levedura nas primeiras 24 horas de propagação da levedura é aumentado em 10% a 50% em comparação com o crescimento de levedura nas primeiras 24 horas de propagação de levedura sem a peroxidase.

[0152] A adição da peroxidase ou composição de peroxidase ao tanque de propagação de levedura ou ao tanque de fermentação aumenta a quantidade de etanol produzido nas primeiras 24 horas de fermentação em comparação com a quantidade de etanol produzido nas primeiras 24 horas de fermentação quando a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas são realizadas sem a peroxidase. Em algumas modalidades, a quantidade de etanol produzido na primeira hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas ou 24 horas de fermentação após a adição da peroxidase durante a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas é aumentada em pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 7%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 33%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 66%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes, em comparação com a quantidade de etanol produzido durante o mesmo período de tempo sem a adição de peroxidase. Em uma modalidade preferencial, a taxa na qual etanol é produzido nas primeiras 24 horas de fermentação é aumentada em 10% a 50% em comparação com a taxa na qual etanol é produzido nas primeiras 24 horas de fermentação sem a peroxidase.

[0153] A adição da peroxidase ou composição de peroxidase ao tanque de propagação de levedura ou ao tanque de fermentação reduz os títulos de ácido láctico nas primeiras 24 horas de fermentação em comparação com os títulos de ácido láctico nas primeiras 24 horas de fermentação quando a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas são realizadas sem a peroxidase. Em algumas modalidades, os títulos de ácido láctico na primeira hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas ou 24 horas de fermentação são reduzidos em pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 7%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 33%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 66%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% em comparação com os títulos de ácido láctico durante o mesmo período de fermentação sem a adição da peroxidase. Em uma modalidade preferencial, os títulos de ácido láctico nas primeiras 24 horas de fermentação são reduzidos em 10% a 50% em comparação com os títulos de ácido láctico nas primeiras 10% a 50% de horas de fermentação sem a peroxidase.

[0154] A adição da peroxidase ou composição de peroxidase ao tanque de propagação de levedura ou tanque de fermentação reduz os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação em comparação com os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação sem a adição da peroxidase. A adição da peroxidase ao tanque de propagação de levedura ou tanque de fermentação reduz os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação em pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 7%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 33%, pelo menos 40%, pelo menos 50%,

pelo menos 66%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% ou pelo menos 90% em comparação com os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação sem a adição da peroxidase. Em uma modalidade preferencial, os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação são reduzidos em 10% a 50% em comparação com os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação sem a peroxidase.

[0155] A levedura (por exemplo, uma composição de levedura descrita no presente documento) pode ser adicionada ao tanque de propagação ou ao tanque de fermentação. A composição de levedura introduzida no tanque de fermentação pode compreender a cepa de levedura descrita no presente documento (por exemplo, na Seção III ou Seção IX). Em uma modalidade, a composição de levedura introduzida no tanque de fermentação compreende uma cepa de levedura e uma peroxidase ou composição de peroxidase. Em modalidades particulares, pelo menos uma composição de levedura formulada como uma levedura em creme, uma levedura desintegrada, uma levedura seca ativa ou uma levedura comprimida é introduzida no tanque de fermentação. A pelo menos uma composição de levedura formulada como uma levedura em creme, uma levedura desintegrada, uma levedura seca ativa ou uma levedura comprimida pode ser introduzida no tanque de fermentação simultaneamente ou sequencialmente com a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0156] Nas modalidades acima, a composição de levedura opcionalmente inclui adicionalmente um componente de ocorrência natural ou não natural selecionado de um tensoativo, um emulsificante, uma goma, um agente de inchamento, um antioxidante, um auxiliar de processamento ou qualquer combinação dos mesmos.

[0157] Qualquer cepa de levedura descrita no presente documento, incluindo levedura produzida por contato, cultura, cultivo e/ou propagação da levedura na presença de uma peroxidase e uma levedura descrita na Seção IX no presente documento (por exemplo, uma cepa de Saccharomyces, uma cepa de Saccharomyces cerevisiae, etc.), pode ser usada na composição de levedura.

[0158] A composição de levedura pode ser opcionalmente formulada para incluir, ou introduzida simultaneamente ou sequencialmente com, uma ou mais enzimas adicionais. Exemplos de enzimas adicionais para formulação ou introdução no tanque de fermentação simultaneamente ou sequencialmente com a composição de organismo fermentador ou composição de levedura incluem, sem limitação, acetilxilana esterase, acilglicerol lipase, amilase, alfa-amilase, beta-amilase, arabinofuranosidase, celobio-hidrolases, celulase, feruloil esterase, galactanase, alfa- galactosidase, beta-galactosidase, beta-glucanase, beta-glucosidase, glucana 1,4-a-glucosidase, glucana 1,4-alfa-malto-hidrolase, glucana 1,4-a- glucosidase, glucana 1,4-alfa-malto-hidrolase, lisofosfolipase, lisozima, alfa- manosidase, beta-manosidase (mananase), fitase, fosfolipase A1, fosfolipase A2, fosfolipase D, protease, pululanase, pectinesterase, triacilglicerol lipase, xilanase, beta-xilosidase ou qualquer combinação das mesmas.

[0159] Em algumas modalidades, a composição de levedura compreende adicionalmente pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco das enzimas adicionais. Em uma modalidade, a composição de levedura compreende adicionalmente uma alfa-amilase. Em uma modalidade, a composição de levedura compreende adicionalmente uma glucoamilase. Em uma modalidade, a composição de levedura compreende adicionalmente uma protease. Em uma modalidade, a composição de levedura compreende adicionalmente qualquer combinação de pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três enzimas selecionadas de uma alfa-amilase, uma glucoamilase e uma protease.

[0160] Em uma modalidade, a composição de levedura compreende uma cepa de levedura compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco polinucleotídeos heterólogos que codificam, respectivamente, pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco das enzimas adicionais.

[0161] Em uma modalidade particular, a composição de levedura compreende uma cepa de Saccharomyces cerevisiae compreendendo pelo menos um, pelo menos dois ou pelo menos três polinucleotídeos heterólogos que codificam uma enzima selecionada de uma alfa-amilase, uma glucoamilase, uma protease e qualquer combinação de uma, duas ou todas as três enzimas citadas.

[0162] Qualquer cepa de levedura, tal como especialmente as cepas de levedura descritas no presente documento, por exemplo sob o título “Organismo fermentador”, pode ser usada nos processos de propagação de levedura para a produção de bioproduto em um sistema de biocombustível. Em uma modalidade, a levedura pertence a um gênero selecionado de Saccharomyces, Rhodotorula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Rhodosporidium, Candida, Yarrowia, Lipomyces, Cryptococcus ou Dekkera. Em uma modalidade, a levedura é Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus (carlsbergiensis), Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Fusarium oxysporum ou qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, a levedura é Saccharomyces cerevisiae.

[0163] Qualquer peroxidase pode ser usada nos processos de propagação de levedura para a produção de bioproduto em um sistema de biocombustível. Em uma modalidade, a peroxidase é uma peroxidase ou enzimas de decomposição de peróxido selecionadas de: E.C. 1.11.1.1 NADH peroxidase; E.C. 1.11.1.2 NADPH peroxidase; E.C. 1.11.1.3 ácido graxo peroxidase; E.C. 1.11.1.5 citocromo-c peroxidase; E.C. 1.11.1.5; E.C.

1.11.1.6 catalase; E.C. 1.11.1.7 peroxidase; E.C. 1.11.1.8 iodeto peroxidase; E.C. 1.11.1.9 glutationa peroxidase; E.C. 1.11.1.10 cloreto peroxidase; E.C.

1.11.1.11 L-ascorbato peroxidase; E.C. 1.11.1.12 Fosfolipídeo-hidroperóxido glutationa peroxidase; EC 1.11.1.13 manganês peroxidase; E.C. 1.11.1.14 lignina peroxidase; E.C. 1.11.1.15 peroxirredoxina; E.C. 1.11.1.16 peroxidase versátil; E.C. 1.11.1.B2 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.B6 iodeto peroxidase (contendo vanádio); E.C. 1.11.1.B7 brometo peroxidase; E.C. 1.11.1.B8 iodeto peroxidase. Em uma modalidade, a peroxidase é derivada de um microrganismo, tal como um organismo fúngico, tal como uma levedura ou fungos filamentosos, ou bactérias; ou planta. Em uma modalidade, a peroxidase é selecionada de: (i) uma peroxidase derivada de uma cepa de Thermoascus, tal como uma cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 1 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 no presente documento; (ii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Mycothermus, tal como uma cepa de Mycothermus thermophilus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 2 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 no presente documento; ou (iii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Coprinus, tal como uma cepa de Coprinus cinereus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 3 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 no presente documento.

[0164] O processo para a propagação de levedura para a produção de bioproduto em um sistema de biocombustível pode ser usado em qualquer sistema de biocombustíveis. Em uma modalidade, o biocombustível é um álcool. Em uma modalidade, o álcool é etanol. Em uma modalidade, o álcool é metanol. Em uma modalidade, o álcool é butanol. VI. REDUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO E/OU PREVENÇÃO DE

UM AUMENTO DE ÁCIDO LÁCTICO

[0165] Em um aspecto, a invenção se refere a um processo para reduzir e/ou prevenir um aumento de ácido láctico em um sistema de fermentação de biocombustível, em que o processo compreende a introdução de uma peroxidase ou composição de peroxidase em um sistema de fermentação de biocombustível. A peroxidase ou composição de peroxidase pode ser adicionada em uma concentração suficiente para reduzir e/ou prevenir um aumento de ácido láctico no sistema de fermentação de biocombustível (por exemplo, uma quantidade eficaz).

[0166] Como usada no presente documento, a expressão “reduzir e/ou prevenir um aumento de ácido láctico” abrange a redução do ácido láctico existente presente no sistema de fermentação, bem como a prevenção do aumento dos níveis de ácido láctico no sistema, por exemplo, devido à produção de ácido láctico por organismo infeccioso no sistema (por exemplo, bactérias). Por exemplo, uma composição de peroxidase ou peroxidase pode reduzir o nível de ácido láctico em um sistema de fermentação em pelo menos 1%, 3%, 5%, 10%, 11%, 13%, 15%, 17%, 21%, 24%, 26%, 32%, 35%, 40%, 45%, 50%, 54%, 58%, 61%, 63%, 66%, 70%, 75%, 77%, 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[0167] Os sistemas e métodos para fermentação de biocombustíveis são bem conhecidos na técnica. O sistema de fermentação pode incluir um ou mais vasos, tubos e/ou componentes de fermentação, que são configurados de modo a executarem um processo de produção de produtos de fermentação, tal como o processo de produção de etanol de moagem a seco exemplificativo mostrado na FIG. 1. Os especialistas na técnica apreciarão que a peroxidase ou composição de peroxidase pode ser introduzida no sistema de fermentação em uma variedade de diferentes localizações. Em uma modalidade, pelo menos um dos recipientes de fermentação no sistema de fermentação é um tanque de fermentação e a peroxidase ou composição de peroxidase é introduzida no tanque de fermentação. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é introduzida no tanque de fermentação antes do início da fermentação. Em uma modalidade, pelo menos um dos recipientes de fermentação é um tanque de propagação de levedura e a peroxidase ou composição de peroxidase é introduzida no tanque de propagação de levedura. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é introduzida logo após a liquefação e antes do tanque de fermentação ou tanque de propagação. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é introduzida em qualquer ponto do sistema de resfriamento do mosto. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada a um trocador de calor. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada a um tanque de mistura.

[0168] Em uma modalidade, o biocombustível é um álcool. Em uma modalidade, o álcool é etanol. Em uma modalidade, o álcool é metanol. Em uma modalidade, o álcool é butanol. VII. PEROXIDASES

[0169] A presente divulgação contempla processos e composições que compreendem qualquer peroxidase, tal como especialmente uma peroxidase que aumenta o crescimento e/ou a produtividade de levedura. Em um aspecto, a invenção se refere ao aumento do crescimento e/ou da atividade de levedura usando uma peroxidase. Em um aspecto, a invenção se refere à cultura, cultivo ou produção ou propagação de levedura na presença de uma peroxidase. Em um aspecto, a invenção se refere ao uso de uma peroxidase em um processo para a propagação de levedura para a produção de bioproduto em um sistema de biocombustíveis. Em um aspecto, a invenção se refere ao uso de uma peroxidase em um processo para a produção de um produto de fermentação, tal como especialmente etanol.

[0170] Qualquer polipeptídeo com atividade de peroxidase pode ser usado como uma enzima usada nos processos da presente invenção, ou como um componente da composição de enzima (por exemplo, composição de peroxidase) usada nos processos da presente invenção. Os termos “peroxidase” e “polipeptídeo com atividade de peroxidase” são usados de forma intercambiável no presente documento. A peroxidase pode estar presente como uma atividade enzimática na composição de enzima e/ou como um ou mais (vários) componentes proteicos adicionados à composição.

[0171] Exemplos de peroxidases são peroxidase e enzimas de decomposição de peróxido, incluindo mas não se limitando às seguintes:

E.C. 1.11.1.1 NADH peroxidase; E.C. 1.11.1.2 NADPH peroxidase; E.C. 1.11.1.3 ácido graxo peroxidase; E.C. 1.11.1.5 citocromo-c peroxidase; E.C. 1.11.1.6 catalase; E.C. 1.11.1.7 peroxidase; E.C. 1.11.1.8 iodeto peroxidase; E.C. 1.11.1.9 glutationa peroxidase; E.C. 1.11.1.10 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.11 L-ascorbato peroxidase; E.C. 1.11.1.12 fosfolipídeo-hidroperóxido glutationa peroxidase; E.C. 1.11.1.13 manganês peroxidase; E.C. 1.11.1.14 lignina peroxidase; E.C. 1.11.1.15 peroxirredoxina; E.C. 1.11.1.16 peroxidase versátil; E.C. 1.11.1.B2 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.B6 iodeto peroxidase; E.C. 1.11.1B7 brometo peroxidase; E.C. 1.11.1.B8 iodeto peroxidase: os números e nomes de EC podem ser encontrados, por exemplo, em www.brenda-enzymes.org.

[0172] Em um aspecto, a peroxidase é uma NADH peroxidase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma NADPH peroxidase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma ácido graxo peroxidase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma citocromo-c peroxidase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma catalase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma peroxidase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma iodeto peroxidase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma glutationa peroxidase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma cloreto peroxidase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma L-ascorbato peroxidase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma fosfolipídeo-hidroperóxido glutationa peroxidase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma manganês peroxidase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma lignina peroxidase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma peroxirredoxina. Em outro aspecto, a peroxidase é uma peroxidase versátil. Em outro aspecto, a peroxidase é uma cloreto peroxidase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma iodeto peroxidase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma brometo peroxidase. Em outro aspecto, a peroxidase é uma iodeto peroxidase.

[0173] Em uma modalidade preferencial, a peroxidase é uma E.C. 1.11.1.7 peroxidase.

[0174] Exemplos de peroxidases incluem, mas não estão limitados a, peroxidase de Thermoascus auranticacus (SEQ ID NO: 1 no presente documento) e a sequência de cDNA que codifica a peroxidase de Thermoascus auranticacus, peroxidase de Mycothermus thermophilus (SEQ ID NO: 2 no presente documento) e a sequência de cDNA que codifica a peroxidase de Mycothermus thermophilus, e a peroxidase de Coprinus cinereus (Baunsgaard et al., 1993), a sequência de aminoácidos da peroxidase de Coprinus macrorhizus e a sequência de cDNA que codifica a peroxidase de Coprinus cinereus. Uma nova família de peroxidases fúngicas, Eur. J. Biochem. 213 (1): 605 a 611 (Número de acesso P28314) ou SEQ ID NO: 3 no presente documento); peroxidase de raiz forte (Fujiyama et al., 1988, Structure of the horseradish peroxidase isozyme C genes, Eur. J. Biochem. 173(3): 681 a 687 (Número de acesso P15232)); peroxirredoxina (Singh e Shichi, 1998, A novel glutathione peroxidase in bovine eye. Sequence analysis,mRNA level, and translation, J. Biol. Chem. 273(40): 26171 a 26178 (Número de acesso O77834); lactoperoxidase (Dull et al., 1990, Molecular cloning of cDNAs encoding bovine and human lactoperoxidase, DNA Cell Biol. 9(7): 499 a 509 (Número de acesso

P80025)); peroxidase de eosinófilo (Fornhem et al., 1996, Isolation and characterization of porcine cationic eosinophilgranule proteins, Int.

Arch.

Allergy Immunol. 110(2): 132 a 142 (Número de acesso P80550); peroxidase versátil (Ruiz-Duenas et al., 1999, Molecular characterization of a novel peroxidase isolated from the ligninolytic fungus Pleurotus eryngii, Mol.

Microbiol. 31(1): 223 a 235 (Número de acesso O94753)); peroxidase de nabo (Mazza e Welinder, 1980, Covalent structure of turnip peroxidase 7. Cyanogen bromide fragments, complete structure and comparison to horseradish peroxidase C, Eur.

J.

Biochem. 108(2): 481 a 489 (Número de acesso P00434); mieloperoxidase (Morishita et al., 1987, Chromosomal gene structure of human myeloperoxidase and regulation of its expression by granulocyte colony-stimulating factor, J.

Biol.

Chem. 262(31): 15208 a 15213 (Número de acesso P05164); peroxidasina e homólogos da peroxidasina (Horikoshi et al., 1999, Isolation of differentially expressed cDNAs from p53- dependent apoptotic cells: activation of the human homologue of the Drosophila peroxidasin gene, Biochem.

Biophys.

Res. 864 a 869 (Número de acesso Q92626)); peroxidase de lignina (Tien e Tu, 1987, Cloning and sequencing of a cDNA for a ligninase from Phanerochaete chrysosporium, Nature 326(6112): 520 a 523 (Número de acesso P06181)); Manganês peroxidase (Orth et al., 1994, Characterization of a cDNA encoding a manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium: genomic organization of lignin and manganese peroxidase-encoding genes, Gene 148(1): 161 a 165 (Número de acesso P78733)); alfa-dioxigenase, oxidase dupla, peroxidasina, peroxinectina de invertebrados, peroxidoquerina curta, lactoperoxidase, mieloperoxidase, peroxidase de vertebrados diferentes de mamíferos, catalase, fusão catalase-lipoxigenase, citocromo c peroxidase di- hémica, proteína de uso de metilamina, peroxidase tipo DyP, haloperoxidase, ascorbato peroxidase, catalase peroxidase, ascorbato-citocromo c peroxidase híbrida, lignina peroxidase, manganês peroxidase, peroxidase versátil, outra peroxidase da classe II, peroxidase da classe III, alquil- hidroperoxidase D, outras alquil-hidroperoxidases, haloperoxidase não hémica e não metálica, vanádio haloperoxidase não hémica, manganês catalase, NADH peroxidase, glutationa peroxidase, cisteína peroxirredoxina, tiol peroxidase dependente de tiorredoxina e peroxirredoxina do tipo AhpE (Passard et al., 2007, Phytochemistry 68:1605 a 1611).

[0175] A atividade de peroxidase pode ser obtida de microrganismos de qualquer gênero. Em um aspecto, o polipeptídeo obtido a partir de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

[0176] A atividade de peroxidase pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de bactéria Gram-positiva, tal como um polipeptídeo de Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus ou Oceanobacillus com atividade de peroxidase, ou um polipeptídeo de bactéria Gram-negativa, tal como um polipeptídeo de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria ou Ureaplasma com atividade de peroxidase.

[0177] Em uma modalidade, a peroxidase é derivada de uma cepa de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis.

[0178] Em outra modalidade, a peroxidase é derivada de uma cepa de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[0179] Em outro aspecto, a peroxidase é derivada de uma cepa de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis,

Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus ou Streptomyces lividans.

[0180] A atividade de peroxidase também pode ser um polipeptídeo fúngico, e mais preferencialmente um polipeptídeo de levedura, tal como um polipeptídeo derivado de uma cepa de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia com atividade de peroxidase; ou mais preferencialmente um polipeptídeo de fungo filamentoso, tal como um de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella ou Xylaria.

[0181] Em outro aspecto, a peroxidase é derivada de uma cepa de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis.

[0182] Em outro aspecto, a peroxidase é derivada de uma cepa de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

[0183] Em outro aspecto, a peroxidase é peroxidase de raiz forte.

[0184] Em outro aspecto, a peroxidase é derivada de uma cepa de Thermoascus, tal como uma cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 1 no presente documento. Em uma modalidade, a peroxidase tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 no presente documento. Em uma modalidade, a peroxidase tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%,

pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com os aminoácidos 20 a 717 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 no presente documento.

[0185] Em outro aspecto, a peroxidase é derivada de uma cepa de Mycothermus, tal como uma cepa de Mycothermus thermophilus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 2 no presente documento. Em uma modalidade, a peroxidase tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 no presente documento.

[0186] Em outro aspecto, a peroxidase é derivada de uma cepa de Coprinus, tal como uma peroxidase de Coprinus cinereus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 3 no presente documento. Em uma modalidade, a peroxidase tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 no presente documento. Em uma modalidade, a peroxidase tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos

75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com os aminoácidos 23 a 351 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 no presente documento.

[0187] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídio que codifica um polipeptídeo com atividade de peroxidase são conhecidas na técnica e incluem o isolamento a partir de DNA genômico, preparação a partir de cDNA ou uma combinação dos mesmos. A clonagem dos polinucleotídeos da presente invenção a partir de tal DNA genômico pode ser efetuada, por exemplo, usando a bem conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês “polymerase chain reaction”) ou rastreamento com anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonados com características estruturais partilhadas. Veja, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Podem ser usados outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos, tais como reação em cadeia da ligase (LCR, do inglês “ligase chain reaction”), transcrição ativada por ligação (LAT, do inglês “ligation activated transcription”) e amplificação baseada em sequências nucleotídicas (NASBA, do inglês “nucleotide sequence-based amplification”). VIII. COMPOSIÇÕES DE ENZIMAS

[0188] A presente invenção também se refere a composições que compreendem uma peroxidase da presente invenção. De preferência, as composições são enriquecidas na peroxidase da invenção. O termo “enriquecida” indica que a atividade da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1, tal como pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos

2,0, pelo menos pelo menos 3,0, pelo menos 4,0, pelo menos 5,0, pelo menos 10.

[0189] Em uma modalidade, a composição compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro peroxidases da invenção.

[0190] Qualquer peroxidase pode ser usada em uma composição da presente invenção (por exemplo, composição de peroxidase). Em uma modalidade, a peroxidase é uma peroxidase ou enzimas de decomposição de peróxido selecionadas de: E.C. 1.11.1.1 NADH peroxidase; E.C. 1.11.1.2 NADPH peroxidase; E.C. 1.11.1.3 ácido graxo peroxidase; E.C.

1.11.1.5 citocromo-c peroxidase; E.C. 1.11.1.5; E.C. 1.11.1.6 catalase; E.C.

1.11.1.7 peroxidase; E.C. 1.11.1.8 iodeto peroxidase; E.C. 1.11.1.9 glutationa peroxidase; E.C. 1.11.1.10 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.11 L-ascorbato peroxidase; E.C. 1.11.1.12 Fosfolipídeo-hidroperóxido glutationa peroxidase; EC 1.11.1.13 manganês peroxidase; E.C. 1.11.1.14 lignina peroxidase; E.C.

1.11.1.15 peroxirredoxina; E.C. 1.11.1.16 peroxidase versátil; E.C. 1.11.1.B2 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.B6 iodeto peroxidase (contendo vanádio); E.C. 1.11.1.B7 brometo peroxidase; E.C. 1.11.1.B8 iodeto peroxidase. Em uma modalidade, a peroxidase é derivada de um microrganismo, tal como um organismo fúngico, tal como uma levedura ou fungos filamentosos, ou bactérias; ou planta. Em uma modalidade, a peroxidase é selecionada de: (i) uma peroxidase derivada de uma cepa de Thermoascus, tal como uma cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 1 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 no presente documento; (ii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Mycothermus, tal como uma cepa de Mycothermus thermophilus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 2 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 no presente documento; ou (iii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Coprinus, tal como uma cepa de Coprinus cinereus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 3 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 no presente documento.

[0191] As composições podem compreender adicionalmente múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em acetilxilana esterase, acilglicerol lipase, amilase, alfa-amilase, beta-amilase, arabinofuranosidase, celobio-hidrolases, celulase, feruloil esterase, galactanase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, beta-glucanase, beta- glucosidase, glucana 1,4-a-glucosidase, glucana 1,4-alfa-malto-hidrolase, glucana 1,4-a-glucosidase, glucana 1,4-alfa-malto-hidrolase, lisofosfolipase,

lisozima, alfa-manosidase, beta-manosidase (mananase), fitase, fosfolipase A1, fosfolipase A2, fosfolipase D, protease, pululanase, pectinesterase, triacilglicerol lipase, xilanase, beta-xilosidase ou qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase e pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco das atividades enzimáticas adicionais. Em uma modalidade, a composição compreende pelo menos duas peroxidases e pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco das atividades enzimáticas adicionais. Em uma modalidade, a composição compreende pelo menos três peroxidases e pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco das atividades enzimáticas adicionais. Em uma modalidade, a composição compreende pelo menos quatro peroxidases e pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco das atividades enzimáticas adicionais.

[0192] Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase da invenção e uma glucoamilase. Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase da invenção e uma glucoamilase derivada de Talaromyces emersonii (por exemplo, SEQ ID NO: 4) ou uma variante da mesma. Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase da invenção e uma glucoamilase derivada de Gloeophyllum, tal como G. serpiarium (por exemplo, SEQ ID NO: 5) ou G. trabeum (por exemplo, SEQ ID NO: 6) ou variantes da mesma. Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase da invenção e uma glucoamilase derivada do gênero Pycnoporus, em particular uma cepa de Pycnoporus conforme descrita em WO 2011/066576 (SEQ ID NO: 2, 4 ou 6 no mesmo), incluindo a glucoamilase de Pycnoporus sanguineus que tem SEQ ID NO: 7 no presente documento ou uma variante da mesma. Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase da invenção e uma glucoamilase derivada de Triametes, tal como glucoamilase de Triametes cingulate que tem SEQ ID NO: 8 no presente documento ou uma variante da mesma.

[0193] Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase da invenção, uma glucoamilase e uma alfa-amilase. Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase da invenção, uma glucoamilase e uma alfa-amilase derivada de Rhizomucor, preferencialmente uma cepa de Rhizomucor pusillus, tal como uma alfa-amilase híbrida de Rhizomucor pusillus com um ligante (por exemplo, de Aspergillus niger) e domínio de ligação ao amido (por exemplo, de Aspergillus niger). Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa-amilase e uma composição de enzima celulolítica. Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa-amilase e uma composição de enzima celulolítica, em que a composição celulolítica é derivada de Trichoderma reesei. Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa-amilase e uma protease. Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa-amilase e uma trealase. A protease pode ser derivada de Thermoascus aurantiacus. Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa- amilase, uma composição de enzima celulolítica e uma protease. Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa-amilase, uma composição de enzima celulolítica, uma protease e uma trealase. Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase da invenção; uma glucoamilase, por exemplo, derivada de Talaromyces emersonii, Gloeophyllum serpiarium ou Gloephyllum trabeum; uma alfa-amilase, por exemplo, derivada de Rhizomucor pusillus, em particular uma que tem um ligante e domínio de ligação ao amido, em particular derivados de Aspergillus niger, em particular uma que tem as seguintes substituições: G128D + D143N (usando SEQ ID NO: 9 para numeração); uma composição de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei; e uma protease, por exemplo, derivada de Thermoascus aurantiacus ou Meripilus giganteus. Em uma modalidade, a composição compreende uma peroxidase da invenção; uma glucoamilase, por exemplo, derivada de Talaromyces emersonii, Gloeophyllum serpiarium ou Gloephyllum trabeum; uma alfa-amilase, por exemplo, derivada de Rhizomucor pusillus, em particular uma que tem um ligante e domínio de ligação ao amido, em particular derivados de Aspergillus niger, em particular uma que tem as seguintes substituições: G128D + D143N (usando SEQ ID NO: 9 para numeração); uma composição de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei; uma protease, por exemplo, derivada de Thermoascus aurantiacus ou Meripilus giganteus; e uma trealase.

[0194] Qualquer trealase pode ser usada nas composições e processos da invenção. Em uma modalidade, a trealase é derivada de uma cepa de Talaromyces, tal como uma cepa de Talaromyces funiculosus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 28 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 28 no presente documento, ou uma cepa de Talaromyces leycettanus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 29 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% com SEQ ID NO: 29 no presente documento.

[0195] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais agentes de formulação conforme divulgados no presente documento, de preferência, um ou mais dos compostos selecionados da lista que consiste em glicerol, etilenoglicol, 1,2- propilenoglicol ou 1,3-propilenoglicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, amido, caulim e celulose.

[0196] Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais componentes selecionados da lista que consiste em vitaminas, minerais e aminoácidos.

[0197] São dados abaixo exemplos de usos preferenciais das composições da presente invenção. A dosagem da composição e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica. IX. PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE PRODUTOS DE

FERMENTAÇÃO

[0198] A invenção também se refere a processos para a produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido usando um organismo fermentador, em que uma peroxidase ou uma composição de enzima compreendendo uma peroxidase é adicionada antes e/ou durante a sacarificação e/ou fermentação. Processos para a produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido não gelatinizado

[0199] EM um aspecto, a invenção se refere a processos para a produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido sem gelatinização (isto é, sem cozimento) do material contendo amido (frequentemente chamado de um processo de “hidrólise de amido cru”), em que uma peroxidase é adicionada. O produto de fermentação, tal como etanol, pode ser produzido sem liquefazer a pasta semifluida aquosa contendo o material contendo amido e água. Em uma modalidade, um processo da invenção inclui sacarificação de material contendo amido (por exemplo, moído), por exemplo, amido granular, abaixo da temperatura de gelatinização inicial, preferencialmente na presença de alfa-amilase e/ou enzima(s) geradora(s) de fonte de carboidratos para produzir açúcares que podem ser fermentados no produto de fermentação por um organismo fermentador adequado. Nesta modalidade, o produto de fermentação desejado, por exemplo, etanol, é produzido a partir de grãos de cereais não gelatinizados (isto é, não cozidos), preferencialmente moídos, tais como milho.

[0200] ASSIM, em um aspecto, a invenção se refere a processos para a produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido que compreendem a sacarificação e fermentação simultâneas do material contendo amido usando enzimas geradoras de fonte de carboidrato e um organismo fermentador a uma temperatura abaixo da temperatura inicial de gelatinização do referido material contendo amido na presença de uma protease variante da invenção. A sacarificação e a fermentação podem ser também separadas. Desse modo, em outro aspecto, a invenção se refere a processos de produção de produtos de fermentação, que compreendem as seguintes etapas: (b) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura inicial de gelatinização usando uma enzima geradora de fonte de carboidrato, por exemplo, uma glucoamilase; e (c) fermentação usando um organismo fermentador; em que a etapa (b) e/ou (c) são realizadas usando pelo menos uma glucoamilase e uma peroxidase ou composição de peroxidase da invenção. Em uma modalidade, a referida peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada em uma concentração suficiente para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura. Observe que a etapa (a) foi intencionalmente omitida deste processo de amido cru de modo que a etapa de sacarificação (b) e a etapa de fermentação (c) do processo de amido cru correspondam à etapa de sacarificação (b) e etapa de fermentação (c) do processo convencional descrito abaixo, que inclui uma etapa de liquefação (a).

[0201] EM uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada durante a etapa de sacarificação (b). De preferência, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada dentro do primeiro minuto, primeiros cinco minutos, primeiros 10 minutos, primeiros 15 minutos, primeiros 20 minutos, primeiros 25 minutos, primeiros 30 minutos, primeiros 45 minutos, primeira hora, primeiros 90 minutos ou primeiras 2 horas de sacarificação. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada dentro da primeira hora de sacarificação. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada dentro dos 90 minutos de sacarificação. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada durante a etapa de fermentação (c). De preferência, a peroxidase é adicionada dentro do primeiro minuto, primeiros cinco minutos, primeiros 10 minutos, primeiros 15 minutos, primeiros 20 minutos, primeiros 25 minutos, primeiros 30 minutos, primeiros 45 minutos, primeira hora, primeiros 90 minutos, primeiras 2 horas, primeiras 3 horas, primeiras 4 horas, primeiras 5 horas ou primeiras 6 horas de fermentação.

[0202] EM uma modalidade, uma alfa amilase, em particular, uma alfa-amilase fúngica, é também adicionada na etapa (b). As etapas (b) e (c) podem ser realizadas simultaneamente. Em uma modalidade, a peroxidase é adicionada durante a sacarificação e fermentação simultâneas (SFS). De preferência, a peroxidase é adicionada dentro do primeiro minuto,

primeiros cinco minutos, primeiros 10 minutos, primeiros 15 minutos, primeiros 20 minutos, primeiros 25 minutos, primeiros 30 minutos, primeiros 45 minutos, primeira hora, primeiros 90 minutos, primeiras 2 horas, primeiras 3 horas, primeiras 4 horas, primeiras 5 horas ou primeiras 6 horas de sacarificação e fermentação simultâneas.

[0203] EM uma modalidade, o processo inclui adicionalmente a propagação de um organismo fermentador sob condições adequadas para ser posteriormente usado em fermentação. Em uma modalidade, o organismo fermentador é levedura e a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada durante a propagação da levedura. De preferência, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada dentro do primeiro minuto, primeiros cinco minutos, primeiros 10 minutos, primeiros 15 minutos, primeiros 20 minutos, primeiros 25 minutos, primeiros 30 minutos, primeiros 45 minutos, primeira hora, primeiros 90 minutos, primeiras 2 horas, primeiras 3 horas, primeiras 4 horas, primeiras 5 horas ou primeiras 6 horas de propagação de levedura.

[0204] A peroxidase ou composição de peroxidase pode ser adicionada durante a sacarificação, fermentação, sacarificação e fermentação simultâneas ou propagação de levedura como um único bolo, uma dose dividida ou titulada ao longo do tempo dentro da primeira hora, primeiros 90 minutos, primeiras 2 horas, primeiras 3 horas, primeiras 4 horas, primeiras 5 horas ou primeiras 6 horas de sacarificação, fermentação, sacarificação e fermentação simultâneas ou propagação de levedura.

[0205] A adição da peroxidase ou composição de peroxidase durante a propagação de levedura aumenta o crescimento e/ou a produtividade da levedura durante a propagação em comparação com levedura propagada sem a peroxidase ou composição de peroxidase. O crescimento e/ou a produtividade da levedura propagada na presença da peroxidase ou composição de peroxidase dentro da primeira hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas ou 24 horas de propagação é aumentado em pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 7%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 33%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 66%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 12 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes, em comparação com o crescimento e/ou a produtividade da levedura propagada durante os mesmos períodos de tempo sem peroxidase ou composição de peroxidase. Em uma modalidade, o crescimento de levedura nas primeiras 24 horas de propagação da levedura é aumentado em 10% a 50% em comparação com o crescimento de levedura nas primeiras 24 horas de propagação de levedura sem a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0206] A adição da peroxidase ou composição de peroxidase durante a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas aumenta a quantidade de etanol produzido nas primeiras 24 horas de fermentação em comparação com a quantidade de etanol produzido nas primeiras 24 horas de fermentação quando a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas são realizadas sem a peroxidase ou composição de peroxidase. Em algumas modalidades, a taxa na qual o etanol é produzido na primeira hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas ou 24 horas de fermentação após a adição da peroxidase durante a propagação de levedura,

sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas é aumentada em pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 7%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 33%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 66%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes, em comparação com a taxa na qual o etanol é produzido durante o mesmo período de tempo sem a adição de peroxidase ou composição de peroxidase. Em uma modalidade preferencial, a taxa na qual o etanol é produzido nas primeiras 24 horas de fermentação é aumentada em 10% a 50% em comparação com a quantidade de etanol produzido nas primeiras 24 horas de fermentação sem a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0207] A adição da peroxidase ou composição de peroxidase durante a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas reduz os títulos de ácido láctico nas primeiras 24 horas de fermentação em comparação com os títulos de ácido láctico nas primeiras 24 horas de fermentação quando a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas são realizadas sem a peroxidase ou composição de peroxidase. Em algumas modalidades, os títulos de ácido láctico na primeira hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas ou 24 horas de fermentação são reduzidos em pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 7%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 33%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 66%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% em comparação com os títulos de ácido láctico durante o mesmo período de fermentação sem a adição da peroxidase ou composição de peroxidase. Em uma modalidade preferencial, os títulos de ácido láctico nas primeiras 24 horas de fermentação são reduzidos em 10% a 50% em comparação com os títulos de ácido láctico nas primeiras 24 horas de fermentação sem a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0208] A adição da peroxidase ou composição de peroxidase durante a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas reduz os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação em comparação com os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação sem a adição da peroxidase ou composição de peroxidase. A adição da peroxidase durante a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas reduz os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação em pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 7%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 33%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 66%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% ou pelo menos 90% em comparação com os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação sem a adição da peroxidase ou composição de peroxidase. Em uma modalidade preferencial, os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação são reduzidos em 10% a 50% em comparação com os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação sem a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0209] Qualquer cepa de levedura, tal como especialmente as cepas de levedura descritas no presente documento, por exemplo sob o título “Organismo fermentador”, pode ser usada como o organismo fermentador nos processos para a produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido. Em uma modalidade, a levedura pertence a um gênero selecionado de Saccharomyces, Rhodotorula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Rhodosporidium,

Candida, Yarrowia, Lipomyces, Cryptococcus ou Dekkera. Em uma modalidade, a levedura é Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus (carlsbergiensis), Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Fusarium oxysporum ou qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, a levedura é Saccharomyces cerevisiae.

[0210] Qualquer peroxidase pode ser usada nos processos para a produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido. Em uma modalidade, a peroxidase é uma peroxidase ou enzimas de decomposição de peróxido selecionadas de: E.C. 1.11.1.1 NADH peroxidase; E.C. 1.11.1.2 NADPH peroxidase; E.C. 1.11.1.3 ácido graxo peroxidase; E.C.

1.11.1.5 citocromo-c peroxidase; E.C. 1.11.1.5; E.C. 1.11.1.6 catalase; E.C.

1.11.1.7 peroxidase; E.C. 1.11.1.8 iodeto peroxidase; E.C. 1.11.1.9 glutationa peroxidase; E.C. 1.11.1.10 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.11 L-ascorbato peroxidase; E.C. 1.11.1.12 Fosfolipídeo-hidroperóxido glutationa peroxidase; EC 1.11.1.13 manganês peroxidase; E.C. 1.11.1.14 lignina peroxidase; E.C.

1.11.1.15 peroxirredoxina; E.C. 1.11.1.16 peroxidase versátil; E.C. 1.11.1.B2 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.B6 iodeto peroxidase (contendo vanádio); E.C. 1.11.1.B7 brometo peroxidase; E.C. 1.11.1.B8 iodeto peroxidase. Em uma modalidade, a peroxidase é derivada de um microrganismo, tal como um organismo fúngico, tal como uma levedura ou fungos filamentosos, ou bactérias; ou planta. Em uma modalidade, a peroxidase é selecionada de: (i) uma peroxidase derivada de uma cepa de Thermoascus, tal como uma cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 1 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 no presente documento; (ii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Mycothermus, tal como uma cepa de Mycothermus thermophilus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 2 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 no presente documento; ou (iii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Coprinus, tal como uma cepa de Coprinus cinereus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 3 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 no presente documento. Processos para a produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido gelatinizado

[0211] Em um aspecto, a invenção se refere a processos para a produção de produtos de fermentação, especialmente etanol, a partir de material contendo amido, em que o processo inclui uma etapa de liquefação e etapas de sacarificação e fermentação realizadas sequencialmente ou simultaneamente. Consequentemente, a invenção se refere a um processo para a produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo as etapas de: (a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa-amilase para formar um mosto liquefeito; (b) sacarificação do mosto liquefeito usando uma enzima geradora de fonte de carboidrato para produzir um açúcar fermentável; e (c) fermentação do açúcar usando um organismo fermentador sob condições adequadas para produzir o produto de fermentação; em que uma peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada antes ou durante a etapa de sacarificação (b) e/ou a etapa de fermentação (c). Em uma modalidade, a referida peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada em uma concentração suficiente para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura.

[0212] Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada antes ou durante a etapa de sacarificação (b). De preferência, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada dentro do primeiro minuto, primeiros cinco minutos, primeiros 10 minutos, primeiros 15 minutos, primeiros 20 minutos, primeiros 25 minutos, primeiros 30 minutos, primeiros 45 minutos, primeira hora, primeiros 90 minutos ou primeiras 2 horas de sacarificação. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada antes ou durante a etapa de fermentação (c). De preferência, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada dentro do primeiro minuto, primeiros cinco minutos, primeiros 10 minutos, primeiros 15 minutos, primeiros 20 minutos, primeiros 25 minutos, primeiros 30 minutos, primeiros 45 minutos, ou primeira hora, primeiros 90 minutos, primeiras 2 horas, primeiras 3 horas, primeiras 4 horas, primeiras 5 horas ou primeiras 6 horas de fermentação.

[0213] Em uma modalidade, uma alfa amilase, em particular, uma alfa-amilase fúngica, é também adicionada na etapa (b). As etapas (b) e (c) podem ser realizadas simultaneamente. Em uma modalidade, a peroxidase é adicionada durante a sacarificação e fermentação simultâneas (SFS). De preferência, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada dentro do primeiro minuto, primeiros cinco minutos, primeiros 10 minutos, primeiros 15 minutos, primeiros 20 minutos, primeiros 25 minutos, primeiros 30 minutos, primeiros 45 minutos, ou primeira hora, primeiros 90 minutos, primeiras 2 horas, primeiras 3 horas, primeiras 4 horas, primeiras 5 horas ou primeiras 6 horas de sacarificação e fermentação simultâneas.

[0214] Em uma modalidade, o processo inclui adicionalmente a propagação de um organismo fermentador sob condições adequadas para ser posteriormente usado em fermentação. Em uma modalidade, o organismo fermentador é levedura e a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada antes ou durante a propagação de levedura. De preferência, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada dentro do primeiro minuto, primeiros cinco minutos, primeiros 10 minutos, primeiros 15 minutos, primeiros 20 minutos, primeiros 25 minutos, primeiros 30 minutos, primeiros 45 minutos, ou primeira hora, primeiros 90 minutos, primeiras 2 horas, primeiras 3 horas, primeiras 4 horas, primeiras 5 horas ou primeiras 6 horas de propagação de levedura. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada dentro das primeiras 4 horas de propagação de levedura. Em uma modalidade, a peroxidase ou composição de peroxidase é adicionada dentro das primeiras 6 horas de propagação de levedura.

[0215] A peroxidase ou composição de peroxidase pode ser adicionada durante a sacarificação, fermentação, sacarificação e fermentação simultâneas ou propagação de levedura como um único bolo, uma dose dividida ou titulada ao longo do tempo dentro da primeira hora, primeiros 90 minutos, primeiras 2 horas, primeiras 3 horas, primeiras 4 horas, primeiras 5 horas ou primeiras 6 horas de sacarificação, fermentação, sacarificação e fermentação simultâneas ou propagação de levedura.

[0216] A adição da peroxidase ou composição de peroxidase durante a propagação de levedura aumenta o crescimento e/ou a produtividade da levedura durante a propagação em comparação com levedura propagada sem a peroxidase ou composição de peroxidase. O crescimento e/ou a produtividade da levedura propagada na presença da peroxidase ou composição de peroxidase dentro da primeira hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas ou 24 horas de propagação é aumentado em pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 7%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 33%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 66%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 12 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes, em comparação com o crescimento e/ou a produtividade da levedura propagada durante os mesmos períodos de tempo sem peroxidase ou composição de peroxidase. Em uma modalidade, o crescimento de levedura nas primeiras 24 horas de propagação da levedura é aumentado em 10% a 50% em comparação com o crescimento de levedura nas primeiras 24 horas de propagação de levedura sem a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0217] A adição da peroxidase ou composição de peroxidase durante a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas aumenta a quantidade de etanol produzido nas primeiras 24 horas de fermentação em comparação com a quantidade de etanol produzido nas primeiras 24 horas de fermentação quando a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas são realizadas sem a peroxidase ou composição de peroxidase. Em algumas modalidades, a quantidade de etanol produzido na primeira hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas ou 24 horas de fermentação após a adição da peroxidase durante a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas é aumentada em pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 7%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 33%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 66%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes, em comparação com a quantidade de etanol produzido durante o mesmo período de tempo sem a adição de peroxidase ou composição de peroxidase. Em uma modalidade preferencial, a taxa na qual o etanol é produzido nas primeiras 24 horas de fermentação é aumentada em 10% a 50% em comparação com a quantidade de etanol produzido nas primeiras 24 horas de fermentação sem a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0218] A adição da peroxidase ou composição de peroxidase durante a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas reduz os títulos de ácido láctico nas primeiras 24 horas de fermentação em comparação com os títulos de ácido láctico nas primeiras 24 horas de fermentação quando a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas são realizadas sem a peroxidase ou composição de peroxidase. Em algumas modalidades, os títulos de ácido láctico na primeira hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas ou 24 horas de fermentação são reduzidos em pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 7%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 33%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 66%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% em comparação com os títulos de ácido láctico durante o mesmo período de fermentação sem a adição da peroxidase ou composição de peroxidase. Em uma modalidade preferencial, os títulos de ácido láctico nas primeiras 24 horas de fermentação são reduzidos em 10% a 50% em comparação com os títulos de ácido láctico nas primeiras 24 horas de fermentação sem a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0219] A adição da peroxidase ou composição de peroxidase durante a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas reduz os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação em comparação com os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação sem a adição da peroxidase ou composição de peroxidase. A adição da peroxidase ou composição de peroxidase durante a propagação de levedura, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas reduz os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação em pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 7%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 33%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 66%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% ou pelo menos 90% em comparação com os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação sem a adição da peroxidase ou composição de peroxidase. Em uma modalidade preferencial, os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação são reduzidos em 10% a 50% em comparação com os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação sem a peroxidase ou composição de peroxidase.

[0220] Qualquer cepa de levedura, tal como especialmente as cepas de levedura descritas no presente documento, por exemplo sob o título “Organismo fermentador”, pode ser usada como o organismo fermentador nos processos para a produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido. Em uma modalidade, a levedura pertence a um gênero selecionado de Saccharomyces, Rhodotorula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Rhodosporidium, Candida, Yarrowia, Lipomyces, Cryptococcus ou Dekkera. Em uma modalidade, a levedura é Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus (carlsbergiensis), Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Fusarium oxysporum ou qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, a levedura é Saccharomyces cerevisiae.

[0221] Qualquer peroxidase pode ser usada nos processos para a produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido. Em uma modalidade, a peroxidase é uma peroxidase ou enzimas de decomposição de peróxido selecionadas de: E.C. 1.11.1.1 NADH peroxidase; E.C. 1.11.1.2 NADPH peroxidase; E.C. 1.11.1.3 ácido graxo peroxidase; E.C.

1.11.1.5 citocromo-c peroxidase; E.C. 1.11.1.5; E.C. 1.11.1.6 catalase; E.C.

1.11.1.7 peroxidase; E.C. 1.11.1.8 iodeto peroxidase; E.C. 1.11.1.9 glutationa peroxidase; E.C. 1.11.1.10 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.11 L-ascorbato peroxidase; E.C. 1.11.1.12 Fosfolipídeo-hidroperóxido glutationa peroxidase; EC 1.11.1.13 manganês peroxidase; E.C. 1.11.1.14 lignina peroxidase; E.C.

1.11.1.15 peroxirredoxina; E.C. 1.11.1.16 peroxidase versátil; E.C. 1.11.1.B2 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.B6 iodeto peroxidase (contendo vanádio); E.C. 1.11.1.B7 brometo peroxidase; E.C. 1.11.1.B8 iodeto peroxidase. Em uma modalidade, a peroxidase é derivada de um microrganismo, tal como um organismo fúngico, tal como uma levedura ou fungos filamentosos, ou bactérias; ou planta. Em uma modalidade, a peroxidase é selecionada de: (i) uma peroxidase derivada de uma cepa de Thermoascus, tal como uma cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 1 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 no presente documento; (ii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Mycothermus, tal como uma cepa de Mycothermus thermophilus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 2 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 no presente documento; ou (iii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Coprinus, tal como uma cepa de Coprinus cinereus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 3 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 no presente documento.

[0222] A pasta semifluida é aquecida até acima da temperatura de gelatinização e uma variante de alfa-amilase pode ser adicionada para iniciar a liquefação (diluição). A pasta semifluida pode em uma modalidade ser cozida a jato para gelatinizar adicionalmente a pasta semifluida antes de ser sujeita a alfa-amilase na etapa (a). A liquefação pode em uma modalidade ser realizada como um processo de pasta semifluida a quente em três etapas.

A pasta semifluida é aquecida até entre 60 e 95 °C, preferencialmente, entre 70 e 90 °C, tal como preferencialmente entre 80 e 85 °C a um pH de 4 a 6, em particular a um pH de 4,5 a 5,5, e uma variante de alfa-amilase, opcionalmente em conjunto com uma hemicelulose, uma endoglucanase, uma protease, uma enzima geradora de fonte de carboidrato, tal como uma glucoamilase, uma fosfolipase, uma fitase e/ou pululanase, é adicionada para iniciar a liquefação (diluição). O processo de liquefação é normalmente realizado a um pH de 4 a 6, em particular a um pH de 4,5 a 5,5. A etapa de sacarificação (b) pode ser realizada usando condições bem conhecidas na técnica.

Por exemplo, um processo de sacarificação total pode durar até de cerca de 24 a cerca de 72 horas, no entanto, é comum fazer somente uma pré-sacarificação de tipicamente 40 a 90 minutos a uma temperatura entre 30 e 65 °C, tipicamente cerca de 60 °C, seguida por sacarificação completa durante a fermentação em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (processo SFS). A sacarificação é tipicamente realizada a uma temperatura de 20 a 75 °C, em particular, 40 a 70 °C, tipicamente em torno de 60 °C, e a um pH entre 4 e 5, normalmente a cerca de pH 4,5. O processo mais amplamente usado para produzir um produto de fermentação, especialmente o etanol, é um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SFS), no qual não existe uma fase de permanência para a sacarificação, significando que um organismo fermentador, tal como levedura, e enzima(s), podem ser adicionados em conjunto.

A SFS pode ser tipicamente realizada a uma temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, preferencialmente em torno de cerca de 32 °C.

Em uma modalidade, a fermentação é contínua durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas. Materiais contendo amido

[0223] De acordo com a invenção pode ser usado qualquer material de partida contendo amido adequado. O material de partida é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado, em particular etanol. Exemplos de materiais de partida contendo amido, adequados para uso em processos da presente invenção, incluem cereal, tubérculos ou grãos. Especificamente, o material contendo amido pode ser milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, aveia, arroz, ervilhas, feijão ou batata-doce ou misturas dos mesmos. São também contemplados tipos cerosos e não cerosos de milho e cevada.

[0224] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é milho.

[0225] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é trigo.

[0226] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é cevada.

[0227] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é centeio.

[0228] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é milo.

[0229] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é sagu.

[0230] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é mandioca.

[0231] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é tapioca.

[0232] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é sorgo.

[0233] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é arroz.

[0234] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é ervilhas.

[0235] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é feijão.

[0236] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é batata-doce.

[0237] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é aveia. Produtos de fermentação

[0238] O termo “produto de fermentação” significa um produto produzido por um método ou processo que inclui fermentação usando um organismo fermentador. Um produto de fermentação pode ser qualquer substância derivada da fermentação. O produto de fermentação pode ser, sem limitação, um álcool (por exemplo, arabinitol, n-butanol, isobutanol, etanol, glicerol, metanol, etilenoglicol, 1,3-propanodiol [propilenoglicol], butanodiol, glicerina, sorbitol e xilitol); um alcano (por exemplo, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano e dodecano), um cicloalcano (por exemplo, ciclopentano, ciclo-hexano, ciclo-heptano e ciclo- octano), um alceno (por exemplo, penteno, hexeno, hepteno e octeno); um aminoácido (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina e treonina); antibióticos (por exemplo, penicilina e tetraciclina); enzimas; um gás (por exemplo, metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2) e monóxido de carbono (CO)); isopreno; uma cetona (por exemplo, acetona); hormônios; um ácido orgânico (por exemplo, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D- glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico,

ácido láctico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico e ácido xilônico); policetídeo; e vitaminas (por exemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno).

[0239] Em um aspecto, o produto de fermentação é um álcool. O termo “álcool” engloba uma substância que contém uma ou mais frações de hidroxila. O álcool pode ser, mas não está limitado a, n-butanol, isobutanol, etanol, metanol, arabinitol, butanodiol, etilenoglicol, glicerina, glicerol, 1,3-propanodiol, sorbitol, xilitol. Veja, por exemplo, Gong et al., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlim Heidelberg, Alemanha, 65: 207 a 241; Silveira e Jonas, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400 a 408; Nigam e Singh, 1995, Process Biochemistry 30(2): 117 a 124; Ezeji et al., 2003, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19(6): 595 a 603.

[0240] Em uma modalidade preferencial, o produto de fermentação é etanol, por exemplo, etanol combustível; etanol potável, isto é, bebidas alcoólicas potáveis; ou etanol industrial ou produtos usados na indústria do álcool consumível (por exemplo, cerveja e vinho), indústria dos lacticínios (por exemplo, produtos lácteos fermentados), indústria das peles e indústria do tabaco. Tipos de cerveja preferenciais compreendem ales, stouts, porters, lagers, bitters, licores de malte, happoushu, cerveja com alto teor de álcool, cerveja com baixo teor de álcool, cerveja baixa em calorias ou cerveja sem álcool. Em uma modalidade, o produto de fermentação é etanol.

[0241] Em outro aspecto, o produto de fermentação é um alcano. O alcano pode ser um alcano não ramificado ou ramificado. O alcano pode ser, mas não está limitado a, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano ou dodecano.

[0242] Em outro aspecto, o produto de fermentação é um cicloalcano. O cicloalcano pode ser, mas não está limitado a, ciclopentano,

ciclo-hexano, ciclo-heptano ou ciclo-octano. Em outro aspecto, o produto de fermentação é um alceno. O alceno pode ser um alceno não ramificado ou ramificado. O alceno pode ser, mas não está limitado a, penteno, hexeno, hepteno ou octeno.

[0243] Em outro aspecto, o produto de fermentação é um aminoácido. O ácido orgânico pode ser, mas não está limitado a, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina ou treonina. Veja, por exemplo, Richard e Margaritis, 2004, Biotechnology and Bioengineering 87(4): 501 a 515.

[0244] Em outro aspecto, o produto de fermentação é um gás. O gás pode ser, mas não está limitado a, metano, H2, CO2 ou CO. Veja, por exemplo, Kataoka et al., 1997, Water Science and Technology 36(6-7): 41 a 47; e Gunaseelan, 1997, Biomass and Bioenergy 13(1-2): 83 a 114.

[0245] Em outro aspecto, o produto de fermentação é isopreno.

[0246] Em outro aspecto, o produto de fermentação é uma cetona. O termo “cetona” engloba uma substância que contém uma ou mais frações de cetona. A cetona pode ser, mas não está limitada a, acetona.

[0247] Em outro aspecto, o produto de fermentação é um ácido orgânico. O ácido orgânico pode ser, mas não está limitado a, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido láctico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido propiônico, ácido succínico ou ácido xilônico. Veja, por exemplo, Chen e Lee, 1997, Appl. Biochem. Biotechnol. 63 a 65: 435 a 448.

[0248] Em outro aspecto, o produto de fermentação é policetídeo.

Organismos fermentadores

[0249] O organismo fermentador descrito no presente documento pode ser derivado de qualquer célula hospedeira conhecida pelo especialista capaz de produzir um produto de fermentação, tal como etanol. Como usado no presente documento, um “derivado” de cepa é derivado de uma cepa mencionada, tal como através de mutagênese, tecnologia de DNA recombinante, cruzamento, fusão celular ou citodução entre cepas de leveduras. Os especialistas na técnica entenderão que as alterações genéticas, incluindo modificações metabólicas exemplificadas no presente documento, podem ser descritas com referência a um organismo hospedeiro adequado e suas reações metabólicas correspondentes ou um organismo de origem adequado para material genético desejado tal como genes para uma via metabólica desejada. No entanto, dado o sequenciamento de genoma completo de uma ampla variedade de organismos e o elevado nível de perícia na área da genômica, os especialistas na técnica podem aplicar os ensinamentos e orientações fornecidos no presente documento a outros organismos. Por exemplo, as alterações metabólicas exemplificadas no presente documento podem ser prontamente aplicadas a outras espécies por incorporação do mesmo ácido nucleico codificante ou ácido nucleico codificante análogo de espécies sem ser as espécies mencionadas.

[0250] Exemplos de organismos fermentadores incluem organismos fúngicos tais como levedura. Leveduras preferenciais incluem cepas de Saccharomyces, em particular Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces uvarum; cepas de Pichia, em particular Pichia stipitis tais como Pichia stipitis CBS 5773 ou Pichia pastoris; cepas de Candida, em particular Candida arabinofermentans, Candida boidinii, Candida diddensii, Candida shehatae, Candida sonorensis, Candida tropicalis ou Candida utilis. Outros organismos fermentadores incluem cepas de Hansenula, em particular Hansenula anomala ou Hansenula polymorpha; cepas de

Kluyveromyces, em particular Kluyveromyces fragilis ou Kluyveromyces marxianus; e cepas de Schizosaccharomyces, em particular Schizosaccharomyces pombe.

[0251] Em uma modalidade, o organismo fermentador é um organismo fermentador de açúcares C6, tal como uma cepa de, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae.

[0252] Em uma modalidade, o organismo fermentador é um organismo fermentador de açúcares C5, tal como uma cepa de, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae.

[0253] As células hospedeiras para preparar as células recombinantes descritas no presente documento podem ser de qualquer hospedeiro adequado, como uma cepa de levedura, incluindo, porém, sem limitação, uma célula de Saccharomyces, Rhodotorula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Rhodosporidium, Candida, Yarrowia, Lipomyces, Cryptococcus, ou Dekkera sp.. Em particular são contempladas células hospedeiras de Saccharomyces, tais como células de Saccharomyces cerevisiae, bayanus ou carlsbergensis. De preferência, a célula de levedura é uma célula de Saccharomyces cerevisiae. As células adequadas podem, por exemplo, ser derivadas de cepas comercialmente disponíveis e cepas industriais poliploides ou aneuploides, incluindo, mas não se limitando a, aquelas de Superstart™, THERMOSACC®, C5 FUELTM, XyloFerm®, etc. (Lallemand); RED STAR e ETHANOL RED® (Fermentis/Lesaffre); FALI (AB Mauri); Baker's Best Yeast, Baker's Compressed Yeast, etc. (Fleishmann's Yeast); BIOFERM AFT, XP, CF e XR (North American Bioproducts Corp.); Turbo Yeast (Gert Strand AB); e FERMIOL® (DSM Specialties). Outras cepas de leveduras úteis estão disponíveis a partir de depositórios biológicos, tais como a American Type Culture Collection (ATCC) ou o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), tais como, por exemplo, BY4741 (por exemplo, ATCC 201388); Y108-1 (ATCC PTA.10567) e NRRL YB-1952 (ARS Culture Collection). Ainda outras cepas de S. cerevisiae são adequadas como células hospedeiras DBY746, [Alpha][Eta]22, S150-2B, GPY55-15Ba, CEN.PK, USM21, TMB3500, TMB3400, VTT-A-63015, VTT-A-85068, VTT-c- 79093 e seus derivados bem como Saccharomyces sp. 1400, 424A (LNH- ST), 259A (LNH-ST) e seus derivados. Em uma modalidade, a célula recombinante é um derivado de uma cepa CIBTS1260 de Saccharomyces cerevisiae (depositada sob o N.º de Acesso NRRL Y-50973 na Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 E.U.A.).

[0254] O organismo fermentador pode ser uma cepa de Saccharomyces, por exemplo, uma cepa de Saccharomyces cerevisiae produzida usando o método descrito e em causa na patente dos E.U.A. n.º

8.257.959-BB.

[0255] A cepa pode ser também um derivado da cepa NMI V14/004037 de Saccharomyces cerevisiae (Veja WO2015/143324 e WO2015/143317, cada uma incorporada no presente documento por referência), as cepas n.os V15/004035, V15/004036 e V15/004037 (Veja WO 2016/153924, incorporada no presente documento por referência), as cepas n.os V15/001459, V15/001460, V15/001461 (Veja WO2016/138437 incorporada no presente documento por referência) ou qualquer cepa descrita em PCT/US2016/061887 (incorporada no presente documento por referência).

[0256] Os organismos fermentadores de acordo com a invenção foram gerados de modo a melhorar o rendimento da fermentação e para melhorar a economia do processo por corte dos custos com enzimas uma vez que parte das ou todas as enzimas necessárias para melhorar o desempenho do método são para serem produzidas pelo organismo fermentador.

[0257] Os organismos fermentadores descritos no presente documento podem utilizar vetores de expressão compreendendo a sequência codificante de um ou mais (por exemplo, dois, vários) genes heterólogos ligados a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão em uma célula adequada sob condições compatíveis com a(s) sequência(s) de controle. Tais vetores de expressão podem ser usados em qualquer uma das células e métodos descritos no presente documento. Os polinucleotídeos descritos no presente documento podem ser manipulados em uma variedade de modos para proporcionar expressão de um polipeptídeo desejado. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação dos polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[0258] Aspectos da invenção referem-se a organismos fermentadores compreendendo polinucleotídeos heterólogos que codificam enzimas usadas em sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas. Exemplos de enzimas adequadas incluem, sem limitação, acetilxilana esterase, acilglicerol lipase, amilase, alfa-amilase, beta-amilase, arabinofuranosidase, celobio-hidrolases, celulase, feruloil esterase, galactanase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, beta- glucanase, beta-glucosidase, glucana 1,4-a-glucosidase, glucana 1,4-alfa- malto-hidrolase, glucana 1,4-a-glucosidase, glucana 1,4-alfa-malto- hidrolase, lisofosfolipase, lisozima, alfa-manosidase, beta-manosidase (mananase), fitase, fosfolipase A1, fosfolipase A2, fosfolipase D, protease, pululanase, pectinesterase, triacilglicerol lipase, xilanase, beta-xilosidase ou qualquer combinação das mesmas.

[0259] Em uma modalidade, o organismo fermentador compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima selecionada de uma alfa-amilase, uma celulase, uma glucoamilase, uma protease, uma trealase e qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, o organismo fermentador é uma cepa de levedura que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima selecionada de uma alfa-amilase, uma celulase, uma glucoamilase, uma protease, uma trealase e qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, o organismo fermentador é uma cepa de levedura de Saccharomyces que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima selecionada de uma alfa-amilase, uma celulase, uma glucoamilase, uma protease e qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, o organismo fermentador é uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima selecionada de uma alfa-amilase, uma celulase, uma glucoamilase, uma protease, uma trealase e qualquer combinação das mesmas.

[0260] Em uma modalidade, o organismo fermentador, por exemplo, levedura, por exemplo, uma cepa de Saccharomyces, tal como uma cepa de Saccharomyces cerevisiae, compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma alfa-amilase.

[0261] Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana é derivada de uma alfa-amilase descrita no Pedido dos E.U.A. N.º 62/514.636, depositado em 2 de junho de 2017 (N.º de registro legal 14480-US-PRO, que está incorporado no presente documento em sua totalidade) selecionada a partir da alfa-amilase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 76 no mesmo, da alfa-amilase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 82 no mesmo, da alfa-amilase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 83 no mesmo, da alfa-amilase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 84 no mesmo ou da alfa-amilase de Bacillus licheniformis de SEQ ID NO: 85 no mesmo, da alfa-amilase de Clostridium phytofermentans de SEQ ID NO: 89 no mesmo, da alfa-amilase de Clostridium phytofermentans de SEQ ID NO: 90 no mesmo, da alfa-amilase de Clostridium phytofermentans de SEQ ID NO: 91 no mesmo, da alfa-

amilase de Clostridium phytofermentans de SEQ ID NO: 92 no mesmo, da alfa-amilase de Clostridium phytofermentans de SEQ ID NO: 93 no mesmo, da alfa-amilase de Clostridium phytofermentans de SEQ ID NO: 94 no mesmo, da alfa-amilase de Clostridium thermocellum de SEQ ID NO: 10 no mesmo, da alfa-amilase de Thermobifida fusca de SEQ ID NO: 11 no mesmo, da alfa-amilase de Thermobifida fusca de SEQ ID NO: 97 no mesmo, de Anaerocellum thermophilum de SEQ ID NO: 98 no mesmo, de Anaerocellum thermophilum de SEQ ID NO: 99 no mesmo, de Anaerocellum thermophilum de SEQ ID NO: 100 no mesmo, de Streptomyces avermitilis de SEQ ID NO: 101 no mesmo ou de Streptomyces avermitilis de SEQ ID NO: 88 no mesmo.

[0262] Em uma modalidade, a alfa-amilase é derivada de uma alfa-amilase de levedura, tal como uma alfa-amilase de levedura descrita no Pedido dos E.U.A. N.º 62/514.636, depositado em 2 de junho de 2017 (N.º de registro legal 14480-US-PRO, que está incorporado no presente documento em sua totalidade) selecionada a partir da alfa-amilase de Saccharomycopsis fibuligera de SEQ ID NO: 77 no mesmo, da alfa-amilase de Debaryomyces occidentalis de SEQ ID NO: 78 no mesmo, da alfa-amilase de Debaryomyces occidentalis de SEQ ID NO: 79 no mesmo, da alfa-amilase de Lipomyces kononenkoae de SEQ ID NO: 80 no mesmo, da alfa-amilase de Lipomyces kononenkoae de SEQ ID NO: 81 no mesmo.

[0263] Em uma modalidade, a alfa-amilase é derivada de uma alfa-amilase de fungo filamentoso, tal como uma alfa-amilase de fungo filamentoso descrita no Pedido dos E.U.A. N.º 62/514.636, depositado em 2 de junho de 2017 (N.º de registro legal 14480-US-PRO, que está incorporado no presente documento em sua totalidade) selecionada a partir da alfa- amilase de Aspergillus niger de SEQ ID NO: 86 no mesmo ou da alfa-amilase de Aspergillus niger de SEQ ID NO: 87 no mesmo.

[0264] Alfa-amilases adicionais contempladas para uso com a presente invenção podem ser encontradas em WO2011/153516 (o conteúdo da qual é incorporado no presente documento).

[0265] Polinucleotídeos adicionais que codificam alfa- amilases adequadas podem ser obtidos de microrganismos de qualquer gênero, incluindo aqueles prontamente disponíveis dentro do banco de dados UniProtKB (www.uniprot.org).

[0266] As sequências que codificam alfa-amilases podem ser também usadas para a concepção de sondas de ácidos nucleicos para a identificação e clonagem de DNA que codifica alfa-amilases de cepas de gêneros ou espécies diferentes, como descrito supra.

[0267] Os polinucleotídeos que codificam alfa-amilases podem ser também identificados e obtidos de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, adubos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, adubos, água, etc.) como descrito supra.

[0268] Técnicas usadas para o isolamento ou a clonagem de polinucleotídeos que codificam alfa-amilases são descritas supra.

[0269] Em uma modalidade, o organismo fermentador, por exemplo, levedura, por exemplo, uma cepa de Saccharomyces, tal como uma cepa de Saccharomyces cerevisiae, compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma glucoamilase.

[0270] Em uma modalidade, o organismo fermentador, por exemplo, levedura, por exemplo, uma cepa de Saccharomyces, tal como uma cepa de Saccharomyces cerevisiae, compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma protease. Proteases exemplificativas que podem ser expressas com o organismo fermentador, por exemplo, levedura, por exemplo, uma cepa de Saccharomyces, tal como uma cepa de Saccharomyces cerevisiae e os processos descritos no presente documento incluem, sem limitação, as proteases mostradas na Tabela 1 do Pedido dos E.U.A. N.º 62/514.636, depositado em 2 de junho de 2017 (N.º de registro legal 14480-US-PRO), que é incorporado por referência no presente documento em sua totalidade, ou seja, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco de quaisquer de SEQ ID NOs: 9 a 73 no mesmo (ou variantes das mesmas com pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com as mesmas).

[0271] Uma construção ou vetor (ou múltiplas construções ou vetores) compreendendo o um ou mais (por exemplo, dois, vários) genes heterólogos pode ser introduzido em uma célula tal que a construção ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente.

[0272] As várias sequências nucleotídicas e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais (por exemplo, dois, vários) sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo em tais sítios. Alternativamente, o(s) polinucleotídeo(s) pode(m) ser expresso(s) por inserção do(s) polinucleotídeo(s) ou uma construção de ácido nucleico compreendendo a sequência em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor tal que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão.

[0273] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa promover expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[0274] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) no(s) qual(ais) foi integrado. Além do mais, pode ser usado um vetor ou plasmídeo único ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contêm em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula ou um transpóson.

[0275] O vetor de expressão pode conter qualquer sequência promotora adequada que seja reconhecida por uma célula para expressão de um gene descrito no presente documento. A sequência promotora contém sequências de controle da transcrição que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula de escolha incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos para a célula.

[0276] Cada polinucleotídeo heterólogo descrito no presente documento pode estar operacionalmente ligado a um promotor que é estranho ao polinucleotídeo. Por exemplo, em uma modalidade, o polinucleotídeo heterólogo que codifica o transportador de hexose está operacionalmente ligado a um promotor estranho ao polinucleotídeo. Os promotores podem ser idênticos a ou partilhar um elevado grau de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de

85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99%) com um promotor nativo selecionado.

[0277] Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição das construções de ácido nucleico em células de levedura incluem os, mas não estão limitados aos, promotores obtidos dos genes da enolase, (por exemplo, enolase de S. cerevisiae ou enolase de I. orientalis (ENO1)), galactoquinase (por exemplo, galactoquinase de S. cerevisiae ou galactoquinase de I. orientalis (GAL1)), álcool desidrogenase/gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase (por exemplo, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase de S. cerevisiae ou álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de I. orientalis (ADH1, ADH2/GAP)), triose fosfato isomerase (por exemplo, triose fosfato isomerase de S. cerevisiae ou triose fosfato isomerase de I. orientalis (TPI)), metalotioneína (por exemplo, metalotioneína de S. cerevisiae ou metalotioneína de I. orientalis (CUP1)), 3-fosfoglicerato quinase (por exemplo, 3-fosfoglicerato quinase de S. cerevisiae ou 3-fosfoglicerato quinase de I. orientalis (PGK)), PDC1, xilose redutase (XR), xilitol desidrogenase (XDH), L-(+)-lactato-citocromo c oxidorredutase (CYB2), fator de alongamento da tradução-1 (TEF1, do inglês “translation elongation factor-1”), fator de alongamento da tradução-2 (TEF2 do inglês “translation elongation factor-2”), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e orotidina 5'-fosfato descarboxilase (URA3). Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423 a 488.

[0278] A sequência de controle pode ser também uma sequência terminadora da transcrição adequada, que seja reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência terminadora está operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula de levedura de escolha. O terminador pode ser idêntico a ou partilhar um elevado grau de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99%) com o terminador nativo selecionado.

[0279] Terminadores adequados para células hospedeiras de levedura podem ser obtidos dos genes para enolase (por exemplo, a enolase citocromo C de S. cerevisiae ou I. orientalis (por exemplo, citocromo de S. cerevisiae ou I. orientalis (CYC1)), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (por exemplo, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de S. cerevisiae ou I. orientalis (gpd)), PDC1, XR, XDH, transaldolase (TAL), transcetolase (TKL), ribose 5-fosfato cetol-isomerase (RKI), CYB2 e a família de genes de galactose (especialmente o terminador de GAL10). Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[0280] A sequência de controle pode ser também uma região estabilizante de RNAm a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[0281] Exemplos de regiões estabilizantes de RNAm adequadas são obtidos de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465 a 3471).

[0282] A sequência de controle pode ser também uma sequência líder adequada, quando transcrita é uma região não traduzida de um RNAm que é importante para tradução pela célula hospedeira. A sequência líder está operacionalmente ligada ao terminal 5' do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Pode ser usada qualquer sequência líder que seja funcional na célula de levedura de escolha.

[0283] Líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase (por exemplo, enolase de S. cerevisiae ou I. orientalis (ENO-1)), 3-fosfoglicerato quinase (por exemplo, 3- fosfoglicerato quinase de S. cerevisiae ou I. orientalis), fator alfa (por exemplo, fator alfa de S. cerevisiae ou I. orientalis) e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (por exemplo, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de S. cerevisiae ou I. orientalis (ADH2/GAP)).

[0284] A sequência de controle pode ser também uma sequência de poliadenilação; uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao RNAm transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira de escolha. Sequências de poliadenilação úteis para células de leveduras são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983 a 5990.

[0285] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que permitem a regulação da expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Os sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Nas leveduras pode ser usado o sistema ADH2 ou sistema GAL1.

[0286] Os vetores podem conter um ou mais (por exemplo, dois, vários) marcadores de seleção que permitem a fácil seleção de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador de seleção é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotróficos e similares. Marcadores adequados para células hospedeiras de levedura incluem, mas não estão limitados a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3.

[0287] Os vetores podem conter um ou mais (por exemplo, dois, vários) elementos que permitem a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.

[0288] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência polinucleotídica que codifica o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para dirigir a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em localização(ões) precisa(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para aumentar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além do mais, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga. Os locos de integração potenciais incluem aqueles descritos na técnica (por exemplo, veja US2012/0135481).

[0289] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula de levedura. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediador da replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo. Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3 e a combinação de ARS4 e CEN6.

[0290] Mais do que uma cópia de um polinucleotídeo descrito no presente documento pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Pode ser obtido um aumento do número de cópias do polinucleotídeo por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula de levedura ou por inclusão de um gene marcador de seleção amplificável com o polinucleotídeo, onde as células contendo cópias amplificadas do gene marcador de seleção e, deste modo, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente de seleção apropriado.

[0291] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes descritos no presente documento são bem conhecidos por um especialista na técnica (veja, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

[0292] Procedimentos e técnicas adicionais conhecidos na técnica para a preparação de células recombinantes para fermentação de etanol, são descritos, por exemplo, em WO 2016/045569, cujo conteúdo é por meio deste incorporado por referência.

[0293] O organismo fermentador pode estar na forma de uma composição compreendendo um organismo fermentador (por exemplo, uma cepa de levedura descrita no presente documento) e um componente de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural.

[0294] O organismo fermentador descrito no presente documento pode estar em qualquer forma viável, incluindo forma desintegrada, seca, incluindo seca ativa e instantânea, comprimida, creme (líquido), etc. Em uma modalidade, o organismo fermentador (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) é levedura seca, tal como levedura seca ativa ou levedura instantânea. Em uma modalidade, o organismo fermentador (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) é uma levedura desintegrada. Em uma modalidade, o organismo fermentador (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) é uma levedura comprimida. Em uma modalidade, o organismo fermentador (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) é uma levedura em creme.

[0295] Em uma modalidade, há uma composição que compreende um organismo fermentador descrito no presente documento (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) e um ou mais dos componentes selecionados do grupo que consiste em: tensoativos, emulsificantes, gomas, agentes de inchamento, antioxidantes e outros auxiliares de processamento.

[0296] As composições descritas no presente documento podem compreender um organismo fermentador descrito no presente documento (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) e quaisquer tensoativos adequados. Em uma modalidade, o(s) tensoativo(s) é/são (um) tensoativo(s) aniônico(s), tensoativo(s) catiônico(s) e/ou tensoativo(s) não iônico(s).

[0297] As composições descritas no presente documento podem compreender um organismo fermentador descrito no presente documento (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) e qualquer emulsificante adequado. Em uma modalidade, o emulsificante é um éster de ácido graxo de sorbitana. Em uma modalidade, o emulsificante é selecionado do grupo de monoestearato de sorbitana (SMS), ésteres de ácido cítrico de monodiglicerídeos, éster de poliglicerol,

ésteres de ácidos graxos de propilenoglicol.

[0298] Em uma modalidade, a composição compreende um organismo fermentador descrito no presente documento (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) e Olindronal SMS, Olindronal SK ou Olindronal SPL incluindo a composição em causa na Patente Europeia N.º 1.724.336 (por meio deste incorporada por referência). Estes produtos estão comercialmente disponíveis da Bussetti, Áustria, para leveduras secas ativas.

[0299] As composições descritas no presente documento podem compreender um organismo fermentador descrito no presente documento (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) e qualquer goma adequada. Em uma modalidade, a goma é selecionada do grupo de gomas de alfarroba, guar, tragacanto, arábica, xantana e acácia, em particular para leveduras em creme, comprimidas e secas.

[0300] As composições descritas no presente documento podem compreender um organismo fermentador descrito no presente documento (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) e qualquer agente de inchamento adequado. Em uma modalidade, o agente de inchamento é metilcelulose ou carboximetilcelulose.

[0301] As composições descritas no presente documento podem compreender um organismo fermentador descrito no presente documento (por exemplo, uma cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae) e qualquer antioxidante adequado. Em uma modalidade, o antioxidante é hidroxianisol butilado (BHA) e/ou hidroxitolueno butilado (BHT) ou ácido ascórbico (vitamina C), particular para leveduras secas ativas. Fermentação

[0302] As condições de fermentação são determinadas com base, por exemplo, no tipo de material vegetal, nos açúcares fermentáveis disponíveis, no(s) organismo(s) fermentador(es) e/ou no produto de fermentação desejado. Um especialista na técnica pode facilmente determinar condições de fermentação adequadas. A fermentação pode ser realizada em condições convencionalmente usadas. Processos de fermentação preferenciais são processos anaeróbicos.

[0303] Por exemplo, as fermentações podem ser realizadas a temperaturas tão altas quanto 75 °C, por exemplo, entre 40 e 70 °C, tal como entre 50 e 60 °C. No entanto, são também conhecidas bactérias com uma temperatura ótima significativamente mais baixa até em torno da temperatura ambiente (em torno de 20 °C). Exemplos de organismos fermentadores adequados podem ser encontrados na seção “Organismos fermentadores” acima.

[0304] Para a produção de etanol usando levedura, a fermentação pode continuar durante 24 a 96 horas, em particular durante 35 a 60 horas. Em uma modalidade, a fermentação é realizada a uma temperatura entre 20 e 40 °C, preferencialmente 26 a 34 °C, em particular em torno de 32 °C. Em uma modalidade, o pH é de pH 3 a 6, preferencialmente em torno de pH 4 a 5. Recuperação de produtos de fermentação

[0305] Subsequentemente à fermentação ou SFS, o produto de fermentação pode ser separado do meio de fermentação. A pasta semifluida pode ser destilada para se extrair o produto de fermentação desejado (por exemplo, etanol). Alternativamente, o produto de fermentação desejado pode ser extraído do meio de fermentação por técnicas de microfiltração ou filtração com membranas. O produto de fermentação também pode ser recuperado por esgotamento ou outro método bem conhecido na técnica. Tipicamente, o produto de fermentação, por exemplo, etanol, com uma pureza de até, por exemplo, cerca de 96 por cento em volume de etanol é obtido.

[0306] Desse modo, em uma modalidade, o método da invenção compreende adicionalmente destilação de modo a se obter o produto de fermentação, por exemplo, etanol. A fermentação e a destilação podem ser realizadas simultaneamente e/ou separadamente/sequencialmente; opcionalmente seguidas por uma ou mais etapas de processo para purificação adicional do produto de fermentação.

[0307] Após o término do processo de destilação, o material restante é considerado a vinhaça completa. Como usado no presente documento, o termo “vinhaça completa” inclui o material que permanece no final do processo de destilação após recuperação do produto de fermentação, por exemplo, etanol. O produto de fermentação pode ser opcionalmente recuperado por qualquer método conhecido na técnica. Separação (desidratação) de vinhaça completa em vinhaça fina e bolo úmido

[0308] Em uma modalidade, a vinhaça completa é separada ou dividida em uma fase sólida e líquida por um ou mais métodos para separação da vinhaça fina do bolo úmido.

[0309] A separação de vinhaça completa em vinhaça fina e bolo úmido de modo a se remover uma porção significativa do líquido/água pode ser feita usando qualquer técnica de separação adequada, incluindo centrifugação, compressão e filtração. Em uma modalidade preferencial, a separação/desidratação é realizada por centrifugação. Centrífugas preferidas na indústria são centrífugas tipo decantadoras, preferencialmente centrífugas tipo decantadoras de alta velocidade. Um exemplo de uma centrífuga adequada é a série de cones íngremes NX 400 da Alfa Laval que é uma decantadora de alto desempenho. Em outra modalidade preferencial, a separação é realizada usando outro equipamento de separação convencional, tal como filtros prensas de placas/quadros, filtros prensas de esteiras, prensas de parafuso, espessadores gravitacionais e deckers ou equipamento similar. Processamento de vinhaça fina

[0310] Vinhaça fina é o termo usado para o sobrenadante da centrifugação da vinhaça completa. Tipicamente, a vinhaça fina contém 4 a 6 por cento de sólidos secos (SS) (majoritariamente proteínas, fibra solúvel, fibras finas e componentes da parede celular) e tem uma temperatura de cerca de 60 a 90 graus centígrados. A corrente de vinhaça fina pode ser condensada por evaporação para fornecer duas correntes de processo incluindo: (i) uma corrente de condensado do evaporador compreendendo água condensada removida da vinhaça fina durante a evaporação e (ii) uma corrente de xarope, compreendendo uma corrente mais concentrada dos sólidos dissolvidos e não dissolvidos não voláteis, tais como açúcares não fermentáveis e óleo, permanecendo presentes a partir da vinhaça fina como o resultado da remoção da água evaporada. Opcionalmente, o óleo pode ser removido da vinhaça fina ou pode ser removido como uma etapa intermediária ao processo de evaporação, que é tipicamente realizado usando uma série de várias fases de evaporação. O xarope e/ou o xarope sem óleo podem ser introduzidos em um secador em conjunto com os grãos úmidos (da etapa de separação da vinhaça completa) para fornecer um produto chamado de grãos secos de destilaria com solúveis, que pode ser também usado como ração animal.

[0311] Em uma modalidade, o xarope e/ou o xarope sem óleo são pulverizados em um ou mais secadores de modo a combinar o xarope e/ou o xarope sem óleo com a vinhaça completa para produzir grãos secos de destilaria com solúveis.

[0312] Entre 5 e 90% em volume, tal como entre 10 e 80%, tal como entre 15 e 70%, tal como entre 20 e 60%, da vinhaça fina (por exemplo, opcionalmente hidrolisada) pode ser reciclado (como contracorrente) para a etapa (a). A vinhaça fina reciclada (isto é,

contracorrente) pode constituir de cerca de 1 a 70% em volume, preferencialmente 15 a 60% em volume, especialmente de cerca de 30 a 50% em volume da pasta semifluida formada na etapa (a).

[0313] Em uma modalidade, o processo compreende adicionalmente a reciclagem de pelo menos uma porção da corrente de vinhaça fina tratada com uma LPMO da invenção para a pasta semifluida, opcionalmente após o óleo ter sido extraído da corrente de vinhaça fina. Secagem de bolo úmido e produção de grãos secos de destilaria e grãos secos de destilaria com solúveis

[0314] Após o bolo úmido, contendo cerca de 25 a 40% em peso, preferencialmente 30 a 38% em peso, de sólidos secos, ter sido separado da vinhaça fina (por exemplo, desidratado) esse pode ser seco em um secador de tambor, secador pulverizador, secador de anel, secador de leito fluido ou similar de modo a produzir “Grãos Secos de Destilaria” (GSD). O GSD é um ingrediente valioso de ração para animais, tais como gado, aves domésticas e peixes. É preferencial fornecer GSD com um teor de menos do que cerca de 10 a 12% em peso de umidade de forma a evitar bolor e degradação microbiana e aumentar a vida útil. Adicionalmente, o elevado teor de umidade também torna mais caro transportar o GSD. O bolo úmido é preferencialmente seco sob condições que não desnaturam as proteínas no bolo úmido. O bolo úmido pode ser combinado com xarope separado da vinhaça fina e seco em GSD com Solúveis (GSDS). Produtos intermediários parcialmente secos, tais como são por vezes chamados de grãos úmidos de destilaria modificados, podem ser produzidos por secagem parcial do bolo úmido, opcionalmente com a adição de xarope antes, durante ou após o processo de secagem. Alfa-amilase presente e/ou adicionada durante a liquefação

[0315] De acordo com a invenção, uma alfa-amilase está presente e/ou é adicionada na liquefação opcionalmente em conjunto com uma hemicelulase, uma endoglucanase, uma protease, uma enzima geradora de fonte de carboidrato, tal como uma glucoamilase, uma fosfolipase, uma fitase e/ou pululanase.

[0316] A alfa-amilase adicionada durante a etapa de liquefação i) pode ser qualquer alfa-amilase. São preferenciais alfa-amilases bacterianas, tais como especialmente alfa-amilases de Bacillus, tais como alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus, que são estáveis à temperatura usada durante a liquefação. Alfa-amilase bacteriana

[0317] O termo “alfa-amilase bacteriana” significa qualquer alfa-amilase bacteriana classificada sob EC 3.2.1.1. Uma alfa-amilase bacteriana usada de acordo com a invenção pode, por exemplo, ser derivada de uma cepa do gênero Bacillus, que é por vezes também chamado do gênero Geobacillus. Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus é derivada de uma cepa de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus sp. TS-23 ou Bacillus subtilis, mas também pode ser derivada de outra Bacillus sp.

[0318] Exemplos específicos de alfa-amilases bacterianas incluem a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus de SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 10 no presente documento, a alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens de SEQ ID NO: 5 em WO 99/19467 e a alfa- amilase de Bacillus licheniformis de SEQ ID NO: 4 em WO 99/19467 e a alfa- amilase de Bacillus sp. TS-23 divulgada como SEQ ID NO: 1 em WO 2009/061380 (todas as sequências são por meio deste incorporadas por referência).

[0319] Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana pode ser uma enzima que tem um grau de identidade de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos

99% com qualquer uma das sequências mostradas em SEQ ID NOS: 3, 4 ou 5, respectivamente, em WO 99/19467 e SEQ ID NO: 1 em WO 2009/061380.

[0320] Em uma modalidade, a alfa-amilase pode ser uma enzima que tem um grau de identidade de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com qualquer uma das sequências mostradas em SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 10 no presente documento.

[0321] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é derivada de Bacillus stearothermophilus. A alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus pode ser um tipo selvagem maduro ou uma variante madura da mesma. As alfa-amilases maduras de Bacillus stearothermophilus, ou variante das mesmas, podem ser naturalmente truncadas durante a produção recombinante. Por exemplo, a alfa-amilase madura de Bacillus stearothermophilus pode ser truncada no terminal C de modo que tenha em torno de 491 aminoácidos de comprimento (em comparação com SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 10 no presente documento), tal como de 480 a 495 aminoácidos de comprimento.

[0322] A alfa-amilase de Bacillus pode ser também uma variante e/ou um híbrido. Exemplos de uma tal variante podem ser encontrados em qualquer uma de WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059, WO 02/10355 e WO2009/061380 (todos os documentos são por meio deste incorporados por referência). Variantes de alfa-amilase específicas são divulgadas nas Patentes dos E.U.A. N.os 6.093.562, 6.187.576, 6.297.038 e 7.713.723 (por meio deste incorporadas por referência) e incluem variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (frequentemente chamadas de alfa-amilase BSG) tendo uma deleção de um ou dois aminoácidos em qualquer uma das posições

R179, G180, I181 e/ou G182, preferencialmente a deleção dupla divulgada em WO 96/23873 – ver, por exemplo, página 20, linhas 1 a 10 (por meio deste incorporada por referência), correspondendo preferencialmente à deleção das posições I181 e G182 em comparação com a sequência de aminoácidos da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus apresentada em SEQ ID NO: 3 divulgado em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 10 no presente documento ou à deleção dos aminoácidos R179 e G180 usando SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 10 no presente documento. São ainda mais preferenciais alfa-amilases de Bacillus, especialmente alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus (BSG), que têm pelo uma ou duas deleções de aminoácidos correspondendo às posições R179, G180, I181 e G182, preferencialmente que têm uma deleção dupla correspondendo a R179 e G180 ou, preferencialmente, uma deleção das posições 181 e 182 (denotada I181* + G182*) e, opcionalmente, compreendem adicionalmente uma substituição N193F (denotada I181* + G182* + N193F) em comparação com a sequência de aminoácidos de alfa-amilase BSG do tipo selvagem apresentada em SEQ ID NO: 3 divulgado em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 10 no presente documento. A alfa-amilase bacteriana pode ter também uma substituição em uma posição correspondendo a S239 na alfa-amilase de Bacillus licheniformis mostrada em SEQ ID NO: 4 em WO 99/19467 ou uma variante S242 na alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus de SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 10 no presente documento.

[0323] Em uma modalidade, a variante é uma variante S242A, E ou Q, preferencialmente uma variante S242Q ou A, da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (usando SEQ ID NO: 10 no presente documento para numeração).

[0324] Em uma modalidade, a variante é uma variante da posição E188, preferencialmente uma variante E188P da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (usando SEQ ID NO: 10 no presente documento para numeração).

[0325] Outra variante contemplada é a variante de Bacillus sp. TS-23 divulgada em WO2009/061380, especialmente variantes definidas na reivindicação 1 de WO2009/061380 (por meio deste incorporada por referência). Alfa-amilases híbridas bacterianas

[0326] A alfa-amilase bacteriana pode ser também uma alfa- amilase bacteriana híbrida, por exemplo, uma alfa-amilase compreendendo 445 resíduos de aminoácidos do terminal C da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (mostrada em SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467) e os 37 resíduos de aminoácidos N-terminais da alfa-amilase derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada em SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467). Em uma modalidade preferencial, esse híbrido tem uma ou mais, especialmente todas, as seguintes substituições: G48A + T49I + G107A + H156Y + A181T + N190F + I201F + A209V + Q264S (usando a numeração de Bacillus licheniformis em SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467). São também preferenciais variantes que têm uma ou mais das seguintes mutações (ou mutações correspondentes em outras alfa-amilases de Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V e Q264S e/ou a deleção de dois resíduos entre as posições 176 e 179, preferencialmente a deleção de E178 e G179 (usando SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467 para numeração das posições).

[0327] Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana é a parte madura da alfa-amilase quimérica divulgada em Richardson et al., 2002, The Journal of Biological Chemistry 277(29): 267501 a 26507, chamada de BD5088 ou uma variante da mesma. Esta alfa-amilase é a mesma que aquela mostrada em SEQ ID NO: 2 em WO 2007134207. A sequência da enzima madura começa após o aminoácido “Met” inicial na posição 1.

Alfa-amilase termoestável

[0328] De acordo com a invenção, a alfa-amilase é usada em combinação com uma hemicelulase, preferencialmente xilanase, tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 80 °C. Opcionalmente, uma endoglucanase tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 70 °C, tal como acima de 75 °C, em particular acima de 80 °C, pode ser incluída. A alfa-amilase termoestável, tal como uma alfa-amilase bacteriana, é preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus ou Bacillus sp. TS-23. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM de pelo menos 10.

[0329] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 15.

[0330] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 20.

[0331] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 25.

[0332] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 30.

[0333] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 40.

[0334] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 50.

[0335] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, de pelo menos 60.

[0336] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, entre 10 e 70.

[0337] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, entre 15 e 70.

[0338] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min)

a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, entre 20 e 70.

[0339] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, entre 25 e 70.

[0340] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, entre 30 e 70.

[0341] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, entre 40 e 70.

[0342] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, entre 50 e 70.

[0343] Em uma modalidade, a alfa-amilase tem uma T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 0,12 mM, entre 60 e 70.

[0344] Em uma modalidade, a alfa-amilase é uma alfa- amilase bacteriana, preferencialmente derivada do gênero Bacillus, especialmente de uma cepa de Bacillus stearothermophilus, em particular a de Bacillus stearothermophilus conforme divulgada em WO 99/19467 como SEQ ID NO: 3 ou em SEQ ID NO: 10 no presente documento com um ou dois aminoácidos deletados nas posições R179, G180, I181 e/ou G182, em particular com R179 e G180 deletados ou com I181 e G182 deletados, com mutações na lista de mutações abaixo. Em modalidades preferenciais, as alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus têm a deleção dupla I181 + G182 e a substituição opcional N193F, opcionalmente compreendendo adicionalmente mutações selecionadas da lista abaixo: - V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D2 81N; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F; - V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; - A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - E129V+K177L+R179E; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; - E129V+K177L+R179E+S242Q; - E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - K220P+N224L+S242Q+Q254S; - M284V; - V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V.

[0345] Em uma modalidade, a alfa-amilase é selecionada do grupo de variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus: - I181*+G182*;

- I181*+G182*+N193F; preferencialmente - I181*+G182*+E129V+K177L+R179E; - I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E; - 181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P +N224L+Q254S; - I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V ;e - I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q25 4S (usando SEQ ID NO: 10 no presente documento para numeração).

[0346] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase bacteriana, tal como alfa-amilase de Bacillus, tal como alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 10 no presente documento.

[0347] Em uma modalidade preferencial, a variante de alfa- amilase bacteriana, tal como variante de alfa-amilase de Bacillus, tal como variante de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade,

preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 10 no presente documento.

[0348] Deve ser entendido que quando se faz referência a alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus e variantes das mesmas elas são normalmente produzidas naturalmente na forma truncada. Em particular, o truncamento pode ser tal que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 10 no presente documento, ou variantes da mesma, seja truncada no terminal C e tenha tipicamente em torno de 491 aminoácidos de comprimento, tal como de 480 a 495 aminoácidos de comprimento. Hemicelulase termoestável presente e/ou adicionada durante a liquefação

[0349] De acordo com a invenção, uma hemicelulase opcional, preferencialmente xilanase, tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 80 °C está presente e/ou é adicionada à etapa de liquefação i) em combinação com uma alfa-amilase, tal como uma alfa-amilase bacteriana (descrita acima).

[0350] A termoestabilidade de uma hemicelulase, preferencialmente xilanase, pode ser determinada conforme descrito na seção “Materiais e métodos” sob “Determinação de Td por calorimetria diferencial de varredura para endoglucanases e hemicelulases”.

[0351] Em uma modalidade, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH10 ou GH11, tem um Ponto de Fusão

(DSC) acima de 82 °C, tal como acima de 84 °C, tal como acima de 86 °C, tal como acima de 88 °C, tal como acima de 90 °C, tal como acima de 92 °C, tal como acima de 94 °C, tal como acima de 96 °C, tal como acima de 98 °C, tal como acima de 100 °C, tal como entre 80 °C e 110 °C, tal como entre 82 °C e 110 °C e tal como entre 84 °C e 110 °C.

[0352] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH10, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 11 no presente documento, preferencialmente derivada de uma cepa do gênero Dictyoglomus, tal como uma cepa de Dictyogllomus thermophilum.

[0353] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH11, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 12 no presente documento, preferencialmente derivada de uma cepa do gênero Dictyoglomus, tal como uma cepa de Dictyogllomus thermophilum.

[0354] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH10, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 13 no presente documento, preferencialmente derivada de uma cepa do gênero Rasamsonia, tal como uma cepa de Rasomsonia byssochlamydoides.

[0355] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH10, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 14 no presente documento, preferencialmente derivada de uma cepa do gênero Talaromyces, tal como uma cepa de Talaromyces leycettanus.

[0356] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH10, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 15 no presente documento, preferencialmente derivada de uma cepa do gênero Aspergillus, tal como uma cepa de Aspergillus fumigatus. Endoglucanase termoestável presente e/ou adicionada durante a liquefação

[0357] De acordo com a invenção, uma endoglucanase (“E”) opcional tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 70 °C, tal como entre 70 °C e 95 °C, pode estar presente e/ou ser adicionada na etapa de liquefação i) em combinação com uma alfa-amilase, tal como uma alfa- amilase bacteriana termoestável, e uma hemicelulase opcional, preferencialmente xilanase, tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 80 °C.

[0358] A termoestabilidade de uma endoglucanase pode ser determinada conforme descrito na seção “Materials & Methods” de WO 2017/112540 (incorporada na sua totalidade no presente documento por referência) sob o título “Determination of Td by Differential Scanning Calorimetry for Endoglucanases and Hemicellulases”.

[0359] Em uma modalidade, a endoglucanase tem um Ponto de Fusão (DSC) acima de 72 °C, tal como acima de 74 °C, tal como acima de 76 °C, tal como acima de 78 °C, tal como acima de 80 °C, tal como acima de 82 °C, tal como acima de 84 °C, tal como acima de 86 °C, tal como acima de 88 °C, tal como entre 70 °C e 95 °C, tal como entre 76 °C e 94 °C, tal como entre 78 °C e 93 °C, tal como entre 80 °C e 92 °C, tal como entre 82 °C e 91 °C, tal como entre 84 °C e 90 °C.

[0360] Em uma modalidade preferencial, a endogluconase usada em um processo da invenção ou compreendida em uma composição da invenção é uma endoglucanase da Família de Glicosídeo Hidrolases 5 ou endoglucanase GH5 (veja o banco de dados CAZy na página da internet “www.cazy.org”).

[0361] Em uma modalidade, a endoglucanase GH5 é da família EG II, tal como a endoglucanase de Talaromyces leycettanus mostrada em SEQ ID NO: 16 no presente documento; endoglucanase de Penicillium capsulatum mostrada em SEQ ID NO: 17 no presente documento e endoglucanase de Trichophaea saccata mostrada em SEQ ID NO: 18 no presente documento.

[0362] Em uma modalidade, a endoglucanase é uma endoglucanase da família GH45. Em uma modalidade, a endoglucanase GH45 é da família EG V, tal como a endoglucanase de Sordaria fimicola mostrada em SEQ ID NO: 19 no presente documento ou a endoglucanase de Thielavia terrestris mostrada em SEQ ID NO: 20 no presente documento.

[0363] Em uma modalidade, a endoglucanase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 16 no presente documento. Em uma modalidade, a endoglucanase é derivada de uma cepa do gênero Talaromyces, tal como uma cepa de Talaromyces leycettanus.

[0364] Em uma modalidade, a endoglucanase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 17 no presente documento, preferencialmente derivada de uma cepa do gênero Penicillium, tal como uma cepa de Penicillium capsulatum.

[0365] Em uma modalidade, a endoglucanase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 18 no presente documento, preferencialmente derivada de uma cepa do gênero Trichophaea, tal como uma cepa de Trichophaea saccata.

[0366] Em uma modalidade, a endoglucanase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos

98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 19 no presente documento, preferencialmente derivada de uma cepa do gênero Sordaria, tal como uma cepa de Sordaria fimicola.

[0367] Em uma modalidade, a endoglucanase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 20 no presente documento, preferencialmente derivada de uma cepa do gênero Thielavia, tal como uma cepa de Thielavia terrestris.

[0368] Em uma modalidade, a endoglucanase é adicionada na etapa de liquefação i) a uma dose de 1 a 10.000 µg de PE (Proteína de Enzima)/g de SS, tal como 10 a 1.000 µg de PE/g de SS. Enzima geradora de fonte de carboidrato presente e/ou adicionada durante a liquefação

[0369] De acordo com a invenção, uma enzima geradora de fonte de carboidrato opcional, em particular uma glucoamilase, preferencialmente uma glucoamilase termoestável, pode estar presente e/ou ser adicionada na liquefação em conjunto com uma alfa-amilase e hemicelulase opcional, preferencialmente xilanase, tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 80 °C, e uma endoglucanase opcional tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 70 °C e uma pululanase opcional e/ou fitase opcional.

[0370] O termo “enzima geradora de fonte de carboidrato” inclui quaisquer enzimas que geram açúcares fermentáveis. Uma enzima geradora de fonte de carboidrato é capaz de produzir um carboidrato que pode ser usado como uma fonte de energia pelo(s) organismo(s) fermentador(es) em questão, por exemplo, quando usada em um processo da invenção para a produção de um produto de fermentação, tal como etanol. Os carboidratos gerados podem ser convertidos diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado, preferencialmente etanol. De acordo com a invenção, pode ser usada uma mistura de enzimas geradoras de fontes de carboidratos. Exemplos específicos incluem glucoamilase (sendo geradoras de glicose), beta-amilase e amilase maltogênica (sendo geradora de maltose).

[0371] Em uma modalidade preferencial, a enzima geradora de fonte de carboidrato é termoestável. A enzima geradora de fonte de carboidrato, em particular glucoamilase termoestável, pode ser adicionada em conjunto com ou separadamente da alfa-amilase e protease termoestável.

[0372] Em uma modalidade específica e preferencial, a enzima geradora de fonte de carboidrato é uma glucoamilase termoestável, preferencialmente de origem fúngica, preferencialmente de um fungo filamentoso, tal como de uma cepa do gênero Penicillium, especialmente uma cepa de Penicillium oxalicum, em particular a glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 (que é por meio deste incorporada por referência) e mostrada em SEQ ID NO: 21 no presente documento.

[0373] Em uma modalidade, a glucoamilase termoestável tem pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com o polipeptídeo maduro mostrado em SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 ou SEQ ID NOs: 21 no presente documento.

[0374] Em uma modalidade, a enzima geradora de fonte de carboidrato, em particular glucoamilase termoestável, é a glucoamilase de Penicillium oxalicum mostrada em SEQ ID NO: 21 no presente documento.

[0375] Em uma modalidade preferencial, a enzima geradora de fonte de carboidrato é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 e mostrada em SEQ ID NO: 21 no presente documento, tendo uma substituição K79V (chamada de “PE001”) (usando a sequência madura mostrada em SEQ ID NO: 14 para numeração). A variante de glucoamilase K79V tem sensibilidade reduzida à degradação por protease em relação ao genitor conforme divulgado em WO 2013/036526 (que é por meio deste incorporada por referência).

[0376] Variantes de glucoamilase de Penicillium oxalicum contempladas são divulgadas em WO 2013/053801 (que é por meio deste incorporada por referência).

[0377] Em uma modalidade, essas variantes têm uma sensibilidade reduzida à degradação por protease.

[0378] Em uma modalidade, essas variantes têm termoestabilidade melhorada em comparação com o genitor.

[0379] Mais especificamente, em uma modalidade, a glucoamilase tem uma substituição K79V (usando SEQ ID NO: 21 no presente documento para numeração), correspondendo à variante PE001, e compreende adicionalmente pelo menos uma das seguintes substituições ou combinação de substituições:

T65A; Q327F; E501V; Y504T; Y504*; T65A + Q327F; T65A + E501V; T65A + Y504T; T65A + Y504*; Q327F + E501V; Q327F + Y504T; Q327F + Y504*; E501V + Y504T; E501V + Y504*; T65A + Q327F + E501V; T65A + Q327F + Y504T; T65A + E501V + Y504T; Q327F + E501V + Y504T; T65A + Q327F + Y504*; T65A + E501V + Y504*; Q327F + E501V + Y504*; T65A + Q327F + E501V + Y504T; T65A + Q327F + E501V + Y504*; E501V + Y504T; T65A + K161S; T65A + Q405T; T65A + Q327W; T65A + Q327F; T65A + Q327Y; P11F + T65A + Q327F; R1K + D3W + K5Q + G7V + N8S + T10K + P11S + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; R1E + D3N + P4G + G6R + G7A + N8A + T10D+ P11D + T65A + Q327F; P11F + T65A + Q327W; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; T65A + Q327F + E501V + Y504T; T65A + S105P + Q327W; T65A + S105P + Q327F; T65A + Q327W + S364P; T65A + Q327F + S364P; T65A + S103N + Q327F; P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S; P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502*; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502T + P563S + K571E; P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + N564D + K571S; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T; P2N + P4S + P11F + T65A + V325T+ Q327W; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + I375A + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K218A + K221D + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + T10D + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + F12Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; K5A + P11F + T65A

+ Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T568N; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + F80* + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K112S + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + N502T + Y504*; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + T65A + V79A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79G + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79I + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79L + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79S + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + L72V + Q327F + E501V + Y504T; S255N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + E74N +Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + G220N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Y245N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q253N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + D279N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S359N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D370N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460T + P468T + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T463N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A +

Q327F + S465N + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T477N + E501V + Y504T.

[0380] Em uma modalidade preferencial, a variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma substituição K79V usando SEQ ID NO: 21 no presente documento para numeração (variante PE001) e compreende adicionalmente uma das seguintes mutações: P11F + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T.

[0381] Em uma modalidade, a variante de glucoamilase, tal como variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 21 no presente documento.

[0382] A enzima geradora de fonte de carboidrato, em particular glicoamilase, pode ser adicionada em quantidades de 0,1 a 100 microgramas de PE/g de SS, tais como 0,5 a 50 microgramas de PE/g de SS, tais como 1 a 25 microgramas de PE/g de SS, tais como 2 a 12 microgramas de PE/g de SS. Pululanase presente e/ou adicionada durante a liquefação

[0383] Opcionalmente, uma pululanase pode estar presente e/ou ser adicionada durante a etapa de liquefação i) em conjunto com uma alfa-amilase e uma hemicelulase opcional, preferencialmente xilanase, tendo um ponto de fusão (DSC) acima de 80 °C. Como mencionado acima, uma protease, uma enzima geradora de fonte de carboidrato, preferencialmente uma glucoamilase termoestável, podem estar também opcionalmente presentes e/ou ser adicionadas durante a etapa de liquefação i).

[0384] A pululanase pode estar presente e/ou ser adicionada durante a etapa i) de liquefação e/ou etapa ii) de sacarificação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SFS).

[0385] As pululanases (E.C. 3.2.1.41, pululana 6-glucano- hidrolase), são enzimas desramificadoras caracterizadas pela sua capacidade de hidrolisarem as ligações alfa-1,6-glicosídicas, por exemplo, na amilopectina e pululana.

[0386] As pululanases contempladas de acordo com a presente invenção incluem as pululanases de Bacillus amyloderamificans divulgadas na Patente dos E.U.A. N.º 4.560.651 (por meio deste incorporada por referência), a pululanase divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 01/151620 (por meio deste incorporada por referência), a pululanase de Bacillus deramificans divulgada como SEQ ID NO: 4 em WO 01/151620 (por meio deste incorporada por referência) e a pululanase de Bacillus acidopullulyticus divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO 01/151620 (por meio deste incorporada por referência) e também descrita em FEMS Mic. Let. (1994) 115, 97 a 106.

[0387] Pululanases adicionais contempladas de acordo com a presente invenção incluem as pululanases de Pyrococcus woesei, especificamente de Pyrococcus woesei DSM N.º 3773 divulgada em WO 92/02614.

[0388] Em uma modalidade, a pululanase é uma pululanase da família GH57. Em uma modalidade, a pululanase inclui um domínio X47 conforme divulgado em WO 2011/087836 (que é por meio deste incorporada por referência). Mais especificamente, a pululanase pode ser derivada de uma cepa do gênero Thermococcus, incluindo Thermococcus litoralis e Thermococcus hydrothermalis, tal como a pululanase de Thermococcus hydrothermalis mostrada em WO 2011/087836 truncada no sítio X4 logo após o domínio X47. A pululanase também pode ser um híbrido das pululanases de Thermococcus litoralis e Thermococcus hydrothermalis ou uma enzima híbrida de T. hydrothermalis/T. litoralis com o truncamento do sítio X4 divulgado em WO 2011/087836 (que é por meio deste incorporada por referência).

[0389] Em outra modalidade, a pululanase é uma pululanase compreendendo um domínio X46 divulgado em WO 2011/076123 (Novozymes).

[0390] A pululanase pode, de acordo com a invenção, ser adicionada em uma quantidade eficaz que inclui a quantidade preferencial de cerca de 0,0001 a 10 mg de proteína de enzima por grama de SS, preferencialmente 0,0001 a 0,10 mg de proteína de enzima por grama de SS, mais preferencialmente 0,0001 a 0,010 mg de proteína de enzima por grama de SS. A atividade de pululanase pode ser determinada como NPUN. Um Ensaio para a determinação de NPUN é descrito na seção ”Materiais e métodos” abaixo.

[0391] Produtos de pululanase comercialmente disponíveis adequados incluem PROMOZYME 400L, PROMOZYME™ D2 (Novozymes A/S, Dinamarca), OPTIMAX L-300 (Genencor Int., E.U.A.) e AMANO 8 (Amano, Japão). Fitase presente e/ou adicionada durante a liquefação

[0392] Opcionalmente, uma fitase pode estar presente e/ou ser adicionada na liquefação em combinação com uma alfa-amilase e hemicelulase, preferencialmente xilanase, tendo um ponto de fusão (DSC) acima de 80 °C.

[0393] Uma fitase usada de acordo com a invenção pode ser qualquer enzima capaz de efetuar a liberação de fosfato inorgânico a partir de ácido fítico (hexacisfosfato de mio-inositol) ou de qualquer sal do mesmo (fitatos). As fitases podem ser classificadas de acordo com sua especificidade na etapa de hidrólise inicial, viz. de acordo com o qual o grupo éster de fosfato é hidrolisado em primeiro lugar. A fitase a ser usada na invenção pode ter qualquer especificidade, por exemplo, ser uma 3-fitase (EC 3.1.3.8), uma 6-fitase (EC 3.1.3.26) ou uma 5-fitase (sem número EC).Em uma modalidade, a fitase tem uma temperatura ótima acima de 50 °C, tal como na faixa de 50 a 90 °C.

[0394] A fitase pode ser derivada de plantas ou microrganismos, tais como bactérias ou fungos, por exemplo, levedura ou fungos filamentosos.

[0395] Uma fitase vegetal pode ser de farelo de trigo, milho, soja ou pólen de lírio. Fitases vegetais adequadas são descritas em Thomlinson et al., Biochemistry, 1 (1962), 166 a 171; Barrientos et al., Plant. Physiol., 106 (1994), 1489 a 1495; WO 98/05785; WO 98/20139.

[0396] Uma fitase bacteriana pode ser do gênero Bacillus, Citrobacter, Hafnia, Pseudomonas, Buttiauxella ou Escherichia, especificamente as espécies Bacillus subtilis, Citrobacter braakii, Citrobacter freundii, Hafnia alvei, Buttiauxella gaviniae, Buttiauxella agrestis, Buttiauxella noackies e E. coli. Fitases bacterianas adequadas são descritas em Paver e Jagannathan, 1982, Journal of Bacteriology 151:1102 a 1108; Cosgrove, 1970, Australian Journal of Biological Sciences 23:1207 a 1220; Greiner et al., Arch. Biochem. Biophys., 303, 107 a 113, 1993; WO 1997/33976; WO 1997/48812, WO 1998/06856, WO 1998/028408, WO 2004/085638, WO

2006/037327, WO 2006/038062, WO 2006/063588, WO 2008/092901, WO 2008/116878 e WO 2010/034835.

[0397] Uma fitase de levedura pode ser derivada do gênero Saccharomyces ou Schwanniomyces, especificamente as espécies Saccharomyces cerevisiae ou Schwanniomyces occidentalis. A enzima anterior foi descrita como Fitases de levedura adequadas descritas em Nayini et al., 1984, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17:24 a 26; Wodzinski et al., Adv. Appl. Microbiol., 42, 263 a 303; AU-A-24840/95;

[0398] As fitases de fungos filamentosos podem ser derivadas do filo fúngico de Ascomycota (ascomicetos) ou do filo Basidiomycota, por exemplo, o gênero Aspergillus, Thermomyces (também chamado de Humicola), Myceliophthora, Manascus, Penicillium, Peniophora, Agrocybe, Paxillus ou Trametes, especificamente a espécie Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus ficuum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae, T. lanuginosus (também conhecida como H. lanuginosa), Myceliophthora thermophila, Peniophora lycii, Agrocybe pediades, Manascus anka, Paxillus involtus ou Trametes pubescens. Fitases fúngicas adequadas são descritas em Yamada et al., 1986, Agric. Biol. Chem. 322:1275 a 1282; Piddington et al., 1993, Gene 133:55 a 62; EP 684.313; EP 0 420 358; EP 0 684 313; WO 1998/28408; WO 1998/28409; JP 7-67635; WO 1998/44125; WO 1997/38096; WO 1998/13480.

[0399] Em uma modalidade preferencial, a fitase é derivada de Buttiauxella, tal como Buttiauxella gaviniae, Buttiauxella agrestis ou Buttiauxella noackies, tal como aquelas divulgadas em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6, respectivamente, em WO 2008/092901 (por meio deste incorporada por referência).

[0400] Em uma modalidade preferencial, a fitase é derivada de Citrobacter, tal como Citrobacter braakii, tal como aquela divulgada em

WO 2006/037328 (por meio deste incorporada por referência).

[0401] Fitases modificadas ou variantes de fitases são obteníveis por métodos conhecidos na técnica, em particular pelos métodos divulgados em EP 897010; EP 897985; WO 99/49022; WO 99/48330, WO 2003/066847, WO 2007/112739, WO 2009/129489 e WO 2010/034835.

[0402] Produtos contendo fitase comercialmente disponíveis incluem BIO-FEED PHYTASE™, PHYTASE NOVO™ CT ou L (todos da Novozymes), LIQMAX (DuPont) ou RONOZYME™ NP, RONOZYME® HiPhos, RONOZYME® P5000 (CT), NATUPHOS™ NG 5000 (da DSM).

[0403] De acordo com a invenção, uma enzima geradora de fonte de carboidrato, preferencialmente uma glucoamilase, está presente e/ou é adicionada durante a sacarificação e/ou fermentação.

[0404] Em uma modalidade preferencial, a enzima geradora de fonte de carboidrato é uma glucoamilase, de origem fúngica, preferencialmente a partir de uma cepa de Aspergillus, preferencialmente A. niger, A. awamori ou A. oryzae; ou uma cepa de Trichoderma, preferencialmente T. reesei; ou uma cepa de Talaromyces, preferencialmente T. emersonii. Enzima geradora de fonte de carboidrato presente e/ou adicionada durante a sacarificação e/ou a fermentação

[0405] De acordo com a invenção, uma enzima geradora de fonte de carboidrato, em particular uma glucoamilase, pode estar presente e/ou ser adicionada na etapa de sacarificação (b), etapa de fermentação (c), sacarificação e fermentação simultâneas (SFS); ou pré-sacarificação antes da etapa (b) opcionalmente em conjunto com uma alfa-amilase, uma composição celulolítica, uma protease, uma trealase e qualquer combinação das mesmas.

[0406] A enzima geradora de fonte de carboidrato (por exemplo, glucoamilase) presente e/ou adicionada durante a etapa de sacarificação (b); etapa de fermentação (c); sacarificação e fermentação simultâneas; ou pré-sacarificação antes da etapa (b), pode ser derivada de qualquer fonte adequada, por exemplo, derivada de um microrganismo ou uma planta. As glucoamilases preferenciais são de origem fúngica ou bacteriana, selecionadas do grupo que consiste em glucoamilases de Aspergillus, em particular glucoamilases G1 ou G2 de Aspergillus niger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), páginas 1097 a 1102), ou variantes das mesmas, tais como aquelas divulgadas em WO 92/00381, WO 00/04136 e WO 01/04273 (da Novozymes, Dinamarca); a glucoamilase de A. awamori divulgada em WO 84/02921, glucoamilase de Aspergillus oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), páginas 941 a 949) ou variantes ou fragmentos das mesmas. Outras variantes de glucoamilases de Aspergillus incluem variantes com estabilidade térmica intensificada: G137A e G139A (Chen et al. (1996), Prot. Eng. 9, 499 a 505); D257E e D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8, 575 a 582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275 a 281); ligações de dissulfeto, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698 a 8704); e introdução de resíduos de Pro nas posições A435 e S436 (Li et al. (1997), Protein Eng. 10, 1199 a 1204).

[0407] Outras glucoamilases incluem glucoamilase de Athelia rolfsii (previamente designada Corticium rolfsii) (veja a patente dos E.U.A. n.º

4.727.026 e Nagasaka et al., (1998), “Purification and properties of the raw- starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii”, Appl Microbiol Biotechnol 50:323 a 330), glucoamilases de Talaromyces, em particular derivadas a partir de Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (patente dos E.U.A. n.º Re. 32.153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (patente dos E.U.A. n.º 4.587.215). Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase usada durante a sacarificação e/ou a fermentação é a glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada em WO 99/28448.

[0408] Glucoamilases bacterianas contempladas incluem glucoamilases do gênero Clostridium, em particular C. thermoamylolyticum (EP 135.138) e C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831).

[0409] Glucoamilases fúngicas contempladas incluem as de Trametes cingulata (SEQ ID NO: 8), Pachykytospora papyracea; e Leucopaxillus giganteus, todas divulgadas em WO 2006/069289; ou a de Peniophora rufomarginata divulgada em WO2007/124285; ou uma mistura das mesmas. São também contempladas glucoamilases híbridas de acordo com a invenção. Exemplos incluem as glucoamilases híbridas divulgadas em WO 2005/045018. Exemplos específicos incluem a glucoamilase híbrida divulgada nas Tabelas 1 e 4 do Exemplo 1 (híbridos esses que são por meio deste incorporados por referência).

[0410] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma cepa do gênero Pycnoporus, em particular uma cepa de Pycnoporus sanguineus como descrita em WO 2011/066576 (SEQ ID NOs 2, 4 ou 6 no mesmo), em particular aquela apresentada como SEQ ID NO: 7 no presente documento (correspondendo à SEQ ID NO: 4 em WO 2011/066576) ou a partir de uma cepa do gênero Gloeophyllum, tal como uma cepa de Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum trabeum, em particular uma cepa de Gloeophyllum como descrita em WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16 no mesmo). Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803 ou SEQ ID NO: 5 no presente documento (isto é, glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium). Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é SEQ ID NO: 6 no presente documento (isto é, glucoamilase de Gloeophyllum trabeum divulgada como SEQ ID NO: 3 em WO2014/177546) (todas as referências são por meio deste incorporadas por referência).

[0411] São também contempladas glucoamilases que exibem uma elevada identidade com qualquer uma das glucoamilases acima mencionadas, isto é, pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% de identidade com qualquer uma das partes maduras das sequências de enzimas mencionadas acima, tais como qualquer uma de SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 7 ou 8 no presente documento, respectivamente.

[0412] Em uma modalidade, a glucoamilase usada em fermentação ou SFS, exibe pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% de identidade com a parte madura de SEQ ID NO: 4 no presente documento.

[0413] Em uma modalidade, a glucoamilase usada em fermentação ou SFS, exibe pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% de identidade com a parte madura de SEQ ID NO: 5 no presente documento.

[0414] Em uma modalidade, a glucoamilase usada em fermentação ou SFS, exibe pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% de identidade com a parte madura de SEQ ID NO: 6 no presente documento.

[0415] Em uma modalidade, a glucoamilase usada em fermentação ou SFS, exibe pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% de identidade com a parte madura de SEQ ID NO: 7 no presente documento.

[0416] Em uma modalidade, a glucoamilase usada em fermentação ou SFS, exibe pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% de identidade com a parte madura de SEQ ID NO: 8 no presente documento.

[0417] As glucoamilases podem, em uma modalidade, ser adicionadas à sacarificação e/ou fermentação em uma quantidade de 0,0001 a 20 AGU/g de SS, preferencialmente 0,001 a 10 AGU/g de SS, especialmente entre 0,01 e 5 AGU/g de SS, tal como 0,1 a 2 AGU/g de SS.

[0418] As glucoamilases podem, em uma modalidade, ser adicionadas à sacarificação e/ou fermentação em uma quantidade de 1 a

1.000 µg de PE/g de SS, preferencialmente 10 a 500 µg/g de SS, especialmente entre 25 e 250 µg/g de SS.

[0419] Em uma modalidade, a glucoamilase é adicionada como uma combinação compreendendo adicionalmente uma alfa-amilase. Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é uma alfa-amilase fúngica, especialmente uma alfa-amilase fúngica ácida. A alfa-amilase é tipicamente uma atividade secundária.

[0420] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma combinação compreendendo glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada em WO 99/28448 como SEQ ID NO: 34 ou como SEQ ID NO: 4 no presente documento e glucoamilase de Trametes cingulata divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 06/069289 e SEQ ID NO: 8 no presente documento.

[0421] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma combinação compreendendo glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada em SEQ ID NO: 4 no presente documento, glucoamilase de Trametes cingulata divulgada como SEQ ID NO: 8 no presente documento e alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase e SBD de Aspergillus niger, divulgada como V039 na Tabela 5 em WO 2006/069290 ou SEQ ID NO: 9 no presente documento.

[0422] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma combinação compreendendo glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium apresentada como SEQ ID NO: 5 no presente documento e Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD, do inglês “starch-binding domain”) de Aspergillus niger, divulgada como SEQ ID NO: 9 no presente documento com as seguintes substituições: G128D + D143N.

[0423] Em uma modalidade, a alfa-amilase pode ser derivada de uma cepa do gênero Rhizomucor, preferencialmente uma cepa de Rhizomucor pusillus, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO2013/006756, ou do gênero Meripilus, preferencialmente uma cepa de Meripilus giganteus. Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger, divulgada como V039 na Tabela 5 em WO 2006/069290 ou SEQ ID NO: 9 no presente documento.

[0424] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus ou a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante e domínio de ligação ao amido (SBD), preferencialmente um ligante de glucoamilase e SBD de Aspergillus niger, tem pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H+Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W +

D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C (usando SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756 para numeração ou SEQ ID NO: 9 no presente documento). Em uma modalidade preferencial, a combinação de glucoamilase compreende glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium (por exemplo, SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803 ou SEQ ID NO: 5 no presente documento) e alfa-amilase de Rhizomucor pusillus.

[0425] Em uma modalidade preferencial, a combinação de glucoamilase compreende a glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium apresentada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803 ou SEQ ID NO: 5 no presente documento e Rhizomucor pusillus com um ligante e domínio de ligação ao amido (SBD), preferencialmente um ligante de glucoamilase e SBD de Aspergillus niger, divulgada como SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756 e SEQ ID NO: 9 no presente documento com as seguintes substituições: G128D+D143N.

[0426] Composições compreendendo glucoamilase comercialmente disponíveis incluem AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL, SPIRIZYME ACHIEVE™ e AMG™ E (da Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300, GC480, GC417 (da DuPont-Danisco); AMIGASE™ e AMIGASE™ PLUS (da DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ e G990 ZR (da DuPont-Danisco). Beta-amilase

[0427] Beta-amilase (E.C 3.2.1.2) é o nome tradicionalmente dado a amilases maltogênicas exoatuantes, que catalisam a hidrólise de ligações 1,4-alfa-glucosídicas em amilose, amilopectina e polímeros de glicose relacionados. As unidades de maltose são sucessivamente removidas das extremidades da cadeia não redutoras de um modo sequencial até a molécula ser degradada ou, no caso da amilopectina, até ser alcançado um ponto de ramificação. A maltose liberada tem a configuração anomérica beta, daí o nome beta-amilase.

[0428] Beta-amilases foram isoladas de várias plantas e microrganismos (W.M. Fogarty e C.T. Kelly, Progress in Industrial Microbiology, volume 15, páginas 112 a 115, 1979). Estas beta-amilases são caracterizadas por terem temperaturas ótimas na faixa de 40 C a 65 C e pH ótimo na faixa de 4,5 a 7. Uma beta-amilase de cevada comercialmente disponível é NOVOZYM™ WBA da Novozymes A/S, Dinamarca e SPEZYME™ BBA 1500 da Genencor Int., E.U.A. Amilase maltogênica

[0429] A enzima geradora de fonte de carboidrato presente e/ou adicionada durante a sacarificação e/ou fermentação pode ser também uma alfa-amilase maltogênica. Uma “alfa-amilase maltogênica” (glucana 1,4- alfa-malto-hidrolase, E.C. 3.2.1.133) é capaz de hidrolisar amilose e amilopectina em maltose na configuração alfa. Uma amilase maltogênica da cepa de Bacillus stearothermophilus NCIB 11837 está comercialmente disponível da Novozymes A/S. Alfa-amilases maltogênicas são descritas nas Patentes dos E.U.A. n.os 4.598.048, 4.604.355 e 6.162.628, que são por meio deste incorporadas por referência. A amilase maltogênica pode, em uma modalidade preferencial, ser adicionada em uma quantidade de 0,05 a 5 mg de proteína total/grama de SS ou 0,05 a 5 MANU/g de SS. Composição de celulase ou enzima celulolítica presente e/ou adicionada durante a sacarificação e/ou fermentação ou SFS

[0430] Aspectos da invenção referem-se ao uso de uma composição celulolítica em um processo da invenção. Em determinados aspectos, a composição celulolítica está presente e/ou é adicionada durante a sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas. A composição celulolítica pode estar presente ou ser adicionada durante a sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas, simultaneamente ou sequencialmente em conjunto com uma alfa-amilase, uma glucoamilase, uma protease, uma trealase e/ou qualquer combinação das mesmas. A composição celulolítica usada em um processo da invenção pode ser derivada de qualquer microrganismo. Como usado no presente documento, “derivada de qualquer microrganismo” significa que a composição celulolítica compreende uma ou mais enzimas que foram expressas no microrganismo. Por exemplo, uma composição celulolítica derivada de uma cepa de Trichoderma reesei significa que a composição celulolítica compreende uma ou mais enzimas que foram expressas em Trichoderma reesei.

[0431] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma cepa de Aspergillus, tal como uma cepa de Aspergillus aurantiacus, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae.

[0432] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma cepa de Chrysosporium, tal como uma cepa de Chrysosporium lucknowense.

[0433] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma cepa de Humicola, tal como uma cepa de Humicola insolens.

[0434] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma cepa de Penicilium, tal como uma cepa de Penicilium emersonii ou Penicilium oxalicum.

[0435] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma cepa de Talaromyces, tal como uma cepa de Talaromyces aurantiacus ou Talaromyces emersonii.

[0436] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma cepa de Trichoderma, tal como uma cepa de Trichoderma reesei.

[0437] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma cepa de Trichoderma reesei.

[0438] A composição celulolítica pode compreender um ou mais dos seguintes polipeptídeos, incluindo enzimas: polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica, beta-glucosidase, CBHI, CBHII ou uma mistura de duas, três ou quatro das mesmas.

[0439] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica compreendendo uma beta-glucosidase tendo um valor de carga de DE50 relativo de menos do que 1,00, preferencialmente menos do que 0,80, tal como preferencialmente menos do que 0,60, tal como entre 0,1 e 0,9, tal como entre 0,2 e 0,8, tal como 0,30 a 0,70.

[0440] A composição celulolítica pode compreender alguma hemicelulase, tal como, por exemplo, xilanase e/ou beta-xilosidase. A hemicelulase pode vir do organismo produtor de composição celulolítica ou de outras fontes, por exemplo, a hemicelulase pode ser estranha ao organismo produtor de composição celulolítica, tal como, por exemplo, Trichoderma reesei.

[0441] Em uma modalidade preferencial, o teor de hemicelulase na composição celulolítica constitui menos do que 10% em peso, tal como menos do que 5% em peso da composição celulolítica.

[0442] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende uma beta-glucosidase.

[0443] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende um polipeptídeo GH61 que tem atividade intensificadora de atividade celulolítica e uma beta-glucosidase.

[0444] Em outra modalidade, a composição celulolítica compreende uma beta-glucosidase e uma CBH.

[0445] Em outra modalidade, a composição celulolítica compreende um polipeptídeo GH61 que tem atividade intensificadora de atividade celulolítica, uma beta-glucosidase e uma CBHI.

[0446] Em outra modalidade, a composição celulolítica compreende uma beta-glucosidase e uma CBHI.

[0447] Em outra modalidade, a composição celulolítica compreende um polipeptídeo GH61 que tem atividade intensificadora de atividade celulolítica, uma beta-glucosidase, uma CBHI e uma CBHII.

[0448] Em outra modalidade, a composição celulolítica compreende uma beta-glucosidase, uma CBHI e uma CBHII.

[0449] A composição celulolítica pode, adicionalmente, compreender uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 que tem atividade intensificadora de atividade celulolítica, uma esterase, uma expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

[0450] Em uma modalidade, a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobio-hidrolase e uma beta-glucosidase.

[0451] Em uma modalidade, a endoglucanase é uma endoglucanase I.

[0452] Em uma modalidade, a endoglucanase é uma endoglucanase II. Beta-glucosidase

[0453] A composição celulolítica usada de acordo com a invenção pode, em uma modalidade, compreender uma ou mais beta- glucosidases. A beta-glucosidase pode, em uma modalidade, ser uma derivada de uma cepa do gênero Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae, tal como aquela divulgada em WO 2002/095014 ou a proteína de fusão tendo atividade de beta-glucosidase divulgada em WO 2008/057637, ou Aspergillus fumigatus, tal como uma divulgada em WO 2005/047499 ou SEQ

ID NO: 22 no presente documento ou uma variante de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus, tal como uma divulgada em WO 2012/044915 ou pedido PCT copendente PCT/US11/054185 (ou pedido provisório dos E.U.A. N.º 61/388.997), tal como uma com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y.

[0454] Em outra modalidade, a beta-glucosidase é derivada de uma cepa do gênero Penicillium, tal como uma cepa de Penicillium brasilianum, divulgada em WO 2007/019442, ou uma cepa do gênero Trichoderma, tal como uma cepa de Trichoderma reesei.

[0455] Em uma modalidade, a beta-glucosidase é uma beta- glucosidase de Aspergillus fumigatus ou homólogo da mesma selecionada do grupo que consiste em: (i) uma beta-glucosidase compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 22; (ii) uma beta-glucosidase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 22 no presente documento; (iii) uma beta-glucosidase codificada por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 em WO 2013/148993; e (iv) uma beta-glucosidase codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos alta estringência, por exemplo, condições de muito alta estringência, com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 em WO 2013/148993 ou o complemento de comprimento total do mesmo.

[0456] Em uma modalidade, a beta-glucosidase é uma variante compreendendo uma substituição em uma ou mais (várias) posições correspondendo às posições 100, 283, 456 e 512 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 22 no presente documento, em que a variante tem atividade de beta-glucosidase.

[0457] Em uma modalidade, a beta-glucosidase genitora da variante é (a) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 22 no presente documento; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 22 no presente documento; (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de alta ou muito alta estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 em WO 2013/148993, (ii) a sequência de cDNA contida na sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 em WO 2013/148993 ou (iii) a fita complementar de comprimento total de (i) ou (ii); (d) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 em WO 2013/148993 ou a sequência de cDNA do mesmo; ou (e) um fragmento do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 22 no presente documento, que tem atividade de beta-glucosidase.

[0458] Em uma modalidade, a variante de beta-glucosidase tem pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos da beta-glucosidase progenitora.

[0459] Em uma modalidade, a variante tem pelo menos 80%,

por exemplo, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 22 no presente documento.

[0460] Em uma modalidade, a beta-glucosidase é de uma cepa de Aspergillus, tal como uma cepa de Aspergillus fumigatus, tal como uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 22 no presente documento), que compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em L89M, G91L, F100D, I140V, I186V, S283G, N456E e F512Y; tal como uma variante da mesma com as seguintes substituições: - F100D + S283G + N456E + F512Y; - L89M + G91L + I186V + I140V; - I186V + L89M + G91L + I140V + F100D + S283G + N456E + F512Y.

[0461] Em uma modalidade, o número de substituições é entre 1 e 4, tal como 1, 2, 3 ou 4 substituições.

[0462] Em uma modalidade, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 100, uma substituição em uma posição correspondendo à posição 283, uma substituição em uma posição correspondendo à posição 456 e/ou uma substituição em uma posição correspondendo à posição 512.

[0463] Em uma modalidade preferencial, a variante de beta- glucosidase compreende as seguintes substituições: Phe100Asp, Ser283Gly, Asn456Glu, Phe512Tyr em SEQ ID NO: 22 no presente documento.

[0464] Em uma modalidade preferencial, a beta-glucosidase tem um valor de carga de DE50 relativo de menos do que 1,00,

preferencialmente menos do que 0,80, tal como preferencialmente menos do que 0,60, tal como entre 0,1 e 0,9, tal como entre 0,2 e 0,8, tal como 0,30 a 0,70. Polipeptídeo GH61 que tem atividade intensificadora de atividade celulolítica

[0465] A composição celulolítica usada de acordo com a invenção pode, em uma modalidade, compreender um ou mais polipeptídeos GH61 que têm atividade intensificadora de atividade celulolítica. Em uma modalidade, a composição de enzima compreende um polipeptídeo GH61 que tem atividade intensificadora de atividade celulolítica, tal como um derivado do gênero Thermoascus, tal como de uma cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como aquele descrito em WO 2005/074656 como SEQ ID NO: 2; ou um derivado do gênero Thielavia, tal como de uma cepa de Thielavia terrestris, tal como aquele descrito em WO 2005/074647 como SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8; ou um derivado de uma cepa de Aspergillus, tal como uma cepa de Aspergillus fumigatus, tal como aquele descrito em WO 2010/138754 como SEQ ID NO: 2; ou um derivado de uma cepa derivada de Penicillium, tal como uma cepa de Penicillium emersonii, tal como aquele divulgado em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 23 no presente documento.

[0466] Em uma modalidade, o polipeptídeo GH61 de Penicillium sp. que tem atividade intensificadora de atividade celulolítica ou um homólogo do mesmo é selecionado do grupo que consiste em: (i) um polipeptídeo GH61 que tem atividade intensificadora de atividade celulolítica compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 23 no presente documento; (ii) um polipeptídeo GH61 que tem atividade intensificadora de atividade celulolítica compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%,

91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 23 no presente documento; (iii) um polipeptídeo GH61 que tem atividade intensificadora de atividade celulolítica codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7 em WO 2013/148993; e (iv) um polipeptídeo GH61 que tem atividade intensificadora de atividade celulolítica codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos alta estringência, por exemplo, condições de muito alta estringência, com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7 em WO 2013/148993 ou o complemento de comprimento total do mesmo. Celobio-hidrolase I

[0467] A composição celulolítica usada de acordo com a invenção pode, em uma modalidade, compreender uma ou mais CBH I (celobio-hidrolase I). Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende uma celobio-hidrolase I (CBHI), tal como uma derivada de uma cepa do gênero Aspergillus, tal como uma cepa de Aspergillus fumigatus, tal como a CBHI Cel7A divulgada em SEQ ID NO: 6 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 24 no presente documento, ou uma cepa do gênero Trichoderma, tal como uma cepa de Trichoderma reesei.

[0468] Em uma modalidade, a celobio-hidrolase I de Aspergillus fumigatus ou um homólogo da mesma é selecionado do grupo que consiste em: (i) uma celobio-hidrolase I compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 24 no presente documento;

(Ii) uma celobio-hidrolase I compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 24 no presente documento; (iii) uma celobio-hidrolase I codificada por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 em WO 2013/148993; e (iv) uma celobio-hidrolase I codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos alta estringência, por exemplo, condições de muito alta estringência, com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 em WO 2013/148993 ou o complemento de comprimento total do mesmo. Celobio-hidrolase II

[0469] A composição celulolítica usada de acordo com a invenção pode, em uma modalidade, compreender uma ou mais CBHII (celobio-hidrolase II). Em uma modalidade, a celobio-hidrolase II (CBHII), tal como uma derivada de uma cepa do gênero Aspergillus, tal como uma cepa de Aspergillus fumigatus, tal como aquela em SEQ ID NO: 25 no presente documento ou uma cepa do gênero Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, ou uma cepa do gênero Thielavia, tal como uma cepa de Thielavia terrestris, tal como celobio-hidrolase II CEL6A de Thielavia terrestris.

[0470] Em uma modalidade, a celobio-hidrolase II de Aspergillus fumigatus ou homólogo da mesma é selecionado do grupo que consiste em: (i) uma celobio-hidrolase II compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 25 no presente documento;

(ii) uma celobio-hidrolase II compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 25 no presente documento; (iii) uma celobio-hidrolase II codificada por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 em WO 2013/148993; e (iv) uma celobio-hidrolase II codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos alta estringência, por exemplo, condições de muito alta estringência, com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 em WO 2013/148993 ou o complemento de comprimento total do mesmo. Composições celulolíticas

[0471] Conforme mencionado acima, a composição celulolítica pode compreender um número de polipeptídeos diferentes, tais como enzimas.

[0472] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende uma composição celulolítica de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente o polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus que tem atividade intensificadora de atividade celulolítica (WO 2005/074656) e proteína de fusão de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637).

[0473] Em outra modalidade, a composição celulolítica compreende uma composição celulolítica de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente um polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus que tem atividade intensificadora de atividade celulolítica (SEQ

ID NO: 2 em WO 2005/074656) e beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499).

[0474] Em outra modalidade, a composição celulolítica compreende uma composição celulolítica de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente o polipeptídeo GH61A de Penicillium emersonii que tem atividade intensificadora de atividade celulolítica divulgado em WO 2011/041397, beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499) ou uma variante da mesma com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y.

[0475] A composição de enzima da presente invenção pode estar em qualquer forma adequada para uso, tal como, por exemplo, um caldo de fermentação bruto com ou sem células removidas, um lisado celular com ou sem detritos celulares, uma composição de enzima semipurificada ou purificada, ou uma célula hospedeira, por exemplo, célula hospedeira de Trichoderma, como uma fonte das enzimas.

[0476] A composição de enzima pode ser um pó ou granulado seco, um granulado sem formação de poeira, um líquido, um líquido estabilizado ou uma enzima protegida estabilizada. As composições de enzimas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas pela adição de estabilizantes, tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou outro poliol e/ou ácido láctico ou outro ácido orgânico de acordo com processos estabelecidos.

[0477] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica compreendendo uma beta-glucosidase tem um valor de carga de DE50 relativo de menos do que 1,00, preferencialmente menos do que 0,80, tal como preferencialmente menos do que 0,60, tal como entre 0,1 e 0,9, tal como entre 0,2 e 0,8, tal como 0,30 a 0,70.

[0478] Em uma modalidade, a composição de enzima celulolítica é doseada (isto é, durante a etapa de sacarificação na etapa ii)

e/ou fermentação na etapa iii) ou SFS) de 0,0001 a 3 mg de PE/g de SS, preferencialmente 0,0005 a 2 mg de PE/g de SS, preferencialmente 0,001 a 1 mg/g de SS, mais preferencialmente de 0,005 a 0,5 mg de PE/g de SS, ainda mais preferencialmente 0,01 a 0,1 mg de PE/g de SS. Protease presente e/ou adicionada durante a liquefação e/ou sacarificação e/ou fermentação

[0479] Em uma modalidade da invenção, uma protease opcional, tal como uma protease termoestável, pode estar presente e/ou ser adicionada na liquefação em conjunto com uma alfa-amilase, tal como uma alfa-amilase termoestável, e uma hemicelulase, preferencialmente xilanase, tendo um ponto de fusão (DSC) acima de 80 °C e, opcionalmente, uma endoglucanase, uma enzima geradora de fonte de carboidrato, em particular uma glucoamilase, opcionalmente uma pululanase e/ou opcionalmente uma fitase.

[0480] Em uma modalidade da invenção, uma protease opcional pode estar presente e/ou ser adicionada na etapa de sacarificação (b), etapa de fermentação (c), sacarificação e fermentação simultâneas, ou pré-sacarificação antes da etapa (b), opcionalmente em conjunto com uma alfa-amilase, uma glucoamilase, uma composição celulolítica e uma trealase.

[0481] As proteases são classificadas com base no seu mecanismo catalítico nos seguintes grupos: Serina proteases (S), Cisteína proteases (C), Proteases aspárticas (A), Metaloproteases (M) e Proteases desconhecidas ou ainda não classificadas (U), veja Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Academic Press (1998), em particular a parte da introdução geral.

[0482] Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável usada de acordo com a invenção é uma “metaloprotease” definida como uma protease pertencendo a EC 3.4.24 (metaloendopeptidases); preferencialmente EC 3.4.24.39

(metaloproteinases ácidas).

[0483] Para se determinar se uma dada protease é uma metaloprotease ou não, é feita referência ao “Handbook of Proteolytic Enzymes” acima e aos princípios indicados no mesmo. Tal determinação pode ser realizada para todos os tipos de proteases, sejam proteases de ocorrência natural ou do tipo selvagem; ou proteases geneticamente manipuladas ou sintéticas.

[0484] A atividade de protease pode ser medida usando qualquer ensaio adequado, no qual um substrato é empregue, que inclua ligações peptídicas relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH do ensaio e a temperatura do ensaio devem ser do mesmo modo adaptados para a protease em questão. Exemplos de valores de pH do ensaio são pH 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Exemplos de temperaturas do ensaio são 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ou 80 °C.

[0485] Exemplos de substratos de proteases são caseína, tal como a Caseína Reticulada com Azurina (AZCL-caseína). Dois ensaios de protease são descritos abaixo na seção “Materials & Methods” de WO 2017/112540 (incorporada no presente documento por referência), dos quais o denominado “Ensaio de AZCL-caseína” é o ensaio preferencial.

[0486] Em uma modalidade, a protease termoestável tem pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 100%, da atividade de protease da variante JTP196 (Exemplo 2 de WO 2017/112540) ou Protease Pfu (SEQ ID NO: 26 no presente documento) determinada pelo ensaio de AZCL-caseína descrito na seção “Materials & Methods” em WO 2017/112540.

[0487] Não existem quaisquer limitações quanto à origem da protease termoestável usada em um processo ou composição da invenção desde que ela cumpra com as propriedades de termoestabilidade definidas abaixo.

[0488] Em uma modalidade, a protease é de origem fúngica.

[0489] Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável é uma variante de uma metaloprotease conforme definida acima. Em uma modalidade, a protease termoestável usada em um processo ou composição da invenção é de origem fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica derivada de uma cepa do gênero Thermoascus, preferencialmente uma cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC N.º 0670 (classificada como EC 3.4.24.39).

[0490] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma variante da parte madura da metaloprotease mostrada em SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou da parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 e mostrada como SEQ ID NO: 27 no presente documento adicionalmente com mutações selecionadas da lista abaixo: - S5*+D79L+S87P+A112P+D142L; - D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; - S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L; - N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L; - T46R+D79L+S87P+T116V+D142L; - D79L+P81R+S87P+A112P+D142L; - A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; - D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; - D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; - D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L; - D79L+S87P+A112P+D142L; - D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L; - S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L;

- D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L; - A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; - D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L; - D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C; - S36P+D79L+S87P+A112P+D142L; - A37P+D79L+S87P+A112P+D142L; - S49P+D79L+S87P+A112P+D142L; - S50P+D79L+S87P+A112P+D142L; - D79L+S87P+D104P+A112P+D142L; - D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; - S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L; - D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L; - S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; - D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L; - D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L; - Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L; - Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L; - A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; - A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; - A27K+D79L+Y82F+ D104P+A112P+A126V+D142L; - A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L; - A27K+D79L+S87P+A112P+D142L; - D79L+S87P+D142L.

[0491] Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável é uma variante da metaloprotease madura divulgada como a parte madura de SEQ ID NO: 2 divulgado em WO 2003/048353 ou a parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 27 no presente documento com as seguintes mutações: D79L+S87P+A112P+D142L;

D79L+S87P+D142L; ou A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

[0492] Em uma modalidade, a variante de protease tem pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 divulgado em WO 2003/048353 ou a parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 27 no presente documento.

[0493] A protease termoestável pode ser também derivada de qualquer bactéria desde que a protease tenha as propriedades de termoestabilidade definidas de acordo com a invenção.

[0494] Em uma modalidade, a protease termoestável é derivada de uma cepa da bactéria Pyrococcus, tal como uma cepa de Pyrococcus furiosus (protease pfu).

[0495] Em uma modalidade, a protease é uma mostrada como SEQ ID NO: 1 na patente dos E.U.A. N.º 6.358.726-B1 (Takara Shuzo Company) e SEQ ID NO: 26 no presente documento.

[0496] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma divulgada em SEQ ID NO: 26 no presente documento ou uma protease tendo pelo menos 80% de identidade, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, de identidade com SEQ ID NO: 1 na patente dos E.U.A. n.º 6.358.726-B1 ou SEQ ID NO: 26 no presente documento. A protease de Pyrococcus furiosus pode ser adquirida da Takara Bio, Japão.

[0497] A protease de Pyrococcus furiosus é uma protease termoestável de acordo com a invenção. Foi descoberto que o produto comercial protease de Pyrococcus furiosus (Pfu S) (veja o Exemplo 5 de ) tinha uma termoestabilidade de 110% (80 °C/70 °C) e 103% (90 °C/70 °C) a pH 4,5 determinada conforme descrito no Exemplo 2 de WO 2017/112540.

[0498] Em uma modalidade, uma protease termoestável tem um valor de termoestabilidade de mais do que 20% determinado como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C determinada conforme descrito no Exemplo

2.

[0499] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90%, mais do que 100%, tal como mais do que 105%, tal como mais do que 110%, tal como mais do que 115%, tal como mais do que 120% determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C.

[0500] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de entre 20 e 50%, tal como entre 20 e 40%, tal como 20 e 30% determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C. Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade entre 50 e 115%, tal como entre 50 e 70%, tal como entre 50 e 60%, tal como entre 100 e 120%, tal como entre 105 e 115% determinada como Atividade Relativa a 80 °C/70 °C.

[0501] Em uma modalidade, a protease tem um valor de termoestabilidade de mais do que 10% determinado como Atividade Relativa a 85 °C/70 °C determinada conforme descrito no Exemplo 2 de WO 2017/112540.

[0502] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de mais do que 10%, tal como mais do que 12%, mais do que 14%, mais do que 16%, mais do que 18%, mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90%, mais do que 100%, mais do que 110% determinada como Atividade Relativa a 85 °C/70 °C.

[0503] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de entre 10 e 50%, tal como entre 10 e 30%, tal como entre 10 e 25% determinada como Atividade Relativa a 85 °C/70 °C.

[0504] Em uma modalidade, a protease tem mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90% determinada como Atividade Relativa a 80 °C; e/ou

[0505] Em uma modalidade, a protease tem mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90% determinada como Atividade Relativa a 84 °C.

[0506] A determinação da “Atividade Relativa” e “Atividade Remanescente” é feita conforme descrito no Exemplo 2 de WO 2017/112540. Em uma modalidade, a protease pode ter uma termoestabilidade acima de 90, tal como acima de 100 a 85 °C conforme determinada usando o ensaio de Zeína-BCA conforme divulgado no Exemplo 3 de WO 2017/112540.

[0507] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade acima de 60%, tal como acima de 90%, tal como acima de 100%, tal como acima de 110% a 85 °C como determinada usando o ensaio de Zeína-BCA.

[0508] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade entre 60 e 120, tal como entre 70 e 120%, tal como entre 80 e 120%, tal como entre 90 e 120%, tal como entre 100 e 120%, tal como 110 a 120% a 85 °C conforme determinada usando o ensaio de Zeína-BCA.

[0509] Em uma modalidade, a protease termoestável tem pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 100% da atividade da variante de protease JTP196 ou Protease Pfu determinada pelo ensaio de AZCL-caseína descrito na seção “Materials & Methods” de WO 2017/112540.

[0510] Proteases adicionais adequadas para uso em processos da invenção são mostradas em SEQ ID NOs: 9 a 73 (ou variantes das mesmas tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com as mesmas) da Tabela 1 do Pedido dos E.U.A. N.º 62/514.636, depositado em 2 de junho de 2017 (N.º de registro legal 14480-US-PRO), que é incorporado por referência no presente documento em sua totalidade.

[0511] Em várias modalidades, as proteases podem ser expressas com o organismo fermentador, por exemplo, levedura, por exemplo, uma cepa de Saccharomyces, tal como uma cepa de Saccharomyces cerevisiae e processos descritos no presente documento. Em determinadas modalidades, as proteases são expressas com o organismo fermentador, por exemplo, levedura, por exemplo, uma cepa de Saccharomyces, tal como uma cepa de Saccharomyces cerevisiae, nas etapas de sacarificação, fermentação, sacarificação e fermentação simultâneas de processos para a produção de um produto de fermentação, tal como especialmente etanol.

Trealases usadas na sacarificação e/ou fermentação

[0512] De acordo com a invenção, uma trealase pode estar presente e/ou ser adicionada na etapa de sacarificação (b), etapa de fermentação (c), sacarificação e fermentação simultâneas (SFS); ou pré- sacarificação antes da etapa (b) opcionalmente em conjunto com uma alfa- amilase, uma composição celulolítica, uma protease e qualquer combinação das mesmas.

[0513] As trealases são enzimas que degradam a trealose nos seus monossacarídeos unitários (isto é, glicose). De acordo com a invenção, a trealase pode ser uma única trealase, ou uma combinação de duas ou mais trealases de qualquer origem, tal como origem vegetal, mamífera ou microbiana, tal como origem bacteriana ou fúngica. Em uma modalidade preferencial, a trealase é de origem mamífera, tal como uma trealase suína. Em outra modalidade preferencial, a trealase é de origem fúngica, preferencialmente de origem de levedura. Em uma modalidade preferencial, a trealase é derivada de uma cepa de Saccharomyces, tal como uma cepa de Saccharomyces cervisae.

[0514] As trealases são classificadas em EC 3.2.1.28 (alfa,alfa-trealase) e EC. 3.2.1.93 (alfa,alfa-fosfotrealase). As classes de EC são baseadas nas recomendações do Nomenclature Committee da International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). A descrição das classes de EC pode ser encontrada na internet, por exemplo, em “http://www.expasy.org/enzyme/”. As trealases são enzimas que catalisam as seguintes reações: EC 3.2.1.28: Alfa,alfa-trealose + H2O = 2 D-glicose; EC 3.2.1. 93: Alfa,alfa-trealose 6-fosfato + H2O <=> D-glicose + D-glicose 6- fosfato.

[0515] As duas classes de enzimas são ambas chamadas de “trealases” no contexto da presente invenção. Em uma modalidade preferencial, a trealase é classificada como EC 3.2.1.28. Em outra modalidade, a trealase é classificada como EC 3.2.1.93. Na modalidade, a trealase é uma trealase neutra. Em outra modalidade, a trealase é uma trealase ácida.

[0516] A trealase presente e/ou adicionada durante a etapa de sacarificação (b); etapa de fermentação (c); sacarificação e fermentação simultâneas; ou pré-sacarificação antes da etapa (b), pode ser derivada de qualquer fonte adequada, por exemplo, derivada de um microrganismo ou uma planta.

[0517] Exemplos de trealases neutras incluem, mas não estão limitados a, trealases de Saccharomyces cerevisiae (Londesborouh et al. (1984), Characterization of two trehalases from baker's yeast, Biochem J 219, 511 a 518); Mucor roxii (Dewerchin et al. (1984), Trehalase activity and cyclic AMP content during early development of Mucor rouxii spores, J. Bacteriol. 158, 575 a 579); Phycomyces blakesleeanus (Thevelein et al. (1983), Glucose-induced trehalase activation and trehalose mobilization during early germination of Phycomyces blakesleeanys spores, J. Gen Microbiol. 129, 719 a 726); Fusarium oxysporium (Amaral et al. (1996), Comparative study of two trehalase activities from Fusarium oxysporium var Linii, Can. J Microbiol. 41, 1057 a 1062).

[0518] Exemplos de trealases neutras incluem, mas não estão limitados a, trealases de Saccharomyces cerevisiae (Parvaeh et al. (1996), Purification and biochemical characterization of the ATH1 gene product, vacuolar acid trehalase from Saccharomyces cereviase, FEBS Lett. 391, 273 a 278); Neorospora crassa (Hecker et al. (1973), Location of trehalase in the ascospores of Neurospora: Relation to ascospore dormancy and germination, J. Bacteriol. 115, 592 a 599); Chaetomium aureum (Sumida et al. (1989), Purification and some properties of trehalase from Chaetomium aureum MS-27, J. Ferment. Bioeng. 67, 83 a 86); Aspergillus nidulans (d'Enfert et al. (1997), Molecular characterization of the Aspergillus nidulans treA gene encoding an acid trehalase required for growth on trehalose, Mol. Microbiol. 24, 203 a 216); Humicola grisea (Zimmermann et al. (1990), Purification and properties of an extracellular conidial trehalase from Humicola grisea var. thermoidea, Biochim. Acta 1036, 41 a 46); Humicola grisea (Cardello et al. (1994), A cytosolic trehalase from the thermophilhilic fungus Humicola grisea var. thermoidea, Microbiology UK 140, 1671 a 1677; Scytalidium thermophilum (Kadowaki et al. (1996), Characterization of the trehalose system from the thermophilic fungus Scytalidium thermophilum, Biochim. Biophys. Acta 1291, 199 a 205); e Fusarium oxysporium (Amaral et al. (1996), Comparative study of two trehalase activities from Fusarium oxysporium var Linii, Can. J Microbiol. 41: 1057 a 1062).

[0519] Uma trealase é também conhecida da soja (Aeschbachet et al. (1999), Purification of the trehalase GmTRE1 from soybean nodules and cloning of its cDNA, Plant Physiol 119, 489 a 496).

[0520] As trealases estão também presentes no intestino delgado e rins de mamíferos.

[0521] Em uma modalidade, a trealase é derivada de uma cepa de Talaromyces, tal como uma cepa de Talaromyces funiculosus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 28 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 28 no presente documento, uma cepa de Talaromyces leycettanus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 29 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%,

pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% com SEQ ID NO: 29 no presente documento, ou uma cepa de Talaromyces cellulyticus, tal como aquela com o N.º de acesso: Uniprot:A0A0B8MYG3, ou uma variante da mesma tendo pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0522] Em uma modalidade, a trealase é derivada de uma cepa de Myceliophthora, tal como uma cepa de Myceliophthora thermophile, tal como uma divulgada em WO 2012/027374 (incorporada no presente documento por referência em sua totalidade) Diádica) ou variantes da mesma tendo pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma, ou de uma cepa de Myceliophthora sepedonium pertencente à Família 37 de glucosídeo hidrolases (“GH37”), conforme definida pelo banco de dados CAZY (disponível na internet) tendo alta termoestabilidade e uma ampla faixa de pH, ou variantes da mesma tendo pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0523] Em uma modalidade, a trealase é derivada de uma cepa de Trichoderma, tal como uma cepa de Triochoderma reesei, tal como uma divulgada em WO 2013/148993 (incorporada no presente documento por referência em sua totalidade), ou uma variante da mesma tendo pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0524] Em uma modalidade, a trealase é derivada de uma cepa de Aspergillus, tal como uma cepa de Aspergillus wentii, tal como aquela que tem o N.º de acesso: Uniprot:A0A1L9RM22, ou uma variante da mesma tendo pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0525] A trealase comercialmente disponível inclui a trealase suína disponível da SIGMA, E.U.A. (produto n.º A8778).

[0526] A trealase pode ser adicionada ou estar presente em qualquer dosagem eficaz durante a fermentação, que inclui, mas não está limitada a, de 1 a 500 unidades Sigma por litro de meio de fermentação, de preferência 10 a 100 unidades Sigma por litro de meio de fermentação. X. Aspectos adicionais da invenção

[0527] Em um aspecto adicional da invenção, refere-se ao uso de uma peroxidase ou composição de peroxidase para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura.

[0528] Em um aspecto adicional da invenção, refere-se ao uso de uma peroxidase ou composição de peroxidase para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura durante a propagação da levedura.

[0529] Em um aspecto adicional da invenção, refere-se ao uso de uma peroxidase ou composição de peroxidase para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura durante a fermentação de etanol.

[0530] Em um aspecto adicional da invenção, refere-se ao uso de uma peroxidase ou composição de peroxidase para aumentar a taxa na qual o etanol é produzido nas primeiras 24 horas de fermentação durante um processo de produção de biocombustível.

[0531] Em um aspecto adicional da invenção, refere-se ao uso de uma peroxidase ou composição de peroxidase para reduzir os níveis de ácido láctico em um sistema de fermentação de biocombustível.

[0532] Em um aspecto adicional da invenção, refere-se ao uso de uma peroxidase ou composição de peroxidase para reduzir os níveis de ácido láctico em um meio de fermentação.

[0533] Em um aspecto adicional da invenção, refere-se ao uso de uma peroxidase ou composição de peroxidase para reduzir os títulos de ácido láctico durante as etapas de fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas de um processo de produção de biocombustível.

[0534] Em um aspecto adicional da invenção, refere-se ao uso de uma peroxidase ou composição de peroxidase para reduzir os níveis de ácido láctico durante a propagação de levedura.

[0535] Em um aspecto adicional da invenção, refere-se ao uso de uma peroxidase ou composição de peroxidase para reduzir os títulos de ácido láctico durante as etapas de fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas de um processo de produção de biocombustível.

[0536] Os especialistas na técnica apreciarão que os aspectos e modalidades descritos nesta seção são aplicáveis a qualquer peroxidase, por exemplo, as peroxidases descritas na seção VII no presente documento.

[0537] Em uma modalidade, a peroxidase é uma peroxidase ou enzimas de decomposição de peróxido selecionadas de: E.C. 1.11.1.1 NADH peroxidase; E.C. 1.11.1.2 NADPH peroxidase; E.C. 1.11.1.3 ácido graxo peroxidase; E.C. 1.11.1.5 citocromo-c peroxidase; E.C. 1.11.1.5; E.C.

1.11.1.6 catalase; E.C. 1.11.1.7 peroxidase; E.C. 1.11.1.8 iodeto peroxidase; E.C. 1.11.1.9 glutationa peroxidase; E.C. 1.11.1.10 cloreto peroxidase; E.C.

1.11.1.11 L-ascorbato peroxidase; E.C. 1.11.1.12 Fosfolipídeo-hidroperóxido glutationa peroxidase; EC 1.11.1.13 manganês peroxidase; E.C. 1.11.1.14 lignina peroxidase; E.C. 1.11.1.15 peroxirredoxina; E.C. 1.11.1.16 peroxidase versátil; E.C. 1.11.1.B2 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.B6 iodeto peroxidase (contendo vanádio); E.C. 1.11.1.B7 brometo peroxidase; E.C. 1.11.1.B8 iodeto peroxidase.

[0538] De preferência, a peroxidase é derivada de um microrganismo, tal como um organismo fúngico, tal como uma levedura ou fungos filamentosos, ou bactérias; ou planta.

[0539] Em uma modalidade preferencial, a peroxidase é selecionada de: (i) uma peroxidase derivada de uma cepa de Thermoascus, tal como uma cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 1 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 no presente documento; (ii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Mycothermus, tal como uma cepa de Mycothermus thermophilus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 2 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 no presente documento; ou (iii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Coprinus, tal como uma cepa de Coprinus cinereus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 3 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 no presente documento.

[0540] A invenção é adicionalmente resumida nos seguintes parágrafos:

1. Um processo para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura, em que o processo compreende colocar a levedura em contato com uma quantidade eficaz de uma peroxidase.

2. Um processo para a produção de levedura que compreende o cultivo da levedura da reivindicação 1 sob condições conducentes ao crescimento de levedura.

3. O processo do parágrafo 1 ou 2, em que o crescimento da levedura é aumentado em 10% a 50% em comparação com o crescimento de levedura que não foi colocada em contato com o polipeptídeo.

4. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 3, em que a produtividade da levedura é aumentada em 10% a 50% em comparação com a produtividade de levedura que não foi colocada em contato com o polipeptídeo.

5. Uma composição que compreende levedura produzida de acordo com o processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 4 e pelo menos um componente selecionado de um tensoativo, um emulsificante, uma goma, um agente de inchamento, um antioxidante e qualquer combinação dos mesmos.

6. A composição de acordo com o parágrafo 5, que é formulada como uma levedura em creme, uma levedura comprimida, uma levedura desintegrada ou uma levedura seca ativa.

7. Um recipiente que compreende a composição de acordo com o parágrafo 5 ou 6, em que o recipiente é opcionalmente selecionado de uma bolsa, um skid de dosagem, um pacote, um saco ou um recipiente de fermentação.

8. Um processo para a propagação de levedura para a produção de bioproduto em um sistema de fermentação de biocombustível, em que o processo compreende a introdução de uma composição de enzima compreendendo uma peroxidase em um sistema de fermentação de biocombustível, em que o sistema de fermentação compreende um ou mais recipientes de fermentação, tubos e/ou componentes, e em que a peroxidase é adicionada em uma concentração suficiente para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura no sistema de fermentação de biocombustível.

9. O processo de qualquer um do parágrafo 8, em que pelo menos um dos recipientes de fermentação é um tanque de fermentação e a composição de enzima é introduzida no tanque de fermentação.

10. O processo do parágrafo 8 ou 9, em que composição de enzima é introduzida no tanque de fermentação dentro das primeiras seis horas de fermentação.

11. O processo de qualquer um dos parágrafos 8 a 10, em que a taxa na qual etanol é produzido nas primeiras 24 horas de fermentação é aumentada em 10% a 50% em comparação com a quantidade de etanol produzido nas primeiras 24 horas sem a peroxidase.

12. O processo de qualquer um dos parágrafos 8 a 11, em que o crescimento de levedura nas primeiras 24 horas de fermentação é aumentado em 10% a 50% em comparação com o crescimento de levedura nas primeiras 24 horas de fermentação sem a peroxidase.

13. O processo de qualquer um dos parágrafos 8 a 12, em que pelo menos um dos recipientes de fermentação é um tanque de propagação de levedura e a composição de enzima é introduzida no tanque de propagação de levedura.

14. O processo de qualquer um dos parágrafos 8 a 13, em que a taxa na qual etanol é produzido nas primeiras 24 horas de fermentação é aumentada em 10% a 50% em comparação com a quantidade de etanol produzido nas primeiras 24 horas sem a peroxidase.

15. O processo de qualquer um dos parágrafos 8 a 14, em que o crescimento de levedura após 24 horas de propagação é aumentado em 10% a 50% na presença da peroxidase em comparação com o crescimento de levedura durante o mesmo período de propagação sem a peroxidase.

16. O processo de qualquer um dos parágrafos 8 a 15, que compreende adicionalmente a adição de levedura ao tanque de propagação ou ao recipiente de fermentação.

17. O processo do parágrafo 16, em que a levedura é colocada em contato com uma peroxidase antes de ser adicionada ao tanque de propagação ou ao recipiente de fermentação.

18. O processo de qualquer um dos parágrafos 8 a 17, em que o biocombustível é etanol.

19. Um processo para a produção de um produto de fermentação a partir de um material contendo amido, em que o processo compreende: a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa-amilase para formar um mosto liquefeito; b) sacarificação do mosto liquefeito usando uma enzima geradora de fonte de carboidrato para produzir um açúcar fermentável; c) fermentação do açúcar usando um organismo fermentador sob condições adequadas para produzir o produto de fermentação, em que uma peroxidase é adicionada antes ou durante a etapa de sacarificação b) e/ou a etapa de fermentação c).

20. O processo do parágrafo 19, em que os passo b) e c) são levados a cabo simultaneamente.

21. O processo do parágrafo 19 ou 20, em que uma pasta semifluida do material contendo amido é aquecida até acima da temperatura de gelatinização.

22. O processo de qualquer um dos parágrafos 19 a 21, em que a peroxidase é adicionada durante a liquefação.

23. O processo de qualquer um dos parágrafos 19 a 22, em que a peroxidase é adicionada durante a sacarificação, em que a peroxidase é opcionalmente adicionada dentro das primeiras 2 horas de sacarificação.

24. O processo de qualquer um dos parágrafos 19 a 23, em que a peroxidase é adicionada durante a fermentação, em que a peroxidase é opcionalmente adicionada dentro das primeiras 6 horas de fermentação.

25. O processo de qualquer um dos parágrafos 19 a 24, em que o produto de fermentação é um álcool, preferencialmente etanol.

26. O processo de qualquer um dos parágrafos 19 a 25, em que o organismo fermentador é levedura.

27. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 26, em que a levedura pertence a um gênero selecionado de Saccharomyces, Rhodotorula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Rhodosporidium, Candida, Yarrowia, Lipomyces, Cryptococcus ou Dekkera.

28. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 27, em que a levedura é Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus (carlsbergiensis), Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Fusarium oxysporum ou qualquer combinação das mesmas.

29. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 28, em que a levedura é Saccharomyces cerevisiae.

30. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 29, em que a levedura compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima selecionada de uma alfa-amilase, uma glucoamilase ou uma protease.

31. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 30, em que a peroxidase é adicionada durante a propagação de levedura.

32. O processo do parágrafo 31, em que o crescimento de levedura nas primeiras 24 horas de propagação da levedura é aumentado em 10% a 50% em comparação com o crescimento de levedura nas primeiras 24 horas de propagação de levedura sem a peroxidase.

33. O processo de qualquer um dos parágrafos 19 a 32, em que a taxa na qual etanol é produzido nas primeiras 24 horas de fermentação é aumentada em 10% a 50% em comparação com a quantidade de etanol produzido nas primeiras 24 horas de fermentação sem a peroxidase.

34. O processo de qualquer um dos parágrafos 19 a 33, em que os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação são reduzidos em 10% a 50% em comparação com os títulos absolutos de ácido láctico no final da fermentação sem a peroxidase.

35. O processo de qualquer um dos parágrafos 19 a 34, em que os títulos de ácido láctico nas primeiras 24 horas de fermentação são reduzidos em 10% a 50% em comparação com os títulos de ácido láctico nas primeiras 24 horas de fermentação sem a peroxidase.

36. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 35, em que a peroxidase é uma peroxidase ou enzimas de decomposição de peróxido selecionadas de: E.C. 1.11.1.1 NADH peroxidase; E.C. 1.11.1.2 NADPH peroxidase; E.C. 1.11.1.3 ácido graxo peroxidase; E.C. 1.11.1.5 citocromo-c peroxidase; E.C. 1.11.1.5; E.C. 1.11.1.6 catalase; E.C. 1.11.1.7 peroxidase; E.C. 1.11.1.8 iodeto peroxidase; E.C. 1.11.1.9 glutationa peroxidase; E.C. 1.11.1.10 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.11 L-ascorbato peroxidase; E.C. 1.11.1.12 Fosfolipídeo-hidroperóxido glutationa peroxidase; EC 1.11.1.13 manganês peroxidase; E.C. 1.11.1.14 lignina peroxidase; E.C.

1.11.1.15 peroxirredoxina; E.C. 1.11.1.16 peroxidase versátil; E.C. 1.11.1.B2 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.B6 iodeto peroxidase (contendo vanádio); E.C. 1.11.1.B7 brometo peroxidase; E.C. 1.11.1.B8 iodeto peroxidase.

37. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 36, em que a peroxidase é derivada de um microrganismo, tal como um organismo fúngico, tal como uma levedura ou fungos filamentosos, ou bactérias; ou planta.

38. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 37, em que a peroxidase é selecionada de: (i) uma peroxidase derivada de uma cepa de Thermoascus, tal como uma cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 1 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 no presente documento; (ii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Mycothermus, tal como uma cepa de Mycothermus thermophilus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 2 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 no presente documento; ou (iii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Coprinus, tal como uma cepa de Coprinus cinereus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 3 no presente documento, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 no presente documento.

39. Uso de uma peroxidase de acordo com qualquer um dos parágrafos 36 a 39 para a propagação de levedura.

40. Uso de uma peroxidase de acordo com qualquer um dos parágrafos 36 a 39 para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura.

41. Uso de uma peroxidase de acordo com qualquer um dos parágrafos 36 a 39 para aumentar a taxa na qual o etanol é produzido nas primeiras 24 horas de fermentação durante um processo de produção de biocombustível.

42. Uso de uma peroxidase de acordo com qualquer um dos parágrafos 36 a 39 para reduzir os títulos de ácido láctico durante as etapas de fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas de um processo de produção de biocombustível.

[0541] A invenção descrita e reivindicada no presente documento não é para estar limitada em escopo pelos aspectos específicos divulgados no presente documento, uma vez que estes aspectos se destinam a ser ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo da presente invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas no presente documento se tornarão aparentes aos especialistas na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações se destinam também a residir dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação incluindo as definições prevalecerá. Todas as referências são especificamente incorporadas por referência para o que é descrito.

[0542] Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar determinados aspectos da presente invenção, mas não pretendem de modo algum limitar o escopo da invenção como reivindicada. Materiais e métodos

[0543] Catalase de T.a.: Polipeptídeo de Thermoascus aurantiacus com atividade de peroxidase classificado como uma catalase E.C. 1.11.1.6 e tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0544] Catalase de T.a.: Polipeptídeo de Mycothermus thermophilus com atividade de peroxidase classificado como uma catalase de E.C. 1.11.1.6 e tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0545] Peroxidase de C.c.: Polipeptídeo de Coprinus cinereus com atividade de peroxidase classificado como uma peroxidase E.C. 1.11.1.7 e tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[0546] Alfa-Amilase 369 (AA369): alfa amilase de Bacillus stearothermophilus com as mutações: I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V (SEQ ID NO: 22 no presente documento) truncada até 491 aminoácidos.

[0547] Glucoamilase SA (GSA): Combinação compreendendo glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada como SEQ ID NO: 34 em WO99/28448, glucoamilase de Trametes cingulata divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 06/69289 e alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger, divulgada em SEQ ID NO: 9 no presente documento tendo as seguintes substituições G128D+D143N (a razão de atividades de AGU:AGU:FAU-F é cerca de 20:5:1).

[0548] REDSTAR/ETHANOL RED™ (“ER”): Levedura Saccharomyces cerevisiae disponível da Fermentis/Lesaffre, E.U.A.

[0549] Protease Pfu: Protease derivada de Pyrococcus furiosus mostrada em SEQ ID NO: 26 no presente documento.

[0550] Meio YPD a 6%: Extrato de levedura, peptona e glicose (no lugar de dextrose) foram solubilizados em água desionizada e, em seguida, filtrados para esterilização; a glicose constituía 6% da solução total.

[0551] Meio nutriente: Meio nutriente definido que consiste em carboidratos complexos, metais-traço e íons similares aos de um mosto de milho típico; usado para medições padronizadas de desempenho de levedura.

[0552] Cytation: Realizado usando CYTATION 5 da Biotek, que combina microscopia de campo claro e de contraste de fase. O programa de imagem integrado foi usado para desenvolver um método para enumeração de células típicas com base na forma e tamanho da célula.

[0553] Mosto de milho limpo: O mosto de milho foi preparado em nossos laboratórios por liquefação de milho moído usando AA369 e protease Pfu a 85 ºC por 2 horas.

[0554] Mosto de milho infectado: Meio MRS foi inoculado com uma mistura de bactérias isoladas de plantas comerciais de produção de etanol de milho infectadas. A cultura de MRS foi cultivada ao longo da noite a 32 °C por até 24 horas. A cultura foi então introduzida em mosto de milho limpo e então incubada por até 24 horas, e então aliquotada com 20% de glicerol e armazenada a 4 °C. Antes do experimento, uma alíquota era descongelada e então pesada em mosto de milho limpo a uma taxa de 1% p/p.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Peroxidase para aumentar a produção e robustez de células de levedura durante a fermentação de etanol

[0555] Este exemplo demonstra que a adição de peroxidases na fermentação aumenta a produção e robustez de células de levedura no início da fermentação de etanol e, em particular, aumenta significativamente a produção de etanol e diminui os títulos de ácido láctico nas primeiras 24 horas de fermentação. Procedimento de fermentação

[0556] Mosto de milho infectado, a uma taxa de infecção de 1% p/p em mosto limpo, foi pesado em um recipiente grande no qual 200 ppm de ureia foram adicionados. O pH foi ajustado para aproximadamente pH 5,0 e a % de sólidos secos (SS) foi ajustada com água da torneira para

20% de SS ou 32% de SS. O mosto ajustado foi então pesado em tubos Falcon de 15 mL, onde o volume final da reação foi de 5 g. Uma mistura de glucoamilase comercial GSA foi doseada a 0,6 AGU/g de sólidos secos para todos os tratamentos. Penicilina foi doseada a 25 ppm para um único tratamento de controle. A catalase de T.a. ou a peroxidase de C.c. foram dosadas a 10, 50, 100 e 200 ppm. Água da torneira adicional foi adicionada para normalizar os volumes de tratamento. Red Star ou ER (levedura seca ativada) foi reidratada em água da torneira a 32 °C durante aproximadamente 30 minutos e, em seguida, inoculada a 0,25 g/L. Todas as amostras foram tampadas com uma tampa com um pequeno orifício na parte superior para liberação de CO2. Cada amostra foi então agitada em vórtex por aproximadamente 15 segundos antes da incubação a 32 °C por ~24 horas (para amostras de 20% de SS) ou ~60 horas (para amostras de 32% de SS). Os tratamentos foram realizados em triplicata. Os compostos de interesse foram medidos por HPLC usando uma coluna H de troca iônica. Os padrões de medição foram: maltotriose (DP3), maltose (DP2), glicose, frutose, arabinose, ácido láctico, glicerol, ácido acético e etanol. Os títulos foram relatados em g/L. Essas condições foram usadas para a realização de três estudos separados, descritos nos resultados abaixo.

RESULTADOS

[0557] Em um primeiro estudo, a adição de peroxidases durante a fermentação aumentou os títulos de etanol significativamente em comparação com o controle sem peroxidase e controle de penicilina (FIG. 2). Além disso, três dos tratamentos apresentaram títulos de ácido láctico diminuídos em comparação com os controles (FIG. 3).

[0558] Em um segundo estudo, a adição de peroxidases durante a fermentação aumentou os títulos de etanol significativamente em comparação com o controle sem peroxidases e controle de penicilina (FIG. 4). Neste caso, não foi observado que os títulos de ácido láctico diminuíram,

mas foi observado que eram quase equivalentes em comparação com os controles (FIG. 5).

[0559] Em um terceiro estudo, a adição de peroxidases durante a fermentação aumentou os títulos de etanol significativamente em comparação com o controle sem peroxidase e controle de penicilina (FIG. 6). No entanto, a peroxidase de C.c. não parecia ser tão tolerante ao etanol quanto a catalase de T.a. Como visto no primeiro estudo, os títulos de ácido láctico diminuíram em comparação com os controles (FIG. 7). Exemplo 2 - Peroxidase para o crescimento de células de levedura

[0560] Este exemplo demonstra que as peroxidases aumentam o crescimento de células de levedura e podem ser usadas para a propagação de levedura (por exemplo, para a produção de levedura em escala comercial, para a fermentação de etanol, etc.). Procedimento de propagação de 50 mL

[0561] Levedura seca ativada (LSA) com Ethanol Red foi reidratada em água da torneira a 32 °C por aproximadamente 30 minutos. 50 mL de meio YPD foram aliquotados sob condições estéreis em um frasco estéril com defletor de 125 mL. Uma alça cheia de levedura reidratada (aproximadamente 10 uL) foi inoculada no meio estéril. A catalase de T.a. foi então doseada a 5, 25, 50 e 200 uL de produto. Um tratamento sem enzima foi usado como um controle. Água estéril adicional foi adicionada para completar o volume líquido. Os tratamentos foram incubados a 32 °C durante aproximadamente 1 hora com agitação orbital de 100 rpm. A medição das células de levedura foi realizada por análise das células em um Cytation, usando técnicas de microscopia de campo claro e programa de contagem de células. A preparação de Cytation consiste em colocar 20 uL de amostra diluída no poço de uma placa preta de 384 poços com fundo transparente. São tiradas 20 imagens por poço e, em seguida, é calculada a média das contagens para todas as imagens. As amostras foram realizadas em quadruplicata. Procedimento de propagação de 14 L

[0562] A levedura (S. cerevisiae) foi inicialmente propagada em meio nutriente para permitir que as células chegassem a uma determinada densidade antes da propagação em maior escala. As propagações em escala de 2 L foram realizadas em meio nutriente líquido por até 24 horas a 30 °C com agitação. Uma porção da propagação de 2 L foi usada para inocular reatores de 14 L para a produção de células de levedura. Foram introduzidos 0,5 mL/L de produto de catalase de T.a. líquido concentrado ou produto de catalase de M.t. concentrado na escala de 14 L antes da inoculação da levedura. As reações de 14 L foram realizadas em meio nutriente líquido, titulado ao longo do tempo, de 30 °C a 35 °C com agitação por até 50 horas. Resultados

[0563] Imagens de Cytation mostrando o crescimento de células de levedura em meio nutriente estéril são mostradas na figura abaixo (FIG. 8A, FIG. 8B, FIG. 8C, FIG. 8D e FIG. 8E). Na medida em que a titulação do produto de catalase de T.a. aumenta, a contagem de células de levedura, ou seja, a geração de biomassa de células de levedura, também aumenta. A enumeração foi realizada usando programa e técnicas de microscopia de campo claro. Grandes densidades populacionais podem ser subestimadas pois as células tendem a se agrupar, como mostrado na FIG. 8E e FIG. 9.

[0564] Na propagação de 14 L, um aumento de 10% da biomassa de células de levedura foi relatado no final da reação em comparação com o controle (FIG. 10). Isso indica que a adição de catalase de T.a. ou catalase de M.t. pode aumentar o crescimento de células de levedura usando a mesma introdução de nutrientes.

Exemplo 3 - Peroxidases para a produção e robustez de células de levedura durante a propagação

[0565] Este exemplo demonstra que peroxidases aumentam o crescimento e/ou a produtividade de levedura, por exemplo, levedura propagada na presença de peroxidase consumiu mais glicose e produziu títulos de etanol mais altos nas primeiras 6 horas de propagação. Inesperadamente, quando a levedura propagada foi transferida para fermentação e a levedura foi desafiada com infecção, a levedura tratada com peroxidase foi capaz de vencer a infecção de forma mais produtiva, conforme medido por títulos de ácido láctico reduzidos. Procedimento de propagação

[0566] Mosto limpo foi diluído para 20% de sólidos secos (SS) e, em seguida, foram adicionados 1000 ppm de ureia e mistura de glucoamilase comercial GSA. O substrato foi então pesado em frascos de agitação com defletor de 125 mL. Produto de catalase de T.a. concentrado foi doseado a 10 uL até 450 uL nos tratamentos. O volume final de trabalho foi de 50 g para todos os tratamentos. Penicilina e Sem Tratamento foram usados como controles. A levedura seca ativada Ethanol Red ou Red Star foi reidratada e então inoculada em densidades celulares equivalentes para todos os tratamentos. As amostras foram incubadas a 32 °C por aproximadamente 6 horas com agitação. Medições de HPLC foram feitas e analisadas quanto a carboidratos solúveis e ácidos orgânicos. Procedimento de fermentação

[0567] Mosto de milho infectado, a uma taxa de infecção de 1% p/p em mosto limpo, foi pesado em um recipiente grande no qual 1000 ppm de ureia foram adicionados. O pH foi ajustado para aproximadamente pH 5,0 e a % de sólidos secos (SS) foi ajustada com água da torneira para 32% de SS. O mosto ajustado foi então pesado em frascos Ankom. A glucoamilase comercial, GSA, foi doseada em uma quantidade comercialmente relevante equivalente para todos os tratamentos. Nenhuma enzima catalase adicional foi usada durante a fermentação. Os tratamentos de propagação foram transferidos para tratamentos de fermentação a 5% do volume de fermentação de trabalho, onde o volume de trabalho total foi de 50 g. Os tratamentos de fermentação foram realizados em triplicata. Monitores de pressão Ankom foram usados para tampar os frascos e a liberação de gás foi registrada durante a fermentação, relatada em psi. Os compostos de interesse foram medidos por HPLC usando uma coluna H de troca iônica. Os padrões de medição foram: maltotriose (DP3), maltose (DP2), glicose, frutose, arabinose, ácido láctico, glicerol, ácido acético e etanol. Os títulos foram relatados em g/L.

RESULTADOS

[0568] A levedura que foi propagada na presença de catalase consumiu mais glicose (FIG. 11A) e produziu títulos mais altos de etanol durante a propagação (FIG. 11B). Quando as propagações foram transferidas para a fermentação, os tratamentos com catalase produziram gás a uma taxa mais rápida do que os controles sem tratamento ou de tratamento com penicilina (FIG. 12). Como resultado, quando a levedura foi desafiada com um sistema infectado, a levedura tratada com catalase foi capaz de superá-lo e vencê-lo de forma mais produtiva, conforme medido por títulos de ácido láctico reduzidos (FIG. 13A). Apesar disso, no momento em que a fermentação foi medida, aproximadamente 60 horas, os títulos de etanol eram bastante planos em todos os tratamentos (FIG. 13B). No entanto, os títulos de DP2 diminuíram conforme a dose de catalase aumentou (FIG. 13C).

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura, sendo o processo caracterizado pelo fato de que compreende colocar a levedura em contato com uma quantidade eficaz de uma peroxidase.

2. Processo para a produção de levedura caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo da levedura da reivindicação 1 sob condições conducentes ao crescimento de levedura.

3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o crescimento da levedura é aumentado em 10% a 50% em comparação com o crescimento de levedura que não foi colocada em contato com o polipeptídeo.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a produtividade da levedura é aumentada em 10% a 50% em comparação com a produtividade de levedura que não foi colocada em contato com o polipeptídeo.

5. Composição caracterizada pelo fato de que compreende levedura produzida de acordo com o processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e pelo menos um componente selecionado de um tensoativo, um emulsificante, uma goma, um agente de inchamento, um antioxidante e qualquer combinação dos mesmos.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é formulada como uma levedura em creme, uma levedura comprimida, uma levedura desintegrada ou uma levedura seca ativa.

7. Recipiente caracterizado pelo fato de que compreende a composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, em que o recipiente é opcionalmente selecionado de uma bolsa, um skid de dosagem, um pacote, um saco ou um recipiente de fermentação.

8. Processo para a propagação de levedura para a produção de bioproduto em um sistema de fermentação de biocombustível, sendo o processo caracterizado pelo fato de que compreende a introdução de uma composição de enzima compreendendo uma peroxidase em um sistema de fermentação de biocombustível, em que o sistema de fermentação compreende um ou mais recipientes de fermentação, tubos e/ou componentes, e em que a peroxidase é adicionada em uma concentração suficiente para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura no sistema de fermentação de biocombustível.

9. Processo para a produção de um produto de fermentação a partir de um material contendo amido, sendo o processo caracterizado pelo fato de que compreende: a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa-amilase para formar um mosto liquefeito; b) sacarificação do mosto liquefeito usando uma enzima geradora de fonte de carboidrato para produzir um açúcar fermentável; c) fermentação do açúcar usando um organismo fermentador sob condições adequadas para produzir o produto de fermentação, em que uma peroxidase é adicionada antes ou durante a etapa de sacarificação b) e/ou a etapa de fermentação c).

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a peroxidase é adicionada durante a propagação de levedura.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a peroxidase é uma peroxidase ou enzimas de decomposição de peróxido selecionadas de: E.C.

1.11.1.1 NADH peroxidase; E.C. 1.11.1.2 NADPH peroxidase; E.C. 1.11.1.3 ácido graxo peroxidase; E.C. 1.11.1.5 citocromo-c peroxidase; E.C. 1.11.1.5; E.C. 1.11.1.6 catalase; E.C. 1.11.1.7 peroxidase; E.C. 1.11.1.8 iodeto peroxidase; E.C. 1.11.1.9 glutationa peroxidase; E.C. 1.11.1.10 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.11 L-ascorbato peroxidase; E.C. 1.11.1.12 Fosfolipídeo-hidroperóxido glutationa peroxidase; EC 1.11.1.13 manganês peroxidase; E.C. 1.11.1.14 lignina peroxidase; E.C. 1.11.1.15 peroxirredoxina; E.C. 1.11.1.16 peroxidase versátil; E.C. 1.11.1.B2 cloreto peroxidase; E.C. 1.11.1.B6 iodeto peroxidase (contendo vanádio); E.C.

1.11.1.B7 brometo peroxidase; E.C. 1.11.1.B8 iodeto peroxidase.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a peroxidase é derivada de um microrganismo, tal como um organismo fúngico, tal como uma levedura ou fungos filamentosos, ou bactérias; ou planta.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a peroxidase é selecionada de: (i) uma peroxidase derivada de uma cepa de Thermoascus, tal como uma cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 1, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1; (ii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Mycothermus, tal como uma cepa de Mycothermus thermophilus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 2, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2; ou (iii) uma peroxidase derivada de uma cepa de Coprinus, tal como uma cepa de Coprinus cinereus, tal como a mostrada em SEQ ID NO: 3, ou uma que tem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3.

14. Uso de uma peroxidase, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que é para aumentar o crescimento e/ou a produtividade de levedura.

15. Uso de uma peroxidase, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que é para reduzir os títulos de ácido láctico durante as etapas de fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas de um processo de produção de biocombustível.