ES2835313T3 - Variantes de glucoamilasa y polinucleótidos que las codifican - Google Patents

Abstract

Variante de glucoamilasa, que tiene una propiedad mejorada con respecto a la glucoamilasa precursora que consiste en el polipeptido de la SED ID N.o 3, en la que las propiedades mejoradas son una mayor termoestabilidad y una mayor tolerancia a la glucosa, que comprende una sustitucion en una o mas posiciones correspondientes a las posiciones 95, 59, 119, 121, 19 y 426 del polipeptido de la SEQ ID N.o: 3, donde la variante tiene actividad glucoamilasa y donde la variante tiene al menos 90 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID N.o: 3, y donde la variante comprende al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones: V59C + A426G; V59G + A426G; V59C + S95P + T119W + A426G; V59C + S95P + T119W + A121P + A426G; V59C + S95P + A121P + A426G; o V18F + V59I + S95P + T119W + A121P.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de glucoamilasa y polinucleótidos que las codifican

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a variantes de glucoamilasa, polinucleótidos que codifican las variantes, métodos de producción de las variantes y métodos de uso de las variantes. También se describe el uso de glucoamilasas de la invención para la conversión de almidón para producir productos de fermentación, tal como etanol y jarabes, tal como glucosa. La invención también se refiere a una composición que comprende una glucoamilasa de la invención.

Descripción de la técnica relacionada

[0002] La glucoamilasa (1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) es una enzima que cataliza la liberación de D-glucosa de los extremos no reductores del almidón o de moléculas de oligo- y polisacáridos relacionados. Las glucoamilasas las producen diferentes hongos filamentosos y levaduras, siendo las de Aspergillus las más importantes a nivel comercial.

[0003] A nivel comercial, las glucoamilasas se utilizan para convertir material que contiene almidón, que ya está parcialmente hidrolizado por una alfa-amilasa, en glucosa. La glucosa puede luego convertirse directa o indirectamente en un producto de fermentación utilizando un organismo fermentador. Los ejemplos de productos de fermentación comerciales incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol, 1,3-propanodiol) ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico, gluconato, ácido láctico, ácido succínico, ácido 2,5-diceto-D-glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (por ejemplo, H2 y CO2) y compuestos más complejos incluyendo, por ejemplo, antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); hormonas y otros compuestos que son difíciles de producir sintéticamente. Los procesos de fermentación también se usan habitualmente en las industrias del alcohol apto para el consumo (por ejemplo, cerveza y vino) o de los lácteos (por ejemplo, en la producción de yogur y queso).

[0004] El producto final también puede ser jarabe. Por ejemplo, el producto final puede ser glucosa, pero también puede ser convertido, por ejemplo, por glucosa isomerasa en fructosa o una mezcla compuesta casi a partes iguales por glucosa y fructosa. Esta mezcla, o una mezcla enriquecida además con fructosa, es el jarabe de maíz con alto contenido en fructosa (HFCS, por sus siglas en inglés) comercializado en todo el mundo y cuyo uso es el más extendido.

[0005] Un objeto de la presente invención es proporcionar polipéptidos con actividad glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos y que proporcionan un alto rendimiento en los procesos de producción de productos de fermentación, tales como procesos de producción de etanol, que incluyen procesos de fermentación de etanol en una única fase a partir de almidón crudo (o sin cocer) no gelatinizado.

[0006] En la patente WO2011/068803 se divulgan glucoamilasas aisladas del hongo Gloeofillum. En particular, de Gloeofillum sepiarium y Gloeofillum trabeum.

[0007] La presente invención proporciona variantes de glucoamilasa con propiedades mejoradas en comparación con su precursora.

Resumen de la invención

[0008] La presente invención se refiere a una variante de glucoamilasa, que tiene una propiedad mejorada con respecto a la glucoamilasa precursora que consiste en el polipéptido de la SED ID N.° 3, en la que las propiedades mejoradas son una mayor termoestabilidad y una mayor tolerancia a la glucosa, que comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 95, 59, 119, 121, 18 y 46 del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3, donde la variante tiene actividad glucoamilasa y donde la variante tiene al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3, variantes que comprenden una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en 59C 426G, 59G 426G, y 18F 59I, más particularmente V59C A426G, o V59G A426G, o V18F V59I, y donde la variante comprende al menos una de las siguientes combinaciones de sustituciones: V59C A426G;

V59G A426G;

V59C S95P T119W A426G;

V59C S95P T119W A121P A426G;

V59C S95P A121P A426G; o

V18F V59I S95P T119W A121P.

[0009] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican las variantes; construcciones de ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras que comprenden los polinucleótidos; y métodos de producción de las variantes.

[0010] La presente invención se refiere además a composiciones que comprenden las variantes de glucoamilasa de la invención.

[0011] En otro aspecto, la presente invención se refiere a un uso de la variante de glucoamilasa para producir un jarabe o un producto de fermentación.

[0012] En aspectos todavía adicionales, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón que incluye los pasos de:

(a) licuefacción de material que contiene almidón en presencia de una alfa amilasa;

(b) sacarificación del material licuado; y

(c) fermentación con un organismo fermentador;

donde el paso (a) y/o el paso (b) se realizan usando al menos una variante de glucoamilasa de la invención.

[0013] En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón, que incluye los pasos de:

(a) sacarificación de un material que contiene almidón a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial de dicho material que contiene almidón; y

(b) fermentación con un organismo fermentador,

donde el paso (a) se realiza usando al menos una variante de glucoamilasa de la invención.

Definiciones

[0014] Glucoamilasa: el término "glucoamilasa" (1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) se define como una enzima que cataliza la liberación de D-glucosa a partir de los extremos no reductores del almidón o de moléculas de oligo- y polisacáridos relacionados. Para los fines de la presente invención, la actividad glucoamilasa se determina según el procedimiento descrito en los ejemplos del presente documento. La unidad de glucoamilasa (AGU) se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto en condiciones estándar a 37°C, pH 4,3, sustrato: maltosa 23,.2 mM, tampón: acetato 0,1 M, tiempo de reacción de 5 minutos.

[0015] Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos 20 %, preferiblemente al menos 40 %, preferiblemente al menos 45 %, más preferiblemente al menos 50 %, más preferiblemente al menos 55 %, más preferiblemente al menos 60 %, más preferiblemente al menos 65 %, más preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 75 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, aún más preferiblemente al menos 90 %, de la forma más preferible al menos 95 % e incluso de la forma más preferible al menos 100 % de la actividad glucoamilasa del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2.

[0016] En otra forma de realización, los polipéptidos de la presente invención tienen al menos 20 %, preferiblemente al menos 40 %, preferiblemente al menos 45 %, más preferiblemente al menos 50 %, más preferiblemente al menos 55 %, más preferiblemente al menos 60 %, más preferiblemente al menos 65 %, más preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 75 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, aún más preferiblemente al menos 90 % de la forma más preferible al menos 95 % e incluso de la forma más preferible al menos 100 % de la actividad glucoamilasa del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0017] Variante alélica: el término "variante alélica" significa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de manera natural por mutación y puede resultar en polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

[0018] ADNc: el término "ADNc" significa una molécula de ADN que se puede preparar mediante transcripción inversa a partir de una molécula, madura, cortada y empalmada, de ARNm obtenida a partir de una célula eucariota o procariota. El ADNc carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito primario de ARN inicial es un precursor para el ARNm que se procesa a través de una serie de pasos, incluyendo corte y empalme, antes de aparecer como ARNm maduro cortado y empalmado.

[0019] Secuencia codificante: el término "secuencia codificante" significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de una variante. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente por un marco de lectura abierto, que empieza con un codón de inicio tal como, ATG, GTG o TTG y termina con un codón de terminación tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de estos.

[0020] Secuencias de control: el término "secuencias de control" significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o foránea (es decir, procedente de un gen diferente) respecto del polinucleótido que codifica la variante o nativa o foránea entre sí. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia del propéptido, un promotor, una secuencia del péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden estar provistas de porciones conectoras con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten el ligamiento de las secuencias de control con la región de codificación del polinucleótido que codifica una variante.

[0021] Expresión: el término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción de una variante, incluyendo, pero no exclusivamente, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

[0022] Vector de expresión: el término "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica una variante y está operativamente unida a secuencias de control que permiten su expresión.

[0023] Fragmento: el témino "fragmento" significa un polipéptido con uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes del extremo amino y/o carboxilo terminal de un polipéptido maduro; donde el fragmento tiene actividad glucoamilasa. En un aspecto, un fragmento contiene al menos 454 residuos de aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos 18 a 471 de la SEQ ID N.°: 2 o 1 a 454 de la SEQ ID N.°: 3), que comprenden el dominio catalítico y tienen una o más de las sustituciones según la invención.

[0024] Condiciones de alta astringencia: el término "condiciones de alta astringencia" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos en longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y formamida al 50 %, después de procedimientos de transferencia de Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material que constituye el vehículo por último se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, utilizando 2X SSC, SDS al 0,2 % a 65°C.

[0025] Célula hospedadora: el término "célula hospedadora" significa cualquier tipo de célula que sea susceptible de transformación, transfección, transducción o similar con una construcción de ácidos nucleicos o vector de expresión que comprenda un polinucleótido de la presente invención. El término "célula hospedadora" abarca cualquier descendiente de una célula madre que no sea idéntico a la célula madre debido a mutaciones que se producen durante la replicación.

[0026] Propiedad mejorada: el término "propiedad mejorada" significa una característica asociada a una variante que se mejora en comparación con el precursor. Tales propiedades mejoradas incluyen, pero de forma no limitativa, actividad específica, tolerancia a la glucosa y termoestabilidad.

[0027] Aislado: el término "aislado" significa una sustancia en una forma o ambiente que no se produce en la naturaleza. Los ejemplos no limitativos de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia que no se produzca de forma natural, (2) cualquier sustancia que incluya, pero no exclusivamente, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que sea al menos parcialmente retirada de uno o más o todos los constituyentes de origen natural con los que se asocia en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre con respecto a la sustancia encontrada en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada mediante el aumento de la cantidad de la sustancia con respecto a otros componentes con los cuales está asociada de manera natural (por ejemplo, copias múltiples de un gen que codifica la sustancia; uso de un promotor más fuerte que el promotor asociado de manera natural al gen que codifica la sustancia). Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentación.

[0028] Condiciones de baja astringencia: el término "Condiciones de baja astringencia " significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos en longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y formamida al 25 %, después de procedimientos de transferencia de Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material que constituye el vehículo por último se lava tres veces cada una durante a 15 minutos utilizando 2X SSC, SDS al 0,2 % a 50°C.

[0029] Polipéptido maduro: el término "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final tras la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como procesamiento en el extremo N-terminal, truncamiento en el extremo C-terminal, glucosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro son los aminoácidos 18 a 576 de la SEQ ID N.°: 2. Los amino ácidos 1 a 17 de la SEQ ID N.°: 2 son un péptido señal. Se conoce en la técnica que una célula hospedadora puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoácido en el extremo C-terminal y/o N-terminal diferente) expresados por el mismo polinucleótido. El polipéptido maduro se describe en este documento como la SEQ ID N.°: 3.

[0030] Secuencia codificante del polipéptido maduro: el término "secuencia codificante del polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro con actividad glucoamilasa. En un aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro son los nucleótidos 52 a 1728 (o 1731 con el codón de terminación) de la SEQ ID N.°: 1. Los nucleótidos 1 a 51 de la SEQ ID N.°: 1 codifican un péptido señal.

[0031] Condiciones de astringencia media: el término "conditiones de astringencia media" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y formamida al 35 %, después de procedimientos de transferencia de Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material que constituye el vehículo por último se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, utilizando 2X SSC, SDS al 0,2 % a 55°C.

[0032] Condiciones de astringencia media-alta: el término "condiciones de astringencia media-alta" significa, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado ADN y formamida al 35 %, después de procedimientos de transferencia de Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material que constituye el vehículo por último se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, utilizando 2X SSC, SDS al 0,2 % a 60°C.

[0033] Construcción de ácidos nucleicos: el término "construcción de ácidos nucleicos" significa una molécula de ácido nucleico, monocatenaria o bicatenaria, que se aísla de un gen de origen natural o que se modifica para que contenga segmentos de ácidos nucleicos de una manera que no existiría en la naturaleza o que es sintética, que comprende una o más secuencias de control.

[0034] Operativamente unido: el término "operativamente unido" significa una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con respecto a la secuencia de codificación de un polinucleótido de tal modo que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.

[0035] Precursor o glucoamilasa precursora: el término "precursor" o "glucoamilasa precursora" significa una glucoamilasa para la que se hace una alteración para producir las variantes enzimáticas de la presente invención. El precursor puede ser un polipéptido (tipo salvaje) de origen natural o una variante o fragmento del mismo.

[0036] Identidad de secuencia: la relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe con el parámetro "identidad de secuencia".

[0037] Para los fines de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son penalización por apertura de espacio de 10, penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBo Ss de BLOSUM62). El resultado de Needle etiquetado como "identidad más larga" (obtenido utilizando la opción -nobrief) se usa como la identidad en porcentaje y se calcula de la siguiente manera:

( Residuos idén ticos x 100)/(Longitud de alineamiento— Número to ta l de espacios en alineam iento)

[0038] Para los fines de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias desoxirribonucleótidas se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) como implementado en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son penalización por apertura de espacio de 10, penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EADNFUl L (versión de EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle etiquetado "identidad más larga" (obtenido usando la opción -nobrief) se usa como el identidad en porcentaje y se calcula de la siguiente manera:

(Desoxiribonucleótidos idénticos x 100)/ (Longitud de alineamiento - Número total de espacios en alineamiento)

[0039] Subsecuencia: el término "subsecuencia" significa un polinucleótido con uno o más (por ejemplo; diferentes) nucleótidos ausentes del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificante del polipéptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento con actividad glucoamilasa. En un aspecto, una subsecuencia codifica al menos el dominio catalítico de la variante según la invención. Por ejemplo, contiene al menos 1362 nucleótidos (por ejemplo, nucleótidos 52 a 1413 de la SEQ ID N.°: 1).

[0040] Variante: el término "variante" significa un polipéptido con actividad glucoamilasa que incluye una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción en una o más posiciones (por ejemplo, varias). Una sustitución significa el reemplazo del aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente; una deleción significa la deleción del aminoácido que ocupa una posición; e inserción significa la adición de un aminoácido adyacente a e inmediatamente después del aminoácido que ocupa una posición. Las variantes de la presente invención tienen al menos 20 %, por ejemplo, al menos 40 %, al menos 45 %, más preferiblemente al menos 50 %, más preferiblemente al menos 55 %, más preferiblemente al menos 60 %, más preferiblemente al menos 65 %, más preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 75 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, aún más preferiblemente al menos 90 %, de la forma más preferible al menos 95 % e incluso de la forma más preferible al menos 100 % de la actividad glucoamilasa del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2 descrito como SeQ ID N.°: 3.

[0041] Condiciones de astringencia muy altas: el término "condiciones de astringencia muy altas" significa para sondas de al menos 100 nucleótidos en longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y formamida al 50 %, después de los procedimientos de transferencia de Southern estándar durantre 12 a 24 horas. El material que constituye el vehículo por último se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, utilizando 2X SSC, SDS al 0,2 % a 70°C.

[0042] Condiciones de astringencia muy bajas: el término "condiciones de astringencia muy bajas" significa para sondas de al menos 100 nucleótidos en longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSpE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado ADN y formamida al 25 %, después de procedimientos de transferencia de Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material que constituye el vehículo por último se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, utilizando 2X SSC, SDS al 0,2 % a 45°C.

[0043] Glucoamilasa tipo salvaje: el término glucoamilasa "tipo salvaje" significa una glucoamilasa expresada por un microorganismo de origen natural, tal como una bacteria, levadura u hongo filamentoso encontrado en la naturaleza.

Convenciones para designación de variantes

[0044] Para los fines de la presente invención, el polipéptido maduro descrito en la SEQ ID N.°: 3 se usa para determinar el residuo de aminoácido correspondiente en otra glucoamilasa. La secuencia de aminoácidos de otra glucoamilasa se alinea con el polipéptido maduro descrito en la SEQ ID N.°: 3 y, según el alineamiento, el número de posición del aminoácido que corresponde con cualquier residuo de aminoácido en el polipéptido maduro descrito en la SEQ ID N.°: 3 se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se ha implementado en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son penalización por apertura de espacio de 10, penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión de EMBOSS de BLOSUM62).

[0045] La identificación del residuo de aminoácido correspondiente en otra glucoamilasa se puede determinar por un alineamiento de secuencias de polipéptidos múltiples usando diferentes programas informáticos que incluyen, pero no están limitados a, MUSCLE (comparación de secuencias múltiples por log-resultado esperado; versión 3.5 o posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), Ma f Ft (versión 6.857 o posterior; Katoh y Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537:_39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26:_1899-1900), y EMBOSS EMMA con ClustalW (1.83 o posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando sus respectivos parámetros por defecto.

[0046] Cuando la otra enzima ha divergido del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2 de manera que la comparación basada en secuencias tradicional no es capaz de detectar su relación (Lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol.295: 613-615), puden utilizarse otros algoritmos de comparación de pares de secuencias. La sensibilidad superior en la búsqueda basada en secuencias se puede lograr utilizando programas de búsqueda que utilizan representaciones probabilísticas de familias (perfiles) de polipéptidos para la búsqueda en bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso de búsqueda en bases de datos reiterativa y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Incluso una sensibilidad superior se puede conseguir si la familia o superfamilia para el polipéptido tiene uno o más representantes en las bases de datos de estructuras de proteínas. Los programas tal como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información procedente una variedad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructuras secundarias, perfiles de alineamiento estructural y potenciales de disolución) como entrada a una red neuronal que predice el plegamiento estructural para una secuencia de consulta. De forma similar, el método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, puede utilizarse para alinear una secuencia estructural desconocida con los modelos de superfamilias presentes en la base de datos SCOP. Estos alineamientos se pueden utilizar sucesivamente para generar modelos de homología para el polipéptido, y tales modelos se pueden evaluar con exactitud utilizando una variedad de herramientas desarrolladas para este fin.

[0047] Para proteínas de estructura conocida, varias herramientas y recursos están disponibles para la recuperación y generación de alineamientos estructurales. Por ejemplo, las superfamilias de proteínas de SCOP han sido estructuralmente alineadas, y esos alineamientos están disponibles y son descargables. Dos o más estructuras de proteínas se pueden alinear utilizando una variedad de algoritmos como el alineamiento de matriz de de distancia (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o la extensión combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747) y la implementación de estos algoritmos se puede utilizar adicionalmente para bases de datos de consulta de estructuras con una estructura de interés para descubrir homólogos estructurales posibles (por ejemplo, Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

[0048] Al describir las variantes de la presente invención, la nomenclatura descrita a continuación se ha adaptado para mayor facilidad de referencia. Se emplea la abreviatura IUPAC de amoniácidos de una letra o tres letras.

[0049] Sustituciones. Para la sustitución de un aminoácido, se usa la nomenclatura siguiente: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina en la posición 226 por alanina se designa como "Thr226Ala" o "T226A". Las mutaciones múltiples se separan por signos de suma ("+"): por ejemplo, en "Gly205Arg Ser411Phe" o "G205R S411F", se representan sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) con arginina (R) y de serina (S) con fenilalanina (F), respectivamente.

[0050] Deleciones. Para la deleción de aminoácido, se usa la siguiente nomenclatura: aminioácido original, posición, *. Por consiguiente, la deleción de glicina en la posición 195 se designa como "Gly195*" o "G195*". Las deleciones múltiples se separan por signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly195* Ser411*" o "G195* S411*".

[0051] Inserciones. Para la inserción de un aminoácido, se usa la siguiente nomenclatura: aminioácido original, posición, aminioácido original, aminoácido insertado. Por consiguiente, la inserción de lisina después de glicina en la posición 195 se designa "Gly195GlyLys" o "G195GK". Una inserción de múltiples aminoácidos se designa [aminioácido original, posición, aminioácido original, aminoácido insertado #1, aminoácido insertado #2; etc.]. Por ejemplo, la inserción de lisina y alanina después de glicina en la posición 195 se indica como "Gly195GlyLysAla" o "G195GKA".

[0052] En tales casos, el/los residuo(s) de aminoácidos insertados se numeran mediante la adición de letras minúsculas al número de posición del residuo de aminoácido precedente al residuo(s) de aminoácido insertado. En el ejemplo anterior, la secuencia así sería:

[0053] Alteraciones múltiples. Las variantes que comprenden alteraciones múltiples se separan por signos de suma ("+"), por ejemplo, "Arg170Tyr+Gly195Glu" o "R170Y+G195E", que representan una sustitución de arginina y glicina en posiciones 170 y 195 con tirosina y ácido glutámico, respectivamente.

[0054] Alteraciones diferentes. Cuando las alteraciones diferentes se pueden introducir en una posición, las alteraciones diferentes se separan por una coma, por ejemplo, "Arg170Tyr,Glu" representa una sustitución de arginina en la posición 170 con tirosina o ácido glutámico. Así, "Tyr167Gly,Ala Arg170Gly,Ala" designa las variantes siguientes:

" Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly", y "Tyr167Ala+Arg170Ala".

Descripción detallada de la invención

[0055] La presente descripción se refiere a variantes de glucoamilasa, que comprenden una sustitución en una o más (por ejemplo varias) posiciones correspondientes a las posiciones 59, 95, 119, 121, 18, 426 y 316 del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3, donde la variante tiene actividad glucoamilasa. En particular, las variantes tienen propiedades mejoradas en comparación con la glucoamilasa descrita como la SEQ ID N.°: 3. Particularmente, las propiedades mejoradas son termoestabilidad mejorada, una mayor tolerancia a la glucosa y/o una mayor actividad específica. Las variantes según la divulgación tienen al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0056] El polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2 corresponde a la SEQ ID N.°: 3. Por lo tanto, los números de posición a los que se hace referencia en este documento corresponden a los números de posición de la SEQ ID N.°: 3.

Variantes

[0057] La presente descripción proporciona variantes de glucoamilasa, que incluyen una alteración, en particular, una sustitución, en una o más (por ejemplo, varias) posiciones correspondientes a las posiciones 59, 95, 119, 121, 18, 426, y 316, y la variantes tienen actividad glucoamilasa.

[0058] En una forma de realización, la variante está aislada.

[0059] En un aspecto, la variante tiene una identidad de secuencia de al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, pero menos del 100 % de la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa precursora.

[0060] En otro aspecto, la variante tiene al menos al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, tal como al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2. El polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2 es, en una forma de realización, la s Eq ID N.°: 3.

[0061] Así, en un aspecto, la presente descripción se refiere a una variante de glucoamilasa que comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 95, 59, 119, 121, 18, 426 y 316 del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3, donde la variante tiene actividad glucoamilasa y donde la variante tiene al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0062] En otro aspecto, una variante comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 59, 95, 119, 121, 18, 426 y 316. En otro aspecto, una variante comprende una sustitución en dos posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones 59, 95, 119, 121, 18, 426 y 316. En otro aspecto, una variante comprende una sustitución en tres posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones 59, 95, 119, 121, 18, 426 y 316. En otro aspecto, una variante comprende una sustitución en cuatro posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones 59, 95, 119, 121, 18, 426 y 316. En otro aspecto, una variante comprende una sustitución en cinco posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones 59, 95, 119, 121, 18, 426 y 316. En otro aspecto, una variante comprende una sustitución en seis posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones 59, 95, 119, 121, 18, 426 y 316. En otro aspecto, una variante comprende una sustitución en cada posición correspondiente a las posiciones 59, 95, 119, 121, 18, 426 y 316.

[0063] En otro aspecto, la alteración de la variante comprende o consiste en una sustitución en una posición correspondiente a la posición 18. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 18 está sustituido con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys., Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp o Tyr, preferiblemente con Phe. En otro aspecto, la alteración de la variante comprende o consiste en la sustitución V18F del polipéptido de la SEQ ID NO: 3.

[0064] En otro aspecto, la alteración de la variante comprende o consiste en una sustitución en una posición correspondiente a la posición 59. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 59 está sustituido con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp o Tyr, preferiblemente con Ala, Cys, Gly o Ile. En otro aspecto, la alteración de la variante comprende o consiste en la sustitución V59A, V59C, V59G o V59I del polipéptido de la SEQ ID NO: 3.

[0065] En otro aspecto, la alteración de la variante comprende o consiste en una sustitución en una posición correspondiente a la posición 95. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 95 está sustituido con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr o Val, preferiblemente con Pro. En otro aspecto, la alteración de la variante comprende o consiste en la sustitución S95P del polipéptido de la SEQ ID NO: 3.

[0066] En otro aspecto, la alteración de la variante comprende o consiste en una sustitución en una posición correspondiente a la posición 119. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 119 está sustituido con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr o Val, preferiblemente con T rp. En otro aspecto, la alteración de la variante comprende o consiste en la sustitución T119W del polipéptido de la SEQ ID NO: 3.

[0067] En otro aspecto, la alteración de la variante comprende o consiste en una sustitución en una posición correspondiente a la posición 121. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 121 está sustituido con Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferiblemente con Pro. En otro aspecto, la alteración de la variante comprende o consiste en la sustitución A121P del polipéptido de la SEQ ID NO: 3.

[0068] En otro aspecto, la alteración de la variante comprende o consiste en una sustitución en una posición correspondiente a la posición 316. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 316 está sustituido con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys. Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr o Val, preferiblemente con Trp. En otro aspecto, la alteración de la variante comprende o consiste en la sustitución S316W del polipéptido de la SEQ ID NO: 3.

[0069] En otro aspecto, la alteración de la variante comprende o consiste en una sustitución en una posición correspondiente a la posición 426. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 426 está sustituido con Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferiblemente con Gly. En otro aspecto, la alteración de la variante comprende o consiste en la sustitución A426G del polipéptido de la s Eq ID NO: 3.

[0070] En otro aspecto, la variante comprende o consiste en las sustituciones específicas enumeradas a continuación o combinaciones de sustituciones específicas del polipéptido de la SEQ ID N.° 3:

V18F;o

V59A; o

V59C; o

V59G; o

V59I; o

S95P; o

T119W; o

A121P; o

A426G; o

S316W; o

S95P+A121P; o

V59A+S95P; o

S95P+T119W; o

V59A+S95P+A121P; o

S95P+T119W+A121P; o

V59C+A426G; o

V59G+A426G; o

V18F+V59I; o

V59C+S95P+T119W+A426G; o

V59C+S95P+T119W+A121P+A426G; o

V59C+S95P+A121P+A426G; o

V18F+V59I+S95P+A121P; o

V18F+V59I+S95P+T119W+A121P; o

S95P+A121P+S316W; y donde la variante tiene actividad glucoamilasa y donde la variante tiene al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0071] En otro aspecto, la variante comprende o consiste en las sustituciones específicas o combinaciones de sustituciones específicas enumeradas a continuación del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3:

V59A; o

S95P; o

T119W; o

A121P; o

S95P+A121P; o

V59A+S95P; o

S95P+T119W; o

V59A+S95P+A121P; o

S95P+T119W+A121P; y donde la variante tiene actividad glucoamilasa y donde la variante tiene al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0072] Se ha demostrado que estas sustituciones y combinaciones de sustituciones específicas aumentan la termoestabilidad de la variante de glucoamilasa en comparación con la glucoamilasa de la SEQ ID N.°: 3.

[0073] En otro aspecto, la variante comprende o consiste en las sustituciones específicas o combinaciones de sustituciones específicas enumeradas a continuación del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3:

V59C+S95P+T119W+A426G; o

V59C+S95P+T119W+A121P+A426G; o

V59C+S95P+A121P+A426G; o

V18F+V59I+S95P+A121P; o

V18F+V59I+S95P+T119W+A121P; y donde la variante tiene actividad glucoamilasa y donde la variante tiene al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0074] Se ha demostrado que estas sustituciones y combinaciones de sustituciones específicas aumentan la termoestabilidad, así como reducen la inhibición de glucosa de la variante de glucoamilasa según la invención.

[0075] En otro aspecto, la variante comprende o consiste en las sustituciones específicas o combinaciones de sustituciones específicas enumeradas a continuación del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3: S95P+A121P+S316W; y donde la variante tiene actividad glucoamilasa y donde la variante tiene al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0076] Se ha demostrado que esta combinación específica de sustituciones aumenta la termoestabilidad, así como la actividad específica de la variante de glucoamilasa según la invención.

[0077] En un aspecto, la termoestabilidad mejorada de las variantes de glucoamilasa según la divulgación se proporciona introduciendo una o más de las sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en 59A, 95P, 119W, y 121P, y en particular una variante de glucoamilasa que comprende las sustituciones 95P 121P, más particularmente S95P A121P y donde la variante tiene actividad glucoamilasa, y donde la variante tiene al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0078] En otro aspecto, se realiza la inhibición de glucosa reducida de las variantes de glucoamilasa según la divulgación mediante la introducción de una o más de las combinaciones de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en 59C 426G, 59G 426G, y 18F 59I, más particularmente V59C A426G, o V59G A426G, o V18F V59I y donde la variante tiene actividad glucoamilasa y donde la variante tiene al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0079] En otro aspecto, se proporciona actividad específica aumentada de las variantes de glucoamilasa según la divulgación mediante la introducción de la sustitución 316W, particularmente S316W, y donde la variante tiene actividad glucoamilasa y donde la variante tiene al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0080] En un aspecto particular de la divulgación, la actividad específica de la variante de glucoamilasa se puede mejorar eliminando el dominio de unión al almidón (SBD), dando así como resultado la forma G2 de la variante. En una forma de realización más particular, los aminoácidos 455-559 de la SEQ ID N.°: 3 se eliminan en la forma G2. Esto se observó para la forma G2 de las variantes que comprenden S95P+A121P+S316W o S95P+A121P como se muestra en los ejemplos.

[0081] Por lo tanto, en aspecto particular, se proporciona actividad específica aumentada de las variantes de glucoamilasa según la divulgación, eliminando el SBD, en particular 455-559 de la SEQ ID N.°: 3, más particularmente en una variante que comprende S95P+A121P+S316W o S95P+A121P y donde la variante tiene actividad glucoamilasa y donde la variante tiene al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0082] Las variantes pueden comprender además una o más sustituciones adicionales en una o más (por ejemplo, varias) posiciones distintas.

[0083] Debe observarse que, para todas las variantes específicas descritas, tal variación adicional podría introducirse sin afectar significativamente a las propiedades de las variantes de glucoamilasa. En un aspecto, el número de sustituciones en las variantes de la presente invención además de las sustituciones específicas discutidas aquí es de 1-20, por ejemplo, 1-10 y 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones.

[0084] Por lo tanto, el % de identidad del polipéptido variante en comparación con el polipéptido precursor de la SEQ ID N.°: 3 puede ser al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, tal como al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0085] En una forma de realización particular, las variantes anteriores tienen actividad glucoamilasa, y la variante tiene al menos 85 %, pero menos del 100 %, de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.° 3.

[0086] En una forma de realización particular, las variantes anteriores tienen actividad glucoamilasa y la variante tiene al menos 90 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0087] En una forma de realización particular, las variantes anteriores tienen actividad glucoamilasa y la variante tiene al menos 91 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0088] En una forma de realización particular, las variantes anteriores tienen actividad glucoamilasa y la variante tiene al menos 92 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0089] En una forma de realización particular, las variantes anteriores tienen actividad glucoamilasa y la variante tiene al menos 93 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0090] En una forma de realización particular, las variantes anteriores tienen actividad glucoamilasa y la variante tiene al menos 94 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0091] En una forma de realización particular, las variantes anteriores tienen actividad glucoamilasa y la variante tiene al menos 95 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0092] En una forma de realización particular, las variantes anteriores tienen actividad glucoamilasa y la variante tiene al menos 96 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0093] En un aspecto particular, las variantes anteriores tienen actividad glucoamilasa y la variante tiene al menos 97 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0094] En un aspecto particular, las variantes anteriores tienen actividad glucoamilasa y la variante tiene al menos 98 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0095] En un aspecto particular, las variantes anteriores tienen actividad glucoamilasa y la variante tiene al menos 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3.

[0096] Los cambios en los aminoácidos que pueden estar presentes además de las sustituciones específicas descritas en este documento pueden ser de una naturaleza menor, a saber, sustituciones o inserciones de aminoácidos conservadoras que no afectan al significativamente plegamiento y/o a la actividad de la proteína; deleciones pequeñas, típicamente de 1-30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino o carboxilo terminales, tales como un residuo de metionina amino terminal; un péptido enlazador pequeño de hasta 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita la purificación por alteración de la carga neta u otra función, tal como una cola de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

[0097] Los ejemplos de sustituciones conservadoras se encuentran dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran actividad específica se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, por H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Las sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly.

[0098] Alternativamente, los cambios en los aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades físicoquímicas de los polipéptidos se alteran. Por ejemplo, los cambios en los aminoácidos pueden mejorar la termoestabilidad del polipéptido, alterar la especificidad de sustrato, cambiar el pH óptimo y similar.

[0099] Los aminoácidos esenciales de un polipéptido se pueden identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la técnica anterior, se introducen mutaciones de alanina únicas en cada residuo de la molécula y se analiza la actividad glucoamilasa de las moléculas mutantes resultantes para identificar residuos de aminoácidos que son fundamentales para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar por análisis físico de la estructura, como por técnicas como la resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcado por fotoafinidad, conjuntamente con la mutación de aminoácidos del sitio de contacto putativo. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899­ 904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de aminoácidos esenciales también se puede inferir a partir de un alineamiento con un polipéptido relacionado.

[0100] En un aspecto, la variante tiene una actividad específica mejorada en comparación con la enzima precursora. La actividad específica se determinó utilizando el ensayo AGU.

[0101] En un aspecto, la variante tiene una mayor tolerancia a la glucosa (o una menor inhibición de la glucosa) en comparación con el precursor. La inhibición de glucosa se determinó como la proporción de actividad glucoamilasa con y sin 30 % de glucosa con respecto al peso de la enzima precursora descrita como la SEQ ID N.°: 3. Para más detalles, véase la sección Materiales y métodos incluida en el presente documento.

[0102] En un aspecto, la variante tiene una termoestabilidad mejorada en comparación con la enzima precursora. La termoestabilidad se midió como actividad residual a 32°C utilizando el equipo de ensayo Kikkoman. Para más detalles, véase la sección Materiales y métodos del presente documento.

Glucoamilasas precursoras

[0103] La glucoamilasa precursora puede ser (a) un polipéptido con al menos 85 % de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibridiza en condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 1, o (ii) el complemento en toda su longitud de (i); o (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido con un mínimo de 70 % de identidad de secuencia respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 1.

[0104] En un aspecto, el precursor tiene una identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2 de al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %, que tiene actividad glucoamilasa.

En un aspecto, la secuencia de aminoácidos de el precursor difiere en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2.

[0105] En otro aspecto, el precursor comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 2.

En otro aspecto, el precursor comprende o consiste en el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2. En otro aspecto, el precursor comprende o consiste en la SEQ ID N.°: 3.

[0106] En otro aspecto, el precursor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2.

[0107] El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido en el que una región de un polipéptido está fusionada en el extremo N-terminal o C-terminal de una región de otro polipéptido.

[0108] El precursor puede ser un polipéptido de fusión o polipéptido de fusión escindible en el que otro polipéptido está fusionado en el extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de fusión se produce por fusión de un polinucleótido que codifica otro polipéptido a un polinucleótido de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica e incluyen el ligamiento de las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos, de modo que estén dentro del marco y que la expresión del polipéptido de fusión esté bajo el control del/de los mismo(s) promotor(es) y terminador. Los polipéptidos de fusión también se pueden construir utilizando la tecnología de inteína, en la que los polipéptidos de fusión se crean postraduccionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[0109] Un polipéptido de fusión puede comprender además un sitio de escisión entre los dos polipéptidos. Cuando se secreta la proteína de fusión, el sitio se divide de forma que se liberan los dos polipéptidos. Los ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero de forma no limitativa, los sitios descritos en Martín et al., 2003, J. Ind. Microbiol.

Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl.

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[[0110] El precursor puede ser una glucoamilasa fúngica. Por ejemplo, el precursor puede ser una glucoamilasa de Gloeofillum.

[0111] En otro aspecto, el precursor es una glucoamilasa de Gloeofillum trabeum o Gloeofillum sepiarium.

[0112] En otro aspecto, el precursor es una glucoamilasa de Gloeofillum trabeum, por ejemplo, la glucoamilasa de la SEQ ID N.°: 2 o el polipéptido maduro de la misma.

[0113] Se entenderá que, para las especies mencionadas anteriormente, la invención abarca tanto el estado perfecto como el imperfecto y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de especie por el que se conocen. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados.

[0114] Las cepas de estas especies están a disposición del público en varias de colecciones de cultivo, tal como la American Type Culture Collection (ATCC), la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

GmbH (DSMZ), el Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y el Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0115] El precursor se puede identificar y obtener de otras fuentes, incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, tierra, abonos, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, tierra, abonos, agua, etc.) utilizando las sondas anteriormente mencionadas. En la técnica se conocen diversas técnicas para el aislamiento de microorganismos y ADN directamente a partir de hábitats naturales. Un polinucleótido que codifica un precursor se puede obtener de forma similar por cribado de una genoteca de ADN o ADNc genómico de otro microorganismo o muestra de ADN mixta. Una vez que un polinucleótido que codifica un precursor ha sido detectado con la(s) sonda(s), el polinucleótido se puede aislar o clonar mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Preparación de variantes

[0116] Las variantes se pueden preparar utilizando cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica, tal como mutagénesis dirigida, construcción de genes sintéticos, construcción de genes semi-sintéticos, mutagénesis aleatoria, barajado, etc.

[0117] La mutagénesis dirigida es una técnica en la que una o más (por ejemplo, varias) mutaciones se introducen en uno o más sitios definidos en un polinucleótido que codifica el precursor.

[0118] La mutagénesis dirigida se puede realizar in vitro mediante PCR con el uso de cebadores (oligonucleótidos) con la mutación deseada. La mutagénesis dirigida también se puede realizar in vitro por mutagénesis de "casete" con la escisión por una enzima de restricción en un sitio del plásmido que comprende un polinucleótido que codifica el precursor y la posterior unión de un oligonucleótido que contiene la mutación en el polinucleótido. Normalmente, la enzima de restricción que digiere el plásmido y el oligonucleótido es la misma, lo que permite que los extremos pegajosos del plásmido y el inserto se unan entre sí. Véase, por ejemplo, Scherer y Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 76: 4949-4955; y Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[0119] La mutagénesis dirigida también se puede realizar in vivo por métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n° 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol.

19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; y Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

[0120] Cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida se puede usar en la presente invención. Hay muchos equipos comerciales disponibles que pueden utilizarse para preparar variantes.

[0121] La construcción sintética de genes implica la síntesis in vitro de una molécula de polinucleótido diseñada para codificar un polipéptido de interés. La síntesis genética se puede realizar utilizando diversas técnicas, como la tecnología con microchip multiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) y tecnologías similares en las que los oligonucleótidos se sintetizan y se ensamblan en chips microfluídicos fotoprogramables.

[0122] Las sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos únicas o múltiples pueden hacerse y evaluarse usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o barajado, seguidos de un procedimiento de selección pertinente, tal como los descritos por Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden usar incluyen PCR con tendencia al error, visualización de fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; U.S. Patent No. 5,223,409; WO 92/06204) y mutagénesis dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et a/., 1988, ADN 7: 127).

[0123] Los métodos de mutagénesis/barajado se pueden combinar con métodos de selección automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos clonados mutagenizados expresados por células hospedadoras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células hospedadoras y secuenciar rápidamente usando métodos estándar en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido.

[0124] La construcción de genes semi-sintéticos se realiza mediante la combinación de aspectos de construcción sintética de genes, y/o mutagénesis dirigida, y/o mutagénesis aleatoria, y/o barajado. La construcción semisintética se caracteriza por un proceso que utiliza fragmentos de polinucleótidos que se sintetizan, en combinación con técnicas PCR. Las regiones definidas de genes pueden así ser sintetizadas de novo, mientras que otras regiones se pueden amplificar utilizando cebadores mutagénicos específicos, mientras que otras regiones se pueden someter a amplificación por PCR con tendencia al error o PCR sin tendencia al error. Las subsecuencias de polinucleótidos puedne barajarse posteriormente.

Polinucleótidos

[0125] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican una variante de la presente invención.

Construcciones de ácidos nucleicos

[0126] La presente invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención operativamente unida a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedadora adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control.

[0127] El polinucleótido se puede manipular en una variedad de formas para lograr la expresión de una variante. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. En la técnica se conocen diversas técnicas para la modificación de polinucleótidos utilizando ADN recombinante.

[0128] La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que es reconocido por una célula hospedadora para la expresión del polinucleótido. El promotor contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que posea actividad transcripcional en la célula hospedadora con promotores mutantes, truncados e híbridos, y se puede obtener a partir de de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos respecto de la célula hospedadora.

[0129] Algunos ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula hospedadora bacteriana son los promotores obtenidos del gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), el gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), el gen de penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), el gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), el gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, el gen crylIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), el operón lac de E. coli, el promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), el gen de agarasa (dagA) y el gen de betalactamasa procariota (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 80: 21-25), de Streptomyces coelicolor. Otros promotores se desdriben en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; and in Sambrook et al., 1989, supra. En la patente WO 99/43835 se describen ejemplos de promotores en serie.

[0130] Algunos ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula hospedadora fúngica filamentosa son promotores obtenidos de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus awamori (glaA) o Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa de Trichoderma reesei I, xilanasa de Trichoderma reesei II, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado a partir de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus donde el líder no traducido ha sido sustituido por un líder no traducido a partir de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; entre los ejemplos no limitativos se incluyen promotores modificados a partir de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger donde el líder no traducido ha sido sustituido por un líder no traducido a partir de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados e híbridos de estos.

[0131] En un hospedador que es una levadura, los promotores útiles se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol dehidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células hospedadoras de levadura se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[0132] La secuencia de control también puede ser un terminador de la transcripción, que es reconocido por una célula hospedadora para poner fin a la transcripción. La secuencia terminadora está operativamente unida al extremo 3'-terminal del polinucleótido que codifica la variante. Se puede utilizar cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedadora.

[0133] Los terminadores preferidos para células hospedadoras bacterianas se obtienen de los genes para proteasa alcalina de Bacillus clausii (aprH), alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) y ARN ribosómico de Escherichia coli (rrnB).

[0134] Los terminadores preferidos para células hospedadoras fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0135] Los terminadores preferidos para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) y gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células hospedadoras de levadura se describen en Romanos et al., 1992, supra.

[0136] La secuencia de control también puede ser una región de estabilizadora de ARNm en dirección hacia el extremo 3' respecto de un promotor y en dirección hacia el extremo 5' de la secuencia codificante de un gen que aumenta la expresión del gen.

[0137] Algunos ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuadas se obtienen a partir de un gen crylIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) y un gen Bacillus subtilis SP82 (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[0138] La secuencia de control también puede ser un líder, una región no traducida de un ARNm que es importante para traducción por la célula hospedadora. La secuencia líder está operativamente unida al exrremo 5'-terminal del polinucleótido que codifica la variante. Se puede utilizar cualquier líder que sea funcional en la célula hospedadora.

[0139] Los líderes preferidos para células hospedadoras fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

[0140] Los líderes adecuados para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

[0141] La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente unida al extremo 3'-terminal de la secuencia de codificación de la variante y, cuando se transcribe, es reconocida por la célula hospedadora como una señal para añadir residuos de poliadenosina para ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedadora puede ser utilizada.

[0142] Las secuencias de poliadenilación preferidas para células hospedadoras fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0143] Las secuencias de poliadenilación útiles para células hospedadoras de levadura se describen en Guo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[0144] La secuencia de control también puede ser una región codificante del péptido señal que codifica un péptido señal enlazado al extremo N-terminal de una variante y que dirige la variante en la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener intrínsecamente una secuencia codificante del péptido señal unida de manera natural en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica la variante. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante del péptido señal que es foránea a la secuencia codificante. Una secuencia codificante del péptido señal foránea se puede requerir donde la secuencia codificante de manera natural no contiene una secuencia codificante del péptido señal. Alternativamente, una secuencia codificante del péptido señal foránea puede sencillamente reemplazar la secuencia codificante del péptido señal natural para mejorar la secreción de la variante. Sin embargo, se puede utilizar cualquier secuencia codificante del péptido señal que dirija la variante expresada en la vía secretora de una célula hospedadora.

[0145] Las secuencias codificantes del péptido señal eficaces para células hospedadoras bacterianas son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señal se describen en Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[0146] Las secuencias codificantes del péptido señal eficaces para células hospedadoras fúngicas filamentosas son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.

[0147] Los péptidos señal útiles para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras secuencias codificantes del péptido señal útiles se describen en Romanos et al., 1992, supra.

[0148] La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante del propéptido que codifica un propéptido posicionado en el extremo N-terminal de una variante. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es inactivo generalmente y se puede convertir en un polipéptido activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido desde el propolipéptido. La secuencia codificante del propéptido se puede obtener de los genes para proteasa alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, proteasa neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y factor alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[0149] Cuando están presentes secuencias tanto del péptido señal como del propéptido, la secuencia del propéptido está situada junto al extremo N-terminal de la variante y la secuencia del péptido señal está situada junto al extremo N-terminal de la secuencia del propéptido.

[0150] También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que regulen la expresión de la variante con respecto al crecimiento de la célula hospedadora. Los ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causan que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a una sustancia química o estímulo físico, con la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas del operón lac, tac y trp. En levaduras, se puede usar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En los hongos filamentosos, se pueden usar el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, promotor de TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae y promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica la variante estaría operativamente unido con la secuencia reguladora.

Vectores de expresión

[0151] La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención, un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las varias secuencias de nucleótidos y de control se pueden juntar para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la variante en tales sitios. Alternativamente, el polinucleótido se puede expresar por inserción del polinucleótido o una construcción de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante esté operativamente unida con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

[0152] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que el vector debe ser introducido. El vector puede ser un plásmido lineal o cerrado circular.

[0153] El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduzca en la célula hospedadora, se integre en el genoma y se replique junto con el/los cromosoma(s) en el/los que se ha integrado. Además, se puede utilizar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que, juntos, contienen el ADN total para ser introducido en el genoma de la célula hospedadora, o un transposón.

[0154] El vector contiene preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten la selección fácil de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o a virus, resistencia a metales pesados, prototrofia para auxótrofos y similar.

[0155] Los ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son genes dal de Bacillus licheniformis o de Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia a antibióticos, tal como resistencia a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina o tetraciclina. Los marcadores adecuados para células hospedadoras de levaduras incluyen, pero de forma no limitativa, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, t Rp 1 y URA3. Los marcadores seleccionables para usar en una célula hospedadora fúngica filamentosa incluyen, pero de forma no limitativa, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de estos. Para el uso en una célula de Aspergillus se prefieren los genes amdS y pyrG de Aspergillus o de Aspergillus oryzae y un gen bar de Streptomyces hygroscopicus.

[0156] El vector contiene preferiblemente un/varios elemento(s) que permite(n) la integración del vector en el genoma de la célula hospedadora o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

[0157] Para la integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica la variante o cualquier otro elemento del vector para integración en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula hospedadora en una ubicación(es) precisa(s) en el/los cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10,000 pares de bases, 400 a 10,000 pares de bases y 800 a 10,000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia en cuestión en el genoma de la célula hospedadora. Además, los elementos integracionales pueden ser polinucleótidos codificantes o no codificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula hospedadora por recombinación no homóloga.

[0158] Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita al vector replicarse autónomamente en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que medie en la replicación autónoma y que funcione en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" significa un polinucleótido que permite a un plásmido o vector replicarse in vivo.

[0159] Los ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de plásmidos pBR322; pUC19; pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicación en E. Coli y pUB110; pE194; pTA1060 y pAMp1 que permiten la replicación en Bacillus.

[0160] Los ejemplos de orígenes de replicación para usar en una célula hospedadora de levadura son el origen de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.

[0161] Los ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se puede realizar según los métodos descritos en la patente WO 00/24883.

[0162] Más de una copia de un polinucleótido de la presente invención se puede insertar en una célula hospedadora para aumentar la producción de una variante. Un aumento en el número de copias del polinucleótido se puede obtener por integración de al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o la inclusión de un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y copias adicionales del polinucleótido se pueden seleccionar por cultivo de las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

[0163] Los procedimientos usados para unir los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención los conoce un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células hospedadoras

[0164] La presente invención también se refiere a células hospedadoras recombinantes, que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención operativamente unida a una o más secuencias de control que dirigen la producción de una variante de la presente invención. Una construcción o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula hospedadora de modo que la construcción o vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosomal que se duplica como se ha descrito anteriormente. El término "célula hospedadora" abarca cualquier progenie de una célula madre que no es idéntica a la célula madre debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La elección de una célula hospedadora dependerá en gran parte del gen que codifica la variante y su fuente.

[0165] La célula hospedadora puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante, por ejemplo, una procariota o una eucariota.

[0166] La célula hospedadora procariota puede ser cualquier bacteria gram-positiva o gram-negativa. Las bacterias gram-positivas incluyen, pero de forma no limitativa, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Las bacterias gramnegativas incluyen, pero de forma no limitativa, Campylobacter, E. Coli, Flavobacterium, Fusobacterium, helicobacteria, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma.

[0167] La célula hospedadora bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus incluyendo, pero de forma no limitativa, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis.

[0168] La célula hospedadora bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptococcus incluyendo, pero de forma no limitativa, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis y Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus.

[0169] La célula hospedadora bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptomyces, incluyendo, pero de forma no limitativa, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans.

[0170] La introducción de ADN en una célula de Bacillus se puede efectuar por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformación celular competente (véase, por ejemplo, Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, or Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742­ 751) o conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli se puede efectuar por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporación (véase, por ejemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces se puede efectuar por transformación de protoplastos, electroporación (véase, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugación (véase, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) o transducción (véase, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas se puede efectuar por electroporación (véase, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o conjugación (véase, por ejemplo, Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51 -57). La introducción de a Dn en una célula de Streptococcus se puede efectuar por competencia natural (véase, por ejemplo, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), electroporación (véase, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o conjugación (véase, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev.

45: 409-436). Sin embargo, se puede usar cualquier método conocido en la técnica para la introducción de ADN en una célula hospedadora.

[0171] La célula hospedadora también puede ser una célula eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta u hongo.

[0172] La célula hospedadora puede ser una célula fúngica. "Fúngica" como se utiliza en este caso incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y zygomycota, así como Oomycota y todos los hongos mitospóricos (como se definen en Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).

[0173] La célula hospedadora fúngica puede ser una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza en este caso incluye levaduras ascoesporógenas (Endomycetales), levaduras basidioesporogéneas y levaduras de los Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Ya que la clasificación de las levaduras puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura se definirá como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[0174] La célula hospedadora de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia, tal como una célula de Kluyveromyce lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces, norbensis Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica.

[0175] La célula hospedadora fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. "Fúngica filamentosa" incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawkswort et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan por lo general por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

[0176] La célula hospedadora fúngica filamentosa puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporte, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomices, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromices, Pleurotus, Schizofilum, Talaromyces, Termoascus, Thielavia, Tolipocladium, Trametes o Trichoderma.

[0177] Por ejemplo, la célula hospedadora fúngica filamentosa puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera, adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium, torulosum Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0178] Las células fúngicas se pueden transformar por un proceso que implica la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos y la regeneración de la pared celular en cierto modo conocido per se. Los procedimientos adecuados para transformación de células hospedadoras de Aspergillus y Trichoderma se describen en la patente EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 81: 1470-1474 y Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Los métodos adecuados para transformación de especies de Fusarium se describen en Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. Las levaduras se pueden transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; and Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de producción

[0179] La presente invención también se refiere a métodos de producción de una variante, que comprenden: (a) cultivo de una célula hospedadora de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y (b) recuperación de la variante.

[0180] Las células hospedadoras se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de la variante usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitación o fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo fermentación continua, por lote alimentado o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales en un medio adecuado y en condiciones que permiten que la variante se exprese y/o aísle. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y carbono, y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados se puedeb obtener de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collectio). Si la variante se secreta en el medio nutritivo, la variante se puede recuperar directamente desde el medio. Si la variante no es secretada, esta se puede recuperar de lisados celulares.

[0181] La variante se puede detectar utilizando métodos conocidos en la técnica que son específicos para las variantes. Estos métodos de detección incluyen, pero de forma no limitativa, uso de anticuerpos específicos, formación de un producto enzimático o desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo enzimático para determinar la actividad de la variante.

[0182] La variante se puede recuperar utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la variante se puede recuperar del medio nutritivo mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero de forma no limitativa colección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.

[0183] La variante se puede purificar mediante una variedad de procedimientos conocida en la técnica que incluyen, pero no de forma limitativa cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrófoba, de cromatoenfoque y de exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparatorio), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) para obtener variantes sustancialmente puras.

[0184] En un aspecto alternativo, la variante no se recupera, sino que una célula hospedadora de la presente invención que expresa la variante se usa como una fuente de la variante.

Composiciones

[0185] La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención. Preferiblemente, la composición también comprende un vehículo y/o un excipiente. Más preferiblemente, las composiciones se enriquecen con tal polipéptido. El término "enriquecido" indica que la actividad glucoamilasa de la composición ha sido aumentada, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de al menos 1.1. Preferiblemente, las composiciones se formulan para proporcionar características deseables tales como poco color, poco olor y estabilidad de almacenamiento aceptable.

[0186] La composición puede comprender un polipéptido de la presente invención como componente enzimático principal, por ejemplo, una composición monocomponente. Alternativamente, la composición puede comprender actividades enzimáticas múltiples, tales como aminopeptidasa, alfa-amilasa, isoamilasa carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glucosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, pululanasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa.

[0187] En una forma de realización particular, la composición comprende una alfa-amilasa y la variante de glucoamilasa según la invención. En otra forma de realización, la composición comprende una isoamilasa y la variante de glucoamilasa según la invención. En otra forma de realización, la composición comprende una alfaamilasa, una isoamilasa y la variante de glucoamilasa según la invención.

[0188] En otro aspecto, la composición comprende la variante de glucoamilasa de la invención combinada con una pululanasa. En otro aspecto, la composición comprende la variante de glucoamilasa de la invención combinada con una pululanasa y una isoamilasa. En otro aspecto, la composición comprende la variante de glucoamilasa de la invención combinada con una pululanasa y una alfa-amilasa.

[0189] En una forma de realización particular, la composición comprende además una proteasa.

[0190] Las composiciones polipeptídicas se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden ser en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición polipeptídica puede ser en forma de un granulado o un micro-granulado. El polipéptido para ser incluido en la composición se puede estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.

[0191] A continuación se dan ejemplos de usos preferidos del polipéptido o composiciones polipeptídicas de la invención. La dosificación de la composición polipeptídica de la invención y otras condiciones en las que se usa la composición se pueden determinar según métodos conocidos en la técnica.

[0192] Las composiciones anteriores son adecuadas para su uso en procesos de licuefacción, sacarificación y/o fermentación, preferiblemente en la conversión de almidón, especialmente para producir jarabe y productos de fermentación, tal como etanol.

[0193] A continuación se proporcionan ejemplos de usos preferidos de las composiciones polipeptídicas de la presente invención. La dosificación de la composición polipeptídica de la invención y otras condiciones bajo las que la composición se usa se pueden determinar según métodos conocidos en la técnica.

Usos

[0194] La presente invención está también orientada al uso de un polipéptido de la presente invención en un proceso de licuefacción, sacarificación y/o fermentación. El polipéptido se puede utilizar en un proceso único, por ejemplo, en un proceso de licuefacción, un proceso de sacarificación o un proceso de fermentación. El polipéptido también se puede usar en una combinación de procesos, por ejemplo en un proceso de licuefacción y de sacarificación, en un proceso de licuefacción y de fermentación o en un proceso de una sacarificación y fermentación, preferiblemente en relación con la conversión de almidón.

[0195] En un aspecto preferido de la presente invención, el proceso de licuefacción, sacarificación y/o fermentación incluye procesos de licuefacción y sacarificación realizados de manera consecutiva o simultánea.

[0196] En el proceso de licuefacción enzimática convencional, se añade alfa-amilasa termoestable y el almidón de cadena larga se degrada en unidades ramificadas y lineales más cortas (maltodextrinas), pero la glucoamilasa no se añade. La glucoamilasa de la presente invención es altamente termoestable, por lo que es ventajoso añadir la glucoamilasa en el proceso de licuefacción. La glucoamilasa de la presente invención tiene un efecto sinergístico cuando se combina con una alfa-amilasa en el proceso de licuefacción. Durante la sacarificación convencional, las dextrinas generadas durante el proceso de licuefacción se hidrolizan adicionalmente para producir azúcares DP1-3, de bajo peso moleculare, que se pueden metabolizar por el organismo fermentador. La hidrólisis se realiza típicamente usando glucoamilasas; alternativamente, además de glucoamilasas, se pueden usar alfa-glucosidasas y/o alfa-amilasas ácidas.

[0197] Cuando se applica la glucoamilasa de la presente invención, potencialmente en combinación con una alfaamilasa en un proceso de licuefacción y/o de sacarificación, especialmente en un proceso de licuefacción y sacarificación simultáneas, el proceso se puede llevar a cabo a una temperatura más alta. En particular, la variante de glucoamilasa de la invención es útil para sacarificación de almidón crudo (almidón granulado) a altas temperaturas pero por debajo de la temperatura de gelatinización, tal como a temperaturas en el rango de 40 a 65 °C, más particular de 50 a 62 °C, más particular de 59 a 62 °C.

[0198] Al realizar los procesos de sacarificación y/o de licuefacción a temperaturas más altas, el proceso puede llevarse a cabo en un periodo de tiempo más corto o alternativamente el proceso puede llevarse a cabo usando dosis de enzimas más bajas. Además, el riesgo de contaminación microbiana se reduce cuando el proceso de licuefacción y/o de sacarificación se realiza a temperaturas más altas.

Conversión de material que contiene almidón

[0199] La presente invención proporciona un uso de la glucoamilasa de la invención para producir glucosas y similares a partir de almidón. Generalmente, el método incluye los pasos de hidrolizar parcialmente el almidón precursor utilizando la variante de glucoamilasa de la presente invención bien sola o en presencia de una alfaamilasa.

[0200] La variante de glucoamilasa de la invención también se puede usar en combinación con una enzima que hidroliza solo enlaces alfa-(1,6)-glucosídicos en moléculas que comprenden al menos cuatro residuos glucosilo.

[0201] En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una glucoamilasa de la invención en la conversión de almidón. Además, la glucoamilasa de la invención se puede utilizar en un proceso de conversión de almidón continuo que incluye un proceso de sacarificación continuo.

Producción de jarabe, bebidas y/o productos de fermentación

[0202] El uso de la glucoamilasa de la invención incluye la conversión de almidón en por ejemplo, bebida, jarabe y/o un producto de fermentación, incluyendo etanol.

[0203] La presente invención también proporciona un proceso de uso de una glucoamilasa de la invención para producir jarabe, tal como glucosa y similares, a partir de material que contiene almidón. Las materias primas adecuadas se ejemplifican en la sección "Materiales que contienen almidón". Generalmente, el proceso comprende los pasos de hidrolizar parcial o totalmente material que contiene almidón (licuefacción y/o sacarificación) en presencia de la glucoamilasa de la presente invención sola o en combinación con alfa-amilasa para liberar glucosa de los extremos no reductores del almidón o de moléculas de oligo- y polisacáridos relacionados.

[0204] La glucoamilasa de la invención también se puede usar en forma inmovilizada. Esto es adecuado y se usa frecuentemente para producir jarabes de especialidad, tales como jarabes de maltosa, así como en el flujo refinado de oligosacáridos en relación con la producción de jarabes de fructosa, por ejemplo, jarabe con alto contenido en fructosa (HFS).

Productos de fermentación

[0205] El término "producto de fermentación" significa un producto producido mediante un proceso que incluye un proceso de fermentación utilizando un organismo fermentador. Los productos de fermentación contemplados según la invención incluyen alcoholes (por ejemplo, arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, etilenglicol, 1,3­ propanodiol [propilenglicol], butanodiol, glicerina, sorbitol, y xilitol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético, ácido acetónico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucónico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido itacónico, ácido láctico, ácido málico, ácido malónico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiónico, ácido succínico y ácido xilónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, lisina, serina y treonina); un alcano (por ejemplo, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano y dodecano); un cicloalcano (por ejemplo, ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano y ciclooctano); un alqueno (por ejemplo penteno, hexeno, hepteno y octeno); gases (por ejemplo, metano, hidrógeno (H2), dióxido de carbono (CO2) y monóxido de carbono (CO)); antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); y hormonas. En un aspecto preferido, el producto de fermentación es etanol, por ejemplo, etanol combustible; etanol potable, es decir, bebidas espirituosas neutras potables; o etanol industrial o productos usados en la industria del alcohol apto para el consumo (por ejemplo, cerveza y vino), la industria láctea (por ejemplo, productos lácteos fermentados), la industria de cuero y la industria del tabaco. Los tipos de cerveza preferida comprenden cerveza inglesa de malta, cerveza negra, porter, cerveza rubia, cerveza amarga, soluciones de malta, cerveza happoushu, cerveza de alto contenido en alcohol, cerveza de bajo contenido en alcohol, cerveza baja en calorías o cerveza light. Los procesos de fermentación preferidos usados incluyen procesos de fermentación alcohólica, que son ampliamente conocidos en la técnica. Los procesos de fermentación preferidos son procesos de fermentación anaeróbica, que son ampliamente conocidos en la técnica.

Elaboración de cerveza

[0206] Las glucoamilasas de la presente invención son altamente termoestables y, por lo tanto, se pueden usar en una industria que necesita la hidrólisis de almidón a alta temperatura. Por ejemplo, las glucoamilasas de la invención se pueden usar en una industria de elaboración de cerveza. Las glucoamilasas de la invención se añaden en cantidades eficaces que se pueden determinar fácilmente por la persona experta en la técnica.

Producción de un producto de licuefacción, sacarificación y/o fermentación

[0207] En este aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un producto de licuefacción, sacarificación y/o fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprende el paso de: tratamiento de material que contiene almidón con un polipéptido de la presente invención. Las materias primas que contienen almidón adecuado se enumeran en la sección "Materias que contienen almidón" que aparece a continuación. Las enzimas contempladas se enumeran en la sección "Enzimas" que aparece a continuación. Preferiblemente, el proceso de la presente invención comprende el tratamiento de materia que contiene almidón con un polipéptido de la presente invención solo o junto con una alfa-amilasa. El producto de licuefacción y/o de sacarificación de la presente invención son dextrina o azúcares, de bajo peso molecular, por ejemplo DP1-3. En el proceso de licuefacción, la conversión de almidón en glucosa, dextrina y/o azúcares de bajo peso molecular se mejora por la adición de una glucoamilasa de la presente invención. El producto de fermentación, tal como etanol, puede ser recuperado opcionalmente después de la fermentación, por ejemplo, por destilación. La fermentación preferiblemente se realiza en presencia de levadura, preferiblemente una cepa de Saccharomyces. Los organismos fermentadores adecuados se enumeran en la sección "Organismos fermentadores" que aparece a continuación.

Proceso para producir productos de fermentación de material que contiene almidón gelatinizado

[0208] En este aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un producto de fermentación, especialmente etanol, a partir de material que contiene almidón, donde dicho proceso incluye un paso de licuefacción y pasos de fermentación y sacarificación realizados consecutiv o simultáneamente. La invención se refiere a un procedimiento para producir un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón, que incluye los pasos de:

(a) licuefacción de un material que contiene almidón; utilizando una alfa amilasa;

(b) sacarificación del material licuado obtenido en el paso (a) utilizando una glucoamilasa; y

(c) fermentación del material sacarificado utilizando un organismo fermentador.

[0209] Preferiblemente, el paso (a) incluye también el uso de las variantes de glucoamilasa de la invención. En una forma de realización, las variantes de glucoamilasa de la invención también están presentes/se añaden en el paso (b).

[0210] El producto de fermentación, tal como especialmente etanol, puede ser recuperado opcionalmente después de la fermentación, por ejemplo, por destilación. Las materias primas que contienen almidón adecuado se enumeran en la sección "Materias que contienen almidón" que aparece a continuación. Las enzimas contempladas se enumeran en la sección "Enzimas" que aparece a continuación. La licuefacción se realiza preferiblemente en presencia de una alfa-amilasa. La fermentación preferiblemente se realiza en presencia de levadura, preferiblemente una cepa de Saccharomyces. Los organismos fermentadores adecuados se enumeran en la sección "Organismos fermentadores" que aparece a continuación. En formas de realización preferidas, los pasos (b) y (c) se realizan consecutiva o simultáneamente (es decir, como proceso SSF).

[0211] En una forma de realización particular, el proceso de la invención comprende además, antes del paso (a), los pasos de:

x) reducción del tamaño de partícula del material que contiene almidón, preferiblemente por molienda; e y) formación de una suspensión que comprende el material que contiene almidón y agua.

La suspensión acuosa puede contener 10-40 % en peso, preferiblemente 25-35 % en peso de material que contiene almidón. La suspensión se calienta por encima de la temperatura de gelatinización y la alfa-amilasa, preferiblemente, la alfa-amilasa fúngica bacteriana y/o ácida, se puede añadir para iniciar la licuefacción (dilución). En una forma de realización, la suspensión puede ser cocida a chorro para gelatinizar adicionalmente la suspensión antes someterla a una alfa-amilasa en el paso (a) de la invención.

[0212] Más específicamente, la licuefacción se puede realizar como un proceso de suspensión en caliente en tres pasos. La suspensión se calienta durante entre 60-95°C, preferiblemente 80-85°C y la alfa-amilasa se añade para iniciar la licuefacción (dilución). Luego la suspensión se puede cocer a chorro a una temperatura entre 95-140°C, preferiblemente 105-125°C, durante 1-15 minutos, preferiblemente durante 3-10 minutos, especialmente alrededor de 5 minutos. La suspensión se enfría durante 60-95°C y se añade más alfa-amilasa para finalizar la hidrólisis (licuefacción secundaria). El proceso de licuefacción normalmente se realiza a pH 4.5-6.5, en particular a un pH entre 5 y 6. Los granos enteros molidos y licuados se conocen como masa.

[0213] La sacarificación del paso (b) se puede realizar usando condiciones ampliamente conocidas en la técnica. Por ejemplo, un proceso de sacarificación completo puede durar hasta aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas; sin embargo, es común hacer una solo presacarificación de típicamente 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65°C, típicamente aproximadamente 60°C, seguida de sacarificación completa durante fermentación en un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (proceso de SSF). La sacarificación típicamente se realiza a temperaturas de 30-65°C, típicamente alrededor de 60°C y a un pH de entre 4 y 5, normalmente de alrededor de pH 4.5.

[0214] El proceso más ampliamente usado en la producción de productos de fermentación, especialmente etanol, es el proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF), en el que no hay fase de retención para la sacarificación, lo que significa que el organismo fermentador, tal como levadura y enzima(s), se pueden añadir juntos. El proceso de SSF puede efectuarse típicamente a una temperatura entre 25°C y 40°C, tal como entre 29°C y 35°C, tal como entre 30°C y 34°C, tal como alrededor de 32°C. Según la invención, la temperatura se puede ajustar al alza o la baja durante la fermentación. Conforme a la presente invención, el paso de fermentación (c) incluye, sin limitación, procesos de fermentación usados para producir alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (por ejemplo, H2 y CO2) antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); y hormonas. Los procesos de fermentación preferidos incluyen procesos de fermentación alcohólica, como se conocen en la técnica. Procesos de fermentación preferidos son procesos de fermentación anaeróbica, como se conocen en la técnica.

Procesos para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón no gelatinizado

[0215] En este aspecto, la invención se refiere a procesos para producir un producto de fermentación a partir de la materia que contiene almidón sin gelatinización de la materia que contiene almidón (es decir, materia que contiene almidón crudo). Según la invención, el producto de fermentación deseado, tal como etanol, se puede producir sin licuefacción de la suspensión acuosa con el material que contiene almidón. En una forma de realización, un proceso de la invención incluye la sacarificación de material que contiene almidón (molido), por ejemplo, almidón granulado, por debajo de la temperatura de gelatinización en presencia de una alfa amilasa para producir azúcares que se pueden fermentar por un organismo fermentador adecuado para obtener el producto de fermentación deseado. En otra forma de realización, una glucoamilasa de la invención y una alfa amilasa se usan durante la sacarificación y la fermentación. En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para producir un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprende:

(a) sacarificación de material que contiene almidón con una variante de glucoamilasa madura según la invención, a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial de dicho material que contiene almidón,

(b) fermentación utilizando un organismo fermentador.

[0216] Los pasos (a) y (b) del proceso de la invención se pueden realizar consecutiva o simultáneamente. En una forma de realización, una suspensión que comprende agua y material que contiene almidón se prepara antes del paso (a).

[0217] En una forma de realización preferida, el paso (a) incluye la adición de una alfa amilasa.

[0218] El proceso de fermentación se puede realizar durante un periodo de 1 a 250 horas, es preferiblemente de 25 a 190 horas, más preferiblemente de 30 a 180 horas, más preferiblemente de 40 a 170 horas, aún más preferiblemente de 50 a 160 horas, aún más preferiblemente de 60 a 150 horas, incluso aún más preferiblemente de 70 a 140 horas y de la forma más preferible de 80 a 130 horas.

[0219] El término "temperatura de gelatinización inicial" significa la temperatura mínima a la que comienza la gelatinización del almidón. El almidón calentado en el agua empieza a gelatinizarse entre 50°C y 75°C; la temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico y puede ser determinada fácilmente por el experto en la materia. Así, la temperatura de gelatinización inicial puede variar según la especie vegetal, según la variedad particular de la especie vegetal así como según las condiciones de cultivo. En el contexto de esta invención, la temperatura de gelatinización inicial de una materia que contiene almidón dada es la temperatura a la que la birrefringencia se pierde en 5 % de los gránulos de almidón utilizando el método descrito por Gorinstein y Lii, 1992, Starch/Starke 44(12): 461-466.

[0220] Antes del paso (a) se puede preparar una suspensión de material que contiene almidón, tal como almidón granulado, que tiene 10-55 % en peso de sólidos secos, preferiblemente 25-40 % en peso de sólidos secos, más preferiblemente 30-35 % en peso de sólidos secos de material que contiene almidón. La suspensión puede incluir agua y/o aguas de proceso, tales como lías (vinaza), agua de lavado, condensado o destilado de evaporador, agua secundaria de destilación u otra agua de proceso de planta de producto de fermentación. Debido a que el proceso de la invención se realiza por debajo de la temperatura de gelatinización y, por lo tanto, no se produce ningún aumento de viscosidad significativa, se pueden usar grandes cantidades de vinaza si se desea. En una forma de realización, la suspensión acuosa contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 70 % vol. de vinaza, preferiblemente 15-60 % vol. de vinaza, especialmente de aproximadamente 30 a 50 % vol. de vinaza.

[0221] El material que contiene almidón se puede preparar reduciendo el tamaño de partícula, preferiblemente por molienda en húmedo o en seco, a 0,05 a 3,0 mm, preferiblemente 0,1-0,5 mm. Después de ser sometido a un proceso de la invención al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o preferiblemente al menos 99 % de los sólidos secos del material que contiene almidón se convierten en un hidrolizado de almidón soluble.

[0222] El proceso de la invención se lleva a cabo a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial. Preferiblemente, la temperatura en la que el paso (a) se realiza es de entre 30-75°C, preferiblemente de entre 45-60°C.

[0223] En una forma de realización preferida, el paso (a) y paso (b) se realizan como un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas o secuenciales. En tal forma de realización preferida, el proceso se lleva a cabo típicamente a una temperatura entre 25°C y 40°C, tal como entre 29°C y 35°C, tal como entre 30°C y 34°C, tal como alrededor de 32°C. Según la invención, la temperatura se puede ajustar al alza o a la baja durante la fermentación.

[0224] En una forma de realización, la sacarificación y fermentación simultáneas se realizan de modo que el nivel de azúcar, tal como el nivel de glucosa, se mantiene a un nivel bajo tal como por debajo de 6 % en peso, preferiblemente, por debajo de aproximadamente 3 % en peso, preferiblemente, por debajo de aproximadamente 2 % en peso, más preferiblemente por debajo de aproximadamente 1 % en peso, aún más preferiblemente, por debajo de aproximadamente 0,5 % en peso o aún más preferiblemente 0,25 % en peso, tal como por debajo de aproximadamente 0,1 % en peso. Tales niveles bajos de azúcar se pueden obtener de manera sencilla utilizando cantidades ajustadas de enzima y organismo fermentador. Una persona experta en la técnica puede determinar fácilmente qué cantidades de enzima y organismo fermentador usar. Las cantidades empleadas de enzima y organismo fermentador también se pueden seleccionar de manera que se mantengan bajas concentraciones de maltosa en el caldo de fermentación. Por ejemplo, el nivel de maltosa se puede mantener por debajo de aproximadamente 0,5 % en peso o por debajo de aproximadamente 0,2 % en peso.

[0225] El proceso se puede llevar a cabo a un pH en el rango de entre 3 y 7, preferiblemente pH 3.5 a 6, o más preferiblemente de pH 4 a 5.

[0226] Las variantes de glucoamilasa de la presente invención son termoestables, así la pre-sacarificación y/o sacarificación se puede llevar a cabo a una temperatura más alta que la pre-sacarificación convencional y/o sacarificación. En una forma de realización, un proceso de la invención incluye material que contiene almidón pre­ sacarificado antes del proceso de sacarificación y fermentación simultáneos (SSF). La pre-sacarificación puede llevarse a cabo a una alta temperatura (por ejemplo, 50- 85°C, preferiblemente 60-75°C) antes de moverse en la SSF.

Materias que contienen almidón

[0227] Cualquier materia prima que contiene almidón adecuado, incluido almidón granuladom se pueden utilizar según la presente invención. La materia prima se selecciona generalmente en función del producto de fermentación deseado. Los ejemplos de materias primas que contienen almidón, adecuadas para usar en un proceso de la presente invención incluyen tubérculos, raíces, tallos, granos enteros, maíz, trigo, cebada, centeno, milo, sagú, mandioca, tapioca, sorgo, guisantes, arroz, alubias o batata, o mezclas derivadas, o cereales, materias primas que contienen azúcar, tal como melaza, materias de fruta, azúcar de caña o remolacha azucarera, patatas y materias con celulosa, tal como madera o residuos vegetales o mezclas derivadas. Se contemplan tanto los tipos cerosos como los no cerosos de maíz y cebada.

Organismos fermentadores

[0228] "Organismos fermentadores" se refiere a cualquier organismo, incluyendo organismos bacterianos y fúngicos, adecuados para usar en un proceso de fermentación y capaces de producir un producto de fermentación deseado. Los organismos fermentadores adecuados especialmente son capaces de fermentar, es decir, convertir, azúcares, tal como glucosa o maltosa, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado. Los ejemplos de organismos fermentadores incluyen organismos fúngicos, tal como levadura. La levadura preferida incluye cepas de Saccharomyces spp., en particular, Saccharomyces cerevisiae. Las levaduras disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, Red Star™/Lesaffre Ethanol Red (comercializada por Red Star/Lesaffre, EE. UU.) FALI (comercializada por Fleischmann's Yeast, una división de Burns Philp Food Inc., EE. UU.), SUPERSTART (comercializada por Alltech), GERT STRAND (comercializada por Gert Strand AB, Suecia) y FERMIOL (comercializada por d Sm Specialties).

ENZIMAS

Glucoamilasa

[0229] La glucoamilasa es preferiblemente una glucoamilasa de la invención. Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, una glucoamilasa de la invención también se puede combinar con otras glucoamilasas. La glucoamilasa se puede añadir en una cantidad de 0,001 a 10 AGU/g de MS, preferiblemente de 0,01 a 5 AGU/g de MS, tal como alrededor de 0,05, 0,1, 0,3, 0,5,1 o 2 AGU/g de MS, especialmente 0,05 a 0,5 AGU/g de MS; o 0,02-20 AGU/g de MS, preferiblemente 0,1-10 AGU/g de MS.

Alfa-amilasa

[0230] La alfa-amilasa según la invención puede ser de cualquier origen. Se prefieren las alfa-amilasas de origen fúngico o bacteriano.

[0231] En un aspecto preferido, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida, por ejemplo, alfa-amilasa ácida fúngica o alfa-amilasa ácida bacteriana. El término "alfa amilasa ácida" significa una alfa-amilasa (E.C. 3.2.1.1) que, añadida en una cantidad eficaz, tiene actividad óptima a un rango de pH de 3 a 7, preferiblemente de 3.5 a 6 o más preferiblemente de 4-5.

Alfa-amilasas bacterianas

[0232] Según la invención, una alfa-amilasa bacteriana puede derivar preferiblemente del género Bacillus.

[0233] En un aspecto preferido, la alfa-amilasa de Bacillus deriva de una cepa de B. licheniformis, B. Amyloliquefaciens, B. Stearothermophilus o B. subtilis, pero también puede derivar de la especie Bacillus. Otros ejemplos específicos de alfa-amilasas contempladas incluyen la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (BLA) mostrada en la SEQ ID N.°: 4 en la WO 99/19467, la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (BAN) mostrada en la SEQ ID N.°: 5 en WO 99/19467 y la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (BSG) mostrada en la SEQ ID N.°: 3 en la WO 99/19467. En una forma de realización de la invención, la alfa-amilasa es una enzima con un grado de identidad de al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferido al menos 80 %, aún más preferido al menos 90 %, tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad con cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID N.°: 1,2, 3, 4 o 5, respectivamente, en la WO 99/19467.

[0234] La alfa-amilasa de Bacillus también puede ser una variante y/o híbrida, especialmente una descrita en cualquiera de las patentes WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059 y WO 02/10355. Las variantes de alfa-amilasa contempladas en concreto se describen en la patente de EE. UU. N.° 6,093,562, 6,297,038 o la patente de EE. UU N.° 6,187,576 e incluyen variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (BSG alfa-amilasa) con una deleción de uno o dos aminoácidos en la posición 179 a 182, preferiblemente una deleción doble descrita en la WO 1996/023873 - véase, por ejemplo, página 20, líneas 1-10, preferiblemente correspondientes a delta(181-182) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la alfaamilasa de tipo salvaje BSG expuesta en la SEQ ID N.°: 3 descrita en la patente WO 99/19467 o deleción de aminoácidos 179 y 180 usando la SEQ ID N.°: 3 en la WO 99/19467 para la numeración. Aún más preferidas son las alfa-amilasas de Bacillus, especialmente la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, que tiene una deleción doble que corresponde con delta (181-182) y además comprende una sustitución N193F (denominada también I181* G182* N193F) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa de tipo salvaje BSG expuesta en la SEQ ID N.°: 3 descrita en la patente WO 99/19467.

[0235] La alfa-amilasa también puede ser una alfa-amilasa maltogénica. Una "alfa-amilasa" maltogénica (glucano 1,4-alfa-maltohidrolasa, E.C. 3,2,1,133) es capaz de hidrolizar amilosa y amilopectina en maltosa en la configuración alfa. Una alfa-amilasa maltogénica de la cepa de Bacillus stearothermophilus NCIB 11837 está comercialmente disponible en Novozymes A/S, Dinamarca. La alfa-amilasa maltogénica se describe en la Patente de EE. UU. n.° 4,598,048, 4,604,355 y 6,162,628.

Alfa-amilasas híbridas bacterianas

[0236] Una alfa-amilasa híbrida específicamente contemplada comprende 445 residuos de aminoácidos en el extremo C-terminal de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (mostrada como SEQ ID N.°: 4 en WO 99/19467) y los 37 residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal de la alfa-amilasa derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada como SEQ ID N.°: 3 en WO 99/194676), con una o más, especialmente todas de las siguientes sustituciones:

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S (utilizando la numeración de Bacillus licheniformis). También se prefieren variantes que tienen una o varias de las siguientes mutaciones (o mutaciones correspondientes en otras estructuras de alfa-amilasa de Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V y Q264S y/o deleción de dos residuos entre posiciones 176 y 179, preferiblemente deleción de E178 y G179 (utilizando el SEQ ID N.°: 5 numeración de WO 99/19467).

Alfa-amilasas fúngicas

[0237] Las alfa-amilasas ácidas fúngicas incluyen alfa-amilasas ácidas derivadas a partir de una cepa del género Aspergillus, tal como alfa-amilasas de Aspergillus oryzae, Aspergillus niger o Aspergillus kawachii.

[0238] Una alfa-amilasa fúngica ácida preferida es una alfa-amilasa de tipo Fungamyl que se deriva preferiblemente a partir de una cepa de Aspergillus oryzae. En la presente descripción, el término "alfa amilasa de tipo fungamyl" indica una alfa-amilasa que muestra una alta identidad, es decir, más del 70 %, más del 75 %, más del 80 %, más del 85 % más del 90 %, más del 95 %, más del 96 %, más del 97 %, más del 98 %, más del 99 % o incluso 100 % de identidad con la parte madura de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID N.°: 10 en la WO96/23874.

[0239] Otra alfa-amilasa acida preferida se deriva de una cepa Aspergillus niger. En un aspecto preferido, la alfaamilasa fúngica ácida es la de A. niger descrita como "AMYA_ASPNG" en la base de datos Swiss-prot/TeEMBL bajo el número de acceso primario n° P56271 y descrita con más detalle en la WO 89/01969 (ejemplo 3). La alfaamilasa ácida de Aspergillus niger se muestra también como la SEQ ID N.°: 1 en la WO 2004/080923 (Novozymes). También se contemplan variantes de dicha amilasa fúngica ácida que tiene al menos 70 % de identidad, tal como al menos 80 % o incluso al menos 90 % de identidad, tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad con la SEQ ID N.°: 1 en WO 2004/080923.

[0240] En un aspecto preferido, la alfa-amilasa se deriva de Aspergillus kawachii y se describe en Kaneko et al. J. Ferment. Bioeng. 81:292-298(1996) "Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase from Aspergillus kawachii' y además como EMBL:#AB008370.

[0241] La alfa-amilasa ácida fúngica también puede ser una enzima de tipo salvaje que comprende un módulo de unión a carbohidratos (CBM) y un dominio catalítico de alfa-amilasa (es decir, una no híbrida) o una variante. En una forma de realización, la alfa-amilasa ácida tipo salvaje se deriva de una cepa de Aspergillus kawachii.

Alfa-amilasas híbridas fúngicas

[0242] En un aspecto preferido, la alfa-amilasa ácida fúngica es una alfa-amilasa híbrida. Los ejemplos preferidos de alfa-amilasas híbridas fúngicas incluyen aquellos descritos en la WO 2005/003311 o en la publicación de patente de EE. UU. n° 2005/0054071 (Novozymes) o en la solicitud de patente de EE. UU. n° 2006/0148054 (Novozymes). Una alfa-amilasa híbrida puede comprender un dominio catalítico (CD) de alfa-amilasa y un dominio/módulo de enlace de carbohidratos (CBM) y opcionalmente un enlazador.

[0243] Los ejemplos específicos de alfa-amilasas híbridas contempladas incluyen, pero no están limitados a aquellos descritos en la solicitud de patente de EE. UU. n° 2006/0148054, incluyendo la variante Fungamyl con dominio catalítico JA118 y Athelia rolfsii SBD (SEQ ID N.°: 100 en la solicitud de EE. UU. n° 2006/0148054), alfaamilasa de Rhizomucor pusillus con enlazador AMG y SBD ded Athelia rolfsii (SEQ ID N.°: 101 en la solicitud e EE. UU. n° 2006/0148054) y alfa-amilasa de Meripilus giganteus con enlazador de glucoamilasa y SBD de Athelia rolfsii (SEQ ID N.°: 102 en la solicitud de EE. u U. n° 2006/0148054); y alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con enlazador de glucoamilasa y CBM de Aspergillus niger (SEQ ID N.° 2 en la publicación internacional n° WO2007/144424).

[0244] Otros ejemplos específicos de alfa-amilasas híbridas contempladas incluyen, pero no están limitados a aquellos descritos en la publicación de patente de EE. UU. n° 2005/0054071, incluyendo aquellos descritos en la tabla 3 en la página 15, tal como alfa-amilasa de Aspergillus niger con enlazador y dominio de unión al almidón de Aspergillus kawachii.

Productos comerciales de alfa-amilasa

[0245] Las composiciones comerciales preferidas que comprenden alfa-amilasa incluyen micolasa de DSM (Gist Brocades), BAN™, TERMAMYL™ SC, FUNGAMYL™, LIQUOZYME™ SC, LIQUOZYME™ SC DS, y SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) y CLARASE™ L-40,000, DEX-LO™, SPEZYME™ FRED, SPEZYME™ AA, SPEZYME™ Ethyl, y SPEZYME™ DELTA AA (Genencor Int.)

[0246] La presente invención se describe a continuación mediante los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Materiales y métodos

Actividad glucoamilasa

[0247] La actividad glucoamilasa se puede medir en unidades AGU.

Actividad glucoamilasa (AGU)

[0248] La unidad de glucoamilasa (AGU) se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto en condiciones estándar (37°C, pH 4.3, sustrato: maltosa 100 mM, tampón: acetato 0,1 M, tiempo de reacción 6 minutos como se presenta en la incubación de glucoamilasa que aparece a continuación), generando así glucosa.

[0249] El principio de análisis se describe por 3 pasos de reacción:

El paso 1 es una reacción enzimática:

La glucoamilasa (AMG), EC 3,2,1,3 (exo-alfa-1,4-glucano-glucohidrolasa), hidroliza maltosa para formar alfa-D-glucosa. Tras la incubación, la reacción se detiene con NaOH.

Los pasos 2 y 3 suponen una reacción de punto final:

La glucosa se fosforila por ATP, en una reacción catalizada por hexoquinasa. El glucosa-6-fosfato formado se oxida a 6-fosfogluconato por glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

[0250] En esta misma reacción, una cantidad equimolar de NAD+ se reduce para NADH con un aumento resultante en la absorbancia a 340 nm. Un sistema de autoanalizador tal como analizador Konelab 30 (Thermo Fisher Scientific) puede ser utilizado.

Actividad específica (SA) de glucoamilasa

[0251] La actividad específica se determinó por el ensayo de AGU que se acaba de describir utilizando un instrumento Konelab.

Actividad glucoamilasa usando el equipo de Kikkoman

Ensayo de actividad glucoamilasa (Kikkoman)

Código de producto: 60211

[0252] Principio del ensayo:

glucoamilasa (3-glucosidasa

a-glucosidasa

G2-p-pNP _______________ ► G1-|3-pNP -------------------► pNP

[0253] El sustrato, 4-nitrofenil- p-maltósido (G2-p-pNP) se degrada por glucoamilasa o a-glucosidasa en 4-nitrofenil-p-glucósido (G1-p-pNP). El G1-p-pNP posteriormente se degrada en 4-nitrofenol (PNP) por p-glucosidasa en este equipo. La reacción se realiza a temperatura ambiente a pH aproximadamente 4. La reacción se detiene por adición de carbonato de sodio y al mismo tiempo la solución se convierte a pH alcalino para maximizar la absorbancia de pNP. La actividad de formación de glucosa se mide por cuantificación del pNP a 400nm.

1) la respuesta medida muestra la actividad de degradación del G2-p-pNP de la glucoamilasa y la aglucosidasa en la muestra. Se cree que esta es la actividad formadora de glucosa en la muestra.

2) la prueba se puede usar para extracto de arroz koji sin diálisis.

3) este ensayo no está afectado por a-amilasa de la muestra.

Com onentes del e ui o

1) Mezcla de la "solución de sustrato" y la "solución enzimática" del equipo a 1:1.

2) Pipeteo de 10|_il de la muestra de variante de glucoamilasa purificada que tiene aproximadamente 0. 1.AGU/ml de actividad (o agua como un blanco) y transferir a un pocillo de placa de microtitulación. (duplicado)

3) Adición de 60|_il de la mezcla de enzima sustrato al pocillo.

4) Incubación a 32°C de temperatura durante 20 min.

5) Adición de 120|_il de la solución de parada al pocillo.

6) Lectura OD400nm. # OD400 Neta = OD4oo(muestra) - OD400(blanco)

1. Blanco: normalmente, la absorbancia de blanco es inferior a 0,200.

2. Especificidad: la respuesta no está afectada por glucosa (hasta 100g/l) o a-amilasa (725U/ml).

3. Reproducibilidad: el CV de la absorbancia es menor que 1 % cuando la misma muestra se analiza 10 veces.

4. Rango lineal: la OD400 neta hasta 1,6 debería ser proporcional a la concentración enzimática.

5. Estabilidad de color: la absorbancia no cambia durante 2h a 25°C.

Ensayo de termoestabilidad

[0254] La termoestabilidad se determinó para las variantes seleccionadas como la actividad residual después del tratamiento térmico a 63°C o 67°C durante 1 hora utilizando el equipo de glucoamilasa de Kikkoman.

Ensayo de inhibición de glucosa

[0255] La inhibición de glucosa se determinó como la proporción de actividad glucoamilasa (AMG) con y sin glucosa. El equipo de ensayo Kikkoman se usó para el ensayo AMG. Se añadieron diez micrólitros de las muestras diluidas 3 veces a 190 micrólitros de sustrato (solución de sustrato en el equipo: solución enzimática en el equipo: 40 % de glucosa o DW = 1:1:6) y la mezcla de reacción se incubó a 37° C. El tiempo de reacción dependió de los sustratos, 30 min para el sustrato sin glucosa y 2 h con glucosa. Luego se mezclaron 80 micrólitros de mezcla de reacción con 160 micrólitros de Na2CO3 al 3 % para la reacción y se midió la A400.

[0256] El valor de inhibición de glucosa se calculó como la ecuación siguiente;

Inhibición de glucosa = (Vg / Vdw) / (WTg / WTdw)/2*0,5*100

Vg; delta A400 de la variante de sustrato con glucosa

Vdw; delta A400 de la variante de sustrato sin glucosa

WTg; delta A400 del Gt-AMG de sustrato con glucosa

Vdw; delta A400 del Gt-AMG de sustrato sin glucosa

Manipulaciones de ADN

[0257] Todos los plásmidos fueron construidos y propagados en células de E.coli DH5a. Las endonucleasas de restricción para manipulaciones de ADN se pueden obtener en New England Biolabs, Inc. y se usan según las instrucciones. Se usa In-fusion (Clontech) para el ligamiento de ADN. Los plásmidos amplificados se recuperan con el kit de plásmido Qiagen. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realiza con la Prime star Max ADN polimerasa (TaKaRa). El equipo de extracción de Gel QIAquickge (Qiagen) se usa para la purificación de fragmentos de ADN extraídos de geles de agarosa. Toda la manipulación de ADN se realizó siguiendo básicamente las instrucciónes del fabricante y el manual Molecular cloning: a laboratory manual (2nd edn.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York described in Sambrook, Fritsch EF, Maniatis T (1989).

Ejemplo 1: clonación del gen de glucoamilasa Gt-AMG

Preparación de ADNc de la cepa Gloeophyllum trabeum.

[0258] El ADNc se sintetizó siguiendo las instrucciones del equipo de síntesis de ADNc Transciptor high Fidelity cDNA synthesis kit (Roche).

Clonación del gen de glucoamilasa Gt-AMG.

[0259] El gen de glucoamilasa se reclonó a partir del ADNc en un vector de expresión de Aspergillus por PCR usando dos cebadores de clonación pra102 y cebador pra103 mostrados a continuación, que se diseñaron en función de la secuencia conocida y marcadores añadidos para la clonación directa mediante la estrategia IN­ FUSION™.

Cebador par102: 5' AGTCTTGATCGGATCCATGTACCGCTTCCTTGTCTGTGCT 3'

Cebador pra103: 5' CGCACCACGTGGTTTAAACTTAACGCCAAGTGTCATTCTC 3'

[0260] La PCR se realizó utilizando un motor ADN PTC-200 en condiciones descritas a continuación.

Sistema de reacción por PCR: Condiciones:

8 Micro L H2O 1 94°C 2 Min

10 Micro L 2X Prime star(TaKaRa) 2 94°C 10 Seg

Cebadores 0,5micro L X 2100 pmol/micro L 3 55°C 10 Seg

(pra102 Y pra103)

4 72°C 10 Seg

1 Micro L Modelo ADN 2-4 25 Ciclos

5 72°C 10 Min

[0261] Los productos de reacción se asialron por electroforesis en gel de agarosa al 1,0 % de utilizando 1 x tampón TAE donde aproximadamente una banda de producto de PCR de 1,7kb se extrajo del gel y se purificó utilizando un equipo de extracción de gel Qiagen según las instrucciones del fabricante. El ADN que correspondía con el gen de glucoamilasa de Gloeophyllum trabeum se clonó en un vector de expresión de Aspergillus linealizado con BamHI y Pmel, utilizando un equipo de 5X HD IN-FUSION™ (Clontech) según las instrucciones del fabricante.

[0262] Se usaron 2 pl de volumen de la mezcla de ligamiento para transformar células de E. Coli DH5a (TOYOBO). Después de un choque térmico a 42 °C durante 45 seg y el enfriamiento en hielo, se añadieron 250 pl de medio SOC y las células se incubaron a 37°C a 225 r.p.m. durante 90 min antes de ser colocadas en placas de agar LB que contanían 250 pg de ampicilina por ml y ser cultivadas durante toda la noche a 37°C. Las colonias seleccionadas se inocularon en 3 ml de medio LB suplementado con 50 pg de ampicilina por ml y se incubaron a 37°C a 225 r.p.m. durante toda la noche. El ADN plasmídico de las colonias seleccionadas se purificó utilizando el kit de plásmido Qiagen mini (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. La secuencia de genes de glucoamilasa de Gloeofillum trabeum se verificópor secuenciación de Sanger antes de la expresión heteróloga. Uno de los plásmidos se seleccioní para la expresión adicional y se le denominó pNori140.

[0263] Se prepararon protoplastos de un hospedador de la especie Aspergillus niger como se describe en la patente WO 95/02043. Preferiblemente, se eliminó la para actividad glucoamilasa endógena del hospedador A. niger. El gen de glucoamilasa de Gloeofillum trabeum se integró en el genoma del hospedador A. niger utilizando el sistema de integración dirigida basado en FLP como se describe en la WO2012/160093. Cien pl de suspensión de protoplasto se mezclaron con 2,5 pg del plásmido pNori140, que contiene el gen de glucoamilasa Gloeofillum trabeum con el promotor, terminador, gen FLP y sitios de integración descritos en la WO2012/160093 y se añadieron y mezclaron suavemente 250 microlitros de 60 % PEG 4000 (Applichem) (polietilenglicol, peso molecular 4,000), 10 mM de CaCl2 y 10 mM de Tris-HCl pH 7,5. La mezcla se incubó a 37°C durante 30 minutos y los protoplastos se mezclaron con agarosa con bajo punto de fusión al 6 % (Biowhittaker Molecular Applications) en placas de sacarosa COVE (Cove, 1996, Biochim. Biophys. Acta 133:51-56) (1M) suplementadas con 10 mM de acetamida y 15 mM CsCl y se añadieron como una capa superior en las placas de sacarosa COVE (1M) suplementadas con 10 mM de acetamida y 15 mM CsCl para la selección de transformantes (4 ml de agar superior por placa). Tras la incubación durante 6 días a 32°C, se aislaron esporas de cinco transformantes sobre la placa COVe II y transformantes aislados fueron se sometieron a cultivo en matraz.

[0264] Cultivo. El transformante aislado se inoculó en una placa COVE Ngly a 30°C durante 7 días y el cultivo de la placa se inoculó en medios MSS de 100ml y se cultivó a 30 °C durante 3 días en matraces de agitación de 500 ml en un agitador orbital. Se inocularon 10 Ml del caldo de cultivo en un medio MU-1 de 100ml y se cultivaron a 30°C durante 6 días. El caldo de cultivo se centrifugó y el sobrenadante se filtró utilizando filtros de membrana de 0,2 pm.

[0265] Gel de afinidad de alfa-ciclodextrina. Se suspendieron diez gramos de polvo de sefarosa 6B activada por epoxi (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, U.K) y se lavaron con agua destilada en un filtro de vidrio sinterizado. El gel se suspendió en solución de acoplamiento (100 ml de 12,5 mg/ml de alfa-ciclodextrina, 0,5 M NaOH) y se incubó a temperatura ambiente durante un día con agitación suave. El gel se lavó con agua destilada en un filtro de vidrio sinterizado, se suspendió en 100 ml de 1 M etanolamina, pH 10, y se incubó a 50 °C durante 4 horas para su bloqueo. El gel se lavó luego varias veces utilizando 50 mM Tris-HCl, pH 8 y 50 mM NaOAc, pH 4.0 alternativamente. Finalmente, el gel se envasó en una columna de 35-40 ml usando un tampón de equilibrado (50 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 4.5).

[0266] Purificación de glucoamilasa a partir de caldo de cultivo. Se pasó caldo de cultivo de fermentación de transformantes de A. niger que contenían el gen de glucoamilasa a través de un filtro PES de 0,22 pm y se aplicó en una columna con gel de afinidad de alfa-ciclodextrina previamente equilibrada en un tampón 50 mM NaOAc, 150 mM NaCl, de pH 4.5. El material no unido se lavó con tampón de equilibrado y la glucoamilasa se eluyó usando el mismo tampón que contenía 10 mM beta-ciclodextrina por 3 volúmenes de columna.

[0267] La actividad glucoamilasa del eluyente se analizó para ver si la glucoamilasa se había ligado al gel de afinidad de alfa-ciclodextrina. La muestra de glucoamilasa purificada luego se dializó con 20 mM NaOAc, pH 5.0. Por último, se analizó la pureza mediante SDS-PAGE y solo se descubrió una única banda.

Ejemplo 2: construcción y expresión de una variante dirigida de glucoamilasa de Gloeofillum trabeum

[0268] Se llevaron a cabo dos reacciones PCR con el plásmido pNori140, descrito en el ejemplo 1, usando los cebadores V59A-F y V59A-R mostrados a continuación, diseñados para sustituir a la alanina, A, en la posición 59 de la secuencia madura con valina, V, y los cebadores pra102 y pra103 mostrados a continuación, diseñados basándose en la secuencia conocida y marcadores adicionados para la clonación directa por estrategia de IN­ FUSION™.

Cebador par102: 5' agtcttgatcggatccatgtaccgcttccttgtctgtgct 3'

Cebador pra103: 5' cgcaccacgtggtttaaacttaacgccaagtgtcattctc 3'

[0269] La PCR se realizó utilizando un motor de ADN PTC-200 en condiciones descritas a continuación.

Sistema de reacción PCR:_________ Condiciones:

8 Micro L H2O 1 94°C 2 Min

10 Micro L 2X Prime star( 2 94°C 10 Seg cebadores 0,5micro L X 2100 pmol/ 3 55°C 10 Seg

(V59A-F pra344, V59A-R pra343 4 72°C 10 Seg

1 Micro L Modelo ADN 2-4 25 Ciclos

5 72°C 10 Min

[0270] Los fragmentos de ADN se recuperaron de gel de agarosa mediante el equipo de extracción de gel Qiagen según las instrucciones del fabricante. Los dos fragmentos purificados resultantes se clonaron en un vector de expresión de Aspergillus, pNori140, se linealizaron con BamHIy Pmel utilizando un IN-FUSION™ (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA) según las instrucciones del fabricante.

[0271] La mezcla de ligamiento fue usada para transformar células de E. Coli DH5a (TOYOBO). Las colonias seleccionadas se inocularon en un medio LB de 3 ml suplementado con 50 pg de ampicilina por ml y se incubaron a 37°C a 225 r.p.m. durante toda la noche. El plásmido de ADN de las colonias seleccionadas se purificó utilizando el kit de plásmido Qiagen mini (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. La secuencia de de la variante dirigida de glucoamilasa de Gloeofillum trabeum se verificó antes de la expresión heteróloga y se seleccionó uno de los plásmidos para la expresión adicional.

[0272] Los protoplastos de células hospedadoras de Aspergillus niger de los que se eliminó la actividad glucoamilasa endógena se prepararon como se describe en la patente WO 95/02043. Cien pl de suspensión de protoplastos se mezclaron con 2,5 pg del plásmido pNori140 que comprendía el gen variante de Am G de G. Trabeum con la sustitución específica y 250 micrólitros de PEG 4000 al 60 % (Applichem) (polietilenglicol, peso molecular 4,000), 10 mM CaCl2 y se añadieron 10 mM pH Tris-HCl 7,5 y se mezclaron lentamente. La mezcla se incubó a 37°C durante 30 minutos y los protoplastos se mezclaron con agarosa de punto de fusión bajo al 6 % (Biowhittaker Molecular Applications) en placas de sacarosa COVE (Cove, 1996, Biochim. Biophys. Acta 133:51-56) (1 M) suplementadas con 10 mM de acetamida y 15 mM CsCl y y se añadieron como una capa superior en las placas de sacarosa COVE (1 M) suplementadas con 10 mM de acetamida y 15 mM CsCl para la selección de transformantes (4 ml de agar superior por placa). Tras la incubación durante 6 días a 32°C, las esporas de cinco transformantes se aislaron sobre una placa 11 COVE y los transformantes aislados se pusieron en cultivo en matraz.

[0273] Otras variantes se constryeron utilizando los cebadores directos e indirectos mostrados en la tabla que aparece a continuación.

[0274] Cultivo. Los transformantes aislados se inocularon en placas COVE Ngly a 30°C durante 7 días y el cultivo de la placa se inoculó en 100ml de medios MSS y se cultivó a 30 °C durante 3 días en frascos de agitación de 500 ml en un agitador orbital. 10 Ml del caldo de cultivo se inocularon en medio MU-1 de 100ml y se cultivaron a 30°C durante 6 días. El caldo de cultivo se centrifugó y el sobrenadante fue filtrado utilizando 0,2 |_im filtros de membrana.

Ejemplo 3: purificación de variantes Gt AMG dirigidas

[0275] Los transformantes seleccionados de la variante se cultivaron en el MU-1 descrito en el ejemplo 1 y el cultivo se pasó a través de un filtro PES de 0,22 |_im y se aplicó en una columna de gel de afinidad de alfa-ciclodextrina previamente equilibrada en tampón 50 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 4.5. El material no unido se extrajo de la columna con tampón de equilibrado y la glucoamilasa se eluyó usando el mismo tampón que contenía 10 mM de beta-ciclodextrina por 3 volúmenes de columna.

[0276] La actividad glucoamilasa del eluyente se analizó para ver si la glucoamilasa se había ligado al gel de afinidad de alfa-ciclodextrina. Las muestras de glucoamilasa purificada se dializaron con 20 mM NaOAc, pH .0.

Ejemplo 4: caracterización de la variante de glucoamilasa que tiene termoestabilidad mejorada

[0277] La termoestabilidad de variantes de glucoamilasa que tienen sustituciones específicas o combinaciones de sustituciones se determinó por medición de la actividad residual después del tratamiento térmico a 63° C y 67° C durante 1 hora utilizando el equipo de ensayo de glucoamilasa de Kikkoman. Los valores de la tabla son relativos a la actividad medida para la muestra de control que no se ha sometido a tratamiento térmico.

[0278] Los resultados se resumen en la tabla 1 que aparece a continuación.

Tabla 1.

JGA125 | S95P, T119W, A121P | 81

| 100

[0279] La termoestabilidad mejoró para todas las combinaciones evaluadas, desde las sustituciones únicas (JGA064, 078, 083 y 122), las sustituciones dobles, JGA098,099 y 123, a las mutaciones triples (JGA100 y 125) y JGA100 fue la más termoestable. Por otro lado, JGA064, 099 y 100, que tenían V59A, mostraron menos inhibición de la glucosa, lo que sugiere que la posición V59 fue importante también para inhibición de glucosa.

[0280] La inhibición de glucosa (GI) se determinó como la proporción de actividades AMG con y sin glucosa al 30 %. Los valores son relativos al tipo salvaje. Los valores más altos corresponden a una menor inhibición.

[0281] Para ajustar el espacio alrededor de V59,4 los aminoácidos vecinos, V18; V37; T422 y A426, se seleccionaron en función del análisis estructural. Se construyeron y se evaluaron cuatro bibliotecas de saturación doble con V59 y aminoácidos seleccionados.

Ejemplo 5: caracterización de variantes de glucoamilasa con tolerancia a la glucosa mejorada y termoestabilidad mejorada

[0282] De las bibliotecas de saturación doble (V59X-V18X, V59X-V37X, V59X-T422X, y V-59X- A426X), se seleccionaron JGA127, 128 y 129 como los mejores candidatos para mejorar la inhibición de glucosa. Para mejorar la termoestabilidad de JGA127 y 129, se introdujeron las sustituciones termo estabilizantes S95P, T119W y A121P. Los resultados de su caracterización se resumen en la tabla 2.

Tabla 2. Caracterización de variantes con menor inhibición de glucosa

[0283] Todas las variantes han mantenido una actividad específica inferior.

Ejemplo 6: caracterización de variantes de glucoamilasa con tolerancia a la glucosa mejorada y termoestabilidad mejorada combinada con una buena actividad específica

[0284] JGA149 se obtuvo de la biblioteca de saturación de un sitio de sustitución S316X como una variante con menor inhibición de la glucosa a la vez que se mantenía la actividad específica de la glucoamilasa precursora. Para mejorar su termoestabilidad, las sustituciones S95P y A121P se introdujeron en JGA149 y la variante resultante JGA151 se caracterizó. La termoestabilidad y actividad específica aumentaron (tabla 4).

[0285] La forma G2 (ningún dominio de unión al almidón) de JGA098 y JGA151 se construyó y nombró JGA148 y 203, respectivamente. JGA148 y JGA203 mostraron actividad específica aumentada sin cambio de otras características (tabla 3).

Tabla 3.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Variante de glucoamilasa, que tiene una propiedad mejorada con respecto a la glucoamilasa precursora que consiste en el polipéptido de la SED ID N.° 3, en la que las propiedades mejoradas son una mayor termoestabilidad y una mayor tolerancia a la glucosa, que comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 95, 59, 119, 121, 19 y 426 del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3, donde la variante tiene actividad glucoamilasa y donde la variante tiene al menos 90 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 3, y donde la variante comprende al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones:

V59C A426G;

V59G A426G;

V59C S95P T119W A426G;

V59C S95P T119W A121P A426G;

V59C S95P A121P A426G; o

V18F V59I S95P T119W A121P.

2. Composición que comprende el polipéptido según la reivindicación 1.

3. Composición según la reivindicación 2, que incluye una alfa-amilasa y un polipéptido de la reivindicación 1.

4. Uso de un polipéptido según la reivindicación 1 para la producción de jarabe y/o de un producto de fermentación.

5. Proceso de producción de un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón que incluye los pasos de:

(a) licuefacción de material que contiene almidón en presencia de una alfa amilasa;

(b) sacarificación del material licuado; y

(c) fermentación con un organismo fermentador;

donde el paso (a) y/o paso (b) se realizan usando al menos una variante de glucoamilasa según la reivindicación 1.

6. Proceso de producción de un producto de jarabe de material que contiene almidón, que comprende los pasos de:

(a) licuefacción de material que contiene almidón en presencia de una alfa amilasa;

(b) sacarificación del material licuado en presencia de una variante de glucoamilasa según la reivindicación 1.

7. Polinucleótido aislado que codifica la variante según la reivindicación 1.

8. Construcción de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido según la reivindicación 7.

9. Vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 7.

10. Célula hospedadora que comprende el polinucleótido según la reivindicación 7.

11. Proceso de producción de una variante de glucoamilasa, que comprende:

cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 10 en las condiciones adecuadas para la expresión de la variante y recuperar la variante de glucoamilasa