BR122022018788B1 - Variantes de glucoamilase, composição, uso de um polipeptídeo, processo de produção de um produto de fermentação, processo de produção de um produto de xarope, polinucleotídeos isolado, constructo de ácido nucleico, vetor de expressão e célula hospedeira - Google Patents

Abstract

A presente invenção se relaciona com variantes de glucoamilase. A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando as variantes; constructos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de uso das variantes.

Description

[001] Dividido do BR 112015026972-9, depositado em 29/04/2014.

Referência a uma Listagem de Sequências

[002] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é incorporada aqui por referência.

Antecedentes da Invenção Área da Invenção

[003] A presente invenção se relaciona com variantes de glucoamilase, polinucleotídeos codificando as variantes, métodos de produção das variantes, e métodos de uso das variantes. É também descrito aqui o uso de glucoamilases da invenção para conversão de amido para produzir produtos de fermentação, tais como etanol, e xaropes, tais como glucose. A invenção se relaciona também com uma composição compreendendo uma glucoamilase da invenção.

Descrição da Técnica Relacionada

[004] A glucoamilase (1,4-alfa-D-glucana glucoidrolase, EC 3.2.1.3) é uma enzima, que catalisa a liberação de D-glucose das extremidades não redutoras de amido ou moléculas de oligo- ou polissacarídeo relacionadas. As glucoamilases são produzidas por vários fungos filamentosos e levedura, com aqueles de Aspergillus sendo comercialmente as mais importantes.

[005] Comercialmente, as glucoamilases são usadas para converter material contendo amido, que já está parcialmente hidrolisado por uma alfa-amilase, em glucose. A glucose pode ser depois direta ou indiretamente convertida em um produto de fermentação usando um organismo fermentador. Exemplos de produtos de fermentação comerciais incluem álcoois (p.ex., etanol, metanol, butanol, 1,3-propanodiol); ácidos orgânicos (p.ex., ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido glucônico, gluconato, ácido láctico, ácido succínico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico); cetonas (p.ex., acetona); aminoácidos (p.ex., ácido glutâmico); gases (p.ex., H2 e CO2), e compostos mais complexos, incluindo, por exemplo, antibióticos (p.ex., penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (p.ex., riboflavina, B12, beta-caroteno); hormônios, e outros compostos que são difíceis de produzir sinteticamente. Processos de fermentação são também comummente usados nas indústrias de álcool consumível (p.ex., cerveja e vinho), lacticínios (p.ex., na produção de iogurte e queijo).

[006] O produto final pode ser também xarope. Por exemplo, o produto final pode ser glucose, mas pode ser também convertido, p.ex., por glucose isomerase em frutose ou uma mistura composta quase igualmente por glucose e frutose. Esta mistura, ou uma mistura adicionalmente enriquecida com frutose, é o xarope de milho com alta frutose (HFCS) o mais comummente usado comercializado em todo o mundo.

[007] É um objetivo da presente invenção proporcionar polipeptídeos tendo atividade de glucoamilase e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos e que proporcionam um elevado rendimento em processos de produção de produtos de fermentação, tais como processos de produção de etanol, incluindo processos de fermentação de etanol de um passo a partir de amido bruto (ou não cozido) não gelatinizado.

[008] WO2011/068803 divulga glucoamilases isoladas do fungo Gloeophyllum. Em particular de Gloeophyllum sepiarium e Gloeophyllum trabeum.

[009] A presente invenção proporciona variantes de glucoamilase com propriedades melhoradas em comparação com o seu genitor.

Resumo da Invenção

[0010] A presente invenção se relaciona com uma variante de glucoamilase, compreendendo uma substituição em uma ou mais posições correspondendo às posições 95, 59, 119, 121, 18, 426, e 316 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[0011] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos isolados codificando as variantes; constructos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de produção das variantes.

[0012] A presente invenção se relaciona adicionalmente com composições compreendendo as glucoamilases variantes da invenção.

[0013] Em outro aspeto, a presente invenção se relaciona com um uso da glucoamilase variante para produção de um xarope ou um produto de fermentação.

[0014] Ainda em aspetos adicionais, a presente invenção se relaciona com um processo de produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo os passos de: (a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito; e (c) fermentação com um organismo fermentador;

[0015] em que o passo (a) e/ou passo (b) são levados a cabo usando pelo menos uma glucoamilase variante da invenção.

[0016] Em um aspeto adicional, a presente invenção se relaciona com um processo de produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido, compreendendo os passos de: (a) sacarificação de material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido; e (b) fermentação com um organismo fermentador, em que o passo (a) é levado a cabo usando pelo menos uma glucoamilase variante da invenção.

Definições

[0017] Glucoamilase: O termo "glucoamilase" (1,4- alfa-D-glucana glucoidrolase, EC 3.2.1.3) é definido como uma enzima, que catalisa a liberação de D-glucose das extremidades não redutoras de amido ou moléculas de oligo- ou polissacarídeo relacionadas. Para propósitos da presente invenção, a atividade de glucoamilase é determinada de acordo com o procedimento descrito nos Exemplos aqui. A Unidade de Glucoamilase (AGU) é definida como a quantidade de enzima, que hidrolisa 1 micromole de maltose por minuto sob as condições padrão 37 °C, pH 4,3, substrato: maltose 23,2 mM, tampão: acetato 0,1 M, tempo de reação 5 minutos.

[0018] Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20 %, preferencialmente pelo menos 40 %, preferencialmente pelo menos 45 %, mais preferencialmente pelo menos 50 %, mais preferencialmente pelo menos 55 %, mais preferencialmente pelo menos 60 %, mais preferencialmente pelo menos 65 %, mais preferencialmente pelo menos 70 %, mais preferencialmente pelo menos 75 %, mais preferencialmente pelo menos 80 %, mais preferencialmente pelo menos 85 %, ainda mais preferencialmente pelo menos 90 %, o mais preferencialmente pelo menos 95 %, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 100 % da atividade de glucoamilase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[0019] Em outra forma de realização, os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20 %, preferencialmente pelo menos 40 %, preferencialmente pelo menos 45 %, mais preferencialmente pelo menos 50 %, mais preferencialmente pelo menos 55 %, mais preferencialmente pelo menos 60 %, mais preferencialmente pelo menos 65 %, mais preferencialmente pelo menos 70 %, mais preferencialmente pelo menos 75 %, mais preferencialmente pelo menos 80 %, mais preferencialmente pelo menos 85 %, ainda mais preferencialmente pelo menos 90 %, o mais preferencialmente pelo menos 95 %, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 100 % da atividade de glucoamilase do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[0020] Variante alélica: O termo "variante alélica" significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0021] cDNA: O termo "cDNA" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura, processada, obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que possam estar presentes no correspondente DNA genômico. O transcrito de RNA primário, inicial, é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA maduro processado.

[0022] Sequência codificante: O termo "sequência codificante" significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de uma variante. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG, ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético, ou uma sua combinação.

[0023] Sequências de controle: O termo "sequências de controle" significa sequências de ácido nucleico necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa do (i.e., do mesmo gene) ou estranha (i.e., de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando a variante ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal, e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sequências de terminação transcricional e translacional. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificante do polinucleotídeo codificando uma variante.

[0024] Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer passo envolvido na produção de uma variante incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós- transcricional, tradução, modificação pós-translacional, e secreção.

[0025] Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando uma variante e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.

[0026] Fragmento: O termo "fragmento" significa um polipeptídeo tendo um ou mais (p.ex., vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade de glucoamilase. Em um aspeto, um fragmento contém pelo menos 454 resíduos de aminoácidos (p.ex., aminoácidos 18 a 471 de SEQ ID NO: 2 ou 1 a 454 de SEQ ID NO: 3), compreendendo o domínio catalítico e tendo uma ou mais das substituições de acordo com a invenção.

[0027] Condições de elevada estringência: O termo "condições de elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré- hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 65 °C.

[0028] Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução, ou similares com um constructo de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0029] Propriedade melhorada: O termo "propriedade melhorada" significa uma característica associada a uma variante que é melhorada em comparação com o genitor. Tais propriedades melhoradas incluem, mas não estão limitadas a, atividade específica, tolerância à glucose, e termoestabilidade.

[0030] Isolado: O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente com os quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (p.ex., múltiplas cópias de um gene codificando a substância ou uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0031] Condições de baixa estringência: O termo "condições de baixa estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 50 °C.

[0032] Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspeto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 18 a 576 de SEQ ID NO: 2. Os aminoácidos 1 a 17 de SEQ ID NO: 2 são um peptídeo sinal. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. O polipeptídeo maduro é divulgado aqui como SEQ ID NO: 3.

[0033] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo "sequência codificante do polipeptídeo maduro" significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de glucoamilase. Em um aspeto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro é os nucleotídeos 52 a 1728 (ou 1731 incluindo o códon de terminação) de SEQ ID NO: 1. Os nucleotídeos 1 a 51 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo sinal.

[0034] Condições de média estringência: O termo "condições de média estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 55 °C.

[0035] Condições de média-elevada estringência: O termo "condições de média-elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 60 °C.

[0036] Constructo de ácido nucleico: O termo "constructo de ácido nucleico" significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que de outra maneira não existiria na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0037] Operacionalmente ligado: O termo "operacionalmente ligado" significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.

[0038] Genitor ou glucoamilase genitora: O termo "genitor" ou "glucoamilase genitora" significa uma glucoamilase à qual é feita uma alteração para produzir as variantes de enzima da presente invenção. O genitor pode ser um polipeptídeo (tipo selvagem) que ocorre naturalmente ou uma sua variante ou fragmento.

[0039] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro "identidade de sequência".

[0040] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue:

[0041] (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[0042] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue:

[0043] (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[0044] Subsequência: O termo "subsequência" significa um polinucleotídeo tendo um ou mais (p.ex., vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante do polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento tendo atividade de glucoamilase. Em um aspeto, uma subsequência codifica pelo menos o domínio catalítico da variante de acordo com a invenção. P.ex., contém pelo menos 1362 nucleotídeos (p.ex., nucleotídeos 52 a 1413 de SEQ ID NO: 1).

[0045] Variante: O termo "variante" significa um polipeptídeo tendo atividade de glucoamilase compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção, e/ou deleção, em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Uma substituição significa substituição do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente e imediatamente a seguir ao aminoácido ocupando uma posição. As variantes da presente invenção têm pelo menos 20 %, p.ex., pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, mais preferencialmente pelo menos 50 %, mais preferencialmente pelo menos 55 %, mais preferencialmente pelo menos 60 %, mais preferencialmente pelo menos 65 %, mais preferencialmente pelo menos 70 %, mais preferencialmente pelo menos 75 %, mais preferencialmente pelo menos 80 %, mais preferencialmente pelo menos 85 %, ainda mais preferencialmente pelo menos 90 %, o mais preferencialmente pelo menos 95 %, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 100 % da atividade de glucoamilase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 divulgado como SEQ ID NO: 3.

[0046] Condições de muito elevada estringência: O termo "condições de muito elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 70 °C.

[0047] Condições de muito baixa estringência: O termo "condições de muito baixa estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré- hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 45 °C.

[0048] Glucoamilase de tipo selvagem: O termo glucoamilase de "tipo selvagem" significa uma glucoamilase expressa por um microrganismo ocorrendo naturalmente, tal como uma bactéria, levedura, ou fungo filamentoso encontrado na natureza.

[0049] Convenções para Designação de Variantes

[0050] Para propósitos da presente invenção, o polipeptídeo maduro divulgado em SEQ ID NO: 3 é usado para se determinar o resíduo de aminoácido correspondente em outra glucoamilase. A sequência de aminoácidos de outra glucoamilase é alinhada com o polipeptídeo maduro divulgado em SEQ ID NO: 3, e, com base no alinhamento, o número de posição do aminoácido correspondendo a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptídeo maduro divulgado em SEQ ID NO: 3 é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62).

[0051] A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em outra glucoamilase pode ser determinada por um alinhamento de múltiplas sequências de polipeptídeos usando vários programas de computador incluindo, mas não se limitando a, MUSCLE (comparação de múltiplas sequências por expectativa log; versão 3.5 ou superior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900), e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando seus respectivos parâmetros de definição.

[0052] Quando a outra enzima divergiu do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 tal que a comparação tradicional baseada em sequências falha em detectar a sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615) podem ser usados outros algoritmos de comparação de sequência par a par. Pode ser alcançada maior sensibilidade na pesquisa com base em sequências usando programas de pesquisa que utilizam representações probabilísticas de famílias de polipeptídeos (perfis) para pesquisar bases de dados. Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis através de um processo iterativo de pesquisa de bases de dados e é capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Pode ser alcançada ainda maior sensibilidade se a família ou superfamília para o polipeptídeo tiver um ou mais representantes nas bases de dados de estrutura de proteína. Programas tais como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizam informação de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamentos estruturais, e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prevê a dobragem estrutural para uma sequência de consulta. Similarmente, o método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados SCOP. Estes alinhamentos podem por sua vez ser usados para gerar modelos de homologia para o polipeptídeo, e tais modelos podem ser avaliados quanto à precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para esse propósito.

[0053] Para proteínas de estrutura conhecida estão disponíveis várias ferramentas e recursos para recuperar e gerar alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias de proteínas SCOP foram estruturalmente alinhadas, e esses alinhamentos estão acessíveis e podem ser baixados. Duas ou mais estruturas de proteína podem ser alinhadas usando uma variedade de algoritmos tais como a matriz de alinhamento de distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatória (Shindyalov e Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), e pode ser adicionalmente utilizada implementação destes algoritmos para consultar bases de dados de estruturas com uma estrutura de interesse de modo a descobrir possíveis homólogos estruturais (p.ex., Holm e Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

[0054] Ao descrever as variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita em baixo é adaptada para facilidade de referência. É usada a abreviatura de aminoácidos de letra única ou três letras da IUPAC aceite.

[0055] Substituições. Para uma substituição de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Conformemente, a substituição de treonina na posição 226 por alanina é designada como "Thr226Ala" ou "T226A". Mutações múltiplas são separadas por sinais de adição ("+"), p.ex., "Gly205Arg + Ser411Phe" ou "G205R + S411F", representando substituições nas posições 205 e 411 da glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

[0056] Deleções. Para uma deleção de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição*. Conformemente, a deleção de glicina na posição 195 é designada como "Gly195*" ou "G195*". Deleções múltiplas são separadas por sinais de adição ("+"), p.ex., "Gly195* + Ser411*" ou "G195* + S411*".

[0057] Inserções. Para uma inserção de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. Conformemente, a inserção de lisina após glicina na posição 195 é designada "Gly195GlyLys" ou "G195GK". Uma inserção de múltiplos aminoácidos é designada [Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido #1, aminoácido inserido #2; etc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após glicina na posição 195 é indicada como "Gly195GlyLysAla" ou "G195GKA".

[0058] Em tais casos, o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s) é(são) numerado(s) pela adição de minúsculas ao número de posição do resíduo de aminoácido precedendo o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s). No exemplo acima, a sequência seria então:

[0059] Alterações múltiplas. Variantes compreendendo múltiplas substituições são separadas por sinais de adição ("+"), p.ex., "Arg170Tyr+Gly195Glu" ou "R170Y+G195E" representando uma substituição de arginina e glicina nas posições 170 e 195 por tirosina e ácido glutâmico, respectivamente.

[0060] Diferentes alterações. Onde alterações diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes são separadas por uma vírgula, p.ex., "Arg170Tyr,Glu" representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico. Assim, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" designa as seguintes variantes:

[0061] "Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly", e "Tyr167Ala+Arg170Ala".

Descrição Detalhada da Invenção

[0062] A presente invenção se relaciona com variantes de glucoamilase, compreendendo uma substituição em uma ou mais (p.ex., várias) posições correspondendo às posições 59, 95, 119, 121, 18, 426, e 316 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, em que a variante tem atividade de glucoamilase. Em particular, as variantes têm propriedades melhoradas em comparação com a glucoamilase divulgada como SEQ ID NO: 3. Particularmente, as propriedades melhoradas são termoestabilidade melhorada, tolerância à glucose melhorada e/ou atividade específica aumentada. As variantes de acordo com a invenção têm pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[0063] O polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 corresponde a SEQ ID NO: 3. Assim, os números de posição referidos aqui correspondem aos números de posição de SEQ ID NO: 3.

[0064] Variantes

[0065] A presente invenção proporciona variantes de glucoamilase, compreendendo uma alteração, em particular uma substituição, em uma ou mais (p.ex., várias) posições correspondendo às posições 59, 95, 119, 121, 18, 426, e 316, e as variantes têm atividade de glucoamilase.

[0066] Em uma forma de realização, a variante está isolada.

[0067] Em uma forma de realização, a variante tem identidade de sequência de pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, com a sequência de aminoácidos da glucoamilase genitora.

[0068] Em outra forma de realização, a variante tem pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, tal como pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. O polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é em uma forma de realização SEQ ID NO: 3.

[0069] Assim, em uma forma de realização, a presente invenção se relaciona com uma variante de glucoamilase, compreendendo uma substituição em uma ou mais posições correspondendo às posições 95, 59, 119, 121, 18, 426, e 316 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[0070] Em outro aspeto, uma variante compreende uma substituição em uma ou mais posições correspondendo às posições 59, 95, 119, 121, 18, 426, e 316. Em outro aspeto, uma variante compreende uma substituição em duas posições correspondendo a qualquer uma das posições 59, 95, 119, 121, 18, 426, e 316. Em outro aspeto, uma variante compreende uma substituição em três posições correspondendo a qualquer uma das posições 59, 95, 119, 121, 18, 426, e 316. Em outro aspeto, uma variante compreende uma substituição em quatro posições correspondendo a qualquer uma das posições 59, 95, 119, 121, 18, 426, e 316. Em outro aspeto, uma variante compreende uma substituição em cinco posições correspondendo a qualquer uma das posições 59, 95, 119, 121, 18, 426, e 316. Em outro aspeto, uma variante compreende uma substituição em seis posições correspondendo a qualquer uma das posições 59, 95, 119, 121, 18, 426, e 316. Em outro aspeto, uma variante compreende uma substituição em cada posição correspondendo às posições 59, 95, 119, 121, 18, 426, e 316.

[0071] Em outro aspeto, a alteração de variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 18. Em outro aspeto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 18 está substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, ou Tyr, preferencialmente por Phe. Em outro aspeto, a alteração de variante compreende a ou consiste na substituição V18F do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[0072] Em outro aspeto, a alteração de variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 59. Em outro aspeto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 59 está substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, ou Tyr, preferencialmente por Ala, Cys, Gly ou Ile. Em outro aspeto, a alteração de variante compreende a ou consiste na substituição V59A, V59C, V59G, ou V59I do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[0073] Em outro aspeto, a alteração de variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 95. Em outro aspeto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 95 está substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferencialmente por Pro. Em outro aspeto, a alteração de variante compreende a ou consiste na substituição S95P do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[0074] Em outro aspeto, a alteração de variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 119. Em outro aspeto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 119 está substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr, ou Val, preferencialmente por Trp. Em outro aspeto, a alteração de variante compreende a ou consiste na substituição T119W do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[0075] Em outro aspeto, a alteração de variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 121. Em outro aspeto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 121 está substituído por Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferencialmente por Pro. Em outro aspeto, a alteração de variante compreende a ou consiste na substituição A121P do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[0076] Em outro aspeto, a alteração de variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 316. Em outro aspeto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 316 está substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferencialmente por Trp. Em outro aspeto, a alteração de variante compreende a ou consiste na substituição S316W do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[0077] Em outro aspeto, a alteração de variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 426. Em outro aspeto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 426 está substituído por Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val, preferencialmente por Gly. Em outro aspeto, a alteração de variante compreende a ou consiste na substituição A426G do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[0078] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 18 e 59, tais como aquelas descritas acima.

[0079] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 18 e 95, tais como aquelas descritas acima.

[0080] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 18 descritas acima.

[0081] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 18 descritas acima.

[0082] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 18 descritas acima.

[0083] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 18 descritas acima.

[0084] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59 descritas acima.

[0085] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59 descritas acima.

[0086] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59 descritas acima.

[0087] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59 descritas acima.

[0088] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59 e 426, tais como aquelas descritas acima.

[0089] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 95 e 119, tais como aquelas descritas acima.

[0090] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 95 e 121, tais como aquelas descritas acima.

[0091] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 95 e 316, tais como aquelas descritas acima.

[0092] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 95 e 426, tais como aquelas descritas acima.

[0093] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 119 e 121, tais como aquelas descritas acima.

[0094] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 119 e 316, tais como aquelas descritas acima.

[0095] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 119 e 426, tais como aquelas descritas acima.

[0096] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 121 e 316, tais como aquelas descritas acima.

[0097] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 121 e 426, tais como aquelas descritas acima.

[0098] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 316 e 426, tais como aquelas descritas acima.

[0099] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59, 95, e 119, tais como aquelas descritas acima.

[00100] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59, 95, e 121, tais como aquelas descritas acima.

[00101] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59, 95, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00102] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59, 119, e 121, tais como aquelas descritas acima.

[00103] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59, 119, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00104] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 95, 119, e 121, tais como aquelas descritas acima.

[00105] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 95, 119, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00106] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 119, 121, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00107] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59, 95, e 18, tais como aquelas descritas acima.

[00108] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59, 95, e 426, tais como aquelas descritas acima.

[00109] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59, 119, e 18, tais como aquelas descritas acima.

[00110] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59, 119, e 426, tais como aquelas descritas acima.

[00111] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59, 121, e 18, tais como aquelas descritas acima.

[00112] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59, 121, e 426, tais como aquelas descritas acima.

[00113] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59, 121, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00114] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59, 18, e 426, tais como aquelas descritas acima.

[00115] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59, 18, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00116] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 59, 426, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00117] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 95, 119, e 18, tais como aquelas descritas acima.

[00118] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 95, 119, e 426, tais como aquelas descritas acima.

[00119] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 95, 121, e 18, tais como aquelas descritas acima.

[00120] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 95, 121, e 426, tais como aquelas descritas acima.

[00121] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 95, 121, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00122] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 95, 18, e 426, tais como aquelas descritas acima.

[00123] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 95, 18, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00124] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 95, 426, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00125] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 119, 121, e 18, tais como aquelas descritas acima.

[00126] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 119, 121, e 426, tais como aquelas descritas acima.

[00127] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 119, 18, e 426, tais como aquelas descritas acima.

[00128] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 119, 18, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00129] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 119, 426, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00130] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 121, 18, e 426, tais como aquelas descritas acima.

[00131] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 121, 18, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00132] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 121, 426, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00133] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 18, descritas acima.

[00134] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00135] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00136] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00137] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00138] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00139] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00140] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00141] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00142] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00143] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00144] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00145] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00146] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00147] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima. 95, 121, e 316, tais como as alterações de variante substituições em posições 95, 18, e 426, tais como as alterações de variante substituições em posições 95, 18, e 316, tais como as alterações de variante substituições em posições 95, 426, e 316, tais como as alterações de variante substituições em posições 119, 121, e 18, tais como as alterações de variante substituições em posições 119, 121, e 426, tais como as alterações de variante substituições em posições 119, 121, e 316, tais como as alterações de variante substituições em posições 119, 18, e 426, tais como

[00148] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00149] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00150] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00151] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00152] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00153] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 59, aquelas descritas acima.

[00154] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 95, aquelas descritas acima.

[00155] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em as alterações de variante substituições em posições 119, 18, e 316, tais como as alterações de variante substituições em posições 119, 426, e 316, tais como as alterações de variante substituições em posições 121, 18, e 426, tais como as alterações de variante substituições em posições 121, 18, e 316, tais como as alterações de variante substituições em posições 121, 426, e 316, tais como as alterações de variante substituições em posições 18, 426, e 316, tais como as alterações de variante substituições em posições 119, 121, e 18, tais como as alterações de variante substituições em posições correspondendo às posições 95, aquelas descritas acima.

[00156] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 95, aquelas descritas acima.

[00157] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 95, aquelas descritas acima.

[00158] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 95, aquelas descritas acima.

[00159] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 95, aquelas descritas acima.

[00160] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 95, aquelas descritas acima.

[00161] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 95, aquelas descritas acima.

[00162] Em outro aspeto, compreendem ou consistem em correspondendo às posições 95, aquelas descritas acima. 119, 121, e 426 tais como as alterações de variante substituições em posições 119, 121, e 316, tais como as alterações de variante substituições em posições 119, 18, e 426, tais como as alterações de variante substituições em posições 119, 18, e 316, tais como as alterações de variante substituições em posições 119, 426, e 316, tais como as alterações de variante substituições em posições 121, 18, e 426, tais como as alterações de variante substituições em posições 121, 18, e 316, tais como as alterações de variante substituições em posições 121, 426, e 316, tais como

[00163] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 95, 18, 426, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00164] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 119, 121, 18, e 426, tais como aquelas descritas acima.

[00165] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 119, 121, 18, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00166] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 119, 121, 426, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00167] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 119, 18, 426, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00168] Em outro aspeto, as alterações de variante compreendem ou consistem em substituições em posições correspondendo às posições 121, 18, 426, e 316, tais como aquelas descritas acima.

[00169] Em outro aspeto, a variante compreende as ou consiste nas substituições específicas ou combinações de substituições específicas abaixo listadas do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3: V18F; ou V59A; ou V59C; ou V59G; ou V59I; ou S95P; ou T119W; ou A121P; ou A426G; ou S316W; ou S95P+A121P; ou V59A+S95P; ou S95P+T119W; ou V59A+S95P+A121P; ou S95P+T119W+A121P; ou V59C+A426G; ou V59G+A426G; ou V18F+V59I; ou V59C+S95P+T119W+A426G; ou V59C+S95P+T119W+A121P+A426G; ou V59C+S95P+A121P+A426G; ou V18F+V59I+S95P+A121P; ou V18F+V59I+S95P+T119W+A121P; ou S95P+A121P+S316W; e em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00170] Em outra forma de realização, a variante compreende as ou consiste nas substituições específicas ou combinações de substituições específicas abaixo listadas do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3: V59A; ou S95P; ou T119W; ou A121P; ou S95P+A121P; ou V59A+S95P; ou S95P+T119W; ou V59A+S95P+A121P; ou S95P+T119W+A121P; e em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00171] Se mostrou aqui que estas substituições e combinações de substituições específicas aumentam a termoestabilidade da glucoamilase variante em comparação com a glucoamilase de SEQ ID NO: 3.

[00172] Em outra forma de realização, a variante compreende as ou consiste nas substituições específicas ou combinações de substituições específicas abaixo listadas do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3: V59C+S95P+T119W+A426G; ou V59C+S95P+T119W+A121P+A426G; ou V59C+S95P+A121P+A426G; ou V18F+V59I+S95P+A121P; ou V18F+V59I+S95P+T119W+A121P; e em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00173] Se mostrou aqui que estas substituições e combinações de substituições específicas aumentam a termoestabilidade bem como reduzem a inibição pela glucose da glucoamilase variante de acordo com a invenção.

[00174] Em outra forma de realização, a variante compreende as ou consiste nas substituições específicas ou combinações de substituições específicas abaixo listadas do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3:

[00175] S95P+A121P+S316W; e em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00176] Se mostrou aqui que esta combinação de substituições aumenta a termoestabilidade bem como aumenta a atividade específica da glucoamilase variante de acordo com a invenção.

[00177] Em uma forma de realização é proporcionada termoestabilidade melhorada das variantes de glucoamilase de acordo com a invenção por introdução de uma ou mais das substituições selecionadas do grupo consistindo em 59A, 95P, 119W, e 121P, e em particular uma variante de glucoamilase compreendendo as substituições 95P + 121P, mais particularmente S95P + A121P, e em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00178] Em outra forma de realização é proporcionada inibição pela glucose reduzida das variantes de glucoamilase de acordo com a invenção por introdução de uma ou mais das combinações de substituições selecionadas do grupo consistindo em 59C + 426G, 59G + 426G, e 18F + 59I, mais particularmente V59C + A426G, ou V59G + A426G, ou V18F + V59I, e em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00179] Em outra forma de realização é proporcionada atividade específica aumentada das variantes de glucoamilase de acordo com a invenção por introdução da substituição 316W, particularmente S316W, e em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00180] Em uma forma de realização particular, a atividade específica da glucoamilase variante pode ser melhorada por remoção do domínio de ligação do amido (SBD) resultando assim na forma G2 da variante. Em uma forma de realização particular, os aminoácidos 455-559 de SEQ ID NO: 3 estão removidos na forma G2. Isto foi observado para a forma G2 das variantes compreendendo S95P+A121P+S316W ou S95P+A121P como mostrado nos exemplos.

[00181] Assim, em uma forma de realização particular, é proporcionada atividade específica aumentada das variantes de glucoamilase de acordo com a invenção por remoção do SBD, em particular 455-559 de SEQ ID NO: 3, mais particularmente em uma variante compreendendo S95P+A121P+S316W ou S95P+A121P e em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00182] As variantes podem adicionalmente compreender uma ou mais substituições adicionais em uma ou mais (p.ex., duas, várias) outras posições.

[00183] Deve ser notado que, para todas as variantes específicas divulgadas, tal variação adicional poderia ser introduzida sem afetar significativamente as propriedades das variantes de glucoamilase. Em um aspeto, o número de substituições nas variantes da presente invenção adicionalmente às substituições específicas divulgadas aqui é 1-20, p.ex., 1-10 e 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições.

[00184] Portanto, a % de identidade do polipeptídeo variante em comparação com o polipeptídeo genitor de SEQ ID NO: 3 pode ser pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, tal como pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00185] Em uma forma de realização particular, as variantes acima têm atividade de glucoamilase, e a variante tem pelo menos 85 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00186] Em uma forma de realização particular, as variantes acima têm atividade de glucoamilase, e a variante tem pelo menos 90 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00187] Em uma forma de realização particular, as variantes acima têm atividade de glucoamilase, e a variante tem pelo menos 91 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00188] Em uma forma de realização particular, as variantes acima têm atividade de glucoamilase, e a variante tem pelo menos 92 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00189] Em uma forma de realização particular, as variantes acima têm atividade de glucoamilase, e a variante tem pelo menos 93 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00190] Em uma forma de realização particular, as variantes acima têm atividade de glucoamilase, e a variante tem pelo menos 94 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00191] Em uma forma de realização particular, as variantes acima têm atividade de glucoamilase, e a variante tem pelo menos 95 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00192] Em uma forma de realização particular, as variantes acima têm atividade de glucoamilase, e a variante tem pelo menos 96 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00193] Em uma forma de realização particular, as variantes acima têm atividade de glucoamilase, e a variante tem pelo menos 97 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00194] Em uma forma de realização particular, as variantes acima têm atividade de glucoamilase, e a variante tem pelo menos 98 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00195] Em uma forma de realização particular, as variantes acima têm atividade de glucoamilase, e a variante tem pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00196] As mudanças de aminoácidos que podem estar presentes adicionalmente às substituições específicas descritas aqui podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga total ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[00197] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

[00198] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade quanto ao substrato, mudar o pH ótimo, e similares.

[00199] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura da alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, mutações de alanina simples são introduzidas em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade de glucoamilase para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 46994708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[00200] Em uma forma de realização, a variante tem atividade específica melhorada em comparação com a enzima genitora. A atividade específica foi determinada usando o ensaio AGU.

[00201] Em uma forma de realização, a variante tem tolerância à glucose melhorada (ou inibição pela glucose reduzida) em comparação com o genitor. A inibição pela glucose foi determinada como a razão da atividade de glucoamilase com e sem glucose a 30 % em relação à enzima genitora de wt divulgada como SEQ ID NO: 3. Para detalhes ver a seção Materiais e Métodos incluídos aqui.

[00202] Em uma forma de realização, a variante tem termoestabilidade melhorada em comparação com a enzima genitora. A termoestabilidade foi medida como atividade residual a 32 °C usando o estojo de ensaio Kikkoman. Para detalhes ver a seção Materiais e Métodos aqui.

[00203] Glucoamilases genitoras

[00204] A glucoamilase genitora pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de média-elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (ii) o seu complemento de comprimento total de (i); ou (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 70 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[00205] Em um aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que têm atividade de glucoamilase. Em um aspeto, a sequência de aminoácidos do genitor difere em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00206] Em outro aspeto, o genitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em outro aspeto, o genitor compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste em SEQ ID NO: 3.

[00207] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00208] Em outro aspeto, o genitor é codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência, com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (ii) o complemento de comprimento total de (i) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[00209] O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, ou uma sua subsequência, bem como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento, pode ser usado para desenhar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando um genitor de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente aí. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, p.ex., pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, p.ex., pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina, ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[00210] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto a DNA que hibrida com as sondas descritas acima e codifica um genitor. O DNA genômico ou outro de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para, e imobilizado em, nitrocelulose ou outro material transportador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que hibrida com SEQ ID NO: 1 ou uma sua subsequência, o material transportador é usado em uma transferência de Southern.

[00211] Para propósitos da presente invenção, hibridação indica que o polinucleotídeo hibrida com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo a (i) SEQ ID NO: 1; (ii) à sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; (iii) ao seu complemento de comprimento total; ou (iv) uma sua subsequência; sob condições de muito baixa a muito elevada estringência. As moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibrida sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[00212] Em um aspeto, a sonda de ácido nucleico é a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1. Em outro aspeto, a sonda de ácido nucleico é os nucleotídeos 52 a 1728 de SEQ ID NO: 1. Em outro aspeto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2; o seu polipeptídeo maduro; ou um seu fragmento. Em outro aspeto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1.

[00213] Em outra forma de realização, o genitor é codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %.

[00214] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de outro polipeptídeo.

[00215] Um genitor pode ser um polipeptídeo de fusão ou polipeptídeo de fusão clivável ao qual outro polipeptídeo está fundido no terminal N ou terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando um outro polipeptídeo com um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligação das sequências codificantes codificando os polipeptídeos tal que fiquem em grelha e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[00216] Um polipeptídeo de fusão pode adicionalmente compreender um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins- Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[00217] O genitor pode ser obtido a partir de microrganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo "obtido de" como usado aqui em conexão com uma dada fonte deve significar que o genitor codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma estirpe na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspeto, o genitor é secretado extracelularmente.

[00218] O genitor pode ser uma glucoamilase fúngica. Por exemplo, o genitor pode ser uma glucoamilase de Gloeophyllum, ou Trametes.

[00219] Em outro aspeto, o genitor é uma glucoamilase de Gloeophyllum trabeum, Gloeophyllum sepiarium, ou Trametes cingulata.

[00220] Em outro aspeto, o genitor é uma glucoamilase de Gloeophyllum trabeum, p.ex. a glucoamilase de SEQ ID NO: 2 ou o seu polipeptídeo maduro.

[00221] Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, p.ex., anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Aqueles peritos na técnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes apropriados.

[00222] Estirpes destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de culturas, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[00223] O genitor pode ser identificado e obtido de outras fontes, incluindo microrganismos isolados da natureza (p.ex., solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (p.ex., solo, compostos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando o genitor pode ser depois obtido por rastreio similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídeo codificando um genitor com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas daqueles de perícia vulgar na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).

[00224] Preparação de Variantes

[00225] As variantes podem ser preparadas usando qualquer procedimento de mutagênese conhecido na técnica, tal como mutagênese sítio-dirigida, construção de gene sintética, construção de gene semissintética, mutagênese aleatória, embaralhamento, etc.

[00226] A mutagênese sítio-dirigida é uma técnica na qual uma ou mais (p.ex., várias) mutações são introduzidas em um ou mais locais definidos em um polinucleotídeo codificando o genitor.

[00227] A mutagênese sítio-dirigida pode ser alcançada in vitro por PCR envolvendo o uso de iniciadores de oligonucleotídeos contendo a mutação desejada. A mutagênese sítio-dirigida pode ser também realizada in vitro por mutagênese de cassete envolvendo a clivagem por uma enzima de restrição em um local no plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codificando o genitor e subsequente ligação de um oligonucleotídeo contendo a mutação no polinucleotídeo. Usualmente, a enzima de restrição que digere o plasmídeo e o oligonucleotídeo é a mesma, permitindo que as extremidades viscosas do plasmídeo e da inserção se liguem umas às outras. Ver, p.ex., Scherer e Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; e Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[00228] A mutagênese sítio-dirigida pode ser também alcançada in vivo por métodos conhecidos na técnica. Ver, p.ex., Publicação do Pedido de Patente dos E.U.A. No. 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; e Calissano e Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

[00229] Pode ser usado qualquer procedimento de mutagênese sítio-dirigida na presente invenção. Existem muitos estojos comerciais disponíveis que podem ser usados para preparar variantes.

[00230] A construção de gene sintética implica síntese in vitro de uma molécula de polinucleotídeo desenhada para codificar um polipeptídeo de interesse. A síntese de gene pode ser realizada utilizando um número de técnicas, tal como a tecnologia à base de microchip em multiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) e tecnologias similares em que oligonucleotídeos são sintetizados e montados em chips microfluídicos fotoprogramáveis.

[00231] Substituições, deleções, e/ou inserções simples ou múltiplas de aminoácidos podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreio relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 5357; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 21522156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição de fagos (p.ex., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente dos E.U.A. No. 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese direcionada para região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[00232] Podem ser combinados métodos de mutagênese/embaralhamento com métodos de rastreio automatizados, de elevado rendimento, para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados, expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[00233] A construção de gene semissintética é alcançada por combinação de aspetos da construção de gene sintética, e/ou mutagênese sítio-dirigida, e/ou mutagênese aleatória, e/ou embaralhamento. A construção semissintética é tipificada por um processo utilizando fragmentos de polinucleotídeos que são sintetizados, em combinação com técnicas de PCR. Regiões definidas de genes podem assim ser sintetizadas de novo, enquanto outras regiões podem ser amplificadas usando iniciadores mutagênicos sítio- específicos, enquanto outras regiões ainda podem estar sujeitas a amplificação por PCR propensa a erros ou PCR não propensa a erros. Subsequências de polinucleotídeos podem ser depois embaralhadas.

[00234] Polinucleotídeos

[00235] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos isolados codificando uma variante da presente invenção.

[00236] Constructos de Ácido Nucleico

[00237] A presente invenção se relaciona também com constructos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[00238] O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de modo a proporcionar expressão de uma variante. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[00239] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão da variante. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[00240] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos constructos de ácidos nucleicos da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene da alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, e gene da beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores tandem são divulgados em WO 99/43835.

[00241] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos constructos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácida estável de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, celobiohidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta- xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus; exemplos não limitantes incluem promotores modificados de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus niger nos quais o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados, e híbridos.

[00242] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactocinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae, e 3-fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[00243] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência do terminador está operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando a variante. Pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.

[00244] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.

[00245] Terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[00246] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[00247] A sequência de controle pode ser também uma região estabilizadora de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[00248] Exemplos de regiões estabilizadoras de mRNA adequadas são obtidos de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[00249] A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução pela célula hospedeira. A sequência líder está operacionalmente ligada ao terminal 5' do polinucleotídeo codificando a variante. Pode ser usado qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira.

[00250] Líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da amilase TAKA de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[00251] Líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae, e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[00252] A sequência de controle pode também ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' da sequência de codificação da variante e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina a mRNA transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira.

[00253] Sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[00254] Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[00255] A sequência de controle pode ser também uma região codificante do peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao terminal N de uma variante e dirige a variante para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante do peptídeo sinal naturalmente ligada em grelha de leitura de tradução ao segmento da sequência codificante que codifica a variante. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante de um peptídeo sinal que é estranha à sequência codificante. Uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode ser requerida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante do peptídeo sinal. Alternativamente, uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo sinal natural de modo a intensificar a secreção da variante. No entanto pode ser usada qualquer sequência codificante do peptídeo sinal que dirija a variante expressa para a via secretora de uma célula hospedeira.

[00256] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[00257] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa, e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[00258] Peptídeos sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes do fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências codificantes do peptídeo sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[00259] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificante de pró-peptídeos que codifica um pró- peptídeo posicionado no terminal N de uma variante. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró- polipeptídeo está geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida dos genes da protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[00260] Onde estiverem presentes sequências do peptídeo sinal e pró-peptídeo, a região do pró-peptídeo está posicionada junto ao terminal N da variante e a sequência do peptídeo sinal está posicionada junto ao terminal N da sequência do pró-peptídeo.

[00261] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão da variante em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac, e trp. Em levedura pode ser usado o sistema ADH2 ou sistema GAL1. Em fungos filamentosos podem ser usados o promotor de glucoamilase de Aspergillus niger, o promotor de alfa-amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e o promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências reguladoras incluem o gene da diidrofolato reductase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Em estes casos, o polinucleotídeo codificando a variante estaria operacionalmente ligado à sequência reguladora.

[00262] Vetores de Expressão

[00263] A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação transcricional e translacional. As várias sequências de nucleotídeos e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando a variante em tais locais. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um constructo de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor tal que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão.

[00264] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (p.ex., um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa provocar expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[00265] O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, p.ex., um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) nos(s) qual(ais) foi integrado. Além disso pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transpóson.

[00266] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitam seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas, ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares.

[00267] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tal como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina, ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras levedura incluem, mas não estão limitados a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, mas não estão limitados a, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoíltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato reductase), pyrG (orotidina-5’-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. Preferenciais para uso em uma célula de Aspergillus são genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

[00268] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

[00269] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo codificando a variante ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionamento da integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local(ais) preciso(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases, e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[00270] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem da replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funcione em uma célula. O termo "origem da replicação" ou "replicador de plasmídeo" significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[00271] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 permitindo replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMβl permitindo replicação em Bacillus.

[00272] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

[00273] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos divulgados em WO 00/24883.

[00274] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de uma variante. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e deste modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

[00275] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos de um perito na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).

[00276] Células Hospedeiras

[00277] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, compreendendo uma variante da presente invenção operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de uma variante da presente invenção. Um constructo ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira de forma a que o constructo ou vetor seja mantido como integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não é idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande medida do gene codificando a variante e sua fonte.

[00278] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de uma variante, por exemplo um procariota ou um eucariota.

[00279] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. Bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. Bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[00280] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[00281] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas não se limitando a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[00282] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces, incluindo mas não se limitando a células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

[00283] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação com protoplastos (ver, p.ex., Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação com células competentes (ver, p.ex., Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, p.ex., Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (ver, p.ex., Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação com protoplastos (ver, p.ex., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, p.ex., Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação com protoplastos, eletroporação (ver, p.ex., Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, p.ex., Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou transdução (ver, p.ex., Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (ver, p.ex., Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397), ou conjugação (ver, p.ex., Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (ver, p.ex., Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação com protoplastos (ver, p.ex., Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, p.ex., Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), ou conjugação (ver, p.ex., Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira.

[00284] A célula hospedeira pode ser também um eucariota, tal como uma célula de mamífero, de inseto, de planta, ou fúngica.

[00285] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. "Fungos" como usado aqui incluem os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definido por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).

[00286] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. "Levedura" como usado aqui inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena, e levedura pertencendo aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de leveduras pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, e Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[00287] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.

[00288] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por floração de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

[00289] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

[00290] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[00291] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos, transformações dos protoplastos, e regeneração da parede celular de uma forma conhecida per se. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Métodos adequados para transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

[00292] Métodos de Produção

[00293] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de uma variante, compreendendo: (a) cultivo de uma célula hospedeira da presente invenção sob condições adequadas para expressão da variante; e (b) recuperação da variante.

[00294] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção da variante usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada, ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizado em um meio adequado e sob condições permitindo que a variante seja expressa e/ou isolada. O cultivo tem lugar em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (p.ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Se a variante for secretada para o meio nutriente, a variante pode ser recuperada diretamente do meio. Se a variante não for secretada pode ser recuperada de lisatos de células.

[00295] A variante pode ser detectada usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para as variantes. Estes métodos de detecção incluem, mas não estão limitados a, uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo pode ser usado um ensaio de enzimas para se determinar a atividade da variante.

[00296] A variante pode ser recuperada usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a variante pode ser recuperada do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação.

[00297] A variante pode ser purificada por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p.ex., permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem, e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (p.ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p.ex., precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, p.ex., Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter variantes substancialmente puras.

[00298] Em um aspeto alternativo, a variante não é recuperada, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando a variante é usada como uma fonte da variante.

[00299] Composições

[00300] A presente invenção se relaciona também com composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. Preferencialmente, a composição compreende também um transportador e/ou um excipiente. Mais preferencialmente, as composições são enriquecidas em um tal polipeptídeo. O termo "enriquecido" indica que a atividade de glucoamilase da composição foi aumentada, p.ex., com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1. Preferencialmente, as composições são formuladas para proporcionarem características desejáveis tais como fraca cor, fraco odor e estabilidade no armazenamento aceitável.

[00301] A composição pode compreender um polipeptídeo da presente invenção como o principal componente enzimático, p.ex., uma composição monocomponente. Alternativamente, a composição pode compreender atividades enzimáticas múltiplas, tais como uma aminopeptidase, alfa-amilase, isoamilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, pululase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase.

[00302] Em uma forma de realização particular, a composição compreende uma alfa-amilase e a glucoamilase variante de acordo com a invenção. Em outra forma de realização, a composição compreende uma isoamilase e a glucoamilase variante de acordo com a invenção. Em outra forma de realização, a composição compreende uma alfa- amilase, uma isoamilase e a glucoamilase variante de acordo com a invenção.

[00303] Em outro aspeto, a composição compreende a glucoamilase variante da invenção combinada com uma pululanase. Em outro aspeto, a composição compreende a glucoamilase variante da invenção combinada com uma pululanase, e uma isoamilase. Em outro aspeto, a composição compreende a glucoamilase variante da invenção combinada com uma pululanase, e uma alfa-amilase.

[00304] Em uma forma de realização particular, a composição compreende adicionalmente uma protease.

[00305] As composições de polipeptídeo podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[00306] São dados em baixo exemplos de usos preferenciais das composições de polipeptídeo da invenção. A dosagem da composição de polipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica.

[00307] As composições acima são adequadas para uso em processos de liquefação, sacarificação, e/ou fermentação, preferencialmente na conversão de amido, especialmente para produção de xarope e produtos de fermentação, tais como etanol.

[00308] São dados em baixo exemplos de usos preferenciais das composições de polipeptídeo da presente invenção. A dosagem da composição de polipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica.

[00309] Usos

[00310] A presente invenção está também dirigida ao uso de um polipeptídeo da presente invenção em um processo de liquefação, sacarificação e/ou fermentação. O polipeptídeo pode ser usado em um único processo, por exemplo, em um processo de liquefação, um processo de sacarificação, ou um processo de fermentação. O polipeptídeo pode ser também usado em uma combinação de processos, por exemplo em um processo de liquefação e sacarificação, em um processo de liquefação e fermentação, ou em um processo de sacarificação e fermentação, preferencialmente em relação a conversão de amido.

[00311] Em um aspeto preferencial da presente invenção, o processo de liquefação, sacarificação e/ou fermentação inclui processos de liquefação e sacarificação sequencial ou simultaneamente realizados.

[00312] Em processo de liquefação enzimática convencional, alfa-amilase termoestável é adicionada e o amido de cadeia longa é degradado em unidades mais curtas ramificadas e lineares (maltodextrinas), mas glucoamilase não é adicionada. A glucoamilase da presente invenção é altamente termoestável, logo é vantajoso adicionar a glucoamilase no processo de liquefação. A glucoamilase da presente invenção tem um efeito sinérgico quando combinada com uma alfa-amilase no processo de liquefação. Durante sacarificação convencional, as dextrinas geradas durante o processo de liquefação são adicionalmente hidrolisadas para produzir açúcares baixo molecular DP1-3 que podem ser metabolizados por organismo fermentador. A hidrólise é tipicamente alcançada usando glucoamilases; alternativamente, adicionalmente a glucoamilases, podem ser usadas alfa- glucosidases e/ou alfa-amilases ácidas.

[00313] Quando se aplica a glucoamilase da presente invenção, potencialmente em combinação com uma alfa-amilase em um processo de liquefação e/ou sacarificação, especialmente em um processo de liquefação e sacarificação simultâneo, o processo pode ser conduzido a uma temperatura mais elevada. Em particular, a glucoamilase variante da invenção é útil para sacarificação de amido em bruto (amido granular) a elevada temperatura mas abaixo da temperatura de gelatinização, tal como a temperaturas na gama de 40 a 65 °C, mais particular de 50 a 62 °C, mais particular de 59 a 62 °C.

[00314] Por condução do processo de liquefação e/ou sacarificação a temperaturas mais elevadas, o processo pode ser levado a cabo em um período de tempo mais curto ou alternativamente o processo pode ser levado a cabo usando dosagem de enzima mais baixa. Além do mais, o risco de contaminação microbiana é reduzido quando se realiza o processo de liquefação e/ou sacarificação a temperatura mais elevada.

[00315] Conversão de material contendo amido

[00316] A presente invenção proporciona um uso da glucoamilase da invenção para produção de glucoses e similares a partir de amido. Geralmente, o método inclui os passos de hidrólise parcial de amido precursor usando a glucoamilase variante da presente invenção sozinha ou na presença de uma alfa-amilase.

[00317] A glucoamilase variante da invenção pode ser também usada em combinação com uma enzima que somente hidrolisa ligações alfa-(1,6)-glucosídicas em moléculas compreendendo pelo menos quatro resíduos de glucosila.

[00318] Em um aspeto adicional, a invenção se relaciona com o uso de uma glucoamilase da invenção na conversão de amido. Além do mais, a glucoamilase da invenção pode ser usada em um processo de conversão de amido contínuo incluindo um processo de sacarificação contínuo.

[00319] Produção de xarope, bebida e/ou produto de fermentação

[00320] Os usos da glucoamilase da invenção incluem conversão de amido em, p.ex., xarope, bebida, e/ou um produto de fermentação, incluindo etanol.

[00321] A presente invenção proporciona também um processo de uso de uma glucoamilase da invenção para produção de xarope, tal como glucose e similares, a partir de material contendo amido. Materiais de início adequados são exemplificados na seção "Materiais contendo amido". Geralmente, o processo compreende os passos de hidrólise parcial ou total de material contendo amido (liquefação e/ou sacarificação) na presença da glucoamilase da presente invenção sozinha ou em combinação com alfa-amilase para liberar glucose das extremidades não redutoras do amido ou moléculas de oligo- ou polissacarídeo relacionadas.

[00322] A glucoamilase da invenção pode ser também usada em forma imobilizada. Isto é adequado e frequentemente usado para produção de xaropes de especialidade, tais como xaropes de maltose bem como na corrente de rafinato de oligossacarídeos em conexão com a produção de xaropes de frutose, p.ex., xarope de alta frutose (HFS).

[00323] Produtos de Fermentação

[00324] O termo "produto de fermentação" significa um produto produzido por um processo incluindo um processo de fermentação usando um organismo fermentador. Produtos de fermentação contemplados de acordo com a invenção incluem álcoois (p.ex., arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, etileno glicol, 1,3-propanodiol [propileno glicol], butanodiol, glicerina, sorbitol, e xilitol); ácidos orgânicos (p.ex., ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3- hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido láctico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico, e ácido xilônico); cetonas (p.ex., acetona); aminoácidos (p.ex., ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina, e treonina); um alcano (p.ex., pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano, e dodecano); um cicloalcano (p.ex., ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano, e ciclooctano); um alqueno (p.ex., penteno, hexeno, hepteno, e octeno); gases (p.ex., metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2), e monóxido de carbono (CO)); antibióticos (p.ex., penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (p.ex., riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios. Em um aspeto preferencial, o produto de fermentação é etanol, p.ex., etanol para combustível; etanol para bebida, i.e., bebidas alcoólicas neutras potáveis ou produtos usados na indústria do álcool consumível (p.ex., cerveja e vinho), indústria dos lacticínios (p.ex., produtos lácteos fermentados), indústria das peles e indústria do tabaco. Tipos de cerveja preferenciais compreendem ales, stouts, porters, lagers, bitters, licores de malte, happoushu, cerveja com muito álcool, cerveja com pouco álcool, cerveja baixa em calorias ou cerveja sem álcool. Processos de fermentação preferenciais usados incluem processos de fermentação de álcool, que são bem conhecidos na técnica. Processos de fermentação preferenciais usados são processos de fermentação anaeróbicos, que são bem conhecidos na técnica.

[00325] Fabricação de cerveja

[00326] As glucoamilases da presente invenção são altamente termoestáveis e portanto podem ser usadas em uma indústria que necessita de hidrólise de amido a elevada temperatura. Por exemplo, as glucoamilases da invenção podem ser usadas em uma indústria de fabricação de cerveja. As glucoamilases da invenção são adicionadas em quantidades eficazes que podem ser facilmente determinadas pela pessoa perita na técnica.

[00327] Produção de um produto de liquefação, sacarificação e/ou fermentação

[00328] Em este aspeto, a presente invenção se relaciona com um processo para produção de um produto de liquefação, sacarificação e/ou fermentação a partir de material contendo amido, compreendendo o passo de: tratamento de material contendo amido com um polipeptídeo da presente invenção.

[00329] Materiais de início contendo amido adequados são listados na seção "Materiais contendo amido" em baixo. Enzimas contempladas são listadas na seção "Enzimas" em baixo. Preferencialmente, o processo da presente invenção compreende tratamento de material contendo amido com um polipeptídeo da presente invenção sozinho ou em conjunto com uma alfa-amilase. O produto de liquefação e/ou sacarificação da presente invenção é dextrina, ou açúcares de baixo molecular, por exemplo DP1-3. No processo de liquefação, a conversão de amido em glucose, dextrina e/ou açúcares de baixo peso molecular é intensificada pela adição de uma glucoamilase da presente invenção. O produto de fermentação, tal como etanol, pode ser opcionalmente recuperado após fermentação, p.ex., por destilação. A fermentação é preferencialmente levada a cabo na presença de levedura, preferencialmente uma estirpe de Saccharomyces. Organismos fermentadores adequados são listados na seção "Organismos Fermentadores" em baixo.

Processo para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido gelatinizado

[00330] Em este aspeto, a presente invenção se relaciona com um processo para produção de um produto de fermentação, especialmente etanol, a partir de material contendo amido, cujo processo inclui um passo de liquefação e passos de sacarificação e fermentação sequencial ou simultaneamente realizados.

[00331] A invenção se relaciona com um processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo os passos de: (a) liquefação de material contendo amido; usando uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito obtido no passo (a) usando uma glucoamilase; e (c) fermentação do material sacarificado usando um organismo fermentador.

[00332] Preferencialmente, o passo (a) inclui também uso das variantes de glucoamilase da invenção. Em uma forma de realização, as variantes de glucoamilase da invenção estão (são) também presentes/adicionadas no passo (b).

[00333] O produto de fermentação, tal como especialmente etanol, pode ser opcionalmente recuperado após fermentação, p.ex., por destilação. Materiais de início contendo amido adequados são listados na seção "Materiais contendo amido" em baixo. Enzimas contempladas são listadas na seção "Enzimas" em baixo. A liquefação é preferencialmente levada a cabo na presença de uma alfa-amilase. A fermentação é preferencialmente levada a cabo na presença de levedura, preferencialmente uma estirpe de Saccharomyces. Organismos fermentadores adequados são listados na seção "Organismos Fermentadores" em baixo. Em formas de realização preferenciais, os passos (b) e (c) são levados a cabo sequencial ou simultaneamente (i.e., como processo SSF).

[00334] Em uma forma de realização particular, o processo da invenção compreende adicionalmente, antes do passo (a), os passos de:

[00335] x) redução do tamanho das partículas do material contendo amido, preferencialmente por moagem; e

[00336] y) formação de uma pasta compreendendo o material contendo amido e água.

[00337] A pasta aquosa pode conter de 10-40 % por peso, preferencialmente 25-35 % por peso, de material contendo amido. A pasta é aquecida até acima da temperatura de gelatinização e alfa-amilase, preferencialmente alfa- amilase bacteriana e/ou fúngica ácida, pode ser adicionada para iniciar a liquefação (desbaste). A pasta pode em uma forma de realização ser cozida com jato para gelatinizar adicionalmente a pasta antes de ser sujeita a uma alfa- amilase no passo (a) da invenção.

[00338] Mais especificamente, a liquefação pode ser levada a cabo como um processo de empastagem a quente de três passos. A pasta é aquecida até entre 60-95 °C, preferencialmente 80-85 °C, e alfa-amilase é adicionada para iniciar a liquefação (desbaste). Depois, a pasta pode ser cozida com jato a uma temperatura entre 95-140 °C, preferencialmente 105-125 °C, durante 1-15 minutos, preferencialmente durante 3-10 minutos, especialmente em torno de 5 minutos. A pasta é resfriada até 60-95 °C e mais alfa-amilase é adicionada para finalizar a hidrólise (liquefação secundária). O processo de liquefação é usualmente levado a cabo a pH 4,5-6-5, em particular a um pH entre 5 e 6. Grãos inteiros moídos e liquefeitos são conhecidos como puré.

[00339] A sacarificação no passo (b) pode ser levada a cabo usando condições bem conhecidas na técnica. Por exemplo, um passo de sacarificação completa pode durar até de cerca de 24 a cerca de 72 horas, no entanto, é também comum fazer uma pré-sacarificação de tipicamente 40-90 minutos a uma temperatura entre 30-65 °C, tipicamente cerca de 60 °C, seguida por sacarificação completa durante a fermentação em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A sacarificação é tipicamente levada a cabo a temperaturas de 30-65 °C, tipicamente em torno de 60 °C, e a um pH entre 4 e 5, normalmente a cerca de pH 4,5.

[00340] O processo o mais amplamente usado na produção de produto de fermentação, especialmente etanol, é o processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), no qual não existe um passo de espera para a sacarificação, significando que o organismo fermentador, tal como levedura, e enzima(s) podem ser adicionados em conjunto. As SSF podem ser tipicamente levadas a cabo a uma temperatura entre 25 °C e 40 °C, tal como entre 29 °C e 35 °C, tal como entre 30 °C e 34 °C, tal como em torno de 32 °C. De acordo com a invenção, a temperatura pode ser ajustada para cima ou para baixo durante a fermentação.

[00341] De acordo com a presente invenção, o passo de fermentação (c) inclui, sem limitação, processos de fermentação usados para produzir álcoois (p.ex., etanol, metanol, butanol); ácidos orgânicos (p.ex., ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido glucônico); cetonas (p.ex., acetona); aminoácidos (p.ex., ácido glutâmico); gases (p.ex., H2 e CO2); antibióticos (p.ex., penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (p.ex., riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios. Processos de fermentação preferenciais incluem processos de fermentação de álcool, como são bem conhecidos na técnica. Processos de fermentação preferenciais usados são processos de fermentação anaeróbicos, como são bem conhecidos na técnica.

Processos para produção de produtos de fermentação a partir de contendo amido não gelatinizado

[00342] Em este aspeto, a invenção se relaciona com processos para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido sem gelatinização do material contendo amido (i.e., material contendo amido não cozido). De acordo com a invenção, o produto de fermentação desejado, tal como etanol, pode ser produzido sem liquefação da pasta aquosa contendo o material contendo amido. Em uma forma de realização, um processo da invenção inclui sacarificação de material contendo amido (moído), p.ex., amido granular, abaixo da temperatura de gelatinização na presença de uma alfa-amilase para produzir açúcares que podem ser fermentados no produto de fermentação desejado por um organismo fermentador adequado. Em outra forma de realização, uma glucoamilase da invenção e uma alfa-amilase são usadas durante sacarificação e fermentação. Em um aspeto, a invenção se relaciona com um processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo: (a) sacarificação de material contendo amido com uma variante de glucoamilase madura de acordo com a invenção, a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido, (b) fermentação usando um organismo fermentador.

[00343] Os passos (a) e (b) do processo da invenção podem ser levados a cabo sequencial ou simultaneamente. Em uma forma de realização, uma pasta compreendendo água e material contendo amido é preparada antes do passo (a).

[00344] Em uma forma de realização preferencial, o passo (a) inclui adição de uma alfa-amilase.

[00345] O processo de fermentação pode ser levado a cabo durante um período de 1 a 250 horas, preferencialmente é de 25 a 190 horas , mais preferencialmente de 30 a 180 horas, mais preferencialmente de 40 a 170 horas, ainda mais preferencialmente de 50 a 160 horas, ainda mais preferencialmente de 60 a 150 horas, ainda mais preferencialmente preferencialmente de de 80 70 a 140 horas, a 130 horas.

[00346] O termo "temperatura de gelatinização inicial" significa a temperatura mais baixa à qual a gelatinização do amido começa. O amido aquecido em água começa a gelatinizar entre 50 °C e 75 °C; a temperatura exata da gelatinização depende do amido específico, e pode ser prontamente determinada pelo especialista perito. Assim, a temperatura de gelatinização inicial pode variar de acordo com a espécie de planta, com a variedade particular da espécie de planta bem como com as condições de crescimento. No contexto desta invenção, a temperatura de gelatinização inicial de um dado material contendo amido é a temperatura à qual a birrefrigência é perdida em 5 % dos grânulos de amido usando o método descrito por Gorinstein e Lii, 1992, Starch/Starke 44(12): 461-466.

[00347] Antes do passo (a) pode ser preparada uma pasta de material contendo amido, tal como amido granular, tendo 10-55 % por peso de sólidos secos, preferencialmente 25-40 % por peso de sólidos secos, mais preferencialmente 3035 % por peso de sólidos secos, de material contendo amido. A pasta pode incluir água e/ou águas do processo, tais como vinhaça (contracorrente), água do purificador, condensado ou destilado do evaporador, água descarregada dos lados da destilação, ou outra água do processo de instalações de produtos de fermentação. Porque o processo da invenção é levado a cabo abaixo da temperatura de gelatinização inicial e logo não tem lugar nenhum aumento significativo da viscosidade podem ser usados se desejado elevados níveis de vinhaça. Em uma forma de realização, a pasta aquosa contém de cerca de 1 a cerca de 70 % por volume de vinhaça, preferencialmente 15-60 % por volume de vinhaça, especialmente de cerca de 30 a 50 % por volume de vinhaça.

[00348] O material contendo amido pode ser preparado por redução do tamanho das partículas, preferencialmente por moagem a seco ou úmida, até 0,05 a 3,0 mm, preferencialmente 0,1-0,5 mm. Após ser sujeito a um processo da invenção, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou preferencialmente pelo menos 99 % dos sólidos secos do material contendo amido é convertido em um hidrolisado de amido solúvel.

[00349] O processo da invenção é conduzido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial. Preferencialmente, a temperatura à qual o passo (a) é levado a cabo é entre 30-75 °C, preferencialmente entre 45-60 °C.

[00350] Em uma forma de realização preferencial, o passo (a) e passo (b) são levados a cabo como um processo de sacarificação e fermentação sequenciais ou simultâneas. Em tal forma de realização preferencial, o processo é tipicamente levado a cabo a uma temperatura entre 25 °C e 40 °C, tal como entre 29 °C e 35 °C, tal como entre 30 °C e 34 °C, tal como em torno de 32 °C. De acordo com a invenção, a temperatura pode ser ajustada para cima ou para baixo durante a fermentação.

[00351] Em uma forma de realização, as sacarificação e fermentação simultâneas são levadas a cabo tal que o nível de açúcar, tal como nível de glucose, seja mantido a um nível baixo tal como abaixo de 6 % por peso, preferencialmente abaixo de 3 % por peso, preferencialmente abaixo de cerca de 2 % por peso, mais preferencial abaixo de 1 % por peso, ainda mais preferencial abaixo de cerca de 0,5 % por peso, ou mesmo mais preferencial abaixo de 0,25 % por peso, tal como abaixo de cerca de 0,1 % por peso. Tais níveis baixos de açúcar podem ser alcançados por emprego simples de quantidades ajustadas de enzima e organismo fermentador. Uma pessoa perita na técnica pode facilmente determinar que quantidades de enzima e organismo fermentador usar. As quantidades empregues de enzima e organismo fermentador podem ser também selecionadas para se manterem baixas concentrações de maltose no caldo de fermentação. Por exemplo, o nível de maltose pode ser mantido abaixo de cerca de 0,5 % por peso ou abaixo de cerca de 0,2 % por peso.

[00352] O processo pode ser levado a cabo a um pH na gama entre 3 e 7, preferencialmente de pH 3,5 a 6, ou mais preferencialmente de pH 4 a 5.

[00353] As variantes de glucoamilase da presente invenção são termoestáveis, tal que a pré-sacarificação e/ou sacarificação possam ser levadas a cabo a uma temperatura mais elevada do que a pré-sacarificação e/ou sacarificação convencionais. Em uma forma de realização, um processo da invenção inclui pré-sacarificação de material contendo amido antes do processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A pré-sacarificação pode ser levada a cabo a uma temperatura elevada (por exemplo, 50-85 °C, preferencialmente 60-75 °C) antes de se ir para SSF.

Materiais contendo amido

[00354] Pode ser usado qualquer material contendo amido adequado, incluindo amido granular, de acordo com a presente invenção. O material de início é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado. Exemplos de materiais de início contendo amido, adequados para uso em um processo da presente invenção, incluem tubérculos, raízes, caules, grãos inteiros, milho, espigas, trigo, cevada, centeio, milo, mandioca, tapioca, sorgo, grãos de arroz, feijão, ou batatas-doces, ou suas misturas, ou cereais, matérias-primas contendo açúcar, tais como melaços, materiais de frita, cana-de-açúcar ou beterraba-sacarina, batatas, e materiais contendo celulose, tais como resíduos de madeira ou planta, ou suas misturas. São contemplados ambos os tipos cerosos e não cerosos de milho e cevada.

Organismos Fermentadores

[00355] "Organismo fermentador" se refere a qualquer organismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, adequado para uso em um processo de fermentação e capaz de produzir um produto de fermentação desejado. Organismos fermentadores especialmente adequados são capazes de fermentar, i.e., converter, açúcares, tais como glucose ou maltose, direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado. Exemplos de organismos fermentadores incluem organismos fúngicos, tais como levedura. Leveduras preferenciais incluem estirpe de Saccharomyces spp., em particular, Saccharomyces cerevisiae. Leveduras comercialmente disponíveis incluem, p.ex., Red Star™/Lesaffre Ethanol Red (disponível da Red Star/Lesaffre, EUA) FALI (disponível da Fleischmann’s Yeast, uma divisão da Burns Philp Food Inc., EUA), SUPERSTART (disponível da Alltech), GERT STRAND (disponível da Gert Strand AB, Suécia) e FERMIOL (disponível da DSM Specialties).

ENZIMAS Glucoamilase

[00356] A glucoamilase é preferencialmente uma glucoamilase da invenção. No entanto, como mencionado acima, uma glucoamilase da invenção pode ser combinada com outras glucoamilases.

[00357] A glucoamilase pode ser adicionada em uma quantidade de 0,001 a 10 AGU/g de DS, preferencialmente de 0,01 a 5 AGU/g de DS, tal como em torno de 0,05, 0,1, 0,3, 0,5, 1 ou 2 AGU/g de DS, especialmente 0,05 a 0,5 AGU/g de DS; ou 0,02-20 AGU/g de DS, preferencialmente 0,1-10 AGU/g de DS.

Alfa-Amilase

[00358] A alfa-amilase pode de acordo com a invenção ser de qualquer origem. São preferenciais alfa-amilases de origem fúngica ou bacteriana.

[00359] Em um aspeto preferencial, a alfa-amilase é uma alfa-amilase ácida, p.ex., alfa-amilase ácida fúngica ou alfa-amilase ácida bacteriana. O termo "alfa-amilase ácida" significa uma alfa-amilase (E.C. 3.2.1.1) que, adicionada em uma quantidade eficaz, tem atividade ótima a um pH na gama de 3 a 7, preferencialmente de 3,5 a 6, ou mais preferencialmente de 4-5.

Alfa-Amilases Bacterianas

[00360] De acordo com a invenção, uma alfa-amilase bacteriana pode ser preferencialmente derivada do gênero Bacillus.

[00361] Em um aspeto preferencial, a alfa-amilase de Bacillus é derivada de uma estirpe de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis ou B. stearothermophilus, mas pode ser também derivada de outras Bacillus sp. Exemplos específicos de alfa-amilases contempladas incluem a alfa- amilase de Bacillus licheniformis (BLA) mostrada em SEQ ID NO: 4 em WO 99/19467, a alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (BAN) mostrada em SEQ ID NO: 5 em WO 99/19467, e a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (BSG) mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467. Em uma forma de realização da invenção, a alfa-amilase é uma enzima tendo um grau de identidade de pelo menos 60 %, preferencialmente pelo menos 70 %, mais preferencial pelo menos 80 %, ainda mais preferencial pelo menos 90 %, tal como pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com qualquer uma das sequências mostradas como SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, ou 5, respectivamente, em WO 99/19467.

[00362] A alfa-amilase de Bacillus pode ser também uma variante e/ou híbrido, especialmente um descrita em qualquer uma de WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059, e WO 02/10355 (todos os documentos deste modo incorporados por referência). Variantes de alfa-amilase especificamente contempladas são divulgadas nas patentes dos EUA nos. 6,093,562, 6,297,038 ou patente dos EUA no. 6,187,576 (deste modo incorporadas por referência) e incluem variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (alfa-amilase de BSG) tendo uma deleção de um ou dois aminoácidos nas posições 179 a 182, preferencialmente uma dupla deleção divulgada em WO 1996/023873 - ver, p.ex., página 20, linhas 1-10 (deste modo incorporada por referência), preferencialmente correspondendo a delta(181- 182) em comparação com a sequência de aminoácidos de alfa- amilase de BSG de tipo selvagem apresentada em SEQ ID NO: 3 divulgada em WO 99/19467 ou deleção dos aminoácidos 179 e 180 usando SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 para numeração (cuja referência é deste modo incorporada por referência). São ainda mais preferenciais alfa-amilases de Bacillus, especialmente alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus, que têm uma dupla deleção correspondendo a delta (181-182) e compreendem adicionalmente uma substituição N193F (também denotada I181* + G182* + N193F) em comparação com a sequência de aminoácidos de alfa-amilase de BSG de tipo selvagem apresentada em SEQ ID NO: 3 divulgada em WO 99/19467.

[00363] A alfa-amilase pode ser também uma alfa- amilase maltogênica. Uma "alfa-amilase maltogênica" (glucana 1,4-alfa-maltoidrolase, E.C. 3.2.1.133) é capaz de hidrolisar amilose e amilopectina em maltose na configuração alfa. Uma alfa-amilase maltogênica da estirpe de Bacillus stearothermophilus NCIB 11837 está comercialmente disponível da Novozymes A/S, Dinamarca. A alfa-amilase maltogênica é descrita nas patentes dos EUA nos. 4,598,048, 4,604,355 e 6,162,628, que são deste modo incorporadas por referência.

Alfa-Amilases Híbridas Bacterianas

[00364] Uma alfa-amilase híbrida especificamente contemplada compreende 445 resíduos de aminoácidos C- terminais da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (mostrada como SEQ ID NO: 4 em WO 99/19467) e os 37 resíduos de aminoácidos N-terminais da alfa-amilase derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada como SEQ ID NO: 3 em WO 99/194676), com uma ou mais das, especialmente todas as, seguintes substituições:

[00365] G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+ Q264S (usando a numeração de Bacillus licheniformis). São também preferenciais variantes tendo uma ou mais das seguintes mutações (ou mutações correspondentes em outras estruturas principais de alfa-amilases de Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V e Q264S e/ou deleção de dois resíduos entre as posições 176 e 179, preferencialmente deleção de E178 e G179 (usando a numeração de SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467).

Alfa-Amilases Fúngicas

[00366] As alfa-amilases ácidas fúngicas incluem alfa- amilases ácidas derivadas de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como alfa-amilases de Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, ou Aspergillus kawachii.

[00367] Uma alfa-amilase fúngica ácida preferencial é uma alfa-amilase tipo Fungamyl que é preferencialmente derivada de uma estirpe de Aspergillus oryzae. Na presente divulgação, o termo "alfa-amilase tipo Fungamyl" indica uma alfa-amilase que exibe uma elevada identidade, i.e., mais do que 70 %, mais do que 75 %, mais do que 80 %, mais do que 85 % mais do que 90 %, mais do que 95 %, mais do que 96 %, mais do que 97 %, mais do que 98 %, mais do que 99 % ou mesmo 100 % de identidade com a parte madura da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 10 em WO 96/23874.

[00368] Outra alfa-amilase ácida preferencial é derivada de uma estirpe Aspergillus niger. Em um aspeto preferencial, a alfa-amilase fúngica ácida é uma de A. niger divulgada como "AMYA_ASPNG" na base de dados Swiss- prot/TeEMBL sob o no. de acesso primário P56271 e descrita em mais detalhe em WO 89/01969 (Exemplo 3). A alfa-amilase ácida de Aspergillus niger é também mostrada como SEQ ID NO: 1 em WO 2004/080923 (Novozymes) que é deste modo incorporada por referência. São também contempladas variantes da referida alfa-amilase fúngica ácida tendo pelo menos 70 % de identidade, tal como pelo menos 80 % ou mesmo pelo menos 90 % de identidade, tal como pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade com SEQ ID NO: 1 em WO 2004/080923.

[00369] Em um aspeto preferencial, a alfa-amilase é derivada de Aspergillus kawachii e divulgada por Kaneko et al. J. Ferment. Bioeng. 81:292-298(1996) "Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase from Aspergillus kawachii"; e adicionalmente como EMBL:#AB008370.

[00370] A alfa-amilase ácida fúngica pode ser também uma enzima de tipo selvagem compreendendo um domínio de ligação do amido (CBM) e um domínio catalítico da alfa- amilase (i.e., um não híbrido), ou uma sua variante. Em uma forma de realização, a alfa-amilase ácida de tipo selvagem é derivada de uma estirpe de Aspergillus kawachii.

Alfa-Amilases Híbridas Fúngicas

[00371] Em um aspeto preferencial, a alfa-amilase ácida fúngica é uma alfa-amilase híbrida. Exemplos preferenciais de alfa-amilases híbridas fúngicas incluem aquelas divulgadas em WO 2005/003311 ou Publicação da Patente dos E.U.A. no. 2005/0054071 (Novozymes) ou pedido de patente dos EUA No. 2006/0148054 (Novozymes), que são deste modo incorporados por referência. Uma alfa-amilase híbrida pode compreender um domínio catalítico (CD) da alfa-amilase e um domínio/módulo de ligação de carboidrato (CBM) e opcionalmente um ligante.

[00372] Exemplos específicos de alfa-amilases híbridas contempladas incluem aquelas, mas não limitadas àquelas, divulgadas no pedido de patente dos E.U.A. No. 2006/0148054 incluindo variante de Fungamyl com domínio catalítico JA118 e SBD de Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 100 no pedido dos E.U.A. No. 2006/0148054), alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com ligante AMG e SBD de Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 101 no pedido dos E.U.A. No. 2006/0148054) e alfa-amilase de Meripilus giganteus com ligante de glucoamilase e SBD de Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 102 no pedido dos E.U.A. No. 2006/0148054); e alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com ligante de glucoamilase e CBM de Aspergillus niger (SEQ ID NO: 2 no pedido internacional No. WO2007/144424).

[00373] Outros exemplos específicos de alfa-amilases híbridas contempladas incluem aquelas, mas não limitadas àquelas, divulgadas na Publicação da Patente dos E.U.A no. 2005/0054071, incluindo aquelas divulgadas na Tabela 3 na página 15, tais como alfa-amilase de Aspergillus niger com ligante e domínio de ligação do amido de Aspergillus kawachii.

Produtos de Alfa-Amilase Comerciais

[00374] Composições compreendendo alfa-amilase comerciais preferenciais incluem MYCOLASE de DSM (Gist Brocades), BAN™, TERMAMYL™ SC, FUNGAMYL™, LIQUOZYME™ SC, LIQUOZYME™ SC DS, e SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) e CLARASE™ L-40,000, DEX-LO™, SPEZYME™ FRED, SPEZYME™ AA, SPEZYME™ Ethyl, e SPEZYME™ DELTA AA (Genencor Int.)

[00375] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes parágrafos numerados:

[00376] Parágrafo [1]. Uma variante de glucoamilase, compreendendo uma substituição em uma ou mais posições correspondendo às posições 95, 59, 119, 121, 18, 426, e 316 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00377] Parágrafo [2]. A variante do parágrafo 1, que é uma variante de uma glucoamilase genitora selecionada do grupo consistindo em: a) um polipeptídeo tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3; b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 85 % de identidade com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; e c) um fragmento do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, que tem atividade de glucoamilase.

[00378] Parágrafo [3]. A variante do parágrafo 2, em que a glucoamilase genitora tem pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00379] Parágrafo [4]. A variante de qualquer um dos parágrafos 2-3, em que a glucoamilase genitora é codificada por um polinucleotídeo tendo pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[00380] Parágrafo [5]. A variante de qualquer um dos parágrafos 2-4, em que a glucoamilase genitora compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00381] Parágrafo [6]. A variante de qualquer um dos parágrafos 2-5, em que a glucoamilase genitora é um fragmento do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, em que o fragmento tem atividade de glucoamilase.

[00382] Parágrafo [8]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-7, que tem pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % de identidade, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da glucoamilase genitora.

[00383] Parágrafo [9]. A variante de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-8, que tem pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00384] Parágrafo [10]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-9, em que o número de substituições é 1-20, p.ex., 1-10 e 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições.

[00385] Parágrafo [11]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-10, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 59.

[00386] Parágrafo [12]. A variante do parágrafo 11, em que a substituição é uma substituição por Ala, Cys, Glu, ou Ile.

[00387] Parágrafo [13]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-12, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 95.

[00388] Parágrafo [14]. A variante do parágrafo 13, em que a substituição é uma substituição por Pro.

[00389] Parágrafo [15]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-14, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 119.

[00390] Parágrafo [16]. A variante do parágrafo 15, em que a substituição é uma substituição por Trp.

[00391] Parágrafo [17]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-16, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 121.

[00392] Parágrafo [18]. A variante do parágrafo 17, em que a substituição é uma substituição por Pro.

[00393] Parágrafo [19]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-18, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 18.

[00394] Parágrafo [20]. A variante do parágrafo 19, em que a substituição é uma substituição por Phe.

[00395] Parágrafo [21]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-20, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 426.

[00396] Parágrafo [22]. A variante do parágrafo 21, em que a substituição é uma substituição por Gly.

[00397] Parágrafo [23]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-22, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 316.

[00398] Parágrafo [24]. A variante do parágrafo 23, em que a substituição é uma substituição por Trp.

[00399] Parágrafo [25]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-24, que compreende uma substituição em duas posições correspondendo a qualquer uma das posições 59, 95, 119, 121, 18, 426, e 316.

[00400] Parágrafo [26]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-25, que compreende uma substituição em três posições correspondendo a qualquer uma das posições 59, 95, 119, 121, 18, 426, e 316.

[00401] Parágrafo [27]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-26, que compreende uma substituição em quatro posições correspondendo a qualquer uma das posições 59, 95, 119, 121, 18, 426, e 316.

[00402] Parágrafo [28]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-27, que compreende uma substituição em cinco posições correspondendo a qualquer uma das posições 59, 95, 119, 121, 18, 426, e 316.

[00403] Parágrafo [29]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-28, que compreende uma substituição em seis posições correspondendo a qualquer uma das posições 59, 95, 119, 121, 18, 426, e 316.

[00404] Parágrafo [30]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-21, que compreende uma substituição em cada posição correspondendo às posições 59, 95, 119, 121, 18, 426, e 316.

[00405] Parágrafo [31]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-24, que compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em 59A, 95P, 119W, e 121P, e em particular uma variante de glucoamilase compreendendo as substituições 95P + 121P, mais particularmente S95P + A121P, e em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00406] Parágrafo [32]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-24, que compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em 59C + 426G, 59G + 426G, e 18F + 59I, mais particularmente V59C + A426G, ou V59G + A426G, ou V18F + V59I, e em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00407] Parágrafo [33]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-24, que compreende uma ou mais substituições selecionadas da substituição 316W, particularmente S316W, e em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00408] Parágrafo [34]. A variante de qualquer um dos parágrafos precedentes, em que a variante compreende pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: V59A; ou S95P; ou A121P; ou T119W; ou S95P + A121P; ou V59A + S95P; ou S95P + T119W; ou V59A + S95P + A121P; ou S95P + T119W + A121P, e em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00409] Parágrafo [35]. A variante de qualquer um dos parágrafos precedentes, em que a variante compreende pelo menos uma das seguintes combinações de substituições: V59C + A426G; ou V59G + A426G; ou V18F + V59I; ou V59C + S95P + T119W + A426G; ou V59C + S95P + T119W + A121P + A426G; ou V59C + S95P + A121P + A426G; ou V18F + V59I + S95P + A121P; ou V18F + V59I + S95P + T119W + A121P, e em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00410] Parágrafo [36]. A variante de qualquer um dos parágrafos precedentes, em que a variante compreende pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: S316W; ou S95P + A121P + S316W, em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00411] Parágrafo [37]. A variante de qualquer um dos parágrafos 1-36, que tem uma propriedade melhorada em relação ao genitor, em que a propriedade melhorada é selecionada do grupo consistindo em atividade específica, termoestabilidade, e tolerância à glucose.

[00412] Parágrafo [38]. A variante dos parágrafos 1-37, que tem uma propriedade melhorada em relação ao genitor, em que a propriedade melhorada é termoestabilidade aumentada.

[00413] Parágrafo [39]. A variante do parágrafo 35, que tem uma propriedade melhorada em relação ao genitor, em que as propriedades melhoradas são termoestabilidade aumentada e tolerância à glucose aumentada.

[00414] Parágrafo [40]. A variante do parágrafo 36, que tem uma propriedade melhorada em relação ao genitor, em que as propriedades melhoradas são termoestabilidade aumentada, e atividade específica aumentada.

[00415] Parágrafo [41]. Uma composição compreendendo o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 140.

[00416] Parágrafo [42]. A composição de acordo com o parágrafo 41, compreendendo uma alfa-amilase e um polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-40.

[00417] Parágrafo [43]. A composição de acordo com o parágrafo 41, compreendendo uma isoamilase e um polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-40.

[00418] Parágrafo [44]. A composição de acordo com o parágrafo 41, compreendendo uma alfa-amilase, uma isoamilase, e um polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-40.

[00419] Parágrafo [45]. A composição de acordo com o parágrafo 41, compreendendo uma pululanase e um polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-40.

[00420] Parágrafo [46]. Um uso de um polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-40 para produção de xarope e/ou um produto de fermentação.

[00421] Parágrafo [47]. O uso de acordo com o parágrafo 46, em que o material de início é material contendo amido gelatinizado ou não gelatinizado.

[00422] Parágrafo [48]. Um processo de produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo os passos de: (a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito; e (c) fermentação com um organismo fermentador;

[00423] em que o passo (a) e/ou passo (b) são levados a cabo usando pelo menos uma glucoamilase variante de qualquer um dos parágrafos 1-40.

[00424] Parágrafo [49]. Um processo de produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido, compreendendo os passos de: (a) sacarificação de material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido; e (b) fermentação com um organismo fermentador, em que o passo (a) é levado a cabo usando pelo menos uma glucoamilase variante de qualquer um dos parágrafos 1-40.

[00425] Parágrafo [50]. Um processo de produção de um produto de xarope a partir de material contendo amido, compreendendo o passo de:

[00426] sacarificação de material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido na presença de uma glucoamilase variante de qualquer um dos parágrafos 1-40.

[00427] Parágrafo [51]. Um processo de produção de um produto de xarope a partir de material contendo amido, compreendendo o passo de: (a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito na presença de uma glucoamilase variante de qualquer um dos parágrafos 1-40.

[00428] Parágrafo [52]. O processo de acordo com o parágrafo 51, em que o passo b) compreende adicionalmente adição de uma pululanase.

[00429] Parágrafo [53]. O processo de acordo com os parágrafos 51 e 52, em que a temperatura de sacarificação está na gama de 40 a 65 °C, mais particular de 50 a 62 °C, mais particular de 59 a 62 °C.

[00430] Parágrafo [54]. Um polinucleotídeo isolado codificando a variante de qualquer um dos parágrafos 1-40.

[00431] Parágrafo [55]. Um constructo de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 54.

[00432] Parágrafo [56]. Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 54.

[00433] Parágrafo [57]. Uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 54.

[00434] Parágrafo [58]. Um método de produção de uma variante de glucoamilase, compreendendo:

[00435] cultivo da célula hospedeira do parágrafo 57 sob condições adequadas para expressão da variante; e recuperação da glucoamilase variante.

[00436] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção. Exemplos Materiais e Métodos Atividade de glucoamilase A atividade de glucoamilase pode ser medida em Unidades AGU.

Atividade de glucoamilase (AGU)

[00437] A Unidade de Glucoamilase (AGU) é definida como a quantidade de enzima, que hidrolisa 1 micromole de maltose por minuto sob as condições padrão (37 °C, pH 4,3, substrato: maltose a 100 mM, tampão: acetato a 0,1 M, tempo de reação 6 minutos como apresentado na incubação de glucoamilase em baixo), gerando deste modo glucose.

[00438] O princípio da análise é descrito por 3 passos de reação:

[00439] O passo 1 é uma reação de enzima:

[00440] A glucoamilase (AMG), EC 3.2.1.3 (exo-alfa- 1,4-glucan-glucoidrolase), hidrolisa maltose para formar alfa-D-glucose. Após incubação, a reação é parada com NaOH.

[00441] Os passos 2 e 3 resultam em uma reação de ponto final:

[00442] A glucose é fosforilada por ATP, em uma reação catalisada por hexocinase. A glucose-6-fosfato formada é oxidada em 6-fosfogluconato por glucose-6-fosfato desidrogenase. Em esta mesma reação, uma quantidade equimolar de NAD+ é reduzida em NADH com um aumento resultante da absorvância a 340 nm. Pode ser usado um sistema autoanalisador tal como Analisador Konelab 30 (Thermo Fisher Scientific).

Atividade específica (SA) de glucoamilase

[00443] A atividade específica foi determinada por ensaio AGU acima usando um instrumento Konelab. Atividade de glucoamilase usando estojo Kikkoman Ensaio de atividade de glucoamilase (Kikkoman) Código do produto: 60211 Princípio do ensaio:

[00444] O substrato, 4-nitrofenil-β-maltosideo (G2-β- pNP), é degradado por glucoamilase ou α-glucosidase em 4- nitrofenil-β-glucosideo (G1-β-pNP). G1-β-pNP é adicionalmente degradado em 4-nitrofenol (pNP) por β-glucosidase em este estojo. A reação é realizada à temperatura ambiente a pH cerca de 4. A reação é parada por adição de carbonato de sódio, e ao mesmo tempo a solução se torna pH alcalino para maximizar a absorvância de pNP. A atividade de formação de glucose é medida por quantificação do pNP a 400 nm.

[00445] 1) A resposta medida mostra a atividade de degradação de G2-β-pNP de glucoamilase e α-glucosidase na amostra. Se pensa que isto seja a atividade de formação de glucose na amostra.

[00446] 2) O teste pode ser usado para extrato de arroz koji sem diálise.

[00447] 3) Este ensaio não é afetado por α-amilase na amostra.

[00448] Componentes do estojo

[00449] 1) Misturar "solução de substrato" e "solução de enzima" do estojo a 1:1.

[00450] 2) Pipetar 10 μL da amostra de variante de glucoamilase purificada tendo atividade de cerca de 0,1 AGU/mL (ou água como um branco) e transferir para um poço de placa de microtitulação. (duplicado)

[00451] 3) Adicionar 60 μL da mistura substrato- enzima ao poço.

[00452] 4) Incubar a temperatura de 32 °C durante 20 min.

[00453] 5) Adicionar 120 μL da mistura de paragem ao poço.

[00454] 6) Ler OD400 nm. # OD400 Líquida = OD400 (amostra) — OD400 (branco)

[00455] 1. Branco: Usualmente, a absorvância do branco é menos do que 0,200.

[00456] 2. Especificidade: A resposta não é afetada por glucose (até 100 g/L) ou α-amilase (725 U/mL).

[00457] 3. Reprodutibilidade: A CV da absorvância é menos do que 1 % quando a mesma amostra é analisada 10 vezes.

[00458] 4. Gama linear: A OD400 líquida até 1,6 deve ser proporcional à concentração de enzima.

[00459] 5. Estabilidade de cor: A absorvância não muda durante 2 h a 25 °C.

Ensaio da termoestabilidade

[00460] A termoestabilidade foi determinada para as variantes selecionadas como a atividade residual após tratamento com calor a 63 °C ou 67 °C durante 1 hora usando o estojo de glucoamilase Kikkoman.

Ensaio de inibição pela glucose

[00461] A inibição pela glucose foi determinada como a razão da atividade de glucoamilase (AMG) com e sem glucose. Foi usado o estojo de ensaio Kikkoman para o ensaio de AMG. Dez microlitros das amostras diluídas 3 vezes foram adicionados a 190 microlitros de substrato (solução de substrato no estojo: solução de enzima no estojo: glucose a 40 % ou DW = 1:1:6), e a mistura reacional foi incubada a 37 °C. O tempo de reação dependeu dos substratos, 30 min para o substrato sem glucose e 2 hr com glucose. Depois, 80 microlitros de mistura reacional foram misturados com 160 microlitros de Na2CO3 a 3 % para parar a reação, e a A400 foi medida.

[00462] O valor da inibição pela glucose foi calculado como a seguinte equação;

[00463] Inibição pela glucose = (Vg / Vdw) / (WTg / WTdw)/2*0,5*100

[00464] Vg; delta A400 da variante do substrato com glucose

[00465] Vdw; delta A400 da variante do substrato sem glucose

[00466] Wtg; delta A400 da Gt-AMG do substrato com glucose

[00467] Vdw; delta A400 da Gt-AMG do substrato sem glucose

Manipulações de DNA

[00468] Todos os plasmídeos foram construídos e propagados em células E.coli DH5α. As endonucleases de restrição para manipulações de DNA são obteníveis dos New England Biolabs, Inc. e são usadas de acordo com a instrução. In-fusion (Clontech) é usado para a ligação de DNAs. Os plasmídeos amplificados são recuperados com Estojo de Plasmídeos da Qiagen. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é levada a cabo com DNA polimerase Prime star Max (TaKaRa). É usado Estojo de Extração em Gel QIAquick (Qiagen) para purificação de fragmentos de DNA excisados de géis de agarose. Toda a manipulação de DNA foi basicamente seguida pela instrução do fabricante e Molecular cloning: a laboratory manual (2° edn.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque descrito em Sambrook, Fritsch EF, Maniatis T (1989).

Exemplo 1: Clonagem do gene da glucoamilase Gt-AMG Preparação de cDNA da estirpe Gloeophyllum trabeum.

[00469] O cDNA foi sintetizado seguindo a instrução do estojo de síntese de cDNA Transciptor high Fidelity (Roche).

Clonagem do gene da glucoamilase Gt-AMG.

[00470] O gene da glucoamilase foi reclonado a partir do cDNA em um vetor de expressão de Aspergillus por PCR usando dois iniciadores de clonagem pra102 e pra103 mostrados em baixo, que foram desenhados com base na sequência conhecida e marcadores adicionados para clonagem direta por estratégia IN-FUSIONTM. Iniciador par102: 5’ AGTCTTGATCGGATCCATGTACCGCTTCCTTGTCTGTGCT 3’ Iniciador pra103: 5’ CGCACCACGTGGTTTAAACTTAACGCCAAGTGTCATTCTC 3’

[00471] A PCR foi realizada usando um Dispositivo de DNA PTC-200 sob as condições descritas em baixo.

[00472] Os produtos da reação foram isolados por eletroforese em gel de agarose a 1,0 % usando tampão 1 x TAE onde uma banda de produto de PCR de aproximadamente 1,7 kb foi excisada do gel e purificada usando um Estojo de extração em gel da Qiagen de acordo com as instruções do fabricante. DNA correspondendo ao gene da glucoamilase de Gloeophyllum trabeum foi clonado em um vetor de expressão de Aspergillus linearizado com BamHI e PmeI, usando um Estojo 5X HD IN- FUSIONTM (Clontech) de acordo com as instruções do fabricante.

[00473] Um volume de 2 μL da mistura de ligação foi usado para transformar células E. coli DH5α (TOYOBO). Após um choque de calor a 42 °C durante 45 seg, e resfriamento em gelo, 250 μL de meio SOC foram adicionados, e as células foram incubadas a 37 °C a 225 rpm durante 90 min antes de serem plaqueadas em placas LB ágar contendo 250 μg de ampicilina por mL, e cultivadas durante a noite a 37 °C. Colônias selecionadas foram inoculadas em 3 mL de meio LB suplementado com 50 μg de ampicilina por mL e incubadas a 37 °C a 225 rpm durante a noite. DNA de plasmídeo das colônias selecionadas foi purificado usando miniestojo de plasmídeo Qiagen (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. A sequência do gene da glucoamilase de Gloeophyllum trabeum foi verificada por sequenciação de Sanger antes de expressão heteróloga. Um dos plasmídeos foi selecionado para expressão adicional, e foi nomeado pNori140.

[00474] Protoplastos de um hospedeiro de Aspergillus niger foram preparados como descrito em WO 95/02043. Preferencialmente, a atividade de glucoamilase endógena foi eliminada no hospedeiro de A. niger. O gene da glucoamilase de Gloeophyllum trabeum foi integrado no genoma do hospedeiro de A. niger usando o sistema de integração sítio-dirigido baseado em FLP como descrito em WO2012/160093. Cem μL de suspensão de protoplastos foram misturados com 2,5 μg do plasmídeo pNori140, transportando o gene da glucoamilase de Gloeophyllum trabeum com o promotor, terminador, gene de FLP e locais de integração descritos em WO2012/160093, e 250 microlitros de PEG 4000 a 60 % (Applichem) (polietileno glicol, peso molecular 4.000), CaCl2 a 10 mM, e Tris-HCl a 10 mM pH 7,5 foram adicionados e suavemente misturados. A mistura foi incubada a 37 °C durante 30 minutos e os protoplastos foram misturados com agarose com baixo ponto de ebulição a 6 % (Biowhittaker Molecular Applications) em placas de sacarose COVE (Cove, 1996, Biochim. Biophys. Acta 133:51-56) (1 M) suplementadas com acetamida a 10 mM e CsCl a 15 mM e adicionadas como uma camada de topo em placas de sacarose COVE (1M) suplementadas com acetamida a 10 mM e CsCl a 15 mM para seleção de transformantes (4 mL de ágar de topo por placa). Após incubação durante 6 dias a 32 °C, os esporos de cinco transformantes foram isolados em placa COVE II e os transformantes isolados foram sujeitos a cultivação em frascos.

[00475] Cultivo. O transformante isolado foi inoculado em placa COVE Ngly a 30 °C durante 7 dias, e a cultura da placa foi inoculada em 100 mL de meio MSS e cultivada a 30 °C durante 3 dias em frascos de agitação de 500 mL em um agitador rotativo. 10 mL do caldo de cultura foram inoculados em 100 mL de meio MU-1 e cultivados a 30 °C durante 6 dias. O caldo de cultura foi centrifugado e o sobrenadante foi filtrado usando filtros de membrana de 0,2 μm.

[00476] Gel de afinidade de alfa-ciclodextrina. Dez gramas de pó de Sepharose 6B ativada por Epoxi (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, R.U.) foram suspensos em e lavados com água destilada em um filtro de vidro sinterizado. O gel foi suspenso em solução de acoplamento (100 mL de alfa- ciclodextrina a 12,5 mg/mL, NaOH a 0,5 M) e incubado à temperatura ambiente durante um dia com agitação suave. O gel foi lavado com água destilada em um filtro de vidro sinterizado, suspenso em 100 mL de etanolamina a 1 M, pH 10, e incubado a 50 °C durante 4 horas para bloqueio. O gel foi depois lavado várias vezes usando Tris-HCl a 50 mM, pH 8 e NaOAc a 50 mM, pH 4,0 alternativamente. O gel foi finalmente empacotado em uma coluna de 35-40 mL usando tampão de equilíbrio (NaOAc a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH 4,5).

[00477] Purificação de glucoamilase do caldo de cultura. Caldo de cultura da fermentação de transformantes de A. niger transportando o gene da glucoamilase foi filtrado através de um filtro PES de 0,22 μm, e aplicado a uma coluna de gel de afinidade de alfa-ciclodextrina previamente equilibrada em tampão NaOAc a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH 4,5. O material não ligado foi lavado para forma da coluna com tampão de equilíbrio e a glucoamilase foi eluída usando o mesmo tampão contendo beta-ciclodextrina a 10 mM ao longo de 3 volumes da coluna.

[00478] A atividade de glucoamilase do eluente foi checada para se ver se a glucoamilase se tinha ligado ao gel de afinidade de alfa-ciclodextrina. A amostra de glucoamilase purificada foi depois dialisada contra NaOAc a 20 mM, pH 5,0. A pureza foi finalmente checada por SDS-PAGE, e foi somente encontrada uma banda.

Exemplo 2: Construção e expressão de uma variante sítio- dirigida de glucoamilase de Gloeophyllum trabeum

[00479] Foram realizadas duas reações de PCR com o plasmídeo pNori140, descrito no Exemplo 1, usando os iniciadores V59A-F e V59A-R mostrados em baixo, que foram desenhados para substituírem a alanina, A, na posição 59 da sequência madura por valina, V, e os iniciadores pra102 e pra103 mostrados em baixo, que foram desenhados com base na sequência conhecida e marcadores adicionados para clonagem direta por estratégia IN-FUSIONTM.

[00480] Iniciador par102: 5’ agtcttgatcggatccatgtaccgcttccttgtctgtgct 3’

[00481] Iniciador pra103: 5’ cgcaccacgtggtttaaacttaacgccaagtgtcattctc 3’

[00482] A PCR foi realizada usando um Dispositivo de DNA PTC-200 sob as condições descritas em baixo.

[00483] Os fragmentos de DNA foram recuperados do gel de agarose pelo Estojo de extração em gel da Qiagen de acordo com a instrução do fabricante. Os dois fragmentos purificados resultantes foram clonados em um vetor de expressão de Aspergillus, pNori140, linearizado com BamHI e PmeI usando um IN-FUSIONTM (BD Biosciences, Palo Alto, CA, EUA) de acordo com a instrução do fabricante.

[00484] O volume de ligação foi usado para transformar células E. coli DH5α (TOYOBO). As colônias selecionadas foram inoculadas em 3 mL de meio LB suplementado com 50 μg de ampicilina por mL e incubadas a 37 °C a 225 rpm durante a noite. DNA de plasmídeo das colônias selecionadas foi purificado usando miniestojo de plasmídeo Qiagen (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. A sequência do gene da variante sítio-dirigida da glucoamilase de Gloeophyllum trabeum foi verificado antes de expressão heteróloga e um dos plasmídeos foi selecionado para expressão adicional.

[00485] Protoplastos de células hospedeiras de Aspergillus niger com a atividade de glucoamilase endógena eliminada foram preparados como descrito em WO 95/02043. Cem μL de suspensão de protoplastos foram misturados com 2,5 μg do plasmídeo pNori140, compreendendo o gene variante AMG de G. trabeum tendo a substituição sítio-específica e 250 microlitros de PEG 4000 a 60 % (Applichem) (polietileno glicol, peso molecular 4.000), CaCl2 a 10 mM, e Tris-HCl a 10 mM pH 7,5 foram adicionados e suavemente misturados. A mistura foi incubada a 37 °C durante 30 minutos e os protoplastos foram misturados com agarose com baixo ponto de ebulição a 6 % (Biowhittaker Molecular Applications) em placas de sacarose COVE (Cove, 1996, Biochim. Biophys. Acta 133:51-56) (1 M) suplementadas com acetamida a 10 mM e CsCl a 15 mM e adicionadas como uma camada de topo em placas de sacarose COVE (M) suplementadas com acetamida a 10 mM e CsCl a 15 mM para seleção de transformantes (4 mL de ágar de topo por placa). Após incubação durante 6 dias a 32 °C, os esporos de cinco transformantes foram isolados em placa COVE II e os transformantes isolados foram sujeitos a cultivação em frascos.

[00486] Foram construídas outras variantes usando os iniciadores diretos e reversos mostrados na tabela em baixo.

[00487] Cultivo. Os transformantes isolados foram inoculados em placa COVE Ngly a 30 °C durante 7 dias, e a cultura da placa foi inoculada em 100 mL de meio MSS e cultivada a 30 °C durante 3 dias em frascos de agitação de 500 mL em um agitador rotativo. 10 mL do caldo de cultura foram inoculados em 100 mL de meio MU-1 e cultivados a 30 °C durante 6 dias. O caldo de cultura foi centrifugado e o sobrenadante foi filtrado usando filtros de membrana de 0,2 μm.

Exemplo 3: Purificação de variantes Gt-AMG sítio-dirigidas

[00488] Os transformantes selecionados da variante foram cultivados em MU-1 como descrito no Exemplo 1 e a cultura foi filtrada através de um filtro PES de 0,22 μm, e aplicada a uma coluna de gel de afinidade de alfa- ciclodextrina previamente equilibrada em tampão NaOAc a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH 4,5. O material não ligado foi lavado para forma da coluna com tampão de equilíbrio e a glucoamilase foi eluída usando o mesmo tampão contendo beta- ciclodextrina a 10 mM ao longo de 3 volumes da coluna.

[00489] A atividade de glucoamilase do eluente foi checada para se ver se a glucoamilase se tinha ligado ao gel de afinidade de alfa-ciclodextrina. As amostras de glucoamilase purificadas foram depois dialisadas contra NaOAc a 20 mM, pH 5,0.

Exemplo 4: Caracterização de variante de glucoamilase tendo termoestabilidade melhorada

[00490] A termoestabilidade de variantes de glucoamilase tendo substituições ou combinações de substituições específicas foi determinada por medição da atividade residual após tratamento com calor a 63 °C e 67 °C durante 1 hora usando o estojo de ensaio de glucoamilase da Kikkoman. Os valores na tabela são em relação à atividade medida para a amostra de controle que não foi sujeita a um tratamento com calor.

[00491] Os resultados são resumidos na tabela 1 em baixo. Tabela 1.

[00492] A termoestabilidade foi melhorada para todas as combinações testadas, das substituições simples (JGA064, 078, 083, e 122), às substituições duplas, JGA098, 099 e 123, às mutações triplas (JGA100 e 125) e JGA100 foi a mais termoestável. Por outro lado, JGA064, 099, e 100 que têm V59A mostraram menos inibição pela glucose, sugerindo que a posição V59 era também importante para inibição pela glucose.

[00493] A inibição pela glucose (GI) foi determinada como a razão de atividades AMG com e sem glucose a 30 %. Os valores são em relação ao tipo selvagem. Valores mais elevados correspondem a menos inibição.

[00494] De modo a afinar o espaço em torno de V59, 4 aminoácidos vizinhos, V18, V37, T422 e A426, foram selecionadas com base na análise da estrutura. Foram construídas e rastreadas quatro bibliotecas de saturação dupla com V59 e aminoácidos selecionados.

Exemplo 5: Caracterização de variantes de glucoamilase tendo tolerância à glucose melhorada e termoestabilidade melhorada

[00495] Das bibliotecas de saturação dupla (V59XV18X, V59X - V37X, V59X - T422X, e V-59X- A426X), JGA127, 128, e 129 foram selecionadas como os melhores candidatos para melhoria da inibição pela glucose. De modo a melhorar a termoestabilidade de JGA127 e 129, as substituições termoestabilizantes, S95P, T119W, e A121P, foram introduzidas. Os seus resultados de caracterização são resumidos na Tabela 2.

[00496] Tabela 2. Caracterização de variantes com menos inibição pela glucose

[00497] Todas as variantes mantiveram uma atividade específica mais baixa.

Exemplo 6: Caracterização de variantes de glucoamilase tendo tolerância à glucose melhorada e termoestabilidade melhorada combinadas com boa atividade específica

[00498] JGA149 foi obtida da biblioteca de saturação em um local da substituição S316X como uma variante menos inibida pela glucose enquanto se mantinha a atividade específica da glucoamilase genitora. De modo a melhorar a sua termoestabilidade, as substituições S95P e A121P foram introduzidas em JGA149 e a variante resultante JGA151 foi caracterizada. A termoestabilidade e atividade específica aumentaram (Tabela 4).

[00499] As formas G2 (nenhum domínio de ligação do amido) de JGA098 e JGA151 foram construídas e nomeadas JGA148 e 203, respectivamente. JGA148 e JGA203 mostraram atividade específica aumentada com nenhuma mudança de outras características (Tabela 3). Tabela 3.

[00500] A invenção descrita e reivindicada aqui não é para ser limitada no escopo pelos aspetos específicos aqui divulgados, uma vez que estes aspetos são pretendidos como ilustrações de vários aspetos da invenção. Quaisquer aspetos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão evidentes àqueles peritos na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações se destinam também a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação, incluindo definições, imperará.

Claims (11)

1. Variante de glucoamilase caracterizado por ter uma propriedade melhorada em relação à glucoamilase genitora consistindo no polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, em que as propriedades melhoradas são termoestabilidade aumentada e tolerância à glicose aumentada, consistindo de uma substituição em uma ou mais posições correspondentes às posições 95, 59, 119, 121, 18 e 426 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 e de 0 a 10 substituições conservativas de aminoácidos, em que a variante tem atividade de glucoamilase e em que a variante tem o polipeptídeo de SEQ ID NO.: 3, e em que a variante consiste de pelo menos uma das seguintes combinações de substituições: V59C + A426G; V59G + A426G; V59C + S95P + T119W + A426G; V59C + S95P + T119W + A121P + A426G; V59C + S95P + A121P + A426G; ou V18F + V59I + S95P + T119W + A121P.

2. Composição caracterizada por compreender o polipeptídeo conforme definido na reivindicação 1.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por compreender uma alfa-amilase e um polipeptídeo conforme definido na reivindicação 1.

4. Uso de um polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por ser para produção de xarope e/ou um produto de fermentação.

5. Processo de produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido caracterizado por compreender as etapas de: (a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito; e (c) fermentação com um organismo fermentador; em que a etapa (a) e/ou a etapa (b) é realizada usando pelo menos uma variante de glucoamilase conforme definido na reivindicação 1.

6. Processo de produção de um produto de xarope a partir de material contendo amido, caracterizado por compreender a etapa de: (a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito na presença de uma variante de glucoamilase conforme definida na reivindicação 1.

7. Polinucleotídeo isolado caracterizado por ter a SEQ ID NO.: 1 que codifica a variante conforme definido na reivindicação 1, ou sua sequência de cDNA ou suas sequências degeneradas que codificam a mesma variante.

8. Constructo de ácido nucleico caracterizado por compreender o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 7.

9. Vetor de expressão caracterizado por compreender o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 7.

10. Célula hospedeira procariótica caracterizada por compreender o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 7.

11. Método de produção de uma variante de glucoamilase, caracterizado por compreender: cultivar a célula hospedeira conforme definida na reivindicação 10 em condições adequadas para a expressão da variante; e recuperar a variante de glucoamilase.