BR112020002115A2 - polipeptídeo variante de trealase, polinucleotídeo, construto de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células, método de produção de uma variante de trealase, e, processo de produção de um produto de fermentação - Google Patents

Abstract

A presente invenção se relaciona com variantes de trealase da trealase GH37 de Myceliophthora sepedonium. A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando as variantes; construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de uso das variantes.

Description

1 / 127 POLIPEPTÍDEO VARIANTE DE TREALASE, POLINUCLEOTÍDEO, CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO, FORMULAÇÃO DE CALDO INTEIRO OU COMPOSIÇÃO DE CULTURA DE CÉLULAS, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA VARIANTE DE TREALASE, E, PROCESSO

DE PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO Referência a uma Listagem de Sequências

[001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é incorporada aqui por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Área da Invenção

[002] A presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo atividade de trealase e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos. A invenção se relaciona também com construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos bem como métodos de produção dos polipeptídeos. A invenção se relaciona também com processos de produção de produtos de fermentação usando uma trealase da invenção. Descrição da Técnica Antecedente

[003] A presente invenção proporciona variantes da enzima trealase com propriedades melhoradas em comparação com o seu genitor. A trealose é um açúcar de dissacarídeos estável consistindo em dois monômeros de açúcar (glucose). A trealose é acumulada em levedura como uma resposta ao estresse em até 10-15% do peso seco celular (GrBa et al. (1975) Eur. J. Appl. Microbiol. 2: 29-37). A trealose não pode ser metabolizada pela levedura. A enzima trealase cliva a trealose em duas unidades de glucose.

[004] As trealases são classificadas em EC 3.2.1.28 (alfa,alfa- trealase) e EC. 3.2.1.93 (alfa,alfa-fosfotrealase). As classes de EC são baseadas nas recomendações do Nomenclature Committee da International

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Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). A descrição das classes de EC pode ser encontrada na internet, p.ex., em “http://www.expasy.org/enzyme/”. As duas classes de enzimas são ambas referidas como “trealases”. Exemplos de trealases neutras incluem trealases de Saccharomyces cerevisiae (Londesborouh et al. (1984) “Characterization of two trehalases from baker's yeast” Biochem J 219, 511-518); Mucor roxii (Dewerchin et al. (1984), “Trehalase activity and cyclic AMP content during early development of Mucor rouxii spores”, J.

Bacteriol. 158, 575-579); Phycomyces blakesleeanus (Thevelein et al. (1983), “Glucose-induced trehalase activation and trehalose mobilization during early germination of Phycomyces blakesleeanys spores” J.

Gen Microbiol. 129, 719-726); Fusarium oxysporium (Amaral et al. (1996), “Comparative study of two trehalase activities from Fusarium oxysporium var Linii” Can.

J Microbiol. 41: 1057-1062). Exemplos de trealases neutras incluem, mas não estão limitadas a, trealases de Saccharomyces cerevisiae (Parvaeh et al. (1996) “Purification and biochemical characterization of the ATH1 gene product, vacuolar acid trehalase from Saccharomyces cereviase” FEBS Lett. 391, 273- 278); Neorospora crassa (Hecker et al. (1973), “Location of trehalase in the ascospores of Neurospora: Relation to ascospore dormancy and germination”. J.

Bacteriol. 115, 592-599); Chaetomium aureum (Sumida et al. (1989), “Purification and some properties of trehalase from Chaetomium aureum MS-27”. J.

Ferment.

Bioeng. 67, 83-86); Aspergillus nidulans (d'Enfert et al. (1997), “Molecular characterization of the Aspergillus nidulans treA gene encoding an acid trehalase required for growth on trehalose”. Mol.

Microbiol. 24, 203-216); Humicola grisea (Zimmermann et al. (1990). ” Purification and properties of an extracellular conidial trehalase from Humicola grisea var. thermoidea“, Biochim.

Acta 1036, 41-46); Humicola grisea (Cardello et al. (1994), “A cytosolic trehalase from the thermophilhilic fungus Humicola grisea var. thermoidea”, Microbiology UK

3 / 127 140, 1671-1677; Scytalidium thermophilum (Kadowaki et al. (1996), “Characterization of the trehalose system from the thermophilic fungus Scytalidium thermophilum” Biochim. Biophys. Acta 1291, 199-205); e Fusarium oxysporium (Amaral et al. (1996), “Comparative study of two trehalase activities from Fusarium oxysporium var Linii” Can. J Microbiol. 41: 1057-1062).

[005] Uma trealase é também conhecida a partir da soja (Aeschbachet et al. (1999) “Purification of the trehalase GmTRE1 from soybean nodules and cloning of its cDNA”, Plant Physiol 119, 489-496).

[006] As trealases estão também presentes no intestino delgado e rins de mamíferos.

[007] WO 2009/121058 (Novozymes) diz respeito a um método de fermentação de açúcares derivados a partir de material vegetal em um produto de fermentação, tal como etanol, usando um organismo fermentador por adição de uma ou mais trealases ao meio de fermentação.

[008] WO 2012/027374 (Dyadic) revela uma trealase de Myceliophthora thermophila que pode ser usada em uma mistura de enzimas para degradação de biomassa lignocelulósica até açúcares fermentáveis.

[009] WO 2013/148993 (Novozymes) divulga um processo de produção de um produto de fermentação, tal como etanol, a partir de material contendo amido por liquefação, sacarificação e fermentação do material contendo amido, em que uma enzima geradora de fonte de carboidratos, uma composição celulolítica e uma trealase estão presentes na fermentação. Uma trealase de Trichoderma reesei é divulgada.

[0010] WO 2015/065978 (Danisco US Inc.) divulga um método de aumento da produção de etanol a partir de um liquefato em uma reação de fermentação incluindo fermentação do liquefato com uma glucoamilase, um organismo fermentador e uma trealase e recuperação do etanol e outros produtos de fermentação no final da fermentação.

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[0011] WO 2016/205127 (Novozymes) divulga uma trealase de Myceliophthora sepedonium pertencendo às Glucosídeo Hidrolases da Família 37 (“GH37”) como definida por CAZY (ver www.cazy.org), tendo elevada termoestabilidade e uma gama de pH ampla. Foi também descoberto que um rendimento aumentado de etanol pode ser obtido quando se adiciona uma trealase à fermentação em um processo de etanol.

[0012] Existe ainda uma necessidade de se proporcionarem enzimas ou composição de enzimas trealase melhoradas adequadas para uso em processos para produção de produtos de fermentação, tais como etanol, em rendimentos aumentados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0013] A presente invenção se relaciona com um polipeptídeo variante de trealase tendo estabilidade aumentada contra a degradação por proteases e/ou termoestabilidade aumentada, compreendendo uma substituição em uma ou mais posições correspondendo à posição 152, 182, 185 ou 583 de SEQ ID NO: 1, em que a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com os aminoácidos 1 a 674 de SEQ ID NO: 1 e em que a variante tem atividade de trealase.

[0014] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando as variantes; construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de produção das variantes. A presente invenção se relaciona também com composições compreendendo o polipeptídeo variante da invenção.

[0015] A presente invenção se relaciona também com um processo de produção de um produto de fermentação, compreendendo (a) liquefação de um material contendo amido com uma alfa amilase;

5 / 127 opcionalmente pré-sacarificação do material liquefeito antes do passo (b); (b) sacarificação do material liquefeito; (c) fermentação usando um organismo fermentador; em que i) uma glucoamilase; ii) uma trealase da invenção; iii) opcionalmente uma composição de enzimas celulolíticas e/ou uma protease; estão presentes e/ou são adicionadas durante - o passo de sacarificação (b); - o passo de fermentação (c); - a sacarificação e fermentação simultâneas; - opcionalmente o passo de pré-sacarificação antes do passo (b).

[0016] A presente invenção se relaciona também com um processo de produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo: (i) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (ii) fermentação usando um organismo fermentador; em que a sacarificação e/ou a fermentação são feitas na presença das seguintes enzimas: glucoamilase, alfa-amilase, trealase variante da invenção e, opcionalmente, uma protease e/ou uma composição de enzimas celulolíticas.

[0017] A presente invenção se relaciona também com um processo de produção de um produto de fermentação a partir de material celulósico pré- tratado, compreendendo: (a) hidrólise do referido material celulósico pré-tratado com

6 / 127 uma composição de enzimas celulolíticas; (b) fermentação usando um organismo fermentador; e (c) opcionalmente recuperação do produto de fermentação, em que uma trealase variante da invenção é adicionada e/ou está presente no passo de hidrólise (a) e/ou passo de fermentação (b).

DEFINIÇÕES

[0018] Trealase: O termo “trealase” significa uma enzima que degrada a trealose nos seus monossacarídeos unitários (i.e., glucose). As trealases são classificadas em EC 3.2.1.28 (alfa,alfa-trealase) e EC. 3.2.1.93 (alfa,alfa-fosfotrealase). As classes de EC são baseadas nas recomendações do Nomenclature Committee da International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). A descrição das classes de EC pode ser encontrada na internet, p.ex., em “http://www.expasy.org/enzyme/”. As trealases são enzimas que catalisam as seguintes reações: EC 3.2.1.28: Alfa,alfa-trealose + H2O  2 D-glucose; EC 3.2.1. 93: Alfa,alfa-trealose 6-fosfato + H2O  D-glucose + D-glucose 6-fosfato.

[0019] Para propósitos da presente invenção, a atividade de trealase pode ser determinada de acordo com o procedimento “Ensaio de Trealase” descrito na seção “Materiais & Métodos”. Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, p.ex., pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de trealase do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade preferencial, uma trealase da invenção é uma Glicosídeo Hidrolase da Família 37 (“trealase GH37”).

[0020] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer

7 / 127 uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações gênicas podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0021] Domínio catalítico: O termo “domínio catalítico” significa a região de uma enzima contendo a maquinaria catalítica da enzima. Em uma modalidade, o domínio catalítico é os aminoácidos 105 a 608 de SEQ ID NO:

1.

[0022] cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA, processada, madura, obtida a partir de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que possam estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário, inicial é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA processado maduro. Em uma modalidade, o cDNA é SEQ ID NO: 3 aqui.

[0023] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de uma variante. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma sua combinação.

[0024] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa sequências de ácido nucleico necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção. Cada

8 / 127 sequência de controle pode ser nativa (i.e., do mesmo gene) ou estranha (i.e., de um gene diferente) em relação ao polinucleotídeo codificado a variante ou nativa ou estranha uma em relação à outra. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência do pró-peptídeo, promotor, sequência do peptídeo sinal e terminador da transcrição. Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de paragem transcricional e translacional. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificante do polinucleotídeo codificando uma variante.

[0025] Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer passo envolvido na produção de uma variante incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional e secreção.

[0026] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando uma variante e está operacionalmente ligada a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.

[0027] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo que tem um ou mais (p.ex., vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade de trealase. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 504 resíduos de aminoácidos (p.ex., aminoácidos 105 a 608 de SEQ ID NO: 1).

[0028] Condições de elevada estringência: O termo “condições de elevada estringência” significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 50%, seguindo procedimentos de

9 / 127 transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS 0,2% a 65 °C.

[0029] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução ou similar com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. Em particular, a célula hospedeira é uma célula hospedeira recombinante. Particularmente, a célula hospedeira recombinante compreende o polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção no qual o referido polinucleotídeo é heterólogo (de origem/espécie diferente) à célula hospedeira. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0030] Propriedade melhorada: O termo “propriedade melhorada” significa uma característica associada a uma variante que é melhorada em comparação com o genitor. Tais propriedades melhoradas incluem, mas não estão limitadas a, termoestabilidade aumentada e estabilidade aumentada contra a degradação por proteases, em particular degradação por mistura de proteases de Aspergillus niger.

[0031] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que seja pelo menos parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente com os quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por

10 / 127 aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes com os quais está naturalmente associada (p.ex., múltiplas cópias de um gene codificando a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0032] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tal como processamento N-terminal, truncamento C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 a 674 de SEQ ID NO: 1. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo.

[0033] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo “sequência codificante do polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de trealase. Em um aspecto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro é os nucleotídeos 61 a 2022 de SEQ ID NO: 2.

[0034] Mutante: O termo “mutante” significa um polinucleotídeo codificando uma variante.

[0035] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiria de outro modo na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0036] Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de

11 / 127 um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.

[0037] Genitor ou trealase genitora: O termo “genitor” ou “trealase genitora” significa qualquer polipeptídeo com atividade de trealase ao qual é feita uma alteração para produzir as variantes de enzima da presente invenção.

[0038] Identidade de sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequências”.

[0039] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue:

[0040] (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento)

[0041] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS

12 / 127 de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento)

[0042] Condições de estringência: O termo “condições de elevada estringência” significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 50%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 65 °C.

[0043] O termo “condições de muito elevada estringência” significa, para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 50%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 70 °C.

[0044] Subsequência: O termo “subsequência” significa um polinucleotídeo tendo um ou mais (p.ex., vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante do polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento tendo atividade de trealase.

[0045] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo tendo atividade de trealase compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Uma substituição significa substituição do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido

13 / 127 ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente ao e imediatamente após o aminoácido ocupando uma posição. As variantes da presente invenção têm pelo menos 20%, p.ex., pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de trealase do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[0046] Trealase de tipo selvagem: O termo trealase de “tipo selvagem” significa uma trealase expressa por um microrganismo ocorrendo naturalmente, tal como uma bactéria, levedura ou fungo filamentoso encontrado na natureza. Convenções para Designação de Variantes

[0047] Para propósitos da presente invenção, o polipeptídeo maduro divulgado como SEQ ID NO: 1 é usado para se determinar o resíduo de aminoácido correspondente em outra trealase. A sequência de aminoácidos de outra trealase é alinhada com o polipeptídeo divulgado em SEQ ID NO: 1 e, com base no alinhamento, o número de posições dos aminoácidos correspondendo a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptídeo maduro divulgado como SEQ ID NO: 1, é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62).

[0048] A identificação do resíduo de aminoácido correspondente na trealase pode ser determinada por um alinhamento de múltiplas sequências de polipeptídeos usando vários programas de computador incluindo, mas não se limitando a, MUSCLE (comparação de múltiplas sequências por expectativa

14 / 127 log; versão 3.5 ou posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792- 1797), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673- 4680), usando seus respectivos parâmetros de definição.

[0049] Quando a outra enzima divergiu do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 tal que a comparação tradicional à base de sequências falhe em detectar a sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), outros algoritmos de comparação de sequências par a par podem ser usados. Pode ser alcançada maior sensibilidade na pesquisa baseada em sequências usando programas de pesquisa que utilizam representações probabilísticas de famílias (perfis) de polipeptídeos para pesquisar bases de dados. Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis através de um processo iterativo de pesquisa de bases de dados e é capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Pode ser alcançada ainda maior sensibilidade se a família ou superfamília para o polipeptídeo tiver um ou mais representantes nas bases de dados de estrutura de proteína. Programas tais como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizam informação a partir de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamentos estruturais e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prevê a dobragem estrutural para uma sequência de consulta. Similarmente, o método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados SCOP. Estes alinhamentos podem por sua vez ser usados para gerar modelos

15 / 127 de homologia para o polipeptídeo, e tais modelos podem ser avaliados quanto à precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para esse propósito.

[0050] Para proteínas de estrutura conhecida estão disponíveis várias ferramentas e recursos para recuperar e gerar alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias de proteínas SCOP foram estruturalmente alinhadas, e esses alinhamentos estão acessíveis e são descarregáveis. Duas ou mais estruturas de proteína podem ser alinhadas usando uma variedade de algoritmos tais como a matriz de alinhamento de distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatorial (Shindyalov e Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), e pode ser adicionalmente utilizada implementação destes algoritmos para consultar bases de dados de estruturas com uma estrutura de interesse de modo a descobrirem possíveis homólogos estruturais (p.ex., Holm e Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

[0051] Na descrição das variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita em baixo é adaptada para facilidade de referência. É empregue a abreviatura de aminoácidos de letra única ou três letras aceite pela IUPAC.

[0052] Substituições. Para uma substituição de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Conformemente, a substituição de treonina na posição 226 por alanina é designada como “Thr226Ala” ou “T226A”. Mutações múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), p.ex., “Gly205Arg + Ser411Phe” ou “G205R + S411F”, representando substituições nas posições 205 e 411 de glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

[0053] Deleções. Para uma deleção de aminoácido é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, *. Conformemente, a deleção de glicina na posição 195 é designada como “Gly195*” ou “G195*”. Deleções múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), p.ex., “Gly195* +

16 / 127 Ser411*” ou “G195* + S411*”.

[0054] Inserções. Para uma inserção de aminoácido é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. Conformemente, a inserção de lisina após glicina na posição 195 é designada "Gly195GlyLys” ou “G195GK”. Uma inserção de múltiplos aminoácidos é designada [Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido #1, aminoácido inserido #2; etc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após glicina na posição 195 é indicada como “Gly195GlyLysAla” ou “G195GKA”.

[0055] Em tais casos, o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s) é(são) numerado(s) pela adição de letras minúsculas ao número de posição do resíduo de aminoácido precedendo o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s). No exemplo acima, a sequência seria assim: Genitor: Variante: 195 195 195a 195b G G - K - A

[0056] Alterações múltiplas. Variantes compreendendo múltiplas alterações são separadas por sinais de adição (“+”), p.ex., “Arg170Tyr + Gly195Glu” ou “R170Y + G195E” representando uma substituição de arginina e glicina nas posições 170 e 195 por tirosina e ácido glutâmico, respectivamente.

[0057] Diferentes alterações. Onde alterações diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes são separadas por uma vírgula, p.ex., “Arg170Tyr,Glu” representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico. Assim, “Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala” designa as seguintes variantes:

[0058] “Tyr167Gly + Arg170Gly”, “Tyr167Gly + Arg170Ala”, “Tyr167Ala + Arg170Gly” e “Tyr167Ala + Arg170Ala”.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0059] A presente invenção se relaciona com variantes de trealase,

17 / 127 compreendendo uma substituição em uma ou mais (p.ex., várias) posições correspondendo às posições 152, 182, 185 e 583 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a variante tem atividade de trealase. Em particular, a trealase variante da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação por proteases e/ou termoestabilidade aumentada em comparação com a trealase de SEQ ID NO: 1. Variantes

[0060] A presente invenção proporciona variantes de trealase, compreendendo uma substituição em uma ou mais (p.ex., várias) posições correspondendo às posições 152, 182, 185 e 583, em que a variante tem atividade de trealase.

[0061] Em uma modalidade, a variante tem identidade de sequências de pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, com a sequência de aminoácidos da trealase genitora.

[0062] Em outra modalidade, a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[0063] Em um aspecto, o número de alterações nas variantes da presente invenção é 1-20, p.ex., 1-10 e 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições.

[0064] Em outro aspeto, uma variante compreende uma substituição em uma ou mais (p.ex., várias) posições correspondendo às posições 152, 182, 185 e 583. Em outro aspeto, a variante compreende substituição em duas

18 / 127 posições correspondendo a qualquer uma das posições 152, 182, 185 e 583. Em outro aspeto, a variante compreende uma substituição em três posições correspondendo a qualquer uma das posições 152, 182, 185 e 583. Em outro aspeto, a variante compreende uma substituição em cada posição correspondendo às posições 152, 182, 185 e 583.

[0065] Em outro aspeto, a variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 152. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 152 está substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Ala, Glu, Gly. Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições P152G, P152E, P152A do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[0066] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 182. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 182 está substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Val. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição F182V do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[0067] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 185. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 185 está substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Arg. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição F185R do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[0068] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma substituição em uma posição correspondendo à posição 583. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 583 está

19 / 127 substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferencialmente por Thr. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição G583T do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[0069] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições 152 e 182, tais como aquelas descritas acima.

[0070] Em outro aspeto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições 152 e 185, tais como aquelas descritas acima.

[0071] Em outro aspeto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições 152 e 583, tais como aquelas descritas acima.

[0072] Em outro aspeto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições 182 e 185, tais como aquelas descritas acima.

[0073] Em outro aspeto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições 182 e 583, tais como aquelas descritas acima.

[0074] Em outro aspeto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições 185 e 583, tais como aquelas descritas acima.

[0075] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições 152, 182 e 185, tais como aquelas descritas acima.

[0076] Em outro aspeto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições 152, 182, e 583, tais como aquelas descritas acima.

[0077] Em outro aspeto, a variante compreende ou consiste em

20 / 127 substituições em posições correspondendo às posições 152, 185, e 583, tais como aquelas descritas acima.

[0078] Em outro aspeto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições 182, 185, e 583, tais como aquelas descritas acima.

[0079] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições 152, 182, 185 e 583, tais como aquelas descritas acima.

[0080] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em uma ou mais (p.ex., várias) substituições selecionadas do grupo consistindo em P152G, P152E, P152A, F182V, F185R e G583T.

[0081] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições P152G,E,A + F182V do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou de um polipeptídeo tendo pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem atividade de trealase e, adicionalmente, a variante da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação por proteases e/ou termoestabilidade aumentada em comparação com a trealase de SEQ ID NO: 1.

[0082] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições P152G,E,A + F185R do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou de um polipeptídeo tendo pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem atividade de trealase e, adicionalmente, a variante da invenção tem estabilidade aumentada

21 / 127 contra a degradação por proteases e/ou termoestabilidade aumentada em comparação com a trealase de SEQ ID NO: 1.

[0083] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições P152G,E,A + G583T do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou de um polipeptídeo tendo pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem atividade de trealase e, adicionalmente, a variante da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação por proteases e/ou termoestabilidade aumentada em comparação com a trealase de SEQ ID NO: 1.

[0084] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições F182V + F185R do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou de um polipeptídeo tendo pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem atividade de trealase e, adicionalmente, a variante da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação por proteases e/ou termoestabilidade aumentada em comparação com a trealase de SEQ ID NO: 1.

[0085] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições F182V + G583T do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou de um polipeptídeo tendo pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem atividade de

22 / 127 trealase e, adicionalmente, a variante da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação por proteases e/ou termoestabilidade aumentada em comparação com a trealase de SEQ ID NO: 1.

[0086] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições F185R + G583T do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou de um polipeptídeo tendo pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem atividade de trealase e, adicionalmente, a variante da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação por proteases e/ou termoestabilidade aumentada em comparação com a trealase de SEQ ID NO: 1.

[0087] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições P152G,E,A + F182V + F185R do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou de um polipeptídeo tendo pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem atividade de trealase e, adicionalmente, a variante da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação por proteases e/ou termoestabilidade aumentada em comparação com a trealase de SEQ ID NO:

1.

[0088] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições P152G,E,A + F182V + G583T do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou de um polipeptídeo tendo pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo

23 / 127 menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem atividade de trealase e, adicionalmente, a variante da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação por proteases e/ou termoestabilidade aumentada em comparação com a trealase de SEQ ID NO:

1.

[0089] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas substituições P152G,E,A + F185R + G583T do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou de um polipeptídeo tendo pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem atividade de trealase e, adicionalmente, a variante da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação por proteases e/ou termoestabilidade aumentada em comparação com a trealase de SEQ ID NO:

1.

[0090] Em outro aspecto, a variante compreende as ou consiste nas substituições F182V + F185R + G583T do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou de um polipeptídeo tendo pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem atividade de trealase e, adicionalmente, a variante da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação por proteases e/ou termoestabilidade aumentada em comparação com a trealase de SEQ ID NO:

1.

[0091] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste nas

24 / 127 substituições P152G,E,A + F182V + F185R + G583T do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou de um polipeptídeo tendo pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem atividade de trealase e, adicionalmente, a variante da invenção tem estabilidade aumentada contra a degradação por proteases e/ou termoestabilidade aumentada em comparação com a trealase de SEQ ID NO:

1.

[0092] Em outro aspecto, o polipeptídeo variante de trealase tendo estabilidade aumentada contra a degradação por proteases compreende uma substituição ou combinação de substituições selecionada de: G583T; P152G; P152E; P152A; F182V; F185R; P152G + G583T; F185R + G583T; P152A + F182V + G583T; F182V + F185R +G583T; e em que a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com os aminoácidos 1 a 674 de SEQ ID NO: 3 e em que a variante tem atividade de trealase e em que a atividade residual após incubação de 3 dias com mistura de proteases de A. niger a 30 °C, pH 4,0 é

25 / 127 pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%.

[0093] Em outro aspecto, o polipeptídeo variante de trealase tendo termoestabilidade aumentada compreende uma substituição ou combinação de substituições selecionada de: P152G; P152E; P152A; F182V; F185R; P152G + G583T; F185R + G583T; P152A + F182V + G583T; F182V + F185R +G583T; e em que a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com os aminoácidos 1 a 674 de SEQ ID NO: 3 e em que a variante tem atividade de trealase e em que a temperatura de desnaturação térmica medida por ensaio de TSA é pelo menos 65,7 °C.

[0094] Em outro aspecto, o polipeptídeo variante de trealase tendo termoestabilidade aumentada compreende uma substituição ou combinação de substituições selecionada de: P152G; P152E; P152A; F182V; F185R; P152G + G583T; F185R + G583T;

26 / 127 F182V + F185R +G583T; e em que a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com os aminoácidos 1 a 674 de SEQ ID NO: 3 e em que a variante tem atividade de trealase e em que a temperatura de desnaturação térmica medida por ensaio de TSA é pelo menos 65,8 °C.

[0095] Em outro aspecto, o polipeptídeo variante de trealase tendo termoestabilidade aumentada compreende uma substituição ou combinação de substituições selecionada de: P152G; P152E; F182V; F185R; P152G + G583T; F185R + G583T; F182V + F185R +G583T; e em que a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com os aminoácidos 1 a 674 de SEQ ID NO: 3 e em que a variante tem atividade de trealase e em que a temperatura de desnaturação térmica medida por ensaio de TSA é pelo menos 66,0 °C.

[0096] As variantes podem compreender adicionalmente uma ou mais alterações adicionais em uma ou mais (p.ex., várias) outras posições.

[0097] As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões

27 / 127 amino- ou carboxila-terminais, tais como um resíduo de metionina amino- terminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga líquida ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[0098] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que geralmente não alteram a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

[0099] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura por alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Em esta última técnica, mutações de alanina simples são introduzidas em cada resíduo da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de trealase para se identificarem resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de

28 / 127 aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[00100] Em uma modalidade, a variante tem estabilidade aumentada contra a degradação por proteases em comparação com a enzima genitora.

[00101] Em uma modalidade, a variante tem termoestabilidade melhorada em comparação com a enzima genitora, p.ex., SEQ ID NO: 1, como medida por ensaio de TSA descrito aqui. Particularmente, a temperatura de desnaturação térmica,Td2, é pelo menos 65,7 °C, mais particularmente pelo menos 65,8 °C, mais particularmente 66,0 °C. Trealase genitora

[00102] A trealase genitora pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de baixa estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou o seu cDNA ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); ou (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[00103] A sequência de cDNA é incluída aqui como SEQ ID NO: 3.

[00104] Em um aspecto, o genitor tem uma identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de trealase. Em um

29 / 127 aspecto, a sequência de aminoácidos do genitor difere em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[00105] Em outro aspecto, o genitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[00106] Em outra modalidade, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[00107] O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2, ou uma sua subsequência, pode ser usado para conceber sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando um genitor a partir de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão, de modo a se identificar e isolar o gene correspondente no mesmo. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, p.ex., pelo menos 25, pelo menos 35 ou pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, p.ex., pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detecção do gene correspondente (por 32 exemplo, com P, 3H, 35 S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[00108] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA, preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto ao DNA que hibrida com as sondas descritas acima e codifica um genitor. O DNA genômico ou outro tipo de DNA de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese

30 / 127 em gel de agarose ou poliacrilamida ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para e imobilizado em nitrocelulose ou outro material transportador adequado. De modo a se identificar um clone ou DNA que hibrida com SEQ ID NO: 2 ou uma sua subsequência, o material transportador é usado em uma transferência de Southern.

[00109] Para propósitos da presente invenção, a hibridação indica que o polinucleotídeo hibrida com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo (i) a SEQ ID NO: 2; (ii) à sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (iii) a sua sequência de cDNA; (iv) o seu complemento de comprimento total; ou (v) uma sua subsequência; sob condições de muito baixa a muito elevada estringência. Moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibrida sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[00110] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é os nucleotídeos 61 a 2022 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, a sonda de ácidos nucleicos é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1; o seu polipeptídeo maduro; ou um seu fragmento. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

[00111] Em outra modalidade, o genitor é codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou a sua sequência de cDNA de pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou

31 / 127 100%.

[00112] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de outro polipeptídeo.

[00113] O genitor pode ser um polipeptídeo de fusão ou polipeptídeo de fusão clivável ao qual outro polipeptídeo está fundido no terminal N ou terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando outro polipeptídeo com um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica e incluem ligação das sequências codificantes codificando os polipeptídeos tal que fiquem em grelha e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Os polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[00114] Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[00115] O genitor pode ser obtido a partir de microrganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo “obtido a

32 / 127 partir de” como usado aqui em combinação com uma dada fonte deverá significar que o genitor codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma estirpe na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o genitor é secretado extracelularmente.

[00116] Em outro aspecto, o genitor é uma trealase de Myceliophthora sepedonium pertencendo às Glucosídeo Hidrolases da Família 37 (“GH37”) como definido por CAZY, p.ex., a trealase de SEQ ID NO: 1.

[00117] As estirpes destas espécies são prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[00118] O genitor pode ser identificado e obtido a partir de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (p.ex., solo, adubos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente a partir de materiais naturais (p.ex., solo, adubos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando um genitor pode ser depois obtido por rastreamento similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídeo codificando um genitor com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas dos peritos na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra). Preparação de Variantes

[00119] As variantes podem ser preparadas usando qualquer procedimento de mutagênese conhecido na técnica, tal como mutagênese sítio-dirigida, construção de genes sintética, construção de genes

33 / 127 semissintética, mutagênese aleatória, embaralhamento, etc.

[00120] A mutagênese sítio-dirigida é uma técnica na qual uma ou mais (p.ex., várias) mutações são introduzidas em um ou mais locais definidos em um polinucleotídeo codificando o genitor.

[00121] A mutagênese sítio-dirigida pode ser alcançada in vitro por PCR envolvendo o uso de iniciadores de oligonucleotídeos contendo a mutação desejada. A mutagênese sítio-dirigida pode ser também realizada in vitro por mutagênese de cassete envolvendo a clivagem por uma enzima de restrição em um local no plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codificando o genitor e subsequente ligação de um oligonucleotídeo contendo a mutação no polinucleotídeo. Usualmente, a enzima de restrição que digere o plasmídeo e o oligonucleotídeo é a mesma, permitindo que as extremidades coesivas do plasmídeo e da inserção se liguem umas às outras. Ver, p.ex., Scherer e Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; e Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[00122] A mutagênese sítio-dirigida pode ser também alcançada in vivo por métodos conhecidos na técnica. Ver, p.ex., Publicação do Pedido de Patente dos E.U.A. No. 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; e Calissano e Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

[00123] Pode ser usado qualquer procedimento de mutagênese sítio- dirigida na presente invenção. Existem vários estojos comerciais disponíveis que podem ser usados para preparar variantes.

[00124] A construção de genes sintética implica síntese in vitro de uma molécula de polinucleotídeo concebida para codificar um polipeptídeo de interesse. A síntese de genes pode ser realizada utilizando um número de técnicas, tais como a tecnologia à base de microchip em múltiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) e tecnologias similares em que oligonucleotídeos são sintetizados e montados mediante chips microfluídicos

34 / 127 fotoprogramáveis.

[00125] Podem ser feitas e testadas substituições, deleções e/ou inserções únicas ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreamento relevante, tais como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição em fagos (p.ex., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832- 10837; Patente dos E.U.A. No. 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese dirigida a regiões (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[00126] Podem ser combinados métodos de mutagênese/embaralhamento com métodos de rastreamento automatizados, de elevada produtividade para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[00127] A construção de genes semissintética é alcançada por combinação de aspectos da construção de genes sintética e/ou mutagênese sítio-dirigida e/ou mutagênese aleatória e/ou embaralhamento. A construção semissintética é tipificada por um processo utilizando fragmentos de polinucleotídeos que são sintetizados, em combinação com técnicas de PCR. Regiões definidas de genes podem assim ser sintetizadas de novo, enquanto outras regiões podem ser amplificadas usando iniciadores mutagênicos sítio- específicos, enquanto ainda outras regiões podem estar sujeitas à amplificação

35 / 127 por PCR propensa a erros ou PCR não propensa a erros. As subsequências de polinucleotídeos podem ser depois embaralhadas. Polinucleotídeos

[00128] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando uma variante da presente invenção. Em uma modalidade, o polinucleotídeo é isolado. Construtos de Ácido Nucleico

[00129] A presente invenção se relaciona também com construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle. Em uma modalidade particular, pelo menos uma sequência de controle é heteróloga (de origem/espécie diferente) em relação ao polinucleotídeo codificando a variante da presente invenção.

[00130] O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de modos para proporcionar a expressão de uma variante. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[00131] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão da variante. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos e pode ser obtido a partir de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos em relação à célula hospedeira.

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[00132] Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos a partir dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácida estável de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene de alfa-amilase neutro de Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene de triose fosfato isomerase de Aspergillus; exemplos não limitantes incluem promotores modificados de um gene de alfa-amilase neutra de Aspergillus niger no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene de triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados e híbridos.

[00133] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos a partir dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactocinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de

37 / 127 Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae e 3- fosfogliceratocinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[00134] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência do terminador está operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando a variante. Pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.

[00135] Terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae e protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[00136] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes da enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[00137] A sequência de controle também pode ser uma região estabilizante de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[00138] A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência líder está operacionalmente ligada ao terminal 5' do polinucleotídeo codificando a variante. Pode ser usado qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira.

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[00139] Líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes da amilase TAKA de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[00140] Líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[00141] A sequência de controle pode ser também uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' da sequência codificante da variante e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira.

[00142] Sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa- glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae e protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[00143] Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[00144] A sequência de controle pode ser também uma região codificante do peptídeo-sinal que codifica um peptídeo-sinal ligado ao terminal N de uma variante e dirige a variante para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante do peptídeo-sinal naturalmente ligada em grelha de leitura de tradução ao segmento da sequência codificante que codifica a variante. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência

39 / 127 codificante pode conter uma sequência codificante do peptídeo-sinal que é estranha à sequência codificante. Uma sequência codificante do peptídeo- sinal estranha pode ser requerida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante do peptídeo-sinal. Alternativamente, uma sequência codificante do peptídeo-sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo-sinal natural de modo a intensificar a secreção da variante. No entanto pode ser usada qualquer sequência codificante do peptídeo-sinal que dirija a variante expressa para a via secretora de uma célula hospedeira.

[00145] Sequências codificantes do peptídeo-sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências codificantes do peptídeo- sinal obtidas a partir dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[00146] Peptídeos-sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes do fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências codificantes do peptídeo-sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[00147] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificante do pró-peptídeo que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal N de uma variante. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró- polipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró- polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida a partir dos genes da lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

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[00148] Onde estiverem presentes sequências do peptídeo-sinal e pró- peptídeo, a sequência do pró-peptídeo está posicionada junto ao terminal N da variante e a sequência do peptídeo-sinal está posicionada junto ao terminal N da sequência do pró-peptídeo.

[00149] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão da variante em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Em levedura pode ser usado o sistema ADH2 ou sistema GAL1. Em fungos filamentosos podem ser usados o promotor de glucoamilase de Aspergillus niger, promotor de alfa-amilase TAKA de Aspergillus oryzae e promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem a amplificação de genes. Em sistemas eucariotas, estas sequências reguladoras incluem o gene da di-idrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato e os genes da metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Em estes casos, o polinucleotídeo codificando a variante estaria operacionalmente ligado à sequência reguladora. Vetores de Expressão

[00150] A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção, um promotor e sinais de terminação transcricional e translacional. As várias sequências de nucleotídeos e controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando a variante em tais locais. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico compreendendo o

41 / 127 polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor tal que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada com as sequências de controle apropriadas para expressão.

[00151] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (p.ex., um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e podem dar origem à expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[00152] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente da replicação cromossômica, p.ex., um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) no(s) qual(ais) foi integrado. Além do mais pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transpóson.

[00153] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores de seleção que permitam seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador de seleção é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxótrofos e similares.

[00154] Marcadores adequados para células hospedeiras de levedura incluem, mas não estão limitados a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Os marcadores selecionáveis para uso em uma célula

42 / 127 hospedeira fúngica filamentosa incluem, mas não estão limitados a, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5’-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase) e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. São preferenciais para uso em uma célula de Aspergillus os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

[00155] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.

[00156] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo codificando a variante ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para dirigir a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em uma localização(ões) precisa(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem conter uma quantidade suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequências com a sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integrais podem ser qualquer sequência que seja homóloga à sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[00157] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender

43 / 127 adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediador da replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[00158] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3 e a combinação de ARS4 e CEN6.

[00159] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos divulgados em WO 00/24883.

[00160] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de uma variante. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e deste modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultura das células na presença do agente selecionável apropriado.

[00161] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos de um perito na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra). Células Hospedeiras

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[00162] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de uma variante da presente invenção. Em uma modalidade particular, a célula hospedeira recombinante compreende o polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção no qual o referido polinucleotídeo é heterólogo (de origem/espécie diferente) à célula hospedeira. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande parte do gene codificando a variante e sua fonte.

[00163] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de uma variante, p.ex., um procariota ou um eucariota.

[00164] A célula hospedeira pode ser também um eucariota, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fúngica.

[00165] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos” como usado aqui inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definido por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8ª edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).

[00166] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura” como usada aqui inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena e levedura pertencendo aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de leveduras pode variar no

45 / 127 futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deverá ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore e Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series N.º 9, 1980).

[00167] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis ou Yarrowia lipolytica. Em uma modalidade particular, a célula hospedeira é uma célula de Saccharomyces cerevisiae. Em uma modalidade particular adicional, a célula hospedeira, particularmente Saccharomyces cerevisiae, é usada como organismo fermentador expressando a trealase de acordo com a invenção.

[00168] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas das subdivisões Eumycota e Oomycota (como definidas por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por brotamento de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

[00169] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia,

46 / 127 Tolypocladium, Trametes ou Trichoderma.

[00170] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

[00171] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos, transformações dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474 e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Os métodos adequados para transformação de

47 / 127 espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147- 156 e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920. Métodos de Produção

[00172] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de uma variante, compreendendo: (a) cultura de uma célula hospedeira da presente invenção sob condições adequadas para expressão da variante; e (b) recuperação da variante.

[00173] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção da variante usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultura em frasco agitado ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizada em um meio adequado e sob condições permitindo que a variante seja expressa e/ou isolada. A cultura ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (p.ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Se a variante for secretada para o meio nutriente, a variante pode ser recuperada diretamente a partir do meio. Se a variante não for secretada pode ser recuperada a partir de lisados celulares.

[00174] A variante pode ser detectada usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para as variantes. Estes métodos de detecção incluem, mas não estão limitados a, uso de anticorpos específicos, formação

48 / 127 de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo pode ser usado um ensaio de enzima para se determinar a atividade da variante.

[00175] A variante pode ser recuperada usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a variante pode ser recuperada a partir do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

[00176] A variante pode ser purificada por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p.ex., permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão por tamanhos), procedimentos eletroforéticos (p.ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p.ex., precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, p.ex., Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para se obterem variantes substancialmente puras.

[00177] Em um aspecto alternativo, a variante não é recuperada, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando a variante é usada como uma fonte da variante. Formulações de Caldo de Fermentação ou Composições de Células

[00178] A presente invenção se relaciona também com uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. Em uma modalidade particular, a formulação de caldo inteiro é gerada por fermentação de uma célula hospedeira recombinante da invenção. O produto de caldo de fermentação compreende adicionalmente ingredientes adicionais usados no processo de fermentação, tais como, por exemplo, células (incluindo as células hospedeiras contendo o gene codificando o polipeptídeo da presente invenção que são usadas para produzir o polipeptídeo de interesse), detritos

49 / 127 celulares, biomassa, meios de fermentação e/ou produtos de fermentação. Em algumas modalidades, a composição é um caldo inteiro de células mortas contendo ácido(s) orgânico(s), células mortas e/ou detritos celulares e meio de cultura.

[00179] O termo “caldo de fermentação” como usado aqui se refere a uma preparação produzida por fermentação celular que sofre recuperação e/ou purificação nulas ou mínimas. Por exemplo são produzidos caldos de fermentação quando culturas microbianas são cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir síntese de proteínas (p.ex., expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção de proteínas no meio de cultura de células. O caldo de fermentação pode conter conteúdos tanto não fracionados como fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação não é fracionado e compreende o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (p.ex., células fúngicas filamentosas) serem removidas, p.ex., por centrifugação. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação contém meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.

[00180] Em uma modalidade, a formulação de caldo de fermentação e composições de células compreendem um primeiro componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 1-5 carbonos e/ou um seu sal e um segundo componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 6 ou mais carbonos e/ou um seu sal. Em uma modalidade específica, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um seu sal, ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores e o segundo componente de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um seu sal ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores.

[00181] Em um aspecto, a composição contém um ácido(s) orgânico(s)

50 / 127 e, opcionalmente, contém adicionalmente células mortas e/ou detritos celulares. Em uma modalidade, as células mortas e/ou detritos celulares são removidos a partir de um caldo inteiro de células mortas para proporcionar uma composição que esteja isenta destes componentes.

[00182] As formulações de caldo de fermentação ou composições celulares podem compreender adicionalmente um conservante e/ou agente antimicrobiano (p.ex., bacteriostático), incluindo, mas não se limitando a, sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio e outros conhecidos na técnica.

[00183] O caldo inteiro ou composição de células mortas pode conter os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo inteiro ou composição de células mortas contém o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (p.ex., células fúngicas filamentosas) serem cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas. Em algumas modalidades, o caldo inteiro ou composição de células mortas contém o meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e células fúngicas filamentosas mortas. Em algumas modalidades, as células microbianas presentes no caldo inteiro ou composição de células mortas podem ser permeabilizadas e/ou lisadas usando métodos conhecidos na técnica.

[00184] Um caldo inteiro ou composição de células como descrito aqui é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, detritos celulares, componentes de meios de cultura e/ou enzima(s) insolúvel(eis). Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para proporcionar uma composição líquida clarificada.

[00185] As formulações de caldo inteiro e composições de células da presente invenção podem ser produzidas por um método descrito em WO 90/15861 ou WO 2010/096673.

51 / 127 Composições de Enzimas

[00186] A presente invenção se relaciona também com composições compreendendo um polipeptídeo tendo atividade de trealase da presente invenção. Preferencialmente, as composições são enriquecidas em um tal polipeptídeo. O termo “enriquecido” indica que a atividade de trealase da composição foi aumentada, p.ex., com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.

[00187] As composições podem compreender um polipeptídeo da presente invenção como o principal componente enzimático, p.ex., uma composição monocomponente. Alternativamente, as composições podem compreender múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorredutase ou transferase, p.ex., uma alfa-galactosidase, alfa- glucosidase, aminopeptidase, amilase, beta-galactosidase, beta-glucosidase, beta-xilosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoamilase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase.

[00188] Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção e uma glucoamilase. Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção e uma glucoamilase derivada a partir de Talaromyces emersonii (p.ex., SEQ ID NO: 4). Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção e uma glucoamilase derivada a partir de Gloeophyllum, tal como G. serpiarium (p.ex., SEQ ID NO: 5) ou G. trabeum (p.ex., SEQ ID NO: 6). Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção, uma glucoamilase e uma alfa-amilase. Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da

52 / 127 invenção, uma glucoamilase e uma alfa-amilase derivada a partir de Rhizomucor, preferencialmente uma estirpe de Rhizomucor pusillus, tal como um híbrido de alfa-amilase de Rhizomucor pusillus tendo um ligante (p.ex., de Aspergillus niger) e domínio de ligação ao amido (p.ex., de Aspergillus niger). Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa-amilase e uma composição de enzimas celulolíticas. Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa-amilase e uma composição de enzimas celulolíticas, em que a composição celulolíticas é derivada a partir de Trichoderma reesei. Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa-amilase e uma protease. Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa-amilase e uma protease. A protease pode ser derivada a partir de Thermoascus aurantiacus. Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção, uma glucoamilase, uma alfa-amilase, uma composição de enzimas celulolíticas e uma protease. Em uma modalidade, a composição compreende uma trealase da invenção, uma glucoamilase, p.ex., derivada a partir de Talaromyces emersonii, Gloeophyllum serpiarium ou Gloephyllum trabeum, uma alfa-amilase, p.ex., derivada a partir de Rhizomucor pusillus, em particular uma tendo um ligante e domínio de ligação ao amido, em particular derivados a partir de Aspergillus niger, em particular tendo as seguintes substituições: G128D + D143N (usando SEQ ID NO: 7 para numeração); uma composição de enzimas celulolíticas derivada a partir de Trichoderma reesei, e uma protease, p.ex., derivada a partir de Thermoascus aurantiacus ou Meripilus giganteus.

[00189] Exemplos de enzimas secundárias especificamente contempladas, p.ex., uma glucoamilase de Talaromyces emersonii mostrada em SEQ ID NO: 4 aqui ou uma glucoamilase tendo, p.ex., pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo

53 / 127 menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 4 aqui podem ser encontrados na seção “Enzimas” em baixo.

[00190] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[00191] São dados em baixo exemplos de usos preferenciais das composições da presente invenção. A dosagem da composição e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica. Usos Processos Da Invenção Produção de um Produto de Fermentação a partir de Material de Amido Gelatinizado Usando uma Trealase da Invenção

[00192] Em este aspecto, a presente invenção se relaciona com produção de um produto de fermentação, em particular etanol, a partir de material contendo amido gelatinizado e/ou não gelatinizado ou material celulósico. Os açúcares fermentáveis gerados durante a sacarificação/hidrólise são convertidos na fermentação desejada em questão, em particular etanol, durante a fermentação por um organismo fermentador, em particular levedura.

[00193] Em uma modalidade, a invenção se relaciona com processos de produção de um produto de fermentação, em particular etanol, compreendendo: (a) liquefação de um material contendo amido com uma alfa- amilase; opcionalmente pré-sacarificação do material liquefeito antes do passo (b); (b) sacarificação do material liquefeito;

54 / 127 (c) fermentação usando um organismo fermentador; em que i) uma glucoamilase; ii) uma trealase da invenção; iii) opcionalmente uma composição de enzimas celulolíticas e/ou uma protease; estão presentes e/ou são adicionadas durante - o passo de sacarificação (b); - o passo de fermentação (c); - a sacarificação e fermentação simultâneas; - opcionalmente o passo de pré-sacarificação antes do passo (b).

[00194] Em outra modalidade, a invenção se relaciona com processos de produção de um produto de fermentação, em particular etanol, compreendendo: (a) liquefação de um material contendo amido com uma alfa- amilase; (b) sacarificação do material liquefeito; (c) fermentação usando um organismo fermentador; em que uma glucoamilase e uma trealase da invenção estão presentes e/ou são adicionadas durante - o passo de sacarificação (b); - o passo de fermentação (c); - a sacarificação e fermentação simultâneas; Passo de liquefação (a)

[00195] De acordo com processos da invenção, a liquefação no passo (a) é levada a cabo por sujeição de material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial, em particular a uma temperatura entre 80-90 °C, a uma alfa-amilase e opcionalmente uma

55 / 127 protease e outras enzimas, tais como uma glucoamilase, uma pululanase e/ou uma fitase.

[00196] O termo “temperatura de gelatinização inicial” significa a temperatura mais baixa à qual a gelatinização do material contendo amido começa. Em geral, o amido aquecido em água começa a gelatinizar entre cerca de 50 °C e 75 °C; a temperatura exata da gelatinização depende do amido específico e pode ser prontamente determinada pelo especialista. Assim, a temperatura de gelatinização inicial pode variar de acordo com a espécie de planta, com a variedade particular da espécie de planta bem como com as condições de crescimento. No contexto da presente invenção, a temperatura de gelatinização inicial de um dado material contendo amido pode ser determinada como a temperatura na qual a birrefringência é perdida em 5% dos grânulos de amido usando o método descrito por Gorinstein e Lii, 1992, Starch/Stärke 44 (12): 461-466.

[00197] De acordo com a invenção, a liquefação no passo (a) é tipicamente levada a cabo a uma temperatura na gama de 70-100 °C. Em uma modalidade, a temperatura na liquefação é entre 75-95 °C, tal como entre 75- 90 °C, preferencialmente entre 80-90 °C, tal como 82-88 °C, tal como em torno de 85 °C.

[00198] O pH na liquefação pode estar na gama entre 3 e 7, preferencialmente de 4 a 6 ou, mais preferencialmente, de 4,5 a 5,5.

[00199] De acordo com a invenção pode ser levado a cabo um passo de cozimento a jato antes da liquefação no passo (a). O cozimento a jato pode ser levado a cabo a uma temperatura entre 110-145 °C, preferencialmente 120- 140 °C, tal como 125-135 °C, preferencialmente em torno de 130 °C durante cerca de 1-15 minutos, preferencialmente durante cerca de 3-10 minutos, especialmente em torno de cerca de 5 minutos.

[00200] Em uma modalidade, o processo da invenção compreende adicionalmente, antes do passo de liquefação (a), os passos de:

56 / 127 x) redução do tamanho das partículas do material contendo amido, preferencialmente por moagem a seco; z) formação de uma pasta semifluida compreendendo o material contendo amido e água.

[00201] De acordo com a invenção, o conteúdo de sólidos secos (DS) na liquefação reside na gama de 20-55% em peso, preferencialmente 25-45% em peso, mais preferencialmente 30-40% em peso ou 30-45% em peso.

[00202] O material de partida contendo amido, tal como grãos integrais, pode ser reduzido em termos do tamanho das partículas, p.ex., por moagem, de modo a abrir a estrutura, a aumentar a área superficial e permitir processamento adicional. Geralmente existem dois tipos de processos: moagem a úmido e a seco. Na moagem a seco, os grãos inteiros são moídos e usados. A moagem a úmido dá origem a uma boa separação do gérmen e do farelo (grânulos de amido e proteína). A moagem a úmido é frequentemente aplicada em locais em que o hidrolisado de amido é utilizado na produção de, p.ex., xaropes. Tanto a moagem a seco como a moagem a úmido são bem conhecidas na técnica de processamento de amido. De acordo com a presente invenção é preferencial a moagem a seco.

[00203] Em uma modalidade, o tamanho das partículas é reduzido até entre 0,05 e 3,0 mm, preferencialmente 0,1-0,5 mm ou tal que pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 70%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, do material contendo amido passe através de uma peneira com uma tela de 0,05 a 3,0 mm, preferencialmente uma tela de 0,1-0,5 mm. Em outra modalidade, pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, especialmente pelo menos 90%, do material contendo amido passa através de uma peneira com tela # 6.

[00204] A liquefação no passo (a) pode ser levada a cabo durante 0,5-5 horas, tal como 1-3 horas, tal como tipicamente cerca de 2 horas.

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[00205] A alfa-amilase e outras enzimas opcionais, tais como protease, podem ser adicionadas inicialmente à pasta semifluida aquosa para iniciar a liquefação (diluição). Em uma modalidade, somente uma porção das enzimas (p.ex., cerca de 1/3) é adicionada à pasta semifluida aquosa, enquanto que o resto das enzimas (p.ex., cerca de 2/3) é adicionado durante o passo de liquefação (a).

[00206] Uma lista não exaustiva de exemplos de alfa-amilases pode ser encontrada em baixo na seção “Alfa-Amilase Presente e/ou Adicionada Na Liquefação”. Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é uma alfa- amilase bacteriana. As alfa-amilases bacterianas são tipicamente termoestáveis. Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é derivada a partir do gênero Bacillus, tal como uma estirpe de Bacillus stearothermophilus, em particular uma variante de uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO 99/019467 ou SEQ ID NO: 8 aqui.

[00207] Em uma modalidade, a alfa-amilase usada no passo de liquefação (a) é uma variante da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus mostrada em SEQ ID NO: 8 aqui, em particular com as deleções duplas em I181* + G182* e, opcionalmente, com uma substituição N193F, e truncada para ter cerca de 491 aminoácidos em comprimento, p.ex., de 480-495 aminoácidos em comprimento.

[00208] Exemplos de variantes de alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus adequadas podem ser encontrados em baixo na seção “Alfa-Amilase Termoestável” e incluem uma do seguinte grupo de variantes de alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus com deleções duplas I181* + G182* e, opcionalmente, a substituição N193F, e adicionalmente as seguintes substituições: - E129V + K177L + R179E; - V59A + Q89R + E129V + K177L + R179E + H208Y +

58 / 127 K220P + N224L + Q254S; - V59A + Q89R + E129V + K177L + R179E + Q254S + M284V; - V59A + E129V + K177L + R179E + Q254S + M284V; e - E129V + K177L + R179E + K220P + N224L + S242Q + Q254S (usando SEQ ID NO: 8 para numeração).

[00209] De acordo com processos da invenção, a liquefação no passo (a) pode ser levada a cabo usando uma combinação de alfa-amilase (p.ex., a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus mostrada em SEQ ID NO: 8) e protease (p.ex., (protease pfu) de Pyrococcus furiosus mostrada em SEQ ID NO: 9). Uma glucoamilase pode estar também presente, tal como aquela derivada a partir de Penicillium oxalicum mostrada em SEQ ID NO: 10 aqui (ver a seção “Glucoamilase Presente e/ou Adicionada No Passo de Liquefação (a)” em baixo). Sacarificação e Fermentação

[00210] Uma trealase da invenção, uma glucoamilase e opcionalmente uma protease e/ou uma composição de enzimas celulolíticas podem estar presentes e/ou ser adicionadas no passo de sacarificação (b); passo de fermentação (c); sacarificação e fermentação simultâneas (SSF); opcionalmente um passo de pré-sacarificação antes do passo (b).

[00211] Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é adicionada em conjunto com uma alfa-amilase fúngica, em particular uma alfa-amilase fúngica ácida. Podem ser encontrados exemplos de glucoamilases na seção “Glucoamilases Presentes e/ou Adicionadas na Sacarificação e/ou Fermentação” em baixo.

[00212] Quando se faz a sacarificação e a fermentação sequenciais, o passo de sacarificação (b) pode ser levado a cabo em condições bem conhecidas na técnica, i.e., adequadas para sacarificação de enzimas. Por exemplo, o passo de sacarificação (b) pode durar de cerca de 24 a cerca de 72

59 / 127 horas.

[00213] Em uma modalidade, a pré-sacarificação é feita antes da sacarificação no passo (b). A pré-sacarificação é tipicamente feita durante 40- 90 minutos a uma temperatura entre 30-65 °C, tipicamente cerca de 60 °C. A pré-sacarificação é em uma modalidade seguida por sacarificação durante a fermentação na sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A sacarificação é tipicamente levada a cabo a temperaturas de 20-75 °C, preferencialmente de 40-70 °C, tipicamente em torno de 60 °C, e a um pH entre 4 e 5, normalmente a cerca de pH 4,5.

[00214] O processo de sacarificação e fermentação simultâneas (“SSF”) é amplamente usado em processos de produção de produtos de fermentação em escala industrial, especialmente em processos de produção de etanol. Quando se faz a SSF, o passo de sacarificação (b) e o passo de fermentação (c) são levados a cabo simultaneamente. Não existe qualquer etapa de espera para a sacarificação, significando que um organismo fermentador, em particular levedura, e enzimas, podem ser adicionados em conjunto. No entanto, está também contemplado adicionar o organismo fermentador e as enzimas separadamente. A SSF é de acordo com a invenção levada a cabo tipicamente a uma temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, preferencialmente em torno de cerca de 32 °C. Em uma modalidade, a fermentação decorre durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas. Em uma modalidade, o pH está entre 4-5.

[00215] Em uma modalidade da invenção, uma composição celulolítica está presente e/ou é adicionada no passo de sacarificação (b), passo de fermentação (c) ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) ou pré- sacarificação antes do passo (b). Exemplos de tais composições celulolíticas podem ser encontrados na seção “Composição de Enzimas Celulolíticas presente e/ou adicionada durante a Sacarificação e/ou Fermentação” em baixo. A composição de enzimas celulolíticas opcional pode estar presente

60 / 127 e/ou ser adicionada em conjunto com a glucoamilase e trealase da invenção. Exemplos de proteases podem ser encontrados na seção “Proteases Presentes e/ou Adicionadas Na Sacarificação e/ou Fermentação” em baixo.

[00216] Em uma modalidade preferencial, a trealase está presente e/ou é adicionada em uma quantidade entre 0,01-20 ug de EP de trealase/g de DS, tal como entre 0,05-15 ug de EP de trealase/g de DS, tal como entre 0,5 e 10 ug de EP de trealase/g de DS. Materiais Contendo Amido

[00217] De acordo com a invenção pode ser usado qualquer material de partida contendo amido adequado. O material de partida é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado, em particular etanol. Exemplos de materiais de partida contendo amido, adequados para uso em processos da presente invenção, incluem cereal, tubérculos ou grãos. Especificamente, o material contendo amido pode ser milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, aveia, arroz, ervilhas, feijão ou batata-doce ou suas misturas. Estão também contemplados tipos cerosos e não cerosos de milho e cevada.

[00218] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é milho.

[00219] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é trigo.

[00220] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é cevada.

[00221] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é centeio.

[00222] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é milo.

[00223] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é sagu.

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[00224] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é mandioca.

[00225] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é tapioca.

[00226] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é sorgo.

[00227] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é arroz.

[00228] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é ervilhas.

[00229] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é feijão.

[00230] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é batata-doce.

[00231] Em uma modalidade preferencial, o material de partida contendo amido é aveia. Produção de um Produto de Fermentação a partir de Material de Amido Não Gelatinizado usando uma Trealase da Invenção

[00232] Uma trealase da invenção pode ser adequadamente usada em um processo de hidrólise de amido cru (RSH) para produção de produtos de fermentação desejados, em particular etanol. Em processos RSH, o amido não gelatiniza à medida que o processo é levado a cabo a temperaturas abaixo da temperatura de gelatinização inicial do amido em questão (definida acima).

[00233] O produto de fermentação desejado pode em uma modalidade ser etanol produzido a partir de grãos de não gelatinizados (i.e., não cozidos), preferencialmente moídos, tais como milho, ou grãos pequenos tais como trigo, aveia, cevada, centeio, arroz, ou cereais tais como sorgo. Exemplos de materiais de partida contendo amido adequados são listados na seção “Materiais Contendo Amido” acima.

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[00234] Conformemente, em este aspecto, a invenção se relaciona com processos de produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo: (a) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (b) fermentação usando um organismo fermentador; e (c) opcionalmente recuperação do produto de fermentação; em que a sacarificação e/ou a fermentação são feitas na presença das seguintes enzimas: glucoamilase, alfa-amilase, trealase da invenção e, opcionalmente, uma composição de enzimas celulolíticas e/ou uma protease.

[00235] Antes do passo (a) pode ser preparada uma pasta semifluida aquosa de material contendo amido, tal como amido granular, tendo 10-55% em peso de sólidos secos (DS), preferencialmente 25-45% em peso de sólidos secos, mais preferencialmente 30-40% de sólidos secos, de material contendo amido. A pasta semifluida pode incluir água e/ou águas do processo, tais como vinhaça (contracorrente), água do purificador, condensado ou destilado do evaporador, água do separador lateral da destilação ou água de processo de outras instalações de produtos de fermentação. Como um processo de hidrólise de amido cru da invenção é levado a cabo abaixo da temperatura de gelatinização inicial e, assim, não ocorre nenhum aumento significativo da viscosidade, podem ser usados níveis elevados de vinhaça, se desejado. Em uma modalidade, a pasta semifluida aquosa contém de cerca de 1 a cerca de 70% em vol., preferencialmente 15-60% em vol., especialmente de cerca de 30 a 50% em vol. de água e/ou águas do processo, tais como vinhaça (contracorrente), água do purificador, condensado ou destilado do evaporador, água do separador lateral da destilação ou água de processo de outras instalações de produtos de fermentação ou suas combinações ou similares.

[00236] Em uma modalidade, contracorrente, ou outro fluxo reciclado,

63 / 127 é adicionado à pasta semifluida antes do passo (a) ou à sacarificação (passo (a)) ou aos passos de sacarificação e fermentação simultâneas (passo (a) e passo (b) combinados).

[00237] Um processo de RSH da invenção é conduzido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial, o que significa que a temperatura à qual um passo (a) separado é levado a cabo reside tipicamente na gama entre 25-75 °C, tal como entre 30-70 °C ou entre 45-60 °C.

[00238] Em uma modalidade preferencial, a temperatura durante a fermentação no passo (b) ou a sacarificação e fermentação simultâneas nos passos (a) e (b) está entre 25 °C e 40 °C, preferencialmente entre 28 °C e 36 °C, tal como entre 28 °C e 35 °C, tal como entre 28 °C e 34 °C, tal como cerca de 32 °C.

[00239] Em uma modalidade da invenção, a fermentação é levada a cabo durante 30 a 150 horas, preferencialmente 48 a 96 horas. 66.

[00240] Em uma modalidade, a fermentação é levada a cabo tal que o nível de açúcar, tal como nível de glucose, seja mantido a um nível baixo, tal como abaixo de 6% em peso, tal como abaixo de cerca de 3% em peso, tal como abaixo de cerca de 2% em peso, tal como abaixo de cerca de 1% em peso, tal como abaixo de cerca de 0,5% em peso, ou abaixo de 0,25% em peso, tal como abaixo de cerca de 0,1% em peso. Tais níveis baixos de açúcar podem ser alcançados por emprego simples de quantidades ajustadas de enzimas e organismo fermentador. Um perito na técnica pode facilmente determinar que doses/quantidades de enzima e organismo fermentador usar. As quantidades empregues de enzima e organismo fermentador podem ser também selecionadas para se manterem baixas concentrações de maltose no caldo de fermentação. Por exemplo, o nível de maltose pode ser mantido abaixo de cerca de 0,5% em peso, tal como abaixo de cerca de 0,2% em peso.

[00241] O processo da invenção pode ser levado a cabo a um pH de 3 a

64 / 127 7, preferencialmente de 3 a 6 ou, mais preferencialmente, de 3,5 a 5,0.

[00242] O termo “amido granular” significa amido cru não cozido, i.e., amido na sua forma natural encontrada em, p.ex., cereal, tubérculos ou grãos. O amido é formado dentro das células de plantas como grânulos minúsculos insolúveis em água. Quando colocados em água fria, os grânulos de amido podem absorver uma quantidade pequena do líquido e inchar. A temperaturas até em torno de 50 °C a 75 °C, o inchaço pode ser reversível. No entanto, a temperaturas mais elevadas, começa um inchaço irreversível chamado “gelatinização”. O amido granular pode ser um amido altamente refinado, preferencialmente pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99,5% puro, ou pode ser um material contendo amido mais em bruto compreendendo grãos inteiros (p.ex., moídos) incluindo frações não de amido tais como resíduos do gérmen e fibras.

[00243] A matéria-prima, tal como grãos inteiros, pode ser reduzida em termos do tamanho das partículas, p.ex., por moagem, de modo a abrir a estrutura e permitir processamento adicional. Exemplos de tamanhos das partículas adequados são divulgados em US4514496 e WO2004/081193 (ambas as referências são incorporadas por referência). Dois processos são preferenciais de acordo com a invenção: moagem a seco e a úmido. Na moagem a seco, os grãos inteiros são moídos e usados. A moagem a úmido dá uma boa separação de gérmen e farinha (grânulos de amido e proteína) e é frequentemente aplicada em localizações onde o hidrolisado de amido é usado na produção de, p.ex., xaropes. Tanto a moagem a seco como a úmido são bem conhecidas na técnica de processamento de amido.

[00244] Em uma modalidade, o tamanho das partículas é reduzido até entre 0,05 e 3,0 mm, preferencialmente 0,1-0,5 mm ou tal que pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 70%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, do material contendo amido passe através de uma peneira com uma tela de 0,05 a 3,0 mm,

65 / 127 preferencialmente uma tela de 0,1-0,5 mm. Em uma modalidade preferencial, o material contendo amido é preparado por redução do tamanho das partículas do material contendo amido, preferencialmente por moagem, tal que pelo menos 50% do material contendo amido tenha um tamanho das partículas de 0,1-0,5 mm.

[00245] Em uma modalidade preferencial, a trealase está presente e/ou é adicionada em uma quantidade entre 0,01-20 ug de EP de trealase/g de DS, tal como entre 0,05-15 ug de EP de trealase/g de DS, tal como entre 0,5 e 10 ug de EP de trealase/g de DS.

[00246] De acordo com a invenção, as enzimas são adicionadas tal que a glucoamilase esteja presente em uma quantidade de 0,001 a 10 AGU/g de DS, preferencialmente de 0,01 a 5 AGU/g de DS, especialmente de 0,1 a 0,5 AGU/g de DS.

[00247] De acordo com a invenção, as enzimas são adicionadas tal que a alfa-amilase esteja presente ou seja adicionada em uma quantidade de 0,001 a 10 AFAU/g de DS, preferencialmente de 0,01 a 5 AFAU/g de DS, especialmente de 0,3 a 2 AFAU/g de DS ou 0,001 a 1 FAU-F/g de DS, preferencialmente de 0,01 a 1 FAU-F/g de DS.

[00248] De acordo com a invenção, as enzimas são adicionadas tal que a composição de enzimas celulolíticas esteja presente ou seja adicionada em uma quantidade de 1-10.000 microgramas de EP/g de DS, tal como 2-5.000, tal como 3 e 1.000, tal como 4 e 500 microgramas de EP/g de DS.

[00249] De acordo com a invenção, as enzimas são adicionadas tal que a composição de enzimas celulolíticas esteja presente ou seja adicionada em uma quantidade na gama de 0,1-100 FPU por grama de sólidos totais (TS), preferencialmente 0,5-50 FPU por grama de TS, especialmente 1-20 FPU por grama de TS.

[00250] Em uma modalidade da invenção, as enzimas são adicionadas tal que a protease esteja presente em uma quantidade de 0,0001-1 mg de

66 / 127 proteína enzimática por g de DS, preferencialmente 0,001 a 0,1 mg de proteína enzimática por g de DS. Alternativamente, a protease está presente e/ou é adicionada em uma quantidade de 0,0001 a 1 LAPU/g de DS, preferencialmente 0,001 a 0,1 LAPU/g de DS e/ou 0,0001 a 1 mAU-RH/g de DS, preferencialmente 0,001 a 0,1 mAU-RH/g de DS.

[00251] Em uma modalidade da invenção, as enzimas são adicionadas tal que a protease esteja presente ou seja adicionada em uma quantidade na gama de 1-1.000 µg de EP/g de DS, tal como 2-500 µg de EP/g de DS, tal como 3-250 µg de EP/g de DS.

[00252] Em uma modalidade preferencial, a razão entre glucoamilase e alfa-amilase é entre 99:1 e 1:2, tal como entre 98:2 e 1:1, tal como entre 97:3 e 2:1, tal como entre 96:4 e 3:1, tal como 97:3, 96:4, 95:5, 94:6, 93:7, 90:10, 85:15, 83:17 ou 65:35 (mg de EP de glucoamilase:mg de EP de alfa-amilase).

[00253] Em uma modalidade preferencial, a dose total de glucoamilase e alfa-amilase é de acordo com a invenção de 10-1.000 µg/g de DS, tal como de 50-500 µg/g de DS, tal como 75-250 µg/g de DS.

[00254] Em uma modalidade preferencial, a dose total de composição de enzimas celulolíticas adicionada é de 10-500 µg/g de DS, tal como de 20- 400 µg/g de DS, tal como 20-300 µg/g de DS.

[00255] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal como uma derivada a partir de Trametes cingulata, usada em fermentação ou SSF, exibe pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% de identidade com a parte madura de SEQ ID NO: 11.

[00256] Em uma modalidade, a glucoamilase, tal com uma derivada a partir de Pycnoporus sanguineus, usada em fermentação ou SSF, exibe pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo

67 / 127 menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% de identidade com a parte madura de SEQ ID NO: 12.

[00257] Em uma modalidade, a alfa-amilase usada em fermentação ou SSF, exibe pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% de identidade com a parte madura de SEQ ID NO: 7.

[00258] Em uma modalidade preferencial, a invenção se relaciona com processos de produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo: (a) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (b) fermentação usando um organismo de fermentação; em que a sacarificação e/ou a fermentação são feitas na presença das seguintes enzimas: i) glucoamilase; ii) alfa-amilase; iii) trealase da invenção; iii) opcionalmente uma composição de enzimas celulolíticas e/ou uma protease.

[00259] Em uma modalidade preferencial, as enzimas podem ser adicionadas como uma composição de enzimas da invenção. Em uma modalidade preferencial, os passos (a) e (b) são levados a cabo simultaneamente (i.e., fermentação de um passo). No entanto, os passos (a) e (b) podem ser também levados a cabo sequencialmente. Fermentação

[00260] A fermentação é levada a cabo em um meio de fermentação. O meio de fermentação inclui o substrato para a fermentação, isto é, a fonte de carboidratos que é metabolizada pelo organismo fermentador. De acordo com

68 / 127 a invenção, o meio de fermentação pode compreender nutrientes e estimulante(es) do crescimento para o(s) organismo(s) fermentador(es). Nutrientes e estimulantes do crescimento são amplamente usados na técnica de fermentação e incluem fontes de nitrogênio, tais como amônia; ureia, vitaminas e minerais ou suas combinações. Organismos Fermentadores para Fermentação à Base de Amido

[00261] O termo “organismo fermentador” se refere a qualquer organismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, especialmente levedura, adequado para uso em um processo de fermentação e capaz de produzir o produto de fermentação desejado. Organismos fermentadores especialmente adequados são capazes de fermentar, i.e, converter, açúcares, tais como glucose ou maltose, diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado, tal como em particular o etanol. Exemplos de organismos fermentadores incluem organismos fúngicos, tais como em particular levedura. Leveduras preferenciais incluem estirpes de Saccharomyces spp., em particular, Saccharomyces cerevisiae. Em uma modalidade particular, a trealase variante é coformulada com o organismo fermentador, particularmente um organismo de levedura, mais particularmente uma levedura seca.

[00262] Concentrações adequadas do organismo fermentador viável durante a fermentação, tal como SSF, são bem conhecidas na técnica ou podem ser facilmente determinadas pelo perito na técnica. Em uma modalidade, o organismo fermentador, tal como levedura fermentadora de etanol (p.ex., Saccharomyces cerevisiae), é adicionado ao meio de fermentação tal que a contagem do organismo fermentador viável, tal como levedura, por mL de meio de fermentação esteja na gama de 105 a 1012, preferencialmente de 107 a 1010, especialmente cerca de 5 x 107.

[00263] Exemplos de leveduras comercialmente disponíveis incluem, p.ex., levedura RED STAR™ e ETHANOL RED (disponível a partir da

69 / 127 Fermentis/Lesaffre, EUA), FALI (disponível a partir da Fleischmann’s Yeast, EUA), leveduras frescas SUPERSTART e THERMOSACC™ (disponíveis a partir da Ethanol Technology, WI, EUA), BIOFERM AFT e XR (disponíveis a partir da NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, EUA), GERT STRAND (disponível a partir da Gert Strand AB, Suécia) e FERMIOL (disponível a partir da DSM Specialties). Recuperação

[00264] Subsequentemente à fermentação, p.ex., SSF, o produto de fermentação, em particular etanol, pode ser separado a partir do meio de fermentação. A pasta semifluida pode ser destilada para se recuperar/extrair o produto de fermentação desejado (i.e., etanol). Alternativamente, o produto de fermentação desejado (i.e., etanol) pode ser extraído a partir do meio de fermentação por técnicas de microfiltração ou filtração em membrana. O produto de fermentação (i.e., etanol) pode ser também recuperado por separação ou outro método bem conhecido na técnica. Alfa-Amilase Presente e/ou Adicionada Na Liquefação

[00265] De acordo com a invenção, uma alfa-amilase está presente e/ou é adicionada na liquefação opcionalmente em conjunto com outras enzimas tais como uma protease, uma glucoamilase, fitase e/ou pululanase.

[00266] A alfa-amilase adicionada no passo de liquefação (a) pode ser qualquer alfa-amilase. São preferenciais alfa-amilases bacterianas, que são tipicamente estáveis às temperaturas usadas na liquefação. Alfa-Amilase Bacteriana

[00267] O termo “alfa-amilase bacteriana” significa qualquer alfa- amilase bacteriana classificada sob EC 3.2.1.1. Uma alfa-amilase bacteriana usada de acordo com a invenção pode, p.ex., ser derivada a partir de uma estirpe do gênero Bacillus, que é por vezes também referido como o gênero Geobacillus. Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus é derivada a partir de uma estirpe de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis,

70 / 127 Bacillus stearothermophilus ou Bacillus subtilis, mas pode ser também derivada a partir de outra Bacillus sp.

[00268] Exemplos específicos de alfa-amilases bacterianas incluem a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus de SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 8 aqui, a alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens de SEQ ID NO: 5 em WO 99/19467 e a alfa-amilase de Bacillus licheniformis de SEQ ID NO: 4 em WO 99/19467 (todas as sequências são deste modo incorporadas por referência). Em uma modalidade, a alfa-amilase pode ser uma enzima tendo um grau de identidade de pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com qualquer uma das sequências mostradas em SEQ ID NOS: 3, 4 ou 5, respectivamente, em WO 99/19467.

[00269] Em uma modalidade, a alfa-amilase pode ser uma enzima tendo um grau de identidade de pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com qualquer uma das sequências mostradas em SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 8 aqui.

[00270] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é derivada a partir de Bacillus stearothermophilus. A alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus pode ser um tipo selvagem maduro ou uma sua variante madura. As alfa-amilases maduras de Bacillus stearothermophilus podem ser naturalmente truncadas durante a produção recombinante. Por exemplo, a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus pode ser truncada tal que tenha em torno de 491 aminoácidos, p.ex., tal que tenha entre 480-495 aminoácidos em comprimento, logo não tem um domínio funcional de ligação ao amido (em comparação com SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467) ou SEQ ID NO: 8 aqui.

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[00271] A alfa-amilase de Bacillus pode ser também uma variante e/ou híbrido. Exemplos de uma tal variante podem ser encontrados em qualquer uma de WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059 e WO 02/10355 (todos os documentos são deste modo incorporados por referência). Variantes de alfa-amilase específicas são divulgadas nas Patentes dos E.U.A. Nos. 6,093,562, 6,187,576, 6,297,038 e 7,713,723 (deste modo incorporadas por referência) e incluem variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (frequentemente referidas como alfa-amilase BSG) tendo uma deleção de um ou dois aminoácidos nas posições R179, G180, I181 e/ou G182, preferencialmente uma deleção dupla divulgada em WO 96/23873 – ver, p.ex., página 20, linhas 1-10 (deste modo incorporada por referência), correspondendo preferencialmente à deleção das posições I181 e G182 em comparação com a sequência de aminoácidos da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus apresentada em SEQ ID NO: 3 divulgada em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 8 aqui ou à deleção dos aminoácidos R179 e G180 usando SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 8 aqui para numeração (cuja referência é deste modo incorporada por referência). São ainda mais preferenciais alfa-amilases de Bacillus, especialmente alfa- amilases de Bacillus stearothermophilus, que têm uma deleção dupla correspondendo a uma deleção das posições 181 e 182 e compreendem adicionalmente uma substituição N193F (também denotada I181* + G182* + N193F) em comparação com a sequência de aminoácidos de alfa-amilase BSG de tipo selvagem apresentada em SEQ ID NO: 3 divulgada em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 8 aqui. A alfa-amilase bacteriana pode ter também uma substituição em uma posição correspondendo a S239 na alfa-amilase de Bacillus licheniformis mostrada em SEQ ID NO: 4 em WO 99/19467 ou uma variante S242 e/ou E188P da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus de SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 8 aqui.

[00272] Em uma modalidade, a variante é uma variante S242A, E ou

72 / 127 Q, preferencialmente uma variante S242Q, da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (usando SEQ ID NO: 8 aqui para numeração).

[00273] Em uma modalidade, a variante é uma variante da posição E188, preferencialmente uma variante E188P da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (usando SEQ ID NO: 8 aqui para numeração).

[00274] A alfa-amilase bacteriana pode em uma modalidade ser uma alfa-amilase de Bacillus truncada. Em especial, o truncamento é tal que, p.ex., a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 8 aqui, tem em torno de 491 aminoácidos em comprimento, tal como de 480 a 495 aminoácidos em comprimento ou tal que não tem um domínio funcional de ligação ao amido. Alfa-Amilases Híbridas Bacterianas

[00275] A alfa-amilase bacteriana pode ser também uma alfa-amilase bacteriana híbrida, p.ex., uma alfa-amilase compreendendo 445 resíduos de aminoácidos C-terminais da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (mostrada em SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467) e os 37 resíduos de aminoácidos N- terminais da alfa-amilase derivada a partir de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada em SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467). Em uma modalidade preferencial, este híbrido tem uma ou mais das, especialmente todas as, seguintes substituições: G48A + T49I + G107A + H156Y + A181T + N190F + I201F + A209V + Q264S (usando a numeração de Bacillus licheniformis em SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467). São também preferenciais variantes tendo uma ou mais das seguintes mutações (ou mutações correspondentes em outras alfa- amilases de Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V e Q264S e/ou a deleção de dois resíduos entre as posições 176 e 179, preferencialmente a deleção de E178 e G179 (usando SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467 para numeração da posição).

[00276] Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana é a parte

73 / 127 madura da alfa-amilase quimérica divulgada em Richardson et al. (2002), The Journal of Biological Chemistry, Vol. 277, No 29, Edição de 19 de julho, pp. 267501-26507, referida como BD5088 ou uma sua variante. Esta alfa-amilase é a mesma que aquela apresentada em SEQ ID NO: 2 em WO 2007134207. A sequência da enzima madura começa após o aminoácido “Met” inicial na posição 1. Alfa-Amilase Termoestável

[00277] A alfa-amilase pode ser uma alfa-amilase termoestável, tal como uma alfa-amilase bacteriana termoestável, preferencialmente de Bacillus stearothermophilus.

[00278] Em uma modalidade da invenção, a alfa-amilase é uma alfa- amilase bacteriana, preferencialmente derivada a partir do gênero Bacillus, especialmente uma estirpe de Bacillus stearothermophilus, em particular a Bacillus stearothermophilus como divulgada em WO 99/019467 como SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 8 aqui) com um ou dois aminoácidos deletados nas posições R179, G180, I181 e/ou G182, em particular com R179 e G180 deletadas ou com I181 e G182 deletadas, com mutações na lista de mutações em baixo.

[00279] Em modalidades preferenciais, as alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus têm deleção dupla I181 + G182 e, opcionalmente, substituição N193F, compreendendo adicionalmente mutações selecionadas da lista em baixo: -V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F; - V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - 59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V;

74 / 127 - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; - A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - E129V+K177L+R179E; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; - E129V+K177L+R179E+S242Q; - E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - K220P+N224L+S242Q+Q254S; - M284V; - V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V. - V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+ M284V;

[00280] Informação específica sobre a termoestabilidade das variantes de alfa-amilases acima pode ser encontrada em WO12/088303 (Novozymes) que é deste modo incorporada por referência.

[00281] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é selecionada do grupo de variantes de alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus tendo uma deleção dupla em I181 + G182 e, opcionalmente, uma substituição em N193F e substituições da seguinte lista - E129V+K177L+R179E; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224 L+Q254S; - V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; - V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+ M284V; e - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 8 aqui para numeração).

[00282] Deve ser entendido que quando se faz referência a alfa- amilases de Bacillus stearothermophilus e suas variantes elas são normalmente produzidas na forma truncada. Em particular, o truncamento pode ser tal que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 8 aqui, ou suas variantes, sejam truncadas no terminal C e tenham tipicamente em torno de 491 aminoácidos em comprimento, tal como 480-495 aminoácidos em

75 / 127 comprimento ou tal que não tenham um domínio funcional de ligação ao amido.

[00283] Em uma modalidade preferencial, a variante de alfa-amilase pode ser uma enzima tendo um grau de identidade de pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, com as sequências mostradas em SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 8 aqui.

[00284] Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana, p.ex., alfa- amilase de Bacillus, tal como especialmente alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, ou sua variante, é doseada para a liquefação em uma concentração entre 0,01-10 KNU-A/g de DS, p.ex., entre 0,02 e 5 KNU-A/g de DS, tal como entre 0,03 e 3 KNU-A, preferencialmente 0,04 e 2 KNU-A/g de DS, tal como especialmente 0,01 e 2 KNU-A/g de DS. Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana, p.ex., alfa-amilase de Bacillus, tal como especialmente alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus, ou sua variante, é doseada para a liquefação em uma concentração de entre 0,0001-1 mg de EP (Proteína Enzimática)/g de DS, p.ex., 0,0005-0,5 mg de EP/g de DS, tal como 0,001-0,1 mg de EP/g de DS. Protease Presente e/ou Adicionada Na Liquefação

[00285] De acordo com a invenção, uma protease está opcionalmente presente e/ou é opcionalmente adicionada na liquefação em conjunto com a alfa-amilase e uma glucoamilase, fitase e/ou pululanase opcionais.

[00286] As proteases são classificadas com base no seu mecanismo catalítico nos seguintes grupos: Serina proteases (S), Cisteína proteases (C), Proteases aspárticas (A), Metaloproteases (M) e Proteases desconhecidas (U), ou ainda não classificadas, ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Academic Press (1998), em

76 / 127 particular a parte da introdução geral.

[00287] Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável usada de acordo com a invenção é uma “metaloprotease” definida como uma protease pertencendo a EC 3.4.24 (metaloendopeptidases); preferencialmente EC 3.4.24.39 (metaloproteinases ácidas).

[00288] Para se determinar se uma dada protease é uma metaloprotease ou não é feita referência ao Handbook of Proteolytic Enzymes acima e aos princípios indicados nele. Tal determinação pode ser levada a cabo para todos os tipos de proteases, sejam proteases ocorrendo naturalmente ou de tipo selvagem; ou proteases geneticamente manipuladas ou sintéticas.

[00289] A atividade de protease pode ser medida usando qualquer ensaio adequado, no qual um substrato é empregue, que inclua ligações de peptídeos relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH do ensaio e a temperatura do ensaio devem ser do mesmo modo adaptados para a protease em questão. Exemplos de valores de pH do ensaio são pH 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Exemplos de temperaturas do ensaio são 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ou 80 °C.

[00290] Exemplos de substratos de proteases são a caseína, tal como a Caseína Reticulada com Azurina (AZCL-caseína). Dois ensaios de protease são descritos em baixo na seção “Materiais % Métodos”, dos quais o assim chamado “Ensaio de AZCL-Caseína” é o ensaio preferencial.

[00291] Não existem nenhumas limitações quanto à origem da protease usada em um processo da invenção desde que ela cumpra com as propriedades de termoestabilidade definidas em baixo.

[00292] Em uma modalidade, a protease é de origem fúngica.

[00293] A protease pode ser uma variante de, p.ex., uma protease de tipo selvagem desde que a protease seja termoestável. Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável é uma variante de uma metaloprotease como definida acima. Em uma modalidade, a protease termoestável usada em

77 / 127 um processo da invenção é de origem fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica derivada a partir de uma estirpe do gênero Thermoascus, preferencialmente uma estirpe de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670 (classificada como EC 3.4.24.39).

[00294] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma variante da parte madura da metaloprotease mostrada em SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 e apresentada como SEQ ID NO: 13 aqui, adicionalmente com mutações selecionadas da lista em baixo: S5*+D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L; N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L; T46R+D79L+S87P+T116V+D142L; D79L+P81R+S87P+A112P+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L; D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L; S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L; D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C; S36P+D79L+S87P+A112P+D142L; A37P+D79L+S87P+A112P+D142L;

78 / 127 S49P+D79L+S87P+A112P+D142L; S50P+D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D104P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L; S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L; D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L; Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L; Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+Y82F+ D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L; A27K+D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D142L.

[00295] Informação específica sobre a termoestabilidade das variantes de proteases acima pode ser encontrada em WO12/088303 (Novozymes) que é deste modo incorporada por referência.

[00296] Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável é uma variante da metaloprotease divulgada como a parte madura de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 13 aqui com as seguintes mutações: D79L + S87P + A112P + D142L; D79L + S87P + D142L; ou A27K + D79L + Y82F + S87G + D104P + A112P + A126V + D142L.

[00297] Em uma modalidade, a variante de protease tem pelo menos

79 / 127 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 13 aqui.

[00298] A protease termoestável pode ser também derivada a partir de qualquer bactéria, desde que a protease tenha as propriedades de termoestabilidade definidas de acordo com a invenção.

[00299] Em uma modalidade, a protease termoestável é derivada a partir de uma estirpe da bactéria Pyrococcus, tal como uma estirpe de Pyrococcus furiosus (protease pfu).

[00300] Em uma modalidade, a protease é uma apresentada como SEQ ID NO: 1 na patente dos EUA No. 6,358,726-B1 (Takara Shuzo Company) ou em SEQ ID NO: 9 aqui.

[00301] Em outra modalidade, a protease termoestável é uma divulgada em SEQ ID NO: 9 aqui ou uma protease tendo pelo menos 80% de identidade, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 1 na patente dos EUA no. 6,358,726-B1 ou SEQ ID NO: 9 aqui. Uma protease de Pyrococcus furiosus pode ser comprada a partir da Takara Bio, Japão. Glucoamilase Presente e/ou Adicionada Na Liquefação

[00302] De acordo com a invenção, uma glucoamilase pode estar

80 / 127 opcionalmente presente e/ou ser opcionalmente adicionada no passo de liquefação (a). Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é adicionada em conjunto com a ou separadamente da alfa-amilase e protease, fitase e/ou pululanase opcionais.

[00303] Em uma modalidade específica e preferencial, a glucoamilase, preferencialmente de origem fúngica, preferencialmente um fungo filamentoso, é de uma estirpe do gênero Penicillium, especialmente uma estirpe de Penicillium oxalicum, em particular a glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 (que é deste modo incorporada por referência) e mostrada em SEQ ID NO: 10 aqui.

[00304] Em uma modalidade, a glucoamilase tem pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade, com o polipeptídeo maduro mostrado em SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 ou SEQ ID NO: 10 aqui.

[00305] Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 e mostrada em SEQ ID NO: 10 aqui, tendo uma substituição K79V (usando a sequência madura mostrada em SEQ ID NO: 10 aqui para numeração). A variante de glucoamilase K79V tem sensibilidade reduzida à degradação por protease em relação ao genitor como divulgado em WO 2013/036526 (que é deste modo incorporada por referência).

[00306] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada a partir de Penicillium oxalicum.

[00307] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em

81 / 127 WO 2011/127802 e mostrada em SEQ ID NO: 10 aqui. Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase de Penicillium oxalicum é aquela divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 e mostrada em SEQ ID NO: 10 aqui tendo Val (V) na posição 79 (usando SEQ ID NO: 10 aqui para numeração).

[00308] Variantes de glucoamilase de Penicillium oxalicum contempladas são divulgadas em WO 2013/053801 que é deste modo incorporada por referência.

[00309] Em uma modalidade, estas variantes têm uma sensibilidade reduzida à degradação da protease.

[00310] Em uma modalidade, estas variantes têm termoestabilidade melhorada em comparação com o genitor.

[00311] Mais especificamente, em uma modalidade, a glucoamilase tem uma substituição K79V (usando SEQ ID NO: 10 aqui para numeração), (variante PE001), e compreende adicionalmente pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: T65A; ou Q327F; ou E501V; ou Y504T; ou Y504*; ou T65A + Q327F; ou T65A + E501V; ou T65A + Y504T; ou T65A + Y504*; ou Q327F + E501V; ou Q327F + Y504T; ou Q327F + Y504*; ou E501V + Y504T; ou

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E501V + Y504*; ou T65A + Q327F + E501V; ou T65A + Q327F + Y504T; ou T65A + E501V + Y504T; ou Q327F + E501V + Y504T; ou T65A + Q327F + Y504*; ou T65A + E501V + Y504*; ou Q327F + E501V + Y504*; ou T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou T65A + Q327F + E501V + Y504*; E501V + Y504T; ou T65A + K161S; ou T65A + Q405T; ou T65A + Q327W; ou T65A + Q327F; ou T65A + Q327Y; ou P11F + T65A + Q327F; ou R1K + D3W + K5Q + G7V + N8S + T10K + P11S + T65A + Q327F; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; ou P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; ou R1E + D3N + P4G + G6R + G7A + N8A + T10D+ P11D + T65A + Q327F; ou P11F + T65A + Q327W; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; ou T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou T65A + S105P + Q327W; ou

83 / 127

T65A + S105P + Q327F; ou T65A + Q327W + S364P; ou T65A + Q327F + S364P; ou T65A + S103N + Q327F; ou P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S; ou P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502*; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502T + P563S + K571E; ou P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + N564D + K571S; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + V325T+ Q327W; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + I375A + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + K218A + K221D + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + T10D + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + F12Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou

84 / 127

K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T568N; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + K524T + G526A; ou P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + F80* + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + K112S + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + N502T + Y504*; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; ou K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; ou

85 / 127

P2N + P4S + P11F + T65A + V79A + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + V79G + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + V79I + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + V79L + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + V79S + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + L72V + Q327F + E501V + Y504T; ou S255N + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + E74N + V79K + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + G220N + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Y245N + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q253N + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + D279N + Q327F + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S359N + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D370N + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460S + E501V + Y504T; ou

86 / 127 P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460T + P468T + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T463N + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S465N + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T477N + E501V + Y504T.

[00312] Em uma modalidade preferencial, a variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma substituição K79V (usando SEQ ID NO: 10 aqui para numeração), correspondendo à variante PE001, e compreende adicionalmente uma das seguintes mutações: P11F + T65A + Q327F; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; ou P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T.

[00313] A glucoamilase pode ser adicionada em quantidades de 0,1- 100 microgramas de EP/g, tais como 0,5-50 microgramas de EP/g, tais como 1-25 microgramas de EP/g, tais como 2-12 microgramas de EP/g de DS. Trealase Presente E/Ou Adicionada na Sacarificação e/ou Fermentação

[00314] De acordo com o processo da invenção, uma trealase da invenção está presente e/ou é adicionada durante - o passo de sacarificação (b); - o passo de fermentação (c); - a sacarificação e fermentação simultâneas; - opcionalmente o passo de pré-sacarificação antes do passo (b).

87 / 127

[00315] Em uma modalidade preferencial, a trealase está presente e/ou é adicionada em uma quantidade entre 0,01-20 ug de EP (Proteína Enzimática) de trealase/g de DS, tal como entre 0,05-15 ug de EP de trealase/g de DS, tal como entre 0,5 e 10 ug de EP de trealase/g de DS. Glucoamilase Presente E/Ou Adicionada na Sacarificação e/ou Fermentação

[00316] A glucoamilase presente e/ou adicionada durante o passo de sacarificação (b); passo de fermentação (c); sacarificação e fermentação simultâneas; ou pré-sacarificação antes do passo (b) pode ser derivada a partir de qualquer fonte adequada, p.ex., derivada a partir de um microrganismo ou uma planta. As glucoamilases preferenciais são de origem fúngica ou bacteriana, selecionadas do grupo consistindo em glucoamilases de Aspergillus, em particular glucoamilases G1 ou G2 de Aspergillus niger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102), ou suas variantes, tais como aquelas divulgadas em WO 92/00381, WO 00/04136 e WO 01/04273 (a partir da Novozymes, Dinamarca); a glucoamilase de A. awamori divulgada em WO 84/02921, glucoamilase de Aspergillus oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949) ou suas variantes ou fragmentos. Outras variantes de glucoamilases de Aspergillus incluem variantes com estabilidade térmica intensificada: G137A e G139A (Chen et al. (1996), Prot. Eng. 9, 499-505); D257E e D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8, 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); ligações de dissulfeto, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704); e introdução de resíduos de Pro na posição A435 e S436 (Li et al. (1997), Protein Eng. 10, 1199- 1204).

[00317] Outras glucoamilases incluem glucoamilase de Athelia rolfsii (previamente denotada Corticium rolfsii) (ver patente dos EUA no. 4,727,026 e Nagasaka et al., (1998), “Purification and properties of the raw-starch- degrading glucoamylases from Corticium rolfsii”, Appl Microbiol Biotechnol 50: 323-330), glucoamilases de Talaromyces, em particular derivadas a partir

88 / 127 de Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (patente dos EUA no. Re. 32,153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (patente dos EUA no. 4,587,215). Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase usada durante a sacarificação e/ou a fermentação é a glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada em WO 99/28448.

[00318] Glucoamilases bacterianas contempladas incluem glucoamilases do gênero Clostridium, em particular C. thermoamylolyticum (EP 135,138) e C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831).

[00319] Glucoamilases fúngicas contempladas incluem Trametes cingulate (SEQ ID NO: 11), Pachykytospora papyracea; e Leucopaxillus giganteus, todas divulgadas em WO 2006/069289; ou Peniophora rufomarginata divulgada em WO2007/124285; ou uma sua mistura. São também contempladas glucoamilases híbridas de acordo com a invenção. Exemplos incluem as glucoamilases híbridas divulgadas em WO 2005/045018. Exemplos específicos incluem a glucoamilase híbrida divulgada nas Tabelas 1 e 4 do Exemplo 1 (híbridos esses que são deste modo incorporados por referência).

[00320] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada a partir de uma estirpe do gênero Pycnoporus, em particular uma estirpe de Pycnoporus sanguineus como descrita em WO 2011/066576 (SEQ ID NOS 2, 4 ou 6), em particular aquela apresentada como SEQ ID NO: 12 aqui (correspondendo a SEQ ID NO: 4 em WO 2011/066576) ou a partir de uma estirpe do gênero Gloeophyllum, tal como uma estirpe de Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum trabeum, em particular uma estirpe de Gloeophyllum como descrita em WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16). Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803 ou SEQ ID NO: 5 aqui (i.e., glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium). Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é SEQ ID NO: 6 aqui (i.e., glucoamilase de Gloeophyllum trabeum divulgada como SEQ ID

89 / 127 NO: 3 em WO2014/177546) (todas as referências são deste modo incorporadas por referência).

[00321] São também contempladas glucoamilases que exibem uma elevada identidade com qualquer uma das glucoamilases acima mencionadas, i.e., pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% de identidade com qualquer uma das partes maduras das sequências de enzimas mencionadas acima, tais como qualquer um de SEQ ID NOs: 4, 11, 5, 6 ou 12 aqui, respectivamente.

[00322] Em uma modalidade, a glucoamilase usada em fermentação ou SSF, exibe pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% de identidade com a parte madura de SEQ ID NO: 6 aqui.

[00323] Em uma modalidade, a glucoamilase usada em fermentação ou SSF, exibe pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mesmo 100% de identidade com a parte madura de SEQ ID NO: 12 aqui.

[00324] As glucoamilases podem em uma modalidade ser adicionadas à sacarificação e/ou fermentação em uma quantidade de 0,0001-20 AGU/g de DS, preferencialmente 0,001-10 AGU/g de DS, especialmente entre 0,01-5 AGU/g de DS, tal como 0,1-2 AGU/g de DS.

[00325] As glucoamilases podem em uma modalidade ser adicionadas à sacarificação e/ou fermentação em uma quantidade de 1-1.000 µg/g de DS, preferencialmente 10-500 µg/g de DS, especialmente entre 25-250 µg de EP/g de DS.

[00326] Em uma modalidade, a glucoamilase é adicionada como uma

90 / 127 combinação compreendendo adicionalmente uma alfa-amilase. Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é uma alfa-amilase fúngica, especialmente uma alfa-amilase fúngica ácida. A alfa-amilase é tipicamente uma atividade secundária.

[00327] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma combinação compreendendo glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada em WO 99/28448 como SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 4 aqui e glucoamilase de Trametes cingulata divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 06/069289 e SEQ ID NO: 11 aqui.

[00328] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma combinação compreendendo glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada em SEQ ID NO: 4 aqui, glucoamilase de Trametes cingulata divulgada como SEQ ID NO: 11 aqui e alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase e SBD de Aspergillus niger, divulgada como V039 na Tabela 5 em WO 2006/069290 ou SEQ ID NO: 7 aqui.

[00329] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma combinação compreendendo glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium apresentada como SEQ ID NO: 5 aqui e Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger, divulgada como SEQ ID NO: 7 aqui com as seguintes substituições: G128D + D143N.

[00330] Em uma modalidade, a alfa-amilase pode ser derivada a partir de uma estirpe do gênero Rhizomucor, preferencialmente uma estirpe de Rhizomucor pusillus, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO2013/006756, ou do gênero Meripilus, preferencialmente uma estirpe de Meripilus giganteus. Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é derivada a partir de uma Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger, divulgada como V039 na Tabela 5 em WO 2006/069290 ou SEQ ID NO: 7 aqui.

[00331] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus

91 / 127 ou a alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligante e domínio de ligação ao amido (SBD), preferencialmente um ligante de glucoamilase e SBD de Aspergillus niger, tem pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H+Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C (usando SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756 para numeração ou SEQ ID NO: 7 aqui). Em uma modalidade preferencial, a combinação de glucoamilase compreende glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium (p.ex., SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803 ou SEQ ID NO: 5 aqui) e alfa-amilase de Rhizomucor pusillus.

[00332] Em uma modalidade preferencial, a combinação de glucoamilase compreende a glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium apresentada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803 ou SEQ ID NO: 5 aqui e Rhizomucor pusillus com um ligante e domínio de ligação ao amido (SBD), preferencialmente um ligante de glucoamilase e SBD de Aspergillus niger, divulgada como SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756 e SEQ ID NO: 7 aqui com as seguintes substituições: G128D + D143N.

[00333] Composições compreendendo glucoamilase comercialmente disponíveis incluem AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL, SPIRIZYME ACHIEVE™ e AMG™ E (a partir da Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300, GC480, GC417 (a partir da DuPont-Danisco); AMIGASE™ e AMIGASE™

92 / 127 PLUS (a partir da DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ e G990 ZR (a partir da DuPont-Danisco). Composição de Enzimas Celulolíticas Presente e/ou Adicionada Na Sacarificação e/ou Fermentação

[00334] De acordo com a invenção, uma composição de enzimas celulolíticas pode estar presente na sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

[00335] A composição de enzimas celulolíticas compreende uma beta- glucosidase, uma celobioidrolase e uma endoglucanase.

[00336] Exemplos de composições celulolíticas adequadas podem ser encontrados em WO 2008/151079 e WO 2013/028928 que são incorporadas por referência.

[00337] Em modalidades preferenciais, a composição de enzimas celulolíticas é derivada a partir de uma estirpe de Trichoderma, Humicola ou Chrysosporium.

[00338] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é derivada a partir de uma estirpe de Trichoderma reesei, Humicola insolens e/ou Chrysosporium lucknowense.

[00339] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende uma beta-glucosidase, preferencialmente uma derivada a partir de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae, tal como aquela divulgada em WO 2002/095014 ou a proteína de fusão tendo atividade de beta-glucosidase divulgada em WO 2008/057637 (em particular a proteína de fusão de variante de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae mostrada em SEQ ID NOs: 73 e 74, respectivamente, em WO 2008/057637 ou a proteína de fusão de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae mostrada em SEQ ID NOs: 75 e 76, respectivamente, em WO 2008/057637 – ambas deste modo incorporadas por referência), ou Aspergillus fumigatus, tal como aquela divulgada em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 14 aqui ou uma variante de

93 / 127 beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus divulgada em WO 2012/044915 (Novozymes), tal como uma com uma ou mais das, tal como todas as, seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y; ou uma estirpe do gênero Penicillium, tal como uma estirpe da Penicillium brasilianum divulgada em WO 2007/019442, ou uma estirpe do gênero Trichoderma, tal como uma estirpe de Trichoderma reesei.

[00340] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica tal como um derivado a partir do gênero Thermoascus, tal como uma estirpe de Thermoascus aurantiacus, tal como aquele descrito em WO 2005/074656 como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 15 aqui; ou um derivado do gênero Thielavia, tal como uma estirpe de Thielavia terrestris, tal como aquele descrito em WO 2005/074647 como SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8; ou um derivado de uma estirpe de Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como aquele descrito em WO 2010/138754 como SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2; ou um derivado a partir de uma estirpe derivada a partir de Penicillium, tal como uma estirpe de Penicillium emersonii, tal como aquele divulgado em WO 2011/041397 como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 16 aqui.

[00341] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende uma celobioidrolase I (CBH I), tal como uma derivada a partir de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como a CBH I Cel7a divulgada em SEQ ID NO: 2 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 17 aqui, ou uma estirpe do gênero Trichoderma, tal como uma estirpe de Trichoderma reesei.

[00342] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende uma celobioidrolase II (CBH II), tal como uma derivada a partir de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, divulgada como SEQ ID NO: 18 aqui; ou uma estirpe do gênero

94 / 127 Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, ou uma estirpe do gênero Thielavia, tal como uma estirpe de Thielavia terrestris, tal como celobioidrolase II CEL6A de Thielavia terrestris.

[00343] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica e uma beta-glucosidase.

[00344] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica, uma beta- glucosidase e uma CBH I.

[00345] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica, uma beta- glucosidase, uma CBH I e uma CBH II.

[00346] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente o polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus tendo atividade intensificadora celulolítica (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/074656 ou SEQ ID NO: 15 aqui) e proteína de fusão de beta- glucosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637).

[00347] Em uma modalidade, a composição celulolítica é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente um polipeptídeo GH61A de Thermoascus aurantiacus tendo atividade intensificadora celulolítica (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/074656 ou SEQ ID NO: 15 aqui) e beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 14 aqui).

[00348] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é uma composição de enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei compreendendo adicionalmente um polipeptídeo GH61A de Penicillium emersonii tendo atividade intensificadora celulolítica divulgado como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 16 aqui e beta-glucosidase de

95 / 127 Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 14 aqui) ou uma sua variante com as seguintes substituições F100D, S283G, N456E, F512Y (usando SEQ ID NO: 14 aqui para numeração).

[00349] Em uma modalidade preferencial, a composição de enzimas celulolíticas compreende um ou mais dos seguintes componentes: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus ou sua variante; e (iv) um polipeptídeo GH61 de Penicillium sp. Tendo atividade intensificadora celulolítica; ou seus homólogos.

[00350] Em uma modalidade preferencial, a composição de enzimas celulolíticas é derivada a partir de Trichoderma reesei compreendendo um polipeptídeo GH61A com atividade intensificadora celulolítica derivado a partir de uma estirpe de Penicillium emersonii (SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 16 aqui), variante de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 14 aqui) com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y (divulgada em WO 2012/044915); CBH I Cel7A de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO2011/057140 ou SEQ ID NO: 6 aqui e CBH II de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 17 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 18 aqui.

[00351] Em uma modalidade, a composição celulolítica é doseada de 0,0001-3 mg de EP/g de DS, preferencialmente 0,0005-2 mg de EP/g de DS, preferencialmente 0,001-1 mg/g de DS, mais preferencialmente 0,005-0,5 mg de EP/g de DS e, ainda mais preferencialmente, 0,01-0,1 mg de EP/g de DS. Proteases Presentes e/ou Adicionadas na Sacarificação e/ou Fermentação

[00352] Qualquer protease adequada pode ser adicionada na sacarificação e/ou fermentação, tal como SSF.

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[00353] Em uma modalidade preferencial, a protease é uma metaloprotease ou uma serina protease. Em uma modalidade, a composição de enzimas compreende uma metaloprotease preferencialmente derivada a partir de uma estirpe do gênero Thermoascus, preferencialmente uma estirpe de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670, tal como a metaloprotease divulgada como a parte madura de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 13 aqui.

[00354] Em uma modalidade, a protease tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade, com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 13 aqui.

[00355] Em uma modalidade, a protease é derivada a partir de uma estirpe de Pyrococcus, tal como uma estirpe de Pyrococcus furiosus, tal como a protease mostrada em SEQ ID NO: 1 em US 6,358,726 ou SEQ ID NO: 9 aqui.

[00356] Em uma modalidade, a protease é a sequência madura da protease 3 de Meripilus giganteus (protease da família de peptidases S53) em causa no Exemplo 2 em WO 2014/037438 (deste modo incorporada por referência). Em uma modalidade, a protease é a sequência madura da protease 3 de uma estirpe de Meripilus, em particular Meripilus giganteus mostrada como SEQ ID NO: 5 em WO 2014/037438 (deste modo incorporada por referência) e SEQ ID NO: 19 aqui.

[00357] Em uma modalidade, a protease tem pelo menos 60%, tal

97 / 127 como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 19 aqui mostrada como os aminoácidos 1-547. Alfa-amilase Presente e/ou Adicionada na Sacarificação e/ou Fermentação

[00358] Qualquer alfa-amilase adequada, tal como uma alfa-amilase ácida fúngica, pode estar presente e/ou ser adicionada na sacarificação e/ou fermentação.

[00359] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é uma alfa- amilase fúngica, em particular uma que tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase tem uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, em particular G128D + D143N. Processos de Produção de um Produto de Fermentação a Partir de Materiais Celulósicos Usando uma Trealase da Invenção

[00360] Em uma modalidade, a invenção se relaciona com processos de produção de um produto de fermentação a partir de um material celulósico

98 / 127 pré-tratado, compreendendo: (a) hidrólise do referido material celulósico pré-tratado usando uma composição de enzimas celulolíticas; (b) fermentação usando um organismo fermentador; e (c) opcionalmente recuperação do produto de fermentação, em que uma trealase da invenção é adicionada e/ou está presente no passo de hidrólise (a) e/ou passo de fermentação (b).

[00361] De acordo com o processo da invenção, a hidrólise e fermentação podem ser levadas a cabo separadamente ou simultaneamente. Em uma modalidade, o processo da invenção é levado a cabo como hidrólise e fermentação separadas (SHF); sacarificação e fermentação simultâneas (SSF); sacarificação e cofermentação simultâneas (SSCF); hidrólise e fermentação híbridas (HHF); hidrólise e cofermentação separadas (SHCF); hidrólise e cofermentação híbridas (HHCF); ou conversão microbiana direta (DMC), também por vezes chamada bioprocessamento consolidado (CBP). A SHF usa passos de processo separados para hidrolisar enzimaticamente em primeiro lugar o material celulósico até açúcares fermentáveis, p.ex., glucose, celobiose e monômeros de pentose e, depois, fermentar os açúcares fermentáveis até etanol. Em SSF, a hidrólise enzimática do material celulósico e a fermentação de açúcares em etanol são combinadas em um passo. A SSCF envolve a cofermentação de múltiplos açúcares (Sheehan, J., e Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy’s research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). A HHF envolve um passo de hidrólise separado e, adicionalmente, um passo de sacarificação e hidrólise simultâneas, que podem ser levados a cabo no mesmo reator. Os passos em um processo de HHF podem ser levados a cabo a diferentes temperaturas, i.e., hidrólise enzimática a elevada temperatura seguida por SSF a uma temperatura mais baixa que a estirpe da fermentação possa tolerar. A

99 / 127 DMC combina os três processos (produção de enzimas, hidrólise e fermentação) em um ou mais (p.ex., vários) passos onde o mesmo organismo é usado para produzir as enzimas para conversão do material celulósico em açúcares fermentáveis e para converter os açúcares fermentáveis em um produto final.

[00362] De acordo com a invenção, o material celulósico é fragmentos de material de plantas, segmentos de caules de plantas e/ou caules inteiros de plantas. Em uma modalidade, o material celulósico é selecionado do grupo compreendendo cana-do-reino, bagaço, bambu, sabugo de milho, fibra de milho, palha de milho, miscanto, casca de laranja, palha de arroz, grama ou palha de trigo. Em uma modalidade preferencial, a fonte do material celulósico é palha de milho, sabugos de milho e/ou palha de trigo.

[00363] De acordo com a invenção pode ser usado qualquer pré- tratamento. Em uma modalidade preferencial é usado pré-tratamento químico, pré-tratamento físico ou pré-tratamento químico e um pré-tratamento físico. Em uma modalidade preferencial, o material celulósico é pré-tratado com um ácido, tal como pré-tratamento com ácido diluído. Em uma modalidade, o material celulósico é preparado por pré-tratamento do material celulósico a uma elevada temperatura, elevada pressão com um ácido.

[00364] Em uma modalidade, a hidrólise é levada a cabo a uma temperatura entre 20-70 °C, tal como 30-60 °C, preferencialmente 45-55 °C a um pH na gama de 4-6, tal como 4,5-5,5.

[00365] Em uma modalidade, o material celulósico está presente a 1- 20% (p/p) de TS, tal como 2-10% (p/p) de TS, tal como cerca de 5% (p/p) de TS durante a hidrólise.

[00366] Em uma modalidade, a hidrólise é levada a cabo durante 1-20 dias, preferencialmente entre de 5-15 dias.

[00367] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é derivada a partir de Trichoderma reesei, Humicola insolens ou

100 / 127 Chrysosporium lucknowense.

[00368] Composição de enzimas celulolíticas: O termo “composição de enzimas celulolíticas” significa uma ou mais (p.ex., várias) enzimas que hidrolisam um material celulósico. Tais enzimas incluem endoglucanase(s), celobioidrolase(s), beta-glucosidase(s) ou suas combinações. As duas abordagens básicas para medição da atividade celulolítica incluem: (1) medição da atividade celulolítica total e (2) medição das atividades celulolíticas individuais (endoglucanases, celobioidrolases e beta- glucosidases) como revisto em Zhang et al., Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. A atividade celulolítica total é usualmente medida usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman №1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de algas, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio mais comum de atividade celulolítica total é o ensaio de papel de filtro usando papel de filtro Whatman №1 como o substrato. O ensaio foi estabelecido pela International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).

[00369] Para propósitos da presente invenção, a atividade de enzimas celulolíticas é determinada por medição do aumento na hidrólise de um material celulósico por enzima(s) celulolítica(s) sob as seguintes condições: 1-50 mg de proteína enzimática celulolítica/g de celulose em PCS (ou outro material celulósico pré-tratado) durante 3-7 dias a uma temperatura adequada, p.ex., 50 °C, 55 °C ou 60 °C, em comparação com uma hidrólise de controle sem adição de proteína enzimática celulolítica. Condições típicas são reações de 1 mL, PCS lavada ou não lavada, sólidos insolúveis a 5%, acetato de sódio a 50 mM pH 5, MnSO4 a 1 mM, 50 °C, 55 °C ou 60 °C, 72 horas, análise de açúcares por coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA).

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[00370] Exemplos de composições celulolíticas podem ser encontrados na seção “Composição de Enzimas Celulolíticas Presente e/ou Adicionada durante a Sacarificação e/ou Fermentação” acima.

[00371] Material celulósico: O termo “material celulósico” significa qualquer material contendo celulose. O polissacarídeo predominante na parede celular primária de material celulósico é a celulose, o segundo mais abundante é a hemicelulose e o terceiro é a pectina. A parede celular secundária, produzida após a célula ter parado de crescer, contém também polissacarídeos e é fortalecida por lignina polimérica covalentemente reticulada à hemicelulose. A celulose é um homopolímero de anidrocelobiose e assim uma beta-(1-4)-D-glucana linear, enquanto que as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, tais como xilanas, xiloglucanas, arabinoxilanas, e mananas em complexas estruturas ramificadas com um espectro de substituintes. Embora geralmente polimorfa, a celulose é encontrada em tecido de plantas principalmente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias de glucana paralelas. As hemiceluloses estão usualmente ligadas por ligações de hidrogênio à celulose, bem como a outras hemiceluloses, que ajudam a estabilizar a matriz da parede celular.

[00372] A celulose é geralmente encontrada, por exemplo, nos caules, folhas, peles, cascas e sabugos de plantas ou folhas, ramos e madeira de árvores. O material celulósico pode ser, mas não está limitado a, resíduo agrícola, material herbáceo (incluindo culturas energéticas), resíduos sólidos municipais, resíduos de fábricas de pasta celulósica e papel, resíduos de papel e madeira (incluindo resíduos de silvicultura) (ver, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp. 105- 118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T.

102 / 127 Scheper, editor executivo, Volume 65, pp. 23-40, Springer-Verlag, Nova Iorque). É entendido aqui que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, um material das paredes celulares de plantas contendo lignina, celulose e hemicelulose em uma matriz mista. Em um aspecto preferencial, o material celulósico é qualquer material de biomassa. Em outro aspecto preferencial, o material celulósico é lignocelulose, que compreende celulose, hemiceluloses e lignina.

[00373] Em um aspecto, o material celulósico é resíduo agrícola. Em outro aspecto, o material celulósico é material herbáceo (incluindo culturas energéticas). Em outro aspecto, o material celulósico é resíduos sólidos municipais. Em outro aspecto, o material celulósico é resíduos de fábrica de pasta celulósica e papel. Em outro aspecto, o material celulósico é resíduos de papel. Em outro aspecto, o material celulósico é madeira (incluindo resíduos de silvicultura).

[00374] Em outro aspecto, o material celulósico é cana-do-reino. Em outro aspecto, o material celulósico é bagaço. Em outro aspecto, o material celulósico é bambu. Em outro aspecto, o material celulósico é sabugo de milho. Em outro aspecto, o material celulósico é fibra de milho. Em outro aspecto, o material celulósico é palha de milho. Em outro aspecto, o material celulósico é miscanto. Em outro aspecto, o material celulósico é casca de laranja. Em outro aspecto, o material celulósico é palha de arroz. Em outro aspecto, o material celulósico é grama. Em outro aspecto, o material celulósico é palha de trigo.

[00375] Em outro aspecto, o material celulósico é choupo. Em outro aspecto, o material celulósico é eucalipto. Em outro aspecto, o material celulósico é abeto. Em outro aspecto, o material celulósico é pinheiro. Em outro aspecto, o material celulósico é álamo. Em outro aspecto, o material celulósico é espruce. Em outro aspecto, o material celulósico é salgueiro.

[00376] Em outro aspecto, o material celulósico é celulose de algas.

103 / 127 Em outro aspecto, o material celulósico é celulose bacteriana. Em outro aspecto, o material celulósico é línter de algodão. Em outro aspecto, o material celulósico é papel de filtro. Em outro aspecto, o material celulósico é celulose microcristalina. Em outro aspecto, o material celulósico é celulose tratada com ácido fosfórico.

[00377] Em outro aspecto, o material celulósico é uma biomassa aquática. Como usado aqui, o termo “biomassa aquática” significa biomassa produzida em um ambiente aquático por um processo de fotossíntese. A biomassa aquática pode ser algas, plantas emergentes, plantas de folhas flutuantes ou plantas submersas.

[00378] O material celulósico pode ser usado como tal ou pode ser sujeito a pré-tratamento, usando métodos convencionais conhecidos na técnica, como descrito aqui. Em um aspecto preferencial, o material celulósico é pré-tratado.

[00379] Beta-glucosidase: O termo “beta-glucosidase” significa uma beta-D-glucosídeo glucoidrolase (E.C. 3.2.1.21) que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glucose não redutores terminais com a liberação de beta- D-glucose. Para propósitos da presente invenção, a atividade de beta- glucosidase é determinada usando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo como substrato de acordo com o procedimento de Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de beta-glucosidase é definida como 1,0 µmol de ânion de p-nitrofenolato produzido por minuto a 25 °C, pH 4,8 a partir de p- nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo a 1 mM como substrato em citrato de sódio a 50 mM contendo TWEEN® 20 (monolaurato de polioxietileno sorbitana) a 0,01%.

[00380] Beta-xilosidase: O termo “beta-xilosidase” significa uma beta-D-xilosídeo xiloidrolase (E.C. 3.2.1.37) que catalisa a exo-hidrólise de

104 / 127 beta (1→4)-xilo-oligossacarídeos curtos para remover resíduos de D-xilose sucessivos de terminais não redutores. Para propósitos da presente invenção, uma unidade de beta-xilosidase é definida como 1,0 µmol de ânion de p- nitrofenolato produzido por minuto a 40 °C, pH 5, a partir de p-nitrofenil- beta-D-xilosídeo a 1 mM como substrato em citrato de sódio a 100 mM contendo TWEEN® 20 a 0,01%.

[00381] Celobioidrolase: O termo “celobioidrolase” significa uma 1,4- beta-D-glucana celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glucosídicas em celulose, celo-oligossacarídeos ou qualquer polímero contendo glucose ligada em beta-1,4, liberando celobiose a partir das extremidades redutoras ou não redutoras da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). A atividade de celobioidrolase é determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288; e Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581. Na presente invenção, o método de Tomme et al. pode ser usado para se determinar a atividade de celobioidrolase.

[00382] Endoglucanase: O termo “endoglucanase” significa uma endo-1,4-(1,3;1,4)-beta-D-glucana 4-glucanoidrolase (E.C. 3.2.1.4) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tais como carboximetilcelulose e hidroxietilcelulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glucanas mistas tais como beta-D- glucanas ou xiloglucanas de cereais e outro material de plantas contendo componentes celulósicos. A atividade de endoglucanase pode ser determinada por medição da redução na viscosidade do substrato ou aumento nas

105 / 127 extremidades redutoras determinado por um ensaio de açúcares redutores (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Para propósitos da presente invenção, a atividade de endoglucanase é determinada usando carboximetilcelulose (CMC) como substrato de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268, a pH 5, 40 °C.

[00383] Glicosídeo hidrolase da família 61: O termo “glicosídeo hidrolase da Família 61” ou “Família GH61” ou “GH61” significa um polipeptídeo da Família 61 de glicosídeo hidrolases de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat e Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. As enzimas desta família foram originalmente classificadas como uma família de glicosídeo hidrolases com base na medição de atividade muito fraca de endo-1,4-beta-D-glucanase em um membro da família. A estrutura e modo de ação destas enzimas não são canônicos e não podem ser consideradas glicosidases verdadeiras. No entanto, são mantidas na classificação CAZy com base na sua capacidade de intensificar a degradação de celulose quando usadas em conjunto com uma celulase ou uma mistura de celulases.

[00384] Enzima hemicelulolítica ou hemicelulase: O termo “enzima hemicelulolítica” ou “hemicelulase” significa uma ou mais (p.ex., várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico. Ver, por exemplo, Shallom e Shoham, 2003, Microbial hemicellulases. Current Opinion In Microbiology, 6 (3): 219-228). As hemicelulases são componentes-chave na degradação de biomassa de plantas. Exemplos de hemicelulases incluem, mas não estão limitados a, uma acetilmanana esterase, uma acetilxilana esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glucuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase. Os

106 / 127 substratos destas enzimas, as hemiceluloses, são um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados e lineares que estão ligados através de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede celular de plantas, as reticulando em uma rede robusta. As hemiceluloses estão também covalentemente ligadas à lignina, formando em conjunto com a celulose uma estrutura altamente complexa. A estrutura variável e a organização das hemiceluloses exigem a ação conjunta de muitas enzimas para a sua degradação completa. Os módulos catalíticos de hemicelulases são glicosídeo hidrolases (GHs) que hidrolisam ligações glicosídicas, ou carboidrato esterases (CEs), que hidrolisam ligações de éster de grupos laterais de acetato ou ácido ferúlico. Estes módulos catalíticos, com base na homologia da sua sequência primária, podem ser atribuídos às famílias GH e CE. Algumas famílias, com um dobramento similar global, podem ser adicionalmente agrupadas em clãs, marcados alfabeticamente (p.ex., GH-A). Uma classificação mais informativa e atualizada destas e outras enzimas ativas em carboidratos está disponível na base de dados Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy). As atividades de enzimas hemicelulolíticas podem ser medidas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & AppI. Chem. 59: 1739-1752, a uma temperatura adequada, p.ex., 50 °C, 55 °C ou 60 °C, e pH adequado, p.ex., 5,0 ou 5,5.

[00385] Polipeptídeo tendo atividade intensificadora celulolítica: O termo “polipeptídeo tendo atividade intensificadora celulolítica” significa um polipeptídeo GH61 que catalisa a intensificação da hidrólise de um material celulósico por enzima tendo atividade celulolítica. Para propósitos da presente invenção, a atividade intensificadora celulolítica é determinada por medição do aumento nos açúcares redutores ou pelo aumento do total de celobiose e glucose a partir da hidrólise de um material celulósico por enzima celulolítica sob as seguintes condições: 1-50 mg de proteína total/g de celulose em PCS, em que a proteína total é compreendida por 50-99,5% p/p de proteína

107 / 127 enzimática celulolítica e 0,5-50% p/p de proteína de um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica durante 1-7 dias a uma temperatura adequada, p.ex., 50 °C, 55 °C ou 60 °C, e pH adequado, p.ex., 5,0 ou 5,5, em comparação com uma hidrólise de controle com igual carga de proteína total sem atividade intensificadora celulolítica (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS). Em um aspecto, uma mistura de CELLUCLAST 1,5L (Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca) na presença de 2-3% de peso de proteína total de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014) ou 2-3% de peso de proteína total de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae como descrito em WO 2002/095014) de carga de proteína celulase é usada como a fonte da atividade celulolítica.

[00386] Os polipeptídeos GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica intensificam a hidrólise de um material celulósico catalisada por enzima tendo atividade celulolítica por redução da quantidade de enzima celulolítica requerida para se alcançar o mesmo grau de hidrólise, preferencialmente pelo menos 1,01 vezes, p.ex., pelo menos 1,05 vezes, pelo menos 1,10 vezes, pelo menos 1,25 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou pelo menos 20 vezes.

[00387] Xilanase: O termo “xilanase” significa uma 1,4-beta-D-xilana- xiloidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta- D-xilosídicas em xilanas. Para propósitos da presente invenção, a atividade de xilanase é determinada com AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em TRITON® X-100 a 0,01% e tampão de fosfato de sódio 200 mM, pH 6 a 37 °C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 µmole de azurina produzida por minuto a 37 °C, pH 6 a partir de AZCL-arabinoxilana a 0,2% como substrato em tampão de fosfato de sódio 200 mM, pH 6.

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[00388] Organismo Fermentador para Fermentação à Base de Celulósico

[00389] O termo “organismo fermentador” ou “microrganismo fermentador” se refere a qualquer organismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, adequado para uso em um processo de fermentação desejado para produzir um produto de fermentação. O organismo fermentador pode ser organismos fermentadores de hexose e/ou pentose ou uma sua combinação. Tanto os organismos fermentadores da hexose como da pentose são bem conhecidos na técnica. Microrganismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, i.e., converter, açúcares, tais como glucose, xilose, xilulose, arabinose, maltose, manose, galactose e/ou oligossacarídeos, diretamente ou indiretamente, no produto de fermentação desejado. Exemplos de organismos fermentadores bacterianos e fúngicos produzindo etanol são descritos por Lin et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.

[00390] Exemplos de organismos fermentadores que conseguem fermentar açúcares de hexose incluem organismos bacterianos e fúngicos, tais como levedura. Leveduras preferenciais incluem estirpes de Candida, Kluyveromyces e Saccharomyces, p.ex., Candida sonorensis, Kluyveromyces marxianus e Saccharomyces cerevisiae.

[00391] Exemplos de organismos fermentadores que conseguem fermentar açúcares de pentose em seu estado nativo incluem organismos bacterianos e fúngicos, tais como algumas leveduras. Leveduras preferenciais fermentadoras de xilose incluem estirpes de Candida, preferencialmente C. sheatae ou C. sonorensis; e estirpes de Pichia, preferencialmente P. stipitis, tal como P. stipitis CBS 5773. Leveduras fermentadoras de pentose preferenciais incluem estirpes de Pachysolen, preferencialmente P. tannophilus. Organismos que não são capazes de fermentar açúcares de pentose, tais como xilose e arabinose, podem ser geneticamente modificados para o fazerem por métodos conhecidos na técnica.

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[00392] Exemplos de bactérias que podem fermentar eficientemente hexose e pentose em etanol incluem, por exemplo, Bacillus coagulans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermocellum, Clostridium phytofermentans, Geobacillus sp., Thermoanaerobacter saccharolyticum e Zymomonas mobilis (Philippidis, 1996, supra).

[00393] Outros organismos fermentadores incluem estirpes de Bacillus, tais como Bacillus coagulans; Candida, tais como C. sonorensis, C. methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naedodendra, C. blankii, C. entomophilia, C. brassicae, C. pseudotropicalis, C. boidinii, C. utilis, e C. scehatae; Clostridium, tais como C. acetobutylicum, C. thermocellum e C. phytofermentans; E. coli, especialmente estirpes de E. coli que foram geneticamente modificadas para melhorar o rendimento do etanol; Geobacillus sp.; Hansenula, tais como Hansenula anomala; Klebsiella, tais como K. oxytoca; Kluyveromyces, tais como K. marxianus, K. lactis, K. thermotolerans e K. fragilis; Schizosaccharomyces, tais como S. pombe; Thermoanaerobacter, tais como Thermoanaerobacter saccharolyticum; e Zymomonas, tais como Zymomonas mobilis.

[00394] Em um aspecto preferencial, a levedura é uma Bretannomyces. Em um aspecto mais preferencial, a levedura é Bretannomyces clausenii. Em outro aspecto preferencial, a levedura é uma Candida. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida sonorensis. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida boidinii. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida blankii. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida brassicae. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida diddensii. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida entomophiliia. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida pseudotropicalis. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida scehatae. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida utilis. Em outro aspecto preferencial, a

110 / 127 levedura é uma Clavispora. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Clavispora lusitaniae. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Clavispora opuntiae. Em outro aspecto preferencial, a levedura é uma Kluyveromyces. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Kluyveromyces fragilis. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Kluyveromyces thermotolerans. Em outro aspecto preferencial, a levedura é uma Pachysolen. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Pachysolen tannophilus. Em outro aspecto preferencial, a levedura é uma Pichia. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é uma Pichia stipitis. Em outro aspecto preferencial, a levedura é uma Saccharomyces spp. Em um aspecto mais preferencial, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Saccharomyces distaticus. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Saccharomyces uvarum.

[00395] Em um aspecto preferencial, a bactéria é uma Bacillus. Em um aspecto mais preferencial, a bactéria é Bacillus coagulans. Em outro aspecto preferencial, a bactéria é uma Clostridium. Em outro aspecto mais preferencial, a bactéria é Clostridium acetobutylicum. Em outro aspecto mais preferencial, a bactéria é Clostridium phytofermentans. Em outro aspecto mais preferencial, a bactéria é Clostridium thermocellum. Em outro aspecto mais preferencial, a bactéria é Geobacilus sp. Em outro aspecto mais preferencial, a bactéria é uma Thermoanaerobacter. Em outro aspecto mais preferencial, a bactéria é Thermoanaerobacter saccharolyticum. Em outro aspecto preferencial, a bactéria é uma Zymomonas. Em outro aspecto mais preferencial, a bactéria é Zymomonas mobilis.

[00396] Leveduras adequadas para produção de etanol comercialmente disponíveis incluem, p.ex., BIOFERM™ AFT e XR (NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, EUA), levedura ETHANOL RED (Fermentis/Lesaffre, EUA), FALI™ (Fleischmann's Yeast, EUA),

111 / 127 FERMIOL™ (DSM Specialties), GERT STRAND™ (Gert Strand AB, Suécia), e levedura fresca SUPERSTART™ e THERMOSACC™ (Ethanol Technology, WI, EUA).

[00397] Em um aspecto preferencial, o microrganismo fermentador foi geneticamente modificado para proporcionar a capacidade de fermentar açúcares de pentose, tais como microrganismos utilizando xilose, utilizando arabinose e coutilizando xilose e arabinose.

[00398] A clonagem de genes heterólogos em vários microrganismos fermentadores levou à construção de organismos capazes de converter hexoses e pentoses em etanol (cofermentação) (Chen e Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter e Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose- metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470;

112 / 127 WO 2003/062430, xilose isomerase).

[00399] Em um aspecto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Candida sonorensis. Em outro aspecto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Escherichia coli. Em outro aspecto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Klebsiella oxytoca. Em outro aspecto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Kluyveromyces marxianus. Em outro aspecto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Saccharomyces cerevisiae. Em outro aspecto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Zymomonas mobilis.

[00400] É bem conhecido na técnica que os organismos descritos acima podem ser também usados para produzir outras substâncias, como descrito aqui.

[00401] O microrganismo fermentador é tipicamente adicionado ao material celulósico degradado ou hidrolisado e a fermentação é realizada durante cerca de 8 a cerca de 96 horas, p.ex., cerca de 24 a cerca de 60 horas. A temperatura é tipicamente entre cerca de 26 °C a cerca de 60 °C, p.ex., cerca de 32 °C ou 50 °C, e cerca de pH 3 a cerca de pH 8, p.ex., pH 4-5, 6 ou

7.

[00402] Em um aspecto, a levedura e/ou outro microrganismo são aplicados ao material celulósico degradado e a fermentação é realizada durante cerca de 12 a cerca de 96 horas, tal como tipicamente 24-60 horas. Em outro aspecto, a temperatura é preferencialmente entre cerca de 20 °C a cerca de 60 °C, p.ex., cerca de 25 °C a cerca de 50 °C, cerca de 32 °C a cerca de 50 °C, ou cerca de 32 °C a cerca de 50 °C, e o pH é geralmente de cerca de pH 3 a cerca de pH 7, p.ex., cerca de pH 4 a cerca de pH 7. No entanto, alguns organismos fermentadores, p.ex., bactérias, têm temperatura de fermentação ótima mais elevada. A levedura ou outro microrganismo é

113 / 127 preferencialmente aplicado em quantidades de aproximadamente 105 a 1012, preferencialmente aproximadamente 107 a 1010, especialmente aproximadamente 2 x 108, de contagem de células viáveis por mL de caldo de fermentação. Orientação adicional no que diz respeito ao uso de levedura para fermentação pode ser encontrada em, p.ex., “The Alcohol Textbook” (Editores K. Jacques, T.P. Lyons e D.R. Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido 1999), que é deste modo incorporado por referência.

[00403] Para a produção de etanol, após a fermentação, a pasta semifluida fermentada é destilada para se extrair o etanol. O etanol obtido de acordo com os processos da invenção pode ser usado como, p.ex., como etanol para combustível, etanol potável, i.e., bebidas alcoólicas neutras potáveis, ou etanol industrial.

[00404] Pode ser usado um estimulante da fermentação em combinação com qualquer um dos processos descritos aqui para melhorar adicionalmente o processo de fermentação e, em particular, o desempenho do microrganismo fermentador, tal como intensificação da taxa e rendimento de etanol. Um “estimulante da fermentação” se refere a estimulantes do crescimento dos microrganismos fermentadores, em particular, leveduras. Estimuladores da fermentação preferenciais para crescimento incluem vitaminas e minerais. Exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para- aminobenzoico, ácido fólico, riboflavina e Vitaminas A, B, C, D e E. Ver, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é deste modo incorporado por referência. Exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem fornecer nutrientes compreendendo P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn e Cu. Produtos de fermentação

[00405] De acordo com a invenção, o termo “produto de fermentação”

114 / 127 pode ser qualquer substância derivada a partir da fermentação. O produto de fermentação pode ser, sem limitação, um álcool (p.ex., arabinitol, n-butanol, isobutanol, etanol, glicerol, metanol, etilenoglicol, 1,3-propanodiol [propilenoglicol], butanodiol, glicerina, sorbitol e xilitol); um alcano (p.ex., pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano e dodecano), um cicloalcano (p.ex., ciclopentano, ciclo-hexano, ciclo-heptano e ciclo-octano), um alceno (p.ex., penteno, hexeno, hepteno e octeno); um aminoácido (p.ex., ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina e treonina); um gás (p.ex., metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2) e monóxido de carbono (CO)); isopreno; uma cetona (p.ex., acetona); um ácido orgânico (p.ex., ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3- hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido lático, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico e ácido xilônico); e policetídeo. O produto de fermentação pode ser também proteína como um produto de elevado valor.

[00406] Em um aspecto preferencial, o produto de fermentação é um álcool. Será entendido que o termo “álcool” engloba uma substância que contém uma ou mais (p.ex., várias) frações de hidroxila. Em um aspecto mais preferencial, o álcool é n-butanol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é isobutanol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é etanol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é metanol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é arabinitol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é butanodiol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é etilenoglicol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é glicerina. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é glicerol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é 1,3-propanodiol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é sorbitol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é xilitol. Ver,

115 / 127 por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., editor, Springer-Verlag Berlim Heidelberga, Alemanha, 65: 207-241; Silveira, M. M. e Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400- 408; Nigam e Singh, 1995, Processes for fermentative production of xylitol – a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji et al., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.

[00407] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é um alcano. O alcano pode ser um alcano não ramificado ou ramificado. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é pentano. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é hexano. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é heptano. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é octano. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é nonano. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é decano. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é undecano. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é dodecano.

[00408] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é um cicloalcano. Em outro aspecto mais preferencial, o cicloalcano é ciclopentano. Em outro aspecto mais preferencial, o cicloalcano é ciclo-hexano. Em outro aspecto mais preferencial, o cicloalcano é ciclo-heptano. Em outro aspecto mais preferencial, o cicloalcano é ciclo-octano.

[00409] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é um alceno. O alceno pode ser um alceno não ramificado ou ramificado. Em outro aspecto mais preferencial, o alceno é penteno. Em outro aspecto mais preferencial, o alceno é hexeno. Em outro aspecto mais preferencial, o alceno é hepteno. Em outro aspecto mais preferencial, o alceno é octeno.

[00410] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é um

116 / 127 aminoácido. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido aspártico. Em outro aspecto mais preferencial, o aminoácido é ácido glutâmico. Em outro aspecto mais preferencial, o aminoácido é glicina. Em outro aspecto mais preferencial, o aminoácido é lisina. Em outro aspecto mais preferencial, o aminoácido é serina. Em outro aspecto mais preferencial, o aminoácido é treonina. Ver, por exemplo, Richard e Margaritis, 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poli(glutamic acid) production and other microbial biopolymer”, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515.

[00411] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é um gás. Em outro aspecto mais preferencial, o gás é metano. Em outro aspecto mais preferencial, o gás é H2. Em outro aspecto mais preferencial, o gás é CO2. Em outro aspecto mais preferencial, o gás é CO. Ver, por exemplo, Kataoka, Miya e Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan, 1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: A review, Biomass and Bioenergy 13 (1-2): 83-114.

[00412] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é isopreno.

[00413] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é uma cetona. Será entendido que o termo “cetona” engloba uma substância que contém uma ou mais (p.ex., várias) frações de cetona. Em outro aspecto mais preferencial, a cetona é acetona. Ver, por exemplo, Qureshi e Blaschek, 2003, supra.

[00414] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é um ácido orgânico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido acético. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido acetônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido

117 / 127 adípico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido ascórbico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido cítrico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido 2,5- diceto-D-glucônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido fórmico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido fumárico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido glucárico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido glucônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido glucurônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido glutárico. Em outro aspecto preferencial, o ácido orgânico é ácido 3- hidroxipropiônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido itacônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido lático. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido málico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido malônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido oxálico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido propiônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido succínico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido xilônico. Ver, por exemplo, Chen e Lee, 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448. Recuperação

[00415] O(s) produto(s) de fermentação é(são) opcionalmente recuperado(s) após a fermentação usando qualquer método conhecido na técnica incluindo, mas não se limitando a, cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação ou extração. Por exemplo, o álcool, tal como etanol, é separado a partir do material fermentado e purificado por métodos convencionais de destilação. Pode ser obtido etanol com uma pureza de até cerca de 96% em vol., que pode ser usado como, por

118 / 127 exemplo, etanol para combustível, etanol potável, i.e., bebidas alcoólicas neutras potáveis ou etanol industrial.

[00416] A presente invenção é adicionalmente divulgada nas seguintes modalidades numeradas:

[00417] Modalidade 1. Um polipeptídeo variante de trealase tendo estabilidade aumentada contra a degradação por proteases e/ou termoestabilidade aumentada, compreendendo uma substituição em uma ou mais posições correspondendo à posição 152, 182, 185 ou 583 de SEQ ID NO: 1, em que a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com os aminoácidos 1 a 674 de SEQ ID NO: 1 e em que a variante tem atividade de trealase.

[00418] Modalidade 2. A variante da modalidade 1, em que o número de substituições é 1-20, p.ex., 1-10 e 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições.

[00419] Modalidade 3. A variante de qualquer uma das modalidades 1- 2, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição P152.

[00420] Modalidade 4. A variante da modalidade 3, em que a substituição é uma substituição por Gly, Glu ou Ala.

[00421] Modalidade 5. A variante de qualquer uma das modalidades 1- 4, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição F182.

[00422] Modalidade 6. A variante da modalidade 5, em que a substituição é uma substituição por Val.

[00423] Modalidade 7. A variante de qualquer uma das modalidades 1- 6, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição F185.

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[00424] Modalidade 8. A variante da modalidade 7, em que a substituição é uma substituição por Arg.

[00425] Modalidade 9. A variante de qualquer uma das modalidades 1- 8, que compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição G583.

[00426] Modalidade 10. A variante da modalidade 9, em que a substituição é uma substituição por Thr.

[00427] Modalidade 11. A variante de qualquer uma das modalidades 1-10, que compreende uma substituição em duas posições correspondendo a qualquer uma das posições 152, 182, 185 ou 583.

[00428] Modalidade 12. A variante de qualquer uma das modalidades 1-10, que compreende uma substituição em três posições correspondendo a qualquer uma das posições 152, 182, 185 ou 583.

[00429] Modalidade 13. A variante de qualquer uma das modalidades 1-10, que compreende uma substituição em cada posição correspondendo às posições 152, 182, 185 ou 583.

[00430] Modalidade 14. A variante de qualquer uma das modalidades 1-13, que compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em P152G, P152E, P152A, F182V, F185R ou G583T.

[00431] Modalidade 15. A variante de qualquer uma das modalidades 1-14 tendo um aumento na estabilidade contra a degradação por proteases, compreendendo uma substituição ou combinação de substituições selecionada de: G583T; P152G; P152E; P152A; F182V; F185R;

120 / 127 P152G + G583T; F185R + G583T; P152A + F182V + G583T; F182V + F185R + G583T; e em que a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com os aminoácidos 1 a 674 de SEQ ID NO: 1 e em que a variante tem atividade de trealase e em que a atividade residual após incubação de 3 dias com mistura de proteases de A. niger a 30 °C, pH 4,0 é pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%.

[00432] Modalidade 16. A variante de qualquer uma das modalidades 1-14 tendo um aumento na termoestabilidade, compreendendo uma substituição ou combinação de substituições selecionada de: P152G; P152E; P152A; F182V; F185R; P152G + G583T; F185R + G583T; P152A + F182V + G583T; F182V + F185R + G583T; e em que a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com os aminoácidos 1 a 674 de SEQ ID NO: 1 e em que a variante tem atividade de trealase e em que a temperatura de desnaturação térmica medida por ensaio de TSA é pelo menos 65,7 °C.

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[00433] Modalidade 17. A variante da modalidade 16, em que a temperatura de desnaturação térmica é pelo menos 65,8 °C, pelo menos 65,9 °C, pelo menos 66,0 °C, pelo menos 66,1 °C, pelo menos 66,2 °C, pelo menos 66,3 °C, pelo menos 66,4 °C, pelo menos 66,5 °C, pelo menos 66,6 °C, pelo menos 66,6 °C, pelo menos 66,8 °C, pelo menos 66,9 °C, pelo menos 67,0 °C, pelo menos 67,1 °C, pelo menos 67,2 °C, pelo menos 67,3 °C, pelo menos 67,4 °C, pelo menos 67,5 °C.

[00434] Modalidade 18. Um polinucleotídeo codificando a variante de qualquer uma das modalidades 1-17.

[00435] Modalidade 19. Um constructo de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo da modalidade 18.

[00436] Modalidade 20. Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo da modalidade 18.

[00437] Modalidade 21. Uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo da modalidade 18 ou o construto de ácido nucleico da modalidade 19.

[00438] Modalidade 22. A célula hospedeira da modalidade 21, selecionada de uma célula hospedeira de levedura, particularmente uma Saccharomyces sp., mais particularmente uma Saccharomyces cerevisiae.

[00439] Modalidade 23. Uma composição compreendendo o polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-17.

[00440] Modalidade 24. Uma formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células compreendendo o polipeptídeo das modalidades 1-17.

[00441] Modalidade 25. Um método de produção de uma variante de trealase, compreendendo:

[00442] cultura da célula hospedeira da modalidade 21 sob condições adequadas para expressão da variante; e recuperação da variante.

[00443] Modalidade 26. O método da modalidade 25, em que a célula

122 / 127 hospedeira é uma célula hospedeira de levedura, particularmente uma levedura selecionada do grupo consistindo em: célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis ou Yarrowia lipolytica, o mais particularmente Saccharomyces cerevisiae.

[00444] Modalidade 27. Um processo de produção de um produto de fermentação, compreendendo (a) liquefação de um material contendo amido com uma alfa- amilase; opcionalmente pré-sacarificação do material liquefeito antes do passo (b); (b) sacarificação do material liquefeito; (c) fermentação usando um organismo fermentador; em que i) uma glucoamilase; ii) uma trealase da modalidade 1; iii) opcionalmente uma composição de enzimas celulolíticas e/ou uma protease; estão presentes e/ou são adicionadas durante o passo de sacarificação (b); o passo de fermentação (c); a sacarificação e fermentação simultâneas; opcionalmente o passo de pré-sacarificação antes do passo (b).

[00445] Modalidade 28. Um processo de produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido, compreendendo: (i) sacarificação de um material contendo amido a uma

123 / 127 temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (ii) fermentação usando um organismo fermentador; em que a sacarificação e/ou a fermentação são feitas na presença das seguintes enzimas: glucoamilase, alfa-amilase, trealase variante da modalidade 1 e, opcionalmente, uma protease e/ou uma composição de enzimas celulolíticas.

[00446] Modalidade 29. Um processo de produção de um produto de fermentação a partir de material celulósico pré-tratado, compreendendo: (a) hidrólise do referido material celulósico pré-tratado usando uma composição de enzimas celulolíticas; (b) fermentação usando um organismo fermentador; e (c) opcionalmente recuperação do produto de fermentação, em que uma trealase variante da modalidade 1 é adicionada e/ou está presente no passo de hidrólise (a) e/ou passo de fermentação (b).

[00447] Modalidade 30. O processo de acordo com qualquer uma das modalidades 27-29, em que o organismo fermentador é a célula hospedeira de acordo com a modalidade 21, particularmente uma célula hospedeira de levedura, particularmente uma levedura selecionada do grupo consistindo em: célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis ou Yarrowia lipolytica, o mais particularmente Saccharomyces cerevisiae.

[00448] Modalidade 31. O processo de acordo com qualquer uma das modalidades 27-29, em que a trealase variante é coformulada com o organismo fermentador, particularmente um organismo de levedura, mais particularmente uma levedura seca.

[00449] Modalidade 32. O processo de qualquer uma das modalidades

124 / 127 27-31, em que o produto de fermentação é um álcool, particularmente etanol.

[00450] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos.

EXEMPLOS MATERIAIS & MÉTODOS Ensaio de Trealase: PRINCÍPIO: Trealose + H2O Trealase > 2 Glucose T = 37 °C, pH = 5,7, A340 nm, Percurso óptico = 1 cm Determinação da Taxa de Paragem Espectrofotométrica Definição de unidade:

[00451] Uma unidade irá converter 1,0 mmol de trealose em 2,0 mmols de glucose por minuto a pH 5,7 a 37 °C (glucose liberada determinada a pH 7,5).

[00452] (Ver Dahlqvist, A. (1968) Analytical Biochemistry 22, 99-107) Exemplo 1:

[00453] Posições adequadas para melhorar a termoestabilidade e estabilidade em relação a proteases da trealase GH37 de Myceliophthora sepedonium de tipo selvagem foram identificadas e variantes específicas foram construídas. As variantes de substituição única específicas e suas combinações foram testadas quanto a aumento na temperatura de desnaturação térmica, Td, determinado por ensaios de desvio térmico (TSA) e aumento na atividade residual após incubação de 3 dias na presença de uma mistura de proteases a três temperaturas diferentes como uma medida de estabilidade aumentada na direção da degradação de proteases (ensaio de estabilidade em relação a proteases). As variantes específicas construídas e testadas são mostradas na Tabela 1 e o aumento resultante na temperatura de fusão e estabilidade em relação a proteases é mostrado na Tabela 2. Tabela 1. Variantes de PE M-trealase

125 / 127 Variantes Substituições JTH001 G583T JTH061 P152G JTH062 P152E JTH063 P152A JTH064 F182V JTH065 F185R JTH066 P152G G583T JTH067 F185R G583T JTH076 P152A F182V G583T JTH078 F182V F185R G583T Purificação

[00454] A purificação de trealases de tipo selvagem e variantes de trealase foi levada a cabo por dois passos, coluna de dessalinização e coluna de cromatografia de permuta catiônica. Finalmente, as amostras foram dialisadas contra 10 L de tampão de acetato de sódio a 20 mM (pH 4,0) usando membrana de diálise com MWCO (limiar de peso molecular) de 12k - 14k e depois concentradas usando unidade de filtração por centrifugação com MWCO de 30k. Determinação da termoestabilidade (TSA)

[00455] A enzima purificada foi diluída até 0,5 mg/mL com tampão de acetato de sódio a 50 mM (pH 4,5) e misturada com volume igual de SYPRO Orange (Invitrogen) diluído com água Milli-Q. Dezoito microlitros da solução de mistura foram transferidos para Placa Multipoços 384 para LightCycler 480 (Roche Diagnostics) e a placa foi vedada. Parâmetros de equipamento de TSA:

[00456] Aparelho: Sistema de PCR em Tempo Real LightCycler 480 (Roche Applied Science) Taxa de varredura: 0,02 °C/seg Gama de varredura: 37 °C - 96 °C Tempo de integração: 1,0 seg Comprimento de onda de excitação 465 nm Comprimento de onda de emissão 580 nm

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[00457] O sinal de fluorescência obtido foi normalizado para uma gama de 0 e 1. A temperatura de desnaturação (Td) foi definida como a temperatura onde o valor normalizado é o mais próximo de 0,5. A temperatura onde a intensidade de sinal máxima (o valor normalizado é 1) foi definida como Td2 e é usada para um índice de termoestabilidade de variantes de trealase GH37 de Myceliophthora sepedonium. Ensaio de trealase

[00458] Dez microlitros de amostra foram misturados com 190 µL de solução de substrato (trealose a 1% em acetato de sódio a 50 mM, pH 4,3) e incubados a 32 °C durante 1 hora. 10 µL da solução foram depois recolhidos e 200 µL de teste de glucose CII WAKO (Wako Pure Chemical Industries, Osaca, Japão) foram adicionados. A A505 foi medida após incubação de 15 min à temperatura ambiente. Cultura de SF para a preparação de coquetel de proteases

[00459] Estirpes de Aspergillus niger usadas para se preparar coquetel de proteases são derivados de NN059095, que foi isolada pela Novozymes e geneticamente modificada para interromper a expressão de atividades de amiloglicosidase de Aspergillus niger NN049184 isolada do solo.

[00460] Os esporos de estirpes de Aspergillus niger foram inoculados em 100 mL de meio MLC e cultivados a 30 °C durante 2 dias. 10 mL de MLC foram inoculados em 100 mL de meio MU-1 e cultivados a 30 °C durante 7 dias. O sobrenadante foi obtido por centrifugação.

[00461] O MLC é composto por 40 g de glucose, 50 g de soja em pó, 4 g de ácido cítrico (pH 5) e água até 1 litro.

[00462] O MU-1-glu é composto por 260 g de glucose, 3 g de MgSO4·7H2O, 5 g de KH2PO4, 6 g de K2SO4, 0,5 mL de solução de metais vestigiais e 2 g de ureia (pH 4,5) e água até 1 litro.

[00463] A solução de metais vestigiais é composta por 6,8 g de ZnCl2·7H2O, 2,5 g de CuSO4·5H2O, 0,24 g de NiCl2·6H2O, 13,9 g de

127 / 127 FeSO4·7H2O, 13,5 g de MnSO4·H2O e 3 g de ácido cítrico e água até 1 litro. Ensaio de estabilidade em relação a proteases

[00464] Enzima purificada foi diluída até 2 mg/mL com tampão de acetato de sódio a 50 mM pH 4,0 e 100 µL da amostra foram misturados com 100 µL do coquetel de proteases preparado. A solução foi depois incubada a - 20 °C, 4 °C, 30 °C e 40 °C durante 3 dias e a atividade residual foi medida por ensaio de trealase.

[00465] Os resultados dos testes realizados são mostrados na tabela 2. Resultados Tabela 2. Variantes de Ms-trealase Estabilidade em relação a proteases* Variantes Td2 [°C] 4 °C 30 °C 40 °C M-trealase (WT) 65,5 90% 42% 15% JTH001 65,5 100% 58% 17% JTH061 66,2 100% 82% 38% JTH062 66,9 100% 80% 34% JTH063 65,8 100% 68% 26% JTH064 66,3 100% 74% 30% JTH065 67,6 100% 80% 37% JTH066 67,4 100% 86% 35% JTH067 67,4 97% 76% 31% JTH076 65,7 100% 68% 24% JTH078 66,0 100% 58% 18% *Atividade residual após incubação de 3 dias em uma mistura com adição com coquetel de proteases (-20 °C como 100%)

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo variante de trealase tendo estabilidade aumentada contra a degradação por proteases e/ou termoestabilidade aumentada, caracterizado pelo fato de que compreende uma substituição em uma ou mais posições correspondendo à posição 152, 182, 185 ou 583 de SEQ ID NO: 1, em que a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com os aminoácidos 1 a 674 de SEQ ID NO: 1 e em que a variante tem atividade de trealase.

2. Variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em P152G, P152E, P152A, F182V, F185R ou G583T.

3. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que tem um aumento na estabilidade contra a degradação por proteases, compreendendo uma substituição ou combinação de substituições selecionada de: G583T; P152G; P152E; P152A; F182V; F185R; P152G + G583T; F185R + G583T; P152A + F182V + G583T; F182V + F185R +G583T; e em que a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com os aminoácidos 1 a 674 de SEQ ID NO: 1 e em que a variante tem atividade de trealase e em que a atividade residual após incubação de 3 dias com mistura de proteases de A. niger a 30 °C, pH 4,0 é pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%.

4. Variante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ter um aumento na termoestabilidade, compreendendo uma substituição ou combinação de substituições selecionada de: P152G; P152E; P152A; F182V; F185R; P152G + G583T; F185R + G583T; P152A + F182V + G583T; F182V + F185R +G583T; e em que a variante tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com os aminoácidos 1 a 674 de SEQ ID NO: 1 e em que a variante tem atividade de trealase e em que a temperatura de desnaturação térmica medida por ensaio de TSA é pelo menos 65,7 °C.

5. Variante de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a temperatura de desnaturação térmica é pelo menos 65,8 °C, pelo menos 65,9 °C, pelo menos 66,0 °C, pelo menos 66,1 °C, pelo menos 66,2 °C, pelo menos 66,3 °C, pelo menos 66,4 °C, pelo menos 66,5 °C, pelo menos 66,6 °C, pelo menos 66,6 °C, pelo menos 66,8 °C, pelo menos 66,9 °C,

pelo menos 67,0 °C, pelo menos 67,1 °C, pelo menos 67,2 °C, pelo menos 67,3 °C, pelo menos 67,4 °C, pelo menos 67,5 °C.

6. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica a variante como definida em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5.

7. Construto de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 6.

8. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 6.

9. Célula hospedeira, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 6, ou o construto de ácido nucleico como definido na reivindicação 7.

10. Composição, caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou

5.

11. Formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células, caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5.

12. Método de produção de uma variante de trealase, caracterizado pelo fato de que compreende: cultura da célula hospedeira, como definida na reivindicação 9, sob condições adequadas para expressão da variante; e recuperação da variante.

13. Processo de produção de um produto de fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) liquefação de um material contendo amido com uma alfa- amilase; opcionalmente pré-sacarificação do material liquefeito antes do passo (b); (b) sacarificação do material liquefeito;

(c) fermentação usando um organismo fermentador; em que i) uma glucoamilase; ii) uma trealase, conforme definida na reivindicação 1; iii) opcionalmente uma composição de enzimas celulolíticas e/ou uma protease; estão presentes e/ou são adicionadas durante o passo de sacarificação (b); o passo de fermentação (c); a sacarificação e fermentação simultâneas; opcionalmente o passo de pré-sacarificação antes da passo (b).

14. Processo de produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (ii) fermentação usando um organismo fermentador; em que a sacarificação e/ou a fermentação são feitas na presença das seguintes enzimas: glucoamilase, alfa-amilase, trealase variante como definida na reivindicação 1 e, opcionalmente, uma protease e/ou uma composição de enzimas celulolíticas.

15. Processo de produção de um produto de fermentação a partir de material celulósico pré-tratado, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) hidrólise do referido material celulósico pré-tratado usando uma composição de enzimas celulolíticas; (b) fermentação usando um organismo fermentador; e (c) opcionalmente recuperação do produto de fermentação, em que uma trealase variante como definida na reivindicação 1, é adicionada e/ou está presente no passo de hidrólise (a) e/ou passo de fermentação (b).

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o organismo fermentador é a célula hospedeira como definida na reivindicação 9, particularmente uma célula hospedeira de levedura, particularmente uma levedura selecionada do grupo consistindo em: célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis ou Yarrowia lipolytica, o mais particularmente Saccharomyces cerevisiae.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a trealase variante é coformulada com o organismo fermentador, particularmente um organismo de levedura, mais particularmente uma levedura seca.