ES2534067T3 - Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los mismos - Google Patents

Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los mismos Download PDF

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Abstract

1. Polipéptido aislado que tiene actividad de glucoamilasa, seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85%, de forma más preferible al menos 86%, de forma más preferible al menos 87%, de forma más preferible al menos 88%, de forma más preferible al menos 89%, de forma más preferible al menos 90%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, incluso de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, e incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad con los aminoácidos 18 a 573 de SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 14 o aminoácidos 18 a 576 de SEC ID nº: 16 o SEC ID nº: 18; (b) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 86%, de forma más preferible al menos 87%, de forma más preferible al menos 88%, de forma más preferible al menos 89%, de forma más preferible al menos 90%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, incluso de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, e incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad con el dominio catalítico mostrado como los aminoácidos 19 a 474 de SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 14, o aminoácidos 19 a 471 de SEC ID nº: 16 o SEC ID nº: 18; (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85%, de forma más preferible al menos 86%, de forma más preferible al menos 87%, de forma más preferible al menos 88%, de forma más preferible al menos 89%, de forma más preferible al menos 90%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, incluso de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, e incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad con la secuencia codificante de SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 11, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 15 o SEC ID nº: 17 que codifica los aminoácidos 18 a 573 de SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 14, o aminoácidos 18 a 576 de SEC ID nº: 16 o SEC ID nº: 18.

Description

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[0056] Aminoácidos esenciales en el polipéptido original se pueden identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de escaneado de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la última técnica, las mutaciones de alanina únicas se introducen en cada residuo de la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se evalúan para actividad de glucoamilasa para identificar residuos de aminoácidos que sean críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar por análisis físico de estructura, como se determina por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica o marcaje por fotoafinidad, conjuntamente con la mutación de aminoácidos de sitio de contacto putativo. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. Las identidades de los aminoácidos esenciales también pueden ser inferidas a partir de análisis de identidades con polipéptidos que están relacionados con un polipéptido según la invención.
[0057] Sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples, deleciones y/o inserciones se pueden hacer y evaluar usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o redistribución, seguido de un procedimiento de selección pertinente, tal como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden usar incluyen PCR con tendencia al error, presentación en fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10832-10837; Patente de EE.UU. nº: 5.223.409; WO 92/06204), y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
[0058] Métodos de mutagénesis/redistribución se pueden combinar con métodos de selección automatizados de alto rendimiento para detectar actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresados por células huésped (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células huésped y secuenciar rápidamente usando métodos estándar de la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida.
[0059] El número total de sustituciones de aminoácidos, deleciones y/o inserciones del polipéptido maduro, tal como los aminoácidos 18 a 573 de SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 14, SEC ID nº: 16 o SEC ID nº: 18, o el dominio catalítico, tal como los aminoácidos 19 a 474 de SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 8, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 14, o aminoácidos 19 a 471 de SEC ID nº: 16 o SEC ID nº: 18, o es 10, preferiblemente 9, de forma más preferible 8, de forma más preferible 7, de forma más preferible como mucho 6, de forma más preferible 5, de forma más preferible 4, incluso de forma más preferible 3, de la forma más preferible 2, e incluso de la forma más preferible 1.
Fuentes de polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa
[0060] Un polipéptido de la presente invención se puede obtener a partir de microorganismos de cualquier género. Para fines de la presente invención, el término "obtenido a partir de" como se utilizan en este caso en relación con una fuente dada debe referirse a que el polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos es producido por la fuente o por una cepa donde la secuencia de nucleótidos de la fuente ha sido insertada. Preferiblemente, el polipéptido obtenido a partir de una fuente dada es secretado extracelularmente.
[0061] Un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa de la presente invención también puede ser polipéptido bacteriano, o un polipéptido de levadura, o de forma más preferible un polipéptido fúngico filamentoso tal como un polipéptido de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Artomyces, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella o Xylaria que tiene actividad de glucoamilasa.
[0062] En un aspecto preferido, el polipéptido es un polipéptido de Gloeophyllum sp., tal como un polipéptido de Gloeophyllum sepiarium, Gloeophyllum trabeum, or Gloeophyllum abietinum que tiene actividad de glucoamilasa. Se entiende que para las especies ya mencionadas la invención abarca tanto el estado perfecto como el imperfecto, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de especies por el que se conozcan. Expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados.
[0063] Cepas de estas especies son de fácil acceso para el público en varias colecciones de cultivo, como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
[0064] Además, tales polipéptidos se pueden identificar y obtener a partir de otras fuentes, incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, suelo, abonos, agua, etc.) utilizando las sondas anteriormente mencionadas.
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gen completamente sintético basado en el conocimiento de las secuencias de aminoácidos de CBMs, enlaces y dominios catalíticos adecuados.
[0078] El término "enzima híbrida" (también denominado, "proteína de fusión", "híbrido", "polipéptido híbrido" o "proteína híbrida") se utiliza en este caso para caracterizar los polipéptidos híbridos de la invención que comprenden un módulo catalítico que tiene actividad enzimática (por ejemplo, actividad de degradación de almidón, tal como actividad de alfaamilasa, amilopululanasa, beta-amilasa, CGTasa, glucoamilasa, isoamilasa, amilasa maltogénica y pululanasa) y un módulo de unión a carbohidratos donde el dominio catalítico y el módulo de unión a carbohidratos son derivados de distintas fuentes. El término "fuente" incluye, pero no está limitado a, una enzima original o una variante de la misma, por ejemplo, una amilasa o glucoamilasa, u otra actividad catalítica que comprenda un módulo catalítico adecuado y/o un CBM adecuado y/o un enlazador adecuado. No obstante el CBM también se puede derivar a partir de un polipéptido con ninguna actividad catalítica. El dominio catalítico y el módulo de unión a carbohidratos se puede derivar de la misma cepa microbiana, a partir de cepas en las mismas especies, de especies relacionadas de forma cercana u organismos menos relacionados. Preferiblemente, el dominio catalítico y el módulo de unión a carbohidratos de los híbridos son derivados a partir de distintas fuentes, por ejemplo, de distintas enzimas de la misma cepa y/o especies, o por ejemplo, de cepas dentro de especies diferentes.
[0079] En un aspecto la enzima híbrida comprende el CBM (también conocido como un dominio de unión a carbohidrato
o CBD) según la invención y un dominio catalítico. El dominio catalítico es en una forma de realización particular un dominio catalítico de glucoamilasa.
Constructos de ácidos nucleicos
[0080] La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que incluyen un polinucleótido aislado de la presente invención operativamente enlazado a una o varias (diferentes) secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.
[0081] Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de la presente invención se puede manipular de varias formas para proporcionar expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia del polinucleótidos antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias de polinucleótidos que utilizan métodos de ADN recombinante se conocen bien en la técnica.
[0082] La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una célula huésped para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y se pueden obtener a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o heterólogos de la célula huésped.
[0083] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa son promotores obtenidos a partir de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA), proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans, amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, al igual que el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae); y sus promotores mutante, truncados e híbridos.
[0084] En un huésped de levadura, promotores útiles se obtienen a partir de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactoquinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huésped de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
[0085] La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención.
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[0097] La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor y señales de parada transcripcionales y traduccionales. Los diferentes ácidos nucleicos y secuencias de control descritos aquí se pueden unir para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o varios (diferentes) sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o la sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en tales sitios. Alternativamente, una secuencia de polinucleótidos de la presente invención se puede expresar por inserción de la secuencia de nucleótidos o un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante esté operativamente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.
[0098] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que se pueda someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y que puede provocar la expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que el vector se debe introducir. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados.
[0099] El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que exista como una entidad extracromosómica, cuya replicación sea independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduzca en la célula huésped, se integre en el genoma y se replique con el cromosoma(s) en el que se ha integrado. Además, se puede utilizar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contengan el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón.
[0100] Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o varios (diferentes) marcadores seleccionables que permiten la fácil selección de células transformadas, modificadas, transducidas o similares. Una etiqueta seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a los metales pesados, prototrofia a los auxótrofos y similares.
[0101] Marcadores seleccionables para su uso en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, pero de forma no limitativa, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato decarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de los mismos. Se prefieren para su uso en una célula de Aspergillus los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.
[0102] Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen un elemento(s) que permite la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma.
[0103] Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede contar con la secuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para integración en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una ubicación(es) precisa del cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener preferiblemente un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a 10.000 pares de bases, preferiblemente de 400 a 10.000 pares de bases y de la forma más preferible de 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un grado alto de identidad con la secuencia objetivo correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga de la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de nucleótidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.
[0104] Para replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita al vector replicar de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plásmido que medie replicación autónoma que funcione en una célula. El término "origen de replicación" o "plásmido replicador" se define aquí como una secuencia de nucleótidos que permite a un plásmido o vector replicar in vivo.
[0105] Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprendan el gen se puede realizar según los métodos descritos en la WO 00/24883.
[0106] Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en una célula huésped para aumentar la producción del producto génico. Un aumento en el número de copias del polinucleótido se puede obtener integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen
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[0126] Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitado a, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, de cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) para obtener polipéptidos sustancialmente puros.
Plantas
[0127] La presente invención también se refiere a plantas, por ejemplo, una planta transgénica, parte de una planta o célula vegetal, que incluye un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa de la presente invención para expresar y producir el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido se puede recuperar de la planta o de la parte de planta. Alternativamente, la planta o parte de planta que contiene el polipéptido recombinante se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, por ejemplo, mejorar el valor nutricional, la palatabilidad y las propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.
[0128] La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot). Ejemplos de plantas monocotiledóneas son hierbas, tales como poa de los prados (grama azul, Poa), hierba forrajera tal como Festuca, Lolium, césped templado, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz.
[0129] Ejemplos de plantas dicotiledóneas son tabaco, legumbres, tales como altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante, judía y semilla de soja, y plantas crucíferas (familia Brassicaceae), tales como coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo cercanamente relacionado Arabidopsis thaliana.
[0130] Ejemplos de partes de planta son tallo, callo, hojas, raíz, frutos, semillas y tubérculos al igual que los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo, epidermis, mesofilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. Compartimentos de células vegetales específicos, tales como cloroplastos, apoplastos, mitocondria, vacuolas, peroxisomas y citoplasma son también considerado como una parte de una planta. Además, cualquier célula vegetal, independientemente del origen del tejido, se considera parte de planta. Asimismo, partes de planta tales como tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención también se consideran partes de planta, por ejemplo, embriones, endospermas, aleurona y revestimientos de semillas.
[0131] También se incluye dentro del campo de la presente invención los descendientes de tales plantas, partes de planta y células vegetales.
[0132] La célula vegetal o planta transgénica que expresa un polipéptido de la presente invención se puede construir conforme a métodos conocidos en la técnica. En resumen, la planta o célula vegetal se construye por incorporación de uno o varios (diferentes) constructos de expresión que codifican un polipéptido de la presente invención en el genoma huésped vegetal o genoma de cloroplasto y que propaga la planta modificada resultante o célula vegetal en una planta transgénica o célula vegetal.
[0133] El constructo de expresión es convenientemente un constructo de ácidos nucleicos que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención operativamente enlazado a las secuencias reguladoras apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia de nucleótidos de la planta o parte de planta elegida. Además, el constructo de expresión puede comprender una etiqueta seleccionable útil para identificar células huésped en las que el constructo de expresión se haya integrado y secuencias de ADN necesarias para la introducción del constructo en la planta en cuestión (depende del método de introducción de ADN que se vaya a usar).
[0134] La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente secuencias señal o de tránsito se determina, por ejemplo, basándose en cuándo, dónde y cómo se desea que sea expresado el polipéptido. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser desarrollable, fase o tejido específica, y el producto génico puede estar dirigido a un tejido específico o parte de planta tal como semillas u hojas. Secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.
[0135] Para la expresión constitutiva, el 35S-CaMV, la ubiquitina 1 de maíz, y el promotor de actina 1 de arroz se puede utilizar (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294, Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Promotores específicos de órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de patata y frutos (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303) o de tejidos sumidero metabólicos tales como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico de semilla como la glutelina, prolamina, globulina o promotor de albúmina de arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legúmina B4 y el gen de proteína de semilla desconocida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína del cuerpo oleaginoso de semillas (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), el promotor napa de la proteína de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en la WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal
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[0178] La alfa-amilasa puede ser según la invención de cualquier origen. Se prefieren las alfa amilasas de origen fúngico
o bacteriano.
[0179] En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida, por ejemplo, alfa-amilasa ácida fúngica o alfa-amilasa ácida bacteriana. El término "alfa-amilasa ácida" se refiere a una alfa amilasa (EC 3.2.1.1) que añadida en una cantidad eficaz tiene actividad óptima en un pH en la gama de 3 a 7, preferiblemente de 3,5 a 6, o de la forma más preferible de 4-5.
Alfa-amilasas bacterianas
[0180] Según la invención, una alfa-amilasa bacteriana se puede derivar preferiblemente del género Bacillus.
[0181] En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa de Bacillus se deriva de una cepa de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis o B. stearothermophilus, pero también se puede derivar de otra especie de Bacillus sp. Ejemplos específicos de alfa-amilasas contempladas incluyen la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (BLA) mostrada en SEC ID nº: 4 en la WO 99/19467, la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (BAN) mostrada en SEC ID nº: 5 en la WO 99/19467, y la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (BSG) mostrada en SEC ID nº: 3 en la WO 99/19467. En una forma de realización de la invención, la alfa-amilasa es una enzima que tiene un grado de identidad de al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, más preferido al menos 80%, más preferiblemente incluso al menos 90%, tal como al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias mostradas como SEC ID NOS: 1, 2, 3, 4 o 5, respectivamente, en la WO 99/19467.
[0182] La alfa-amilasa de Bacillus también puede ser una variante y/o híbrido, especialmente una descrita en cualquiera de WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059 y WO 02/10355 (todos los documentos se incorporan en la presente por referencia). Variantes de alfa-amilasa específicamente contempladas se describen en las patentes de EE.UU. números: 6.093.562, 6.187.576 y 6.297.038 (incorporadas por la presente por referencia) e incluyen variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (alfa-amilasa BSG) que tienen una eliminación de uno o dos aminoácidos en la posición 179 a 182, preferiblemente una eliminación doble descrita en la WO 96/23873 -véase, por ejemplo, página 20, líneas 1-10 (por la presente incorporada por referencia), que corresponde preferiblemente con delta(181-182) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa BSG de tipo salvaje expuesta en SEC ID nº: 3 descrita en la WO 99/19467 o eliminación de los aminoácidos 179 y 180 usando SEC ID nº: 3 en la WO 99/19467 para numeración (cuya referencia es por la presente incorporada por referencia). Más preferidas incluso son las alfa-amilasas de Bacillus, especialmente la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, que tiene una eliminación doble que corresponde con delta(181-182) y además comprende una sustitución N193F (también denominada I181* + G182* + N193F) en comparación con la secuencia de aminoácidos de alfa-amilasa BSG de tipo salvaje expuesta en SEC ID nº: 3 descrita en la WO 99/19467.
[0183] La alfa-amilasa también puede ser una alfa-amilasa maltogénica. Una "alfa-amilasa maltogénica" (glucano 1,4alfa-maltohidrolasa, EC 3.2.1.133) puede hidrolizar amilosa y amilopectina en maltosa en la alfa configuración. Una alfaamilasa maltogénica de la cepa de Bacillus stearothermophilus NCIB 11837 está comercialmente disponible en Novozymes A/S, Dinamarca. La alfa-amilasa maltogénica se describe en las patentes de EE.UU. números 4.598.048,
4.604.355 y 6.162.628, que son por la presente incorporadas por referencia.
Alfa-amilasas híbridas bacterianas
[0184] Una alfa-amilasa híbrida específicamente contemplada comprende 445 residuos de aminoácidos de C-terminal de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (mostrada como SEC ID nº: 4 en la WO 99/19467) y los 37 residuos de aminoácidos de N-terminal de la alfa-amilasa derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada como SEC ID nº: 3 en la WO 99/19467), con uno o varios, especialmente todas, de las siguientes sustituciones:
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S (utilizando la numeración de Bacillus licheniformis). También preferido son variantes que tienen una o varias de las siguientes mutaciones (o mutaciones correspondientes en otra estructura de alfa-amilasa de Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V y Q264S y/o eliminación de dos residuos entre las posiciones 176 y 179, preferiblemente eliminación de E178 y G179 (utilizando la numeración de SEC ID nº: 5 de la WO 99/19467).
[0185] La alfa-amilasa bacteriana se puede añadir en cantidades que son bien conocidas en la técnica. Cuando se miden en unidades KNU (descritas más abajo en la sección "Materiales y métodos") la actividad de alfa-amilasa está preferiblemente presente en una cantidad de 0,5-5,000 NU/g de DS, en una cantidad de 1-500 NU/g de DS, o de forma más preferible en una cantidad de 5-1,000 NU/g de DS, tal como 10-100 NU/g DS.
Alfa-amilasas fúngicas
[0186] Alfa-amilasas ácidas fúngicas incluyen alfa-amilasas ácidas derivadas de una cepa de Aspergillus, tal como alfaamilasas de Aspergillus kawachii, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.
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Temperatura de incubación: 60°C
Tiempo de reacción: 15 minutos
Terminación de la reacción: NaOH a una concentración de aproximadamente 0,2 g/L (pH~9)
Concentración enzimática: 0,15-0,55 AAU/mL.
[0211] El almidón debería ser almidón Lintner, que es un almidón de ebullición fina usado en el laboratorio como indicador colorimétrico. El almidón Lintner se obtiene por tratamiento de ácido clorhídrico diluido de almidón nativo de modo que retenga la capacidad de colorear de azul con yodo.
5 Actividad de glucoamilasa (AGU)
[0212] La unidad Novo de glucoamilasa (AGU) se define como la cantidad de enzima, que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo las condiciones estándar 37°C, pH 4,3, sustrato: maltosa 23,2 mM, tampón: acetato 0,1 M,
10 tiempo de reacción 5 minutos.
[0213] Se puede usar un sistema autoanalizador. Se añade mutarotasa al reactivo de glucosa deshidrogenasa de modo que cualquier alfa-D-glucosa presente se convierta en beta-D-glucosa. La glucosa deshidrogenasa reacciona específicamente con beta-D-glucosa en la reacción mencionada anteriormente, formando NADH que se determina
15 usando un fotómetro a 340 nm como medida de la concentración de glucosa original.
Incubación AMG:
Substrato:
maltosa 23,2 mM
Tampón:
acetato 0,1 M
pH:
4,30 ± 0,05
Temperatura de incubación:
37°C ± 1
Tiempo de reacción:
5 minutos
Gama de trabajo de enzima:
0,5-4,0 AGU/mL
Reacción de color:
GlucDH:
430 U/L
Mutarotasa:
9 U/L
NAD:
0,21 mM
Tampón:
fosfato 0,12 M; 0,15 M NaCl
pH:
7,60 ± 0,05
Temperatura de incubación:
37°C ± 1
Tiempo de reacción:
5 minutos
Longitud de onda:
340 nm
[0214] Una carpeta (EB-SM-0131,02/01) que describe este método analítico con más detalle está disponible en la 20 solicitud de Novozymes A/S, Dinamarca, esta carpeta se incluye en la presente por referencia.
Actividad de alfa-amilasa (KNU)
[0215] La actividad de alfa-amilasa se puede determinar usando almidón de patata como sustrato. Este método se basa
25 en la descomposición de almidón de patata modificado por la enzima, y la reacción está seguida de muestras de mezcla de la solución de almidón/enzima con una solución de yodo. Inicialmente, se forma un color azul negruzco, pero durante la descomposición del almidón el color azul se hace más débil y gradualmente cambia a marrón rojizo, que se compara con un vidrio coloreado estándar.
30 [0216] Una Unidad Kilo Novo (KNU) de alfa-amilasa se define como la cantidad de enzima que, bajo condiciones estándar (es decir, a 37°C +/-0,05, 0,0003 M Ca2+; y pH 5,6) dextriniza 5260 mg de sustancia seca de almidón Merck Amylum soluble.
[0217] Una carpeta EB-SM-0009.02/01 que describe este método analítico con más detalle está disponible bajo pedido 35 en Novozymes A/S, Dinamarca, esta carpeta se incluye en la presente por referencia.
Actividad de alfa-amilasa ácida
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Temperatura de incubación: 40°C
Tiempo de reacción: 23 segundos
Longitud de onda: 590 nm
Concentración enzimática: 0,025 AFAU/mL
Gama de trabajo de enzima: 0,01-0,04 AFAU/mL
[0225] Una carpeta EB-SM-0259,02/01 que describe este método analítico con más detalle está disponible bajo pedido en Novozymes A/S, Dinamarca, esta carpeta se incluye en la presente por referencia.
5 Ejemplo 1
Sacarificación simultánea y fermentación (SSF) con AMG de Gloeophyllum sepiarium
[0226] El rendimiento de SSF de las glucoamilasas de Gloeophyllum sp se evaluó en diferentes dosis de enzima. La 10 fermentación se realizó bajo las siguientes condiciones:
Sustrato: maíz molido fue suspendido con contracorriente y su sustancia seca se ajustó a aproximadamente 32% (p/p). Luego fue licuado a 85°C y pH 5,8. La trituración licuada tenía una DE de 13,4. Temperatura: 32°C
15 pH inicial: 5,0 Dosis enzimática: AMG de Gloeophyllum sp producida en Aspergillus niger en 30, 40, 55 y 70 microgramos de proteína de enzima/g DS. Las enzimas se compararon con una muestra purificada de AMG de Talaromyces emersonii comercial dosificado en las mismas dosificaciones. La máxima dosis de AMG de Talaromyces emersonii es equivalente a una cantidad pertinente en la industria de 0,56 AGU/g DS. Un control para sacarificación máxima
20 obtenible se preparó usando cantidades en exceso de AMG comercial y alfa-amilasa.
Fermentación
[0227] Al sustrato para SSF, se añadió 1.000 ppm de urea como fuente de nitrógeno y 3 ppm de penicilina para control
25 bacteriano; el pH fue ajustado a 5,0 con H2SO4. Partes alícuotas de 5 g de trituración fueron transferidas a tubos centrifugadores de 15 ml con un orificio practicado en la parte superior para liberar CO2. Se añadieron enzimas y levadura y los tubos se colocaron al baño maría sin agitación a 32°C durante 54 horas. Se analizaron muestras en HPLC para determinar el etanol producido durante la fermentación. Los resultados se muestran en las tablas más abajo.
Tabla 1. Etanol g/L producido durante SSF con AMG de Gloeophyllum sepiarium en 30, 40, 55 y 70 microgramos de proteína de enzima/g DS en comparación con AMG de Talaromyces emersonii. El control resultó en 133,08 g/L etanol.
Dosis enzimática (microgramos de proteína de enzima/g DS)
30
40 55 70
Talaromyces emersonii (SEC ID nº: 20)
110,3 119,8 124,9 126,9
Gloeophyllum sepiarium (SEC ID NO: 2)
115,5 122,6 130,8 130,7
Tabla 2. Etanol g/L producido durante SSF con AMG de Gloeophyllum sepiarium en 30, 40, 55 y 70 microgramos de proteína de enzima/g DS en comparación con AMG de Talaromyces emersonii. El control resultó en 131,9 g/L etanol.
Dosis enzimática (microgramos de proteína de enzima/g DS)
30
40 55 70
Talaromyces emersonii (SEC ID nº: 20)
110,4 118,9 123,4 125,6
Gloeophyllum sepiarium (SEC ID nº: 4)
113,0 121,1 129,0 129,5
Tabla 3. Rendimiento de etanol producido durante SSF con AMG de Gloeophyllum sp en 30, 40, 55 y 70 microgramos de proteína de enzima/g DS en comparación con AMG de Talaromyces emersonii y AMG de Trametes cingulata. El control resultó en 100% de rendimiento.
Dosis enzimática (microgramos de proteína de enzima/g DS)
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40 55 70
Gloeophyllum sepiarium (SEC ID NO: 2)
87% 92% 98% 98%
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