BR112020003866A2 - processo para produção de um produto de fermentação, e, composição. - Google Patents

Abstract

A presente invenção se relaciona com processos melhorados para produção de etanol a partir de materiais contendo amido pelo uso combinado de pelo menos uma endo-protease e pelo menos uma exo-protease em um processo SSF, e em que a endo-protease é selecionada de uma endo-protease da família M35 e a exo-protease são selecionadas de uma exo-protease da família S53. Mais particularmente, a exo-protease deve constituir pelo menos 5% (p/p) da mistura de proteases.

Description

1 / 68 PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE FERMENTA- ÇÃO, E, COMPOSIÇÃO Referência à listagem de sequências

[001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador. A forma legível por computador é incorporada aqui por referência.

ÁREA DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se relaciona com processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido gelatinizado e/ou não gelatinizado.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A produção de produtos de fermentação, tais como etanol, a partir de material contendo amido é bem conhecida na técnica. Geralmente são usados dois tipos diferentes de processos. O processo o mais comumente usado, frequentemente referido como um “processo convencional”, inclui li- quefação de amido gelatinizado a elevada temperatura usando tipicamente uma alfa-amilase bacteriana, seguida por sacarificação e fermentação simul- tâneas levadas a cabo na presença de uma glucoamilase e um organismo fer- mentador. Processos de conversão de amido convencionais, tais como proces- sos de liquefação e sacarificação, são descritos na, p.ex., Patente dos E.U.A. No. 3,912,590, EP252730 e EP063909.

[004] Outro processo bem conhecido, frequentemente referido como um processo de “hidrólise de amido em bruto” (processo RSH) inclui sacari- ficação e fermentação simultâneas de amido granular abaixo da temperatura de gelatinização inicial tipicamente na presença de uma alfa-amilase fúngica ácida e uma glucoamilase.

[005] A Patente dos EUA No. 5,231,017-A divulga o uso de uma protease fúngica ácida durante a fermentação de etanol em um processo com- preendendo liquefação de amido gelatinizado com uma alfa-amilase.

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[006] WO 2003/066826 divulga um processo de hidrólise de amido em bruto (processo RSH) levado a cabo em purê não cozido na presença de glucoamilase fúngica, alfa-amilase e protease fúngica.

[007] WO 2007/145912 divulga um processo para produção de eta- nol compreendendo contato de uma pasta semifluida compreendendo amido granular obtida a partir de material vegetal com uma alfa-amilase capaz de so- lubilizar o amido granular a um pH de 3,5 a 7,0 e a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização do amido durante um período de 5 minutos a 24 horas; obtenção de um substrato compreendendo mais do que 20% de glu- cose e fermentação do substrato na presença de um organismo fermentador e enzimas hidrolisantes do amido a uma temperatura entre 10 °C e 40 °C duran- te um período de 10 horas a 250 horas. Enzimas adicionais adicionadas duran- te o passo de contato podem incluir protease.

[008] WO 2010/008841 divulga processos para produção de produ- tos de fermentação, tais como etanol, a partir de material contendo amido ge- latinizado bem como não gelatinizado por sacarificação do material de amido usando pelo menos uma glucoamilase e uma metaloprotease e fermentação usando um organismo de levedura. Particularmente, a metaloprotease é deri- vada de uma estirpe de Thermoascus aurantiacus.

[009] WO 2014/037438 divulga serina proteases derivadas de Meri- pilus giganteus, Trametes versicolor e Dichomitus squalens e seu uso em ra- ção animal.

[0010] WO 2015/078372 divulga serina proteases derivadas de Meri- pilus giganteus, Trametes versicolor e Dichomitus squalens para uso em um processo de moagem a úmido do amido.

[0011] WO 2003/048353 divulga uma metaloprotease de Thermoas- cus aurantiacus.

[0012] WO 2013/102674 divulga exo-proteases pertencendo à família S53.

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[0013] Proteases S53 são conhecidas na técnica, p.ex., um peptídeo S53 de Grifola frondosa com o número de acesso MER078639. Uma protease S53 de Postia placenta (Uniprot: B8PMI5) foi isolada por Martinez et al. em “Genome, transcriptome, and secretome analysis of wood decay fungus Postia placenta supports unique mechanisms of lignocellulose conversion”, 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 1954-1959.

[0014] Vanden Wymelenberg et al. isolaram uma protease S53 (Uni- prot: Q281W2) em “Computational analysis of the Phanerochaete chryso- sporium v2.0 genome database and mass spectrometry identification of pep- tides in ligninolytic cultures reveal complex mixtures of secreted proteins”, 2006, Fungal Genet. Biol. 43: 343-356. Outro polipeptídeo S53 de Postia placenta (Uniprot:B8P431) foi identificado por Martinez et al. em “Genome, transcriptome, and secretome analysis of wood decay fungus Postia placenta supports unique mechanisms of lignocellulose conversion”, 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106: 1954-1959.

[0015] Floudas et al. publicaram a sequência de uma protease S53 em “The Paleozoic origin of enzymatic lignin decomposition reconstructed from 31 fungal genomes”, 2012, Science, 336: 1715-1719. Fernandez-Fueyo et al. publicaram as sequências de três serina proteases em “Comparative genomics of Ceriporiopsis subvermispora and Phanerochaete chrysosporium provide insight into selective ligninolysis”, 2012, Proc Natl Acad Sci USA. 109: 5458- 5463 (Uniprot: M2QQ01, Uniprot: M2QWH2, Uniprot: M2RD67).

[0016] É um objetivo da presente invenção identificar misturas de proteases que resultarão em um rendimento de etanol aumentado em um pro- cesso de amido até etanol, quando as referidas proteases são adicionadas/estão presentes durante a sacarificação e/ou fermentação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0017] Os inventores da presente invenção descobriram surpreenden- temente que a adição de uma mistura de endo-protease e exo-protease ao pro-

4 / 68 cesso SSF resultará em um rendimento de etanol aumentado. A invenção pro- porciona em um primeiro aspecto um processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo: a) sacarificação do material contendo amido a uma temperatu- ra abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material conten- do amido usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos; e b) fermentação usando um organismo fermentador; em que os passos a) e/ou b) são realizados na presença de uma mistu- ra de endo-protease e exo-protease, em que a exo-protease constitui pelo me- nos 5% (p/p) da mistura de proteases em uma base de proteína de enzima pro- tease total, e em que a endo-protease é selecionada de uma endo-protease da família M35 e a exo-protease é selecionada de uma exo-protease da família S53.

[0018] Em um segundo aspecto, a invenção proporciona um processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo os passos de: (a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido na presença de uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito obtido no passo (a) usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos; (c) fermentação usando um organismo fermentador; em que os passos b) e/ou c) são realizados na presença de uma mistura de endo-protease e exo-protease, em que a exo-protease constitui pelo menos 5% (p/p) da mistura de proteases em uma base de proteína de enzima protease total, e em que a endo-protease é selecionada de uma endo-protease da família M35 e a exo-protease é selecionada de uma exo-protease da família S53.

[0019] Em um terceiro aspecto, a invenção se relaciona com uma

5 / 68 composição compreendendo uma mistura de endo-protease e exo-protease, em que a endo-protease é selecionada de uma endo-protease da família M35 e a exo-protease é selecionada de uma exo-protease da família S53.

DEFINIÇÕES

[0020] Proteases: O termo “protease” inclui qualquer enzima perten- cendo ao grupo de enzimas EC 3.4 (incluindo cada uma das suas dezoito sub- classes). O número EC se refere à Enzyme Nomenclature 1992 de NC- IUBMB, Academic Press, San Diego, Califórnia, incluindo suplementos 1-5 publicada em 1994, Eur. J. Biochem. 223: 1-5; 1995, Eur. J. Biochem. 232: 1- 6; 1996, Eur. J. Biochem. 237: 1-5; 1997, Eur. J. Biochem. 250: 1-6; e 1999, Eur. J. Biochem. 264: 610-650, respectivamente. A nomenclatura é regular- mente suplementada e atualizada; ver, p.ex., a World Wide Web (WWW) em http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

[0021] As proteases são classificadas com base no seu mecanismo ca- talítico nos seguintes grupos: Serina proteases (S), Cisteína proteases (C), Proteases aspárticas (A), Metaloproteases (M) e Proteases desconhecidas, ou ainda não classificadas, (U) ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Bar- rett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (eds), Academic Press (1998), em parti- cular a parte da introdução geral.

[0022] Os polipeptídeos tendo atividade de protease, ou proteases, são por vezes também designados peptidases, proteinases, peptídeo hidrolases ou enzimas proteolíticas. As proteases podem ser do tipo exo (exopeptidases) que hidrolisam peptídeos começando em qualquer uma das suas extremida- des, ou do tipo endo que atuam internamente em cadeias de polipeptídeos (endopeptidases).

[0023] Em modalidades particulares, as proteases para uso nos pro- cessos da invenção são selecionadas do grupo consistindo em: (a) proteases pertencendo às metaloendopeptidases EC 3.4.24; (b) metaloproteases pertencendo ao grupo M do Handbook

6 / 68 acima; (c) metaloproteases ainda não atribuídas a clãs (designação: Clã MX) ou pertencendo a qualquer um dos clãs MA, MB, MC, MD, ME, MF, MG, MH (como definido nas pp. 989-991 do Handbook acima); (d) outras famílias de metaloproteases (como definido nas pp. 1448-1452 do Handbook acima); (e) metaloproteases com um motivo HEXXH; (f) metaloproteases com um motivo HEFTH; (g) metaloproteases pertencendo a qualquer uma das famílias M3, M26, M27, M32, M34, M35, M36, M41, M43 ou M47 (como definido nas pp. 1448-1452 do Handbook acima); e (h) metaloproteases pertencendo à família M35 (como defini- do nas pp. 1492-1495 do Handbook acima).

[0024] Protease S53: O termo “S53” significa uma atividade de pro- tease selecionada de: (a) proteases pertencendo ao grupo de enzimas EC 3.4.21; e/ou (b) proteases pertencendo ao grupo de enzimas EC 3.4.14; e/ou (c) Serina proteases da família de peptidases S53 que compre- ende dois tipos diferentes de peptidases: tripeptidil aminopeptidases (tipo exo) e endopeptidases; como descrito em 1993, Biochem. J. 290: 205-218 e na ba- se de dados de proteases MEROPS, lançamento, 9.4 (31 janeiro 2011) (www.merops.ac.uk). A base de dados é descrita em Rawlings, N. D., Barrett, A. J. e Bateman, A., 2010, “MEROPS: the peptidase database”, Nucl. Acids Res. 38: D227-D233.

[0025] Para se determinar se uma dada protease é uma Serina pro- tease, e uma protease da família S53, é feita referência ao Handbook acima e aos princípios indicados nele. Tal determinação pode ser levada a cabo para

7 / 68 todos os tipos de proteases, sejam proteases ocorrendo naturalmente ou de ti- po selvagem; ou proteases geneticamente manipuladas ou sintéticas.

[0026] As peptidases da família S53 tendem a ser o mais ativas a pH ácido (ao contrário das subtilisinas homólogas), e isto pode ser atribuído à importância funcional de resíduos carboxílicos, notavelmente Asp, no espaço de oxiânion. As sequências de aminoácidos não são intimamente similares àquelas da família S8 (i.e., subtilisinas serina endopeptidases e homólogos), e isto, tomada em conjunto com os resíduos de locais ativos bastante diferentes e o pH mais baixo resultante para atividade máxima, proporciona uma dife- rença substancial em relação a essa família. O dobramento de proteínas da unidade de peptidase para membros desta família se assemelha àquele da sub- tilisina, tendo o tipo de clã SB.

[0027] Protease S8: A maioria dos membros desta família são endo- peptidases e são ativos a pH neutro-ligeiramente alcalino. Muitas peptidases na família são termoestáveis. A caseína é frequentemente usada como um substrato de proteína e um substrato sintético típico é Suc-Ala-Ala-Pro-Phe- NHPhNO2. A maioria dos membros da família são peptidases não específicas com uma preferência para clivarem resíduos hidrofóbicos. Ligação à defini- ção de família S10 para atividade e especificidades: http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum?family=S8

[0028] Protease S10: As carboxipeptidases na família S10 mostram dois tipos principais de especificidade. Algumas (p.ex., carboxipeptidase C) mostram preferência para resíduos hidrofóbicos nas posições P1 e P1”. As carboxipeptidases do segundo conjunto (p.ex., carboxipeptidase D) exibem uma preferência pelos aminoácidos básicos em qualquer lado da ligação cin- dível, mas são também capazes de clivar peptídeos com resíduos hidrofóbicos em estas posições. Ligação à definição de família S10 para atividade e especi- ficidades: http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum?family=S10

[0029] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer

8 / 68 uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo ló- cus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou po- dem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma va- riante alélica de um gene.

[0030] Domínio catalítico: O termo “domínio catalítico” significa a região de uma enzima contendo a maquinaria catalítica da enzima.

[0031] cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA, pro- cessada, madura, obtida a partir de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que possam estar presentes no DNA ge- nômico correspondente. O transcrito de RNA primário, inicial é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo proces- samento, antes de aparecer como mRNA processado maduro.

[0032] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” sig- nifica um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoá- cidos de um polipeptídeo. As fronteiras da sequência codificante são geral- mente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma sua combinação.

[0033] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa sequências de ácidos nucleicos necessárias para expressão de um po- linucleotídeo codificando um polipeptídeo maduro da presente invenção. Ca- da sequência de controle pode ser nativa (i.e., do mesmo gene) ou estranha (i.e., de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não es-

9 / 68 tão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência do pró- peptídeo, promotor, sequência do peptídeo-sinal e terminador da transcrição. Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de paragem transcricional e translacional. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de res- trição específicos facilitando ligação das sequências de controle com a região codificante do polinucleotídeo codificando um polipeptídeo.

[0034] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer passo envol- vido na produção de um polipeptídeo incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional e secreção.

[0035] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam sua expressão.

[0036] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo tendo um ou mais (p.ex., vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo ou domínio maduro; em que o fragmento tem atividade de serina protease.

[0037] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução ou similar com um construto de ácido nucleico ou vetor de expres- são compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célu- la hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a repli- cação.

[0038] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo natural-

10 / 68 mente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantida- de da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, produção recombinante em uma célula hospedeira; múltiplas cópias de um gene codificando a substância; e uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação; p.ex., uma célula hospedeira pode ser geneticamente modificada para expressar o polipeptídeo da invenção. O caldo de fermenta- ção dessa célula hospedeira compreenderá o polipeptídeo isolado.

[0039] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” signi- fica um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modifica- ções pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C- terminal, glicosilação, fosforilação, etc.

[0040] É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode pro- duzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. Também é conhecido na técnica que diferentes células hos- pedeiras processam polipeptídeos diferentemente e, assim, uma célula hospe- deira expressando um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (p.ex., tendo um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) em comparação com outra célula hospedeira expressando o mesmo polinucle- otídeo.

[0041] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo “sequência codificante do polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo

11 / 68 que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de serina protease.

[0042] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiria de outro mo- do na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0043] Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente liga- do” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinu- cleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codi- ficante.

[0044] Atividade de protease: O termo “atividade de protease” signi- fica atividade proteolítica (EC 3.4). Existem vários tipos de atividade de pro- tease tais como proteases tipo tripsina clivando no lado do terminal carbóxi de resíduos Arg e Lys e proteases tipo quimotripsina clivando no lado do termi- nal carbóxi de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos.

[0045] A atividade de protease pode ser medida usando qualquer en- saio, no qual um substrato é empregue, que inclua ligações de peptídeo rele- vantes para a especificidade da protease em questão. O pH do ensaio e a tem- peratura do ensaio são do mesmo modo para serem adaptados à protease em questão. Exemplos de valores de pH do ensaio são pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Exemplos de temperaturas do ensaio são 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 ou 95 °C. Exemplos de substratos de protease gerais são caseína, albumina de soro bovino e hemoglobina. No método clás- sico de Anson e Mirsky é usada hemoglobina desnaturada como substrato e, após a incubação do ensaio com a protease em questão, a quantidade de he- moglobina solúvel em ácido tricloroacético é determinada como uma medição da atividade de protease (Anson, M.L. e Mirsky, A.E., 1932, J. Gen. Physiol.

12 / 68 16: 59 e Anson, M.L., 1938, J. Gen. Physiol. 22: 79).

[0046] Para o propósito da presente invenção, a atividade de protease pode ser determinada usando ensaios que são descritos em “Materiais e Mé- todos”, tais como o ensaio Cinético de Suc-AAPF-pNA, Ensaio de Protazyme AK, Ensaio cinético de Suc-AAPX-pNA e o-Ftaldialdeído (OPA). Para o en- saio de Protazyme AK, o substrato insolúvel de Protazyme AK (Caseína Reti- culada com Azurina) libera uma cor azul quando incubado com a protease e a cor é determinada como uma medida da atividade de protease. Para o ensaio de Suc-AAPF-pNA, o substrato incolor de Suc-AAPF-pNA libera para- nitroanilina amarela quando incubado com a protease e a cor amarela é de- terminada como uma medida da atividade de protease.

[0047] Identidade de sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâme- tro “identidade de sequências”.

[0048] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequên- cias entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443- 453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EM- BOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posteri- or. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penali- dade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle identificado “iden- tidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percen- tagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento)

[0049] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequên- cias entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o

13 / 68 algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The Eu- ropean Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são pena- lidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado co- mo se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento)

[0050] Subsequência: O termo “subsequência” significa um polinu- cleotídeo tendo um ou mais (p.ex., vários) nucleotídeos ausentes da extremi- dade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante do polipeptídeo maduro, em que a subsequência codifica um fragmento tendo atividade de protease.

[0051] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo tendo atividade de protease compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção, e/ou deleção, em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Uma substi- tuição significa reposicionamento do aminoácido ocupando uma posição com um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocu- pando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adja- cente ao e imediatamente após o aminoácido ocupando uma posição.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0052] A presente invenção se relaciona com processos melhorados para produção de etanol a partir de materiais contendo amido pelo uso combi- nado de pelo menos uma endo-protease e pelo menos uma exo-protease em um processo SSF. Mais particularmente, a exo-protease deve constituir pelo menos 5% (p/p) da mistura de proteases em uma base de proteína de enzima protease total.

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[0053] Mais especificamente, a presente divulgação se relaciona com um processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo: a) sacarificação do material contendo amido a uma temperatu- ra abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material conten- do amido usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos; e b) fermentação usando um organismo fermentador; em que os passos a) e/ou b) são realizados na presença de uma mistu- ra de endo-protease e exo-protease, e em que a exo-protease constitui pelo menos 5% (p/p) da mistura de proteases em uma base de proteína de enzima protease total.

[0054] Em um segundo aspecto, a divulgação proporciona um proces- so para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo os passos de: (a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido na presença de uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito obtido no passo (a) usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos; (c) fermentação usando um organismo fermentador; em que os passos b) e/ou c) são realizados na presença de uma mistura de endo-protease e exo-protease, e em que a exo-protease constitui pelo menos 5% (p/p) da mistura de proteases em uma base de proteína de en- zima protease total.

[0055] Processos para a produção de produtos de fermentação, p.ex., etanol, a partir de materiais contendo amido são bem conhecidos na técnica. Geralmente são usados dois tipos diferentes de processos. O processo o mais comumente usado, frequentemente referido como um “processo convencio- nal”, inclui liquefação de amido gelatinizado a elevada temperatura usando

15 / 68 tipicamente uma alfa-amilase bacteriana, seguida por sacarificação e fermen- tação simultâneas levadas a cabo na presença de uma glucoamilase e um or- ganismo fermentador. Outro processo bem conhecido, frequentemente referi- do como um processo de “hidrólise de amido em bruto” (processo RSH) in- clui sacarificação e fermentação simultâneas de amido granular abaixo da temperatura de gelatinização inicial tipicamente na presença de uma alfa- amilase fúngica ácida e uma glucoamilase.

[0056] O amido nativo consiste em grânulos microscópicos, que são insolúveis em água à temperatura ambiente. Quando a pasta semifluida de amido aquosa é aquecida, os grânulos incham e eventualmente rompem, dis- persando as moléculas de amido na solução. A temperaturas até cerca de 50 °C a 75 °C, o inchaço pode ser reversível. No entanto, com temperaturas mais elevadas, começa um inchaço irreversível chamado “gelatinização”. Du- rante este processo de “gelatinização” existe um aumento dramático na visco- sidade. O amido granular a ser processado pode ser uma qualidade de amido altamente refinada, preferencialmente pelo menos 90%, pelo menos 95%, pe- lo menos 97% ou pelo menos 99,5% puro ou pode ser um material contendo amido mais em bruto compreendendo grãos inteiros (p.ex., moídos) incluindo frações diferentes de amido tais como resíduos germinativos e fibras. A maté- ria-prima, tal como grãos inteiros, pode ser reduzida no tamanho das partícu- las, p.ex., por moagem, de modo a abrir a estrutura e permitir processamento adicional. Na moagem a seco, os grãos inteiros são moídos e usados. A moa- gem a úmido dá uma boa separação de gérmen e farinha (grânulos de amido e proteína) e é frequentemente aplicada em localizações onde o hidrolisado de amido é usado na produção de, p.ex., xaropes. A moagem tanto a seco como a úmido é bem conhecida na técnica de processamento do amido e pode ser usada em um processo da invenção. Métodos para redução do tamanho das partículas do material contendo amido são conhecidos dos peritos na técnica.

[0057] Como o nível de sólidos é 30-40% em um processo industrial

16 / 68 típico, o amido tem de ser diluído ou “liquefeito” tal que possa ser adequada- mente processado. Esta redução na viscosidade é principalmente alcançada por degradação enzimática na prática comercial corrente.

[0058] A liquefação é levada a cabo na presença de uma alfa-amilase, preferencialmente uma alfa-amilase bacteriana e/ou alfa-amilase fúngica áci- da. Em uma modalidade, uma fitase está também presente durante a liquefa- ção. Em uma modalidade, enzimas redutoras da viscosidade tais como uma xilanase e/ou beta-glucanase estão também presentes durante a liquefação.

[0059] Durante a liquefação, o amido de cadeia longa é degradado em unidades mais curtas ramificadas e lineares (maltodextrinas) por uma alfa- amilase. A liquefação pode ser levada a cabo como um processo de pasta se- mifluida a quente em três passos. A pasta semifluida é aquecida até entre 60- 95 °C (p.ex., 70-90 °C, tal como 77-86 °C, 80-85 °C, 83-85 °C) e uma alfa- amilase é adicionada para iniciar a liquefação (diluição).

[0060] A pasta semifluida pode em uma modalidade ser cozida com jato a entre 95-140 °C, p.ex., 105-125 °C, durante cerca de 1-15 minutos, p.ex., cerca de 3-10 minutos, especialmente em torno de 5 minutos. A pasta semifluida é depois resfriada até 60-95 °C e mais alfa-amilase é adicionada para se obter a hidrólise final (liquefação secundária). O processo de cozimen- to com jato é levado a cabo a pH 4,5-6,5, tipicamente a um pH entre 5 e 6. A alfa-amilase pode ser adicionada como uma dose única, p.ex., antes do cozi- mento com jato.

[0061] O processo de liquefação é levado a cabo a entre 70-95 °C, tal como 80-90 °C, tal como em torno de 85 °C, durante cerca de 10 minutos a 5 horas, tipicamente durante 1-2 horas. O pH é entre 4 e 7, tal como entre 4,5 e 5,5. De modo a assegurar estabilidade de enzimas ótima sob estas condições, cálcio pode ser opcionalmente adicionado (para proporcionar 1-60 ppm de íons de cálcio livres, tal como cerca de 40 ppm de íons de cálcio livres). Após tal tratamento, o amido liquefeito terá tipicamente um “equivalente de dextro-

17 / 68 se” (DE) de 10-15.

[0062] Geralmente, a liquefação e as condições de liquefação são bem conhecidas na técnica.

[0063] As alfa-amilases para uso em liquefação são preferencialmente alfa-amilases estáveis ácidas bacterianas. Particularmente, a alfa-amilase é de uma Exiguobacterium sp. ou uma Bacillus sp. tal como, p.ex., Bacillus stea- rothermophilus ou Bacillus licheniformis.

[0064] A sacarificação pode ser levada a cabo usando condições bem conhecidas na técnica com uma enzima geradora de fonte de carboidratos, em particular uma glucoamilase, ou uma beta-amilase e opcionalmente uma en- zima desramificadora, tal como uma isoamilase ou uma pululanase. Por exemplo, o passo de sacarificação total pode durar de cerca de 24 a cerca de 72 horas. No entanto é comum fazer uma pré-sacarificação de tipicamente 40- 90 minutos a uma temperatura entre 30-65 °C, tipicamente cerca de 60 °C, seguida por sacarificação completa durante a fermentação em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A sacarificação é tipicamente levada a cabo a uma temperatura na gama de 20-75 °C, p.ex., 25-65 °C e 40- 70 °C, tipicamente em torno de 60 °C, e a um pH entre cerca de 4 e 5, nor- malmente a cerca de pH 4,5.

[0065] Os passos de sacarificação e fermentação podem ser levados a cabo sequencialmente ou simultaneamente. Em uma modalidade, a sacarifica- ção e a fermentação são realizadas simultaneamente (referidas como “SSF”). No entanto é comum realizar um passo de pré-sacarificação durante cerca de 30 minutos a 2 horas (p.ex., 30 a 90 minutos) a uma temperatura de 30 a 65 °C, tipicamente em torno de 60 °C que é seguido por uma sacarificação completa durante a fermentação referido como sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). O pH é usualmente entre 4,2-4,8, p.ex., pH 4,5. Em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), não existe etapa de retenção para a sacarificação; ao invés, a levedura e as enzimas são adicio-

18 / 68 nadas em conjunto e o processo é depois levado a cabo a uma temperatura de 25-40 °C, tal como entre 28 °C e 35 °C, tal como entre 30 °C e 34 °C, tal co- mo em torno de 32 °C. O processo SSF pode ser levado a cabo a um pH de cerca de 3 e 7, preferencialmente de pH 4,0 a 6,5 ou, mais preferencialmente, de pH 4,5 a 5,5.

[0066] Em uma modalidade, a fermentação dura durante 6 a 120 ho- ras, em particular 24 a 96 horas.

[0067] Ao invés do processo convencional descrito acima, o produto de fermentação, p.ex., etanol, pode ser produzido a partir de material conten- do amido sem gelatinização (i.e., sem cozimento) do material contendo amido (frequentemente referido como um processo de “hidrólise de amido em bru- to”). O produto de fermentação, tal como etanol, pode ser produzido sem li- quefazer a pasta semifluida aquosa contendo o material contendo amido e água. Em uma modalidade, o processo inclui sacarificação do material con- tendo amido (p.ex., moído), p.ex., amido granular, abaixo da temperatura de gelatinização inicial, preferencialmente na presença de alfa-amilase e/ou en- zima(s) geradora(s) de fonte de carboidratos para produzir açúcares que po- dem ser fermentados no produto de fermentação por um organismo fermenta- dor adequado. Em esta modalidade, o produto de fermentação desejado, p.ex., etanol, é produzido a partir de grãos de cereais não gelatinizados (i.e., não co- zidos), preferencialmente moídos, tais como milho.

[0068] Conformemente, em este aspecto, a invenção se relaciona com processos para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo os passos de: a) sacarificação do material contendo amido a uma temperatu- ra abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material conten- do amido usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos; e b) fermentação usando um organismo fermentador; em que os passos a) e/ou b) são realizados na presença de uma mistu-

19 / 68 ra de endo-protease e exo-protease, e em que a exo-protease constitui pelo menos 5% (p/p) da mistura de proteases.

[0069] Em uma modalidade particular, os passos a) e b) são realizadas simultaneamente, em que as enzimas sacarificantes e os organismos fermen- tadores (p.ex., levedura) são adicionados em conjunto e depois levados a cabo a uma temperatura de 25-40 °C. O processo SSF pode ser levado a cabo a um pH de cerca de 3 e 7, preferencialmente de pH 4,0 a 6,5 ou, mais preferenci- almente, de pH 4,5 a 5,5. Em uma modalidade, a fermentação dura durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas.

[0070] O termo “temperatura de gelatinização inicial” significa a temperatura mais baixa à qual a gelatinização do amido começa. Em geral, o amido aquecido em água começa a gelatinizar entre cerca de 50 °C e 75 °C; a temperatura exata da gelatinização depende do amido específico e pode ser prontamente determinada pelo especialista. Assim, a temperatura de gelatini- zação inicial pode variar de acordo com a espécie de planta, com a variedade particular da espécie de planta bem como com as condições de crescimento. No contexto da presente invenção, a temperatura de gelatinização inicial de um dado material contendo amido pode ser determinada como a temperatura na qual a birrefringência é perdida em 5% dos grânulos de amido usando o método descrito por Gorinstein e Lii, 1992, Starch/Stärke 44 (12): 461-466. Em uma modalidade, uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial significa que a temperatura reside tipicamente na gama entre 30-75 °C, preferencialmente entre 45-60 °C. Em uma modalidade preferencial, o pro- cesso é levado a cabo a uma temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, preferencialmente em torno de 32 °C.

[0071] Como divulgado acima na seção da técnica antecedente, o uso de proteases durante a fermentação é conhecido na técnica, no entanto, de acordo com a presente invenção, um rendimento de etanol aumentado pode ser obtido quando a sacarificação e/ou a fermentação são realizadas na pre-

20 / 68 sença de uma mistura de endo-protease e exo-protease. Em particular, os pre- sentes inventores descobriram que a exo-protease deve constituir pelo menos 5% (p/p) da mistura de proteases em uma base de proteína de enzima protease total.

[0072] Em uma modalidade, a exo-protease constitui pelo menos 10% (p/p) da mistura de proteases em uma base de proteína de enzima protease to- tal, tal como pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, parti- cularmente pelo menos 75%, mais particularmente a exo-protease constitui de entre 5 e 95% (p/p) em uma base de proteína de enzima protease total, parti- cularmente 10 e 80% (p/p), particularmente 15 e 70% (p/p), mais particular- mente 20 e 60% (p/p) e, ainda mais particularmente, 25 e 50% (p/p) da mistu- ra de proteases na composição em uma base de proteína de enzima protease total.

[0073] Em outra modalidade, a endo-protease e a exo-protease estão presentes em uma razão de 5:2 microgramas de proteína de enzima (EP)/g de sólidos secos (DS), particularmente 5:3, mais particularmente 5:4. As protea- ses usadas em um processo da invenção são selecionadas de endo-peptidases (endo-proteases) e exo-peptidases (exo-proteases). Entre as endo-peptidases, as serina proteases (EC 3.4.21) e as metaloproteases (EC 3.4.24) são especi- almente relevantes.

[0074] A endo-protease pode ser selecionada do grupo consistindo em serina proteases pertencendo à família S53, S8, ou de metaloproteases perten- cendo à família M35.

[0075] Em outra modalidade particular, a endo-protease é selecionada de metaloproteases (ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (eds), Academic Press (1998)); em particular, as proteases da invenção são selecionadas do grupo consistindo em:

21 / 68 (a) proteases pertencendo às metaloendopeptidases EC 3.4.24; (b) metaloproteases pertencendo ao grupo M do Handbook acima; (c) metaloproteases pertencendo à família M35 (como definido nas pp. 1492-1495 do Handbook acima).

[0076] Em uma modalidade particular, a endo-protease é selecionada da família M35, mais particularmente protease M35 derivada de Thermoascus aurantiacus, o polipeptídeo maduro da qual compreende os aminoácidos 1- 177 de SEQ ID NO: 1 ou um polipeptídeo tendo pelo menos 75% de identi- dade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferenci- almente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[0077] A exo-protease é preferencialmente selecionada de uma pro- tease pertencendo à família S10, S53, M14, M28.

[0078] A exo-protease é em outra modalidade selecionada de exo- protease S53 é derivada de uma estirpe de Aspergillus, Trichoderma, Ther- moascus, or Thermomyces, particularly Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Thermoascus thermophilus ou Thermomyces lanugino- sus.

[0079] Em uma modalidade particular, a exo-protease S53 é um poli- peptídeo tendo atividade de serina protease, selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou o

22 / 68 polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[0080] Em uma modalidade particular, a exo-protease S53 é um poli- peptídeo tendo atividade de serina protease, selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4.

[0081] Antes do início do processo pode ser preparada uma pasta se- mifluida de material contendo amido, tal como amido granular, tendo 10-55% p/p de sólidos secos (DS), preferencialmente 25-45% p/p de sólidos secos, mais preferencialmente 30-40% p/p de sólidos secos de material contendo amido. A pasta semifluida pode incluir água e/ou águas do processo, tais co- mo vinhaça (contracorrente), água do purificador, condensado ou destilado do evaporador, água do separador lateral da destilação ou água de processo de outras instalações de produtos de fermentação.

[0082] Em uma modalidade particular, o processo da invenção com- preende adicionalmente, antes da conversão de um material contendo amido em açúcares/dextrinas, os passos de: (x) redução do tamanho das partículas do material contendo amido; e (y) formação de uma pasta semifluida compreendendo o mate- rial contendo amido e água.

[0083] Em uma modalidade, o material contendo amido é moído para reduzir o tamanho das partículas. Em uma modalidade, o tamanho das partí- culas é reduzido até entre 0,05-3,0 mm, preferencialmente 0,1-0,5 mm, ou tal que pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 50%, mais preferencial- mente 70%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% do material con- tendo amido passe através de um crivo com uma peneira de 0,05-3,0 mm, pre- ferencialmente tela de 0,1-0,5 mm.

23 / 68

[0084] Após ser sujeito a um processo da invenção, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou, preferencialmente, pelo menos 99% dos sólidos secos no material conten- do amido são convertidos em um hidrolisado de amido solúvel.

[0085] Em uma modalidade, o tamanho das partículas é mais pequeno do que uma tela # 7, p.ex., uma tela # 6. Uma tela # 7 é usualmente usada em processos da técnica prévia convencionais. Alfa-amilase presente e/ou adicionada na liquefação

[0086] As alfa-amilases para uso em liquefação são preferencialmente alfa-amilases estáveis ácidas bacterianas. Particularmente, a alfa-amilase é de uma Exiguobacterium sp. ou uma Bacillus sp. tal como, p.ex., Bacillus stea- rothermophilus ou Bacillus licheniformis.

[0087] Em uma modalidade, a alfa-amilase é do gênero Bacillus, tal como uma estipe de Bacillus stearothermophilus, em particular uma variante de uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tal como aquela mostra- da em SEQ ID NO: 3 em WO 99/019467 ou SEQ ID NO: 12 aqui.

[0088] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus stearother- mophilus tem uma deleção dupla de dois aminoácidos na região da posição 179 a 182, mais particularmente uma deleção dupla nas posições I181 + G182, R179 + G180, G180 + I181, R179 + I181 ou G180 + G182, preferenci- almente I181 + G182 e, opcionalmente, uma substituição N193F (usando SEQ ID NO: 12 para numeração).

[0089] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus stearother- mophilus tem uma substituição na posição S242, preferencialmente substitui- ção S242Q.

[0090] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus stearother- mophilus tem uma substituição na posição E188, preferencialmente substitui-

24 / 68 ção E188P.

[0091] Em uma modalidade, a alfa-amilase é selecionada do grupo de variantes de alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus com as seguintes mutações: - I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E; - I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y +K220P+N224L +Q254S; - I181*+G182*+N193F +V59A Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e - I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q2 54S (usando SEQ ID NO: 12 para numeração).

[0092] Em uma modalidade, a variante de alfa-amilase tem pelo me- nos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferenci- almente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais pre- ferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 12.

[0093] Deve ser entendido que quando se faz referência a alfa- amilases de Bacillus stearothermophilus e suas variantes elas são normalmen- te produzidas na forma truncada. Em particular, o truncamento pode ser tal que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 12 aqui, ou suas variantes, seja truncada no terminal C preferencialmente para ter em torno de 490 aminoácidos, tal

25 / 68 como de 482-493 aminoácidos. Preferencialmente, a alfa-amilase variante de Bacillus stearothermophilus é truncada, preferencialmente após a posição 484 de SEQ ID NO: 12, particularmente após a posição 485, particularmente após a posição 486, particularmente após a posição 487, particularmente após a po- sição 488, particularmente após a posição 489, particularmente após a posição 490, particularmente após a posição 491, particularmente após a posição 492, mais particularmente após a posição 493. Glucoamilase Presente E/Ou Adicionada Na Sacarificação E/Ou Fermen- tação

[0094] A enzima geradora de fonte de carboidratos presente durante a sacarificação pode em uma modalidade ser uma glucoamilase. Uma glucoa- milase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação, pre- ferencialmente sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), em um proces- so da invenção (i.e., sacarificação e fermentação de material de amido não ge- latinizado ou gelatinizado).

[0095] Em uma modalidade, a glucoamilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é de origem fúngica, preferencialmente de uma estirpe de Aspergillus, preferencialmente A. niger, A. awamori ou A. oryzae; ou uma estirpe de Trichoderma, preferencialmente T. reesei; ou uma estirpe de Talaromyces, preferencialmente T. emersonii ou uma estirpe de Trametes, preferencialmente T. cingulata, ou uma estirpe de Pycnoporus, pre- ferencialmente P. sanguineus, ou uma estirpe de Gloeophyllum, tal como G. serpiarium, G. abietinum ou G. trabeum, ou uma estirpe dos Nigrofomes.

[0096] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de Tala- romyces, tal como uma estirpe de Talaromyces emersonii, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 8.

[0097] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ

26 / 68 ID NO: 8; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8.

[0098] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Pycnoporus, em particular uma estirpe de Pycnoporus sanguineus descrita em WO 2011/066576 (SEQ ID NOs 2, 4 ou 6), tal como aquela mos- trada como SEQ ID NO: 4 em WO 2011/066576 ou SEQ ID NO: 9 aqui.

[0099] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 9; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 9.

[00100] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Gloeophyllum, tal como uma estirpe de Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum trabeum, em particular uma estirpe de Gloeophyllum como descrito em WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16). Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é o Gloeophyllum sepiarium mostrado em SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803.

[00101] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de Gloe- ophyllum serpiarium, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 10.

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[00102] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 10; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 10.

[00103] Em outra modalidade, a glucoamilase é derivada de Gloe- ophyllum trabeum tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 11. Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 11; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 11.

[00104] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de Trametes, tal como uma estirpe de Trametes cingulata, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 7.

[00105] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 7; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de ami-

28 / 68 noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 7.

[00106] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Nigrofomes, em particular uma estirpe de Nigrofomes sp. divulgada em WO 2012/064351.

[00107] As glucoamilases podem em uma modalidade ser adicionadas à sacarificação e/ou fermentação em uma quantidade de 0,0001-20 AGU/g de DS, preferencialmente 0,001-10 AGU/g de DS, especialmente entre 0,01-5 AGU/g de DS, tal como 0,1-2 AGU/g de DS, especialmente 0,1-0,5 AGU/g de DS.

[00108] Composições compreendendo glucoamilase comercialmente disponíveis incluem AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EX- TRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL e AMG™ E (a partir da Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300, GC480, GC417 (a partir da DuPont.); AMIGASE™ e AMIGASE™ PLUS (a partir da DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ e G990 ZR (a partir da DuPont).

[00109] De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, a glucoamilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermenta- ção em combinação com uma alfa-amilase. Exemplos de alfa-amilase ade- quadas são descritos em baixo. Alfa-Amilase Presente e/ou Adicionada Na Sacarificação E/Ou Fermen- tação

[00110] Em uma modalidade, uma alfa-amilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação nos processos da invenção. Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é de origem fúngica ou bacteria-

29 / 68 na. Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é uma alfa-amilase está- vel ácida fúngica. Uma alfa-amilase estável ácida fúngica é uma alfa-amilase que tem atividade na gama de pH de 3,0 a 7,0 e, preferencialmente, na gama de pH de 3,5 a 6,5, incluindo atividade a um pH de cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 e 6,0.

[00111] Em uma modalidade, a alfa-amilase é derivada do gênero As- pergillus, especialmente uma estirpe de A. terreus, A. niger, A. oryzae, A. awamori ou Aspergillus kawachii ou do gênero Rhizomucor, preferencialmen- te uma estirpe o Rhizomucor pusillus ou do gênero Meripilus, preferencial- mente uma estirpe de Meripilus giganteus.

[00112] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é derivada de uma estirpe do gênero Rhizomucor, preferencialmente uma estirpe de Rhizomucor pusillus, tal como uma mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756, tal como um híbrido de alfa-amilase de Rhizomucor pusillus tendo um ligante de As- pergillus niger e domínio de ligação ao amido, tal como aquele mostrado em SEQ ID NO: 6 aqui ou uma sua variante.

[00113] Em uma modalidade, a alfa-amilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6; (ii) uma alfa-amilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6.

[00114] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é uma varian- te da alfa-amilase mostrada em SEQ ID NO: 6 tendo pelo menos uma das se-

30 / 68 guintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H + Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C (usando SEQ ID NO: 6 para numeração).

[00115] Em uma modalidade, a alfa-amilase é derivada de um Rhizo- mucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domí- nio de ligação ao amido (SBD), preferencialmente divulgada como SEQ ID NO: 6, tendo preferencialmente uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, preferencialmente G128D + D143N (usando SEQ ID NO: 6 para numeração), e em que a variante de alfa-amilase presente e/ou adiciona- da na sacarificação e/ou fermentação tem pelo menos 75% de identidade, pre- ferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6 aqui.

[00116] Em uma modalidade preferencial, a razão entre glucoamilase e alfa-amilase presentes e/ou adicionadas durante a sacarificação e/ou fermen- tação pode estar preferencialmente na gama de 500:1 a 1:1, tal como de 250:1 a 1:1, tal como de 100:1 a 1: 1, tal como de 100: 2 a 100:50, tal como de 100:3 a 100:70.

[00117] Em uma modalidade, a alfa-amilase está presente em uma

31 / 68 quantidade de 0,001 a 10 AFAU/g de DS, preferencialmente 0,01 a 5 AFAU/g de DS, especialmente 0,3 a 2 AFAU/g de DS ou 0,001 a 1 FAU-F/g de DS, preferencialmente 0,01 a 1 FAU-F/g de DS.

[00118] Em uma modalidade adicional, a alfa-amilase e a glucoamilase são adicionadas em uma razão de entre 0,1 e 100 AGU/FAU-F, preferencial- mente 2 e 50 AGU/FAU-F, especialmente entre 10 e 40 AGU/FAU-F quando a sacarificação e fermentação são levadas a cabo simultaneamente. Fermentação

[00119] As condições de fermentação são determinadas com base, p.ex., no tipo de material vegetal, nos açúcares fermentáveis disponíveis, no(s) organismo(s) fermentador(es) e/ou no produto de fermentação desejado. Um perito na técnica pode facilmente determinar condições de fermentação adequadas. A fermentação pode ser levada a cabo em condições convencio- nalmente usadas. Processos de fermentação preferenciais são processos anae- róbicos.

[00120] Por exemplo, as fermentações podem ser levadas a cabo a temperaturas tão elevadas como 75 °C, p.ex., entre 40-70 °C, tal como entre 50-60 °C. No entanto são também conhecidas bactérias com uma temperatura ótima significativamente mais baixa até em torno da temperatura ambiente (em torno de 20 °C). Exemplos de organismos fermentadores adequados po- dem ser encontrados na seção “Organismos Fermentadores” acima.

[00121] Para produção de etanol usado levedura, a fermentação pode continuar durante 24 a 96 horas, em particular durante 35 a 60 horas. Em uma modalidade, a fermentação é levada a cabo a uma temperatura entre 20 e 40 °C, preferencialmente 26 a 34 °C, em particular em torno de 32 °C.

[00122] A fermentação pode incluir, adicionalmente a um microrga- nismo fermentador (p.ex., levedura), nutrientes e enzimas adicionais, incluin- do fitases. O uso de levedura em fermentação é bem conhecido na técnica.

[00123] Outros produtos de fermentação podem ser fermentados a

32 / 68 temperaturas conhecidas do perito na técnica como sendo adequadas para o organismo fermentador em questão.

[00124] A fermentação é tipicamente levada a cabo a um pH na gama entre 3 e 7, preferencialmente de pH 3,5 a 6, mais preferencialmente pH 4 a 5. As fermentações continuam tipicamente durante 6-96 horas.

[00125] Os processos da invenção podem ser realizados como um pro- cesso descontínuo ou contínuo. As fermentações podem ser conduzidas em um sistema de ultrafiltração em que o retentado é mantido sob recirculação na presença de sólidos, água, e do organismo fermentador, e em que o permeado é o líquido contendo produto de fermentação desejado. São igualmente con- templados métodos/processos conduzidos em reatores de membrana contí- nuos com membranas de ultrafiltração e onde o retentado é mantido sob recir- culação na presença de sólidos, água, e o(s) organismo(s) fermentador(es), e em que o permeado é o líquido contendo produto de fermentação desejado.

[00126] Após fermentação, o organismo fermentador pode ser separa- do da pasta semifluida fermentada e reciclado. Materiais Contendo Amido

[00127] Qualquer material de partida contendo amido adequado pode ser usado em um processo da presente invenção. Em uma modalidade, o ma- terial contendo amido é amido granular. Em outra modalidade, o material contendo amido é derivado de grão inteiro. O material de partida é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado. Exemplos de ma- teriais de partida contendo amido, adequados para uso nos processos da pre- sente invenção, incluem cevada, feijões, mandioca, cereais, milho, milo, ervi- lhas, batatas, arroz, centeio, sagu, sorgo, batatas-doces, tapioca, trigo e grãos inteiros ou qualquer sua mistura. O material contendo amido pode ser também um tipo ceroso ou não ceroso de milho e cevada. Em uma modalidade prefe- rencial, o material contendo amido é milho. Em uma modalidade preferencial, o material contendo amido é trigo.

33 / 68 Produtos de Fermentação

[00128] O termo “produto de fermentação” significa um produto pro- duzido por um método ou processo incluindo fermentação usando um orga- nismo fermentador. Os produtos de fermentação incluem álcoois (p.ex., eta- nol, metanol, butanol); ácidos orgânicos (p.ex., ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido succínico, ácido glucônico); cetonas (p.ex., acetona); aminoácidos (p.ex., ácido glutâmico); gases (p.ex., H2 e CO2); antibióticos (p.ex., penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (p.ex., riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios. Em uma modalidade preferen- cial, o produto de fermentação é etanol, p.ex., etanol combustível; etanol po- tável, i.e., bebidas alcoólicas potáveis; ou etanol industrial ou produtos usados na indústria do álcool consumível (p.ex., cerveja e vinho), indústria dos lacti- cínios (p.ex., produtos lácteos fermentados), indústria das peles e indústria do tabaco. Tipos de cerveja preferenciais compreendem ales, stouts, porters, la- gers, bitters, licores de malte, happoushu, cerveja com muito álcool, cerveja com pouco álcool, cerveja baixa em calorias ou cerveja sem álcool. Em uma modalidade preferencial, o produto de fermentação é etanol. Organismos Fermentadores

[00129] O termo “organismo fermentador” se refere a qualquer orga- nismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, tais como levedura e fungos filamentosos, adequado para produção de um produto de fermentação desejado. Os organismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, i.e., converter, açúcares fermentáveis, tais como arabinose, frutose, glucose, maltose, manose ou xilose, diretamente ou indiretamente no produto de fer- mentação desejado.

[00130] Exemplos de organismos fermentadores incluem organismos fúngicos tais como levedura. Leveduras preferenciais incluem estirpes de Saccharomyces, em particular Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces uvarum; estirpes de Pichia, em particular Pichia stipitis tal como Pichia stipi-

34 / 68 tis CBS 5773 ou Pichia pastoris; estirpes de Candida, em particular Candida arabinofermentans, Candida boidinii, Candida diddensii, Candida shehatae, Candida sonorensis, Candida tropicalis ou Candida utilis. Outros organismos fermentadores incluem estirpes de Hansenula, em particular Hansenula ano- mala ou Hansenula polymorpha; estirpes de Kluyveromyces, em particular Kluyveromyces fragilis ou Kluyveromyces marxianus; e estirpes de Schizo- saccharomyces, em particular Schizosaccharomyces pombe.

[00131] Organismos fermentadores bacterianos preferenciais incluem estirpes de Escherichia, em particular Escherichia coli, estirpes de Zymomo- nas, em particular Zymomonas mobilis, estirpes de Zymobacter, em particular Zymobactor palmae, estirpes de Klebsiella em particular Klebsiella oxytoca, estirpes de Leuconostoc, em particular Leuconostoc mesenteroides, estirpes de Clostridium, em particular Clostridium butyricum, estirpes de Enterobac- ter, em particular Enterobacter aerogenes, e estirpes de Thermoanaerobacter, em particular Thermoanaerobacter BG1L1 (Appl. Microbiol. Biotech. 77: 61- 86), Thermoanarobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter mathranii ou Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum. Estirpes de Lactobacillus são também pretendidas como o são estirpes de Corynebacterium glutamicum R, Bacillus thermoglucosidaisus e Geobacillus thermoglucosidasius.

[00132] Em uma modalidade, o organismo fermentador é um organis- mo fermentador de açúcares C6, tal como uma estirpe de, p.ex., Saccha- romyces cerevisiae.

[00133] Em uma modalidade, o organismo fermentador é um organis- mo fermentador de açúcares C5, tal como uma estirpe de, p.ex., Saccha- romyces cerevisiae.

[00134] A quantidade de levedura iniciadora empregue na fermentação é uma quantidade eficaz para produzir uma quantidade comercialmente signi- ficativa de etanol em uma quantidade de tempo adequado (p.ex., para produzir pelo menos 10% de etanol a partir de um substrato tendo entre 25-40% de DS

35 / 68 em menos do que 72 horas). As células de levedura são geralmente fornecidas em quantidades de cerca de 104 a cerca de 1012 e, preferencialmente, de cer- ca de 107 a cerca de 1010, especialmente cerca de 5 x 107 contagens de leve- duras viáveis por mL de caldo de fermentação. Após levedura ser adicionada ao purê é tipicamente sujeita a fermentação durante cerca de 24-96 horas, p.ex., 35-60 horas. A temperatura é entre cerca de 26-34 °C, tipicamente a cerca de 32 °C, e o pH é de pH 3-6, p.ex., em torno de pH 4-5.

[00135] A levedura é o organismo fermentador preferencial para fer- mentação do etanol. São preferenciais estirpes de Saccharomyces, especial- mente estirpes da espécie Saccharomyces cerevisiae, preferencialmente estir- pes que são resistentes a elevados níveis de etanol, i.e., até, p.ex., cerca de 10, 12, 15 ou 20 % por vol. ou mais de etanol.

[00136] Em uma modalidade, a levedura utilizadora de C5 é uma estir- pe de Saccharomyces cerevisiae divulgada em WO 2004/085627.

[00137] Em uma modalidade, o organismo fermentador é uma célula microbiana eucariótica C5 mostrada em WO 2010/074577 (Nedalco).

[00138] Em uma modalidade, o organismo fermentador é uma célula eucariótica C5 transformada capaz de isomerizar diretamente xilose em xilu- lose divulgada em US 2008/0014620.

[00139] Em uma modalidade, o organismo fermentador é uma célula fermentadora de açúcares C5 divulgada em WO 2009/109633.

[00140] Leveduras comercialmente disponíveis incluem LNF SA-1, LNF BG-1, LNF PE-2 e LNF CAT-1 (disponíveis a partir da LNF Brazil), le- veduras RED STAR™ e ETHANOL RED (disponíveis a partir da Fermen- tis/Lesaffre, EUA), FALI (disponível a partir da Fleischmann’s Yeast, EUA), leveduras frescas SUPERSTART e THERMOSACC™ (disponíveis a partir da Ethanol Technology, WI, EUA), BIOFERM AFT e XR (disponíveis a par- tir da NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, EUA), GERT STRAND (disponível a partir da Gert Strand AB, Suécia) e FERMIOL (dis-

36 / 68 ponível a partir da DSM Specialties).

[00141] O organismo fermentador capaz de produzir um produto de fermentação desejado a partir de açúcares fermentáveis é preferencialmente cultivado sob condições precisas a uma taxa de crescimento particular. Quan- do o organismo fermentador é introduzido no/adicionado ao meio de fermen- tação, o organismo fermentador inoculado passa através de um número de etapas. Inicialmente não ocorre crescimento. Este período é referido como a “fase de latência” e pode ser considerado um período de adaptação. Durante a próxima fase referida como a “fase exponencial”, a taxa de crescimento au- menta gradualmente. Após um período de crescimento máximo, a taxa cessa e o organismo fermentador entra na “fase estacionária”. Após um período de tempo adicional, o organismo fermentador entra na “fase de morte” onde o número de células viáveis declina. Recuperação

[00142] Subsequente à fermentação, o produto de fermentação pode ser separado do meio de fermentação. Assim, em uma modalidade, o produto de fermentação é recuperado após fermentação. O meio de fermentação pode ser destilado para extrair o produto de fermentação desejado ou o produto de fer- mentação desejado pode ser extraído do meio de fermentação por técnicas de microfiltração ou filtração por membranas. Alternativamente, o produto de fermentação pode ser recuperado por separação. Métodos para recuperação são bem conhecidos na técnica. Composições de Enzimas

[00143] A presente invenção se relaciona também com uma composi- ção compreendendo uma mistura de endo-protease e exo-protease, e em que a exo-protease constitui pelo menos 5% (p/p) da protease na mistura em uma base de proteína de enzima protease total, tal como pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%,

37 / 68 pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, particularmente pelo menos 75%, mais particularmente a exo-protease constitui de entre 5 e 95% (p/p) da protease na mistura em uma base de proteína de enzima protease to- tal, particularmente 10 e 80% (p/p), particularmente 15 e 70% (p/p), mais par- ticularmente 20 e 60% (p/p) e, ainda mais particularmente, 25 e 50% (p/p) da mistura de proteases na composição em uma base de proteína de enzima pro- tease total.

[00144] Em uma modalidade, a endo-protease é derivada de proteases pertencendo à família S53, S8, M35 ou A1 e a exo-protease é derivada de pro- teases pertencendo à família S10, S53, M14 ou M28.

[00145] A endo-protease é preferencialmente selecionada da família M35, mais particularmente protease M35 derivada de Thermoascus aurantia- cus.

[00146] Em uma modalidade particular, a metaloprotease M35 é deri- vada de Thermoascus aurantiacus, tal como, p.ex., o polipeptídeo maduro que compreende os aminoácidos 1-177 de SEQ ID NO: 1 ou um polipeptídeo ten- do pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmen- te pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo me- nos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[00147] A exo-protease é preferencialmente selecionada de uma pro- tease pertencendo à família S10, S53, M14, M28, particularmente exo- protease S53 de Aspergillus, Trichoderma, Thermoascus ou Thermomyces, particularmente Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Thermoascus ther- mophilus ou Thermomyces lanuginosus.

[00148] Em uma modalidade específica, a exo-protease S53 é um poli-

38 / 68 peptídeo tendo atividade de serina protease, selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00149] Em outra modalidade específica, a exo-protease S53 é um po- lipeptídeo tendo atividade de serina protease, selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4.

[00150] Em uma modalidade particular, a endo-protease é uma pro- tease S53 de Thermoascus aurantiacus, tal como aquela divulgada em SEQ ID NO: 1, e a exo-protease é uma protease S53 de Aspergillus, Trichoderma, Thermoascus ou Thermomyces, particularmente Aspergillus niger, Tricho- derma reesei, selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3 e 4.

[00151] As composições podem compreender as proteases como os principais componentes enzimáticos. Alternativamente, as composições po- dem compreender múltiplas atividades enzimáticas, tais como a endo- protease/exo-protease e uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorreductase ou transferase, p.ex., uma alfa-galactosidase, alfa-glucosidase, aminopeptidase, alfa-amilase, beta-amilase, pululanase, beta-galactosidase, beta-glucosidase, beta-xilosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celu- lase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonu- clease, endoglucanase, esterase, glucoamilase, invertase, lacase, lipase, mano- sidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polife- noloxidase, protease, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase. Em uma

39 / 68 modalidade, a composição compreende adicionalmente uma enzima geradora de fonte de carboidratos e opcionalmente uma alfa-amilase. Em uma modali- dade particular, a enzima geradora de fonte de carboidratos é selecionada do grupo consistindo em glucoamilase, alfa-glucosidase, amilase maltogênica, pululanase e beta-amilase.

[00152] Em particular, a enzima geradora de fonte de carboidratos é uma glucoamilase e está presente em uma quantidade de 0,001 a 10 AGU/g de DS, preferencialmente de 0,01 a 5 AGU/g de DS, especialmente 0,1 a 0,5 AGU/g de DS.

[00153] Em uma modalidade, a glucoamilase compreendida na compo- sição é de origem fúngica, preferencialmente derivada de uma estirpe de As- pergillus, preferencialmente Aspergillus niger, Aspergillus oryzae ou Asper- gillus awamori, uma estirpe de Trichoderma, especialmente T. reesei, uma es- tirpe de Talaromyces, especialmente Talaromyces emersonii; ou uma estirpe de Athelia, especialmente Athelia rolfsii; uma estirpe de Trametes, preferen- cialmente Trametes cingulata; uma estirpe do gênero Gloeophyllum, p.ex., uma estirpe de Gloeophyllum sepiarum ou Gloeophyllum trabeum; uma estir- pe do gênero Pycnoporus, p.ex., uma estirpe de Pycnoporus sanguineus; ou uma estirpe dos Nigrofomes ou uma sua mistura.

[00154] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de Trametes, tal como uma estirpe de Trametes cingulata, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 7.

[00155] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 7; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo

40 / 68 menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 7.

[00156] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de Tala- romyces, tal como uma estirpe de Talaromyces emersonii, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 8,

[00157] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8.

[00158] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Pycnoporus, em particular uma estirpe de Pycnoporus sanguineus descrita em WO 2011/066576 (SEQ ID NOs 2, 4 ou 6), tal como aquela mos- trada como SEQ ID NO: 4 em WO 2011/066576.

[00159] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 9; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade

41 / 68 com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 9.

[00160] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Gloeophyllum, tal como uma estirpe de Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum trabeum, em particular uma estirpe de Gloeophyllum como descrito em WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16). Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase é o Gloeophyllum sepiarium mostrado em SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803.

[00161] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de Gloe- ophyllum serpiarium, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 10.

[00162] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 10; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 10.

[00163] Em outra modalidade, a glucoamilase é derivada de Gloe- ophyllum trabeum tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 11.

[00164] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 11; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos

42 / 68 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 11.

[00165] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Nigrofomes, em particular uma estirpe de Nigrofomes sp. divulgada em WO 2012/064351.

[00166] As glucoamilases podem em uma modalidade ser adicionadas à sacarificação e/ou fermentação em uma quantidade de 0,0001-20 AGU/g de DS, preferencialmente 0,001-10 AGU/g de DS, especialmente entre 0,01-5 AGU/g de DS, tal como 0,1-2 AGU/g de DS.

[00167] Composições compreendendo glucoamilase comercialmente disponíveis incluem AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EX- TRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL e AMG™ E (a partir da Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300, GC480, GC417 (a partir da DuPont.); AMIGASE™ e AMIGASE™ PLUS (a partir da DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ e G990 ZR (a partir da DuPont).

[00168] Adicionalmente a uma glucoamilase, a composição pode com- preender adicionalmente uma alfa-amilase. Particularmente, a alfa-amilase é uma alfa-amilase fúngica ácida. Uma alfa-amilase estável ácida fúngica é uma alfa-amilase que tem atividade na gama de pH de 3,0 a 7,0 e, preferencial- mente, na gama de pH de 3,5 a 6,5, incluindo atividade a um pH de cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 e 6,0.

[00169] Preferencialmente, a alfa-amilase fúngica ácida é derivada do gênero Aspergillus, especialmente uma estirpe de A. terreus, A. niger, A. ory- zae, A. awamori ou Aspergillus kawachii ou do gênero Rhizomucor, prefe- rencialmente uma estirpe de Rhizomucor pusillus ou do gênero Meripilus, preferencialmente uma estirpe de Meripilus giganteus.

[00170] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é derivada de uma estirpe do gênero Rhizomucor, preferencialmente uma estirpe de Rhizo-

43 / 68 mucor pusillus, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756, tal como um híbrido de alfa-amilase de Rhizomucor pusillus tendo um ligante de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido, tal co- mo aquele mostrado em SEQ ID NO: 6 aqui ou uma sua variante.

[00171] Em uma modalidade, a alfa-amilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6; (ii) uma alfa-amilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6.

[00172] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é uma varian- te da alfa-amilase mostrada em SEQ ID NO: 9 tendo pelo menos uma das se- guintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H + Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C (usando SEQ ID NO: 6 para numeração).

[00173] Em uma modalidade, a alfa-amilase é derivada de um Rhizo- mucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domí- nio de ligação ao amido (SBD), preferencialmente divulgada como SEQ ID NO: 6, tendo preferencialmente uma ou mais das seguintes substituições:

44 / 68 G128D, D143N, preferencialmente G128D + D143N (usando SEQ ID NO: 6 para numeração), e em que a variante de alfa-amilase tem pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais prefe- rencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6.

[00174] Em uma modalidade preferencial, a razão entre glucoamilase e alfa-amilase presentes e/ou adicionadas durante a sacarificação e/ou fermen- tação pode estar preferencialmente na gama de 500:1 a 1:1, tal como de 250:1 a 1:1, tal como de 100:1 a 1: 1, tal como de 100: 2 a 100:50, tal como de 100:3 a 100:70.

[00175] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição pode estar na forma de granulado ou micro- granulado. A variante pode ser estabilizada de acordo com métodos conheci- dos na técnica.

[00176] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhe- cidos na técnica.

[00177] A composição de enzimas da presente invenção pode estar em qualquer forma adequada para uso, tal como, por exemplo, um caldo de fer- mentação em bruto com ou sem células removidas, um lisado de células com ou sem detritos celulares, uma composição de enzimas semipurificada ou pu- rificada ou uma célula hospedeira, como uma fonte das enzimas.

[00178] A composição de enzimas pode ser um pó ou granulado seco,

45 / 68 um granulado sem formação de poeira, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida estabilizada. As composições de enzimas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas por adição de estabilizantes tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou outro poliol e/ou ácido láctico ou outro ácido orgânico de acordo com processos estabelecidos. Usos da composição de acordo com a invenção

[00179] As composições de acordo com a invenção são contempladas para uso na sacarificação do amido. Em um aspecto, a presente invenção se relaciona assim com um uso da composição de acordo com a presente inven- ção na sacarificação de um material contendo amido.

[00180] Em uma modalidade, o uso compreende adicionalmente fer- mentação do material contendo amido sacarificado para produzir um produto de fermentação. O material de amido pode ser amido gelatinizado ou não ge- latinizado. Particularmente, o produto de fermentação é álcool, mais particu- larmente etanol.

[00181] Em uma modalidade particular, a sacarificação e a fermenta- ção são realizadas simultaneamente.

[00182] A invenção é adicionalmente divulgada na lista em baixo de modalidades preferenciais.

[00183] Modalidade 1. Um processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo: a) sacarificação do material contendo amido a uma temperatu- ra abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material conten- do amido usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos; e b) fermentação usando um organismo fermentador; em que os passos a) e/ou b) são realizados na presença de uma mistu- ra de endo-protease e exo-protease, e em que a exo-protease constitui pelo menos 5% (p/p) da mistura de proteases em uma base de proteína de enzima protease total.

46 / 68

[00184] Modalidade 2. Um processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo os passos de: (a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido na presença de uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito obtido no passo (a) usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos; (c) fermentação usando um organismo fermentador; em que os passos b) e/ou c) são realizados na presença de uma mistura de endo-protease e exo-protease, e em que a exo-protease constitui pelo menos 5% (p/p) da mistura de proteases em uma base de proteína de en- zima protease total.

[00185] Modalidade 3. O processo de acordo com as modalidades 1 ou 2, em que a sacarificação e a fermentação são realizadas simultaneamente.

[00186] Modalidade 4. O processo de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que a exo-protease constitui pelo menos 10% (p/p) da mistura de proteases em uma base de proteína de enzima protease to- tal, tal como pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, parti- cularmente pelo menos 75%, mais particularmente a exo-protease constitui de entre 5 e 95% (p/p) em uma base de proteína de enzima protease total, parti- cularmente 10 e 80% (p/p), particularmente 15 e 70% (p/p), mais particular- mente 20 e 60% (p/p) e, ainda mais particularmente, 25 e 50% (p/p) da mistu- ra de proteases na composição em uma base de proteína de enzima protease total.

[00187] Modalidade 5. O processo de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que a endo-protease e a exo-protease estão pre-

47 / 68 sentes em uma razão de 5:2 microgramas de proteína de enzima (EP)/g de só- lidos secos (DS), particularmente 5:3, mais particularmente 5:4.

[00188] Modalidade 6. O processo de acordo com qualquer uma das modalidades 1-5, em que a endo-protease é derivada de proteases pertencendo à família S53, S8, M35, A1.

[00189] Modalidade 7. O processo de acordo com qualquer uma das modalidades 1-5, em que a exo-protease é derivada de proteases pertencendo à família S10, S53, M14, M28.

[00190] Modalidade 8. O processo da modalidade 7, em que a endo- protease é selecionada da família M35, mais particularmente protease M35 derivada de Thermoascus aurantiacus, o polipeptídeo maduro da qual com- preende os aminoácidos 1-177 de SEQ ID NO: 1 ou um polipeptídeo tendo pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais pre- ferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmen- te pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo me- nos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[00191] Modalidade 9. O processo de acordo com a modalidade 8, em que a exo-protease S53 é derivada de uma estirpe de Aspergillus, Trichoder- ma, Thermoascus, or Thermomyces, particularly Aspergillus oryzae, Asper- gillus niger, Trichoderma reesei, Thermoascus thermophilus ou Thermomyces lanuginosus.

[00192] Modalidade 10. O processo de acordo com a modalidade 9, em que a protease S53 é um polipeptídeo tendo atividade de serina protease, sele- cionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%,

48 / 68 pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00193] Modalidade 11. O processo de acordo com a modalidade 9, em que a protease S53 é um polipeptídeo tendo atividade de serina protease, sele- cionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4.

[00194] Modalidade 12. O processo de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que uma alfa-amilase está presente ou é adicio- nada durante a sacarificação e/ou fermentação.

[00195] Modalidade 13. O processo de acordo com a modalidade 12, em que a alfa-amilase é uma alfa-amilase ácida, preferencialmente uma alfa- amilase fúngica ácida.

[00196] Modalidade 14. O processo de acordo com a modalidade 13, em que a alfa-amilase é derivada do gênero Aspergillus, especialmente uma estirpe de A. terreus, A. niger, A. oryzae, A. awamori ou Aspergillus kawa- chii ou do gênero Rhizomucor, preferencialmente uma estirpe o Rhizomucor pusillus ou do gênero Meripilus, preferencialmente uma estirpe de Meripilus giganteus.

[00197] Modalidade 15. O processo de acordo com a modalidade 14, em que a alfa-amilase presente na sacarificação e/ou fermentação é derivada de uma estirpe do gênero Rhizomucor, preferencialmente uma estirpe de Rhi- zomucor pusillus, tal como um híbrido de alfa-amilase de Rhizomucor pu- sillus tendo um ligante e domínio de ligação ao amido de uma glucoamilase de Aspergillus niger.

[00198] Modalidade 16. O processo da modalidades 15, em que a alfa- amilase presente na sacarificação e/ou fermentação é selecionada do grupo

49 / 68 consistindo em: (i) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6; (ii) uma alfa-amilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6.

[00199] Modalidade 17. O processo da modalidade 16, em que a alfa- amilase é derivada de um Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamila- se e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger, preferencial- mente divulgada como SEQ ID NO: 6, tendo preferencialmente uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, preferencialmente G128D + D143N.

[00200] Modalidade 18. O processo de qualquer uma das modalidades 12-17, em que a alfa-amilase está presente em uma quantidade de 0,001 a 10 AFAU/g de DS, preferencialmente 0,01 a 5 AFAU/g de DS, especialmente 0,3 a 2 AFAU/g de DS ou 0,001 a 1 FAU-F/g de DS, preferencialmente 0,01 a 1 FAU-F/g de DS.

[00201] Modalidade 19. O processo de qualquer uma das modalidades 1-18, em que a enzima geradora de fonte de carboidratos é selecionada do grupo consistindo em glucoamilase, alfa-glucosidase, amilase maltogênica, pululanase e beta-amilase.

[00202] Modalidade 20. O processo de qualquer uma das modalidades 1-19, em que a enzima geradora de fonte de carboidratos é uma glucoamilase e está presente em uma quantidade de 0,001 a 10 AGU/g de DS, preferenci- almente de 0,01 a 5 AGU/g de DS, especialmente 0,1 a 0,5 AGU/g de DS.

[00203] Modalidade 21. O processo de qualquer uma das modalidades

50 / 68 18-20, em que a alfa-amilase e a glucoamilase são adicionadas em uma razão de entre 0,1 e 100 AGU/FAU-F, preferencialmente 2 e 50 AGU/FAU-F, es- pecialmente entre 10 e 40 AGU/FAU-F quando a sacarificação e fermentação são levadas a cabo simultaneamente.

[00204] Modalidade 22. O processo de qualquer uma das modalidades 19-21, em que a glucoamilase é derivada de uma estirpe de Aspergillus, prefe- rencialmente Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, uma estirpe de Tala- romyces, especialmente Talaromyces emersonii; ou uma estirpe de Athelia, especialmente Athelia rolfsii; uma estirpe de Trametes, preferencialmente Trametes cingulata; uma estirpe do gênero Gloeophyllum, p.ex., uma estirpe de Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum trabeum; uma estirpe do gênero Pycnoporus, p.ex., uma estirpe de Pycnoporus sanguineus; ou uma sua mistu- ra.

[00205] Modalidade 23. O processo da modalidade 22, em que a glu- coamilase é derivada de Trametes, tal como uma estirpe de Trametes cingula- ta, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 7.

[00206] Modalidade 24. O processo da modalidade 23, em que a glu- coamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 7; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 7.

[00207] Modalidade 25. O processo da modalidade 22, em que a glu- coamilase é derivada de Talaromyces, tal como uma estirpe de Talaromyces emersonii, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 8.

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[00208] Modalidade 26. O processo da modalidade 25, em que a glu- coamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8.

[00209] Modalidade 27. O processo da modalidade 22, em que a glu- coamilase é derivada de uma estirpe do gênero Pycnoporus, tal como uma es- tirpe de Pycnoporus sanguineus tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 9.

[00210] Modalidade 28. O processo da modalidade 27, em que a glu- coamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 9; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 9.

[00211] Modalidade 29. O processo da modalidade 22, em que a glu- coamilase é derivada de uma estirpe do gênero Gloeophyllum, tal como uma estirpe de Gloeophyllum sepiarium mostrada em SEQ ID NO: 10.

[00212] Modalidade 30. O processo da modalidade 29, em que a glu- coamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ

52 / 68 ID NO: 10; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 10.

[00213] Modalidade 31. O processo da modalidade 22, em que a glu- coamilase é derivada de uma estirpe do gênero Gloeophyllum, tal como uma estirpe de Gloeophyllum trabeum tal como aquela mostrada em SEQ ID NO:

11.

[00214] Modalidade 32. O processo da modalidade 22, em que a glu- coamilase é selecionada do grupo consistindo em: (i) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 11; (ii) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 11.

[00215] Modalidade 33. O processo de qualquer uma das modalidades 1-32, em que o produto de fermentação é recuperado após fermentação.

[00216] Modalidade 34. O processo de qualquer uma das modalidades 1-33, em que o produto de fermentação é um álcool, preferencialmente etanol, especialmente etanol para combustível, etanol potável e/ou etanol industrial.

[00217] Modalidade 35. O processo de qualquer uma das modalidades 1-34, em que o organismo fermentador é levedura, preferencialmente uma es- tirpe de Saccharomyces, especialmente uma estirpe de Saccharomyces cerevi-

53 / 68 siae.

[00218] Modalidade 36. O processo da modalidade 1, em que o materi- al contendo amido é amido granular.

[00219] Modalidade 37. O processo da modalidade 36, em que o mate- rial contendo amido é derivado de grão inteiro.

[00220] Modalidade 38. O processo de qualquer uma das modalidades 1-37, em que o material contendo amido é derivado de milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz ou batatas.

[00221] Modalidade 39. O processo de qualquer uma das modalidades 1-38, em que a fermentação é levada a cabo a um pH na gama entre 3 e 7, pre- ferencialmente de 3,5 a 6 ou, mais preferencialmente, de 4 a 5.

[00222] Modalidade 40. O processo de qualquer uma das modalidades 1-39, em que o processo é levado a cabo durante entre 1 e 96 horas, preferen- cialmente é de 6 a 72 horas.

[00223] Modalidade 41. O processo de qualquer uma das modalidades 1-40, em que o conteúdo de sólidos secos do material contendo amido está na gama de 10-55% p/p, preferencialmente 25-45% p/p, mais preferencialmente 30-40% p/p.

[00224] Modalidade 42. O processo de qualquer uma das modalidades 1-41, em que o material contendo amido é preparado por redução do tamanho de partículas do material contendo amido até um tamanho de partículas de 0,1-0,5 mm.

[00225] Modalidade 43. O processo da modalidade 3, em que a tempe- ratura durante a sacarificação e fermentação simultâneas é entre 25 °C e 40 °C, tal como entre 28 °C e 35 °C, tal como entre 30 °C e 34 °C, tal como em torno de 32 °C.

[00226] Modalidade 44. O processo da modalidade 3, em que o pH du- rante a sacarificação e fermentação simultâneas é selecionado da gama 3-7, preferencialmente 4,0-6,5, mais particularmente 4,5-5,5, tal como pH 5,0.

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[00227] Modalidade 45. O processo de qualquer uma das modalidades 2-44, em que a liquefação é levada a cabo a pH 4,0-6,5, preferencialmente a um pH de 4,5 a 5,5, tal como pH 5,0.

[00228] Modalidade 46. O processo de qualquer uma das modalidades 2-45, em que a temperatura na liquefação está na gama de 70-95 °C, preferen- cialmente 80-90 °C, tal como em torno de 85 °C.

[00229] Modalidade 47. O processo das modalidades 1 ou 2, compre- endendo adicionalmente, antes do passo (a), os passos de: x) redução do tamanho das partículas do material contendo amido; y) formação de uma pasta semifluida compreendendo o mate- rial contendo amido e água.

[00230] Modalidade 48. O processo de qualquer uma das modalidades 1-47, em que uma pululanase está presente i) durante a fermentação e/ou ii) antes da, durante a e/ou após liquefação.

[00231] Modalidade 49. Uma composição compreendendo uma mistu- ra de endo-protease e exo-protease, e em que a exo-protease constitui pelo menos 5% (p/p) da protease na mistura em uma base de proteína de enzima protease total, tal como pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, particularmente pelo menos 75%, mais particularmen- te a exo-protease constitui de entre 5 e 95% (p/p) da protease na mistura em uma base de proteína de enzima protease total, particularmente 10 e 80% (p/p), particularmente 15 e 70% (p/p), mais particularmente 20 e 60% (p/p) e, ainda mais particularmente, 25 e 50% (p/p) da mistura de proteases na com- posição em uma base de proteína de enzima protease total.

[00232] Modalidade 50. A composição da modalidade 49, em que a endo-protease é derivada de proteases pertencendo à família S53, S8, M35 ou

55 / 68 A1 e a exo-protease é derivada de proteases pertencendo à família S10, S53, M14 ou M28.

[00233] Modalidade 51. A composição da modalidade 50, em que a endo-protease S53 é um polipeptídeo tendo atividade de serina protease, sele- cionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[00234] Modalidade 52. A composição de acordo com a modalidade 50, em que a exo-protease S53 é derivada de uma estirpe de Aspergillus, Tri- choderma, Thermoascus, or Thermomyces, particularly Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Thermoascus thermophilus ou Ther- momyces lanuginosus.

[00235] Modalidade 53. A composição de acordo com a modalidade 52, em que a exo-protease S53 é um polipeptídeo tendo atividade de serina protease, selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o po- lipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00236] Modalidade 54. A composição de acordo com a modalidade 52, em que a exo-protease S53 é um polipeptídeo tendo atividade de serina protease, selecionado de um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o po- lipeptídeo de SEQ ID NO: 4.

[00237] Modalidade 55. A composição de qualquer uma das modalida-

56 / 68 des 49-54, compreendendo adicionalmente uma enzima geradora de fonte de carboidratos selecionada do grupo de glucoamilase, alfa-glucosidase, amilase maltogênica e beta-amilase.

[00238] Modalidade 56. A composição da modalidade 55, em que a enzima geradora de fonte de carboidratos é selecionada do grupo de glucoa- milases derivadas de uma estirpe de Aspergillus, preferencialmente Asper- gillus niger ou Aspergillus awamori, uma estirpe de Trichoderma, especial- mente T. reesei, uma estirpe de Talaromyces, especialmente Talaromyces emersonii; ou uma estirpe de Athelia, especialmente Athelia rolfsii; uma es- tirpe de Trametes, preferencialmente Trametes cingulata; uma estirpe do gê- nero Gloeophyllum, p.ex., uma estirpe de Gloeophyllum sepiarum ou Gloe- ophyllum trabeum; um estirpe do gênero Pycnoporus, p.ex., uma estirpe de Pycnoporus sanguineus; ou uma sua mistura.

[00239] Modalidade 57. A composição de qualquer uma das modalida- des 49-56, compreendendo adicionalmente uma alfa-amilase selecionada do grupo de alfa-amilases fúngicas, preferencialmente derivadas do gênero As- pergillus, especialmente uma estirpe de Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori ou Aspergillus kawachii ou do gêne- ro Rhizomucor, preferencialmente uma estirpe o Rhizomucor pusillus ou do gênero Meripilus, preferencialmente uma estirpe de Meripilus giganteus.

[00240] Modalidade 58. Um uso da composição de acordo com qual- quer uma das modalidades 49-57 na sacarificação de um material contendo amido.

[00241] Modalidade 59. O uso de acordo com a modalidade 58, com- preendendo adicionalmente fermentação do material contendo amido sacarifi- cado para produzir um produto de fermentação.

[00242] Modalidade 60. O uso de acordo com qualquer uma das moda- lidades 58-59, em que o material contendo amido é amido gelatinizado ou não gelatinizado.

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[00243] Modalidade 61. O uso de acordo com qualquer uma das moda- lidades 58-60, em que o produto de fermentação é um álcool, particularmente etanol.

[00244] Modalidade 62. O uso de acordo com qualquer uma das moda- lidades 58-61, em que a sacarificação e a fermentação são realizadas simulta- neamente.

[00245] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitando o escopo da in- venção.

EXEMPLOS Ensaios de Enzimas Ensaios de protease Ensaio de AZCL-caseína

[00246] Uma solução de 0,2% do substrato azul AZCL-caseína é sus- pensa em tampão de Bórax/NaH2PO4 pH 9 enquanto se agita. A solução é dis- tribuída enquanto se agita a placa de microtitulação (100 microL em cada po- ço), 30 microL da amostra de enzima são adicionados e as placas são incuba- das em um Termomisturador Eppendorf durante 30 minutos a 45 °C e 600 rpm. A amostra de enzima desnaturada (ebulição a 100 °C durante 20 min) é usada como um branco. Após incubação, a reação é parada por transferência da placa de microtitulação para gelo e a solução colorida é separada do sólido por centrifugação a 3000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. 60 microL de sobre- nadante são transferidos para uma placa de microtitulação e a absorvância a 595 nm é medida usando um Leitor de Microplacas da BioRad. Ensaio cinético de Suc-AAPF-pNA: Substrato de pNA: Suc-AAPF-pNA (L-1400 da Bachem). Temperatura: Temperatura ambiente (25 °C) Tampões do ensaio: ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 mM, Tri-

58 / 68 ton X-100 a 0,01% ajustado até valores de pH 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 e 11,0 com HCl ou NaOH.

[00247] 20 μL de amostra de protease (diluídos em Triton X-100 a 0,01%) foram misturados com 100 μL de tampão do ensaio. O ensaio foi ini- ciado por adição de 100 μL de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 mL de DMSO e adicionalmente diluídos 45x com Triton X-100 a 0,01%). O aumento na OD405 foi monitorizado como uma medida da atividade de pro- tease. Ensaio de ponto final de Suc-AAPF-pNA: Substrato de pNA: Suc-AAPF-pNA (L-1400 da Bachem). Temperatura: controlada (temperatura do ensaio). Tampão do ensaio: ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 mM, Tri- ton X-100 a 0,01%, pH 4,0.

[00248] 200 μL de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 mL de DMSO e adicionalmente diluídos 45x com o tampão do Ensaio) foram pipe- tados em um tubo Eppendorf e colocados em gelo. 20 μL de amostra de pro- tease (diluída em Triton X-100 a 0,01%) foram adicionados. O ensaio foi ini- ciado por transferência do tubo Eppendorf para um termomisturador Eppen- dorf, que estava definido para a temperatura do ensaio. O tubo foi incubado durante 15 minutos no termomisturador Eppendorf à sua taxa de agitação mais elevada (1400 rpm). A incubação foi terminada por transferência do tubo de volta para o banho de gelo e adição de 600 μL de H3BO3/NaOH a 500 mM, pH 9,7. O tubo foi misturado e 200 μL da mistura foram transferidos para uma placa de microtitulação, que foi lida à OD405. Um tampão cego foi inclu- ído no ensaio (em vez da enzima). OD405 (Amostra) – OD405 (Cego) foi uma medida da atividade de protease. Ensaio de Protazyme AK: Substrato: Comprimido de Protazyme AK (caseína reticulada e

59 / 68 corada; da Megazyme) Temperatura: controlada (temperatura do ensaio). Tampão do ensaio: ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 Mm, Tri- ton X-100 a 0,01%, pH 6,5.

[00249] Um comprimido de Protazyme AK foi suspenso em 2,0 mL de Triton X-100 a 0,01% por agitação suave. 500 μL desta suspensão e 500 μL de tampão de ensaio foram dispensados em um tubo Eppendorf e colocados em gelo. 20 μL de amostra de protease (diluída em Triton X-100 a 0,01%) fo- ram adicionados. O ensaio foi iniciado por transferência do tubo Eppendorf para um termomisturador Eppendorf, que estava definido para a temperatura do ensaio. O tubo foi incubado durante 15 minutos no termomisturador Ep- pendorf à sua taxa de agitação mais elevada (1400 rpm). A incubação foi pa- rada por transferência do tubo de volta para o banho de gelo. Depois, o tubo foi centrifugado em uma centrífuga gelada durante alguns minutos e 200 μL de sobrenadante foram transferidos para uma placa de microtitulação, que foi lida à OD650. Um tampão cego foi incluído no ensaio (em vez da enzima). OD650 (Amostra) – OD650 (Cego) foi uma medida da atividade de protease. Ensaio cinético de Suc-AAPX-pNA: Substratos de pNA: Suc-AAPA-pNA (L-1775 da Bachem) Suc-AAPR-pNA (L-1720 da Bachem) Suc-AAPD-pNA (L-1835 da Bachem) Suc-AAPI-pNA (L-1790 da Bachem) Suc-AAPM-pNA (L-1395 da Bachem) Suc-AAPV-pNA (L-1770 da Bachem) Suc-AAPL-pNA (L-1390 da Bachem) Suc-AAPE-pNA (L-1710 da Bachem) Suc-AAPK-pNA (L-1725 da Bachem) Suc-AAPF-pNA (L-1400 da Bachem).

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[00250] Temperatura: Temperatura ambiente (25 °C)

[00251] Tampão do ensaio: ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 Mm, Tri- ton X-100 a 0,01%, pH 4,0 ou pH 9,0.

[00252] 20 μL de protease (diluída em Triton X-100 a 0,01%) foram misturados com 100 μL de tampão do ensaio. O ensaio foi iniciado por adição de 100 μL de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 mL de DMSO e adicionalmente diluídos 45x com Triton X-100 a 0,01%). O aumento na OD405 foi monitorizado como uma medida da atividade de protease. Ensaio de o-ftaldialdeído (OPA):

[00253] Este ensaio detecta aminas primárias e consequentemente a clivagem de ligações de peptídeo por uma protease pode ser medida como a diferença na absorvância entre uma amostra tratada com protease e uma amostra de controle. O ensaio é conduzido essencialmente de acordo com Ni- elsen et al. (Nielsen, PM, Petersen, D, Dampmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. J Food Sci, 2001, 66: 642- 646).

[00254] 500 µL de amostra são filtrados através de um filtro centrífuga Microcon de 100 kDa (60 minutos, 11.000 rpm, 5 °C). As amostras são diluí- das apropriadamente (p.ex., 10, 50 ou 100 vezes) em água desionizada e 25 µL de cada amostra são carregados em uma placa de microtitulação de 96 po- ços (5 replicados). 200 µL de reagente OPA (tetraborato dissódico decaidra- tado a 100 mM, dodecil sulfato de sódio (SDS) a 5,7 mM, di-tiotreitol (DDT) a 3,5 mM,o-ftaldialdeído a 6 mM) são dispensados em todos os poços, a placa é agitada (10 seg, 750 rpm) e a absorvância medida a 340 nm. Ensaios para atividade de glucoamilase Unidades de glucoamilase, AGU

[00255] A Unidade de Glucoamilase (AGU) é definida como a quanti- dade de enzima que hidrolisa 1 micromole de maltose por minuto sob as con-

61 / 68 dições padrão (37 °C, pH 4,3, substrato: maltose a 100 mM, tampão: acetato a 0,1 M, tempo de reação 6 minutos como definido na incubação de glucoami- lase em baixo), gerando deste modo glucose. incubação de glucoamilase: Substrato: maltose a 100 mM Tampão: acetato a 0,1 M pH: 4,30 ± 0,05 Temperatura de incubação: 37 °C ± 1 Tempo de reação: 6 minutos Gama de trabalho da enzima: 0,5-4,0 AGU/mL

[00256] O princípio da análise é descrito por 3 passos de reação: O passo 1 é uma reação de enzima:

[00257] A glucoamilase (AMG), EC 3.2.1.3 (exo-alfa-1,4-glucana- gluco-hidrolase), hidrolisa maltose para formar alfa-D-glucose. Após incuba- ção, a reação é parada com NaOH. Os passos 2 e 3 resultam em uma reação de ponto final:

[00258] A glucose é fosforilada por ATP, em uma reação catalisada por hexocinase. O glucose-6-fosfato formado é oxidado até 6-fosfogluconato por glucose-6-fosfato desidrogenase. Em esta mesma reação, uma quantidade equimolar de NAD+ é reduzida até NADH com um aumento resultante na ab- sorbância a 340 nm. Pode ser usado um sistema autoanalisador tal como Ana- lisador Konelab 30 (Thermo Fisher Scientific). Reação de cor Tris aprox. 35 mM ATP 0,7 mM NAD+ 0,7 mM Mg2+ 1,8 mM Hexocinase > 850 U/L Glucose-6-P-DH > 850 U/L pH aprox. 7,8 Temperatura 37,0 °C ± 1,0 °C Tempo de reação 420 seg Comprimento de onda 340 nm Atividade de alfa-amilase ácida (AFAU)

[00259] A atividade de alfa-amilase ácida pode ser medida em AFAU (Unidades de Alfa-amilase Fúngica Ácida), que são determinadas em relação a um padrão de enzima. 1 AFAU é definido como a quantidade de enzima que

62 / 68 degrada 5,260 mg de matéria seca de amido por hora sob as condições padrão mencionadas em baixo.

[00260] A alfa-amilase ácida, uma endo-alfa-amilase (1,4-alfa-D- glucana-glucano-hidrolase, E.C. 3.2.1.1), hidrolisa ligações alfa-1,4- glucosídicas nas regiões internas da molécula de amido para formar dextrinas e oligossacarídeos com diferentes comprimentos de cadeia. A intensidade da cor formada com iodo é diretamente proporcional à concentração de amido. A atividade de amilase é determinada usando colorimetria reversa como uma re- dução na concentração de amido sob as condições analíticas especificadas.

azul/violeta t = 23 segundos descoloração Condições padrão/condições de reação: Substrato: Amido solúvel, aprox. 0,17 g/L Tampão: Citrato, aprox. 0,03 M Iodo (I2): 0,03 g/L CaCl2: 1,85 mM pH: 2,50 ± 0,05 Temperatura de incubação: 40 °C Tempo de reação: 23 segundos Comprimento de onda: 590 nm Concentração de enzima: 0,025 AFAU/mL Gama de trabalho de enzimas: 0,01-0,04 AFAU/mL

[00261] Uma pasta EB-SM-0259.02/01 descrevendo este método analí- tico em mais detalhe está disponível mediante pedido à Novozymes A/S, Di- namarca, pasta essa que é deste modo incluída por referência. Determinação de FAU-F

[00262] FAU-F Unidades de Alfa-Amilase Fúngica (Fungamyl) é me- dida em relação a um padrão de enzima de uma força declarada. Condições de reação Temperatura 37 °C pH 7,15 Comprimento de onda 405 nm Tempo de reação 5 min Tempo de medição 2 min

[00263] Uma pasta (EB-SM-0216.02) descrevendo este método padrão em mais detalhe está disponível mediante pedido à Novozymes A/S, Dina-

63 / 68 marca, pasta essa que é deste modo incluída por referência. Atividade de Alfa-amilase (KNU)

[00264] A atividade de alfa-amilase pode ser determinada usando ami- do de batata como substrato. Este método é baseado na desagregação de ami- do de batata modificado pela enzima, e a reação é seguida por mistura de amostras da solução de amido/enzima com uma solução de iodo. Inicialmente é formada uma cor enegrecida-azul, mas durante a desagregação do amido a cor azul se torna mais fraca e se torna gradualmente em um avermelhado- marrom, que é comparado com um vidro colorido padrão.

[00265] Uma Unidade de alfa-amilase Kilo Novo (KNU) é definida como a quantidade de enzima que, sob condições padrão (i.e., a 37 °C +/- 0,05; Ca2+ a 0,0003 M; e pH 5,6) dextriniza 5,260 g de substância seca de amido Merck Amylum solúvel.

[00266] Uma pasta EB-SM-0009.02/01 descrevendo este método analí- tico em mais detalhe está disponível mediante pedido à Novozymes A/S, Di- namarca, pasta essa que é deste modo incluída por referência. Atividade de Alfa-amilase (KNU-A)

[00267] A atividade de alfa-amilase é medida em KNU(A), Quilo Uni- dades de Novozymes Quilo (A), em relação a um padrão de enzima de uma resistência declarada.

[00268] A alfa-amilase em amostras e a α-glucosidase no estojo de re- agentes hidrolisam o substrato (4,6-etilideno(G7)-p-nitrofenil(G1)-α,D-malto- heptaosídeo (etilideno-G7PNP)) em glucose e o p-nitrofenol de cor amarela.

[00269] A taxa de formação de p-nitrofenol pode ser observada por Konelab 30. Isto é uma expressão da taxa de reação e deste modo da atividade de enzima.

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[00270] A enzima é uma alfa-amilase com o número de classificação de enzimas EC 3.2.1.1. Parâmetro Condições de reação Temperatura 37 °C pH 7,00 (a 37 °C) Conc. de substrato Etilideno-G7PNP, R2: 1,86 mM Conc. da enzima 1,35-4,07 KNU(A)/L (conc. de padrão elevado/baixo na mistura reacional) Tempo de reação 2 min Tempo de medição cinética de intervalo 7/18 s Comprimento de onda 405 nm Conc. de reagentes/químicos críticos para a análise α-glucosidase, R1:≥ 3,39 kU/l Enzimas

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[00271] Alfa-Amilase 369 (AA369): Alfa-amilase de Bacillus stea- rothermophilus com as mutações: I181* + G182* + N193F + V59A + Q89R + E129V + K177L + R179E + Q254S + M284V truncada até 491 aminoáci- dos (usando SEQ ID NO: 12 para numeração).

[00272] Alfa-Amilase X: Alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com as mutações: I181* + G182* + N193F truncada até 491 aminoácidos (usando SEQ ID NO: 12 para numeração).

[00273] Glucoamilase Po: Parte madura da glucoamilase de Penicil- lium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 e mos- trada em SEQ ID NO: 13 aqui.

[00274] Protease Pfu: Protease derivada de Pyrococcus furiosus mos- trada em SEQ ID NO: 5 aqui.

[00275] Glucoamilase Po 498 (GA498): Variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum tendo as seguintes mutações: K79V + P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F (usando SEQ ID NO: 13 para numeração).

[00276] Combinação de alfa-amilases A: Combinação compreendendo Alfa-amilase AA369, glucoamilase GA498 e protease PfuS (dosagem: 2,1 µg de EP/g de DS de AA369, 4,5 µg de EP/g de DS de GA498, 0,0385 µg de EP/g de DS de PfuS, onde EP é proteína de enzima e DS é sólidos secos to- tais).

[00277] Combinação de glucoamilases A: Combinação compreenden- do glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada como SEQ ID NO: 34 em WO99/28448 e SEQ ID NO: 8 aqui, glucoamilase de Trametes cingulata divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 06/69289 e SEQ ID NO: 7 e alfa- amilase de Rhizomucor pusillus com ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger, divulgada em SEQ ID NO: 6 aqui tendo as seguintes substituições G128D + D143N usando SEQ ID NO: 6 para numeração (a razão de atividade em AGU:AGU:FAU-F é cerca de 29:8:1).

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[00278] A metaloprotease da família M35 (AP025) da estirpe de Thermoascus aurantiacus no. CGMCC 0670 foi isolada a partir de uma amos- tra de solo coletada em 21 de julho, 1998 na Província de Yunnan, Xishuangbanna, China. Esta protease foi previamente divulgada em WO 2003/048353 e incluída aqui como SEQ ID NO: 1. Exemplo 1: Cultura de Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670

[00279] Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670 foi cultivada a 45 °C durante 60 horas em frascos de agitação com o meio CBH1. O caldo de cultura foi coletado por centrifugação (7000 rpm durante 20 minutos a 4 °C). Um total de 1500 mL de caldo de cultura foi obtido. Exemplo 2: Purificação da protease de Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670

[00280] 1500 mL de sobrenadante do Exemplo 2 foram precipitados com sulfato de amônio (saturação de 80%) e redissolvidos em 40 mL de tam- pão de Tris-HCl a 25 mM, pH 7,4. A solução resultante foi ultrafiltrada com uma membrana 5K para se remover os sais e mudar tampão para Tris-HCl a 25 mM, pH 7,4, após o que foi filtrada através de um filtro de 0,45 µm. O vo- lume final foi 30 mL. A solução foi aplicada a uma coluna Q Sepharose FF de 20 mL equilibrada em Tris-HCl a 25 mM, pH 7,4, e as proteínas foram eluí- das com um gradiente linear de NaCl (0 – 0,4 M). As frações da coluna foram analisadas quanto à atividade de protease em AZCL-caseína a pH 9,0, com ou sem SSI. As frações com atividade de protease não inibida por SSI foram agrupadas. Depois, a solução agrupada foi aplicada a uma coluna Superdex75 equilibrada com Tris-HCl a 25 mM, pH 7,4, e as proteínas foram eluídas com o mesmo tampão. As frações contendo protease foram analisadas por SDS- PAGE e as frações puras foram agrupadas.

[00281] A pureza da protease purificada foi checada por SDS-page e em um gel IEF. A amostra continha somente uma protease que foi designada AP025 e divulgada aqui como os aminoácidos 1 a 177 de SEQ ID NO: 1. O

67 / 68 peso molecular é em torno de 23 kDa e o pI é pH 8,5. Exemplo 3. Efeito de exo-peptidase de tripeptidilaminopeptidase de com- binação de A. niger ou T. reesei com endo-protease de Thermoascus au- rantiacus para aumento do título de etanol em processo de sacarificação e fermentação simultâneas

[00282] Um purê liquefeito preparado industrial usando Alfa-amilase- X foi usado para a experiência. Os sólidos secos determinados por equilíbrio de umidade (Mettler-Toledo) foram cerca de 30,8% de DS e o pH foi ajustado até pH 5,0 seguido por suplementação com 3 ppm de penicilina e 400 ppm de ureia. A sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) foram realizadas atra- vés de fermentações em miniescala. Aproximadamente 5 g do purê de milho liquefeito industrial foram adicionados a frascos de tubo de 15 mL. Cada fras- co foi doseado com 0,6 AGU/g de DS de Combinação de glucoamilases A e quantidade apropriada de endo-protease (SEQ ID NO: 1) de Thermoascus au- rantiacus pertencendo à família M35 com ou sem exo-peptidase nomeada- mente tripeptidilaminopeptidase (TPAP) pertencendo à família S53 de Asper- gillus niger (SEQ ID NO: 4) ou Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 3), respec- tivamente, como mostrado na tabela em baixo seguido por adição de 100 mi- crolitros de levedura hidratada por 5 g de pasta semifluida. Como controle, glucoamilase e 400 ppm de ureia foram adicionados mas nenhuma adição de endo-protease ou exo-peptidase. As dosagens reais de glucoamilase e protease foram baseadas no peso exato da pasta semifluida de milho em cada frasco. Os frascos foram incubados a 32 °C. Três réplicas foram selecionadas para análise de ponto temporal de 52 horas. Em cada ponto temporal, a fermenta- ção foi paradas por adição de 50 microL de H2SO4 a 40%, seguida por centri- fugação, e filtração através de um filtro de 0,45 micrômetros. A concentração de etanol e oligossacarídeos foi determinada usando HPLC. Endo-protease de T. Exo-peptidase de A. Exo-peptidase de T. Tratamentos aurantiacus niger reesei (μg/g de DS) μg/g deDS μg/g deDS

1. Controle - -

68 / 68

2. Somente endo-protease 2,5 -

3. Somente endo-protease 5,0

4. Endo-protease + Tripeptidilamino- 2,5 2,5 peptidase de A. niger

5. Endo-protease + Tripeptidilamino- 2,5 2,5 peptidase de T. reesei

[00283] Como mostrado nas tabelas de resultados em baixo, a combi- nação de endo-protease da família M35 com a família S53 de exo-peptidase TPAP aumentou o rendimento de etanol com significância estatística em comparação com controle ou endo-protease sozinha.

[00284] Rendimento de etanol às 52 horas de endo-protease sem ou com exo-peptidase. Tratamentos Etanol (g/L)

1. Controle 122,21

2. Somente endo-protease 125,07

3. Somente endo-protease 126,10

4. Endo-protease + Tripeptidilaminopeptidase de A. niger 126,22

5. Endo-protease + Tripeptidilaminopeptidase de T. reesei 126,22

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido, caracterizado pelo fato de que compreen- de: a) sacarificação do material contendo amido a uma temperatu- ra abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material conten- do amido usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos; e b) fermentação usando um organismo fermentador; em que os passos a) e/ou b) são realizados na presença de uma mistura de endo-protease e exo-protease, em que a exo-protease constitui pelo menos 5% (p/p) da mistura de proteases em uma base de proteína de enzima protease total, e em que a endo-protease é selecionada de uma endo-protease da família M35 e a exo-protease é selecionada de uma exo-protease da família S53.

2. Processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido, caracterizado pelo fato de compreende os passos de: (a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura acima da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido na presença de uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito obtido no passo (a) usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos; (c) fermentação usando um organismo fermentador; em que os passos b) e/ou c) são realizados na presença de uma mistura de endo-protease e exo-protease, em que a exo-protease constitui pelo menos 5% (p/p) da mistura de proteases em uma base de proteína de enzima protease total, e em que a endo-protease é selecionada de uma endo-protease da família M35 e a exo-protease é selecionada de uma exo-protease da família S53.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sacarificação e a fermentação são reali- zadas simultaneamente.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a exo-protease constitui pelo menos 10% (p/p) da mistura de proteases em uma base de proteína de enzima pro- tease total, tal como pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pe- lo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, particularmente pelo menos 75%, mais particularmente a exo-protease constitui de entre 5 a 95% (p/p) em uma base de proteína de enzima protease total, particularmente 10 a 80% (p/p), particularmente 15 a 70% (p/p), mais particularmente 20 a 60% (p/p) e, ainda mais particularmente, 25 a 50% (p/p) da mistura de proteases na composição em uma base de proteína de enzima protease total.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a endo-protease e a exo-protease es- tão presentes em uma razão de 5:2 microgramas de proteína de enzima (EP)/g de sólidos secos (DS), particularmente 5:3, mais particularmente 5:4.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a endo-protease é selecionada da família M35, mais particularmente protease M35 derivada de Thermoascus aurantiacus, o polipeptídeo maduro da qual compreende os aminoácidos 1- 177 de SEQ ID NO: 1 ou um polipeptídeo tendo pelo menos 75% de identi- dade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferenci- almente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a exo-protease S53 é derivada de uma estirpe de Aspergillus, Trichoderma, Thermoascus, ou Thermomyces, particularmente Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Thermoascus thermophilus ou Thermomyces lanuginosus.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pe- lo fato de que a exo-protease S53 é selecionada de uma serina protease tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identi- dade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3; ou de uma serina protease tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo me- nos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que uma alfa-amilase está pre- sente ou é adicionada durante a sacarificação e/ou fermentação.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a alfa-amilase é uma alfa-amilase ácida, preferencialmente uma alfa-amilase fúngica ácida.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a enzima geradora de fonte de carboidratos é selecionada do grupo consistindo em glucoamilase, alfa-glucosidase, amilase maltogênica, pululanase e beta-amilase.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o produto de fermentação é um álcool, preferencialmente etanol, especialmente etanol para combustível, etanol potável e/ou etanol industrial.

13. Composição, caracterizado pelo fato de que compreende uma mistura de endo-protease e exo-protease, em que a endo-protease é sele- cionada de uma endo-protease da família M35 e a exo-protease é selecionada de uma exo-protease da família S53.