FI82711C

FI82711C - Ny enzymprodukt och dess anvaendning vid foersockring av staerkelse.

Info

Publication number: FI82711C
Application number: FI843542A
Authority: FI
Inventors: Paul Ducroo; Johannes Jacobus Maria Labout; Bertus Noordam
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1983-09-11
Filing date: 1984-09-10
Publication date: 1991-04-10
Also published as: FI843542A0; DK167029B1; JPH0542259B2; IE842301L; EP0140410B1; DK167029B2; DE3475209D1; ES8600391A1; ES535827A0; GR80325B; EP0140410A1; DK431384A; EP0140410B2; DK431384D0; FI82711B; CA1272973A; FI843542L; IE58094B1; JPS60149381A; CA1272973C

Description

8271 1

Uusi entsyymituote ja sen käyttö tärkkelyksen sokeroimises-sa - Ny enzymprodukt och dess användning vid försockring av stärkelse

Keksintö koskee tärkkelyksen entsymaattista hajottamista.

5 Tarkemmin sanoen keksinnössä esitetään uusi tärkkelyksen, erityisesti nesteytetyn tärkkelyksen sokeroimisessa käyttökelpoinen entsyymituote ja menetelmä sen valmistamiseksi.

Natiivin tärkkelyksen tiedetään sisältävän kahdentyyppisiä glukoosiyksiköistä koostuneita makromolekyylejä. Ensimmäi-10 nen molekyylityyppi, jota kutsutaan amyloosiksi, on lineaarinen ja koostuu yksinomaan a-1,4-sitoutuneista glukoosiyksiköistä. Tärkkelys sisältää n. 25 % amyloosia. Toinen molekyylityyppi, jota kutsutaan amylopektiiniksi on voimakkaasti haaroittunut ja sisältää a-1,4- samoin kuin a-1,4-sitou-15 tuneita glukoosiyksiköistä. a-1,6-sidosten kokonaismäärä on yleensä pienempi kuin 5 %.

Tärkkelyssokereita, konsentroitujen dekstroosisiirappien muodossa, tuotetaan nykyään useita miljoonia tonneja vuodessa kaksivaiheisella entsyymikatalysoidulla menetelmällä, 20 jossa (1) nesteytetään (tai ohennetaan) kiinteä tärkkelys ·; α-amylaasilla dekstriineiksi, joiden keskimääräinen poly- meroitumisaste on n. 7-10 ja (2) sokeroidaan saatu nestey-tetty tärkkelys (so. tärkkelyshydrolysaatti) amyloglukosi-daasilla, jolloin saadaan siirappia, jonka glukoosipitoi-25 suus on korkea (92-96 % koko kiinteän aineen määrästä).

Suuri osa kaupallisesti tuotetusta dekstroosisiirapista isomeroidaan sitten entsymaattisesti dekstroosi/fruktoosi-seokseksi, joka tunnetaan isosiirappina.

Käytetyt entsyymit, a-amylaasi ja amyloglukosidaasi eroavat 30 toisistaan kahdessa tärkeässä suhteessa. Ensinnäkin a-amy-| · laasi, joka on nk. endoentsyymi, hyökkää makromolekyyliin 2 82711 sattumanvaraisesti. Amykoglukosidaasi toisaalta on nk. ekso-entsyymi ja pilkkoo glukoosiyksiköitä järjestyksessä tärk-kelyshydrolysaatin dekstriinimolekyylin ei-pelkistävästä päästä. Toiseksi α-amylaasi hyökkää lähes pelkästään a-1,4-5 sidoksiin kun taas amyloglukosidaasi pilkkoo myös a-1,6-s idoksia.

Amyloglukosidaasista suositellaan käytettäväksi nimeä ekso- 1,4-a-D-glukosidaasi, Enzyme Committee-numero 3.2.1.3. ja systemaattista nimeä a-1,4-glukaani-glukohydrolaasi. Amylo-10 glukosidaasia kutsutaan myös AG:ksi tai glukoamylaasiksi ja on ymmärrettävä, että jäljempänä käytetyt termit amyloglukosidaasi, AG ja glukoamylaasi ovat toistensa synonyymejä.

Kun amylopektiini hajoaa vain osittain α-amylaasilla, koska tämä entsyymi hyökkää yksinomaan a-1,4-sidoksiin, haaroit-15 tuneiden oligosakkaridien todellinen hydrolyysi tapahtuu seuraavassa sokerointivaiheessa, jota katalysoi amyloglukosidaasi, joka hydrolysoi myös a-1,6-glukosidisidoksia, vaikkakin huomattavasti pienemmällä nopeudella kuin a-1,4-sidok-sia.

20 Yllä esitetyn kaupallisen menetelmän on pitkään katsottu olevan puutteellinen tietyissä suhteissa. Erityisesti nykyisin saatavissa olevat amyloglukosidaasit katalysoivat sekä sokeroitumis- että dekstroosin revergoitumisreaktiota, esim. dekstroosin konversiota isomaltoosiksi, substraatti-25 konsentraatiosta riippuvilla nopeuksilla.

Tällä tavoin tapahtuva sivutuotteiden muodostuminen on rajoittanut tärkkelyshydrolysaattien sokeroitumista dekstroo-siksi vähempään kuin 95 paino-%:iin dekstroosista, laskettuna kuiva-aineista (nimitetään tästälähin DX:ksi) siirapeis-30 sa, jotka sisältävät ainakin 33 paino-% kuiva-ainetta.

On totta, että sivutuotteiden muodostumista reversioreaktiois- 3 82711 ta voidaan ehkäistä n. 50%:iin saakka samanaikaisella, n.

1-2 %:n tärkkelyksen konversion lisäyksellä, jos käytetään suhteellisen suurta amyloglukosidaasin määrää yhdessä substraatin laimennuksen kanssa n. 15%:iin kuiva-ainetta (vrt.

5 US-patentti n:o 4,017,363), mutta näin saatavan dekstroosi-liuoksen konsentrointi tavanomaisen, korkeamman kuiva-ainepitoisuuden saavuttamiseksi kuluttaa energiaa.

Kun on yritetty edelleen kasvattaa DX-arvoa, on ehdotettu käytettäväksi haaroja katkaisevaa (debranching) entsyymiä, 10 yhdessä amyloglukosidaasin kanssa, siten että nesteytetyssä tärkkelyksessä läsnäolevat oligosakkaridit (jotka sisältävät a-1,6-glukosidisidoksia) hydrolysoituisivat tehokkaammin.

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa n:o 82302001.1, jul-kaisunro 0 063 909 selitetään pullulanaasityyppinen haaroja 15 katkaiseva entsyymi, jota tuottaa Bacillus acidopullulyticus-niminen Bacillus-bakteeri. Tämän julkaisun mukaan haaroja katkaisevalla entsyymillä on optimiaktiivisuus pH-välillä 3,5-5,5 (määritellyissä olosuhteissa) ja sen lämpöaktiivi-suusoptimi pHrssa 4-5 on vähintään n. 60°C. Jäännösaktiivi-20 suus 72 tunnin jälkeen 60°C:ssa on pH 5:ssä on 50 % tai enemmän. Tätä hapanpullulanaasia käytetään yhdessä jomman kumman sokeroimisentsyymin, amyloglukosidaasin tai 8-amy-laasin kanssa. Tämän hapanpullulanaasin käytön yhdessä amyloglukosidaasin kanssa on raportoitu johtavan suurempaan 25 dekstroosimäärään, joka on n. 1 % suurempi verrattuna siihen määrään, joka saadaan kun käytetään amyloglukosidaasia yksin samanlaisissa olosuhteissa. Vaihtoehtoisesti sama deks-troosimäärä saavutetaan käyttämällä n. puolta amyloglukosi-daasin määrästä.

30 US-patentissa n:o 4,335,208 esitetään amyloglukosidaasin ja toisen haaroja katkovan entsyymin yhdistetty vaikutus, nimittäin Pseudomonas amyloderamosa-bakteeristä saatavan isoamylaasin yhteisvaikutus. Tämän viitteen mukaan isoamy- 4 82711 laasin pH-optimi on lähellä amyloglukosidaasin vastaavaa siten, että jälkimmäisen määrää voidaan huomattavasti vähentää ja saadaan silti sama tai jopa suurempi dekstroosi-määrä kuin yksistään amyloglukosidaasilla. Prosessin vaka-5 vana haittapuolena on kuitenkin se, että isoamylaasi on läm-pölabiili. Tämä merkitsee sitä, että isoamylaasin läsnäollessa minkäänlainen sokeroituminen ei ole teknisesti mahdollista n. 55°C:n yläpuolella, kun taas amyloglukosidaasia itsessään käytetään normaalisti 60°C:ssa tärkkelyshydroly-10 saatin sokeroimisessa. Lisäksi Pseudomonas-suvun mikro-organismit eivät ole nk. GRAS-mikro-organismeja (Generally Recognized As Safe, yleisesti turvallisiksi havaittuja), siten, että näistä mikro-organismeista tuotettuja entsyymejä ei ole lupa käyttää elintarvikeprosessoinnissa USA:ssa.

15 US-patentissa n:o 3,897,305 esitetään amyloglukosidaasin ja Aerobacter aerogenes (Klebsiella pneumoniae)-bakteerista saadun pullulanaasin yhteiskäyttö, jonka esitetään lisäävän DX-arvoa jopa 2%:11a siirapeissa, jotka sisältävät ainakin 30% kuiva-ainetta. Amyloglukosidaasin säästöä ei kuitenkaan 20 käytännöllisesti katsoen saavuteta lainkaan, K. pneumoniae-bakteerista saatavan entsyymin epäedullisen pH-optimin (5,5-6,0) vuoksi, minkä vuoksi on välttämätöntä suorittaa sokeroiminen suhteellisen korkeassa pH:ssa, jossa amyloglukosidaasin aktiivisuus voimakkaasti laskee.

25 Marshall et ai. (FEBS Letters, voi. 9 n:o 2, heinäkuu 1970, sivut 85-88) raportoi, että Aspergillus niger-homeesta saatava amyloglukosidaasi sisälsi a-amylaasin kaltaista epäpuhtautta, joka ilmeisestikin on välttämätöntä tärkkelyksen täydelliselle hydrolyysille glukoosiksi. Kuitenkaan mitään 30 yrityksiä tämän epäpuhtauden karakterisoimiseksi tai eristämiseksi ei tehty.

Tämän keksinnön kohteena on tuottaa uusi hapanamylaasi, joka voidaan johtaa amyloglukosidaasi-preparaateista, joilla on 5 82711 oleellinen α-1,4-glukosidisia sidoksia pilkkova aktiivisuus. Uudella entsyymillä on a-glukosidisia sidoksia pilkkova aktiivisuus happamassa pHrssa, ja sitä voidaan käyttää tärkkelyksen ja edullisesti nesteytetyn tärkkelyksen sokeroimi-5 sessa.

Tämän keksinnön kohteena on edelleen esittää uusi menetelmä tärkkelyksen muuttamiseksi siirapeiksi, joissa on suuri dekstroosipitoisuus.

Ensimmäisen suoritusmuotonsa mukaisesti tämän keksinnön 10 kohteena on mikrobiaalinen hapanamylaasi,jota saadaan arnylo-glukosidaasista, ja jolla on oleellinen a-1,4-glukosidisia sidoksia pilkkova aktiivisuus. Tämä hapanamylaasi saa aikaan optimisokeroitumisen pH-välillä 3,5 - 5,0 lämpötiloissa n. 60 - n. 75°C. Tavanomaisissa säilytysolosuhteissa 15 se on stabiili useita kuukausia.

Keksinnön mukainen hapanamylaasi esiintyy komponenttina amyloglukosidaasipreparaateissa ja sitä voidaan saada oleellisesti puhtaassa muodossa sellaisista preparaateista käyt-;··; täen sopivaa eristystekniikkaa, kuten korkeapainenestekro- 20 matografiaa, mikä on myös suositeltavin menetelmä.

Vaikka alla selitettyä uutta hapanamylaasia saadaan kaupallisesti saatavana olevasta, Aspergillus niger-mikro-organis-mista johdetusta amyloglukosidaasista, ja tämä on suositeltavin amyloglukosidaasi, on huomattava, että useissa mikro-25 organismisuvuissa on lajeja, joiden tiedetään tuottavan amyloglukosidaasia. Mitä tahansa näistä ja kaikkia tällaisia amyloglukosidaaseja voidaan käyttää tämän keksinnön . mukaisen uuden hapanamylaasin lähteenä. Edullisesti lähtee nä käytetään fungaalista amyloglukosidaasia. 1

Aspergillus niger-homeesta johdetun hapanamylaasin termosta-biilisuus on parempi kuin A. niger-homeesta johdetun amylo- 6 82711 glukosidaasin. Myös mainitun hapanamylaasin stabiilisuus ja jäännösaktiivisuus ovat parempia kuin amyloglukosidaa-sin vastaavat.

Keksinnössä esitetään edelleen uusi entsyymituote, jolla 5 on sekä a-1,4- että ct-1 ,6-sidoksia pilkkovaa aktiivisuutta happamassa pH:ssa, joka tuote sisältää amyloglukosidaasia ja uutta hapanamylaasia suhteessa ainakin 0,16 AAU-yksikköä AGI-yksikköä kohti, kuten jäljempänä määritellään.

Tällaisia preparaatteja voidaan tehdä lisäämällä uutta ha-10 hapanamylaasia tunnettuun amyloglukosidaasipreparaattiin jälkimmäisen hapanamylaasipitoisuuden lisäämiseksi.

Amyloglukosidaasi on mieluiten Aspergillus niger- amyloglukosidaasia ja sitä rikastetaan uudella hapanamylaasilla, joka myös on johdettu Aspergillus niger-homeesta.

15 Keksinnön mukainen uusi entsyymituote voidaan valmistaa lisäämällä uutta hapanamylaasia, mieluimmin oleellisesti puhtaassa muodossa, amyloglukosidaasiin. Vaihtoehtoisesti voidaan löytää amyloglukosidaasia tuottava kanta tai sen variantti tai mutantti, mieluiten sellainen, joka kuuluu 20 Aspergillus-sukuun ja kaikkein mieluimmin A. niger-lajiin, joka kanta tuottaa amyloglukosidaasia, jolla on suhteellisen suuri amylaasipitoisuus verrattuna alalla tunnettuihin amyloglukosidaaseihin, missä tapauksessa entsyymituote voidaan saada viljelemällä mainittua mikro-organismia so-25 pivassa ravintoväliaineessa, joka sisältää hiili- ja typpi-lähteitä ja epäorgaanisia suoloja. Uusi entsyymituote voidaan myös valmistaa parantamalla selektiivisesti hapanamy-laasin fermentointiolosuhteita tai osittain inaktivoimalla amyloglukosidaasia olemassa olevissa preparaateissa. 1

II

Tässä keksinnössä käytettävä amyloglukosidaasi ja myös 7 82711 uusi entsyymituote ovat edullisesti transglukosidaasivapai-ta, koska viimemainittu entsyymi voi aiheuttaa ei-toivottu-jen sivutuotteiden muodostumista. Tämä voidaan saada aikaan esim. tuottamalla amyloglukosidaasi transglukosidaasi-nega-5 tiivisista kannoista tai poistamalla transglukosidaasi käy tetyistä amyloglukosidaasipreparaateista; esimerkiksi bento-niitilla.

Uudessa keksinnön mukaisessa entsyymituotteessa on vähintään 0,16 AAU-yksikköä hapanamylaasia AGI-yksikköä kohti.

10 Yksi hapanamylaasi-aktiivisuusyksikkö (AAU, one unit of acid amylase activity) tässä käytettynä tarkoittaa sitä entsyymimäärää, joka hydrolysoi 1,0 mg liukoista tärkkelystä (100 % kuiva-aineesta) minuutissa vakio-olosuhteissa (pH 4,2; 60°C) tuotteeksi, joka tunnetunvahvuisen jodiliuok-15 sen reaktion jälkeen antaa 620 nmrssä saman absorbanssi- arvon kuin värireferenssi jäljempänä kuvatussa joditärkke-lys-amylaasi-kokeessa (Iodine Starch Amylase Test). Yksi amyloglukosidaasiaktiivisuusyksikkö (AGI, one unit of amyloglukosidase activity) tässä käytettynä tarkoittaa si-20 tä entsyymimäärää, joka vapauttaa 1 ymoolin dekstroosia liukoisesta tärkkelyksestä (100 % kuiva-aineesta) minuutissa 60°C:ssa tärkkelyksen hajoamisen optimiolosuhteissa, kuten jälempänä on selitetty. Uusi entsyymituote sisältää mieluiten n. 0,2 - n. 4,5 AAU-yksikköä hapanamylaasia yhtä 25 AGI-yksikköä kohti, kaikkein mieluiten n. 0,3 - n. 3,0 AAU-yksikköä AGI-yksikköä kohti ja erityisesti n. 0,7 -n. 1,5 AAU-yksikköä AGI-yksikköä kohti.

On yllättäen havaittu, että hapanamylaasilla rikastetut amyloglukosidaasipreparaatit, kun niitä käytetään nestey-30 tetyn tärkkelyksen sokeroimisessa, johtavat odottamattomasta ja merkittävästi korkeampiin dekstroosimääriin lyhyem-missä sokerointiajoissa. Tulokset ovat verrannollisia niihin, jotka saadaan amyloglukosidaasin ja hapanpullulanaa-: · sin vaikuttaessa samanaikaisesti, kuten on kuvattu edellä- 8 82711 mainitussa eurooppalaisessa patenttihakemuksessa, julk. n:o 0 063 909, samanlaisissa olosuhteissa.

Vastaavasti keksinnössä esitetään edelleen menetelmä tärkkelyksen muuntamiseksi siirapin muodossa olevaksi dekstroosik-5 si, jossa menetelmässä tärkkelys sokeroidaan valinnaisesti ja mieluiten nesteytysvaiheen jälkeen tärkkelyshydrolysaa-tin muodostamiseksi, uuden entsyymituotteen läsnäollessa, kuten yllä on määritelty. Uuden entsyymituotteen käytöllä menetelmässä on se etu, että voidaan käyttää oleellisesti 10 pienempi määrä amyloglukosidaasia tärkkelyshydrolysaattien sokeroimiseen, jolloin saadaan suurempia glukoosisaantoja entsyymiyksikköä kohti. Uudella entsyymituotteella on myös se suuri etu, että tärkkelyksen ja tärkkelyshydrolysaattien sokeroinnissa voidaan käyttää suurempia substraattikonsent-15 raatioita. Suurempien substraattikonsentraatioiden käyttö pienentää oleellisesti haihdutuskustannuksia.

Sokerointi suoritetaan sopivasti pH-alueella 2,5 - 6, mieluimmin alueella n. 3 - n. 5 ja mieluiten alueella n. 4,0 -n. 4,5. Prosessi suoritetaan sopivasti lämpötila-alueella 20 40 - 70°C, mieluummin alueella n. 50 - n. 65°C, reaktioai- kojen vaihdellessa välillä 15-96 tuntia maksimisaantojen saamiseksi.

Amyloglukosidaasin osuus tärkkelyshydrolysaattien sokeroi-misessa on edullisesti tavallisesti välillä n. 8 - n. 30 25 AGI-yksikköä ja mieluiten n. 14 - n. 22 AGI-yksikköä kuiva-ainegrammaa kohti.

On myös havaittu, että tärkkelyksen tai tärkkelyshydroly-saatin sokeroimista voidaan edelleen parantaa, kun prosessi suoritetaan uuden entsyymituotteen läsnäollessa, kuten yllä 30 on määritelty, ja joka myös sisältää tehokkaan määrän hapan-pullulanaasia. Tämän keksinnön tarkoituksiin käytettävä sopiva hapanpullulanaasi on esimerkiksi eurooppalaisessa patenttihakemuksessa, julk. n:o 0 063 909 esitetty hapanpullu-

II

9 82711 lanaasi. Uuden entsyymituotteen kanssa yhdessä käytettävän hapanpullulanaasin edulliset konsentraatioannokset ovat välillä 0,005 - 5 pullulanaasiyksikköä (PU), jotka yksiköt on määritelty mainitussa eurooppalaisessa patenttihakemuksessa. 5 Uuden entsyymin käytöllä menetelmässä yhdessä hapanpullulanaasin kanssa on se etu, että voidaan saavuttaa odottamattoman ja erityisen suuria dekstroosimääriä lyhyillä sokeroi-misajoilla.

Toinen sopiva menetelmä hapanamylaasin määrän määrittämisek-10 si entsyymipreparaateissa on muunnettu Phadebas-amylaasi-koe, joka on kuvattu alla. Tässä käytetty hapanamylaasiak-tiivisuusyksikkö (AAU') määritellään entsyymimääränä, joka antaa yhden absorbanssiyksikön 620 nm:ssä muunnetuissa Phadebas-amylaasikoe-olosuhteissa, jotka on selitetty jäl-15 jempänä. Arvo vähintään 0,16 AAU-yksikköä hapanamylaasia AGI-yksikköä kohti jodi-tärkkelys-amylaasikoe-olosuhteissa, kuten edellä on määritelty, vastaa arvoa ainakin 0,12 AAU' -yksikköä hapanamylaasia AGI-yksikköä kohti muunnetun Phade-bas-amylaasikokeen olosuhteissa. Jälkimmäisen menetelmän 20 haittapuoli on synergistinen vaikutus, joka ilmenee, kun amyloglukosidaasi on läsnä. Lisäksi on hyvin vaikeaa tai jopa mahdotonta automatisoida tätä menetelmää.

On ymmärrettävä, että ellei toisin mainita, tässä selityksessä mainitut AAU-arvot on esitetty muunnetun jodi-tärk-25 kelys-amylaasikoemenetelmän mukaisina yksiköinä.

Seuraavat koemenetelmät ja esimerkit kuvaavat keksintöä.

JODI-TÄRKKELYS-AMYLAASI-KOE

Tämä menetelmä perustuu jodi-tärkkelys-kompleksien absor-banssin mittaamiseen amyloglukosidaasi-inhibiittorin läsnä-30 ollessa. Amyloglukosidaasi-inhibiittorina käytettiin Acarbo-sel Bay g 5421:tä, vrt. Schmidt et ai., Naturwissenschaften 10 8271 1 64 (1977) 525.

Reagenssit - Liukoisen tärkkelyksen 2 % liuos (Lintner, J. T. Baker Co). sitraattipuskurissa (0,013 M, pH 4,2) 5 - Jodi-kantaliuos, joka sisältää 22 g jodia ja 44 g kalium- jodidia litraa kohti tislattua vettä.

- Laimennettu jodiliuos: 4 ml jodi-kantaliuosta ja 40 g kaliumjodidia liuotetaan tislattuun veteen. Laimennetaan 1 litraksi tislatulla vedellä.

10 - Väri-referenssi, joka sisältää 250 g koboltti(2)-kloridia 6 aq. ja 38,4 g kaliumbikromaattia litraa kohti 0,01 N HC1.

Menetelmävaiheet Tärkkelysliuos (20 ml) esikuumennettiin 60°C:ssa 20 minuutin ajan. Alkaen ajankohtana 0 tasan 10 ml entsyyminäytet-15 tä (sisälsi 1,4 - 1,8 AAU/ml; huoneenlämmössä) lisättiin substraattiliuokseen. Jos entsyyminäytteessä uskotaan olevan amyloglukosidaasia, entsyyminäytteeseen lisätään etukäteen amyloglukosidaasi-inhibiittoria Bay g 5421 konsent-raationa 1 yg/AGI. 20 minuutin inkubaation jälkeen 1 ml 20 liuosta siirrettiin 5 ml:aan laimennettua jodiliuosta.

Absorbanssi mitattiin välittömästi 620 nm:ssä 1 cm kyve-tissä käyttäen tislattua vettä nollaliuoksena. Tämä siirtoja mittausvaihe toistettiin 1 min:n välein kunnes lukemien havaittiin olevan matalampia kuin värireferenssien lukemat.

25 Värireferenssin kanssa samansuuruisen absorbanssin saavuttamiseen tarvittava aika T määritettiin graafisesti.

Inkubointiliuoksessa läsnäolevan hapanamylaasiaktiivisuuden

II

11 8271 1 määrä AAU-yksiköissä laskettiin kaavasta 400/T, jossa 400 tarkoittaa inkubointiliuoksen liukoisen tärkkelyksen määrää mgroina, T tarkoittaa tarvittavaa reaktioaikaa (min.).

MUUNNETTU PHADEBAS-AMYLAASIKOE

5 Vakio Phadebas-amylaasikoe (Marciniak et ai., Starch J4 442 (1982)) muunnettuna happaman pH:n olosuhteisiin ja lämpötilaan 60°C suoritettiin seuraavasti. Kierrekorkkiseen lasiputkeen pipetoitiin 1 ml entsyyminäytettä, joka sisälsi 10 AGI-yksikköä, ja 4,0 ml asetaattipuskuria (0,3 M, pH 4,0).

10 Sitten lisättiin Phadebas-tabletti (Pharmacia, erä n:o ME

74112) ja kun oli sekoitettu (vortex) 15 sekuntia putki suljettiin ja pantiin 60°C:n vesihauteeseen. Reaktio pysäytettiin tasan 15 minuuttia tabletin lisäyksen jälkeen lisäämällä 0,3 N NaOH:a (5 ml) ja ravistamalla. Sentrifugoinnin 15 jälkeen supernatantti poistettiin ja absorbanssi (optical density, OD) mitattiin (välillä 0,2 - 2,0) 1 cm:n kyvetissä 620 nm:ssä suhteessa tislattuun veteen. Nollaliuos (tislattu vesi) kävi läpi samat vaiheet. AOD on hapanamylaasi-aktiivisuuden mitta. Yksi hapanamylaasiaktiivisuusyksikkö 20 (AAU1) määritellään entsyymimääränä, joka vastaa yhtä ab- sorbanssiyksikköä (ΔΟϋ = 1) 620 nm:ssä näissä koeolosuhteissa.

AMYLOGLUKOSIDAASIMÄÄRITYS

Liukoista tärkkelystä (2 ml; Lintner Starch, J. T. Baker Co.) konsentraationa 16 g/1 asetaattipuskuria (0,04 M, pH 4,3) 25 esikuumennettiin 60°C:ssa 5 minuutin ajan ja sitten lisättiin 2 ml:aan entsvymiliuosta (0,15 - 0,55 AGl/ml). Sekoittamisen jälkeen suspensiota inkuboitiin 60°C:ssa. Reaktio pysäytettiin 15 minuutin kuluttua lisäämällä 20 ml NaOH:a (0,005 N) ja glukoosikonsentraatio mitattiin määritettiin 30 glukoosioksidaasimenetelmällä.

12 8271 1 SOKEROIMISMENETELMÄ

Sokeroimisprosessi suoritettiin maltodekstriinillä MD03 (Roquette), jossa on dekstroosiekvivalentteja (DE) 16,5.

Tämä substraatti sisältää joitakin oligosakkarideja, joilla 5 on fruktosyylipääteryhmiä, joista sokerointivaiheessa muodostuu jopa 0,4 - 0,5 % disakkaridia, maltuloosia. Tämän substraatin liuokseen (33 % kuiva-ainetta) lisättiin 2100 AGI-yksikköä 100 g kuiva-ainetta kohti. pH säädettiin arvoon 4,2 1 N etikkahapolla. Seosta inkuboitiin 60°C:ssa ve-10 sihauteessa. Reaktioseoksesta otettiin 0,1 ml:n eriä 16, 24, 48, 64, 72, 80 ja 92 tunnin kuluttua ja lisättiin 3 ml: aan tislattua vettä suljetussa koeputkessa.

Kukin laimennettu näyte pantiin välittömästi kiehuvaan vesihauteeseen 10 minuutiksi entsyymin inaktivoimiseksi. Jääh-15 dyttämisen jälkeen lisättiin n. 150 mg kuivattua Amberlite MB-3 hartsia (BDH) kuhunkin näytteeseen HPLCitä häiritsevien suolojen poistamiseksi. Yhden tunnin seisottamisen jälkeen hartsi poistettiin ja 40 yl näytteestä injektoitiin HPLC-laitteeseen glukoosin määrittämiseksi menetelmällä, jonka 20 Scobell et ai. ovat esittäneet (Cereal Chem. , 5j4 (4) , ( 1977) 905-917), muunnettuna siten, että käytettiin Bio-Rad HPX-87c 300 mm-kolonnia. Määrityksen tarkkuuden havaittiin olevan 0,1 - ja vastaavasti 0,2-prosenttisesti täydellisiä, glukoosikonsentraation vaihdellessa välillä 90 - 96%. 1 n Näissä olosuhteissa saatiin glukoosin huippuarvot 94,6 - 94,8 % käyttämällä nykyään kaupallisia amyloglukosidaasipre-paraatteja, joita tuottavat Miles (DIAZYME ja OPTIDEX),

Novo (AMG) ja Gist-Brocades (AMIGASE GM).

Esimerkki I

Hapanamylaasin eristys ja identifiointi

Amyloglukosidaasipreparaatissa läsnäolevien amylolyyttisten 13 8271 1 komponenttien identifoimiseksi ja eristämiseksi A. niger-homeen trans-glukosidaasinegatiivisesta kannasta tuotettu amyloglukosidaasi-entsyymipreparaatti kromatografoitiin korkeapainenestekromatografiällä. Järjestelmä koostui 5 anioninvaihtokolonnista ja geelisuodatuskolonnista kytkettynä sarjaan. Kun osa AG-preparaatista oli injektoitu io-ninvaihtokolonnin päälle, liuotin, joka oli 0,05 M natrium-asetaattipuskuri, pH 4,0, johdettiin molempien kolonnien läpi kunnes positiivisesti varautuneet ja varautumattomat 10 komponentit olivat saavuttaneet geelikolonnin. Ioninvaihto-kolonniin adsorboituneet molekyylit eluoitiin suolagradien-tilla (0,05 - 1,65 M natriumasetaattipuskuri, pH 4,0) ja sitten geelikolonniin sitoutuneet molekyylit eluoitiin alkuperäisellä liuottimena.

15 Tällä menetelmällä saavutettiin erinomainen erottuminen, kuten voidaan nähdä selitykseen liitetystä kuviosta 1, amylolyyttisten entsyymien välillä, ja sekä amyloglukosidaa-si-isomeerit että a-amylaasi identifioitiin jakamalla eff-luentti fraktioihin ja inkuboimalla kerätty fraktio sopi--* : 20 vien substraattien kanssa, so. maltoosin ja liukoisen tärk kelyksen kanssa (10% kuiva-ainetta). Eristetyt amylogluko-: sidaasikomponentit tuottivat glukoosia tärkkelyksestä ja maltoosista, kun taas eristetty α-amylaasi tuotti tärkkelyksestä tyypillisiä oligosakkarideja. 1 2 3 4 5 6 a-amylaasin karakteristiset tiedot, erityisesti suhteessa 2 pH-arvoon ja lämpötilaan, määritettiin käyttäen liukoista 3 tärkkelystä substraattina. Muodostuneilla päätuotteilla 4 (di- ja trisakkaridit) oli pH-optimi 3,5 - 5,0, osoittaen, 5 että entsyymi on todellinen hapanamylaasi (AA). Lämpötilan 6 vaikutus tutkittiin pH:ssa 4,0 ja hapanamylaasin optimi oli välillä 65 - 70°C, mikä määritettiin muodostuneiden tri-sakkaridien käyttäytymisen perusteella. Nämä tulokset osoittavat, että hapanamylaasi on tarpeeksi stabiili vakiossa 14 8271 1 sokeroimislämpötilassa 60°C. AA:ta sisältävät fraktiot, joissa entsyymin aktiivisuus oli stabiili yli 3 kuukautta, käytettiin rikastamiskokeisiin.

Esimerkki II

5 Sokerointi hapanamylaasilla rikastetuilla näytteillä

Sokerointi suoritettiin maltodekstriinillä MD03, jossa oli dekstroosiekvivalentteja (DE) 16,5, ja tämän substraatin liuokseen (33 % kuiva-ainetta) lisättiin 2100 AGI-yksikköä 100 g:aa kuiva-ainetta kohti. Lisättiin myös eri määriä 10 hapanamylaasia, jonka aktiivisuus oli etukäteen määritetty edellä selitetyllä Phadebas-menetelmällä. Sokeroinnin aikana tärkkelyshydrolysaatti pidettiin pH:ssa 4,0 - 4,2 ja lämpötilassa 60°C. Näissä olosuhteissa sokerointiaste ja glukoosin muodostuminen mitattiin 17. ja 91. tunnin välillä. 15 Kokeet hapanamylaasilla rikastetuilla näytteillä, jotka olivat täysin transglukosidaasivapaita, osoittivat, että glu-koosisaanto kasvoi ja sokeroimisaika lyheni, kuten voidaan nähdä alla esitetystä taulukosta I.

15 8271 1 ____________tn —-

1 to :tO I

Λ rH M

0) i-H (-1 in in (fl in n m ^ 1¾ :nj:(0

iH *. k k k *v ^ (jj S+J

on -=τ ·=τ -¾ 4j- =4 -4 -4 ^ ,-ιι

ON On On ON ON ON ON (¾ (1)-H

-Ρ Ό (0 0)0 N S OO CO CO ^3- ITi H 3-1-1

C\J *v »S ·, ·\ ·ν 1—l QJ

(0 t·— -¾ 4 -¾ 4 =r 4 -¾ ρ β:(0

.—. OJ ON ON ON ON ON ON ON +J I

dp in Q> tn h ^ -H 3 (0 0) 01 t— t— O VO O -=3- O 3 ,£) t3 O 3 lA ·»·,·*·» »s »s p» 3 <1)0) +) 3 no ^ ^ in 4 in ^ in 3 Ό 3 p ON ON ON ON ON ON ON g <0>i

3 -Ρ Λ -P

(0 p (¾ +J

tn (0 I—( CO OO ON CO +J 0)

•H M oO »s *\ *v *\ I I -P (0 -P

tn -H^r 4 4 -¾ 4 4 ι i <o .η-η

O <0 ON ON ON ON ON 4J1HP

Ο ·Η -H 3 ao .X P Ε -P :3 3 3 rHvooNONoooot^- — 0) 6 <—1 -HiH * *^ *-\ *s *V V *s 3 O O 4 4 4 =4 4 =4 4 4 to 3

P ON ON ON ON ON ON ON 03 3-P

a) <n 3 a) .X -h Ex) O in to (M VO O ON H -P 3 03-¾- ·*»*·***»* *\ ». <0 33 oj nj η (i ^ in 4- in r0 -pen

H ON ON ON ON ON CT\ ON p JJ -H

(0 «0 >

O &i -P -H

►X rl N N N m O 4 0) -Η -H

f S K Λ K N s ρ ε -P

o H on o -h oj m 4Γ =t Pv -- -X

V-} CO ON ON ON ON ON ON -H (0

D in (0 -H

<!____(d -H tn

Eh to tn (0 Ό tt) (0

•H <d p—I

M tn Ή >1 . . o 4 ο >ι ε --· 0-0 LfN ΓΟ O OJ OO .X ε 3 . \ o o oj m o 4 co 4 3 3 3 ►3 »S »V K »K *N ^ C(d < O o O 0 f—t oj =4 Cr> 3 Λ — < 0 & 3 • - H to .3 : : ;__>1 xi M § :«J 3 (0 o >1 -P tn

< t— LTN LfN 0 O oj :3 -P 0) W

-;- \ ^ I Ο ιΗ ΓΟ f— LTN OO W-P-PO) ---- — .Q I »-v 3 :3 3 0) o oooor-ioj 3 tn 3 x

:: c tn -Η ε O

c Ή r-l

:(0 Ή -H

ρ — :3 tn tn a) »0 :0 M 3 M Cm ή ,Χ -H (0 O 3 Ή .X :0 r-ι < oo co co to to co oo ,¾ au -h λ; >1 OOOOOOO '“j S U3 -H e - (0 ·*·*·».·*·»·*·>. 3 f-H -X 3 3

CD w OOOOOOO <D >ι -X I

e :3 -Ρ I >1 tn < 3 O - I >1 tn 3 O 3 h :3 0) ft < 0) ------πε < <! x 3 .. .. ..

*... -P ^ ^ ^ O h oj ro 4 in vo n <0 x> o ·*" :fu *· v__, v__.

_ g e |_ 16 8271 1

Taulukon I tulokset osoittavat, että hapanamylaasi lisää glukoosin saantoa 94,7 %:sta 95,1 &:iin näissä olosuhteissa, kun sokerointiaika optimisaantojen saavuttamiseksi lyheni 70 tunnista 24 tuntiin. Tämä tekee hapanamylaasin käytön 5 kaupallisesti tärkeäksi ja tuloksiltaan vastaavaksi pullu-lanaasilla saatujen kanssa. Osa amyloglukosidaasista voidaan korvata hapanamylaasilla kunnes saadaan taloudellisesti miellyttäviä glukoosisaantoja ja sokerointiaikoja.

Esimerkki III

10 Käyttäen esimerkin I mukaista sokerointimenetelmää suoritettiin kokeita, joissa käytettiin amyloglukosidaasia normaaliannoksina ja puolet normaaliannoksesta sekä puolet normaaliannoksesta amyloglukosidaasia rikastettuna hapanamylaasilla ja hapanpullulanaasilla, joka on selitetty eu-15 rooppalaisessa patenttihakemuksessa, julk. n:o 0 063 909, sekä yksinään että yhdistelmänä. Yksi pullulanaasiyksikkö (PU) määritellään entsyymimääränä, joka on tarpeen tuottamaan 1 ymoolin pelkistävää sokeria pullulaanista minuutissa vakio-olosuhteissa. Tulokset on esitetty taulukossa II.

n 17 8271 1

t·— -3 OO LTn VO t"- 1/0 I

0\ k s k ·* »\ ^ tn —«

oo a- ^ in ιλ in m tn ia red I

ON ON CT\ CTn ON CTN ON J3 I—I Λί

0) MP

Ό Jj m!

t— 0— O t-- -=T LH on id g -P

M »\ »v *n k »s JO r—Il ta o~ m ιλ in ia m in cu q>-h

tn on ot' o> on on at σι +JO

*— m to <u O

<#> -H M G 'M

“ a) VO M O LTN M LAN 3 rH Q) G tr\ »v ^ ►**.·*·». g E m O G vo m m m ia in tn +i im +j g σι m on m on en σ\ a> tn m G -p e (0 a) G G Λ Ό cd td j· oo ia -a· o G a> a) W s-!*! OO *v K V G T3 H M 3 e h ^ A A A IA g Id >i

tn <d ON ON ON ON ON ON ON ,G -P

O -H G (U -P

O -P -P Φ

X G LTV OO O VO LAN ON (M 3 -P Id -P

G Ή *i rs K s td MM

M O m rl -31 IA -3- ΙΛ ΙΓι -P MP

O P 3 ON ON ON On ON On ON -H G :<d

1) g -P :G

X '-r tl) g 0 on O 3· A (A 3· (NJ G'"

t/i 3· K ^ *s »- K K id G

rvj c\j t— M oo oo o 3 tn G-P

ON OO ON On ON On ON tn G <U

•H g Ό -P 3

co H 3 m h 3 on (d GG

H 0— k k >v v r k G +J in

H rH O O LT> 0- OO OO O P -p-H

On CO CO CO OO oo ON G (d >

O CU -P -H

« D -H -rl

«---P g -P

D CU — P-i ►G 00 -H (d

D q i i | oj | cnj cnj tnid -H

< bo id -H tn

H \ I I I rH I M M <0 W G

:o 'O id fo

0^ *H iO rH

W rH >1 . . o >1 e — .--X g (d

‘ 3 G id G

\ O- o- 3 3 vo VO M G G

’ COM^OOb-t-CNJlru J 5 W

— < o o ·>.»*.*». i ^ o 9^2 : , . < < -^ o o m m oo oo h 5 ί . >ι Λ :' ·' \ oo co oo oo ^ ;G 3 id - | i oo oo no i vo r? ™ 2 co m ^ il ^ ^ i :f5 -91}¾ < O JO O O rH rH “ +J 9 31 — < e ^ tn ad G aj

^ 0) tn G M

tn -h g o

\ -H «H X

- oo CO OO OO CO OO OO _ "'"J

CO M r-v OOOOOOO JH-T 2 Ϊ < O (d Kr-»*»*.*· <<v^ ooooooo «5 <2

_ _ GM rX ·ϋ M

---- Pxi :rxj M X >1

Il M g tn M g mg id m x tn id * US'” O A A A A A A . 2 ^ ·* : o$ C »»»»*.» »^ ;g -p I >i « C £ <2 —* M O O O O O O 9 2 " ' ^

3 e m tnGCooM

tn -h o :m a) <c < a»

— "-I e__Mg 3 3 X

a> .. .. ..

' - · - -P r-N ^ r-v

.^1° M oj OO -3 LAN VO O— Cd JO O

Ί :«J *· .. . .

_[_, % e I__ 18 8271 1

Taulukon II tulokset osoittavat, että glukoosimäärä saavutti huippunsa n. 80 tunnin kuluttua kun käytettiin puolet normaalista amyloglukosidaasista (AG) ja hapanamylaasi (AA)-rikastustekijää, mikä on hieman pitempi kuin 70 tunnin so-5 kerointiaika käyttäen normaalia amyloglukosidaasiannosta.

Kuitenkin glukoosin huippuarvo kasvoi 94,7 %:sta 95,5 %:iin, mikä saattaa johtua isomaltoosin vähäisemmästä muodostumisesta, mikä taas johtuu käytetystä amyloglukosidaasin pienemmästä määrästä.

10 Samanlaisia tuloksia saatiin, kun pullulanaasia ja amylo-glukosidaasia käytettiin yhdessä, vaikka merkittäviä eroja glukoosin tuotossa havaittiin lyhyemmillä sokerointiajoilla. Yhdistelmällä hapanamylaasi, pullulanaasi ja puoli annosta amyloglukosidaasia tapahtui nopeampi sokerointi, saatiin 15 suurempi glukoosisaanto entsyymiaktiivisuutta ja tuntia kohti.

Nämä tulokset osoittavat, että hapanamylaasi oleellisesti ·.: edistää tärkkelyksen hydrolyysiä sokerointivaiheessa. Tämä ·: yllättävä vaikutus kilpailee hapanpullulanaasin vastaavan 20 vaikutuksen kanssa, vaikka nämä kaksi entsyymiä toimivat perusteiltaan erilaisilla mekanismeilla. Kun hapanpullulanaasin on ajateltu olevan endo-a-1,6-sidoksen katkaisija, hapanamylaasilla on ot-1 ,4-sidoksia pilkkova aktiivisuus.

Esimerkki IV

25 Uuden hapanamylaasin käyttäminen tärkkelyksen sokeroinnissa tekee mahdolliseksi glukoosin huippuarvojen kasvamisen, sokerointiaikojen lyhentymisen ja välttämättömän amyloglu-kosidaasi/kuiva-aine (DS, dry solids)-suhteen pienenemisen. Toinen etu käytettäessä hapanamylaasia nesteytetyn tärkke-30 lyksen sokeroinnissansubstraattikonsentraation lisääminen, joka silloin on mahdollista mikä voi oleellisesti pienentää haihdutuskustannuksia.

Il 19 8271 1

Substraattia (MD03) eri kuiva-ainemäärinä sisältävien liuosten pH säädettiin arvoon 4,2 ja ne kuumennettiin 60°C: seen. Lisättiin puolet normaalista AG-annoksesta (10,5 AGI/gDS) ja 9-kertainen määrä hapanamylaasia. Eri väliajoin 5 otettiin näytteitä ja analysoitiin ne kuten esimerkissä I

on selitetty. Suoritettiin myös kontrollikokeita normaaleilla ja puolikkailla AG-annoksilla ilman lisättyä hapanamylaasia. Tulokset on esitetty alla taulukossa III.

TAULUKKO III

Sokerointiaika glukoosin v maksimimäärä EPS») AGI/rDS AAU/AGI_____L%!__ 25 10, 5 0, 074 140-165 95,6 25 10,5 0, 74 64 96,1 29 10, 5 0, 074 140-165 95,3 29 10,5 0,74 90 95,8 33 10, 5 0, 074 140-165 94,6 33 10,5 0, 74 90 95,2 37 10, 5 0,074 140-165 93,9 37 10, 5 0, 74 71 94,7 45 10, 5 0, 074 140-165 91,3 45 10, 5 0, 74 71 92,8 33 21 0, 074 _71_ 94,7 *) maltodekstriini MD03

Taulukon III tiedot osoittavat, että kun amyloglukosidaasia 10 käytetään yhdessä uuden hapanamylaasin kanssa, kuiva-ainemäärä (DS) voidaan nostaa glukoosimäärien maksimoimiseksi, sellaiseksi, että ne ovat suurempia kuin ne, joita saadaan kun käytetään kaupallisia amyloglukosidaasipreparaatteja samanlaisissa olosuhteissa. Esimerkiksi glukoosin huippu-15 arvo 94,7 % saavutettiin kaupallisella amyloglukosidaasi-preparaatilla 33 %:n kuiva-aineella. Sama glukoosin maksimiarvo saavutettiin 10-kertaisella hapanamylaasilisäyksellä ja puolella AG:n määrästä 37%:n kuiva-aineella.

20 82 71 1

Esimerkki V

Muista lähteistä saatavia happamia a-amylaaseja, so. bak-teerientsyymejä, jotka ovat aktiivisia happamalla pH-alueel-la ja 60°C:ssa, voidaan myös käyttää parantamaan amyloguko-5 sidaasilla aikaansaatua sokerointia. Siten käytettiin bakteerin ATCC 31199' (ks. GB-julkaisu n:o 1539694 CPC International) raakaa fermentointinäytettä, joka sisälsi a-amylaasiaktiivi-suutta, sokerointikokeessa amyloglukosidaasin kanssa. Käyttämällä raakaa näytettä suhteessa AAU/AGI = 0,74, saa-10 tiin merkittävästi suurempia glukoosimääriä verrattuna pelkästään amyloglukosidaasilla kontrollikokeessa saatuihin, vaikka arvot olivat pienempiä kuin ne, jotka saatiin käytettäessä vastaavaa määrää fungaalista hapanamylaasia.

Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa IV.

21 8271 1

C\J ΓΟ VO I

rH ·» ·ν I

H ^

ON ON

O CM

LO v -. I

on -=r -=r I

on on

VO rH CM

OO * *s *V

_ oo ro tn c#> (0 σ\ σ\ σ\ — tn O -h co in cm

Jj m H ·» ·» k c g t— cm ro in

id C on C7V C7N

cd 3 W 4-1

•H ™ H H

tn λ -=3- ·" ·> k n vo cm ro in O 5 on on σν cd rt >Γ| ,π 4J ro vo t— td pc ·> *» *.

=T O rH ^T

q On On On

M

<D

> M ^ ^ ^ H O O »v v

Ui oo o ^r

O CO ON ON

*

X

3 CM h-

P1 * ·* I

P CM O rH | -'· - < oo co - Eh_____ co

-··: Q

• - to in in in

\ ».VV

• - M o O O

ϋ rH rH rH

<

- - M

O ·=» c c— -¾- -=r \ O t~- Γιο «k P* «.

< o o o < _____

( rt! M

i Se ... ία -S tn |j .·:·· fS Sl 0) ^

-P

ίο + + :cd

!3 O O O

< < < 22 8271 1

Esimerkki VI

Sokerointikokeet suoritettiin samalla menetelmällä kuin edellä on selitetty. Substraattia (MD03, 33 % DS) sisältävien liuosten pH-arvot säädettiin välille 3,5 - 5,0 ja ne 5 kuumennettiin 60°C:een. Lisättiin amyloglukosidaasia (21 AGI/g DS) yhdessä 9-kertaisen määrän kanssa AA:ta (verrattuna AG-preparaatissa läsnäolevaan määrään). Erilaisin välein otettiin näytteitä ja ne analysoitiin. Kontrolliko-keita suoritettiin myös. Saatiin seuraavat tiedot, ks. tau-10 lukko V.

TAULUKKO V

pH 94 tunnin sokerointiaika glukoosin alku-pH kuluttua (t) huippuarvo (%) 3,5 3,^5 71 95,3 4,0 3,85 64 95, 3 (94,9)* 4, 2 3, 95 64 95, 3 (94,8 )* 4, 1 64 95, 3 (94,6)* _5, 0 _____4j_2______________64_______________95, 2_____ « Kontrollit (AG-annokset ilman ylimääräistä AA-lisäystä)

Siten käyttäen ylimäärää hapanamylaasia saatiin vertailukelpoisia glukoosin huippuarvoja pH-alueella 3,5 - 5,0.

Esimerkki VII

Substraattia (MD03, 33 % DS) sisältävien liuosten pH-arvot 15 säädettiin arvoon 4,2 ja ne kuumennettiin eri lämpötiloihin. Lisättiin amyloglukosidaasia (21 AGI/gDS) ja 9-kertai-nen määrä hapanamylaasia. Otettiin näytteitä ja ne analysoitiin kuten esimerkissä II on selitetty. Kontrollit (AG-annokset ilman ylimääräistä AA-lisäystä) suoritettiin myös.

20 Tulokset on annettu alla taulukossa VI.

23 8271 1

TAULUKKO VI

T.. AAU/AQI . . . . ., iglukoosi-

Lampotxla sokerointiaika ||aanto (%) 55 0, 07¾ 65 94,6 0,74 47 95,0 57, 5 0,074 71 95,0 0, 74 47 95,5 60 0, 074 71 94,8 0, 74 64 95,3 62, 5 0,074 90 94,8 0, 74 64 95,4 65 0,074 117 93,0 ____0,74 89__94,6 Nämä tulokset vahvistavat sen, että hapanamylaasi on stabiili lämpötiloissa ainakin 65°C:een saakka, mikä tekee sen hyvin sopivaksi käytettäväksi amyloglukosidaasin kanssa suhteellisen korkeissa sokeroimislämpötiloissa. Alemmat glukoo-5 siarvot 65°C:ssa johtuvat todennäköisesti AG-entsyymin suhteellisesti alemmasta termostabiilisuudesta AA:han verrattuna. Hapanamylaasin läsnäololla on edullinen vaikutus glukoosin tuotantoon korkeammassa lämpötilassa.

Claims

24 8271 1
1. Menetelmä tärkkelyksen muuttamiseksi siirapin muodossa olevaksi dekstroosiksi, tunnettu siitä, että sokeroidaan tärkkelys tai tärkkelyshydrolysaatti entsyymituotteen läsnäollessa, joka sisältää amyloglukosidaasia ja mik-robiaalista hapanamylaasia, jolla on olennaisesti a-l,4-glu-kosidisia sidoksia pilkkova aktiivisuus ja jolla saavutetaan optimaalinen sokeroituminen pH-alueella 3,5 - 5,0 ja lämpötilassa välillä 60 - 75 “C, suhteessa vähintään 0,16 AAU-yksikköä (hapanamylaasiyksikköä) AGI-yksikköä (amylo-glukosidaasiyksikköä) kohti, ja mahdollisesti hapanpullula-naasia.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että käytetty hapanamylaasi on peräisin sienestä.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että käytetty hapanamylaasi on peräisin Aspergillus niqeristä.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetyssä entsyymituotteessa on amyloglukosidaasia ja mainittua hapanamylaasia suhteessa 0,2 - 4,5 AAU-yksikköä AGI-yksikköä kohti.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että käytetty amyloglukosidaasi on peräisin Aspergillus nigeristä.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että käytetty entsyymituote on oleellisesti transglukosidaasivapaa.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mahdollisesti käytetty hapanpullulanaasi : voidaan saada Bacillus acidopullulyticus-bakteerin avulla. 25 8271 1
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että sokeroidaan tärkkelyshydrolysaatti, joka sisältää vähintään 30 paino-% kuiva-ainetta.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että sokerointi suoritetaan pH-alueella 3-5 ja lämpötilassa välillä 40 - 70 eC.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että sokerointi suoritetaan pH:ssa 4 - 4,5 ja lämpötilassa 50 - 65 eC.
11. Jonkin patenttivaatimuksista 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetyn amyloglukosidaasin määrä on 8-30 AGI-yksikköä/g kokonaiskuiva-ainetta.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että käytetyn amyloglukosidaasin määrä on 14-22 AGI-yksikköä/g kokonaiskuiva-ainetta.
13. Entsyymituote, tunnettu siitä, että se sisältää amyloglukosidaasia ja hapanta a-amylaasia, jolla on olennai- -I sesti a-1,4-glukosidisia sidoksia pilkkova aktiivisuus ja : joka saavuttaa optimiaktiivisuutensa sokeroitumisreaktiossa pH:ssa välillä 3,5 - 5,0 ja lämpötilassa välillä 60 - 75 °C, suhteessa vähintään 0,16 AAU-yksikköä AGI-yksikköä kohti.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen entsyymituote, tunnettu siitä, että se sisältää 0,2 - 4,5 AAU-yksikköä AGI-yksikköä kohti.
15. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen entsyymituote, tunnettu siitä, että amyloglukosidaasi on peräisin Aspergillus niqeristä. 1 Jonkin patenttivaatimuksista 13-15 mukainen entsyymituote, tunnettu siitä, että hapan a-amylaasi on peräi- : sin Aspergillus nigeristä. 26 8271 1
17. Jonkin patenttivaatimuksista 13-16 mukainen entsyymituo-te, tunnettu siitä, että se on oleellisesti trans-glukosidaasivapaa.
18. Jonkin patenttivaatimuksista 13-17 mukainen entsyymituo-te, tunnettu siitä, että se sisältää myös tehokkaan määrän hapanpullulanaasia.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen entsyymituote, tunnettu siitä, että hapanpullulanaasi voidaan saada Bacillus acidopullulyticus-bakteerin avulla.