KR100344001B1

KR100344001B1 - 아카비오신-글루코오스의 제조방법

Info

Publication number: KR100344001B1
Application number: KR1019980041907A
Authority: KR
Inventors: 박관화; 김묘정; 김태집; 이희섭; 차현주; 윤현근; 김영완; 이수복; 김도만; 오병하; 김정완
Original assignee: 박관화
Priority date: 1998-10-01
Filing date: 1998-10-01
Publication date: 2002-11-23
Also published as: KR20000025032A

Abstract

본 발명은 아카보오스(acarbose)의 유도체인 아카비오신-글루코오스(acarviosine-glucose)의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 아카보오스를 아카보오스 분해성 아밀레이즈를 분해하는 것으로 이루어지며, 선택적으로, 아카보오스 가수분해와 동시에 또는 아카보오스 가수분해 후에 효모 발효할 수 있다. 본 발명에서 아카보오스 분해성 아밀레이즈는 전분을 가수분해하여 주로 말토오스를 생산하고, 풀루란을 분해하여 주로 판노오스를 생성하며, 사이클로덱스트린을 분해하여 주로 말토오스를 생성하는 전분 가수분해효소들이다. 본 발명에 의해 탄수화물 분해효소를 효과적으로 저해할 수 있는 아카비오신-글루코오스를 대량으로 생산할 수 있다.

Description

아카비오신-글루코오스의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING ACARVIOSINE-GLUCOSE}

본 발명은 탄수화물 분해효소를 저해하는 유사삼탄당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

탄수화물 분해효소를 저해하는 대표적인 화합물인 아카보오스(acarbose)는 불포화 사이클리톨(cyclitol) 분자, 아미노당, 그리고 두 분자의 포도당으로 구성되는 유사사탄당(pseudotetrasaccharide)으로, 탄수화물 분해효소에 의해 더 이상 분해되지 않는다고 보고되고 있으며,α-글루코시데이즈, 글루코아밀레이즈,α-아밀레이즈 그리고 사이클로덱스트린 글루코트랜스퍼레이즈(이하 CGTase)와 같은 탄수화물 분해효소의 저해제로 이용되고 있다. 따라서 소장에서 분비하는 효소인α-글루코시데이즈를 효과적으로 저해하여 포도당의 섭취를 억제하는 효과가 있어 현재 당뇨병 치료제로 널리 이용되고 있다.

아카보오스 및 그 유도체의 구조에서 불포화 사이클리톨과 아미노당은 탄수화물 분해효소 저해효과에 필수적인 요소이고 그 외에 결합된 포도당의 개수에 의해 그 특이성이 결정된다고 알려져 있다. 일반적으로 2개의 포도당이 결합되어 있는 아카보오스가α-글루코시데이즈에 대한 저해 효과가 가장 크고, 결합된 포도당 개수가 많아질수록α-아밀레이즈에 대한 저해 효과가 커진다고 알려져 있으나, 쥐를 이용한in vivo실험에서는 포도당 한개 분자만이 결합된 아카비오신-글루코오스(acarviosine-glucose)가 수크레이즈 및 아밀레이즈에 대한 저해효과가 가장 뛰어난 것으로 보고되어 있다(D. D. Schmidt, W. Frommer, B. Junge, L. Mller, W. Wingender and E. Truscheit (1980) in First International Symposium onAcarbose (Creutzfeldt, W., Ed.) pp5-15, Excerpta Medica, Amsterdam).

아카비오신-글루코오스는 아카보오스의 환원성 말단의 포도당 한 분자가 가수분해되어 제거된 유사삼탄당으로 아카보오스와 같이 탄수화물 분해효소에 대한 저해효과를 나타낸다. 아카비오신-글루코오스는 아카보오스를 묽은 황산으로 100℃ 에서 1시간 정도 가열하여 포도당 분자를 제거하여 생산된다고 보고되었다(B. Junge, H. Bshagen, J. Stoltefuβ, L. Mller (1980) in Enzyme inhibitors (Brodbeck U., Ed.) pp.123-137, Verlag Chemic, Weinheim). 그러나, 이 방법은 화학적 분해 방법으로 특이성이 높지 않고 여러 가지 부반응이 일어날 수 있으며 반응 후에 아카비오신-글루코오스를 정제해야 하는 복잡한 공정을 거쳐야 한다.

본 발명의 목적은 탄수화물 분해효소를 저해하는 아카비오신-글루코오스 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 탄수화물 분해효소를 저해하는 아카비오신-글루코오스를 고순도로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 아카비오신-글루코오스의 분석을 위한 박막크로마토그래피 사진이다.

본 발명은 아카비오신-글루코오스의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 아카보오스를 아카보오스 분해성 아밀레이즈로 가수분해하는 것으로 이루어진다.

본 발명자들은 전분을 가수분해하여 주로 말토오스와 소량의 글루코오스를 생산하고, 풀루란을 분해하여 주로 판노오스를 생성하며, 사이클로덱스트린을 분해하여 주로 말토오스와 소량의 글루코오스를 생성하는 전분 가수분해효소가 아카보오스를 글루코오스와 아카비오신-글루코오스 가수분해한다는 것을 발견하였다.

본 출원 명세서에서 아카보오스 분해성 아밀레이즈는 전분을 가수분해하여 주로 말토오스를 생산하고, 풀루란을 분해하여 주로 판노오스를 생성하며, 사이클로덱스트린을 분해하여 주로 말토오스를 생성하며 아카보오스를 글루코오스와 아카비오신-글루코오스로 분해하는 효소를 의미한다.

한 예로, 한국특허출원번호 96-25135에 보고된,Bacillusstearothermophilus(KFCC-10896)로부터 생산되는 말토제닉 아밀레이즈(maltogenic amylase)(이하 BSMA라 함)가 아카보오스를 글루코오스와 아카비오신-글루코오스로 분해한다. 또다른 예로, 미국특허 5583039와 한국특허 104913에 보고된Bacillus licheniformis(ATCC 27811)에서 분리한 말토제닉 아밀레이즈 역시 아카보오스를 글루코오스와 아카비오신-글루코오스로 가수분해한다는 것을 알게 되었다. 이들 아밀레이즈는 전분을 가수분해하여 주로 말토오스를 생산하고, 풀루란을 분해하여 주로 판노오스를 생성하며, 사이클로덱스트린을 분해하여 주로 말토오스를 생성하는 전분 가수분해효소들이다.

본 발명에 따른 방법에서 아카보오스를 적당한 완충용액에 용해시킨 후, 아카보오스 가수분해를 위한 아카보오스 분해성 아밀레이즈의 최적온도에서 반응시킨다.

본 발명의 또 다른 방법은 아카보오스 분해성 아밀레이즈에 의한 아카보오스 가수분해와 동시에 또는 아카보오스 가수분해 후 추가로 효모 발효하는 것으로 이루어지는 고순도의 아카비오신-글루코오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

이와 같이 아카보오스 분해성 아밀레이즈에 의한 아카보오스 가수분해 반응과 동시에 또는 아카보오스 가수분해 후 추가로 효모 발효를 함으로써, 아카보오스 가수분해에 의해 생성되는 포도당을 제거할 수 있으므로 고순도의 아카비오신-글루코오스를 제조할 수 있다.

본 발명 방법에서 사용되는 효모의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 포도당을 탄소원으로 이용할 수 있는 효모는 모두 사용할 수 있다. 효묘 발효는 효모 발효 분야에서 잘 알려진 조건에 따라 실시할 수 있으며, 사용하는 효모의 종류에 따라 달라질 것이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 설명하고자 하며, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다.

실시예 1. 아카비오신-글루코오스의 제조

대한민국 서울특별시 서대문구 신촌동 134번지에 위치하는 사단법인 한국종균협회에 수탁번호 KFCC-10896으로 기탁된, 아밀레이즈 생산 균주를 LB배지에 접종하여 37℃에서 전배양한 후 같은 배지에서 10시간 배양하고 원심분리하여 균체를 얻었다. 회수한 균체를 pH 7.5의 50mM Tris-Cl 완충용액으로 현탁시킨 다음 초음파로 파괴한 뒤 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 황산암모니움으로 분획하고 컬럼크로마토그래피로 DEAE-TOYOPEARL 및 Mono Q column을 통과시켜 정제된 아밀레이즈를 얻었다.

50mM 사이트레이트 완충용액(pH 6.0)에 아카보오스를 용해시킨 10%(w/v)용액을 미리 40 ℃ 수조에 10분간 방치한 후 아카보오스 1mg 당 160 Cu의 BSMA를 첨가하여 17시간 동안 1차 반응을 시켰다. 아카보오스의 완전한 가수분해를 위하여 효소반응용액에 1차 반응과 같은 조건으로 BSMA를 첨가하여 17시간 동안 2차 반응시켰다. 2차 반응후 반응액을 끓는 물에서 5분간 가열하여 반응을 종결시켰다.

실시예 2. 아카비오신-글루코오스의 제조

ThMA 아밀레이즈 생산 균주를 LB배지에 접종하여 37℃에서 전배양한 후 같은 배지에서 10시간 배양하고 원심분리하여 균체를 얻었다. 회수한 균체를 pH 7.5의 50mM Tris-Cl 완충용액으로 현탁시킨 다음 초음파로 파괴한 뒤 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 황산암모니움으로 분획하고 컬럼크로마토그래피로 Q-Sepharose 및 DEAE 8HR column을 통과시켜 정제된 아밀레이즈를 얻었다.

50mM 아세테이트 완충용액(pH 6.0)에 아카보오스를 용해시킨 10%(w/v)용액을 미리 40 ℃ 수조에 10분간 방치한 후 아카보오스 1mg 당 160 Cu의 ThMA를 첨가하여 17시간 동안 1차 반응을 시켰다. 아카보오스의 완전한 가수분해를 위하여 효소반응액에 1차 반응과 같은 조건으로 ThMA를 첨가하여 17시간 동안 2차 반응시켰다. 2차 반응후 반응액을 끓는 물에서 5분간 가열하여 반응을 종결시켰다.

실시예 3. 고순도의 아카비오신-글루코오스의 제조

먼저, 반응에 사용할 효모를 활성화시키기 위하여, YPD배지(효모 추출물 1%(w/v), 박토펩톤 2%(w/v), 덱스트로오스 2%(w/v))에 과립형태의 제빵 효모를 접종하고 27℃에서 18시간 동안 진탕배양기로 배양하였다.

고순도의 아카비오신-글루코오스를 생산하기 위하여, 실시예 1에서 아카보오스 1mg 당 160 Cu의 BSMA를 사용한 대신, 아카보오스 1mg 당 160 Cu의 BSMA와 효모 배양액 2μL를 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시켰다. 2차 반응 후 반응액을 끓는 물에서 5분간 가열하여 반응을 종결시켰다.

실시예 4. 박막크로마토그래피를 이용한 반응산물의 분석

반응 종결후 박막크로마토그래피를 이용하여 반응산물을 분석하여 도 1에 나타낸다. A는 말토올리고당 표준물질(G1-G7), B는 실시예 1에서 얻은 아카보오스 가수분해산물(위에서부터 포도당, 아카비오신-글루코오스, 아카보오스, 이소아카보오스), C는 실시예 2에서 얻은 효모배양액과 BSMA를 모두 첨가한 아카보오스 가수분해산물, 그리고 D는 아카보오스 표준물질이다. 각 시료를 Whatman K5F TLC 플레이트(20㎝×20㎝)에 1μL씩 로딩하여 아이소프로필 알코올, 에틸 아세테이트, 증류수의 비가 3:1:1 (v/v/v)인 전개액에서 2번 전개시켰다. 전개 후에 플레이트를 잘 건조시켜 메탄올에 0.3%(w/v) N-(1-나프틸)-에틸렌디이아민과 5%(v/v) 황산을 용해시킨 발산액에 담갔다 꺼낸 후 110℃ 오븐에서 10분동안 발색시켰다. BSMA는 아카보오스를 가수분해하여 아카비오신-글루코오스와 포도당을 생산하였고 효모가 첨가되지 않은 반응물에서는 상당량의 포도당과 이소아카보오스가 남아있었다(도 1의 B). 그러나, 효모배양액을 첨가한 경우 포도당은 완전히 제거되었고 기타 부산물의 양도 적었다(도 1의 C).

실시예 5. 아카비오신-글루코오스의 효소저해특성 실험

아카비오신-글루코오스의 탄수화물 가수분해효소에 대한 저해 특성을 알아보기 위하여 각 효소에 대한 Ki 값을 구하였다.

사용한 효소는 제빵 효모에서 분리한α-글루코오시데이즈, 쥐에서 분리한α-글루코오시데이즈, 돼지 췌장에서 분리한α-아밀레이즈, 그리고 Bacillus marcrans CGTase였고 각각 다음과 같은 방법으로 반응속도를 측정하였다.

1.α-글루코오시데이즈

말토오스를 기질로 사용하였고 효소에 의해 가수분해된 포도당은 글루코오스옥시데이즈-퍼옥시데이즈 효소법으로 스펙트로포토미터에서 정량하였다. 즉, 큐벳에 기질 0.6mL, 발색시약 (4-아미노안티피린) 50μL, 발색효소(글루토오스 옥시데이즈, 퍼옥시데이즈) 50μL, 효소저해제(아카보오스 혹은 아카비오신-글루코오스) 50μL 그리고α-글루코오시데이즈 50μL를 넣고 500nm에서 흡광도를 연속적으로 측정했으며 반응온도는 37℃로 유지하였다. 이 때 넣어준α-글루코오시데이즈는 반응 전에 해당 효소저해제 용액에서 5분간 방치하였다. 반응 속도는 10분간 흡광도변화의 평균 기울기로 구하였다.

2.α-아밀레이즈

가용성 전분을 기질로 사용하여, 6 mM의 NaCl이 첨가된 pH가 7.0인 50 mM 인 산완충용액을 사용하여 37℃ 항온수조에서 반응하였다. 기질의 농도를 각각 0.0444, 0.0889, 0.444, 1.07mg/ml로 사용하였다. 1200μL 기질에 100μL의 효소저해제(아카보오스, 아카비오신-글루코오스)와 50μL의α-아밀레이즈를 첨가하여 반응을 시켰다. 시간별로 반응액 100 ㎕를 취하여 발색시약이 들어있는 마이크로플레이트 리더(microplaste reader)에 넣어서 반응을 정지하였다. 85℃에서 35분간 발색을 시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하여 초기 반응 속도를 구하였다.

발색방법으로 구리-바이신코니네이트 환원법(copper-bicinchoninate reducing value method)를 사용하였다. 97.1g의 다이소디움 2,2'-바이신코니네이트, 3.2g의 소디움 카르보하이드레이트 모노하이드레이트, 1.2g의 소디움 바이카르보네이트를 증류수에 녹여 50ml로 맞춘 용액 A와, 62mg의 2가 황산구리, 63mg의 L-세린을 증류수에 녹여 50ml로 맞춘 용액 B를 1: 1로 섞어서 사용하였다.

3. CGTase

기질로 말토덱스트린(평균 Dp=13)을 이용하였고 1mM 염화칼슘이 첨가된 pH 6.0 50mM 이미다졸 용액을 완충액으로 사용하여 25℃ 항온 수조에서 효소반응시켰다. 400μL의 0.5 mM 메틸오렌지용액과 500μL의 기질용액의 혼합액에 100μL의 효소액을 첨가하여 반응시키면서, 528 nm에서의 흡광도 감소를 분광분석기로 연속적으로 측정하여 초기 반응속도를 구하였다. 생성된 싸이클로덱스트린의 양은α-싸이클로덱스트린이 메틸오렌지와 포접화합물을 형성할 때의 흡광도의 감소정도를 측정하여 작성한 정량 곡선으로부터 구하였다.

각각의 효소에 대한 Ki 값을 표 1에 나타낸다. 아카비오신-글루코오스는 아카보오스에 비해,α-글루코오시데이즈에 대하여 Ki 값이 현저히 낮았으며 CGTase 에 대해서도 약 6배 정도의 낮은 Ki 값을 나타내어 아카비오신-글루코오스가 아카보오스보다 효과적인 효소저해제로 작용함을 알 수 있었다. 돼지 췌장α-아밀레이즈에 대해서는 거의 비슷한 저해효과를 보였고 쥐의 소장에서 분리한α-글루코오시데이즈는 아카비오신-글루코오스가 아카보오스보다 작은 Ki 값을 나타내었다.

본 발명에 의해 탄수화물 분해효소를 효과적으로 저해할 수 있는 아카비오신-글루코오스를 대량으로 생산할 수 있다.

Claims

아카보오스를 아카보오스 분해성 아밀레이즈로 가수분해하는 것으로 이루어지는 아카비오신-글루코오스의 제조방법.
제1항에 있어서, 아카보오스를 아카보오스 분해성 아밀레이즈로 가수분해와 동시에 또는 가수분해한 후 추가로 효모 발효를 통하여 아카보오스 가수분해에 의해 생성되는 포도당을 제거하는 것으로 이루어지는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아카보오스 분해성 아밀레이즈가Bacillus stearothermophilusKFCC-10896로부터 생산되는 아밀레이즈인 방법.