KR100349334B1 - 아카비오신 글루코실 시몬진 및 그것의 제조방법. - Google Patents

Abstract

본 발명은 탄수화물 분해성 아밀레이즈 저해 효과 및 식품섭취를 억제 효과가 있는 물질 및 그것의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 아카보오스를 당 수용체인 시몬진 존재 하에서 아카보오스 분해성 아밀레이즈로 반응시키는 것으로 이루어지며, 본 발명에 의해 탄수화물 분해효소를 효과적으로 억제하면서 식품섭취를 저해하는 아카비오신 글루코실 시몬진을 생산할 수 있다.

Description

아카비오신 글루코실 시몬진 및 그것의 제조방법.{Anti-obese compound with hypoglycemic activity and prepartion method thereof}

본 발명은 식품섭취 억제 효과 및 탄수화물 분해효소 저해 효과가 있는 물질 및 그것의 제조방법에 관한 것이다.

비만과 당뇨는 서로 원인이 될 수 있는 질병으로, 이 두 질환을 동시에 가지고 있는 사람들을 위하여 두 질환 모두에 유효한 성분을 개발할 필요가 있다.

시몬진(simmondsin)은 다음 구조식에서와 같이, 시아노헥실링과 포도당으로 구성되는 화합물로서 식품 섭취를 저해하는 효과 있어 경구투여시 체중감소효과를보인다고 보고되고 있다.

한편, 탄수화물 분해효소를 저해하는 대표적인 화합물인 아카보오스는α-글루코시데이즈, 글루코아밀레이즈,α-아밀레이즈 그리고 사이클로덱스트린 글루코트랜스퍼레이즈(이하 CGTase)와 같은 탄수화물 분해효소의 저해제로 이용되고 있다. 따라서 소장에서 분비하는 효소인α-글루코시데이즈를 효과적으로 저해하여 글루코스의 섭취를 억제하는 효과가 있으며 혈당강화 효과가 있어 현재 당뇨병 치료제로 이용되고 있다.

본 발명의 목적은 식품섭취를 억제하는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 탄수화물 분해효소 저해 효과가 있는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 혈당강화 효과가 있는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 식품섭취를 억제하면서 탄수화물 분해효소 저해 효과가 있는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 식품섭취를 억제 효과, 탄수화물 분해효소 저해 효과 및/또는 혈당강화 효과가 있는 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1은 아카비오신 글루코실 시몬진 생산액의 박막크로마토그라피 사진이다.

도 2는 아카비오신 글루코실 시몬진 생산액의 고성능 이온크로마토그램이다.

도 3은 아카비오신 글루코실 시몬진의 MALDI-TOF 스펙트럼이다.

도 4는 아카비오신 글루코실 시몬진의¹³C 핵자기공명분석 스펙트럼이다.

본 발명은 다음의 구조식으로 표시되는, 식품섭취 억제 효과, 탄수화물 분해효소 저해 효과 및/또는 혈당 강하 효과가 있는 아카비오신 글루코실 시몬진에 관한 것이다.

아카비오신 글루코실 시몬진은 아카비오신-글루코스(PTS)에 시몬진이α-1,3,α-1,4 또는α-1,6 결합된 화합물로, 본 발명은 이들 각각의 화합물 또는 이들의 혼합물을 모두 포함한다. 본 명세서에서 특별히 한정하지 않는 한 아카비오신 글루코실 시몬진은α-1,3-아카비오신 글루코실 시몬진,α-1,4-아카비오신 글루코실 시몬진 및α-1,6-아카비오신 글루코실 시몬진을 모두 의미한다.

아카비오신 글루코실 시몬진은α-글루코시데이즈 및α-아밀레이즈와 같은 탄수화물 분해효소의 활성을 저해함과 동시에, 경구투여시 식품섭취 저해효과를 나타낸다.

또한 본 발명은 식품섭취 억제 효과, 탄수화물 분해 효소 저해 효과 및/또는 혈당 강하 효과가 있는 화합물의 제조방법에 관한 것이다

본 발명의 방법은, 시몬진 존재하에서 아카보오스를 아카보오스 분해성 아밀레이즈로 반응시키는 것으로 이루어진다.

본 명세서에서 아카보오스 분해성 아밀레이즈는 전분을 가수분해하여 주로 말토오스를 생산하고, 풀루란을 분해하여 주로 판노오스를 생성하며, 사이클로덱스트린을 분해하여 주로 말토오스를 생성하며 아카보오스를 분해하며 아카비오신-글루코스를 단당류 또는 이당류 이상의 올리고당에 전이하는 효소를 의미한다. 이와 같은 아카비오신-글루코스 전이 특성은 종래에 알려진 아밀레이즈에서는 보고된 바가 없다. 본 발명자들은 이와 같은 효소에 대하여 한국특허출원 1998-41908에서 밝힌 바 있으며, 이 특허출원의 기재 내용은 본 명세서에 포함된다.

한 예로, 한국특허출원 96-25135에 기재된,Bacillus stearothermophilus(KFCC-10896)부터 생산되는 아밀레이즈(이하 BSMA라 함)를 사용하여 탄수화물분해 효소를 저해시키는 화합물을 제조할 수 있다. 또다른 예로, 미국특허 5,583,039에 기재된Bacillus licheniformis(ATCC 27811), 한국특허출원 1998-63956에 기재된Thermussp. (IM6501 KCTC 0527BP)에서 분리된 아밀레이즈(이하 ThMA라 함) 등이 아카보오스 분해성 아밀레이즈에 속하며, 본 발명의 화합물을 제조하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 시몬진 존재하에서 아카보오스에 아카보오스 분해성 아밀레이즈를 반응시키면 아카보오스가 분해되어 생성된 아카비오신-글루코스에 시몬진이 전이되어 아카비오신 글루코실 시몬진을 효과적으로 생산할 수 있다.

따라서 본 발명의 방법은 시몬진 존재하에서 아카보오스에 아카보오스 분해성 아밀레이즈를 반응시키는 것으로 이루어진다.

본 발명의 또다른 방법은 아카보오스에 아카보오스 분해성 아밀레이즈를 반응시켜 얻어지는 산물을 시몬진 존재하에서 아카보오스 분해성 아밀레이즈로 반응시키는 것으로 이루지는 식품섭취를 억제하는 탄수화물 분해효소 저해물질을 제조하는 것으로 이루어진다.

아래에서 실시예를 통하여 본 발명을 설명하고자 하나, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다.

실시예 1. 아카비오신 글루코실 시몬진의 제조 및 정제

대한민국 서울특별시 서대문구 신촌동 134번지에 위치하는 사단법인 한국종균협회에 수탁번호 KFCC-10896으로 기탁된,Bacillus stearothermophilus균주를 LB 배지(0.5% 효모추출물, 1% 박토 트립톤, 0.5% NaCl)에 접종하여 37℃에서 전배양한 후 같은 배지에서 10시간 배양하고 원심분리하여 균체를 얻었다. 회수한 균체를 pH 7.5의 50 mM Tris-Cl 완충용액으로 현탁시킨 다음 초음파로 파괴한 뒤 원심 분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 컬럼크로마토그래피로 Ni-NTA 컬럼을 통과시켜 정제된 아밀레이즈를 얻었다.

50 mM 사이트레이트 완충용액(pH 6.0)에 아카보오스와 시몬진을 각각 10%(w/v)로 용해시켜 기질로 사용하였다. 기질 용액을 미리 50 ℃ 수조에 10분간 방치한 후 아카보오스 1 mg 당 10 Cu의 BSMA를 첨가하여 48시간 동안 반응시켰다. 반응 후 반응액을 끓는 물에서 5분간 가열하여 반응을 종결시켰다. 반응액을 BioGel P-2 컬럼(1.6×90cm)을 통과시켜 반응생성물을 정제하였다. 핵자기공명분석 및 NALDI-TOF을 위하여는 분취 박막크로마토그라피(thin layer chromatography, TLC)를 이용하여 전이 생성물을 순수하게 정제하였다.

실시예 2. 박막크로마토그라피를 이용한 반응생성물의 분석

반응 종결 후 박막크로마토그라피를 이용하여 반응생성물을 분석하였으며 그 결과를 도 1에 나타낸다. 첫째 줄은 말토올리고당 표준물질(G1-G7), 둘째 줄는 아카보오스 유도체(위에서부터 아카비오신-글루코스(PTS), 아카보오스(Ac), 아이소아카보오스(IAc)), 세째 줄은 실시예 1에서 얻은 반응생성물, 네째 줄은 실시예 1에서 얻은 반응생성물을 젤 투과 크로마토그래피로 정제하여 얻은 당전이물 함유 혼합물이며, 다섯째 줄은 박막크로마토그래피로 순수분리한 당전이물이다. 아카비오신-글루코스는 한국특허출원 1998-41907에 기재된 방법에 따라 제조하였으며, 아이소아카보오스는 한국특허출원 1998-41908에 기재된 방법에 따라 제조하였다.

각 시료를 Whatman K5F TLC 플레이트(20cm×20cm)에 1μL씩 로딩하여 아세토나이트릴, 증류수의 비가 8:2 (v/v)인 전개액에서 2번 전개시켰다. 전개 후에 플레이트를 잘 건조시켜 메탄올에 0.3%(w/v) N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민과 5%(v/v) 황산을 용해시킨 발색액에 담갔다 꺼낸 후 110℃ 오븐에서 10분동안 발색시켰다.세째 줄에서 알 수 있듯이, 아카비오신-글루코스보다 위쪽에 당전이에 의해 두 가지의 새로운 물질이 생성된 것이 확인되었다.α-1,6 결합은α-1,4 결합보다 Rf 값이 작으므로 두 가지 중에 위쪽이 아카비오신-글루코스에 시몬진이α-1,4 및α-1,3로 결합된 아카비오신 글루코실 시몬진 혼합물이고, 아래쪽이α-1,6로 결합된 아카비오신 글루코실 시몬진임을 확인하였다.

실시예 3. 고성능이온크로마토그라피를 이용한 아카비오신 글루코실 시몬진의 분석

실시예 1에서 얻은 반응액을 고성능이온크로마토그라피(High Performance Ion Chromatography, HPIC)를 이용하여 분석하였다. 시료는 반응액을 초순수로 400배 희석하여 0.45㎛ 박막여과지로 여과하여 20μL를 주입하였고 유속은 1mL/분로하여 분석하였다. HPIC 분석은 Dionex사(미국)의 GP40 그래디언트 펌프와 ED40 전기화학적 검출기 및 CarboPac PA1 컬럼을 이용하여 시행하였으며, 용매는 150 mM NaOH 용액을 사용하였고 600 mM 소디움 아세테이트로 30분 동안 30%까지의 농도구배를 걸어주었다. 결과를 도 2에 나타낸다. 피크 1은 시몬진, 피크 2는 글루코스, 피크 3은α-1,6로 결합된 아카비오신 글루코실 시몬진, 피크 4는 아카비오신 글루코스와α-1,4 및α-1,3로 결합된 아카비오신 글루코실 시몬진 혼합물, 피크 5는 아카보오스를 나타낸다.α-1,4 및α-1,3로 결합된 아카비오신 글루코실 시몬진의 피크 위치는 실시예 1에서 얻은 반응 생성물을 젤 투과 크로마토그래피로 정제하여 얻은 당전이물 함유 혼합물을 고성능이온크로마트그래피로 분석한 결과 아카비오신 글루코스와 보유시간이 동일함을 확인하였다. 이를 도 2b에 나타낸다.

실시예 4.

MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption ionization with time of flight)를 이용하여, 도 1의 다섯째 줄에 나타난 당전이물의 분자량을 측정하였다. Voyager-DE(PerSeptive Biosystem, Framingham, USA) 시스템을 사용하였으며, 메트릭스로α-시아노-4-하이드록시신나민산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid;α-CHCA)를 사용하고, 켈리브레이션을 위해서는 des-Arg¹-bradykinin, angiotensin I, Glul-fibrinopeptide B와 nenrotensin의 혼합물을 사용하였다. 시료 1μl과 2,5-다이하이드로벤조산 1μl을 사용하여 시료의 분자량을 측정하였다. 결과를 도 3에 나타낸다. m/z 841 ([M+H]⁺)와 863 ([M+Na]⁺)에 나타나는 이온 피크로부터 시료의 분자량이 840으로 측정되었다. 이것은 각각 아카비오신-글루코실 시몬진 수소와 소디움 아카비오신-글루코실 시몬진의 분자량과 일치하였으며, 이로부터 실시예 1에 의한 주요 당전이물이 아카비오신-글루코실 시몬진임을 확인하였다.

실시예 5.¹³C NMR을 이용한 아카비오신 글루코실 시몬진의 구조 분석

본 발명의 주요 전이물인 아카비오신 글루코실 시몬진의 구조를 확인하기 위하여¹³C 핵자기공명분석 (NMR; JNM LA-400 FT-NMR 스펙트로미터(Jeol, 일본))을 수행하였다. 시료는 실시예 1에서 순수 정제한,α-1,6로 결합된 아카비오신 글루코실 시몬진 35mg을 D20에 용해시킨 것을 사용하였다. 결과를 표 1 및 도 4에 나타낸다. 시몬진의 애노머 카본(anomeric carbon) (표 1, 베타 글루코스의 6번 탄소)공명에 대한 화학적 전이(chemical shifts)는 60.962 ppm에서 나오며 이는 해당 탄소의 비환원 상태를 나타낸다. 반면에 아카비오신 글루코실 시몬진의 애노머 카본 (표 1. 베타 글루코스의 6번 탄소) 공명에 대한 화학적 전이는 66.162ppm에서 나오며 이는 해당 탄소의 환원상태를 나타낸다. 이를 통해 아카비오신 글루코실 시몬진은 시몬진의 글루코스 6번 탄소가 아카비오신-글루코실의 글루코스 1번 탄소에 결합되었음을 확인하였다.

실시예 5. 아카비오신 글루코실 시몬진의 효소저해특성 실험

아카비오신-글루코스의 탄수화물 가수분해효소에 대한 저해 특성을 알아보기위하여 아래 효소들에 대한 Ki 값을 구하였다.

사용한 효소는 제빵 효모에서 분리한α-글루코오시데이즈, 쥐에서 분리한α-글루코시데이즈, 돼지 췌장에서 분리한α-아밀레이즈, 그리고 Bacillus marcerans CGTase였고 각각 다음과 같은 방법으로 반응속도를 측정하였다.

1.α-글루코오시데이즈

말토오스를 기질로 사용하였고 효소에 의해 가수분해된 글루코스는 글루코스옥시데이즈-퍼옥시데이즈 효소법으로 스펙트로포토미터에서 정량하였다. 즉, 큐벳에 기질 0.6mL, 발색시약 (4-아미노안티피린) 50μL, 발색효소(글루토오스 옥시데이즈, 퍼옥시데이즈) 50μL, 효소저해제(아카보오스 혹은 아카비오신-글루코스) 50μL 그리고α-글루코오시데이즈 50μL를 넣고 500 nm에서 흡광도를 연속적으로 측정했으며 반응온도는 37℃로 유지하였다. 이 때 넣어준α-글루코오시데이즈는 반응 전에 해당 효소저해제 용액에서 5분간 방치하였다. 반응 속도는 10분간 흡광도변화의 평균 기울기로 구하였다.

2.α-아밀레이즈

가용성 전분을 기질로 사용하여, 6 mM의 NaCl이 첨가된 pH 7.0인 50 mM 인산 완충용액을 사용하여 37℃ 항온수조에서 반응시켰다. 기질의 농도를 각각 0.0214, 0.0285, 0.428, 0.857mg/ml로 사용하였다. 600μL 기질에 75μL의 효소저해제(아카보오스, 아이소아카보오스)와 25μL의α-아밀레이즈를 첨가하여 반응을 시켰다. 시간별로 반응액 100 ㎕를 취하여 발색시약이 들어있는 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)에 넣어서 반응을 정지하였다. 85℃에서 35분간 발색을 시킨후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 초기 반응 속도를 구하였다.

발색방법으로 구리-바이신코니네이트 환원법(copper-bicinchoninate reducing value method)를 사용하였다. 97.1 g의 다이소디움 2,2'-바이신코니네이트, 3.2 g의 소디움 카르보하이드레이트 모노하이드레이트, 1.2 g의 소디움 바이카르보네이트를 증류수에 녹여 50 ml로 맞춘 용액 A와, 62 mg의 2가 황산구리, 63 mg의 L-세린을 증류수에 녹여 50 ml로 맞춘 용액 B를 1: 1로 섞어서 사용하였다.

각각의 효소에 대한 Ki 값을 표 2에 나타낸다.

실시예 5. 아카비오신 글루코실 시몬진의 혈당 강하 효과

실험동물로는 생후 8주 된 Zucker fa/fa 래트를 각 실험군마다 5마리씩 사용하였다. 쥐를 하루밤 굶긴 후,대조군에는 수용성 녹말 2g/kg체중, 양성 대조군에는 수용성 녹말 2g/kg + 아카보오스 5, 10, 20 mg/kg체중, 실험군에는 수용성 녹말 2g/kg체중 + 아카비오신 글루코실 시몬진 5, 10, 20 2mg/kg체중을 경구투여하였다. 경구투여 후 1분, 30분, 1시간, 2시간 째에 꼬리에서 채혈하고 혈장의 포도당 농도를 측정하였다. 혈당강하 정도를 Area Under the Curve(AUC)로 비교하였다. 결과를 표 3에 나타낸다. 아카비오신 글루코실 시몬진 투여 군은 투여 후 30분, 1시간, 2시간의 혈당치 변화와 AUC가 아카보오스 투여 군과 비슷한 정도로, 대조군에 비하여 유의적으로(p<0.05) 저하하였다.

^a,b: 혈당치 변화에서는 각 시간내에서 각 실험군 사이의 유의적(p<0.05) 차이이며, AUC에서는 각 실험군 사이의 유의적(p<0.05) 차이임.

실시예 6. 아카비오신 글루코실 시몬진의 식품 섭취 억제 및 체중 감소 효과

실험동물로는 생후 8주된 ob/ob mice(C57BL/6J-Lep)를 각 실험군당 10마리씩 사용하였다. 양성대조구 1에는 아카보오스 100mg/kg체중, 양성대조군 2에는 시몬진 100mg/kg체중, 실험군에는 아카비오신 글루코실 시몬진을 100mg/kg체중씩 오전 (9시-10시), 오후 (4시-5시) 2회에 걸쳐 하루에 총 200mg/kg체중을 6일간 경구투여하였다. 체중과 식이섭취량은 매일 오전 9시에 측정하였다. 결과를 표 4에 표시한다. 아카비오신 글루코실 시몬진은 시몬진과 유사한 식이섭취 감소효과가 있으며, 체중감소효과는 시몬진보다 우수하였다.

^a,b: 각 실험군 사이의 유의적(p<0.05) 차이임.

본 발명에 의해 식품섭취를 억제하는 동시에 탄수화물 분해효소를 효과적으로 억제할 수 있는 아카비오신 글루코실 시몬진을 제공할 수 있다.

Claims (5)

1. 다음 구조식으로 표시되는 아카비오신 글루코실 시몬진
2. 아카보오스를 시몬진 존재하에서 아카보오스 분해성 아밀레이즈로 반응시키는 것으로 이루어지는 아카비오신 글루코실 시몬진을 제조하는 방법.
3. 삭제
4. 아카보오스에 아카보오스 분해성 아밀레이즈를 반응시켜 얻어지는 산물을 시몬진 존재하에서 아카보오스 분해성 아밀레이즈로 반응시키는 것으로 이루어지는 아카비오신 글루코실 시몬진을 제조하는 방법.
5. 삭제