FI58158B - Foerfarande foer separering och rengoering av mikrobiologiskt framstaellda aminosockerderivat - Google Patents

Description

I·!**»·! ΓβΙ f11. KUULUTUSJULKAISU c Q 1 C β jMTa cLBJ (11) utlAgg n i ngsskim ft 3 0» J 8 (45) : -·.·-·».

J (51) Ky.ik.Vct.3 C 12 P 19Λ6, c 07 H 15/20 SUOMI—FINLAND (M) - Ptfot^knin, 782283 (22) HdMmlipUv·—Aiweknlnpdtg 19.07.78

* * (23) AlkMpUvt—GiMihecadig 19.09.7U

(41) Tulkit iulklMklJ —Blhrlt offyittllf ^ q*, jq raHMtl- I* raklfHrilwIlltg· (44) nm*».» rm.- 'n0'ftri

Pmi» och rcgiltwrstyrtlMn ' Amakan uttajd odi utl^kriftan puMfctrad 29·00. ου (32)(33)(31) atuolkws—8«fM prtorlt«t 22.09* 73 26.lO.73, 21.II.73 Saksan Liittotasavalta-Forbundsrepubliken Tyskland(DE) P 23U7782.9 p 23U7782.9, p 23U7782.9 (71) Bayer Aktiengesellschaft, Leverkusen, Saksan Liittotasavalta-Förbunds-republiken TiysklandiDE) (72) Werner Frommer, Wuppertal-Elberfeld, Bodo Junge, Wuppertal-Barmen,

Uwe Keup, Wuppertal-Elberfeld, Lutz Muller, Wuppertal-Elberfeld,

Walter Puls, Wuppertal-Elberfeld, Delf Schmidt, Wuppertal-Vohvin-kel, Saksan Liittotasavalta-Forbundsrepubliken iyskland(DE) (7U) Oy Kolster Ab (5U) Menetelmä, mikrobiologisesti valmistettujen aminosokerijohdannaisten erottamiseksi ja puhdistamiseksi - Förfarande för separering och ren-göring av mikrobiologiskt framställda aminosockerderivat (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta 27UO/7U (patentti 56698) -Avdelad fr&n ansökan 27UO/7U (patent 56698)

On jo tunnettua, että eräät aktinomyseetit, ennen kaikkea Actinoplanaceae-heimon mikro-organismit kehittävät glykosidihydrolaasien, lähinnä ruuansulatuskanavan hiilihydraatteja pilkkovien entsyymien inhibiittoreita. Eräs tällainen inhibiittoriryhmä on suhteellisen lärrmönkestävä ja huoneen lämpötilassa happoja ja alkaleja kestävä. Nämä inhibiittorit ovat kemialliselta rakenteeltaan amino-sokereita.

Useimmat tämän ryhmän inhibiittoreista ovat hyvin tehokkaita amylaasi-inhibiittoreita, mutta sakkaraasi-inhibiittoreina vain keskivahvoja tai heikkoja (katso suomalainen patenttijulkaisu n:o 49 774).

Keksinnön kohteena on menetelmä mikrobiologisesti valmistettujen amino-sokerijohdannaisten erottamiseksi ja puhdistamiseksi, joilla aminosokereilla 58158 □n yleinen kaava

HQ OH OL

H

HO -( y N H VR

>==/ H )-( CH20H h oh oh jossa R on sakkaridiketju, jossa on 1-7 heksoosiyksikköä.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että Actinoplanes sukuun kuuluvia mikro-organismeja aerobisissa olosuhteissa ja vesipitoisessa ravintoväliaineessa viljelemällä saadun huovaston erottamisen ja saadun vilje-lysuodoksen mahdollisesti aktiivihiilellä pH:ssa 1-3 suoritetun värinpoistokä-sittelyn jälkeen a) viljelysuodos johdetaan vahvasti happamesta ja vahvasti emäksisestä ioninvaihtajasta muodostettuun sekakerrokseen, b) saatu Suodos viedään ioninvaihtajalle, c) ioninvaihtajaan sitoutuneet aminosokerit joko desorboidaan kokonaisuudessaan ammoniakin avulla ja sen jälkeen fraktioidaan sinänsä tunnetulla tavalla yksittäiskomponenteiksi käyttäen geelisuodatusta tai selluloo-sakolonnikromatografiaa, tai ne eluoidaan selektiivisesti laimealla hapolla, ja näin saaduista eluaateista eristetään yksittäiset aminosokerit.

Kuten edellä mainittiin, nämä uudet aminosokerijohdannaiset ovat voimakkaita ruuansulatuskanavan glykosidihydrolaasien inhibiittoreita. Tällöin — alerrmilla jäsenillä, joissa R on sakkaridiketju, jossa on 1 tai 2 heksoosiyksikköä, on pääasiallisesti voimakas sakkaraasia inhiboiva vaikutus, korkeampien jäsenien inhiboidessa voimakkaasti pääasiallisesti amylaasia.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuilla aminosokerijohdannai-silla on vahva spesifinen sakkaraasia ja/tai amylaasia inhiboiva vaikutus.

Joillakin uusilla aminosokerijohdannaisilla in vivo -estovaikutus on monin verroin suurempi kuin niiden in vitro -estovaikutus.

58158

Erityisen yllättävänä on myös pidettävä sitä, että keksinnön mukaisesti valmistetun homologisen sarjan alerrmat jäsenet inhiboivat glukoosiresorptiota in vivo. Näiden yllättävien ominaisuuksien perusteella uusien aminosokerijohdan-naisten valmistus on tärkeätä lääkeaineopillisesti.

Keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamiseksi käytetään aktinomyseettei-hin kuuluvia Actinoplanaceae-heimoon kuuluvan Actinoplanes-suvun kantoja. Esimerkkeinä mainittakoon kannat Actinoplanes spec. SE 50 (CES 961 70), SB 10 (CBS 957 70) ja SE 82 (CBS 615 71). Näitä mikro-organismeja on jo selostettu saksalaisessa hakemusjulkaisussa n:o 2 064 092, ja ne on talletettu suluissa olevin numeroin laitoksessa Centralbureau vor Schirmnelcultures (Baarn/HoHanti).

Erityisen sopiviksi osoittautuivat keksinnön mukaan valmistettujen ami-nosokerijohdannaisten kokonaissaannon kannalta ja/tai käymisessä seoksena muodostuneiden aminosokerijohdannaisten tähteen R koon kannalta kannat SE 50/13 (CBS 614 71) ja SE 50/110 (CBS 674 73). Molempien kantojen kuvaukset vastaavat melkoisesti emäkantaa SE 50. Nämä kannat on saatu mutageeneja käyttämättä luonnollisen valinnan myötä kannasta SE 50.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käsiteltävä viljelyliemi on saatu viljelemällä Actinoplanes-sukuun kuuluvia mikro-organismeja vesipitoisessa ravin-toväliaineessa, joka hiililähteen ohella sisältää typpilähdettä, suoloja ja - vaahtoamista ehkäiseviä aineita tavanomaisina pitoisuuksina, jotka voivat vaih della laajoissa rajoissa.

Hiililähteitä ovat pääasiallisesti hiilihydraatit, erityisesti tärkkelys, maltoosi, glukoosi ja kahden tai kolmen tällaisen aineen seokset ja monimutkaisemmatkin seokset, kuten esim, mallasuute.

Typpi lähteinä voidaan käyttää mikrobiologiassa tavallisia kompleksiseok-sia, kuten esim. kaseiinihydrolysaattia, hiivauutetta, peptonia, kalajauhetta, kalauutteita, maissinliotusvettä, lihauutetta ja myös näiden seoksia samoin kuin aminohappoja ja/tai arrmoniumsuoloja.

Viljely suoritetaan aerobisesti ilmastoiduin täryviljelmin tai säiliö-viljelmin. Hiililähteen laatu ja konsentraatio sekä käymiseen käytettävä kanta 58158 vaikuttavat tähteen R kokoon lopputuotteessa niin paljon, että homologisen sarjan yksityisiä jäseniä tai ainakin homologisarjan hyvin kapean alueen jäseniä voidaan valmistaa lähes selektiivisesti. Tällöin on osoittautunut, että ravintoliuoksissa, joissa on tärkkelystä yli 2 %, muodostuu ensisijaisesti aminoso-kerijohdannaisia, joissa on 4-7 heksoosiyksikköä, ja että tähän tuotantoon soveltuu erityisesti kanta SE 50/13 (CBS 614 71). Eräissä tapauksissa riittää kuitenkin jo se, että ravintoliuoksiin, joissa on esim. 3,5 % glukoosia perushiili-lähteenä, lisätään 0,1 - 3 %, lähinnä 0,5 - 2 % tärkkelystä, jolloin saadaan 4-7 heksoosiyksikköä sisältävien aminosokerijohdannaisten seoksia. Edelleen on osoittautunut, että tärkkelystä sisältämättömissä ravintoliuoksissa ja erityisesti lisättäessä ravintoliuokseen maltoosia, erityisesti kannalla SE 50 (CBS 961 70) — voidaan saada pääasiallisesti 2-3 heksoosiyksikköä sisältäviä aminosokerijohdan-naisia. Erityisen sopiviksi keksinnön mukaisessa menetelmässä sellaisen aminosokeri-johdannaisen valmistamiseksi, jossa R on glukoosi, ovat osoittautuneet ravintoliuokset, joissa hiililähteenä on vain glukoosia. 3os ravintoliuoksessa on ylimäärin glukoosia, pitkän käymisen aikana muodostuu myös pitkäketjuisempia aminosokerijohdan-naisia. Tietyin rajoituksin tämän voidaan katsoa johtuvan siitä, että käymisen aikana typpilähteiden loppuminen tapahtuu samanaikaisesti, kun glukoosi loppuu.

Jos ravintoliuoksissa pyritään käyttämään yksinomaan glukoosia ja hiililähteeksi lisätään maltoosia, saadaan pääasiallisesti aminosokerijohdannaista, jossa on 2 heksoosiyksikköä. Puhdas maltoosi voidaan tällöin korvata myös halvemmilla seoksilla, kuten esim. Maltzinilla, luonnosta saatavalla mallasuutteella, jota tuottaa Diamalt AG, Munchen. Maltotrioosipitoisuutta vastaten muodostuu tällöin myös seu- ~ raavaa korkeampaa homologia. Erityisen sopivaksi alempien homologien valmistuksen kannalta osoittautui kanta SE 50/110, joka optimaalisissa ravintoliuoksissa antaa noin kaksi kertaa suuremmin saannoin alempia homologeja kuin kanta SE 50/13.

s 58158

Ravintoliuoksen muu koostumus, erityisesti typpilähteiden konsentraatiot ja suolakoostumus voivat käymisen yhteydessä vaihdella laajoissa rajoissa.

Ravintoliuokset steriloidaan tavalliseen tapaan. Ravintoliuoksen pH-arvot ovat välillä 5,0 - 8,5, lähinnä välillä 6,0 - 7,8. Hautomislämpötilat ovat välillä 15 ja 45°C, lähinnä välillä 24-32°C. Valmistettaessa korkeampia homologeja käyttämällä kantoja SE 50 ja SE 50/13, korkeampi lämpötila, esim.

28°C, on edullisempi; valmistettaessa alempia homologeja käyttämällä kantoja SE 50 ja SE 50/110, edullisempi on alhaisempi lämpötila esim. 24°C. Viljely-aika on 1-8 päivää, lähinnä 2-6 päivää. Pitempi viljelyaika suosii, etenkin ^ silloin, kun hiilihydraatteja on läsnä ylimäärin, korkeampien homologien muo dostumista. Käymisen loppukohta määritetään määrittämällä estoaktiivisuus ent-symaattisessa estokokeessa ja koostumus levykromatografisesti.

Saatujen aminosokerijohdannaisten eristäminen ja puhdistaminen tapahtuu mikrobiologisista viljelmäliemistä.

Jos lähtöliuokset ovat värjäytyneet hyvin tummiksi, niille suoritetaan ennen keksinnön mukaisten aineiden adsorptiota värinpoistokäsittely aktiivihiilellä happamessa pH:ssa (pH = 1-3] adsorptiohartsilla, esim. tuotteella Lewapoi^ Ca 9221 (epäspesifinen polystyreeniin perustuva hartsi] raekoko 0,35 rrm (Rayer AG], pH:n ollessa välillä 2-7, lähinnä pH-välillä 2-3. Aktiivihiili sitoo happamessa alueessa ensisijaisesti väriaineita, kun taas Lewapol ei adsorboi keksinnön mukaisia aminosokerijohdannaisia neutraalissa eikä happamessa ympäristössä.

—Pienimolekyylisten, inhibiittorivaikutusta omaavien aminosokerijohdannaisten erottaminen neutraaleista sakkarideista onnistuu myös kromatografoimalla selluloosa-pohjaisilla ioninvaihtajilla, lähinnä fosfoselluloosalla (Phospho-Cellulose, Fa. Serva, Heidelberg]. Eluointiaineina käytetään tällöin puskureita, lähinnä fosfaattipuskureita, joiden ionivahvuus on vähäinen, lähinnä 2-100 rrfl, erityisesti 5-10 mM, pH:n ollessa välillä 2,5 - 8, lähinnä pH-välillä 5-6. Tehokkaan fraktioit inisen edellytyksenä on, että fraktioitavien preparaattien 58158 suolapitoisuudet ovat mahdollisimman pienet, kun sensijaan väriaineet häiritsevät vähenmän.

Keksinnön mukaisten inhiboivasti vaikuttavien aminosokerijohdannaisten homologi-sarjan yksityisten jäsenten valmistamiseksi puhtaina tuotteina esipuhdis-tetut preparaatit kromatografoidaan sopivalla molekyyliseulalla, esim. valmisteella Bio-Gel®P-2 (polyakryyliamidi, Fa. Bio-Rad, Munchen), ja eluaatin fraktiot tutkitaan levykromatografisesti. Puhtaita aminosokerijohdannaisia sisältävät fraktiot yhdistetään, kromatografoidaan uudelleen ja lyofilisoidaan konsentroinnin jälkeen tai saostetaan orgaanisilla liuottimilla.

Kemiallisen luonteensa mukaisesti keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut aineet kuuluvat hiilihydraatteihin. Ne muodostavat homologi-sarjoja, joiden — perusrunkona on pidettävä seuraavaa aminosokerijohdannaista 9^33^13*^ ^ ** heksoosi), CH20H h oh oh

Korkearrmat jäsenet eroavat täten perusrungosta siten, että niissä kussakin on yksi monosakkaridi-yksikkö, lähinnä heksoosi-, erityisesti glukoosi-yksikkö enemmän kuin sarjan edellisessä jäsenessä.

Esimerkkinä homologisen sarjan rakenneperiaatteesta esitetään tapaus, jossa ^ sakkaridiketjun muodostaa 1-7 glukoosiyksikköä. (Kaava esittää tällöin sakkaridi-ketjua, jossa n = 1-7 glukoosiyksikköä):

OH ,0H CH3 OLOH

CH20H H OH OH V OH OH n

Sarjan perusrunko vastaa tapausta, jolloin n = 1 ja tästä käytetään nimitystä "Komponentti II". Jokainen sarjan jäsen eroaa seuraavaksi alemmasta tai seuraavaksi korkeammasta jäsenestä siten, että siinä on yksi glukoosi-yksikkö enemmän tai vähemmän. Yhden 7 58158 glukoosi-yksikön verran "Komponenttia II” suuremmasta yhdisteestä käytetään tällöin nimitystä "Komponentti III", 2 glukoosi-yksikköä suuremmasta yhdisteestä nimitystä "Komponentti IV” jne.

Kaikki nämä yhdisteet ovat tunnettuja siitä, että täydellisessä happamessa hydrolyysissä niistä muodostuu glukoosia ja lähemmin määrittelemätöntä ns. "Komponenttia I”.

"Komponenttia II” voidaan fysikokemiallisten omineisuuksiensa, rakenteensa ja reaktiokykynsä osalta luonnehtia seuraavas-t i : _ Komponentti II on väritön, amorfinen kiinteä aine, joka liukenee hyvin veteen, d imetyy 1 if ormamid i i n , dimetyylisulfoksidiin ja metanoliin. Kuumentamalla se liukenee myös etanoliin.

— a) Levykromatografia

Ajoneste: etikkaesteri/MeOH/h^O 10:6:4 (DC-Fertigfolien = levykromatografiässä käytettävät valmiit kalvot).

I. DC-Fertigf olien F 1 500 Kieselgel, Schleicher & Schiill

Rf-arvot: II 0,46 maltoosi: 0,50 glu koosi: 0,65 II. DC-Fertigplatten F 254 Kieselgel, Merck

Rf-arvot: II 0,47 maltoosi: 0,54 glu koosi: 0,66

Komponentti II saadaan näkyväksi silikageelilevyillä edullisimmin AglN^/NaOH-suihkereagenssi 1 la . Ruskeanmusta väri kehittyy jo huoneen lämpötilassakin tai lievästi lämmitettäessä.

b) Kaasu kromatografia:

Kaasukromatografista tutkimusta varten komponentti II si-lyloidaan <X- ja /3-D-glukoosin kanssa tai myös käyttämällä sisäisenä standardina sakkaroosia seoksessa, jossa on pyridiiniä M), tri-metyylikloorisilaania (0,5) ja N-metyyli-trimetyyli-silyyli-tri-fluoriasetamidia (1).

Kolonni: 1Θ0 cm, lasia, täyte 3 % SE 30/Chromosorb WAW

Lämpötilat: Suut inkappale 3 00°C

Detektori 300°C

8 581 58

Uuni 220°C isoterminen, kunnes <X- ja /VD-glukoosi-piikit ovat eluoituneet; sen jälkeen lämpötilaoh-jelma 15°C/min 300°C:seen asti.

Detektori; F I D (Flammen Ionisations Detektor)

Kaasut: Kantokaasu: N2 40 ml/min

Polttokaasu: Ilma 80 ml/min H2 20 ml/min

Retent ioajat: oc-D-glukoosi 3 min /VD-glukoosi 4 min

Sakkaroosi 12-13 min II 16-17 min c) Kiertokulma

Kiteytymätöntä näytettä II, joka oli saatu konsentroimalla — II:n metanoliliuosta, liuotettiin veteen ja määrättiin spesifinen kierto: /<*70 = +134,3°.

d) IR-spektri Vähänsanova, huonosti strukturoitu IR-spektri KBr:a käytettäessä. Pääabsorptiojuovat 0-H:n ja C-0:n valenssivärähtelykohdil-la .

e) NMR-spektri: CD30D/220 MHz: (kuva 1) £>, ppm Multiplisiteetti suhteellinen intensiteetti

1.3 dubletti} 0=6, 5 Hz 3 H

2.3 "tripletti"; 0lU.J2 8-10 Hz 1 H

3,15 "tripletti”; u-J2 7-9 Hz 1 H

3,3-3,9 signaaleja ei voi eritellä 12 H

4,13 AB-systeemi; 0=12 Hz 2 H _

4,48 ^ dubletti; 0=7 Hz ^ ^ H

ja 5,1J dubletti; 0=2,5 Hz j 4,9 singletti 11 H deuteriumia vas taan vaihtuneet protonit

5,0 dubletti; 0=2-3 Hz 1 H

(heikosti erottunut)

5,8 dubletti; 0=3-4 Hz 1 H

(heikosti erottunut) _

33 H

9 58158 f] Komponentin II asetylointi:

Komponentin II annetaan reagoida seoksessa, jossa on suhteessa 1:1 asetanhydridiä ja pyridiiniä, huoneen lämpötilassa de-ka-asetyylijohdannaiseksi (molekyylipaino: 903). Jos reaktio suoritetaan jääetikka/etikkahappoanhydridi-seoksessa 1:1 käyttämällä katalyyttisiä määriä h^SO^ra, massaspektroskooppisesti voidaan osoittaa, että deka-asetyylijohdannaisen ohella on muodostunut myös undeka-asetyylijohdannaista (molekyylipaino: 945).

□eka-asetyylijohdannaisen NNR-spektri: (kuva 2)

Deka-asetyylijohdannaisen MS-spektri:

Molekyylipiikki: 903 (suht. intensiteetti 2,5 %)

Emäspiikki: 843

Edellä mainitussa mittausalueessa olevia tärkeitä fragment-tipiikkejä: 844 (55 % suht. intensiteetti) 784 (36 % suht. intensiteetti) 783 (34 % suht. intensiteetti) 759 (35 % suht. intensiteetti) 556 (36 % suht. intensiteetti) 496 (37 I suht. intensiteetti) 436 (29 % suht. intensiteetti) g) Komponentin II metylointi

Metyloitaessa komponenttia II CH^J/NaH-yhdistelmälla dime-tyylisuIfoksidissa Hakomori’n mukaisesti, päätuotteena saadaan komponentin II dekametyylijohdannaista, vähäisessä määrässä myös undekametyy1ij ohdannaista.

Massaspektri:

Molekyylipiikki: 623 (suht. intensiteetti 6,1 %)

Emäspiikki: 535 2. molekyylipiikki: 637 (suht. intensiteetti 0,2 %)

Spektroskooppisten arvojen ja kemiallisten ominaisuuksien perusteella komponentille II saadaan seuraava rakennekaava: 10 581 58

OH OH CHj MgOH

HO / \ N -/ Λ O / \—OH

CHgOH H OH' OH OH OH

Komponentti II on o(- ja ^-muotojen seoksena, kuten erityisesti NMR-spektrit osoittavat.

Homologisen sarjan seuraavalla jäsenellä, "Komponentilla ^ II Im^25H43°1 θ1^ 00 rakennekaava

OH OH CH3 CH2OH CHjOH

-Q- ° °-Q- “

CHjOH H OH OH OH OH OH OH

Komponentilla III on seuraavat fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet:

Se on hyvin veteen liukeneva amorfinen, kiinteä tuote, a) Levykromatografia

Ajoneste: Etikkaesteri/Me0H/H20 10:6:4 I. DC-Fertigfolien F 1500 Kieselgel (Schleicher & Schull): _

Rf-arvot: III 0,35 maltoosi: 0,50 II. DC-Fertigplatten F 254 Kieselgel (Merck):

Rf-arvot: III 0,33 maltoosi: 0,54

Komponentista III saadaan AgNO^/NaOH-suihereagenssilla jo huoneen lämpötilassa tai hieman levyjä lämmittämällä ruskeanmusta väriläik-k ä.

11 58158 b) IR-spektri Vähän sanova, huonosti erottunut IR-spektri KBr:a käytettäessä, pääabsorptiojuovat 0-H:n ja C-0:n valenssivärähdysalueella (3 700 - 3 100 cm"1 tai 1 180 - 950 cm"1).

c) Kiertokulma fo£7 H20:ssa: +147,2° d) III:n NMR-spektri D20:ssa/220 MHz: (kuva 3) e) Metylointi Hakomori'n mukaisesti:

Metyloitaessa III:a CHgJ:llä ja NaH:lla DMS0:ssa päätuotteena saadaan myös 14-kertaisesti metyloitunutta tuotetta.

f) Metylointituotteen massaspektri

Molekyylipiikki kohdassa Θ27 (1,5 % suht. intensiteetti) vastaa bruttokaavaa ^g^gNO^g. (Suht. intensiteetin ollessa 0,1, kohdalla Θ41 on toinen molekyylipiikki.) Tärkeimmät fragmenttipiikit ovat: 739 (27 % suht. intensiteetti) 592 (3,7 % suht. intensiteetti) 535 (30 % suht. intensiteetti) 388 (9 % suht. intensiteetti) 386 (13 % suht. intensiteetti) 284 (13 % suht. intensiteetti) 187 (12 % suht. intensiteetti) 171 (40 % suht. intensiteetti) 101 (34 % suht. intensiteetti) 88 (25 % suht. intensiteetti) 75 emäspiikki.

Komponentti IV on homologisen sarjan lähinnä seuraava korkeampi jäsen. Yhdiste hajaantuu happamessa osittaishydrolyysissä komponenteiksi II ja glukoosiksi moolisuhteessa 1:2.

Levykromatografia:

Ajoneste: n-butanoli/etanoli/vesi = 50:30:20 DC-Fertigplatten F 1500 Kieselgel (Schleicher & Schull): R , . .-arvot: IV: 0,41 - 0,46 glukoosi ,2 5S158

Korkeampien homologien, erityisesti komponenttien V-VIII estovaikutus sakkaraasin suhteen on hyvin paljon pienempi ja haimasta peräisin olevan Οξ-amylaasin suhteen hyvin paljon voimakkaampi kuin sarjan alemmilla jäsenillä (komponenteilla II-IV).

Korkeampia komponentteja hydrolysoitaessa tuotteiden joukossa voidaan aina osoittaa olevan välituotteina muodostuvia alempia homologeja; pilkkoutumistuotteiden joukossa on myös glukoosia ja maltoosia.

Levykromatografia:

Ajoneste: n-butanoli/etanoli/vesi = 50:30:20 DC-Fertigplatten F 1500 Kieselgel (Schleicher S Schull):

Rglukoosi_arv°ja: V: °'30 ‘ °'34 VI: 0,21 - 0,23 VII: 0,14 - 0,16 VIII: 0,09 - 0,11

Inhiboivasti vaikuttavien aminosokerijohdannaisten ominais-estoaktiivisuudet määritetään entsyymiestokokein in vitro.

Amylaasi koe

Amylaasi-inhibiittori -yksiköksi (1 AIY) määritellään inhibiittori-määrä, joka pystyy inhiboimaan 50-%:isesti kaksi amylaasi-yksikköä. Yksi amylaasiyksikkö (AY) on se määrä entsyymiä, joka yhdessä minuutissa seuraavassa mainittujen koeolosuhteiden vallitessa lohkaisee tärkkelyksessä 1 ^-ekvivalentin glukosisidisidoksia. Lohjenneiden sidosten juVal määritetään muodostuneiden pelkistävien sokerien yuVal-arvona dinitrosalisyylihapolla kolorimetrisesti ja ilmoitetaan pVal-maltoosiekvivalentteina käyttämällä apuna maltoosi-vertailukäyrää. Kokeen suorittamista varten 0,1 ml:aan amylaasi-liuosta (20-22 AY/ml), lisätään 0-10 /ug inhibiittoria tai 0-20 pl ^ kokeiltavaa liuosta 0,4 ml:ssa 0,02 molaarista seosta natriumgly-serofosfaattipuskuri/0,001 moolia CaC^» pH:n ollessa 6,9, ja seoksen annetaan tasapainottua vesihauteella 35uC:ssa noin 10-20 minuuttia. Sen jälkeen inkuboidaan viisi minuuttia 0,5 ml:n kanssa 35°C:seen esilämmitettyä 1-%:ista tärkkelysliuosta (Stärke, löslich.

Firma Merck, Darmstadt, Nr 1252) 35°C:ssa ja sen jälkeen lisätään 1 ml dinitro-salisyylihappo -reagenssia (P. Bernfeld’in mukaisesti,

Co lowi c k-Kap lan, Meth. Enzymol., Band 1, sivu 149). Värin kuhitta- 58158 miseksi erää kuumennetaan viisi minuuttia kiehuvalla vesihauteella, minkä jälkeen jäähdytetään ja lisätään 10 ml tislattua vettä. Ekstinktio kohdalla 540 nm mitataan vastaavalla tavalla valmistettua amylaasitonta nollakoearvoa vastaan. Koetuloksen tulkitsemiseksi aikaisemmin laaditusta amylaasivertailukäyrästä luetaan inhibiittorin lisäämisen jälkeen vielä tehoava amylaasiaktiivisuus ja tästä lasketaan käytetyn amylaasin prosentuaalinen estovaikutus. Prosentuaalinen estokyky merkitään yhtälön jug inhibiittori + AY + + + laskettu kuiva-aineen suhteen ++ saman sarjan inhiboimattoman erän AY funktiona, käyrästä luetaan 50 %:n estokyvyn kohta ja muunnetaan yksiköiksi AIY/mg inhibiittoria.

Sakkaraasikoe

Sakkaraasi-inhibiittori -yksikkö (SIY) määritetään inhibiittorin määräksi, joka inhiboi 50-%:isesti kaksi sakkaraasiyksikköä. Yksi sakkaraasiyksikkö (SY) on se määrä entsyymiä, joka yhdessä minuutissa alla mainituissa koeolosuhteissa pilkkoo 1 μ moolin sakkaroosia glukoosiksi ja fruktoosiksi. Muodostuneen glukoosin μ moo-limäärä määritetään kvantitatiivisesti glukoosioksidaasireaktion avulla olosuhteissa, joissa sakkaroosin pilkkoutumista ei enää tapahdu sakkaraasin vaikutuksesta. Kokeen suorittamista varten 0,05 1 ) ml:aan sakkaraasi1iuosta , jonka SY on säädetty 0,12:ksi, lisätään 0-20 pg inhibiittoria tai 0-20 μ 1 tutkittavaa liuosta, ja 0,1 molaarista natriummaleinaattipuskuria pH 6,0, kunnes tilavuus on 0,1 ml. Tasapainotetaan 10 minuuttia 35°C:ssa ja sitten lisätään 0,1 ml 35°C:seen esilämmitettyä 0,05-moolia sakkaraasiliuosta 0,1 moolia natriummaleinaattipuskurissa pH 6. Inkuboidaan 20 minuuttia 35°C:ssa ja sakkaraasireaktio keskeytetään lisäämällä 1 ml glukoo-

1) Sian ohutsuolilimakalvosta liuotettua sakkaraasia (B. Borgström, A. Dahlquist. Acta Chem. Scan. 12, (1958), sivu 1997). Laimennettu 0,1-molaarisella natriummaleinaattipuskurilla pH

6,0 vastaavan SY-pitoisuuden omaavaksi.

1¾ 5 815 8 sioksidaasireagenssia^ inkuboimista jatketaan 30 minuuttia 35°C:ssa.

Sitten lisätään 1 ml 50-%:ista H2S0^:a ja mittaus suoritetaan kohdalla 545 nm vastaavaa no 1lakoearvoa vastaan. Koetulosten tulkitsemiseksi lasketaan käytetyn sakkaraasin prosentuaalinen estokyky ja 50 %:n estokykykohdasta saatu arvo muutetaan glukoosivertaus -käyrän avulla yksiköiksi SIY/g tai SIY/litra.

Ma Itääsi koe

MaItaasi-inhibiittori -yksikkö (MIY) määritetään inhibiittorin määräksi, joka inhiboi 50-%:isesti kaksi maltaasiyksikköä.

Yksi maltaasiyksikkö (MY) on se määrä entsyymiä, joka yhdessä mi- ^ nuutissa alla mainituissa koeolosuhteissa pilkkoo 1 μ moolin mal-toosia 2 μ mooliksi glukoosia. Muodostuneen glukoosin μ mooli-määrä määritetään kvantitatiivisesti glukoosioksidaasireaktion avul- — la olosuhteissa, joissa maltoosin pilkkoutumista maltaasin vaikutuksesta ei enää tapahdu. Kokeen suorittamista varten 0,05 mlsaan 2) maltaasiliuosta , jonka MY on säädetty välille 0,060 - 0,070, 0-20 mg inhibiittoria tai 0-20 ml tutkittavaa liuosta, ja sitten lisätään 0,1 moolia natriummaleinaattipuskuria pH 6,0, kunnes tilavuus on 0,1 ml. Tasapainotetaan 10 minuuttia 35°C:ssa ja sitten lisätään 0,1 ml 35°C:seen esi lämmitettyä 0,05 molaarista maltoosiliuos-ta 0,1 moläarisessa natriurrmaleinaattipuskurissa (pH 6,0). Inkuboidaan 20 minuuttia 35°C:ssa ja maltaasireaktio keskeytetään lisäämällä 1 ml glukoosioksidaasireagenssia , ja idättämistä jatketaan 30 minuuttia 35°C:ssa. Sen jälkeen lisätään 1 ml 50-%:ista H2S0^:a ja mittaus suoritetaan kohdalla 545 nm vastaavaa nollakoearvoa vastaan .

1) Glukoosioksidaasireagenssi valmistetaan liuottamalla 2 mg glu-koosioksidaasia (Fa. Boehringer Nr. 15423) 100 ml:aan 0,565 moolia tris-HCl -puskuria pH 7,0 ja lisäämällä sen jälkeen 1 ml detergenttiliuosta (2 g Triton X 100 + Θ g 95-%:ista etanolia p.a.), 1 ml dianisidiiniliuosta (260 mg o-dianisidiini HCl:a 20 ml:ssa H^0:ta) ja 0,5 ml 0,1-%:ista peroksidaasivesiliuosta (Fa. Boehringer Nr. 15302).

2) Sian ohutsuolilimakalvosta liuotettua maltaasia (B. Borgström, A. Oahlquist, Acta Chem. Scand 12, (1958), sivu 1997). Laimennettu 0,1 moolia natriummaleinaattipuskurilla (pH 6,0) vastaavan MY-pitoisuuden omaavaksi.

3) Glukoosioksidaasireagenssin valmistus: kuten sakkaraasikokeen (s. 19 alaviite 2), yhteydessä on selostettu.

15 581 58

Koetulosten tulkitsemiseksi lasketaan käytetyn maltaasin estovaikutus prosentteina ja 50 %:n estokykykohdasta saatu arvo muutetaan glukoosivertaus-käyrän avulla yksiköiksi MIY/g tai MIY/litra.

Tulokset in vitro -entsyymiestokokeista, joissa on käytetty keksinnön mukaisten aminosokerijohdannaisten yksityisiä homologeja ja tiettyjä homologi-seoksia, on koottu seuraavaan taulukkoon, jossa heksoosiyksiköt esittävät glukoosiyksiköitä: n = heksoosiyksikköjen lukumäärä AIY/g SIY/g MIY/g

Aminosokerijohdannainen, jossa n = 1 300 000 30 000 5 000 n = 2 300 000 6Θ 000 15 000 n = 3 1 400 000 21 000 5 000 n = 4-6 17 500 000 Θ 500 n = 5-7 30 000 000 2 500

Seuraavissa taulukoissa on verrattu edellämainittua glukoosiyksiköiden (n) in vitro vaikutusta sakkaraasi- ja <*-amylaasi-inhibitioon in vivo.

Sakkaraasi-inhibitio n in vitro in vivo SIY/mg ED50 mg/kg 1 30 3,0 2 68 0,21 3 21 2,65 4- 6 6,5 15,30 5- 7 2,5 — 52,00 58158 16 C-amylaasi-inhibitio n in vitro in vivo AIY/mg ED50 mg/kg 1 300 0,76 2 300 1,60 3 1400 1,61 4- 6 17500 1,42 5- 7 30000 1,00

Glukoosiyksikköjen «C-amylaasi-inhibitio Sakkaraasi-inhibitio lukumäärä (n) AIY/mg SIY/mg 4 67 000 7,0 5 57 000 3,5 6 42 000 1,2 7 24 000 0,06

Kuten taulukoista havaitaan, homologisen sarjan molekyylipainon kasvaessa spesifinen estoaktiivisuus haima-«i-amylaasin suhteen lisääntyy voimakkaasti; siten yhdisteillä, joilla n = 5-7, entsyymivaikutuksen ehkäisykyky in vitro on 100 kertaa voimakkaampi kuin aminosokerijohdannaisen, jossa n = 1 tai n = 2. Toisaalta sakkaraasi-inhiboituminen korostuu voimakkaimmin johdannaisten osalta, jossa n 2. Johdannaisen, jossa n * 1, ehkäisy-vaikutus on teholtaan vain puolet tästä, ja korkeampien johdannaisten spesifinen sakkaraasia ehkäisevä vaikutus putoaa tästä edelleen.

In vivo suoritussa sakkaroosi-kuormituskokeessa aktiivisuuden on todettu olevan suunnilleen samansuuntainen kuin in vitro -kokeissa todetun spesifisen estoaktiivisuuden. Sitä vastoin in vivo suoritetuissa tärkkelys-kuormi- 17 5 81 5 8 tuskokeissa todettiin aminosokerijohdannaisten, joissa n = 1, 2 ja 3 aktiivisuuden kohonneen 10-40 -kertaiseksi verrattuna amylaasin estokykyyn in vitro -kokeissa.

On tunnettua, että eläimillä ja ihmisillä esiintyy veren liikasokeri-suutta hiilihydraattipitoisten ravinto- ja nautintoaineiden (esim. viljan, perunatärkkelyksen, hedelmien, hedelmämehujen, oluen, suklaan) ottamisen jälkeen, mikä johtuu hiilihydraattien nopeasta pilkkoutumisesta glukoosihydrolaa-w sien (esim. sylki- ja haima-amylaasien, maltaasien, sakkaraasien) vaikutuksesta seuraavan kaavion mukaisesti: Tärkkelys tai glykogeeni amylaasi y t maItääsi y J j & 'maltoosi 'glukoosi sakkaraasi y

Sakkaroosi glukoosi + fruktoosi Tämä veren liikasokerisuus on erityisen selvä ja säilyvä diabeetikoilla. Lihavilla ravinnosta johtuva veren liikasokerisuus aiheuttaa usein erityisen voimakasta insuliinin erittymistä,joka puolestaan lisää rasvanmuodostusta ja vähentää rasvan pilkkoutumista. Tällaisen veren liikasokerisuuden yhteydessä terveen aineenvaihdunnan omaavilla ja lihavilla henkilöillä esiintyy insuliinin erittymisen seurauksena usein hypoglykemiaa. On tunnettua, että sekä veren liikasokerisuus että myös mahalaukussa viipyvä ruokasula edistävät mahanesteen muodostumista, joka puolestaan aiheuttaa tai edistää mahakatarrin, mahahaavan tai pohjukaissuolihaavan muodostumista.

Nyt on keksitty, että keksinnön mukaisilla menetelmillä saadut ja eristetyt g 1ykosidihydrolaasien inhibiittorit vähentävät huomattavasti ravinnosta aiheutuvaa veren liikasokerisuutta, liikainsuliinisuutta hypo-g 1 y kerii i aa sen jälkeen, kun rottien ja/tai ihmisten ai noonvaihdu-ntaa on rasitettu vehnätärkkelyksellä tai sakkaroosilla tai maltoosilla, ja jouduttavat näiden mainittujen hiilihydraattien kulkua mahan läpi.

Tämän lisäksi ne ehkäisevät glukoosin re- 58158 18 sorptiota suolesta. Edelleen hiilihydraattien muuttuminen rasvakudoksen lipideiksi ja ravinnosta peräisin olevan rasvan varastoituminen rasvakudoksiin vähenee tai hidastuu.

Edelleen on tunnettua, että mikro-organismit pilkkovat suuontelossa hiilihydraatteja, etenkin sakkaroosia ja edistävät siten harrmasmädän muodostumista.

Glykosidihydrolaasien inhibiittorit soveltuvat sen vuoksi hoitoaineiksi seuraavien tautien yhteydessä: liikalihavuus, veren liikarasvaisuus (valtimon haurauskovetustauti), sokeritauti, esisokeritauti, mahakatarri, mahahaava, poh-jukaissuolihaava ja harmasmätä.

Eräiden käytettävien reagenssien ja apuaineiden selvennyksiä: Amberlite IRA 410 Cl (anioninvaihtaja); Amberlite IRC 120 (H -muoto) vahvasti hapan ka-tioninvaihtaja; Amberlite (HCO^’-muoto) (anioninvaihtaja); Amberlite IRA 410 OH (vahvasti emäksinen anioninvaihtaja); Amberlite IRC 50 H (vahvasti hapan kati-oninvaihtaja); /ftohm and Haas Company'n tavaramerkkejä sekä Dowex 50 WX 4H (vahvasti hapan kationinvaihtaja). Yhtiön Dow Chemical Co. Midland, Michigan, USA tavaramerkki.

Selluloosapohjaisena anioninvaihtajana voidaan käyttää esim. tuotetta DE AE-Zellulose, Firma Schleicher und SchQll.

Polyakryyliamidi-geelinä voidaan käyttää esim. tuotetta Biogel P-2 (yhtiön Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA, tavaramerkki). _

Maltzin on yhtiön Oiamalt AG, Munchen (BRD) luonnonmallasuute.

Lewapol® on yhtiön Bayer AG, Leverkusen (BRD) spesifioimaton poly-styreeni-adsorptiohartsi.

Clarcel on yhtiön CECA, Velizy-Villacoublay, Ranska, suodatusapuaine (piimää/selluloosa).

SE 30 on yhtiön Hewlett Packard silikonielastomeeri.

Seuraavien esimerkkien heksoosiyksiköt esittävät glukoosiyksiköitä.

19 581 58

Levykromatografinen tutkimus Käymisestä saadun lopputuotteen ja preparaattien koostumuksen arvioimiseksi levykromatografisesti 1 jul käymislientä tai 1 μg preparaatteja pannaan silikageelivalmiskalvolevyille (Fa. Schleicher & Schull, Dassel. Typ F 1500) ja kehitetään kaksi kertaa n-butanoli/etanoli/vesiseoksella 50/30/20.

Sakkaraasi-inhibitiovärin aikaansaamiseksi kehitetylle ja hyvin kuivatulle levylle ruiskutetaan entsyymigeeliä (20 ml/20 x 20 cm:n levy) ja geelin — annetaan jähmettyä. Sen jälkeen esi-inkuboidaan viisi minuuttia kosteuskarrmios- sa huoneen lämpötilassa ja tämän jälkeen suihkutetaan riittävästi substraatti-geeliä. Tämän teisen geelikerroksen jähmetyttyä levy pannaan kosteuskammioon ja idätetään 40°C:ssa. Inhibitioväri (vaaleita läikkiä, punaisenruskea tausta) kehittyy 60-90 minuutissa. Värinmuodostuksen kehittäminen keskeytetään optimihet-kellä, ja levy kuivataan sillä olevine agar-kerroksineen tuuletuskuivaimessa lämminilma11a.

Geelien valmistus

Entsyymigeeli: 1,5 g Agarose-valmistetta ((-'Industrie Biologique Francais) suspendoidaan 100 ml:aan 0,2-molaarista Na-maleinaattipuskuria, pH 6,0, ja liuotetaan sen jälkeen kiehauttamalla. Kirkas Agarose-liuos jäädytetään 50°C:seen ja astiaa heilautellen lisätään 250 μ. Triton X-100 -liuosta (2 g Triton X-100 + Θ g etanolia p.a) ja 0,5 ml dianisidiiniliuosta (20 mg _ dianisidiinia/1 ml asetonia). Juuri ennen geelin käyttämistä lisätään 1 ml GOD/POD-reagenssia (12,5 mg Glucoseoxidase, Reinheitsgrad I, Fa. Boehringer, Best. Nr. 15423 ja 2,5 mg Peroxidase, Reinheitsgrad 20 58158 II, Fa. Boehringer, Best. Nr. 15302, liuotettuna 5 ml:aan maleinaat-tipuskuria) ja 4-5 yksikköä sakkaraasia, jota on saatu sian ohutsuolesta1^. Geeli on pidettävä ruiskuttamiseen sakka 50°C:ssa, koska se muuten ruiskutettaessa jähmettyy suuttimiin.

Substraattigeeli: 0,5 g agaroosia suspendoidaan 100 ml:aan Na-maleinaattipuskuria, pH 6,0 ja liuotetaan kiehauttamalla. Sen jälkeen jäähdytetään sivulla 16, alaviitteessä 1) selostetulla tavalla valmistettua entsyymipreparaattia 50°C:seen, lisätään 100 1

Tritonia (2 g Triton X-100 + 8 g etanolia, p.a.) ja 1 g sakkaroosia (Serva Nr. 35579). Sakkaroosin liuettua geeli on valmista käytet- __ täväksi.

Amylaasi-inhibitiovärin aikaansaamiseksi kehitetylle ja kuivatulle kromatografilevylle suihkutetaan amylaasigeeliä (20 ml/ 20 x 20 cm:n levylle) ja annetaan jähmettyä. Viisi minuuttia kestäneen huoneen lämpötilassa tapahtuneen esi-inkuboinnin jälkeen levy geelikalvoineen pannaan 0,5-%:iseen tärkkelysliuokseen (1 g tärkkelystä, Merck Nr. 1252, liuotettu kiehuttaen 200 ml:aan puskuri-liuosta 0,2 m glyserof osf aatti/0,01 m CaC^, pH 6,9) ja pidetään siinä kaksi minuuttia 40°C:ssa ja liuosta käännellen. Sen jälkeen levy huuhdellaan hyvin tislatulla vedellä ja upotetaan hajaantu-mattoman tärkkelyksen värj äämiseksi laimennettuun ^"liuokseen (4 ml J2~Perusliuos^a 500 ml:ssa H20:ta; J2"PBrusliuos: 2,2 g + 4,4 g KJ liuotettu 100 ml:aan H20:ta). Optimiväri on muodostunut noin yhden minuutin kuluttua. Levy valokuvataan välittömästi, koska siniset täplät haalistuvat nopeasti.

Amylaasigee1in valmistus: 1 g agaroosia liuotetaan 100 ml:aan 100°C:ssa olevaa puskuriliuosta 0,2 m natriumglyserof osf aatti/0,01 m CaC^» pH 6,9 ja 50°C:seen jäähdyttämisen jälkeen lisätään 100 μΐ amylaasikidesus-pensiota (10 mg sianhaima-amylaasia/ml kyllästettyä NH^-sulfaatti-liuosta, Fa. Boehringer, Nr. 15017).

Ks. sivun 13 alaviite 1) 2’ 58158

Esimerkki 1

Lasiseen käymisastiaan, jossa oli 8 litraa ravintoliuosta, joka sisälsi 5,0 % tärkkelystä, 1,0 % hiivauutetta, 0,2 % K^HPO^iä, ympättiin kolmen vuorokauden ikäistä Actinoplanes-kannan SE 50/13 ravistusviljelmää (CBS 6lU 71) ja haudottiin tehokkaasti sekoittaen ja ilmastoitiin kolme vuorokautta 28°C:ssa, jolloin saatiin viljelmälientä, jossa oli 105 000 AIY/ml. Tästä otetun kuuden litran suuruisen käymisliemierän pH säädettiin, 20°C:seen jäähdyttämisen jälkeen, puoli-väkevällä HNO^illa arvoon 2,5, lisättiin 30 g Carboraffin-aktiivihiiltä ja sekoitettiin 10 minuuttia. Sen jälkeen sentrifugoitiin 15 minuuttia kierrosluvun ollessa 10 000 kierr./min, ja kirkas, vaaleankeltainen pintafaasi väkevöitiin NH^:lla ^ suoritetun neutraloinnin jälkeen 500 ml:ksi. 500 ml konsentraattia sekoitettiin 1*5 minuuttia 200 g:n kanssa Amberlite IRA 1+10 cl :a, suodatettiin imua käyttäen, ja suodokseen lisättiin U/5-tilavuusosaa = 1*00 ml metanolia, korkeampimolekyylisten ^ tärkkelyspilkkoutumistuotteiden pääosan saostamiseksi erilleen (yhdessä vielä läs näolevan aktiivihiilijäännöksen kanssa). Sentrifugoitiin viisi minuuttia kierrosno-peudella 5 000 kierr./min, 850 ml:n suuruinen päällä oleva faasi tiputettiin tehokkaasti sekoittaen h litraan abs.etanolia. Valkea höytymäinen saostuma suodatettiin imua käyttäen, pestiin kolme kertaa abs. etanolilla ja kaksi kertaa eetterillä ja o 6 kuivattiin vakuumissa 50 C:ssa. Saanto 36 g valkeaa jauhetta, jossa oli 10 x 10 AIY/g.

30 g saatua tuotetta liuotettiin 250 ml:aan H20:ta. Tämän liuoksen johtokyky oli 10 mS, pH 5,5· Suolan poistamiseksi liuokseen lisättiin 60 g Amberlite IRC 50 H :ta (heikosti hapan kationinvaihtaja, joka sitoo aminosokerijohdannaista vesi-liuoksesta vain hivenen) ja 20 g Amberlite IRA 1*10 OH :ta ja sekoitettiin 20 minuuttia. Suodoksen (johtokyky 0,5 mS, pH 3,5) pH säädettiin 1-norm. HClrlla 3,0:ksi (johtokyky 0,6 mS). Tämä liuos pumpattiin nopeudella 1*2 ml/h kolonnin läpi, joka oli täytetty valmisteella Dowex 50 WX 1+ H+, 0,071+ - 0,037 mm (2,5 cm, korkeus 1*0 cm, tasapainotettu 0,001-norm. HCl:ssa) ja pestiin sen jälkeen 2 litralla 0,001-norm. HCl:a. Pylvään pesun jälkeen eluoitiin 1,2-/S:isella ammoniakin vesiliuoksella ja koottiin 10 ml:n fraktioita. Inhibiittoriaktiiviset fraktiot yhdistettiin, ammoniakki imettiin pois vakuumissa ja sen jälkeen liuos konsentroitiin vakuumissa 30 mlrksi. Tuote saostettiin tiputtamalla liuos 600 ml:aan kuivaspriitä, sakka imusuodatettiin erilleen, ja kurvattiin alkoholilla ja eetterillä suoritetun pesun jälkeen vakuumissa. Saanto 1*, 1* g tuotetta, jossa oli 26,5 x 10^ AIY/g.

Hienopuhdistus suoritettiin geelisuodattamalla tuote 0,5 g:n erissä (liuotettu 10 ml:aan vettä) Biogel P-2:lla (0,07*+ - 0,037 mm, Fa. Bio Rad) täytetyn pylvään (halkaisija 5 cm, pituus 95 cm) lävitse. Kehittäminen suoritettiin vedellä virtausnopeudella 80 ml/tunti. Koottiin 12 ml:n fraktioita. Kaikista fraktioista määritettiin kokonaishiilihydraattipitoisuus (antroni-koe, ekstinktio E 620) 22 581 58 sekä sakkaraasi-inhibiittori- ja amylaasi-inhibiittori -pitoisuudet. Levykromato-grafisen määrityksen perusteella (amylaasi-inhibitioväri) todetut aminosokeri-johdannaisfraktiot, joissa n = 5-7, yhdistettiin, konsentroitiin vakuumissa ja sa-ostettiin edellä selostetulla tavalla abs. etanolilla. Saanto 0,5 g:sta raakatuo-tetta: 0,2 g aminosokerijohdannaista, jossa n = 5~7 ja jossa oli 30 x 10^ AIY/g ja 2 5000 SIY/g.

Esimerkki 2

Litran Erlenmeyer-pullossa oleva 120 ml ravintoliuos, joka sisälsi 3,5 % glukoosia, 2 % tärkkelystä, 0,5 % kaseiinihydrolysaattia, 1,3 % hiivauutetta, 0,3 % CaC0^:a ja 0,3 % K^HPO^ia, ja säädettiin pH-arvoon 7,8, ja steriloitiin 30 min/121 C. Siihen ympättiin 6 ml Actinoplanes kannan SE 50/110 esiviljelmää — ravintoliuoksessa, jossa oli 3 % soijajauhetta, 3 % glyserolia ja 0,2 % CaCO^a ja viljelmää haudottiin 3-1+ päivää pyöröravistuskoneessa 2i+°C:ssa, jolloin saatiin viljelmäliuosta, jossa oli 153 000 AIY/ml ja 12 200 SIY/l.

Edellä kuvatulla tavalla valmistetusta viljelmäliuoksesta (2 litraa) erotettiin huovasto linkoamalla (13 000 kierr./min), ja saatu viljelmäsuodos, jonka aktiivisuus oli 13 000 SIY/g, sekoitettiin suolapitoisuuden vähentämiseksi (viljel-mäsuodoksen johtokyky: noin 10 mS) tunnin ajan 500 g:n kanssa seosta, jossa oli 2,5 osaa Amberlite IRC-50 (H+-muoto) ja 1 osa Amberlite IRA-1+10 (OH'-muoto).

Ioninvaihtaja erotettiin, liuos konsentroitiin hieman alle 100 ml:ksi ja sentri-fugoitiin liukenemattomien osien poistamiseksi nopeudella 20 000 kierr./min. 15 minuutin ajan. Päällä olevan faasin tilavuus täytettiin 100 ml:ksi; sen johtokyky oli nyt 3,5 mS ja se pantiin jatkopuhdistusta varten kolonnin (55 x 1+00 mm), jossa oli fosfoselluloosaa (P-Cellulosea, SERVA Kr. U5130; esikäsitelty tunnetuin menetelmin ja tasapainoitettu 5 mmoolia ammoniumfosfaattipuskurissa, pH 5,5)· Ajonesteenä käytettiin mainittua fosfaattipuskuria; virtausnopues oli 90 ml/t, ja ajon aikana koottiin tilavuudeltaan 18 ml:n fraktioita. —

Kun eluaatti-fraktioista oli tutkittu hiilihydraatti-pitoisuus (antronitestin avulla) ja sakkaraasia inhiboivat komponentit (sakkaraasi-inhibitiotestin avulla), yhdistettiin fraktiot, joiden antronitesti oli osoittanut olevan lähes hiilihydraatit- ~ tornia ja jotka samanaikaisesti olivat sakkaraasi-inhibitiotestissä osoittautuneet erikoisen tehokkaiksi (fraktiot 60-170), konsentroitiin 150 ml:ksi ja suodatettiin kollonin läpi (50 x 300 ml), jossa oli valmistetta Amberlite IRA-U10 (HCO^'-muoto). Deionisoitumisen kontrolloinnin parantamista varten eluaatti otettiin talteen frak-tioittain (10 ml fraktio 20 minuutin aikana) ja tutkittiin hiilihydraattipitoisuus (antronitestin avulla: koko ajan lähes negatiivinen), fosfaattipitoisuus (askorbiini-happo-molybdeeni -reagenssin avulla: koko ajan negatiivinen) ja sakkaraasi-inhi-bitiokyky (entsyymiestotestin avulla). Estoaktiiviset fraktiot (3~30) yhdistettiin, konsentroitiin ja lyofilisoitiin, liuotettiin uudelleen ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 280 mg raakainhibiittoria.

581 58 23

Jatkopuhdistusta varten raakainhibiittori fraktioitiin Bio-Gel-P-2:ta käyttäen esimerkissä 1 selostetulla tavalla. Fraktioista, jotka sisälsivät puhdasta aminosokerijohdannaista, jossa n = 1, eristettiin lyofilisoinnin jälkeen 30 mg tuotetta, jossa oli 0,3 x 10^ AIY/g ja 35 000 SIY/g.

Esimerkki 3 200 ml:n Erlenmeyer-pulloon, jossa oli 25 ml ravintoliuosta, joka sisälsi 0,1 % tärkkelystä, 0,02 % hiivauutetta, 0,1 %, K^HPO^, 0,2 % (NH^^SO^, 0,05 %

MgSO, , 0,05 % KC1, 0,01 % FeSOi , ympättiin kannan Asp.niger ATCC 1139*+ itiösus- ^ 4 o ' ..... ...

pensiota ja viljelmää inkuboitiin 28 C:ssa pyororavistuskoneessa, AIY-tutteri putosi kuudessa vuorokaudessa 210 000 AIY/ml:sta 53 000 AIY/ml:aan ja 10 vuorokauden aikana 21 300 AIY/ml:aan. Samanaikaisesti SIY/ml-pitoisuus lisääntyi 7,0:sta 72:een.

20 ml 10 päivän ajan itiösuspension kera inkuboitua ravintoliuosta sentri-fugoitiin huovaston eristämiseksi 30 minuuttia nopeudella 3 000 kierr./min. Päällä olleesta 15 ml:n suuruisesta erästä (72 000 SIY/l) poistettiin suolat sekoittamalla 30 minuuttia 2 g:n kanssa valmistettua Amberlite IRC 50 H+ ja 1 g:n kanssa tuotetta Amberlite IRA ^10 OH (johtokyky alle 2 mS). Suodatettiin ja suodos juoksutettiin nopeudella 5 ml/h pylvään läpi (0 1 cm x 10 cm), jonka Dovex H+ oli tasapainotettu 0,001-norm. HClilla. Sen jälkeen pestiin 200 ml:11a 0,001-norm. HCl:a. Tuotteen uuttamiseksi pylvään läpi pumpattiin 0,6-/6:ista NH^-liuosta ja uute otettiin talteen 5 ml:n fraktioina. Sakkaraasi-inhibitiovaikutusta omaavat fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin 2 ml:ksi rotaatiohaihduttimessa ja lisättiin 2 ml metanolia. Tämän liuoksen pH säädettiin välille 3~*+ ja seostettiin tiputtamalla 100 ml:aan asetonia. Sakka imusuodatettiin erilleen, pestiin asetonilla ja eetterillä ja kuivattiin va-kuumissa. Saanto: 26 mg, 28 000 SIY/g, jossa oli aminosokerijohdannaisia, joissa n -2 ja 3. Jatkopuhdistusta varten *t,0 g inhibiittoria geelisuodatettiin 0,5 g:n erissä Biogel P-2:n läpi. Tätä varten kukin 0,5 g:n preparaatti liuotettiin 10 ml:aan HgO^a ja pantiin Biogel P-2 pylvääseen (0,07*+ - 0,037 mm, FA. Bio-RAd), jonka halkaisija oli 5 cm. Kehittäminen suoritettiin vedellä virtausnopeuden ollessa 80 ml/h. Koottiin 12 ml:n fraktioita. Kaikista fraktioista määritettiin kokonaishiilihydraat-tipitoisuus (antronitesti, ekstinktio E 620) sekä sakkaraasi-inhibiittori- ja amy-laasi-inhibiittoripitoisuudet. Lisäksi fraktioita tutkittiin levykromatografisesti (entsyymi-inhibitioväri: ks. "Levykromatografinen tutkimus"). Saatiin 7 mg aminosokerijohdannaista, jossa n = 2 ja jossa on 60 000 SIY/g.

Terapeuttiset kokeet I Koejärjestelyt glykosidihydrolaasi-inhibiittorien vaikutuksen ja glukoosi-resorptioestokyvyn osoittamiseksi rotilla ja ihmisillä.

Ravinnosta johtuvan veren liikasokerisuuden ja liikainsuliinisuuden aikaansaamiseksi tyhjävatsaisille rotille (6 kpl) tai tyhjävatsaisille koehenkilöille annetaan suun kautta joko 2,5 g sakkaroosia tai 2,5 g maltoosia tai 1 g keitettyä 2ί+ 58158 tärkkelystä tai 2,5 g glukoosia kiloa kohden, tai 50 g sakkaroosia tai 50 g mal-toosia tai 50 g keitettyä tärkkelystä tai 50 g glukoosia henkeä kohden suun kautta vesiliuoksena tai suspensiona. Toiset rotat, kuusi kappaletta, saavat mainittuja hiilihydraatteja samat määrät ja lisäksi yhtä esimerkeissä mainituista vaikutusaineis-ta ilmoitetuin annoksin. Terveille koehenkilöille annetaan vuorotellen yhtä mainituista hiilihydraateista joka toinen päivä tai harvemmin yhdessä jonkin mainitun vaikutusaineen kanssa tai ilman tätä. Verenglukoosi ja seerumi-insuliini määritetään sekä ennen hiilihydraatin - vaikutusaineen antamista että lyhyin väliajoin viiden minuutin - kolmen tunnin aikana antamisesta rottien retro-orbitaalisesta las-kimopunoksesta otetusta verestä tai koehenkilöiden kyynäriäskimosta tai hiussuonista otetusta verestä. Verenglukoosimääritykset suoritetaan Auto-Analyzer-laitteella ^ p (Technicon , Hoffman: J. Biol Chem. 120, 51 (1937) tai entsymaattisesti glukoosi-oksidaasilla ja o-dianisidiinihydrokloridillä), seerumi-insuliinimääritykset Hales'in ja Rande'n menetelmällä: Biochem. J. 88, 137, (19^3)- II Koejärjestely rasvakudoslipidien hiilihydraattien konversionestymisen osoittamiseksi.

Rotat (6 kpl) saavat mahaletkulla yhtä mainituista hiilihydraateista inaktiivisessa muodossa yhdessä sopivan annoksen kanssa samaa hiilihydraattia, mutta 1U + joka on merkitty radioaktiivisella hiilellä ( C) - mainituissa esimerkeissä mainittua vaikutusainetta. Lyhyin aikavälein kokeen aloittamisesta eläimet tapetaan ja niiltä otetaan näytteet lisäkives- ja/tai munuaista ympäröivästä rasvakudoksesta, lipidit uutetaan sopivilla rasvaliuottimilla, esim. kloroformi/metanoli-seoksella (2:1) ja lipidejä sisältämättömät aineenvaihdunta-muuttumistuotteet pestään erilleen.

Tällä tavalla eristetyistä lipideistä määritetään radioaktiivisuus Liquid Scintillation Counter-laitteella. Aktiviteetti ilmoitetaan yksikköinä dpm/1 g rasvakudosta.

Taulukoissa P merkitsee virheen todennäköisyyttä ja S standardipoikkeamaa.

25 581 58 β>

rH

rH

•Η •Η α * +> •h o r- m σ* ιι

•H ti «.»—»» »II

ο Φ in r VO "ί II

© II

S % +1+1 +i +i +i !!

S Γ3 »n II

+» +¾ ·«* vo σ> cm «- mu jj» vo o o m co n rH fl r— t— S « a g 1 § t- m o kv » « Jj •o' c . τι- co m co n vo n o m c o h ii X © *ri m +1 +1 +1 +111 +1 It •h ·? a n n © ® cm co T- co n m n . Ώ r- cm -- en n co n m u «- »- © ® Λί a) °

rH? CO in ΙΛ ΙΛ || <7V II

H O » » » · II » II

Ti ij m co m co n vo n o a O il n 2 3 cm +i +i +i +ΠΙ +1 n

H II II

:aj c*· CO CM <J> II *+ II

rH H VO r- o CO II CO II

H t— ΤΗ fi

© -H

j ί m vo m I co cm n

3 » · · I » »II

I—I a m m . co m i co r~ n

*d Ή r- I II

C ® +1+1 +11 +1 +1 II

© I II

O ., m c~- r- i *+ >«+ii ® +l vo «- o I cn co ii w - - »

+ 1 -P

m os co m vo I σ\ ii

t»H » «— » · j »II

OS «f r M· CO I O II

® O I II

*- +1+1+1 +11 +111

©ad I II

® +> mm m c— I «+ n m mom oo I c~ it N-^ CS t— -P » -p a) :td a) hD X +> β = s r 0 © Φ c t- s m

»9 H

•rl 3 I © C

© to » © o m 3 ω _ „ rH 0 3 *H .M “ B *

X -p I ad S

O 3 4» -P rH

X ι-l a c © .* to q β .* + + + 3 q C «J Cd

r-H © aj to a U

3 β © rH led i, Λ L.

© ©co ^ & e

Eh t» O -o vj vj VJ

•H τΗ <ς

rH rH

H H O O O

O O o O O

£ £ o O o

g § CM «+ CO

M M *“ CM >«+ 26 581 58 ti Ή CM (VJ 'CM II » ► en co I * * n o CT» i- «- | LO t— n o

I II M

Ö +1 -H +11 +1 +III e S

O I II O 3 m o vd cm i t— »—n oj rj- en in ιλ | ιλ (\j il # en r- T- I r- «- ,1 Jjj 11 II tl ·+ 2 2 O f- o> i kmi in n ® n r-t »r CM tO H e * * * I * Il * Il ^ C -(O’-ι* *11 iTv <*> f- I <£> Il «*- Il :nj C I Cl lf\ t— *- | LO LPs II e III II lp p „ m I 11 P +1 +1 +1 I +111 +111 o ·* ö ·* O +1 +1 +11 +1 +1 II * | Il H >i £ fO 1 H rs,OtOCM*-|CMII*-|1’+ •rt S ^ +> ao m i in co il ' .J* i ό ^ o i o il en il ® p CO t- Ί- tM 1 T* O II % g T-T-lr-ll £ HOC T- r- I T- T- ]| p ω μ •H Ό O HIO) :rd mc m oo n T- n m m ao m f- o n p _, * C r— » «— «Il »Il C H *VD * * * 11 2 » m r- en »- m· n cm n 3^:πί -m- *- r- ro <nn ti C -P „ „ C ti -r-J II m _Li m e il H «E »λ 11 m

+> -h e + 1 +1 +»Il +HI +j o e +1 +1 +1 4-1 + I li Q

C ti -h O il il e o o10 il -o rH CSCMr- r~ fO f- Il «- Il r-t -O C-^- 'f (M CT» CT» tO || cc r- m + cm n n cc m to o O cr> n .¾ ti T-r-t-llT-llM-ti r-r-T- C ~ Ό ti a) C -C C P . a) ® £ M- co ^ η co il en n .® ^ 5 o νο ι to ii e- n -£ o p * * *ii * ii * ii o ti a * * * l * ji *ii m mu σ> «+ to n m n (0 n ^ q to vo en t co n co n > •h m u-\ n n n -h e. l n n ti M t- + 1 +| +11! +111 +|l| ti ti o +1 +1 +11 +111 +111 ti

g II II II , 'g to I II II -H

p o M O II 00 II O II ·+ -g 0> Γ· to | o II + Il '-l

Se CO ^ CM II CM II 1- Il S ·+> CM O I O II CO II ^ •H r- T- Il T- Il T- Il * p t- t- | r- Il || g ti S ti M p iH ti r—I Φ e ή o cr» o i co n i—ι m . o

*^ti * tO * * I * Il «HO CT\ O | »— I M

£ rn to T- VO σ> I »- !| ^ 5 »r-r- * I * I

2“ I H Sg N * f M ® I

H ti O+l +1 +1+1! +111 p I l’- :rt Λί *- I II :ri a m +1 +| +| +ι ι +u o

ι—I C rj- lO O VO I O II rlti»- I JO

H B C— fO fO r- | O II (H CO e— CM CM I LO | T» r- f- r- | 1- Il -h IO o O CT» I cr> | o ® a' ® *- r- v 2 * N O O t- 2-H P+

<H X * * H M

iti M D CO CM CO iti M || cm cm n öm+i+i+i+i+j 0 n

H «—N ·Η II

Ma> t"- O O CM CO T-

+ I +1 r- , +1 + I O

* O :d O d -H o ί-t "m m & "m o V - ti >> f»> ti O O n.

•H rH Iti ti γ-Ι Ή O ti M P*

Ai Φ P M m AC M H ti ti v> M a <u M oti a μ m n M >> AC Ai m M o n m z s AC U H μ s s mm o m ai ^ ui m e iti ti μ to p m m p m tie * -M m * ^ ·Η ι ι ι \^.ti H^ + + + ^ti MO+ + + •P :rt>>+ + + +> ti o C£>

to -P -P r—t to P CO o t»-1 >-! O

ac m m m m m ti c.*sw^->h ti e ti co tn en o - M a M HMM * M ti M . ,

•H S «ti «g -H 0+1 V

mc mq Η0>ιαοο cu ^ ä - S ° S Λ

Mm -H H ^ O $5 >{(0 H "H *- | oc h h r- LO O O C HH 1

M '—1C rH »—I ΓΟ M r—I C r—I rH I

X to P O O M, top o o I

CCP U M pCP PM 1 r-t oi m pp h m m p p

CMC CC CMC CC

time oo time oo

£-<J>ti MW EH>»ti MM

27 5 81 5 8 Φ

rH

ιΗ

•H

H

fl ai 5 +» Φ tH ®

H M

CO H

au cd ό 5 a

= - I

H ® C

^ Siihen <y> it vo il ” a» . ·" CO ·— I ·> Il - Il r· C C ΙΛ r- r— | KN II CTV Il

Q) Ή ·Η I II II

•o g S +1 +1 +11 +1 H +1 II

O ® I II H

.M irvr- (M ro i vo il ^ί- il •p Ti a» m <m i T- n o il —'' ^ 5 r- r- | r- Il r- Il Ή Tj n g a> ^ σν T- CM I r- Il T- Il cd cd ·*. ·> ·· j » Il » Il h +* γ<λ ffl in i il av il ä 5 I II n

ä d O +1 +1 +1 I + I M +1 II

O S to I II II

u 3 in ιλ i r· il m il S OÖ |Λ (M | r- Il Il 'Jä r r I r || Il

rH C\J rH

•H C

i? cj in n vo n :aj μ · r- τ- · Il · Il

LTV r— T— VOHKII

rH S ITV II II

:S *-* +i +i+i +i il +i il

β ® Il II

m e» m a» n cm n

o+i vOr-O ao II e- II

rH

a) + 1 -h

CO

o o

B S

cd ai .

•H X <ä MM -H cd m ai op ® m o ©

.¾ O M

e) M "H

-P a) C n - -p Λ! -h o

Pl M o o cd cd o p tö Pd o o cd 0 P H - e C O cd »3 a) M cd

H 3 0 ^ O

mm rH ed

^ O TH <D

0 2 + + + V -p -H Ή

O P -P H rH

>!rHQ) rH *“1 +< i_

* g g g Ö M M

M®§ .p-Piow to

§ a> G o o O O O

E-t>o WWmo o

r- CM

Claims (1)

1. 58158 28 Patenttivaatimus: Menetelmä mikrobiologisesti valmistettujen aminosokerijohdannaisten erottamiseksi ja puhdistamiseksi, joilla aminosokereina on yleinen kaava HO OH C^3 ho—/ y—n—/ y—r / \ H / \ CHo0H \ oh oh d il _ jossa R on sakkaridiketju, jossa on 1-7 heksoosiyksikköä, tunnettu siitä, että Actinoplanes-sukuun kuuluvia mikro-organismeja aerobisissa olosuhteissa ja vesipitoisessa ravintoväliaineessa viljelemällä saadun huovaston erottamisen ja saadun viljelysuodoksen mahdollisesti aktiivihiilellä pHtssä 1-3 suoritetun värin-poistokäsittelyn jälkeen a) viljelysuodos johdetaan vahvasti happamesta ja vahvasti emäksisestä ioninvaihtajasta muodostettuun sekakerrokseen, b) saatu suodos viedään kationinvaihtajalle, c) ioninvaihtajaan sitoutuneet aminosokerit joko desorboidaan kokonaisuudessaan ammoniakin avulla ja sen jälkeen fraktioidaan sinänsä tunnetulla tavalla yksittäiskomponenteiksi käyttäen geelisuodatusta tai selluloosakolonnikromatogra-fiaa, tai ne eluoidaan selektiivisesti laimealla hapolla, ja näin saaduista elu-aateista eristetään yksittäiset aminosokerit.