FI56698C - Foerfarande foer isolering och rening av mikrobiologiskt framstaellda aminosockerderivat - Google Patents

Description

VJ*r»l rq-i KUULUTUSJULKAISU γγλΛλ

JeST} (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 5 86 98 C (45) Patentti myönnetty 10 03 1930

Patent neddelnt (5l) Ky.lk.*/lnt.CI.· Q; «|2 D 13/04-C 07 H 15/20 SUOMI—FINLAND (2.1) Ptunttlhikamus—Paunttntdkning 27^0/7^+ (22) Haktmlspllvi—Ansökningadag 19. 09· 7 4

(23) Alku pilvi—Glltighettdig 19.09· 7 U

(41) Tullut Julkiseksi—Blivit offantllg oo no 7t

Patentti- ja rekisterihallitus 3·ί; ««k ..«ί.4..Μ«·νΜΙ.*η (44) Nlhtivlkiipanon |a kuul.|ulkaisun pvm.—

Patent* och registerstyrelsen Antökan utlagd och utl.ikrlften publicarad 30.11.79 (32) (33) (31) Pyydetty etuoikeus—Begird prlorltet 22.09.73 26.10.73, 2i.ll.73 Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) P 23^+7782.9, p 231+7782.9, p 23^7782.9 (Tl) Bayer Aktiengesellschaft, Leverkusen, Saksan Liittotasavalta-Förbunds-republiken Tyskland(DE) (72) Werner Frommer, Wuppertal-Elberfeld, Bodo Junge, Wuppertal-Barmen,

Uwe Keup, Wuppertal-Elberfeld, Lutz Miiller, Wuppertal-Elberf eld,

Walter Puls, Wuppertal-Elberfeld, Delf Schmidt, Wuppertal-Vohvinkel,

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7*+) Oy Kolster Ab (5I+) Menetelmä mikrobiologisesti valmistettujen aminosokerijohdannaisten eristämiseksi ja puhdistamiseksi - Förfarande för isolering och rening av mikrobiologiskt framställda aminosockerderivat

On jo tunnettua, että eräät aktinomyseetit, ennen kaikkea Actinoplanaceae-heimon mikro-organismit kehittävät glykosidihydrolaasien, lähinnä ruoansulatuskanavan hiilihydraatteja pilkkovien entsyymien, inhibiittoreita. Eräs tällainen inhibiittoriryhmä on suhteellisen lämmönkestävä ja huoneen lämpötilassa happoja ja alkaleja kestävä. Nämä inhibiittorit ovat kemialliselta rakenteeltaan aminosokereita.

Useimmat tämän ryhmän inhibiittoreista ovat hyvin tehokkaita amylaasi-inhibiittoreita, mutta sakkaraasi-inhibiittoreina vain keskivahvoja tai heikkoja (katso suomalainen patenttijulkaisu n:o 1+9 77*+)·

Keksinnön kohteena on menetelmä mikrobiologisesti valmistettujen aminosokeri johdannaisten eristämiseksi ja puhdistamiseksi, joilla aminosokereilla on yleinen kaava 2 06698 OH_ .0H CH3

HO —/ \- N-/ R

ch2oh h oh oh jossa R on sakkaridiketju, jossa on 1-7 heksoosiyksikköä.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että Actinoplanes sukuun kuuluvia mikro-organismeja aerobisissa olosuhteissa ja vesipitoisessa ravintoväliaineessa viljelemällä saadun huovaston erottamisen ja saadun viljelysuodoksen mahdollisesti esimerkiksi aktiivihiilellä pH:ssa 1-3 suoritetun värinpoistokäsittelyn jälkeen a) viljelysuodokseen lisätään neutraalissa pH:ssa aktiivihiiltä, b) aktiivihiileen sitoutuneet aineet desorboidaan selektiivisesti pH-arvoon 1,5“^ säädetyllä veden ja alkoholin tai veden ja asetonin seoksella, edullisesti 50-80-/»:isella asetonilla, c) saatu desorbaatti viedään kationinvaihtajalle, joka on edullisesti vahvasti hapan, ja d) kationinvaihtajaan sitoutuneet aminosokerit joko desorboidaan kokonaisuudessaan ammoniakin avulla ja senjälkeen fraktioidaan sinänsä tunnetulla tavalla geelisuodatusta tai selluloosakolonnia käyttäen yksittäiskomponenteiksi, tai aminosokerit eluoidaan selektiivisesti laimealla hapolla, ja näin saaduista eluaateista eristetään yksittäiset aminosokerit.

Kuten edellä mainittiin, nämä uudet aminosokerijohdannaiset ovat voimakkaita ruoansulatuskanavan glykosidihydrolaasien inhibiittoreita. Tällöin alemmilla jäsenillä, joissa R vastaa oligosakkaridiketjua, jossa on 1 tai 2 heksoosiyksikköä, on pääasiallisesti voimakas sakkaraasia inhiboiva vaikutus, korkeampien jäsenien inhiboidessa voimakkaasti pääasiallisesti amylaasia.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuilla aminosokerijohdannaisilla on vahva spesifinen sakkaraasia ja/tai amylaasia inhiboiva vaikutus. Joillakin uusilla aminosokerijohdannaisilla in vivo-estovaikutus on monin verroin suurempi kuin niiden in vitro-estovaikutus.

Erityisen yllättävänä on myös pidettävä sitä, että keksinnön mukaisen homologisen sarjan alemmat jäsenet inhiboivat glukoosiresorptiota in vivo.

Näiden yllättävien ominaisuuksien perusteella uusien aminosokerijohdannaisten valmistus on tärkeätä lääkeaineopillisesti.

3 06698

Keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamiseksi käytetään aktinomyseetteihin kuuluvia Actinoplanaceae-heimon Actinoplanes-suvun kantoja. Esimerkkeinä mainittakoon kannat Actinoplanes spec. SE 50 (CBS 961 70), SB 18 (CBS 957 70) ja SE 82 (CBS 615 70. Näitä mikro-organismeja on jo selostettu saksalaisessa hakemusjulkaisussa n:O 2 06U 092, ja ne on talletettu suluissa olevin numeroin laitoksessa Centralbureau voor Schimmelcultures (Baara/Hollanti).

Erityisen sopiviksi osoittautviivat keksinnön mukaan valmistettujen amino-sokerijohdannaisten kokonaissaannon kannalta ja/tai käymisessä seoksena muodostuneiden aminosokerijohdannaisten tähteen R koon kannalta kannat SE 50/13 (CBS 611* 71) ja SE 50/110 (CBS 67^ 73). Molempien kantojen kuvaukset vastaavat melkoisesti emäkantaa SE 50. Nämä kannat on saatu mutageeneja käyttämättä luonnollisen valinnan myötä kannasta SE 50.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käsiteltävä viljelylleni on saatu viljelemällä lahkoon Actinonycetales kuuluvia mikro-organismeja vesipitoisessa ravinto-väliaineessa, joka hiililähteen ohella sisältää typpilähdettä, suoloja ja vaahtoa-mistä ehkäiseviä aineita tavanomaisina pitoisuuksina, jotka voivat vaihdella laajoissa rajoissa.

Hiililähteitä ovat pääasiallisesti hiilihydraatit, erityisesti tärkkelys, maltoosi, glukoosi ja kahden tai kolmen tällaisen aineen seokset, ja monimutkaisemmatkin seokset, kuten esim. mallasuute.

Typpilähteinä voidaan käyttää mikrobiologiassa tavallisia kompleksiseoksia kuten esim. kaseiinihydrolysaattia, hiivauutetta, peptonia, kalajauhetta, kalauut-teita, maissinliotusvettäjlihauutetta ja myös näiden seoksia samoin kuin aminohappoja ja/tai ammoniumsuoloja.

Viljely suoritetaan aerobisesti ilmastoiduin täryviljelmin tai säiliövil-jelmin. Hiililähteen laatu ja konsentraatio sekä käymiseen käytettävä kanta vaikuttavat tähteen R kokoon lopputuotteessa niin paljon, että homologisen sarjan yksityisiä jäseniä tai ainakin homologisarjan hyvin kapean alueen jäseniä voidaan vai- k 566S8 mistaa lähes selektiivisesti. Tällöin on osoittautunut, että. ravintoliuoksissa, joissa on tärkkelystä yli 2 %t iruodostuu ensisijaisesti aminosokeri johdannai si a, joissa on U-7 heksoosiyksikköä, ja että. tähän tuotantoon soveltuu erityisesti kanta SE 50/13 (CBS 61U 71). Eräissä tapauksissa, riittää kuitenkin jo se, että ravinto-liuoksiin, joissa on esim. 3»5 % glukoosia perushiililähteenä, lisätään 0,1-3 %, lähinnä 0,5-2 % tärkkelystä, jolloin saadaan h-J heksoosiyksikköä sisältävien aminosokerijohdannaisten seoksia. Edelleen on osoittautunut, että tärkkelystä sisältämättömissä ravintoliuoksissa ja erityisesti lisättäessä ravintoliuokseen maltoosia, erityisesti kannalla SE 50 (CBS 961 70) voidaan saada pääasiallisesti 2~3 heksoosiyksikköä sisältäviä aminosokerijohdannaisia. Erityisen sopiviksi ovat keksinnön mukaisessa menetelmässä sellaisen aminosokerijohdannaisen valmistamiseksi, jossa R on glukoosi, osoittautuneet ravintoliuokset, joissa hiililähteenä on vain glukoosia. Jos ravintoliuoksessa on ylimäärin glukoosia, pitkän käymisen aikana muodostuu myös pitkäket juiserrpia. aminosokeri johdannaisia. Tietyin rajoituksin tämän voidaan katsoa johtuvan siitä, että käymisen aikana typpilähteiden loppuminen tapahtuu samanaikaisesti kun glukoosi loppuu. Jos ravintoliuoksissa pyritään käyttämään yksinomaan glukoosia ja hiililähteeksi lisätään maltoosi a, saadaan pääasiallisesti aminosokerijohdannaista, jossa on 2 heksoosiyksikköä. Puhdas maltoosi voidaan tällöin korvata nyös halvemmilla seoksilla, kuten esim. Meltzinilla, luonnosta saatavalla mallasuutteella, jota. luottaa Diamalt AG, Miinchen. Maltotrioosi-pitoisuutta vastaten tällöin muodostuu myös seuraavaa korkeampaa homologia. Erityisen sopivaksi alempien homologien valmistuksen kannalta osoittautui kanta SE 50/110, joka optimaalisissa ravintoliuoksissa antaa noin kaksi kertaa suuremmin saannoin alempia homologeja kuin kanta SE 50/13.

Ravintoliuoksen muu koostumus, erityisesti typpi lähteiden konsentraatiot ja suolakoostumus voivat käymisen yhteydessä vaihdella laajoissa rajoissa.

Ravintoliuokset steriloidaan tavalliseen tapaan. Ravintoliuoksen pH-ervot ovat välillä 5*0-8,5» lähinnä välillä 6,0-7,8. Hautomislämpötilat ovat välillä 15 ja ^5°C, lähinnä välillä 2U-32°C. Valmistettaessa korkeampia homologeja käyttämällä kantoja SE 50 ja SE 50/13, korkeampi lämpötila, esim. 28°C, on edullisempi; valmistettaessa alempia homologeja käyttämällä kantoja SE 50 ja SE 50/110, edullisempi on alhaisempi lämpötila esim. 2U°C. Viljelyaika on 1-8 päivää, lähinnä 2-6 päivää. Pitempi viljelyaika suosii, etenkin silloin kun hiilihydraatteja on läsnä ylimäärin, korkeampien homologien muodostumista. Käymisen loppukohta määritetään määrittämällä estoaktiivisuusmäärä entsymaattisessa estokokeesse ja koostumus levy-kromatografisesti.

5 56698

Saatujen aminosokerijohdannaisten eristäminen ja puhdistaminen tapahtuu mikrobiologisista viljelmäliemistä.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut yhdisteet saadaan talteen adsorboimalla ne aktiivihiilelle neutraalissa pH:ssa ja uuttamalla sen jälkeen irti vesipitoisilla alkoholeilla tai asetonilla, lähinnä 50-80-prosent-tisella asetonilla. Irrottaminen onnistuu erityisen täydellisesti pH:n ollessa happamella alueella välillä 1,5_1+, lähinnä pH-välillä 2-3.

Jos lähtöliuokset ovat värjäytyneet hyvin tummiksi, niille suoritetaan ennen keksinnön mukaisten aineiden adsorptiota värinpoistokäsittely aktiivi-hiilellä happamessa pH:ssa (pH = 1-3) tai adsorptiohartsilla, esim. tuotteella Levapol ® Ca 9221 (epäspesifinen polystyreeniin perustuva hartsi) raekoko 0,35 mm (Bayer AG), pH:n ollessa välillä 2-7, lähinnä pH-välillä 2-3. Aktiivihiili sitoo happamessa alueessa ensisijaisesti väriaineita, kun taas Lewapol ei adsorboi keksinnön mukaisia aminosokerijohdannaisia neutraalissa eikä happamessa ympäristössä.

Inhibiittorivaikutusta omaavien aminosokerijohdannaisten eristämiseksi inaktiivisista sakkarideista ja muista inaktiivisista yhdisteistä käytetään hyväksi aminosokerikomponenttien heikkoa emäksisyyttä. Sopivissa olosuhteissa (pH = 1“8, lähinnä 2-1; ioniväkevyyden ollessa alhainen, vastaten johtokykyä <10 mS, lähinnä <2 mS) homologiset aminosokerijohdannaiset sitoutuvat vahvasti happamiin kationinvaihtajiin kuten esim. H+-muodossa olevaan valmisteeseen Dowex 50 W (Fa. Dow Chemicals). Inhibiittorivaikutusta omaavat aminosokeri-johdannaiset sitoutuvat erityisen hyvin asetoniliuoksesta (asetonia 50-80 %, pH 1-5, lähinnä 2-1) kationinvaihtajaan joiden kapasiteetti näissä olosuhteissa mainittujen aineiden suhteen on oleellisesti suurempi. Edellyttäen että liuoksessa on asetonia enemmän kuin 50 %y sitoutuminen heikosti happamiinkin ionin-vaihtajiin, kuten esim. valmisteeseen Amberlite IRC-50 (H+-muoto) on melko hyvä.

Keksinnön mukaisesti aminosokerijohdannaisten uuttamiseen kationin-vaihtajista käytetään emästen tai happojen vesiliuoksia, lähinnä ammoniakkia tai suolahappoa konsentraatioiden ollessa 0,01-1 Val/litra. Inhiboivasti vaikuttavat aminosokerijohdannaiset saadaan talteen uutteista - sen jälkeen kun uutteet on neutraloitu vastaavilla heikosti happamilla tai emäksisillä ioninvaihtajilla, tai sen jälkeen kun emäs tai happo on poistettu vakuumissa imua käyttäen mikäli kysymyksessä ovat haihtuvat emäkset tai hapot - liuoksen konsentroinnin jälkeen lyofilisoimalla tai saostamalla orgaanisilla liuottimilla, lähinnä 10-20 tilavuusosalla asetonia.

Pienimolekyylisten, inhibiittorivaikutusta omaavien aminosokerijohdannaisten erottaminen neutraaleista sakkarideista onnistuu myös kromatografoi-malla selluloosa-pohjaisilla ioninvaihtajilla, lähinnä fosfoselluloosalla 6 G66S8 (Phospho-Cellulose, Fa. Serva, Heidelberg). Eluointiaineina käytetään tällöin puskureita, lähinnä fosfaattipuskureita, joiden ionivahvuus on vähäinen, lähinnä 2-100 mM, erityisesti 5-10 mM, pH:n ollessa välillä 2,5-8, lähinnä pH-välillä ^-6. Tehokkaan fraktioitumisen edellytyksenä on, että fraktioi-tavien preparaattien suolapitoisuudet ovat mahdollisimman pienet, kun sen sijaan väriaineet häiritsevät tällöin vähemmän.

Keksinnön mukaisten inhiboivasti vaikuttavien aminosokerijohdannaisten homologi-sarjan yksityisten jäsenten valmistamiseksi puhtaina tuotteina esi-puhdistetut preparaatit kromatografoidaan sopivalla molekyyliseulalla, esim.

(S) valmisteella Bio-Gel ^ P-2 (polyakryyliamidi, Fa. Bio-Rad, Miinchen) ja eluaatin fraktiot tutkitaan levykromatografisesti. Puhtaita aminosokerijohdannaisia sisältävät fraktiot yhdistetään, kromatografoidaan uudelleen ja lyofili-soidaan konsentroinnin jälkeen tai saostetaan orgaanisilla liuottimilla kuten edellä on selostettu.

Kemiallisen luonteensa mukaisesti keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut aineet kuuluvat hiilihydraatteihin. Ne muodostavat homologi-sarjoja, joiden perusrunkona on pidettävä seuraavaa aminosokerijohdannaista /C^H^O^N/ (R = heksoosi).

OH OH CH3

CH20H h OH X0H

Korkeammat jäsenet eroavat täten perusrungosta siten, että niissä kussakin on yksi monosakkaridi-yksikkö, lähinnä heksoosi-, erityisesti glukoosi-yksikkö enemmän kuin sarjan edellisessä jäsenessä.

1 06698

Esimerkkinä homologisen sarjan rakenneperiaatteesta esitetään tapaus, jossa sakkaridiketjun muodostaa 1-7 glukoosi-siyksikköä. (Kaava esittää tällöin oligosakkaridiketjua, jossa n = 1 - 7 glukoosiyksikköä): OH OH CH3 /CH20H \ CH20H h OH OH \0H OH /n

Sarjan perusrunko vastaa tapausta, jolloin n = 1 ja tästä käytetään nimitystä "Komponentti II". Jokainen sarjan jäsen eroaa seuraavaksi alemmasta tai seuraavaksi korkeammasta jäsenestä siten, että siinä on yksi glukoosi-yksikkö enemmän tai vähemmän. Yhden glukoosi-yksikön verran "Komponenttia II" suuremmasta yhdisteestä käytetään tällöin nimitystä "Komponentti III", 2 glukoosi-yksikköä suuremmasta yhdisteestä nimitystä "Komponentti IV" jne.

Kaikki nämä yhdisteet ovat tunnettuja.siitä, että täydellisessä happamessa hydrolyysissä niistä muodostuu glukoosia ja lähemmin määrittelemätöntä ns. "Komponenttia I".

"Komponenttia II" voidaan fysikokemiallisten ominaisuuksiensa, rakenteensa ja reaktiokykynsä osalta luonnehtia seuraavasti:

Komponentti II on väritön, amorfinen kiinteä aine, joka liukenee hyvin veteen, dimetyyliformamidiin, dimetyylisulfoksidiin ja metanoliin. Kuumentamalla se liukenee myös etanoliin.

a) Levykromatografia:

Ajoneste: etikkaesteri/MeOH/HjO 10:6:** (DC-Fertigfolien = levykromatografiässä käytettävät valmiit kalvot).

I. DC-Fertigfolien F 1500 Kieselgel, Schleicher & Schtlll

Rf-arvot: II 0,**6 maltoosi: 0,50 glukoosi: 0,65 II. DC-Fertigplatten F 25** Kieselgel, Merck

Rf-arvot: II 0,**7 maltoosi: 0,5** glukoosi: 0,66 $6698

Komponentti II saadaan näkyväksi silikageelilevyillä edullisimmin AgNO^/NaOH-suihkereagenssilla. Ruskeanmusta väri kehittyy jo huoneen lämpötilassakin tai lievästi lämmitettäessä· b) Kaasukromatografia»

Kaasukromatografista tutkimusta varten komponentti II silyloidaan a- ja β-D-glukoosin kanssa tai myös käyttämällä sisäisenä standardina sakkaroosia eeoksessa, jossa on pyridiiniä (l), trimetyylikloorisilaania (0,5) ja N-metyyli-trimetyyli-silyyli-trifluoriasetarnidia (l).

Kolonni» 180 cm, lasia, täyte 3 56 SE 50/Chromosorb WAW

Lämpötilat» Suutinkappale 3°0°C

Detektori J00°C

Uuni 220°C isoterminen kunnes a- ja β-D-glukooBi-piikit ovat eluoituneet; sen jälkeen lämpötilaohjelma 15°C/min. 300°C:een asti.

Detektori: F I D (Flammen Ionisations Detektor)

Kaasut: Kantokaasu: 40 ml/mln.

Polttokaasu: Ilma 80 ml/min.

20 ml/min.

Retentioa.lat: o-D-glukoosi 3 min· β-D-glukooei 4 min.

Sakkaroosi 12 - 13 min.

II 16 - 17 min.

o) Kiertokulma»

Kiteytymätöntä näytettä II, joka oli saatu konsentroimalla II:n metanoliliuosta, liuotettiin veteen ja määrättiin spesifinen kierto: [<x]D - +134,3°.

d) IR-spektri» Vähänsanova, huonosti strukturoitu IR-spektri Oria käytettäessä.

Pääabsorptiojuovat 0-H»n ja C-0:n valenssivärähtelykohdilla.

e) RMR-spektri» CD^QD/220 MHz» (kuva l) 6, ppm Multiplisiteetti suhteellinen intensiteetti

1.3 dubletti; J-6, 3Hz 3 H

2.3 "tripletti"; JjU.Jg 8-10 Hz 1 H

3,15 "tripletti”; J^.Jg 7-9 Hz 1 H

3.3 ~ 3,9 signaaleja ei voi eritellä 12 H

4,13 AB-systeemi; J-12 Hz 2 H

4,48 *7 dubletti; J»7 Hz ”7

ja 5,1 f dubletti; J-2,5 HzJ

^ deuteriumia 4,9 singletti 11 H vastaan vaih tuneet protonit 9 5Ö698

5,0 dubletti; J-2-3 Hz 1 H

(heikosti erottunut)

5,8 dubletti; J»3-4 Hz 1 H

(heikosti erottunut) _

35 H

f) Komponentin II asetvlointi:

Komponentin II annetaan reagoida seoksessa, jossa on suhteessa 1:1 asetanhydridiä ja pyridiiniä, huoneen lämpötilassa deka-asetyylijohdannaiseksi (molekyylipaino 903)· Jos reaktio suoritetaan jääetikka/etikkahappo-anhydridi-seoksessa 1:1 käyttämällä katalyyttisiä määriä H2S0^:a, massa-spektroskooppisesti voidaan osoittaa, että deka-asetyylijohdannaisen ohella on muodostunut myös undeka-asetyylijohdannaista (molekyylipaino: 943)· Deka-asetyyli.lohdannalsen HMR-spektri: (kuva 2)

Deka-asetyyli.1ohdannaisen MS-spektri:

Molekyylipiikki: 903 (suht. intensiteetti 2,5 ^)

Emäspiikki: 843

Edellä mainitussa mittausalueessa olevia tärkeitä fragmenttipiikkejä: 844 (55 # suht. intensiteetti) 784 (36 $ suht. intensiteetti) 783 (34 i° suht. intensiteetti) 759 (35 $ suht. intensiteetti) 556 (36 i» suht. intensiteetti) 496 (37 96 suht. intensiteetti) 436 (29 i» suht. intensiteetti) g) Komponentin II metvlointi:

Metyloitaessa komponenttia II CH^J/NaH-yhdistelmällä dimetyyllsulfoksi-dissa Hakomori'n mukaisesti, päätuotteena saadaan komponentin II dekametyy-lijohdannaista, vähäisessä määrässä myös undekametyylijohdannaista. Massaspektri:

Molekyylipiikki: 623 (suht. intensiteetti 6,1 #)

Emäspiikki: 535 2. molekyylipiikki: 637 (suht. intensiteetti 0,2 j6)

Spektroskooppisten arvojen ja kemiallisten ominaisuuksien perusteella komponentille II saadaan seuraava rakennekaava:

OH OH CH- vCH„0H

w Vo y-o

HO —/ \ N 0 ·/ \— OH

/=\ H r~\ /“Λ

CHgOH H OH OH OH OH

10 56698

Komponentti II on «X- ja ^-muotojen seoksena, kuten erityisesti NMR-spektrit osoittavat.

Homologisen sarjan seuraavalla jäsenellä, "Komponentilla III" ^25H43°18N^ 0n rakennekaava

OH OH CH3 CH2OH CH2OH

-Q- ° -Q- °-Q- “

CH20H H OH OH OH OH OH OH

Komponentilla III on seuraavat fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet :

Se on hyvin veteen liukeneva amorfinen, kiinteä tuote.

a) Levykromatografia:

Ajoneste: Etikkaesteri/MeOH/HjO 10:6: I. DC-Fertigfolien F 1500 Kieselgel (Schleicher & Schtlll):

Rf-arvot: III 0,35 maltoosi: 0,50 II. DC-Fertigplatten F 254 Kieselgel (Merck):

Rf-arvot: III 0,33 maltoosi: 0,54

Komponentista III saadaan AgNOg/NaOH-suihkereagenssilla jo huoneen lämpötilassa tai hieman levyjä lämmittämällä ruskeanmusta väriläikkä.

b) IR-spektri: Vähän sanova, huonosti erottunut IR-spektri KBr:a käytettäessä, pääabsorptiojuovat 0-H:n ja C-0:n valenssivärähdysalueella (3700 - 3100 cm"1 tai 1180 - 950 cm"1).

c) Kiertokulma: Ä7d H20:ssa: +147,2° d) III:n NMR-spektri D2O:ssa/220 MHz: (kuva 3) e) Metylointi Hakomori * n mukaisesti:

Metyloitaessa III:a CHgJ:llä ja NaH:lla DMS0:ssa päätuotteena saadaan myös 14-kertaisesti metyloitunutta tuotetta.

f) Metylointituotteen massaspektri:

Molekyylipiikki kohdalla 827 (1,5 % suht. intensiteetti) vastaa bruttokaavaa CggHggNO^g. (Suht. intensiteetin ollessa 0,1, kohdalla 841 on toinen molekyylipiikki).

$6698 11 Tärkeimmät fragmenttipiikit ovat: 739 (27 % suht. intensiteetti) 592 (3,7 % suht. intensiteetti) 535 (30 % suht. intensiteetti) 388 (9 % suht. intensiteetti) 386 (13 % suht. intensiteetti) 284 (13 % suht. intensiteetti) 187 (12 % suht. intensiteetti) 171 (% suht. intensiteetti) 101 (34 % suht. intensiteetti) 88 (25 % suht. intensiteetti) 7 5 emäspiikki.

Komponentti IV on homologisen sarjan lähinnä seuraava korkeampi jäsen. Yhdiste hajaantuu happamessa osittaishydrolyysiseä komponenteiksi II ja glukoosiksi moolisuhteessa 1:2.

Levykromatograf ia:

Ajoneste: n-butanoli/etanoli/vesi = 50:30:20.

DC-Ferfigplatten F 1500 Kieselgel (Schleicher & SchUll):

Rglukoosi'arvot! IV: °»H1 · °·1'6

Korkeampien homologien, erityisesti komponenttien V - VIII estovaikutus sakkaraasin suhteen on hyvin paljon pienempi ja haimasta peräisin olevan o(-amylaasin suhteen hyvin paljon voimakkaampi kuin sarjan alemmilla jäsenillä (komponenteilla II - IV).

Korkeampia komponentteja hydrolysoitaessa tuotteiden joukossa voidaan aina osoittaa olevan välituotteina muodostuvia alempia homologeja; pilkkoutumistuotteiden joukossa on myös glukoosia ja maltoosia. Levykromatografia:

Ajoneste; n-butanoli/etanoli/vesi * 50:30:20 DC-Fertigplatten F 1500 Kieselgel (Schleicher & SchUll):

Rglukoosi“arvoja: V: °»30 “ °»3I+ VI: 0,21 - 0,23 VII: 0,14 - 0,16 VIII: 0,09 - 0,11

Inhiboivasti vaikuttavien aminosokerijohdannaisten ominaisesto-aktiivisuudet määritetään entsyymiestokokein in vitro.

Amylaasikoe

Amylaaei-inhibiittori-yksiköksi (1 AIY) määritellään inhibiittori-määrä, joka pystyy inhiboimaan 50-prosenttisesti kaksi amylaasi-yksikköä. Yksi amylaasiyksikkö (AY) on se määrä entsyymiä, joka yhdessä minuutissa seuraavassa mainittujen koeolosuhteiden vallitessa lohkaisee tärkkelyksessä 1 μ-ekvivalentin glukosidisidoksia. Lohjenneiden 12 56698 sidosten jiVal määritetään muodostuneiden pelkistävien sokerien jiVal-arvona dinitrosalisyylihapolla kolorimetrisesti ja ilmoitetaan pVal-maltoosiekvivalentteina käyttämällä apuna maltoosi-vertailukäyrää. Kokeen suorittamista varten 0,1 ml:aan amylaasiliuosta (20 - 22 AY/ml), lisätään 0-10 μg inhibiittoria tai 0-20 μΐ kokeiltavaa liuosta 0,4 mltssa 0,02 molaarista seosta natriumglyserofosfaattipuskuri/ 0,001 moolia CaCl2, pH:n ollessa 6,9, ja seoksen annetaan tasapai-noittua vesihauteella 35°C:ssa noin 10-20 minuuttia. Sen jälkeen inku-boidaan 5 minuuttia 0,5 ml:n kanssa 35°C:een esilämmitettyä 1-prosent-tista tärkkelysliuosta (Stärke, löslich, Firma Merck, Darmstadt,

Nr 1252) 35°C:ssa ja sen jälkeen lisätään 1 ml dinitro-salisyylihappo-reagenssia (P. Bernfeld'in mukaisesti, Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., Band 1, sivu 149). Värin kehittämiseksi erää kuumennetaan 5 minuuttia kiehuvalla vesihauteella, minkä jälkeen jäähdytetään ja lisätään 10 ml tislattua vettä. Ekstinktio kohdalla 540 nm mitataan vastaavalla tavalla valmistettua amylaasitonta nollakoearvoa vastaan. Koetuloksen tulkitsemiseksi aikaisemmin laaditusta amylaasivertailukäyrästä luetaan inhibiittorin lisäämisen jälkeen vielä tehoava amylaasiaktiivisuus ja tästä lasketaan käytetyn amylaasin prosentuaalinen estovaikutus. Prosentuaalinen estokyky merkitään yhtälön jjg inhibiittori + AY + + + laskettu kuiva-aineen suhteen +♦ saman sarjan inhiboimattoman erän AY funktiona, käyrästä luetaan 50 %:n estokyvyn kohta ja muunnetaan yksiköiksi AIY/mg inhibiittoria.

Sakkaraasikoe

Sakkaraasi-inhibiittori-yksikkö (SIY) määritetään inhibiittorin määräksi, joka inhiboi 50-prosenttisesti kaksi eakkaraasiyksikköä.

Yksi sakkaraasiyksikkö (SY) on se määrä entsyymiä, joka yhdessä minuutissa alla mainituissa koeolosuhteissa pilkkoo 1 μ moolin sakkaroosia glukoosiksi ja fruktoosiksi. Muodostuneen glukoosin μ mooli-määrä määritetään kvantitatiivisesti glukoosioksidaasireaktion avulla olosuhteissa, joissa sakkaroosin pilkkoutumista ei enää tapahdu sakka-raasin vaikutuksesta. Kokeen suorittamista varten 0,05 ml:aan sakka-raasiliuosta, ^jonka SY on säädetty 0,12:ksi, lisätään 0-20 μg inhibiittoria tai 0-20 μΐ tutkittavaa liuosta, ja 0,1 molaarista natrium-maleinaattipuskuria pH 6,0 kunnes tilavuus on 0,1 ml. Tasapainoitetaan 10 minuuttia 35°C:ssa ja sitten lisätään 0,1 ml 3S°C:een esilämmitettyä 0,05-moolia sakkaraasiliuosta 0,1 moolia natriummaleinaattipus-kurissa pH 6. Inkuboidaan 20 minuuttia 35°C:ssa ja sakkaraasireaktio keskeytetään lisäämällä 1 ml glukoosioksidaasireagenssia ^ ja 56698 inkuboimista jatketaan 30 minuuttia 35°C:ssa. Sitten lisätään 1 ml 50-prosent-tista HgSO^ra ja mittaus suoritetaan kohdalla 5^5 nm vastaavaa nollakoearvoa vastaan. Koetulosten tulkitsemiseksi lasketaan käytetyn sakkaraasin prosentuaalinen estokyky ja 50 $:n estokykykohdasta saatu arvo muutetaan glukoosi-vertauskäyrän avulla yksiköiksi SIY/g tai SIY/litra.

1) Sian ohutsuolilimakalvosta liuotettua sakkaraasia (B. Borgström, A. Dahlquist. Acta Chem. Scand. 12, (1958), sivu 199T)· Laimennettu 0,1-molaarisella natriummaleinaattipuskurilla pH 6,0 vastaavan SY-pitoisuuden omaavaksi.

2) Glukoosioksidaasireagenssi valmistetaan liuottamalla 2 mg glukoosi-oksidaasia (Fa. Boehringer Nr. 15^23) 100 ml:aan 0,565 moolia tris-HCl-puskuria pH 7,0 ja lisäämällä sen jälkeen 1 ml detergentti-liuosta (2 g Triton X 100 + 8 g 95 #:sta etanolia p.a.), 1 ml dianisidiiniliuosta (260 mg o-dianisidiini. HCl:a 20 ml:ssa H20:ta) ja 0,5 ml 0,1-prosenttista peroksidaasivesiliuosta (Fa. Boehringer Nr. 15302).

Maltaasikoe

Maltaasi-inhibiittori-yksikkö (MIY) määritetään inhibiittorin määräksi, joka inhiboi 50-prosenttisesti kaksi maltaasiyksikköä. Yksi maltaasiyksikkö (MY) on se määrä entsyymiä, joka yhdessä minuutissa alla mainituissa koeolosuhteissa pilkkoo 1 μ moolin maltoosia 2 μ mooliksi glukoosia. Muodostuneen glukoosin μ mooli-määrä määritetään kvantitatiivisesti glukoosioksidaasi-reaktion avulla olosuhteissa, joissa maltoosin pilkkoutumista maltaasin vaikutuksesta ei enää tapahdu. Kokeen suorittamista varten 0,05 ml:aan maltaasiliuosta jonka MY on säädetty välille 0,060-0,070, lisätään 0-20 mg inhibiittoria tai 0-20 ml tutkittavaa liuosta, ja sitten lisätään 0,1 moolia natriummaleinaattipuskuria pH 6,0 kunnes tilavuus on 0,1 ml. Tasapainotetaan 10 minuuttia 35°C:ssa ja sitten lisätään 0,1 ml 35°C:een esilämmitettyä 0,05 molaarista maltoosiliuosta 0,1 molaarisessa natriummaleinaattipuskurissa (pH 6,0). Inkuboidaan 20 minuuttia 35°C:ssa ja maltaasireaktio keskeytetään 2) · . „ . ...

lisäämällä 1 ml glukoosioksidaasireagenssia , ja idättämistä jatketaan 30 minuuttia 35°C:ssa. Sen jälkeen lisätään 1 ml 50-prosenttista H^SO^a ja mittaus suoritetaan kohdalla 5^+5 nm vastaavaa nollakoearvoa vastaan.

Koetulosten tulkitsemiseksi lasketaan käytetyn maltaasin estovaikutus prosentteina ja 50 %:n estokykykohdasta saatu arvo muutetaan glukoosivertaus-käyrän avulla yksiköiksi MIY/g tai MIY/litra.

1) Sian ohutsuolilimakalvosta liuotettua maltaasia (B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand 12, (1958), sivu 1997). Laimennettu 0,1 moolia natriummaleinaattipuskurilla (pH 6,0) vastaavan MY-pitoisuuden omaavaksi.

2) Glukoosioksidaasireagenssin valmistus: kuten sakkaraasikokeen (s. 19 alaviite 2), yhteydessä on selostettu.

111 S66S8

Tulokset In vitro-entsyymiestokokeista, joissa on käytetty keksinnön-mukaisten aminosokerijohdannaisten yksityisiä homologeja ja tiettyjä homoloftiseoksia, on koottu seuraävaan taulukkoon, jossa heksoo-siyksiköt esittävät glukoosiyksiköitä: n - heksoosiyksikköjen ΑΓΥ/g SIY/g MIY/g lukumäärä

Amino sokerij ohdan-nainen, jossa n - 1 300,000 30,000 5,000 n - 2 300,000 68,000 15,000 n - 3 1,400,000 21,000 5,000 n - 4-6 17,500,000 8,500 n - 5-7 30,000,000 2,500

Kuten taulukosta havaitaan, homologisen sarjan molekyylipainon kasvaessa spesifinen estoaktiivisuus haima-a-amylaasin suhteen lisääntyy voimakkaasti; siten yhdisteillä, joilla n = 5-7» entsyymivaikutuksen ehkäisykyky in vitro on 100 kertaa voimakkaampi kuin aminosokerijohdannaisen, jossa n - 1 tai n - 2« Toisaalta sakkaraasi-inhiboltuminen korostuu voimakkaimmin johdannaisen osalta, jossa n - 2. Johdannaisen, jossa n » 1, ehkäisy-vaikutus- on teholtaan-' vain puolet tästäv ja korkeampien johdannaisten spesifinen sakkaraasia ehkäisevä vaikutus putoaa tästä edelleen.

In vivo suoritetussa sakkaroosi-kuormituskokeessa aktiivisuuden on todettu olevan suunnilleen samansuuntainen kuin in vitro-kokeissa todetun spesifisen estoaktiivisuuden. Sitä vastoin in vivo suoritetuissa tärkkelys-kuormituskokeissa todettiin aminosokerijohdannaisten, joissa n 1, 2 ja 3 aktiivisuuden kohonneen 10-40 -kertaiseksi verrattuna amylaa-ein estokykyyn in vitro -kokeissa. (Yrt. taulukkoa 1 taulukoihin 2, 3 ja 5).

On tunnettua, että eläimillä ja ihmisillä esiintyy veren liikasokeri-suutta hiilihydraattipitoisten ravinto- ja nautintoaineiden (esim. viljan, perunatärkkelyksen, hedelmien, hedelmämehujen, oluen, suklaan) ottamisen jälkeen, mikä johtuu hiilihydraattien nopeasta pilkkoutumisesta glukoosi-hydrolaasien (esim. sylki- ja haima-amylaaslen, maltaasien, sakkaraasien) vaikutuksesta seuraavan kaavion mukaisesti* anvlaasl3 Paitaasi \ Tärkkelys tai glykogeeni maltoosi r glukoosi

Sakkaroosi glukoosi + fruktoosi 15 5Ö6S8 Tämä veren liikasokerisuus on erityisen selvä ja säilyvä diabeetikoilla. Lihavilla ravinnosta johtuva veren liikasokerisuus aiheuttaa usein erityisen voimakasta insuliinin erittymistä, joka puolestaan lisää rasvanmuodostusta ja vähentää rasvan pilkkoutumista. Tällaisen veren liikasokerisuuden yhteydessä terveen aineenvaihdunnan omaavilla ja lihavilla henkilöillä esiintyy insuliinin erittymisen seurauksena usein hypoglykemiaa. On tunnettua, että sekä veren liikasokerisuus että myös mahalaukussa viipyvä ruokasula edistävät mahanesteen muodostumista, joka puolestaan aiheuttaa tai edistää mahakatarrin, mahahaavan tai pohjukaissuolihaavan muodostumista.

Nyt on keksitty, että keksinnön mukaisella menetelmällä saadut ja eristetyt glukosidihydrolaasien inhibiittorit vähentävät huomattavasti ravinnosta aiheutuvaa veren liikasokerisuutta, liikainsu-liinisuutta, hypoglykemiaa sen jälkeen kun rottien ja/tai ihmisten aineenvaihduntaa on rasitettu vehnä tärkkelyksellä tai sakkaroosilla tai maltoosi 11a, ja jouduttavat näiden mainittujen hiilihydraattien kulkua mahan läpi. Tämän lisäksi ne ehkäisevät glukoosin resorptiota suolesta. Edelleen hiilihydraattien muuttuminen rasvakudoksen lipideiksi ja ravinnosta peräisin olevan rasvan varastoituminen rasvakudoksiin vähenee tai hidastuu.

Edelleen on tunnettua, että mikro-organismit pilkkovat suu-ontelossa hiilihydraatteja, etenkin sakkaroosia ja edistävät siten hammasmädän muodostumista.

Glykosidihydrolaasien inhibiittorit soveltuvat sen vuoksi hoitoaineiksi seuraavien tautien yhteydessä: liikalihavuus, veren liikarasvaisuus (valtimon haurauskovetustauti), sokeritauti, esisokeritauti, mahakatarri, mahahaava, pohjukaissuoli-haava ja hammasmätä.

Eräiden käytettävien reagenssien ja apuaineiden selvennyksiä: Amberlite IRA 410 Cl" (anioninvaihtaja); Amberlite IRC 120 (H+-muoto) vahvasti hapan kationinvaihtaja; Amberlite (HCO^'-muoto) (Anionin-vaihtaja); Amberlite IRA 410 OH” (vahvasti emäksinen anioninvaihtaja); Amberlite IRC 50 H* (vahvasti hapan kationinvaihtaja); /Rohm and Haas Company'n tavaramerkkejä^ sekä Dowex 50 WX 4H+ (vahvasti hapan kationinvaihtaja). Yhtiön Dow Chemical Co. Midland, Michigan, USA tavaramerkki.

16 56698

Selluloosapohjaisena anioninvaihtajana voidaan käyttää esim. tuotetta DE AE-Zellulose, Firman Schleicher und Schull.

Polyakryyliamidi-geelinä voidaan käyttää esim. tuotetta Biogel-P-2 /yhtiön Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA tavaramerkki/.

Maltzin on yhtiön Diamalt AG, Munchen (BRD) luonnonmallasuute.

(S)

Levapol ^ on yhtiön Bayer AG, Leverkusen (BRD) spesifioimaton poly-styreeniin perustuva adsorptiohartsi.

. Clarcel on yhtiön CECA, Velizy-Villacoublay, Ranska, suodatusapuaine (piimaa/selluloosa).

SE 30 on yhtiön Hewlett Packard silikonielastomeeri.

Seuraavien esimerkkien heksoosiyksiköt ovat glukoosiyksiköitä.

Levykromatografinen tutkimus Käymisessä saadun lopputuotteen ja preparaattien koostumuksen arvioimiseksi levykromatografisesti 1 μΐ käymislientä tai 1 ^ig preparaatteja pannaan silika-geeli-valmiskalvolevyille (Fa. Schleicher & Schull, Dassel. Typ F 1 500) ja kehitetään 2 kertaa n-butanoli/etanoli/vesiseoksella 50/30/20.

Säkkaraasi-inhibitiovärin aikaansaamiseksi kehitetylle ja hyvin kuivatulle levylle ruiskutetaan entsyymigeeliä (20 ml/20 x 20 cm:n levy) ja geelin annetaan jähmettyä. Sen jälkeen esi-inkuboidaan 5 min. kosteuskammiossa huoneen lämpötilassa ja tämän jälkeen suihkutetaan riittävästi substraattigeeliä. Tämän toisen geelikerroksen jähmetyttyä levy pannaan kosteuskammioon ja idätetään 6o°C :ssa. Inhibitioväri (vaaleita läikkiä, punaisenruskea tausta) kehittyy 60-90 minuutissa. Värimuodostuksen kehittäminen keskeytetään optimihetkellä, ja levy kuivataan sillä olevine agar-kerroksineen tuuletuskuivaimessa lämmin-ilmalla.

Geelien valmistus

Entsyymigeeli: 1,5 g Agarose-valmistetta (L'Industrie Biologique Frangais) suspensoidaan 100 ml:aan 0,2-molaarista Na-maleinaattipuskuria, pH

6,0, ja liuotetaan sen jälkeen kiehauttamalla. Kirkas Agarose-liuos jäähdytetään 50°C:een ja astiaa heilautellen lisätään 250 μ Triton X-100-liuosta (2 g Triton X-100 + 8 g etanolia p.a.) ja 0,5 ml dianisidiiniliuosta (20 mg dianisidinia/ 1 ml asetonia). Juuri ennen geelin käyttämistä lisätään 1 ml G0D/P0D-rea-genssia (12,5 mg Glucoseoxidase, Reinheitsgrad I, Fa. Boehringer, Best. Nr.

15^23 ja 2,5 mg Peroxidase, Reinheitsgrad II, Fa. Boehringer, Best. Nr. 15302, liuotettuna 5 ml:aan maleinaattipuskuria) ja 1+ - 5 yksikköä sakkaraasia, jota on saatu sian ohutsuolesta Ί^. Geeli on pidettävä ruiskuttamiseen saakka 50°C:ssa, koska se muuten ruiskutettaessa jähmettyy suuttimiin.

17 56698

Substraattigeeli: 0,5 g agaroosia suspendoidaan 100 ml:aan Na-maleinaatti-puskuria, pH 6,0 ja liuotetaan kiehauttamalla. Sen jälkeen jäähdytetään 1^ sivulla 1 i+, alaviitteessä 1) selostetulla tavalla valmistettua enstyymipreparaattia 50°C:een, lisätään 100 jil Tritonia (2 g Triton X-100 + 8 g etanolia, p.a.) ja 1 g sakkaroosia (Serva Nr. 35579)· Sakkaroosin liuettua geeli on valmista käytettäväksi.

Amylaasi-inhibitiovärin aikaansaamiseksi kehitetylle ja kuivatulle kromato-grafilevylle suihkutetaan amylaasigeeliä (20 ml/20 x 20 cm:n levylle) ja annetaan sen jähmettyä. 5 minuuttia kestäneen huoneen lämpötilassa tapahtuneen esi-inkuboinnin jälkeen levy geelikalvoineen pannaan 0,5~prosenttiseen tärkkelysliuokseen (1 g tärkkelystä, Merck Kr. 1252, liuotettu kiehuttaen 200 ml:aan puskuriliuosta 0,2 m glyserofosfaatti/0,01 m CaClg, pH 6,9) ja pidetään siinä 2 min. i+0°C:ssa ja liuosta käännellen. Sen jälkeen levy huuhdellaan hyvin tislatulla vedellä ja upotetaan hajaantumattoman tärkkelyksen värjäämiseksi laimennettuun Jg-liuokseen (U ml Jg-perusliuosta 500 ml:ssa Hg0:tai Jg-perusliuos: 2,2 g Jg + i+,U g KJ liuotettu 100 ml:aan Hg0:ta). Optimiväri on muodostunut noin 1 minuutin kuluttua. Levy valokuvataan välittömästi koska siniset täplät haalistuvat noepasti.

Amylaasigeelin valmistus 1 g agaroosia liuotetaan 100 ml:aan 100°C:ssa olevaa puskuriliuosta 0 ,2 m natriumglyserofosfaatti/O,01 m CaClg, pH 6,9, ja 50°C:een jäähdyttämisen jälkeen lisätään 100 ^il amylaasikidesuspensiota ( 10 mg sianhaima-anylaasia/ml kyllästettyä NH^-sulfaattiliuosta, Fa. Boehringer, Nr 15017).

Esimerkki 1 100 litraan ravintoliuosta, joka sisälsi 3,5 % glukoosia, 2,5 ί mallasuute-kuivajauhetta, 0,5 % kaseiinihydrolysaattia, 1,3 % hiivauutetta, 0,3 % CaCO^, 0,3 % KgHPO^ ja 0,1 % vaahtoamisenestoainetta, ympättiin 5 litraa kannan SE 50/110 esi-viljelmää ravintoliuoksessa, joka sisälsi 3 % soijajauhoa, 3 % glyserolia ja 0,2 % CaCO^. Viljelmää inkuboitiin sekoittaen ja ilmastoiden 5 päivää 2U°C:ssa, jolloin saatiin viljelmäliuosta, jossa oli 73 000 SIY/1, ja joka sisälsi pääasiallisesti .. aminosokerijohdannaista, jossa n = 2.

90 litran käymiserän, huovastoineen, pH säädettiin pH-mittarin avulla väkevällä HNO^lla 2,5:ksi ja muodostuneen väriaineen pääosan adsorb oi mi seksi lisättiin sekoittaen 900 g (= 1 %) aktiivihiiltä (Merck). Sekoitettiin 15 min., ja huovasto ja pääosa hiilestä eristettiin sentrifugissa kierrosnopeuden ollessa 3 000 kierr./min., ja päällä ollut osa suodatettiin lopuksi paine-imusuodattimella lisäämällä ensin 3 kg Clarcel'ia. Saatiin 65 litraa kellanruskeata, kirkasta suodosta, jonka SIY-pitoisuus oli 60 000 SIY/l.

18 56698

Suodoksen pH säädettiin väkevällä NH^lla 7:ksi ja aktiivisen aineen adsor-boimiseksi suodosta sekoitettiin 1 300 g:n (2 ¢) kanssa aktiivihiiltä (Merck) 30 minuuttia. Suodatettiin paine-imusuodattimella ja aktiivihiilisedimentti pestiin 3 kertaa 10 litralla tislattua vettä. Sen jälkeen hiili puristettiin hyvin kuivaksi ja sekoitettiin aktiivisen aineen uuttamiseksi hiilestä kolme kertaa H litran kanssa 50-prosenttista asetonia pH:n ollessa 2,5, sekoituksen kestäessä kullakin kerralla 15 min. Suodattamalla hiilestä eroitetut asetoniuutteet yhdistettiin. Yhdistetty uute konsentroitiin rotaatiohaihduttimessa 250 ml:ksi, lisättiin sama tilavuus (250 ml) metenolia ja suodatettiin poimusuodattimen läpi. Suodos (U80 ml) tiputettiin voimakkaasti sekoittaen 5 litraan asetonia. Erottuva sakka imusuodatettiin ja pestiin 3 kertaa asetonilla ja eetterillä. Sen jälkeen kuivattiin vakuumissa 35°C:ssa.

Saanto 230 g tuotetta, jossa oli 8 500 SIY/g.

25 g edellä mainittua raakatuotetta liuotettiin 1 litraan H_0:ta ja liuosta sekoitettiin 30 min. 300 g:n kanssa valmistetta Dovex^ 50WX 1+ H (0,07^-0,037 mm). Hartsi suodatettiin erilleen ja pestiin sitten 3 kertaa 2 litralla 0,001 n HCl:a. Pesty Dcwex suspendoitiin sen jälkeen 500 ml:aan Hg0:ta ja suspension pH säädettiin pH-mittarin avulla 25-prosenttisella NH^lla 9,0:ksi. Sen jälkeen uutettiin vielä 2 kertaa 500 ml: 11a 0,6-prosenttista NH^a (kummallekin kerralla), uutteet yhdistettiin ja väkevöitiin rotaatiohaihduttimessa 100 ml:ksi. Värin poistamiseksi tästä konsentraatista sitä sekoitettiin 5 min. 2 g:n kanssa DEAE-selluloosaa (Fa.

Schleicher und Schiill Nr. 02035, 0,6 mVal/g), ja sitten sentrifugoitiin. Vaaleankeltaiseen päällä olleeseen kerrokseen lisättiin sama tilavuus (100 ml) metanolia, ja sitten tämä tiputettiin tehokkaasti sekoittaen 2 litraan asetonia. Sakka imusuodatettiin, pestiin asetonilla ja eetterillä ja kuivattiin vakuumissa 35°C:ssa. Saanto 1+ ,2 g tuotetta, jossa oli 26 000 SIY/g. Jatkopuhdistusta varten b,0 g inhibiittoria geelisuodatettiin 0,5 g:n erissä Biogel P-2:n läpi. Tätä varten kukin 0,5 g:n preparaatti liuotettiin 10 mitään Hg0:ta ja pantiin Biogel P-2-pylvääseen (0,07^-0,037 mm, Fa. Bio-Rad), jonka halkaisija oli 5 cm. Kehittäminen suoritettiin vedellä virtausnopeuden ollessa 80 ml/h. Koottiin 12 ml:n fraktioita. Kaikista fraktioista määritettiin kokonaishiilihydraattipitoisuus (antroni-testi , ekstinktio E 620) sekä s akkar aasi -inhibiittori- ja anylaasi-inhibiittoripitoisuudet. Lisäksi fraktioita tutkittiin levykromatografisesti (Entsyymi-inhibitio väri: ks. "Levykromatografinen tutkimus").

,9 S6698

Fraktiot, joiden todettiin sisältävän aminosokerijohdannaisia, joissa n = U-6, yhdistettiin, konsentroitiin vakuumissa 10 ml:ksi ja seostettiin tiputtamalla 200 ml:aan kuivaspriitä. Sakka sentrifugoitiin erilleen, pestiin asetonilla ja eetterillä ja kuivattiin vakuximissa; saanto U,0 g:sta raakainhitiittoria: 0,2 g aminosokerijohdannaista, jossa n = 1+-6 ja jossa oli 17,5 x 10^ AIY/g ja 8 500 SIY/g. Fraktioita, jotka sisälsivät aminosokerijohdannaista, jossa n = 3, käsiteltiin samalla tavalla saostuksen tapahtuessa 200 ml:lla asetonia, saanto U,0 g:sta raakaa inhibiittoria: 0,1 g aminosokeri johdannaista, jossa n oli = 3 ja jossa oli 1,U x 10^ AIY/g ja 21 000 SIY/g.

Fraktioista, jotka sisälsivät aminosokerijohdannaista, jossa n = 2 (saostus asetonilla) eristettiin 0,9 g aminosokerijohdannaista, jossa n = 2 ja jossa oli 0,3 x 106 AIY/g ja 68 000 SIY/g.

Esimerkki 2

Kolmeen pieneen käymisastiaan, joissa kussakin oli 8 1 ravintoliuosta, joka sisälsi 7>5 % mallasuute-kuivajauhetta, 0,3 % kaseiinihydrolysaattia, 0,7 % hiiva-uutetta, 0,3 % CaCO^, 0,3 % KgHPO^, ympättiin 5 % kannan SE 50/110 esiviljelmää ravintoliuoksessa, joka sisälsi 3 % soijajauhoa, 3 % glyserolia ja 0,2 % CaCO^, jolloin 5-päiväisen 2l|°C:ssa suoritetun inkuboinnin jälkeen saatiin viljelmä lientä, jossa oli 73 SIY/ml, ja joka sisälsi pääasiallisesti aminosokerijohdannaista, jossa n = 2. Huovaston erottamiseksi suoritetun sentrifugoinnin (30 min., 3 000 kierr./min) jälkeen saatiin 20,5 litraa syvänruskeata viljelmäliuosta, jossa oli 67 000 SIY/1. pH säädettiin HNO^lla 3,5 = ksi ja värin poistamiseksi lisättiin 60 g Lewapolia (Ca 9221, raekoko 0,35 mm, Fa. Bayer)/1 = 1,23 kg Lewapolia. 20 min. sekoittamisen jälkeen imusuodatettiin Seitz K 3-suodattimen läpi. Värittömäksi tehty viljelmäliuos neutraloitiin NH^lla (18,5 1, 67 000 SIY/l). Vaikutus aineen adsorb oi mi seksi sen joukkoon sekoitettiin 20 g aktiivihiiItä/1 = 370 g ja sekoittamista jatkettiin 30 minuuttia. Sen jälkeen suodatettiin Seitz K 3-suodattimen läpi, jonka päällä oli kerros suodatusapu-ainetta Clarcel. Suodos (17»5 1, 3 600 SIY/l) heitettiin pois. Hiili-jäännös pestiin 3 kertaa 2 1:11a tislattua vettä. Vaikutusaineen uuttamiseksi hiilestä tätä sekoitettiin 3 kertaa perätysten 15 minuuttia 1 litran kanssa 80-prosenttista asetonia (kullakin kerralla), jolloin pH säädettiin väk. HCl:lla 2,5:ksi. Uutteet yhdistettiin (2,1+ 1, 371 000 SIY/l). Tähän uutteeseen pantiin 20 g Dowex H /1 (Dowex 50W X 1», H -muoto, Fa. Serva, Heidelberg) = U6 g Dowex'ia ja sekoitettiin 20 minuuttia. Sen jälkeen hartsi suodatettiin erilleen (Dowex-fraktio I) ja pestiin pienellä määrällä 75-prosenttistaasetonia. Suodosta ja pesunestettä (31= 215 000 SIY/l) sekoitettiin 60 g:n kanssa Aniberlite IRA 1*10 (OH muotoa) (Fa. Serva Heidelberg)/1, kunnes pH oli 7. Sen jälkeen suodatettiin ja suodokseen (2,8 1, 219 000 SIY/l) lisättiin 72 g Dowex H+-hartsia ja sekoitettiin 20 minuuttia.

20 56698 pH pidettiin tänä aikana 3»0:ssa riiputtamalla seoksessa Amberlite IRA 1*10 OH :11a täytettyä huokoista nailon-pussia. Tämän jälkeen Dovrex suodatettiin erilleen (Dowex-fraktio II), suodos (2,6 1, 27 000 SIY/l) heitettiin pois.

Dovex-fraktiot I ja II pestiin kumpikin erikseen 3 kertaa 75-prosenttisella asetonilla pH:n ollessa 3,5 ja sen jälkeen kummatkin uutettiin 3 kertaa 100 mlrlla (kullakin kerralla) (Dowex-fraktio I) tai 150 ml:lla (Dowex-fraktio II) 0 ,6-pro-senttista NH^a. Ensimmäisessä uutoksessa, jolloin ammoniakki määrä ei riittänyt Dowex-hartsin neutralointiin, pH säädettiin väk. NH^a lisäämällä pH-mittarin avulla 9:ksi. Dowex-fraktioiden I ja II kolmet uutteet yhdistettiin kummatkin erikseen, konsentroitiin rotaatiohaihduttimessa lähes kuiviin, liuotettiin 50 ml:aan H^Oita, pH säädettiin pH-mittarin avulla HClrlla välille 3-1+ ja lisättiin 50 ml metanolia. Liuokset tiputettiin sekoittaen 1,5 litraan absoluuttista asetonia, alas laskeutuva sakka imusuodatettiin erilleen ja pestiin 3 kertaa asetonilla sekä kerran eetterillä. Kuivaus tapahtui vakuumissa.

Saanto: Fraktio I 6,5 g 25 000 SIY/g

Fraktio II 12,3 g 36 000 SIY/g.

Fraktiot I ja II sisältävät estoaktiivisina osina pääasiallisesti aminosoke-rijohdannaista, jossa n = 2, ja tämän ohella vähäisiä määriä lähinnä korkeampia homologeja (n = 3).

Saanto Tilavuus (l) SIY/1 SIY yhteensä SIY saanto, % 1) Viljelmäliuos 20,5 67 000 1 373 500 100 2) Lewapolilla suoritetun värin poistamisen jälkeen 19,5 67 000 1 306 500 95 3) Aktiivihiilellä adsorboinnin jälkeen 18,5 3 600 66 600 (1*,8 hylätty) 1+) 1. uute 0,7 7**2 000 519 1*00) 37,8) ^ 5) 2. uute 0,9 329 000 296 100 ) 883 500 21,6)61*- 6) 3. uute 0,8 85 000 68 000) 5,0) 7) Uuteseos (U-6 ) 2,1* 371 000 89Ο 1*00 61*,8 8) 1. Dowex-adsorption jälkeen 3,0 215 000 61*5 000 9) IRA OH :11a neutraloinnin jälkeen 2,8 219 000 613 200 10) 2. Dowex-adsorption jälkeen 2,5 27 000 67 500 (*+,9 hylätty) 11) Yhdistetty NH_-uute

Dowex-fraktiosta Γ 0,29 6 82 000 19 7 7 80 11*,1*) 12) Yhdistetty NH„-uute ^60-

Dowex-fraktiosta "ΊΙ 0,1*5 1 1*19 000 63Ö 550 1*6,5) 13) Saostus Fraktio I 6,5 g 25 000/g 162 500 11,8) ) 1*1*—

Saostus Fraktio II 12,3 g 36 000/g 1+1*2 800 32,2) 56698

Esimerkki 3 200 g valmistetta, joka oli saatu ymppäämällä 8 litraan ravintoliuosta, joka sisälsi 5,0 % tärkkelystä, 1,0 % hiivauutetta ja 0,2 % Κ,,ΗΡΟ^, 3 vrk ikäistä kannan SE 50/13 (CBS 611+,71) ravistusviljelmää ja inkuboimalla viljelmää 3 vrk 28°C:ssa tehokkaasti sekoittaen, lisättiin 9*+0 ml:aan tislattua vettä ja 60 ml:aan väkevää H^SOj^a ja, liuosta keitettiin palautus jäähdyttäen 1+ tuntia (sisälämpötila 98-100°Cv öljyhauteen lämpötila: 11+0°C). Jäähtyneeseen, mustanruskeaan liuokseen lisättiin 10 g aktiivihiiltä (Merck Art. 2186) ja sekoitettiin tunnin ajan. Tämän jälkeen aktiivihiili suodatettiin erilleen, pestiin vedellä ja suodoksen pH säädettiin välille 7-8 noin 250 ml:11a 10n K0H:a. Liuosta sekoitettiin tannin ajan 50 g:n kanssa s aktiivihiiltä. Hiili suodatettiin erilleen, pestiin 2 1:11a vettä ja suodos heitettiin pois. Tuotteen uuttamiseksi hiilestä tätä digeroitiin yön ajan 2 litralla 30-prosenttista alkoholia. Lopuksi hiili suodatettiin erilleen ja alkoholiliuos haihdutettiin kuiviin rotaatiohaihduttimessa. Jäännös: 6,2 g. Tämä raakatuote (6,2 g) liuotettiin 500 ml:aan vettä ja liuosta sekoitettiin varovaisesti tunnin ajan 30 g:n kanssa tuotetta Amberlite IR 120 (H+-muoto). Ioninvaihtaja suodatettiin pois ja pestiin tislatulla vedellä kunnes suodos oli neutraali ja glukoositon. Sen jälkeen ioninvaihtajaa sekoitettiin yön ajan 1 000 ml:ssa vettä 15 ml:n kanssa 25-prosenttista NH^.a, erotettiin ja heitettiin pois. Suodos haihdutettiin kuiviin rotaatiohaihduttimessa. Jäännös: 3,7 g.

Jatkopuhdistusta varten kromatografoitiin selluloosaa käyttäen. U,5 g ionin-vaihtajasta uutettua ainetta pantiin selluloosalla täytettyyn kolonniin, jonka pituus 011 1 m ja halkaisija 2,5 cm. Ajonesteenä käytettiin ensin etanoli/H^O-seosta 5:1, aminosokerijohdannaisen, jossa n = 1, eluoimiseksi käytettiin ensin etanoli/H20“seos-ta 3:1. Tiputusnopeuden ollessa 20 pisaraa minuutissa otettiin kerrallaan 1*+ ml:n fraktioita. Kukin erillinen fraktio tutkittiin levykromatografisesti. Fraktioista U7-85 saatiin kuiviin haihduttamisen jälkeen 1,6 g lievästi ruskeaksi värjäytynyttä aminosokerijohdannaista, jossa n = 1. Määrällisesti värjäävillä epäpuhtauksilla ei ole mitään merkitystä. Aminosokerijohdannaista, jossa n 58 1, saadaan värittömänä ✓ hartsina, jos puhdistusvaihe vahvasti happamella ioninvaihtajalla suoritetaan erä-menetelmän sijasta kolonnissa.

22 56698

Esimerkki ^ (Esimerkki keksinnön mukaisten yhdisteiden uuttamisesta happamella liuoksella) ... ®

Kolonniin, jonka läpimitta oli 1,5 cm pantiin 30 g kosteata Dowex 50 W x lt:ää, (H+) 0,07^-0,037 mm, 0,001-norm. HClrssä. Sen jälkeen pylvään läpi pumpattiin noin 1 tunnin aikana 500 ml sekauutetta (U00 000 SIY/1, pH 2,5» 60 % asetonia), jota oli saatu esimerkin 2 mukaisesti (taulukko, kohta 7) ja sen jälkeen pylväs huuhdottiin 500 ml:11a 0,001-norm. HCl:a. Näissä olosuhteissa aktiivisuudesta eluoitui vain hivenen. Tämän jälkeen uutettiin 0,0125-norm. HCl:lla, jolloin rekisteröitiin pylväseluaatin johtokyky. Lisäksi tutkittiin eluaatin SIY-pitoisuus. Aktiiviset fraktiot 7^-100 yhdistettiin ja neutraloitiin lisäämällä valmistettua Amberlite IRA bVS OH , sen jälkeen konsentroitiin 5 ml:ksi, lisättiin 5 ml metanolia ja saostettiin tiputtamalla liuos 200 ml:aan asetonia. Asetonilla ja eetterillä suoritetun pesun jälkeen kuivattiin vakuumissa.

Saanto 1 g aminosokerijohdannaista, jossa n = 2 ja jossa oli 65 000 SIY/g.

Aktiivisista esifraktioista voidaan saada talteen aminosokerijohdannaisia, joissa n 5 3 ja n = ·(.

Tämän happamen uutosmenetelmän ansiosta on siis mahdollista, päin vastoin kuin alkalista uutosmenetelmää käytettäessä, fraktioida aminosokerijohdannais-homologeja.

Terapeuttiset kokeet I Koejärjestelyt ^lykosidihydrolaasi-inhibiittorien vaikutuksen ja glukoosiresorptioeBtokyyya . osoittamiseksi rotilla ja ihmisillä

Ravinnosta johtuvan veren liikasokerisuuden ja liikainsuliinisuuden aikaansaamiseksi tyhjävatsaisille rotille (6 kpl) tai tyhjävatsaisille koehenkilöille annetaan suun kautta joko 2,5 g sakkaroosia tai 2,5 g maltoosia tai 1 g keitettyä tärkkelystä tai 2,5 g glukoosia kiloa kohden, tai 50 g sakkaroosia tai 50 g maltoosia tai 50 g keitettyä tärkkelystä tai 50 g glukoosia henkeä kohden suun kautta vesiliuoksena tai suspensiona. Toiset rotat 6 kpl saavat mainittuja hiilihydraatteja samat määrät ja lisäksi yhtä esimerkeissä mainituista vaikutusaineista ilmoitetuin annoksin. Terveille koehenkilöille annetaan vuorotellen yhtä mainituista hiilihydraateista joka toinen päivä tai harvemmin yhdessä jonkin mainitun vaikutusaineen kanssa tai ilman tätä. Verenglukoosi ja seerumi-insuliini määritetään sekä ennen hiilihydraatin -vaikutusaineen antamista että lyhyin väliajoin 5 minuutin - 3 tunnin aikana antamisesta rottien retro-orbitaalisesta laskimopunoksesta otetusta verestä tai 23 56698 koehenkilöiden kyynärlaskimosta tai hiussuonista otetusta verestä. Verenglukoosi-

(fD

määritykset suoritetaan Auto-Analyzer-laitteella (Technicon w, Hoffman: J· Biol. Chem. 120, 51 (1937) tai entsymaattisesti glukoosioksidaasilla ja o-dianisi-diinihydrokloridilla), seerumi-insuliinimääritykset Hales'in ja Rande'n menetelmällä: Biochem. J. 88, 137 (19^3) - II Koejärjestely rasvakudoslipidien hiilihydraattien konversion estymisen osoittamiseksi

Rotat (6 kpl) saavat mahaletkulla yhtä mainituista hiilihydraateista inaktiivisessa muodossa yhdessä sopivan annoksen kanssa samaa hiilihydraattia, „ mutta joka on merkitty radioaktiivisella hiilellä (^C), - mainituissa esi merkeissä mainittua vaikutusainetta. Lyhyin aikavälein kokeen aloittamisesta eläimet tapetaan ja niiltä otetaan näytteet lisäkives- ja/tai munuaista ympäröivästä rasvakudoksesta, lipidit uutetaan sopivilla rasvaliuottimilla, esim. kloroformi/metanoli-seoksella (2:1) ja lipidejä sisältämättömät aineenvaihdunta-muuttumistuotteet pestään erilleen. Tällä tavalla eristetyistä lipideistä määritetään radioaktiivisuus Liquid Scintillation Counter-laitteella. Aktiviteetti ilmoitetaan yksikköinä dpm/1 g rasvakudosta.

Taulukoissa P merkitsee virheen todennäköisyyttä ja s standardi-poikkeamaa.

2k 56698

S

a>

f—I r~i • H •H

a x

« VO «Ö I

-P -=t

•H

•H II

co G

G V

a) cu

G CÖ X

-P CO i-( «Oi P CO :d -p 2 Ο ·η> co 3 -° c £

X * O <U

<a a „ μ a-pc o cnojj· χ d) CO CQ * r- it a «

•m ·Η irv »- t— QO VO caJ

0 CO · LD + I + I + I +1+1 -P

Mi C C -4· VD 0\ t— -=J- CD

•H G ·Η VD O O O coj Cd

<0 <0 B — — — CQ

•Ö CO

•h a o G Ο ·ι~3 cu ”~3 c— σ\ t— I n . -H " " — Ί VOII *

Co H -=t 00 *— VD I *11 G

H <U O +1 + I + I + I i VDII 3

r-C X OOCVJCÖOO t—l + lll «S

•HO t— CVJ CM (-1 VOI +> t o -- -. σι! 3 G G > led i 00 m —I —II Ml CÖ

H B " “ *1 11 H -H

H irv αο 0O| _^|| mu h

•H (- O + I +1 + I 1 + I II + III H

CO CVI I- O 4| (Nl m o

•H G VD — OI Oil OOH G

ICÖ *H (- —I +5

X. Mi G

1 S 2 S Ov VD CO CM Oil ^ ·Η " " « · *11 (- CD CO ΙΑ ® 1Λ OO CVJII o H cu crv +i +1 +i +i +1 n o (- co c— oo oo cyii -+1 +1 vd — — σ\ con o — — v O (CCS ft

> -P

G CO II

<d >> co LTV evil uNI II

•H H - — « *1 *11 II

X 4» J· — Hi crv| uNI II -

CO X O + I +1 +1 +1 I +1 II II

0> X — CD 00 ON OI Ht jl X G erv O Ov OM Hi —' :cd — <—

+> O

A ICÖ <0 * CÖ -p G o

+> CO CU VJ

g> -e >> x v S G r-f ft

cd cu C

»X X CU CO

•H X CO s CO C G X r-f

OP tcö >> (U

— o G +> H X

X co <U X s s

o G . G X G

X H G 3 X !(d X 60 -P S G +> Lrv

G G +> rl «d O

H <U ai .h+>++ +

G G G O

eJ CU G ·Η ·Η >H iH >-l .| E-t > ® HHHMM v H (G <! <! *< ft

O O

G G O O O I

-P -P O O O I

G G O O O I

O O I

X X VO CVI Hf |

— CVJ

25 56698 IA C\1 CT» CM 11 A I! » ιΑ » » »M » Il

β .Τ' t" VO I CM A II g r- r- AA «i- Il "'f H

O » » » i » » Il O 11 .

VD C— A | T CM II +! +1 +» +1 +111 + III

<D i H O II II

[j +1 +1 +11 +1 +111 '-J -+ CD A O CJ II O II

n A I II ^ A CO CM CM A O II O II

•h «1-0 «1- | T- «t II 2 e<- 1— T- r- '— M '— Il c C CM *— I »— O II S® -*— -»— I '— '— Il (D _ C C βχ OJ O ί- A CM II O II ejj 3 Φ A ‘ CM CO II +11 G H » » » » »Il »Il 43

M ® » »T- ||»||»jj M Id A A VO CT» ffl II A II HJ

_ ^ MD O'' *— I! CD II VO II >Γ5 II II

•tö ^ O II II II ·πΓ e° +1 +1 +» +1 +111 +111 ^ 4ä Ä eA +1 +1 +111 +111 +111 £ g A !| Il j§ h a il it il -h cm β T- a «r cr» a il r- 11 3 H G N VO ® Il W II OMI H „ G CT» A A «- O II CT» Il *4 ® 1 o CO A CM I! «- Il O II ra*® «-*-»-«- Il :rt rt C c ^ 11 " rt « . 43 S, rt d VO Ml A II j* rt.5 M O I M CM II g 43® . »ACM »Il »Il £ ra g »CM » I » VO II »Il _ a® c <r» »— 1— τ» n «a- n ^ m α co «- r— 1 vo «-hah 0

H o .H .11 II H o I II II -O

- p ^ BO +1+1+1 +111 +111 3-ÖO +I+I+II+I +11 +111

Ä CM II II M CM I II II

_ J“ (D N r- A II CM I! _ _T A O »d- I CO Il C— Il fi g S C— A CM n- Il r- Il C ® f- + CM I r- Tv II T' Il rt .® ra r- - - Il - Il .® O --1- $ 0 ••i o *3 ra

^ (β M cd M

•H g Γ-AC— |A|| -H S a 01 cr» il «+ il > rt§ » » · j »Il t— H rt 5 » r— »IO »Il »Il ,i9 A CT CO I σ» Il — I! rt A i- VO I r- VO II M II d V. % A I II M Tj S 1 II II * S Ϊ r- +1 +1 +11 +111 +111 Jo A +1 +| +11 +1 +111 +111 3 •1-3 I II II ·γ-» *“ I II II 0

rt -H M Γ— > I +11 OJ II M -H A CM O I A -+ Il CO II S

r—I M A (M — I CT II CO II h H CO A CM I O CT Il CO II -p

H® » * I H ^ — τ- I — G

•H M M o

1 S -£§ A M CM M II CO II M II

g o cr» o 11 vo 11 a n g 0 » » » « 11 » 11 » 11 c »CM »Il »Il »II M β A C— «i CM II CO I! Γ— Il :rt ·Η M — A II CT» Il A II -cö -H II II II — H B O II II II h § +1 +1 +1 +111 +111 +111 o

H rt T- +| +| +111 +111 +1 II H rt o II II II O

H II II -H r- r- 00 O A Γ- Il O II «τ II » “ A A Γ- Il CM II — Il ® VO CM O Τ' Il CO II CO II O

id β ^ £ ° I! " ° i! id e - v MH T- Il r- il ^ .H v

»-IM HM

:d J-t :rt fn

C ® C Φ II

fi γ<λ κλ m vo il θ en m oj vc o n >r^ + ·> * I ·» It *H »» ·» v> *» » #> 11 “ 2 CM t 00 T-JAII “ ® AC M 00 V C— Il H Φ I II H ® (| 4-1 +1 A +1 +1 +1 +1 J +111 4., + , A +| +| +| +| +| +| O :rt CM A Ό MIAU o:d «-ACMCT» O O r~

> h A A CO M I VO II >-P VO CO 00 M M f— O

U Oi fA 01 „ ' rt >> td ^ •H H :rt rt ·Η H :rt rt

M® p> U Λ!ΦΗί-ι V

®M 03® ΜΛΙ®® ® M >, M® Φ M >»M® Ai M fj H >, t c M H H >> ε s s

—»:rt ®CH w:rt Φ G H

+> M Φ Φ +> M Φ ®

» M ® M » M ® M

^rt A M M 'IfC.rt ^MM

t +* :rt>»M_„ -P :rt>»M..

bO-P -P H :rt - bo -P +> h :rt v ~ BG Φ -ρ 0β ®p>

rt C M rt G M

►M rt M + + + »M rt M A

® G Ά :rt *0 c 5 :rt + + + + CM O G Η+>μ H Hn°^ ^ 41 N H p w °

M M -H -H *~i M M ra -H <rt M M M H

o g h h «rt *< -d o g h h ' «rt «rt «rt «rt V

M»-IG HH ^iei —I 1—I 1—I P4

MbO-P OO MbD-P OO

^ I-IO O O G CP» M h o O O O I

gSc cc1'''0 °gmc ccin§ § O

rt ® G 00^1^OS®G §§t-AVO CM I

En>rt W W T_f^E-»>rt «- I

26 56698 Φ Φ Η Η

γΗ ι—I

Η ·Η •Η Η β β β β

o r- »- η co it χΐ- it >5 M

» » » · it »II »II „ 5 ad IT! VO CD II OMI νύ II :a) . n

-P H II II -P a O

H +1 +| +111 +w +1» H -P O

•h il il il -h a μ ® O OJ CO II t- Il ΙΛ II 05 H a VO vO |<Λ O II O II CO II M 3 -3 $ - - Il 3 9 a PC -p a a P · © -p <ö c a ® c λ o n a H -P M CO V— | t"- ITV II HO * » · || a CCDH · VO »I »»Il Cl-» ιΟ T- W ΙΛ il a ΊΊ j f, *>+ *— CT\| C- 00 II Λ·Η II o β S ^ ι it a g +1 +i+i +1 il -r3

Φ S β ^ +* +1 -H» + t +IW Φ J5 C II

t-3 S o ι il ·?,ο «o m f- r- oo u a o ·ο β w (Mi cm ιτν it oa αίνο σν cm ο σ> tl a m Λ c m ΚΝτ-ι ο σνιι >ι o» «- τ- n a

H O a τ- τ— j τ— *Η β ι—I -P

a··*» a h :a a h · a +» a ' t |l β H a r\ ι λ ^ h a ι-l a a ι*· I o ® m s rc\o σ> οι φφφ » ο » i » a o » » o IT\ * II -p β co OI f* ι + ·Η

aa ΙΛ VO r r- omi a a C ι H

h o ° n h -h ao +i +i +i ι +i h ^ fl **> +i +i+i +i +ni j g kv ι p :pfl _ Il ^ -¾ · CM VO o | CM £ O a σ> T- i£N t- 1+11 o i H OVCMOICTV £ μ -vfCMO o σν II μ " g | i- *- I o r-ι T- r« r* Γ ^ xt. UÖ H fl H Ö f-

rH ·Η rH *H Q

# CTV 1+r-r- -¾¾ kn en C" I! Ch II o •rlQ) »r-» »» ·ΗΦ •♦»Il »ti · :a a CMi- νθ i+OO :nj a il- σι rv il irv il o M H M H II II V/

Ha irv +1 +1 +1 +1 +1 H B irv +| +1 +||| +1 II V

»β Φ τ- :a Φ «— il il pv, β,. oof-σν m in o. . irv rv r- n co ii ^ +1 lTv O O O 00 1 ι- *- f- ii ir\ tl n aa 1-T-r- aa ϋ

H *H H H H

a a M

+ 1 O +1 O II

o o o μ o μ > a > a - μ m μ m a ^ a m -na a m h a ° na a μ h a a μ »

Ma οφη Ma οφη O

a o M a a o M a . .

©a μ o φ a μ o V

m-p a β o m-p a β o — -p m h μ —-p m h μ e M ®a - - ,c m a a _ *- a a oM s- a a o m -

M a OM t M a o M

5o μ a 5o μ «S

a e vo e a a a e e a a hci § $ H§ s m + + aa h a + + + a m h a o itHaTTT,^ocMHa -a- o e o e . . ° M +> I H H s,. . . M-p II iHH^Vj *

OC-P H H , >1 >· O C -p H H IH M O

M H ® β H H M MM M H Φ β H H CO CO v /

M 50 β OOCOCOCOM50C OO V

i3 e a a μ μ p e e a μ μ ol· η φ a a -p +> H ® a a +> -p^-i,-, c μ a ββιτν oo c μ a a φ β o o o Jf; SS a © e o o o 04 ° j

E-t > O ι-» MM04 ® &4>ο·ο M M «“ J

2T S6698 β Φ Φ Μ ιΗ β :Φ φ ·η a β :cd ο Ρ β ι—I β :θ C0 γΗ Ή · ' Μ β β -Η Φ 0 Λ ® Ο ·* m ΟΟ -d- m νο ο Ο CO O'— r-r- Or- O *-

JS

rH

Φ Ο Ο (Τ' CM CM vor- OCO

® CM Ο r- τ- CT» *-

a r- r-r- r- να C

+> P

d M

> u o -3- r- o -a- 00^ cm CO

so} φ . <τ οτ- h cmt- . ο *- h *- •Ο Θ <0 CO r- d _ CO _

,β Ρ p P

>, a CD O CD O

+> 4) O O OO

O OOO

oä+l q O O C— rH KO MOCTrH O C"

I—I d U) ft| r— τ— ¢6 rt r— CM

® .3 3 ^ +r_ 3 + Ό ® CO (0 d d Λ 0 a ρ co ρ do co co

β LTN C"~ o CMCO p CO *~ o CO IA

d P **$" Γ— K"\ o KN r— τΗ in CM O CM r~ 1Η Μ Ρ τ- β r- P r- fl 1- Ö X -P 3 -P <0

\ <0 -P M -P M

Μ ο Φ 1 Μ φ 3 M t O O en J ® CO f o r· g ^ !Λ tn I σ' xi- rt r- 5 eo ΙΛ m r- P -P MJ*- Ö *- M *- Π *“ β β Ή Ή Ή (β 05 ιΗ ®ί ·*Η ~ ·Η M CD +» ω 4* 1 fl “moDKN-gvoogcNj^-gcMin g S ^ £ *“ C- tn £ ^i-CM £ CM r- ® CM t— β β 60 *“ h *“ •H Φ % » !d · !C0

I >-1 <0 M a M

Ρ β p co CO

g -£ M £ o^“ ί cmo Scot— S cm vo

β -P ® O CMr- ®CMr— ® (-J “O

μ Φ O Φ _ π _ φ _ m ^ ® β O M O *“ M O*- Φ β O O π O p

a a - M M

VO *H · «H · C0 β CM H ti rH es

1-¾ O w rH CO rH CQ

O CQ O O

Φ C0 M Φ h Φ

rH P -P -H φ ·Η Ρ Ρ ® -H

60 (M M β β M β fl β M β

Θ p O O Ή o Ή o "H O P

Φ-P M -HM ·Η M -HM -H

Ρ ,β "P Ρ P Ρ P "H rH P rH

co p «0 αβ.<4θαβρ;ηβ|Τ|θθ0

O β Ή OCO OCO OCO ODD

r n o β,ο :θ O β :o O β :o O β :o O fl

M M P P MPpMPPMPpMP

οβ ja ρ βίρβίρβίρβι M P fl fl M pp M pp MPPM pp Μ60ΦΡ Έ tee a ta a a (o a 1 us β q φ <0 φ ββφ^]β«ββοββ

P © M M Ä ® H M Φ Η ,β Φ Η ,β ©H

β fl P C0 Φ ΑΦΦΑΦΦΑΦΦΑΦ d ® :rt <o o φφοφφοφφοφφ H>t-3Ö M >co M >co m > to m >co 28 S6698 β "ϋ ο

SH

Ά § I—i

•HO

•ho β β O ·Η 10 Β ^ 8

Μ £ S

* \ οΰ *10 >1 Β Ρ Μ β •Η 03 β ·Η •rl <υ ® (Ο Ο ^ +3 β Ο ιβ β β -O I ·Η -Ρ VO CO 00 VOI Μ -Ρ0Μβ"-“"«1Ο 3 -—· o ia w ia mi o H β 0+1 +1 + | +|| β Β β β Ον (\J oo oj md I β ai h ® t- ah £J· Aj β o β t3 ® +> ·η tn

•ra -p -P

O ·Η +> VOII Λ ^-ngcnt-mua, •h & β -- *- -- voil w

β·Η βΟ+Ι+Ι+Ι +111 O

•H § 3 ^ 5 8 S

β ·Η r- r- · Il " <0 ® β β 'S β rH β νο u~\ +> H β » * mu «-n m •H OV M ’-Il --11 e P β 0+1 +1 +111 +1 II S» o -p co o J ini ooh β w <?\ t— omi cvjii β

•H ’-Il ’—Il -H

ιβ β H

H m H

HP O

•H B O VOII UNI β

tO “O 11 *11 -P

•H oo ·- Ml OOH β Ιβ O +1 +1 +111 +111 o äa OJ -— Ov Qjl ®|l A! •H o\ t~- emi evin

Ai I- --Il *-||

h β O

'“'g o to B “

H ·Η VO *—II VOII O

to * 11 11 ,λ +1 β -=1--- -=1-11 Oli ^ 0+1 +1 +111 +1 II PL, 0+1 -- -- OÖ OÖH Ml

> M CO Oli Oli II

β β -- --Il -"Il II

β -H II

•n <n __ II

Ai o VO CO r- VOI II -

m o * * ·> »i II

O) +> -- IA IA VOI

Ai H +1+1 +1 +1I

·—' β IA σ\ -- J- CMI

B VO O O OM O

K i— r— *

*A β O

-β β x / Öp +> ·Η β a β to β 1¾ β O β "AI O Ai

•H -P

tn β H β O 3 β ·Η e- o β a to

M tn O

O 3 ^ BOSS

Al Η β β +3 M ÖO +> ä H uv

P β -P H β O

h β β -h a "

3 β β O

EH > S 3r + N/ H H Sh Sh PL, £ S S g

-P +> I

e e o o i

O O O O I

« « cvj l 29 56698 © rt rl

H

H

C

C

^ CM £ © - Il ©

:d X

-p _ H

•H u :tö · •H _ H> Cί

01 <D H

m pj ra «j tn o o 2 0 G o

-P 0 __ .M

-p cö 03 ro O 2

2 » 0> » · H

rl fQ · kO r Γ— O'* W

2 _p C

^ tn +1 +1 +1 +1 « Π *H m m <U t 00 CM O o •n c m co in k\ κι -o ^ o C TJ· r- T- T- x m •as 8

.a ίο, eri S

fi '*~2 ·“ C\J · ► pj © '£ r- r- m CM 0) © ® +1 +1 +« +1 * rH ^ O © [j S ' -IA 00 C\J 00 CO * •h 5 r— Ti- CM T- f"!

+»o II H H

O C r- T- 0

M H * M

e -P

. :rt m Ό CM ΙΛ ΙΛ I C

rH ·» r— r— | O

H -3- | Λ! +1 +1 +1 f £ c »n +1 i 3 h r- cm tn in I r-

X CM tJ- ro CM I O

HM t«- *-«-«- l r :rt © o

CS

•H V

^ m a.

m 9 ·**

H

+ 1 + 1 ©

~ OH

> ra M o ai o

H M

X 2 m H © h o to h © m tn Λ! ra M o o w © O Φ o *

-p o Ä Jd f-T

·> -p -M 3 , P

"Ϊ& 2 2 G H e V

© H H to .* to .¾ tora Ph

0 e co I

H g ί $ * + m ra h h ; co o H to · 0 2 ,

M +» H H

O 2 -P H H

Ä rl Φ H H

-¾ to e p P toi toi 2 e e ^ n e s H © ei -P -P C ta

2 M C C

© © C O O O O

Eh t> O M W v£)

Claims (1)

1. 30 56688 Patenttivaatimus: Menetelmä mikrobiologisesti valmistettujen aminosokerijohdannaisten eristämiseksi ja puhdistamiseksi, joilla aminosokereilla on yleinen kaava OH °H CH3 h° \ /1r ch2oh h 0H 0H jossa R on sakkaridiketju, jossa on 1-7 heksoosiyksikköä, tunnettu siitä, että Aetinoplanes sukuun kuuluvia mikro-organismeja aerobisissa olosuhteissa ja vesipitoisessa ravintoväliaineessa viljelemällä saadun huovaston erottamisen ja saadun viljelysuodoksen mahdollisesti esimerkiksi aktiivi-hiilellä pH:ssa 1-3 suoritetun värinpoistokäsittelyn jälkeen a) viljelysuodokseen lisätään neutraalissa pHrssa aktiivihiiltä, b) aktiivihiileen sitoutuneet aineet desorboidaan selektiivisesti pH-arvoon 1,5-^ säädetyllä veden ja alkoholin tai veden ja asetonin seoksella, edullisesti 50-80-#:isella asetonilla, c) saatu desorbaatti viedään kationinvaihtajalle, joka on edullisesti vahvasti hapan, ja d) kationinvaihtajaan sitoutuneet aminosokerit joko desorboidaan kokonaisuudessaan ammoniakin avulla ja senjälkeen fraktioidaan sinänsä tunnetulla tavalla geelisuodatusta tai selluloosakolonnia käyttäen yksittäiskomponenteiksi, tai aminosokerit eluoidaan selektiivisesti laimealla hapolla, ja näin saaduista eluaateista eristetään yksittäiset aminosokerit.