CS200173B2 - Process for derivatives of aminosugars - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby nových derivátů aminocukrů, které se užívají v lékařství zejména při cukrovce a proti otylosti.

Je známo, že řada Actionomycet, především z čeledi Actionoplanaceae tvoří inhibitory hydroláz glykosidů, zejména těch, které štěpí uhlohydráty v zažívací soustavě. Jedna skupina těchto inhibitorů je poměrně stálá proti teplu a při teplotě místnosti stálá také proti kyselinám a zásadám. Tyto inhibitory náležejí chemicky do skupiny oligo*sacharidů nebo polysacharidů a jejich derivátů.

Většina inhibitorů této skupiny jsou vysoce účinné inhibitory amylázy, avšak pouze středně účinné nebo slabé inhibitory sacharázy. (NSR vykládací spis č. 2 064 092).

Nyní bylo zjištěno, že je možno získat nové deriváty aminocukrů obecného vzorec

až 7 hexózovými jednotkami, vyznačující se tím, že se pěstují mikroorganismy čeledi Actinoplánaceae kmen SE 50/110 — CBS 674.73 ve vodném živném prostředí s obsahem zdrojů uhlíku, dusíku a anorganických solí při pH 5,-01 až 8,5 a teplotě 15 až 45 ^CC za aerobních podmínek a derivát aminocukru se po skončené fermentaci izoluje, a popřípadě se při výrobě sloučenin, v nichž R znamená 1 nebo 2 monosacharidové jednotky odbourávájí sloučeniny, v nichž R znamená'více než 2 monosacharidové jednotky enzymatickým způsobem inkubací s hydro lázami nebo hydrolýzou v kyselém prostředí za použití vodných roztoků anorganických kyselin.

Dále bylo zjištěno, že nové deriváty aminocukrů jsou silnými inhibitory hydroláz glykosidů v trávicí soustavě. Nižší členy této řady v nichž R znamená oligosacharidový řetězec s 1 nebo- 2 hexózovými jednotkami inhibují zejména sacharázu, vyšší členy inhibují především amylázu.

Je překvapující, že nové deriváty aminocukrů podle vynálezu mají vyšší specifickou účinnost proti sacharáze a amyláze než dosud známé inhibitory. Je zvláště pozoruhodné, že některé z nových derivátů aminocukrů mají in vivo několikrát vyšší účinnost než in vitro., kde

290173

R znamená oligosacharidový řetězec s 1

Je zvláště překvapující, že nižší členy homologní řady podle vynálezu působí inhibici resorpce glukózy in vivo. Vzhledem k těmto svým překvapujícím vlastnostem jsou nové 'deriváty aminocukrů podle vynálezu významným obohacením v lékařství.

K provádění způsobu podle vynálezu se tížívají mikroorganismy řádu Actionomycetales, z čeledi Actionoplanaceae, a to zejména kmeny Actinoplanes. Jako příklady je možno uvést kmeny Actinoplanes SE 50 (CBS 961.70J, SB 18 (CBS 957.70) a SE 82 (CBS 615.71). Tyto mikroorganismy jsou popsány již v jihoafrickém patentu č. 71/8677 a jsou uloženy pod čísly, která byla uvedena v závorkách v Centralbureau vor Schlmmelcultures v Baarnu v Holandsku.

K provádění způsobu podle vynálezu je možno dále užít, jak je rovněž popsáno již v jihoafrickém patentu č. 71/8677 mutanty nebo varianty svrchu uvedených kmenů. Zvláště výhodné jsou z hlediska celkových výtěžků nových derivátů aminocukrů podle vynálezu a/nebo z hlediska velikosti zbytku R ve směsí derivátů aminocukrů, vytvořených v průběhu fermentace kmeny SE 50/13 (CBS 614.71) a SE 50/110' (CBS 674.73). Oba kmeny odpovídají vlastnostmi do značné míry původnímu kmenu SE 50. Tyto· kmeny byly získány přirozeným výběrem z kmene SE 50 bez použití mutagenů.

K provádění způsobu podle vynálezu, je možno užít pevné nebo kapalné, zejména kapalné vodné živné prostředí, které .obsahuje zdroje uhlíku, zdroje dusíku, anorganické soli a protipěnivé činidlo ve vhodných koncentracích. Tyto koncentrace se mohou pohybovat v širokém· rozmezí.

Jako zdroje uhlíku se užijí především uhlohydráty, zejména škroby, maltóza, glukóza nebo směsi dvou nebo· tří těchto látek, nebo tyto komplexní směsi jako sladový extrakt.

Ze zdrojů dusíku je možno užít v mikrobiologii běžně užívané komplexní směsi jako například hydrolyzát kaseinu, extrakt z kvasnic, pspton, rybí moučka, extrakt z kukuřice, extrakt z masa, rozpustný podíl z rybí moučky nebo směsi těchto látek i aminoskupiny a/nebo amonné soli.

Při provádění způsobu podle vynálezu se užije aerobní třepací kultury při stálém provzdušňování. Je .možno užít také kultury v pevném fermentoru. Druh a koncentrace zdroje uhlíku závisí na použitém kmenu a na žádaném výsledném produktu, zejména pokud jde o požadovanou velikost zbytku R, a to do té míry, že volbou tohoto zdroje je možno získat v téměř čisté formě jednotlivé členy homologní řady. Mimoto bylo zjištěno, že v živných prostředích, která mají vyšší obsah škrobu než 2 · °/o se tvoří především deriváty aminocukrů s 4 až 7 hexózovými jednotkami, přičemž pro tento typ fermentace je vhodný zejména kmen SE 50/13 (CBS 614.71). Obvykle stačí přidat k živnému prostředí, které již obsahuje například 3,5 % glukózy nebo základního zdro je uhlíku 0,1 až 3, s výhodou 0,5 až 2 % škrobu k získání směsi derivátů aminocukrů s· obsahem 4 až 7 hexózových jednotek. Dále bylo zjištěno, že v živném prostředí, které je prosté škrobu a zejména po přidání maltózy a zejména při použití kmene SE 50 (CBS 961.70) se tvoří zejména deriváty aminocukrů s obsahem 2 až 3 hexózových jednotek. Pro výrobu derivátů aminocukrů podle vynálezu, v nichž R =, glukóza jsou zvláště vhodné takové živné roztoky, které obsahují glukózu jako jediný zdroj uhlíku. V případě, že živný roztok obsahuje glukózu v přebytku, tvoří se při další době fermentace také deriváty aminocukrů s delším řetězcem. Jde zřejmě o to, že v průběhu fermentace dochází k vyčerpání zdrojů dusíku současně s vyčerpáním glukózy. V případě, že se ze živného roztoku úplně vyloučí glukóza a jako zdroj uhlíku se užije maltóza, získá se převážně derivát aminocukrů s 2 hexózovými jednotkami. Čistou maltózu je v tomto případě možno nahradit levnější směsí, například přípravkem Maltzin, což je přírodní sladový extrakt firmy Diamalt AG, v Mnichově. Protože tento přípravek obsahuje větší množství maltotriózy, tvoří se v tomto případě současně i vyšší homology. Zvšláště vhodným pro výrobu nižších homologů je kmen · SE 50/110, s jehož použitím je možno při optimálním složení živného roztoku získat přibližně dvojnásobný výtěžek nižších homologů než při použití kmene SE 50/13.

V průběhu fermentace se jinak může složení živného roztoku, zejména koncentrace zdrojů dusíku a složení anorganických solí, pohybovat v širokém rozmezí.

Živné prostředí se sterilizuje běžným způsobem. Živný roztok má nyní pH v rozmezí 5,0 až 8,5, s výhodou rozmezí 6,0 až 7,8. Teplota při fermentaci se pohybuje v rozmezí 15 až 45 °C, s výhodou v rozmezí 24 až 32 °C. Pro výrobu vyšších · homologů při použití kmenů SE 50 a SE 50/13 je nejpříznivější užití vyšší teploty, například 28 °C, pro výrobu nižších homologů při použití kmenů SE 50 a SE 50/110 teplota nižší, například 24 °C. Fermentace trvá 1 až 8 dní, s výhodou 2 až 6 dní. Delší doba fermentace, zejména při použití přebytku uhlohydrátů vede k tvorbě vyšších homologů. Skončení fermentace se stanoví stanovením obsahu a účinnosti získaných produktů v enzymatických testech a chromatografií na tenké vrstvě, kterou se stanoví složení živného prostředí.

Nižší homology derivátů aminocukrů podle vynálezu je možno získat také odštěpením hexózových jednotek z vyšších homologů. Toto štěpení je možno provádět buď vodným roztokem kyselin, zejména 1 až 5 N anorganickými kyselinami při teplotách 50 až 100 °C, s výhodou při teplotním rozmezí 90 až 100 °C, reakce trvá 10 až 180 minut. Stejné homology je možno získat také inkubací s enzymy (hydrolázy), zejména s jamylázami nebo α-amylázami, které nejsou

200 173 inhíbovány nebo s amyloglukosidázami mikrobiálního původu, jako je například a-amyláza z Bacillus subtilis nebo inkubací s mikroorganismy, které jsou schopné růst v prostředcích, v nichž se získávají deriváty aminocukrů podle vynálezu v koncentraci 1 až 10 °/o, s výhodou 2 až 5 °/o, jako. například Aspergillus niger (ATCC 11394).

Izolace a Čištění derivátů aminocukrů podle vynálezu buď z mikrobiálního živného prostředí nebo s kyselého hydrolyzátu, popřípadě z inkubačních směsí, v nichž se provádělo enzymatické a/nebo mikrobiální štěpení vyšších homologů derivátů aminocukrů se provádí obecně známými způsoby.

Způsoby zpracování se většinou řídí oblastí molekulové hmotnosti, do níž spadají látky, které mají být izolovány. U vyšších homologů je možno· provádět srážení po předchozím odbarvení a odpaření roztoků.

Homology s nižší molekulovou hmotností je oproti tomu možno s výhodou izolovat adsorbcí na aktivní uhlí při neutrálním pH s následnou desorpcí, která se provádí směsí vody a alkoholu nebo acetonu, s výhodou o koncentraci 50 až 80 % acetonu. Úplně je možno dosáhnout desorpce při pH v oblasti 1,5 až 4, s výhodou 2 až 3.

V případě, že výchozí roztoky mají velmi tmavou barvu, je nutno je nejprve odbarvit před adsorpcí sloučenin podle vynálezu, a to aktivním uhlím při kyselém pH v rozmezí 1 až 3 nebo pomocí nespecifických pryskyřic, například pryskyřice Lewapol R Ca 9221/0,35 mm průměru zrn (Bayer AG), v rozmezí pH 2 až 7, s výhodou 2 až 3. Aktivní uhlí váže v kyselém prostředí především barviva, kdežto Lewapol adsorbuje barviva bez adsorpce derivátů aminocukrů podle vynálezu při alkalickém pH.

K oddělení derivátů aminocukrů podle vynálezu od neaktivních sacharidů a dalších neaktivních sloučenin se využívá slabě zásadité povahy těchto složek. Homologní deriváty aminocukrů je možno vázat za vhodných podmínek, a to při pH 1 až 8, s výhodou 2 až 4, při nižší iontové síle roztoku, která odpovídá vodivosti nižší než 10 mS, s výhodou nižší než 2 mS . na silně kyselé kationtoměniče, například na . Dowex R 50 W (Dow Chemicals), v H+-formě. Zvláště dobře je možno vázat deriváty aminocukrů podle vynálezu z acetonového roztoku s obsahem 50 až 80 % acetonu při pH 1 až 5, s výhodou 2 až 4 na kationtoměniče, které za těchto podmínek mají pro tyto látky podstatně vyšší kapacitu. S výjimkou případu, že roztok obsahuje méně než 50 % acetonu se sloučeniny váží také na slabé kyselé iontoměniče, například Amberlite IRC-50 v H + —formě.

K desorpci derivátů aminocukrů podle vynálezu z kationtoměničů se užívá vodných roztoků zásad nebo kyselin, s výhodou amoniaku nebo kyseliny solné v koncentraci

0,01 až 1 N. Z desorbátu se získá derivát aminocukrů po neutralizaci odpovídajícím slabě kyselým nebo slabě zásaditým iontoměničem nebo odstraněním zásady nebo kyseliny odpařením ve vakuu v případě těkavé zásady nebo kyseliny, nebo odpařením roztoku lyofilizací, popřípadě vysrážením organickým rozpustidlem, s výhodou 10. až 20 objemy acetonu.

Dále je možno od sebe oddělit ' nízkomolekulární deriváty aminocukrů podle vynálezu od inertních sacharidů chromatografií na iontoměničích na podkladě celulózy, s výhodou fosfocelulózy (firma Serva, Heidelberg). K eluci se užívá pufrů, s výhodou fosforečných pufrů s nízkou iontovou silou, s výhodou 2 až 100 mM, zejména 5 až 10 mM v oblasti pH 2,5 až 8, s výhodou 5 až 6. Přepookladern pro účinoou faakcionac i j e co nejnižší obsah soli v preparátu, který má být frnkcioorváo, kdežto barviva jsou daleko méně na závadu frnkciooncř.

Jednotlivé členy homologní řady derivátů aminocoarů podle vynálezu je možno čistit například chromatografií částečně čištěných preparátů na vhodném molekulárním sítu, například při použití přípravku Bio-Gel R P-2, firma Bio-Rad, Mnichov, přičemž jednotlivé frakce eluátů se sledují ^ρ^^^γι fií na tenké vrstvě. Frakce, které obsahují čisté deriváty ammocukrů se slijí, znovu se chromatografují a po odpaření se lyofilizují nebo se srážejí pomocí organických pozpustiařl, jak bylo svrchu popsáno.

Nové sloučeniny podle vynálezu náleží svou chemickou povahou do třídy uhlohydrátů. Tvoří homologní řady, jejichž základním členem je následující derivát aminocukrů (C19H33O13N), v němž R = hexóza.

снрн H

OH OH

Vyšší členy homologní řady je možno od základního členu odvodit tak, že mimoto obsahují ještě jednotky mrnrsncharidu, s výhodou hexózy, zvláště glukózy.

Všechny členy této homologní řady se dále vyznačují také tím, že při úplné kyselé hydrolýze vzniká složka I (C13H19O7N) a odpovídající monosncharia. Pro složku I bylo odvozen následující vzorec.

Příkladem principu struktury homologní řady může být příklad, v němž oligosacharidový řetězec sestává z 1 až 7 glukózových jednotek. V následujícím vzorci je uveden řetězec s η = 1 až 7 glukózových jednotek.

Základní člen rady se získá v případě, že η = 1 a označuje se jako složka II. Každý člen řady se liší od nejbližšího nižšího nebo od nejbližšího vyššího chybějící nebo přebývající glukózovou jednotkou.

Ve srovnání se složkou II je o jednu glukózovou jednotku vyšší člen řady označován jako složka III, o dvě glukózové jednotky vyšší člen jako složka IV atd.

Všechny tyto složky mají tu společnou vlastnost, že při úplné kyselé hydrolýze poskytují složku I a glukózu.

Složku II je možno popsat vzhledem k jejím fyzikálně chemickým vlastnostem, její struktuře a reaktivitě, následujícím způsobem:

Složka II je bezbarvá, amorfní pevná látka, která je dobře rozpustná, ve vodě, dimethylformamidu, dimethylsulfoxidu a v hydroxidech kovů. Za tepla je rozpustná také v ethanolech.

aj Chromatografie na tenké vrstvě

Rozpustidlo: ethylester kyseliny octové, hydroxid kovu a. voda v poměru 10 : 6 : 4.

Užívá se běžně dodávaných fólií k provádění chromatografie na tenké vrstvě:

I. Silikagelové fólie F 1500 firmy Schle-cher + Schúll

Hodnoty RR: II0,46 maltóza0,50 glukóza0,65

II. ^i^^^^g^eh^\^é plotny F 254 firmy Měrek

Hodnoty RR -I0,47 maltóza0,54 glukóza0,66

Složka II .se na silikagelových plotnách nejlépe barví směsí dusičnanu stříbrného a hydrolxidu sodného. . Hnědočerné zbarvení vzniká již při teplotě místnosti nebo po slabém zahřátí.

složka II silyluje spolu s a- a JD-glukózou nebo se . sacharózou jako vnitřním standardem ve směsi pyridinu, trimethylchlorsilanu a N-methyl-trimethylsilyltrifluoracetamidu v poměru 1 : 0,5 : 1.

Sloupec:

skleněný sloupec o délce 6 stop plněný 3 % SE 30 na chromasorbu WAW

Teploty:

vstřikovací blok 300 °C detektor 300 °C pec 220 °C až do eluce vrcholu a- a β-D-glukózy, pak teplotní program 15 °C/min až do 300 °C.

Detektor:

FIG (plamenový ionizační detektor)

Plyny:

nosný plyn: - N2	40 ml/min
spalný plyn: vzduch	80· ml/min
Hž	20 ml/min
Do'ba - retence:
a-D-glukóza	3 min
/S-D-glukóz-a	4 min
sacharóza	12 až 13 min
II	16 až 17 min

c) Uhel otáčení

Vzorek složky II, získaný odpařením methano-lového roztoku složky II v nekrystalickém stavu se rozpustí ve vodě a stanoví se specifická - otáčivost [a]_D = + 134,3°.

d) Sj^(^l^t]?um v infračerveném světle:

Spektrum ve formě KBr pelet je špatně rozlišitelné, * hlavní absorbční pruhy jsou v oblasti skupiny O—H a C—O při pohybu valencí.

b) Plynová chromatografie

K provádění plynové chromatografie se

	200173
	9	10
e) NMR-spektrum	v CD5OD při 220 MHz:(obr. 1)
v ppm	Multiplicita	Relativní intenzita
1,3	dublety, J = 6, 5Hz	3 H
2,3	triplety, Ji a J2 8—10Hz	1 H
3,15	triplety, Ji a J2 7—9Hz	1 H
3,3 — 3,9	signály nelze jednotlivě přiřadit	12 H
4,13	AB-systém, J = 12Hz	2 H
4,48 ) j	dublety, J = 7Hz ) ) dublety, J = 2,5Hz )	1 H
5,1 )
4,9	singlet	11 H protony, vyměněné za
		deuterium
5,0	dublety, J = 2—3Hz (špatně rozlišitelné)	1 H
5,8	dublety, J = 3—4Hz (špatně rozlišitelné)	1 H

Η

f) Acetylace složky II:

Složka II se převede ve směsi acetanhydridu a pyridinu v poměru 1 : 1 při teplotě místnosti na dekaacetylderivát o molekulové hmotnosti 903. V případě, že se reakce provádí ve směsi ethylesteru kyseliny octové a anhydridu kyseliny octové v poměru 1 : 1, za přítomnosti katalytických množství ‘H2SO4 je možno zjistit kromě dekaacetylderivátu také tvorbu undekaacetylderiváty s molekulovou hmotností 945 při provádění hmotnostní spektroskopie.

NMR-spektrum dekaacetylderivátu: (obr. 2)

Hmotnostní spektrum dekaacetylderivátu:

vrchol pro molekulu vrchol pro· zásadu

903 (2,5 % relativní intenzity)

843

Důležité vrcholy pro fragmenty v uvedené oblasti hmotnostního spektra:

844 (55 % relativní intenzity)

784 (36 % relativní intenzity)

783 (34 % relativní intenzity)

759 (35 % relativní intenzity)

556 (36 % relativní intenzity)

496 (37 % relativní intenzity)

436 (29 % relativní intenzity)

g) Methylace složky II:

Methylací složky II směsí methyljodidu a hydridu sodíku v dimethylsulfoxidu způsobem podle Hakomoriho se získá jako hlavní produkt dekamethylderivát složky II, v malém množství také undekamethylderivát.

Hmotnostní spektrum:

vrchol pro molekulu vrchol pro zásadu

2. vrchol pro molekulu

623 (6,1 % relativní intenzity)

535

637 (0,2 % relativní intenzity)

Podle spektroskopických údajů a chemických vlastností má složka II následující vzorec:

OH

a) Chromatografie na tenké vrstvě:

Rozpustidlo:

ethylester kyseliny octové, hydroxid kovu a voda v poměru 10 : 6 : 4.

I. Silikagelové fólie F 1500 (Schleicher a

Schull):

Složka II je směsí a- a d-formy, jak je možno prokázat zejména NMR-spektrem.

Dalším členem homologní řady je složka III {'C25H43O18N), kterou je imožno podle jejich fyzikálně chemických vlastností, její struktury a reaktivity charakterizovat následujícím způsobem:

Složka II je amorfní pevná látka, dobře rozpustná ve vodě.

Hodnoty R- složka III:0,35 maltóza .0,50

II. Silikagelové plotny F 254 (Merck):

Rf-hodnoty: složka III0,33 maltóza0,54

III. se barví černohnědě směsí dusičnanu stříbrného a hydroxidu sodného již při teplotě místnosti nebo- slabém zahřátí.

b) Spektrum v infračerveném světle:

Spektrum v infračerveném světle ve formě KBr-pelet je velmi špatně zřetelné a nesnadno se odečítá. Hlavní absorpční pruhy jsou v oblasti pohybu valencí O—H a C—O. (3700—3100 cm’¹ a 1180—950 cm~1).

c) Úhel otáčení:

[ a ]n ve vodě: ψ 147,2°

d) NMR-s,pe.ktrum složky III v DžO při 220 MHz je znázorněno na obr. 3.

e) Methylace podle Hakomoriho:

Methylací složky III methyljodidem a hyd ridem sodíku v dimethylsulfoxidu se získá jako hlavní produkt složka III, methylovaná 13.mcthylovými skupinami, v malém množství také 14.methylovými skupinami.

f) HmoSnostní spektrum meehylovaného produktu:

Vr-chol pro molekulu při 827 (1,5 % relativní intenzity) . odpovídá sumárnímu vzorci C38H69NO18. Při 841 se nachází druhý vrchol s 0,1 % relativní . intenzity.

Nejdůležitější vrcholy pro fragmenty jsou:

739 (27 % relativní intenzity)

592 (3,7 % relativní intenzity)

535 (30 % relativní intenzity)

38.8 - (9 °/o -relativní intenzity)

386 (13 % relativní intenzity)

284 (13 % relativní intenzity)

187 (12 % relativní intenzity)

171'-(40 % relativní intenzity)

101 (34 % relativní intenzity) (25 - relativní intenzity)

-vrchol pro zásadu

Pro složku III je -s -chemickými a spektroskopickými vlastnostmi ve shodě následující vzorec:

Složka IV je dalším vyšším -členem homologní řady. Tuto -sloučeninu je možno- parciární kyselou hydrolýzou rozštěpit na složku II a glukózu v poměru 1 : 2.

Chromatografie na tenké vrstvě:

Rozpustidlo:

n-butanol, ethanol a voda v poměru 50 : 30 : : 20

K provádění chromatografie se užije -silikagelsvých -ploten F 1500 (Schleicher -|+ Schull):

Hodnota Rf -pro' glukózu: složka IV: 0,41 až 0,46.

Vyšší homology, zejména složky V až VIII inhibují -sacharózu daleko méně a a-amylázu ze -slinivky břišní -daleko· -silněji než nižší členy řady (složky II až IV).

Při kyselé hydrolýze vyšších složek homologní řady je možno· zjistit vždy nižší členy řady jako· meziprodukty a mimoto glukózu a maltózu jako štěpné produkty.

Chromatografie na tenké vrstvě:

Rozpustidlo:

n-butanol, ethanol, voda v objemovém poměru 50 : 30 : 20

Chromatografie se provádí na -silikagelových plotnách F 1500- (Schleicher -^-Schull):

Rglukóza:

složka V:	0,30- až 0,34
složka VI:	0,21 až 0,23
složka VII:	0,14 až 0,16
složka VIII:	0,09 -až 0,11

Specifické inhibiční účinky -derivátů aminocukrů podle vynálezu je možno zjistit enzymatickými zkouškami, prováděnými in vitro.

Amylázový test

Amylázová inhibiční jednotka (1 AIE) je definována jako· -to množství inhibitoru, které inhibuje na 50- % -dvě jednotky amylázy.

Jedna amylázová jednotka (AE) je to množ200173 st-ví enzymu, které rozštěpí za minutu za uvedených podmínek jeden mikroekvivalent glykosidi-cké vazby škrobu. Mikroekvivalent rozštěpené sloučeniny se stanoví polarimetricky jako jeden mikroekvivalent vytvořeného redukujícího cukru pomocí kyseliny dinitrosalicylo-vé a udává se pomocí maltózové cejch-ovací křivky jako- ekvivalent mikroekvivalentu maltózy. К provádění testu se smísí 0,1 ml roztoku amylázy o koncentraci 20 až 22 AE/ml s O až 10 /tg inhibitoru nebo 0 až 20 μ\ zkoumaného roztoku v 0,4 ml 0,02 M pufru s glycerofosfátem sodným/0,001 M CaClz o pH 6,9 a směs se nechá dosáhnout rovnovážného -stavu 10 až 20 minut ve vodní lázni o teplotě 35 °C. Pak se směs inkubuje 5 minut s 0,5 ml na 35 °C předehřátého 1% roztoku škrobu (rozpustný škrob firmy Merck, Darmstadt č. 1252) při teplotě 35 °C, nač-ež se smísí s 1 ml kyseliny dinitrosalicylové (P. Benfeld v Colo<wick-Kaplan, Meth. Enzymol., s-v. 1, str. 149). Ke vzniku zabarvení se zkouška zahřívá 5 minut na vroucí vodní lázni, pak se zchladí a smísí s 10 ml destilované vody. Extinkce při 540 nm sc měří proti slepé zkoušce bez amylázy. Vyhodnocení se provádí podle předem stanovené amylázo-vé cejchovací křivky tak, že se odečte na této křivce účinnost amylázy, která ještě zbývá po přidání inhibitoru a z výsledku se vypočítá procentuální inhibice užité amylázy. Tato inhibice se nanáší jako funkce kvocientu ________________/zg inhibitoru +________________ AE + + ^b vztaženo na sušinu ^{+ +} AE ve vzorku bez inhibitoru stejné séri-e

Z křivky se odečte bod pro- 50· °/o inhibice a výsledek se přepočítá na AIE/mg inhibitoru.

Sacharázo-vý test

Sacharázová inhibiční jednotka (SIE) je definována jako to množství inhibitoru, které inhibuje dvě sacharázové jednotky na 50 %. Sacharázová jednotka (SE) je to množství enzymu, které za 1 minutu za uvedených podmínek rozštěpí 1 /zmo-l sacharózy na glukózu a fruktózu. Mikromoly vytvořené glukózy se kvantitativně stanoví po-mocí glukóz-ooxidázové reakce za podmínek, při nichž již nemůže dojít působením sacharázy к dalšímu štěpení sacharázy. Zkouška se provádí tak, že se smísí 0,05 ml na 0,12 SE upraveného ro-ztoku sacharázy s 0 až 20 mikrogramy inhibitoru nebo 0 až 20 .mikrolitry zkoumaného roztoku a doplní se na 0,1 ml 0,1 M pufrem s maleinaneim sodným o pH 6,0. [Užije se rozpustná sacharáza ze sliznice tenkého střeva vepře, připravená podle publikace B. Brogstróm, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958), str. 1997. Tato sacharáza se ředí na odpovídající obsah SE 0,1 M pufrem s maleinanem sodným o pH 6,0.]. Zkouška se nechá dosáhnout rovnovážného stavu 10 minut při teplotě 35 °C a pak se smísí s 0,1 ml na 35 °C předehřátého roztoku sacharózy o koncentraci 0,05 M v 0,1 M pufru s maleinanem sodným o pH 6,0. Směs se inkubuje 20 minut při 35 °C a pak se sacharázová, reakce zastaví přidáním 1 ml glukčzo-oxidázového- činidla a směs se dále inkubuje 30 minut při 35 °C. (Glukózooxidázové činidlo se připraví rozpuštěním 2 mg glukóz-ooxidázy [Boehringer č. 15 423] ve 100 ml 0,565 M tris-HCl-pufru o pH 7,0 a pak se přidá 1 ml rozt-oku detergencia [2 g tritonu X 100 + 8 g 95% analyticky čistého ethanolu], 1 ml roztoku dianisidinu s. obsahem 2160 mg o-díanisidinu X 2 HC1 ve 20 ml vody a 0,5 ml 0,1% vodného roztoku pe-roxidázy firmy Boehringer č. 15 302). Pak se přidá 1 ml 50% kyseliny sírové a při 545 nm se měří extinkce proti odpovídající slepé zkoušce Při vyhodnocení se vypočítá procentuální inhibice po-užité sacharázy a pomocí cejchovací křivky se propočítá SIE/g, po-prípadě SIE/litr.

Maltázový test

Maltázová inhibiční jednotka (MIE) je definována jako to množství inhibitoru, které inhibuje dvě maltázové jednotky na 50 °/o. Maltázová jednotka (ME) je to množství enzymu, které za 1 minutu za uvedených podmínek rozštěpí 1 mikromol maltózy na 2 mikromoly glukózy.Mikromoly vytvořené glukózy -se stanoví -kvantitativně pomocí glukózooxldázové reakce za podmínek, při nichž již nemůže dojít к dalšímu štěpení maltózy maltázou. Tato zkouška se provádí tak, že se spolu smísí 0,05 ml roztoku maltázy, upraveného- na obsah 0,060 až 0,070 ME s 0 až 20 mikro-gramy inhibitoru nebo s 0, až 2-0 mikrolitry zkoumaného ro-ztoku a zkouška se doplní na objem 0,1 ml 0,1 M pufrem s maleinanem sodným o pH 6,0. Zkouška se nechá stát к dosažení rovnovážného stavu při teplo-tě 35 °C a pak se smísí s 0,1 ml na 35 °C předehřátého 0,05 M roztoku maltózy v 0,1 M pufru s maleinanem sodným o pH 6,0. (Užije se solubilizovaná maltáza ze sliznice tenkého střeva vepře podle publikace B. Borgstróm, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958), str. 1997. Tato- maltáza se ředí 0,1 M pufrem s maleinanem sodným o pH 6,0 na odpovídající obsah ME). Směs se pak inkubuje dalších 20 minut při teplotě 35 °C, načež se maltázová reakce zastaví přidáním 1 ml glukóz-o-oxidázového činidla a směs se inkubuje dalších 30 minut při teplotě 35 °C. (Příprava glukčzooxidázového reagens se provádí tak, jak bylo- uvedeno při popisu sacharázového testu.). Pak se přidá 1 ml 50% kyseliny sírové a extinkce se měří při 545 nm proti odpovídající slepé zkoušce.

200

K vyhodnocení se vypočítá procentuální inhibice použité maltázy a pomocí glukózové cejchovací křivky se vypočítá množství, které inhibuje 50 % a toto množství se přepočítá na MIE/g, popřípadě na M^;IE/litr.

Výsledky inhibičních enzymatických testů

n — počet hexózových jednotek	AIE/g
derivát aminocukru o
n = 1	300000
n -= 2	3000000
n = 3	1 400 000
n = 4—6	17 500 000
n = 5—7	30 -000 000

¹⁶ .

in vitro pro jednotlivé homology svrchu u' vedené homologní řady - a účinnosti jednotlivých homologů řady derivátů aminocukrů podle vynálezu jsou uvedeny v následující tabulce, v níž hexózové jednotky znamenají glukózové jednotky.

SIE/g MIE/g

0005 000

000 15*000

000- -5 000

500—

500—

Jak je z tabulky zřejmé, stoupá specifická účinnost proti α-amyláze ze slinivky břišní se stoupající molekulovou hmotností v homologní řadě velmi prudce. V oblasti n = = 5 až 7 je možno pozorovat lOOnásobné zvýšení účinnosti in vitro· oproti účinnosti derivátu aminocukru, v němž n = 1 nebo n = 2. Na druhé straně je inhibice sacharázy u derivátu o n = 2 nejsilněji vyjádřena, derivát, v němž η — 1 inhibuje tuto účinnost pouze z polovice a u vyšších derivátů dochází k poklesu specifické účinnosti proti sacharáze.

In -vivo probíhá účinnost derivátů podle vynálezu proti sacharáze při testu se zatížením sacharázou přibližně souběžně s průběhem specifické účinnosti in vitro. Při zatížení organismu škrobem in vivo· bylo zjištěno, že deriváty - aminocukrů, v nichž n = — 1,2 a 3 mají 10 až 40násobně vyšší účinnost ve srovnání s účinkem proti amyláze in vitro. (Tyto skutečnosti jsou podrobněji uvedeny v příkladu 18, tabulky 1, 3, 4 a 5.)

Je známo, že u zvířat -i u lidí -dochází -po použití potravin, které obsahují uhlohydráty, například po požití - -obilovin, bramborového škrobu, zeleniny, -ovocné šťávy, piva nebo -čokolády ke zvýšení hladiny krevního cukru, která je způsobena rychlým odbouráváním uhlohydrátu hydrolázy glykosidů, například amylázami z tenkého -střeva a -slinivky břišní, maltázami a -sacharázami podle schématu amyláza maltáza škrob nebo glýkogen -> maltóza - glukóza sacharáza sacharóza -> glukóza + fruktóza

Toto zvýšení hladiny krevního cukru je u diabetiků zvláště -silné a trvá velmi -dlouho. U otylých působí zvýšení hladiny krevního cukru po jídle zvláště silné vyměšování inzulínu,, což opět -vede -ke zvýšené tvorbě tuku a sníženému odbourávání tuku. Po· tomto zvýšení hladiny krevního cukru dochází jak u normálních osob, tak u osob otylých v -důsledku sekrece inzulínu často k násled nému snížení hladiny krevního cukru. Je známo, že -tato hypoglykemie podporuje výrobu - žaludeční šťávy, která může vyvolat zánět žaludeční -sliznice, žaludeční vřed nebo dvanáctníkový vřed nebo zhoršovat tyto choroby -v případě, že již vznikly.

Nyní bylo zjištěno, že inhibitory hydroláz glykosidů, vyrobené a izolované způsobem podle vynálezu - -snižují zvýšenou hladinu krevního cukru po zatížení krys/lidí pšeničdiny inzulínu i následné snížení hladiny krevního cukru po zatížení krys/lidí pšeničným škrobem, -sacharózou nebo maltózou, přičemž podporují průchod těchto' uhlohydrátů žaludkem. ‘ Mimoto snižují vstřebávání glukózy ve -střevě. Dále dochází i ke snížení nebo zhoršení - přeměny uhlohydrátů na lipidy tukové tkáně a ke zhoršenému včlenění tuku, přijatého v- potravě do zásobní tukové tkáně.

Dále je známo, že uhlohydráty v dutině ústní, zvláště sacharóza se štěpí působením mikroorganismů, čímž dochází ke vzniku zubního kazu.

Inhibitory hydroláz glykosidů jsou tedy vhodné - -pro použití k léčebným účelům v následujících indikacích:

Otylost, zvýšená hladina lipidů v krvi (arterioskleróza), cukrovka, prédiabetes, zánět žaludeční -sliznice, žaludeční vřed, dvanáctníkový vřed a zubní kaz.

Dávky

Podává -se 30 až 300 000 AIE/kg nebo 1 až 10 000 SIE/kg jednou nebo několikrát denně -před a/nebo mezi a/nebo -po jídle nebo pití perorálně.

Lékové formy

Dražé, tablety, kapsle, roztoky, suspenze, granuláty, žvýkačka, - zubní pasta nebo jako přísada k potravinám a/nebo poživatinám s -obsahem uhlohydrátů.

Toxicita inhibitorů hydroláz glykosidů podle vynálezu a látek, brzdících vstřebávání glukózy je velmi malá. Účinná látka z příkladu 9- jako -surový inhibitor o 26 000' SIE/g byla -snášena stejně jako účinné látky z dalších příkladů v dávce 340 000 SIE/kg u myši i u krysy při perorálním podání bez jakýchkoli příznaků. Při nitrožilních injekcí u myší byla snášena dávka 10 000 SIE/kg bez příznaků.

• Velmi výhodné jsou kombinace inhibitorů podle vynálezu se známými perorálními antidiabetiky (β-cytotropními deriváty sulfonylmočoviny a;/nebo« biguanidy, které ovlivňují hladinu krevního cukru).

Dále uvádíme podrobnější vysvětlení použitých reakčních činidel a pomocných látek:

Z iontoměničů je možno užít například běžně dodávaných produktů, jako jsou Amberlite IRA 410 Cl (aniontoměnič), Amberlite IRC 120 v H+-formě (silně kyselý kationtoměnič), Amberlite (НСО‘з -formě) (aniontoměnič), Amberlite IRA 410 OH (silně zásaditý aniontoměnič), Amberlite IRC 50 v H⁺ -formě (slabě kyselý kationtoměnič), všechno výrobky firmy Rohm a Ha as, dále Dowex 50 WX 4H⁺ (silně kyselý kationtoměnič), výrobek firmy Dow Chemical Co. Midland, Michigan, USA.

Z aniontoměničů na podkladě celulózy je možno užít například DE AE-celulózu firmy Schleicher a Schull.

Jako polyakrylamidového gelu je možno užít například přípravku Biogel-P-2 (firma Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA).

Přípravek Maltzin je přírodní sladový extrakt firmy Diamalt AG, Mnichov (NSR).

Lewapol^R je nespecifická adsorpční pryskyřice finmy Bayer AG, Leverkusen (NSR).

Clarcel je pomocný prostředek pro· filtraci firmy CECA, Velizy-Villacoublay (Francie).

SE 30 je silikonový elastomer firmy Hewlett Packard.

V následujících příkladech představují hexozové jednotky glukózové jednotky.

Příklad 1

V jednotlivých příkladech se užívá jako výchozí látky přípravku, který je možno vyrobit následujícím způsobem:

Ve skleněném fermentoru se očkuje 8 litrů živného roztoku o složení 5,0 % škrobu, 1,0 % extraktu z kvasnic, 0,2 % K2HPO4 3 dny starou třepací kulturou kmene SE 50/13 (CBS 614.71) a fermentor se pak provzdušňuje 3 dny při teplotě 28 ^QC za současného intenzivního míchání, čímž se získá fermentační prostředí o koncentraci 105 000 А1Е/ /ml.

litrů tohoto fermentačního prostředí se po zchlazení na teplotu 20 °C upraví na pH

2,5 použitím kyseliny dusičné o koncentraci 50 °/o, к živnému prostředí se přimísí 30 g aktivního uhlí (Carboraffin) a směs se míchá 10 minut, načež se odstřeďuje 15 minut při 10 000 otáčkách za minutu a čirý, světle žlutý supernatant se po neutralizaci amonia kem odpaří na objem 500 ml. 500 ml tohoto koncentrátu se míchá 45 minut s 200 g přípravku Amberlite IRA 410 Cl, směs se zfiltruje za současného odsávání a pak se smísí se 4/5 svého objemu = 400 ml methanolu za účelem vysrážení převážné části vysokomolekulárních produktů odbouráváním škrobů a zbytky aktivního uhlí. Pak se směs odstřeďuje 5 minut při 5 000 otáčkách za minutu a 850 ml takto získaného supernatantu se po kapkách přidá za intenzivního míchání do 4 litrů bezvodého· ethanolu. Bílá, vločkovitá sraženina se zfiltruje za odsávání, promyje se 3X bezvodým ethanolem а 2X etherem a pak se usuší ve vakuu při teplotě 50’ °C. Výtěžek je 36 g bílého* prášku •o koncentraci 10 X 10⁶ AIE/g.

Příklad 2

К posouzení výsledného produktu fermentace a ke stanovení složení tohoto přípravku se provádí chromatografie na tenké vrstvě tak, že se nanese 1 mikrolitr fermentačního prostředí nebo 1 mikrogram preparátu na fólie ze silikagelu (firma Schleicher a Schull, Dassel, typ F 1 500) a fólie se vyvíjí 2 X v soustavě n-butano/ethanol/vcda v poměru 50 : 30 : 20.

К vybarvení sacharázy a ke stanovení její inhibice se postříká vyvinutá a dobře usušená plotna enzymatickým gelem (20 ml při použití plotny o rozměru 20 X 20 cm) a gel se .nechá ztuhnout. Pak se 5 minut plotna předběžně inkubuje ve vlhké komoře při teplotě místnosti a nakonec se postříká substrátovým gelem. Po ztuhnutí této· druhé vrstvy gelu se plotna přenese dc< vlhké komory a inkubuje při teplotě 40 °C. Inhibice se projeví světlými skvrnami na červenehnědém pozadí, tyto* skvrny se vyvinon po 60 až 90 minutách. Jakmile dojde к optimálnímu vybarvení inkubace se přeruší a plotna i s vrstvami agaru se usuší fenem teplým vzduchem.

Příprava gelu

Enzymatický gel: 1,5 g agarózy (I/Industrie Biologique Francie) se uvede v suspenzi ve 100 ml 0,2 M pufru s maleinanem sodným o· pH 6,0 a rozpustí se povařením. Čirý agarový roztok se zchladí na teplotu 50 °C a smísí .s 250' mikrolitry roztoku Tritonu X — — 100 (2 g Tritonu X—100 + 8 g analyticky čistého· ethanolu) a 0,5 ml rozteku dianisidinu (20 mg dianisidin/1 ml acetonu) převracením. Přímo před upotřebením gelu se přidá ještě 1 ml reakčního činidla GOD/POD (12,5 mg glukózoOxidázy, stupeň čistoty I, firma Boehringer, č. 15423 a 2,5 mg peiroxidázy, stupeň čistoty II, firma Boehringer, č. 15302, rozpuštěno v 5 ml maleinanového pufru) a 4 až 5 sacharázových jednotek z tenkého střeva vepře, vyrobených tak, jak je uvedeno svrchu u sacharázového testu. Gel je možno udržovat až do nastříkání na teplotě 50 °C, jinak tuhne již v trysce.

Substrátový gel: 0,5 g agarózy se uvede v suspenzi ve 100 ml pufru s maleinanem sodným o- pH 6,0 a rozpustí se povařením. Pak se směs zchladí na teplotu 50 °C smísí se se 100 mikir-olltry Tritonu (2 g Tritonu · X—100 T 8 g analyticky čistého ethanolu) načež se přidá 1 g sacharózy (Seeva č. 35579). Po rozpuštění sacharózy je gel připraven k použití.

K vybarvení inhibice amylázy se postříká vyvinutá a usušená deska pro chromatografii na tenké vrstvě amylázovým gelem v množství 20 ml na plotnu o rozměru 20' X 20 cm a gel se nechá ztuhnout. Pak se deska předběžně inkubuje 5 minut při teplotě místnosti a přenese do 0-,5°/o roztoku škrobu (1 g škrobu Měrek č. 1252 ve 200 ml 0,2 M glycerofosforečnanového pufru s 0,01 M CaClž o pH 6,9, rozpustí se povařením], v tomto roztoku se ponechá 2 minuty při teplotě 40 °C. Pak se plotna dobře opláchne deslovanou vodou a k vybarvení neodbouraného škrobu se přenese do· zředěného roztoku jodu ' (4 ml základního roztoku jodu na 500 ml vody, základní roztok jodu sestává z 2,2 g I2 + 4,4 g KI v 100 ml vody). Po 1 minutě je vybarvení optimální, deska se ihned vyfotografuje, protože modré skvrny rychle mizí.

Příprava amylázového gelu g agarózy se rozpustí ve 100 ml 0,2 M pufru s glycerofosforečnanem sodným a 0,01 M CaC11-pufru o pH 6,9 při teplotě 100 °C, po zchlazení na 50 °C se přidá 100· ' mikrolitrů Tritonu X-100 2 g Tritonu X-100 + 8 g analyticky čistého ethanolu). Těsně před postřikem se přidá 100 mikrolitrů suspenze krystalické amylázy (10 mg amylázy ze slinivky vepře/ml v roztoku síranu amonného firmy Boehringer č. 15017).

Příklad 3

Erlenmeyrova baňka o obsahu 1 litr s 'obsahem 120 ml živného roztoku, sestávajícího z 4. % škrobu, 2,4 ' % glukózy, 0,9 % hydrolyzátu kaseinu a 0,9 % extraktu z kvasnic o pH ' 7,6, nastavený hydroxidem sodným se smísí s 0,4 % uhličitanu vápenatého' a sterilizuje se ' 30 minut při teplotě 121 °C, načež se očkuje 3 ml předběžné kultury kmene SE 82, který byl vypěstován v živném' roztoku, který byl vyroben z 2 % škrobu, 1 % glukózy, 0,5 % hydrolyzátu kaseinu a 1 % extraktu z kvasnic, po smísení těchto složek bylo· pH upraveno hydroxidem sodným na hodnotu 7,2 a pak bylo přidáno ještě 0,4 % uhličitanu vápenatého a prostředí pak bylo 30 minut sterilizováno' při 121 °C, naočkováno a fermentace pak probíhala 5 dní při teplotě 28 °C na rotační -třepačce, čímž bylo získáno fermentační prostředí s obsahem 122 tisíc AIE/ml. Mycelium se 'oddělilo od živného· prostředí odstředěním při 12 000 otáčkách za minutu, pH 300 ml filtrátu kultury se upraví kyselinou dusičnou o koncentraci 50 % na hodnotu 2,5 a směs se míchá 10 minut s 2,5 g aktivního uhlí. Po 'oddělení aktivního uhlí odstředěním při 12 000 otáčkách za minutu 'se roztok neutralizuje na pH 6 pomocí 10 N hydroxidu draselného' a smísí se se 300 ml methanolu, nechá se krátkou dobu stát a vytvořená sraženina se pak oddělí odstředěním při 12 000 otáčkách za minutu. Supernatant se po kapkách přidá ke 3 litrům ethanolu, 'sraženina se izoluje po krátkém stání 'odstředěním při 12 000 otáčkách za minutu protaiyje se 2' X absolutním ethanolem a jednou etherem a pak se suší ve vakuu, čímž ' se získá 2,23 g produktu O' koncentraci 1,45 X 1(® AIE/g, produkt obsahuje i více než ' 95 % vyšších homologů derivátů aminocukrů o n>4.

Přikladl

Do Erlenmeyerovy baňky o obsahu 1 litr se vlije 120 ml živného roztoku ' o složení

3.5 % glukózy, 2 % škrobu, 0.,5 % hydrolyzátu kaseinu, 1,3 % extraktu z kvasnic, 0,3 % 'CaCO3 a -0,3 '% KaHPOá, pH se upraví před sterilizací na 7,8 a obsah baňky se pak sterilizuje 30 minut při teplotě 121 °C, načež se očkuje 6 ml předběžné kultury kmene SE 50/110 v živném prostředí, které obsahuje 3 % sójové mouky, 3 % glycerinu a 0,2 % CaCO3, fermentace se provádí 3 až 4 dny na rotační třepačce při teplotě 24 °C, čímž se získá fermentační prostředí s obsahem 153 tisíc AIE/ml a 1 220' SIE/litr.

litr tohoto fermentačního prostředí se upraví na pH ' 2,5 kyselinou dusičnou, nechá se s 5 g aktivního' uhlí 10 minut a pak se 30 minut odstřeďuje při 5 000 otáčkách za minutu, načež se neutralizuje přidáním 25 g přípravku IRA 410 v OH- formě.

Neutrální roztok se odpaří na objem 100 ml, smísí se se 100 ' ml methanolu a zfiltruje se. Filtrát se vmíchá do 2 litrů absolutního' ethanolu, vytvořená sraženina se oddělí filtrací za odsávání, promyje se 3 X acetonem a etherem a usuší se ve vakuu.

Tímto způsobem se získá 14 g bílého prášku o koncentraci 5 X 10⁶ AIE/g s _ obsahem převážně homologů o' n>4.

Příklad 5

Postupuje se stejně jako v příkladu 4, přidá ' se vsak ' ještě -0,5 % škrobu, čímž se po fermentaci trvající 4 dny získá fermentační prostředí s 'obsahem 40 '000 AIE a 184 SIE/ /ml. Živné ' prostředí ' obsahuje homology, v nichž n = 1.

Příklad 6

Do Erlenmeyerovy baňky o obsahu 1 litr se vlije 120 ml živného roztoku o složení 3 % glukózy, 0,6 % hydrolyzátu kaseinu,

1.6 % extraktu- z kvasnic, 0,3 % CaCC3, 0,3 ' procent K2HPO4, pH se upraví před sterili200173 žací hydroxidem draselným na 7,8 a baňka se očkuje předběžnou kulturou kmene SE 50/110 podle příkladu 4 a fermentace se provádí 4 dny při 24 °O na rotační třepačce, čímž se získá fermentační prostředí o 10 800 SJE/litr s obsahem převážně účinných látek O1 n = 1.

litrů filtrátu kultury, odděleného od mycelia při 13 000 otáčkách za minutu se upraví na pH 2,5 50^l% kyselinou dusičnou a míchá se 15 minut s 35 g aktivního uhlí Merck a 2'00 g přípravku Clarcel. Směs se zfiltruje za odsávání, neutralizuje koncentrovaným amoniakem na pH 7, odpaří na objem

1,5 litru a vysráží 5násobným množstvím ethanolu. Vločkovitá sraženina se oddělí v průtokové odstředivce při 12 000 otáčkách za minutu, žlutavý supernatant se odpaří na 150 ml a opět odstředí. 50 ml roztoku se nanese na sloupec Amberlitu IR-12 (30 X 300 mm, 30 ml vody za hodinu]. Jakmile ze sloupce vyjde celkem 300 ml eluátu s obsahem inertních sacharidů a podílu neadsorbovaného- inhibitoru převede se iontoměnič s 400 ml vody do· kádinky a přidá se koncentrovaný amoniak do pH 11,5. Po 30 minutách dalšího míchání se iontoměnič oddělí, roztok se odpaří na 1/20 objemu, zfiltruje přes sloupec A^m^Ee^riitu IRA 410' v HOO31 -formě o rozměru 20 X 150 ml při průtokové rychlosti 30· ml za hodinu, shromáždí se 500 ml eluátu, který se odpaří, čímž se získá po lyofilizaci 1,3 g surového produktu.

K dalšímu čištění se podrobí preparát frakcionaci na přípravku Bto-gel P-2 100 až 200 mesh (firma Bio-Rad, Mnichov], Užije se sloupce 50' X 450 mm a vody při průtokové rychlosti 400 ml/hodina, odebírají se frakce- po 10 ml. Všechny frakce se zkouší anthronovou metodou na uhlohydráty a sa charázovým testem na inhibitory. Frakce s obsahem inhibitoru sacharázy se zkoumají chromatografií na -tenké vrstvě podle příkladu 2 na obsah jednotlivých složek. Frakce, obsahující -derivát -o η — 1 se slijí, odpaří a lyofilizují, čímž se získá 35 mg derivátu aminocukru o n = 1 o koncentraci 0,3 X 10® AIE/g a 30 000 SIE/g.

Příklad 7

Do Erlenmeyerovy baňky o- obsahu 1 -litr se vlije 120 ml živného roztoku o· -složení 5 % škrobu, 1 % extraktu z kvasnic, 0,2 % K2HPO4 a baňka se očkuje 2 ml předběžné kultury z příkladu 4, čímž se po 3 dnech fermentace při 28 - °O získá fermentační prostředí s následujícím obsahem inhibitoru amylázy:

Kmen AIE/ml

SE 50 37 000

SE 50/13 109 000

SE 50/110 53 500

Inhibitory amylázy jsou převážně deriváty aminocukru o- ng4.

Příklad 8

Do- Erlenmeyerovy baňky o -obsahu 1 litr se vlije 120 ml živného roztoku -o- složení 1,3 % maltózy, 3,5 % glukózy, 0,5 % hydrolyzátu kaseinu, 1,3 % extraktu z kvasnic, 0,3 % OaOO3, 0,3 % K2HPO4 a baňka se očkuje 2 ml předběžné kultury z příkladu 4, čímž -se po 4 denní fermsntaci na rotační třepačce při 24 °O a při použití různých kmenů získají následující výtěžky:

Kmen

SIE/ml

AIE/ml

SE 50

SE/50/13

SE 50/110

25580

14.81 460

57.9755

Inhibitorem je převážně derivát aminocukru o n<4.

Příklad 9

Fermento-r s -obsahem- 100 litrů živného roztoku o složení 3,5 % glukózy, 2,5 % sušeného· sladového extraktu, 0,5 % hydrolyzátu kaseinu, 1,3 % -extraktu z kvasnic, 0,3 % OaOO3, 0,3 % KaH-POá a 0,1 % protipěnivého činidla se očkuje 5 litry předběžné kultury z příkladu 4 a fermentace se provádí za -současného míchání a provzdušňování 5 dní při 24 °O, čímž se získá fermentační prostředí o 73 000 SIE/litr a s -obsahem převážně derivátu o n = 2.

litrů fermentačního prostředí se upraví koncentrovanou kyselinou dusičnou na pH 2,5 a za stálého míchání se přidá 900- g (= 1 - %] aktivního- uhlí -.(Měrek] k adsorbci většiny vytvořeného- barviva. Směs se míchá 15 minut, pak -se -odstředí při 300 -otáčkách za minutu od mycelia a většiny uhlí a supernatant se -zfiltruje -s přídavkem 3 kg Clarcelu pod tlakem. Získá se 65 litrů žlutohnědého čirého filtrátu -o- 60 000 SIE/litr.

Filtrát se upraví na pH 7 koncentrovaným amoniakem a účinná látka -se absorbuje 30 minut na 1300 g (2 %] aktivního uhlí (Merek), Směs se zfiltruje pod tlakem a aktivní uhlí -se promyje 3 X 10 litry destilované vody. Pak se uhlí vysuší a míchá se s 3 X 4 litry 50'% acetonu při pH 2,5 vždy 15 minut k desorpci účinné látky. Acetonové roztoky -se po- oddělení aktivního uhlí filtrací slijí a odpaří na rotační odparce na objeim 250 ml, přidá sc 250 ml methanolu a směs se znovu zfiltruje, 480 ml filtrátu se po kapkách přidá za energického míchání do 5 litrů acetonu, vytvořená sraženina se oddělí filtrací za odsávání a 3 X promyje acetonem a etherem, načež se usuší ve vakuu při 35 °C Výtěžek je 230 g produktu o 8 500 SIE/g.

g tohoto surového produktu se rozpustí v 1 litru vody a přidá se 300 g přípravku Dowex 50' WX 4 H⁺ :(200 až 400 mesh), směs se míchá 30 minut, pryskyřice se oddělí filtrací a promyje 3X2 litry 0,001 N HCl. Probmytá pryskyřice se uvede v suspenzi v 500 ml vody a suspenze se upraví na pH-metru přidáním 25'% amoniaku na 9,0. Pak se provede desorpce ještě 2 X 500 ml 0,6% amoniaku, desorbáty se slijí a odpaří na rotační odparce na objem 100 ml. К odbarvení se ke koncentrátu přidá 2 g DEAE-celulczy (firma Schleicher a -Schtill č. 02085, 0_;6 mikrovalencí/g) směs se míchá 5 minut a pak se odstředí. Světle žlutý supernatant se smísí se 100 ml methanolu a směs se po kapkách přidá za energického míchání ke 2 litrům acetonu. Sraženina se oddělí filtrací za odsávání, promyje se acetonem a etherem a usuší se ve vakuu při 35 °C. Získá se 4,2 g produktu o 26 000 SIE/g. К dalšímu čištění se provede filtrace 4,0 g inhibitoru po dílech 0,5 g na gelu Biogel Р-2. К tomuto účelu se rozpustí vždy 0,5 g produktu v 10 ml vody a roztok se nanese na sloupec přípravku Biogel P-2 (200 až 400 mesh, firma Bio-Rad) o rozměrech 5 X 95 cm. Sloupec se vyvíjí vodou rychlostí 80 ml za hodinu. Odebírají se frakce po 12 ml. U všech frakcí se stanoví antronovou metodou a extinkcí při E620 obsah uhlohydrátů, dále se stanoví obsah inhibitoru sacharázy a amylázy, mimoto se provádí chromatografie na tenké vrstvě podle příkladu 2.

Frakce, v nichž se zjistí deriváty aminocukrů o n — 4 až 6 se slijí, odpaří ve vakuu na 10 ml a vysráží tím, že se po kapkách přidají ke 200 ml absolutního alkoholu. Sraženina se oddělí filtrací, promyje se acetonem a etherem a usuší ve vakuu. Výtěžek je 4,0 g surového inhibitoru. 0,2 g derivátů aminocukru o n = 4 až 6 s koncentrací 17,5 X 10⁶ AIE/g a 8 500 SIE/g. Frakce, obsahující derivát aminocukru o n = 3 se zpracovávají stejně, srážení se provádí 200 ml acetonu. Výtěžek je 4,0 g surového inhibitoru, 0,1 g derivátu aminocukru o n = 3 při koncentraci 1,4 X 10³ AIE/g a 21 000 SIE/g. Frakce, obsahující derivát aminocukru o n = 2 se zpracovávají stejně, srážení se provádí acetonem, získá se 0,9 g derivátu aminocukru o n = 2 při koncentraci 0,3 X 10⁶ AIE/g a 68 000 SIE/g.

Příklad 10 rů živného ro-ztoku s obsahem 7,5 % sušeného sladového extraktu, 0,3 % hydrolyzátu kaseinu, 0,7 % extraktu z kvasnic, 0,3 % CaCOs, 0,3 % K2HPO4 a fermentory se očkují 5 % předběžné kultury kmene SE 50/100, získané podle příkladu 4, čímž se získá po 5 dnech fermentace při 24 °C fermentační prostředí se 73 SIE/ml a .s obsahem převážně derivátu aminocukru o n = 2. Po odstředění 30 minut při 3 000 otáčkách za minutu к oddělení mycela se získá 20,5- litrů sytě hnědého roztoku o 67 000 SIE/litr. Kyselinou dusičnou se pH upraví na 3,5 а к odbarvení se přidá 60 g Lewapolu (Ca 9221, 0,35 mm rozměr zrn, firma Bayer)/litr, celkem 1,23 kg Lewapolu. Po 20 minutách míchání se směs zfiltruje přes filtr Seitz К 3. Odbarvený roztok se neutralizuje amoniakem (18,5 litrů, 67 000 SIE/litr). Pak se absorbuje účinná látka na 20 g aktivního uhlí/ /litr, celkem 370 g uhlí a míchá se 30 minut. Pak se znovu směs zfiltruje přes filtr Seitz К 3, pokrytý vrstvou přípravku Clarcel. 17,5 litrů filtrátu o koncentraci 3 600 SIE/litr se odloží. Aktivní uhlí se promyje 3X2 litry destilované vody. Desorpce se provádí mícháním s 3X1 litrem 80% acetonu, míchá se vždy 15 minut, přičemž se pH nastaví koncentrovanou kyselinou solnou na 2,5. 2,4 litru desorbátu o koncentraci 371 000 SIE/litr se nanese na 46 g přípravku Dowex H⁺ (Dowex 50W 4 v H⁺-formě, firma Serva, Heidelberg), směs se míchá 20 minut, pryskyřice se oddělí filtrací (frakce Dowex I) a promyje se 75% acetonem. 3 litry filtrátu a promývací kapaliny o koncentraci 215 000 SIE/litr se míchá se 60 g přípravku Amberlite IRA 410 v OH-formě (firma Serva, Heidelberg)/litr až do pH 7. Pak se směs zfiltruje a 2,8 litru filtrátu o koncentraci 219 000 SIE/litr se smísí se 72 gramy Dowexu H ⁺ -formě a směs se míchá 20 minut, pH se upraví tak, že se do směsi ponoří nylonový sáček s pryskyřicí Amberlite IRA 410 v OH~-formě, tímto způsobem je možno pH udržet na hodnotě 3,0. Pak se Dowex oddělí filtrací (Dowex II), 2,6 litrů filtrátu o koncentraci 27 000 SIE/litr se odloží.

Frakce Dowex I а II se odděleně promyjí 3X acetonem o koncentraci 75 % při pH

3,5 a pak se frakce I promyje 3 X 100 ml 0,6% amoniaku a frakce II 3 X 150 ml roztoku. Při první desorpci, při níž amoniak nestačí к neutralizaci pryskyřice je nutno přidat koncentrovaný amoniak a upravit pH na hodnotu 9 při použití pH-metru. S desorbáty z frakce I а II se odděleně slijí, odpaří téměř do sucha, smísí s 50 ml vody a pH se upraví na 3 až 4 kyselinou solnou, a pak se přidá 50 ml methanolu. Roztoku se po kapkách přidají к 1,5 litru absolutního acetonu,

Do třech fermentorů se uvede vždy 8 lit200173 vytvořená sraženina se oddělí filtrací a promyje 3X acetonem a IX etherem, načež se usuší ve vakuu.

Frakce I 6,5 g 25 000 SIE/g

Frakce II 12,3 g 36 000· SIE/g n = 2, malé množství n = 3.

^κ co >Ν ΧΦ g

φ ’Φ ω

^Μ ω

ř-1

CO

X ω φ ί-ι

'>ч >

		Φ		Φ
		(Λ		CD
		>Ν Ο	°°		CD	00
O	O			Г“Т	ιό*	«φ* oo
Ο τΗ	CD	Ό Ο	CO	CM

oo_ •Φ φ

ω >Ν Ο ο

CD

Φ

	IÓ	оо~см~
φ*	CD	τ-Γ с\Г
гЧ	Φ	тН СО

ο ο _{____}__ιό _____

o

o

o

o

00

O

o

O

o

O

O

O

O

O

o

o

o

o

00

o

o

o

o

O

oo

ló

O

O

ló

ló

Có

’Φ

00

o

’Φ

o

CM

ló

b>

ló

U0

CO

CO

CD

CO

Có

/-Л

oo

o

IÓ

oo

bs

O

CO

CM

Cm

b^

O

CO

rH

4—J Λ™»

oo

CÓ

Φ

t—l

Có

Có

CO

Có

*Φ

CO

CO

ló

U-J t—1

00

00

CÓ

i—1

Có

tH

Φ

Có σ>

CM

O	O	O	O	CD	O	O	O	ó	O	o	Có
O	O	O	O	O	O	O	O	O	o	CD	o
O	CD	CD	O	O	o	Có	O	O	o	O	O
		CO	CM	O)	ló	-H	ló	CD		om	CD
CD	Có		’Φ	CM	00	b^	tH	-H	CM	OO	i—1
				oo		oo	CM	CM		oo	’Φ

Ιό

Ιό ιη 1Л Ь^ ο* σΓ со* θ' CM rH гЧ

СП θ' 'CÚ X t-l O to Φ Ό

CO

CD СО

CM

CO θ'

	O)	ló	bo oo
’Φ Có OO ló	CM	*Φ	ló^CO
		Có*'
cm co ci om	Có	CO* CM*

	Φ	Φ
	CD	CD
	<d	ctí
X	t-4	ř4
Φ	<4-4	«+-Ι
ž	N	N
o Q	>4	>4 4-t
«3	'CÚ X	'cd X u	t—(	ř—<
	o	O	Φ	Φ
CD	w	ω	ω	ó
CL Φ	Φ		rX
P-i	T3	Tj	cd	cd
O ГЛ	1 bO	1 to >—<	14 tx-i	f4 Q—1

τι

Přikladli

200: g přípravku z příkladu 1 se rozpustí v 940 ml destilované vody a 60 ml koncentrované kyseliny sírové a zahřívá se 4 hodiny pod zpětným chladičem. (Vnitřní teplota. 98 až 100°C, teplota olejové lázně 140 °C). Zchlazený černohnědý roztok se smísí s 10' g aktivního uhlí (Merck Art. 2186) a míchá se 1 hodinu. Aktivní uhlí se oddělí filtrací za odsávání, promyje vodou a filtrát se upraví 250 ml 10 N KOH na pH 7 až 8. Roztok se míchá 1 hodinu s 50 g .aktivního uhlí, uhlí se oddělí filtrací, promyje 2 litry vody a filtrát se odloží. K desorpci se aktivní uhlí nechá stát se 2 litry 30% alkoholu přes noc. Pak se aktivní uhlí oddělí filtrací za odsávání a alkoholický roztok se .odpaří na rotační odparce na 6,2 g odparku, který se rozpustí v 500 ml vody a opatrně promíchá s 30 g Amberlitu IR 120 v H+-formě 1 hodinu. Iontoměnič se oddělí filtrací za odsávání, promyje destilovanou vodou, až je filtrát neutrální a prostý glukózy. Iontoměnič se míchá s 15 ml 25i% amoniaku v 1000 ml vody přes noc, oddělí se filtrací a filtrát se odpaří na odparek 3,7 g.

K dalšímu čištění se provádí chromatografie na celulóze. 4,5 materiálu, desorbovaného z iontoměniče na sloupec celulózy o rozměrech 1 m X 2,5 cm. Jako rozpustidla se užívá nejprve směsi ethanolu .a vody v poměku 5 : 1, k eluci aminocukru o n = 1 se užije nejprve směsi ethanolu a vody v poměru 3 : 1. Při rychlosti 20 kapek za minutu se odebírají frakce po . 14 ml a tyto frakce se podrobí chromatografií na tenké vrstvě. Frakce 47 .až 85 poskytují po odpaření 1,6 g slabě hnědě zbarveného derivátu aminocukru o n = 1. Znečišťující barvivo nehraje v tomto případě žádnou roli. Deriváty je možno získat i bez příměsi barviva v případě, že se čištění provádí na. silně kyselém iontoměniči nikoli po. jednotlivých množstvích odděleně, nýbrž na sloupci.

Příklad 12

200 g přípravku z příkladu 1 se rozpustí v 940 ml destilované vody a 60' ml koncentrované kyseliny sírové a směs se zahřívá 1/4 hodiny pod zpětným chladičem při vnitřní teplotě 98 až 100 °C a teplotě olejové lázně 140 °C. Zchlazený hnědočerný roztok se smísí s 10 g aktivního uhlí (Měrek, Art. 2186) a míchá se 1 hodinu. Pak se aktivní uhlí oddělí filtrací za odsávání, promyje se vodou a .pH filtrátu .se upraví 10 N hydroxidem draselným na hodnotu 7 až 8. Roztok se míchá 1 hodinu s 50 g aktivního uhlí. Aktivní uhlí se oddělí filtrací za odsávání, promyje se 2 litry vody a filtrát se odloží. K desorpci se aktivní uhlí digeruje přes noc s 2 litry 30·% alkoholu. Nakonec se aktivní uhlí oddělí filtrací za odsávání a alkoholický roztok se odpaří na rotační odparce, čímž se získá 8,0 g -odparku.

Odparek .se smísí s 15 ml vody a nanese se na sloupec o rozměrech 20 X 2,4 cm, naplněný 50' g Am1^<^:rlite IR 120 v H⁺-formě. Průtoková rychlost je 3 kapky za minutu, pak se sloupec promývá vodou rychlostí 12 kapek za minutu k odstranění složek, které nemají zásaditou povahu. Pak se vymývají zásadité složky 0,5% amoniakem rychlostí 12 kapek za minutu a vodný roztok se odpaří na rotační odparce, čímž se získá 4,1 g odparku.

g tohoto odparku se rozpustí v malém množství vody .a roztok se nanese na sloupec o· rozměrech 200 X 3 cm, naplněný Sephadexem G 15. Sloupec se vymývá vodou. Při rychlosti 8 ml za hodinu se odebírají frakce po 2 ml. Jednotlivé frakce se sledují chromatografií na tenké vrstvě. Z frakcí 85 až 94 se získá 280' mg derivátu aminocukru o n = 2 se specifickou účinností 50 000 SIE/g.

Příklad 13 g přípravku z příkladu 1 se inkubují v 60 ml 20 mmolech pufru s glycerofosfátem sodným o pH 6,9 a 1 mmolu CaClž s 1 g α-amylázy ze spec. Aspergillus (Serva č. 13418) za stálého .míchání 120 hodin při teplotě 37 °C, načež se směs zahřeje na 5 minut na 100 °C a odstředí při 4 '000 otáčkách . za minutu .od nerozpustného podílu. Po lyofilizaci roztoku se získá 1,9 g produktu A 3500 SIE/g a 2 X 10B AIE/g. Při zkoumání produktu chromatografií na tenké vrstvě a na inhibici sacharázy zejména derivát aminocukru o n . = 1, 2 .a 3.

Příklad 14 g přípravku z příkladu 1 se inkubují ve 30 ml 20 mmolech acetátového pufru o pH

4,8 a 1,25· mg β-amylázy z topinamburu .(Boehringer 15471) za .stálého míchání 120 hodin při 37 °C, načež se směs zahřeje na 5 minut n'a 100 °C, nerozpustný podíl se odstředí při 4 000 otáčkách za minutu, po' lyofilizaci roztoku se získá 1,5 g produktu o

800 SIE/g a 3,8 X .106 AIE/g. Po zkoušce tohoto produktu chromatografií na tenké vrstvě a na inhibici sacharázy podle příkladu 2 je zřejmé, že je přítomen zejména derivát aminocukru o n = 2 a 3.

Příklad 15

Erlenmeyerovy baňky o .obsahu 200 ml s obsahem 25 ml živného roztoku, který obsahuje 0,1 % K2HPO4, 0,2 % (NH4)žSO4, 0,05 procent MgSCU, '0,05 .% KC1, 0,01 % FeSCh % přípravku z příkladu a suspenze spor kmene Asp. nlger ATCC 11394 se podrobí fermentaci při 28 °C na rotační třepačce, přičemž po 6 dnech poklesne titr AIE z 210 000' AIE/ml na 53 000 AIE/ml, po 10' dnech až na 21 300 AIE/ml. Současně se zvýší obsah SIE/ml ze . 7,0 na 72 SIE/ml.

2B .ml roztoku, který byl 10 dní inkubován se suspenzí spor se odstředí 30· minut k oddělení mycelia při 3 000 otáčkách za. minutu. 15 ml . supernatantu o 72 000· SIE/litr se míchá 30 minut s 2 g Amberlitu IRC 50 v H + -formě a 1 g Amberlitu IRA 410 v 0H~-formě, čímž dojde k odstranění solí. (Vodivost je menší než 2 m Siemens], Směs se zfiltruje a filtrát se nechá projít rychlostí 5 ml/hodinu sloupcem o rozměru 1 X 10· cm s obsahem Dowexu v H + -formě v 0,001 N kyselině solné. Sloupec se vymývá 200 ml 0,001 N kyseliny solné. K desorpci se .nechá rychlostí 10· ml za hodinu projít sloupcem roztok amoniaku okoncentraci 0,6 °/o, odebírají se frakce po 5 ml. Frakce s obsahem inhibitoru sacharázy se slijí, odpaří na 2 ml v rotační odparce a smísí se 2 ml methanolu. Roztok se upraví na pH 3 až 4 a vysráží se tak, že se po kapkách přidá do 100 ml acetonu. Sraženina se oddělí filtrací za odsávání, promyje se acetonem· a etherem, a usuší ve vakuu. Získá se 26 mg produktu o 28 ·000 SIE/g, produkt sestává z derivátů aminocukru o n = 2 a 3. Derivát o n = 2 je možno z tohoto· produktu získat způsobem podle příkladu 9 gelovou filtrací přes sloupec přípravku Bio-Gel P-2. Získá se 7 mg derivátu aminocukru o n = = 2 se specifickou účinností 60 000 SIE/g.

Příklad 16 litry fermentačního prostředí, získaného· podle příkladu 6 oddělením mycelia· při 13 000 · otáčkách za minutu s účinností 13 000 SIE/g se ke snížení obsahu solí (vodivost filtrátu lOmS) míchá s 500 g směsi 2,5· dílu Amber lite IRC-50 v H ⁺ -formě a 1 dílu Amberlite IRA-410· v OH-forině 1 hodinu. Iontoměnič se oddělí, roztok se odpaří na množství nižší než 100· ml a nerozpustný podíl se odstraní odstředěním při 20 000 otáčkách za minutu 15 minut. Supernatant se doplní na 100 ml, má vodivost 3,5 mS a dále se čistí na sloupci o rozměrech 55 X 400 mm s obsahem P-celulózy (Serva č. 45130, připraveno běžným způsobem, rovnovážného stavu bylo dosaženo v 5 molech pufru s fosforečnanem amonným o pH 5,5). Sloupec se vymývá uvedeným pufrem rychlostí 90 ml/hodina. Odebírají se frakce po 18 ml.

Frakce se zkoumají na obsah uhlohydrátu antimonovým testem a na obsah inhibitorů sacharázy testem na inhibici sacharázy, frakce prosté uhlohydrátů (frakce 60 až 80), které byly současně účinné jako inhibitory sacharázy se odpaří na 150 ml a nechají se projít sloupcem o rozměrech 50 X 300 mm s obsahem Amberlite IRA-410 v HCO3-formě. K lepšímu řízení deionizace se eluát odebírá po frakcích (J 10 ml za 20 minut a frakce se zkoušejí na obsah uhlohydrátu antimonovým testem, který má být téměř negativní, na fosforečnan činidlem s kyselinou askorbovou a· molybdenanem a na inhibici sacharázy enzymatickým testem. Nejúčinnější frakce 3 až 30· se slijí, odpaří a lyofilizují, zno vu rozpustí a znovu lyofilizují, čímž se získá · 280· mg surového inhibitoru.

K dalšímu čištění se surový inhibitor podrobí frakcionaci na přípravku Bio-Gel P-2 podle příkladu 6. Z frakcí se získá čistý derivát aminocukrů o n = 1, po lyofilizaci se získá 30· mg produktu o 0,3 X 106 AIE/g a 35 000 SIE/g.

Příklad 17

K získání derivátu aminocukru o· n = 5 až 7 se vychází například z přípravku podle příkladu 1.

g extraktu z příkladu 1 se rozpustí ve 250· ml vody. Vodivost tohoto roztoku je 10 mS, pH 5,5. Roztok se zbaví solí tak, že se smísí s 60· g Amberlite IRC 50· v H+-formě (slabě kyselý kationtoměnič, který váže deriváty aminocukru ve vodném roztoku jen ve stopách) · a 20 g Amberlite IRA 410 v OH“-formě a směs se míchá 20 minut. Filtrát s vodivostí 0,5· mS o pH 3,5 se upraví na pH 3,0· 1 N HC1 a má pak vodivost 0,6 mS. Tento roztok se nechá projít rychlostí 42 ml za hodinu sloupcem · o· rozměru 2,5 X 40 cm s obsahem Dowex 50· W v H+-formě · o · rozměru zrn 200 až 400· mesh, sloupec je v rovnovážném stavu v 0,001 N HC1. Sloupec se vymývá 2 litry 0,001 N HC1. Po promytí se provádí eluce 1,2% vodným amoniakem· a odebírají se frakce po 10 ml. Účinné frakce se slijí, amoniak se odpaří ve vakuu a roztok se pak ve vakuu odpaří na objem 30 ml. Srážení se provádí tak, že se roztok po kapkách přidá do 600 ml bezvodého alkoholu, sraženina se oddělí filtrací za odsávání a po promytí alkoholem a etherem suší ve vakuu, čímž se získá 4,4 g produktu o 26,5· X X106 AIE/g.

Vždy 0,5 tohoto produktu se jemně čistí preparativní na sloupci přípravku Bio-Gel P-2 podle příkladu 9. Frakce, které podle zkoušky ·Chronatografií na tenké vrstvě obsahují derivát aminocukru o n · 5 až 7 se slijí, odpaří ve vakuu a vysráží svrchu uvedeným způsobem bezvodým ethan-olem. Výtěžek z 0,5 g surového produktu je 0,2 g derivátu aminocukru o n = 5 až 7 s 30 X 106 AIE/g a 2 500 SIE/g.

Příklad 18

I. Uspořádání pokusu ke zjištění účinnosti inhibitorů hydroláz glykosidů a ke zjištění zábrany resorpce glukózy u krysy u člověka

K vyvolání alimentární hyperglykemie a hyperinzullnenie se podá bdícím krysám (n=6) nebo bdícím pokusným osobám buď

2,5 g sacharózy, 2,5 g maltózy, 1 g povařeného· škrobu nebo' 2,5 g glukózy/kg · perorálně nebo 50 g sacharózy, 50 g maltózy, 50 g povařeného škrobu nebo 50 g glukózy na osobu ve vodném roztoku nebo suspenzi. Další krysy ι(·π — 6) obdrží stejné množství svrchu uvedených uhlohydrátů a mimoto účinnou látku z některého příkladu v uvedené dávce. Zdravé pokusné osoby střídavě obdržely v odstupu 2 dnů pouze uhlohydrát nebo uhlohydrát s uvedenou účinnou látkou. Hladina krevního cukru a inzulínu, byla stanovena v odstupu po 5 minutách po dobu až 3 hodiny po zatížení uhlohydrátem + účinnon látkou v krvi, přičemž krev byla odebrána u krys z retroorbitální žílné pleteně a u pokusných osob buď z loketní žíly nebo jako kapilární krev. Stanovení hladiny krevního cukru bylo prováděno přístrojem Auto-Analyzer (Technicon^R, podle publikace Hoffman: J. biol. Chem. 120, 51 (1937) nebo enzymaticky glukózooxidázou a o-dianisidinhydrochloridem, stanovení inzulínu v krevním séru bylo prováděno metodou podle publikace Hales a Randle: Biochem. J. 88, 137 (1963).

II. Sledování inhibice přeměny uhlohydrátů na lipidy tukových tkání.

Krysy (n = 6) obdržely uhlohydráty z odstavce I v inaktivní formě spolu s vhodnou dávkou téhož uhlohydrátů, značeného radioaktivním uhlíkem + účinnou látku z téhož příkladu polykací sondou. Po krátké době byla zvířata usmrcena a byla provedena analýza tukové tkáně epididynis a/nebo perirenální tukové tkáně, lipidy byly extrahovány směsí chloroformu a methanolu v poměru 2:1a metabolity nelipidové povahy byly vymyty. Měřena byla radioaktivita izolovaných lipidů na kapalinovém scintilačním počítači. Účinnost byla udána v dpm/1 gramů tukové tkáně.

V tabulkách znamená P pravděpodobnost chyby a s standardní odchylku.

Tabulka 1 к příkladu 18

Glukóza v krvi v mg % (střední hodnota + ls u bdících krys různou dobu po per orálním podání škrobu + účinná látka z příkladu 17, derivát aminocukru s n = 5 až 7

O OO

O

OJ

ID

O cd й К cd o

ČXi >4

4—·

CJ

S

Ю H CD +1+1+1

CD CD 04

CD O O

OD ’ф +1 r4 CD

tX^ CD CD, ’ф co co +1+1+1 m co h N N H r-l г-1

I и и CO^LO LO_ | ID || CD || id oo id co cd +1+1+1 | +1J +1

O CO N CD II ’Ф II ©HO oo || 00||

- IIII

I IIII

I I II

CD^CD^CO	1 °o	1
ld oo oo	1 00	1
+1+1+1	+1	1+1
00 X tx 1	1 ’Ф	’Ф
CD гЧ O | гЧ r4	lOT	1 00 1

l | ll

I I II j 00 ’Ф гЧ ’ф +1+1+1

ID 00 LD ID O CD гЧ

X) ó +

ω

M < s o ’ф

O

V

PH

II

II o o v

P-i

ID CD o

V

P4

ID ’Ф

«гчЧ ’Ф гЧ ’Ф +1+1+1

НО 00 СЛ Ю О D

		'Φ'
ID гЧ tX	oo	©
+1+1+1	+1	+1
CD CD tX	’ф	ID
CD CD О г-1 гЧ	5	.00

I II

^CD r4	X	1 ®
oo^	co	ι ®
+1+1+1	+1	1 +l
CM co oo		1 co
tx CM CM rH r-i	r4 1Ф	|C

СОЮН I id со со +1+1+1

X 00 ’Ф I

CD Η О ι гЧ гЧ |

©~ CD, OD ld oo ld	СМ ι 00 1	1 I- ™
+1+1+1	+11	l+l
OO tx oo	со I
CD гЧ r4 гЧ гЧ	©	Η

I ‘Ч ID LO +1 +1 О I ’Ф CD | X

ω	Ы	ω
<	<	<
S ο	ό ο ο	ο §
со	СМ	φ

II

II

II

II

II

II

II

II

II

II

II

II

0,05 ----Р < 0,01 - -- Р < 0,001 oproti kontrole se škrobem

а +1+1+1

0,001 oproti kontrole se škroben

Чюсм 1	‘4	II ю.
OD ri ri I	σ>
-l-H-l-H |	+1	11 +1 II
00 CM ri I	00	II CM
МП N	ri '	II

°1cm	°- |	1 “=-
t> rl	Λ i	1 ?,
+1+1	1+	+1
ID 00	1	1 <N
M co	O 1	1 05
ri	r

OO' CO ID^	XJ1	1
c\T t>T co	ri	1 ю
+1+1+1	+1	+1
CM 00 CD	o-	1 ID
ID CD 00		1 «=>

н н ш +1+1+1

СО со id см см

см '“L	1	1 <4 1	1 °-
id tr? cd	O) |	1 05 1
+1+1+1	+11	1 +l	+1
T-l in	CJ) I	co 1	1
CD CO CO rH rH	-	S|	Iе”

о ιη со г< ь?

+1+1+1

I I II

Tabulka 5 к příkladu 18

Glukóza v krvi v mg % [střední hodnota + ls u bdících krys různou dobu po perorálním podání škrobu + účiná látka z příkladu 6.

ID

°1cd oo	1	1 4
CD rH rH	1 ю	1
+1+1+1	H	1+1
O CO CM		1 1—1
CD in 00	1 00	04
т-H rH		rH

I I II

*ИН	I cm	l n
1Л rH rH	1	in
+1+1+1	+1	I+i
co 00 ID 1	1 LD	00
S ’Φ N , rH rH	1 rH	° rH

II

II

II

II

II

I - + II I I II

II II

rH « rH		1
rH O) rH		и 04
+1+1+1	+1	11 +1 II
rH rH 00		II rH
Оч 1Л M t—1 rH	cm |	l+

II II

II II II ’ф °o || <4 |||| o? irT irT oo +1+1+1¹¹ +1¹¹ +1¹¹ ii T ii Ξи ⁰⁰ s £ || й II Д||

II IIII

Qoo со н cd +1+1+1 ^ΙΩ o Οχ oo co

I II <=>. I «0 II OO . rH

04 00~ CD		00
co 00 04	00	ГН
+1+1+1	+1	+1
M rH CM	00
0 0 rH rH	CD	00

>ω>G0 ++ wω »—i<

<<

OO ino rH00

OD <=r v

cu o

v (+

o co o

Ю

Ю

O S Q И CO || UO || in co r< co ¹¹ +1+1+1¹¹ +1¹¹ +1¹¹ со cm Z ii ii Σ ii

СО СО O || O || CD ||

СО ^Ю 1^1°. м rH o? | oo | cd Ή+Ι+ΙI +1 I +1

M CM CD I CD | 00 uo oo o i o i cd

Η тН | rl | σγ о ю oo co © +1+1+1

O rH 00 ХЛ CM O

“ rH rH	O	1
CM rH rH		00
+1+1+1	+1	+1
CO 04	CM	1 Ю
in 0 0 rH rH	05 1	Iе”

II

II

II

II

II

II

0,05 ----P < 0,01 = = = = P < 0,001 oproti kontrole seškrobem nebo sacharózou v

PU i и

CD Q

LO тг<

O co +1

CJ ctí Й f—<

Λ £0 a >4

4-J s д •«—A e

II IIII

II IIII

O l> r4 II CM l||| in cd cd ¹¹ CD ¹¹ cd ¹¹ +1+1+11,¹ +1J +1¹¹

CONCO II rH II 1Л || ano ..o ..co h ^ || гч || ||

I I II i ! li

Tji η ω	l£	l in 1 °°
+1+1+1	|+i	1+1
Tíi см см 1	CM	1 LO
LO CO rd , r-Ч r4	1 ° Ή	1 *

CO CD G) 1	LO	CD
cd cd1-1	1	CD
+1+1+1	l+l	+1
CD гЧ JO 1	11>*
тг cm O ! τ—1 гЧ 1	1 ГН	σ>

®rl 4	гЧ	тН
CM гЧ co		od
+1+1+1	+1	+1
00 CD	со	ю
1ПО □ гЧ гЧ	о Т-Ч	00

II o

cd v

Оч

LO O

O v

cu cd

Sr-I

Λ cd

4xí

4-» 'Ctí 'Ctí .s >3 a +1

o CD

O co

LO

ω ctí

Λ ctí o

Pa >>

4~>

P tí s

Хф 1 CD γ-Ч СМ	1 ч 1 ю
+1+1+1	1+1
LO Ьч	оо
О) СМ О гЧ т-Ч	CD

iii I II

Чо ч 1 оо см	1 ч 1
+1+1+1
см со о 1	i 1 см
ONO, r-Ч гЧ |

II II in σ) s || cd|| ” IIII +1+1+1₁₍ +1

LO CO γ—I 1' 00П

Д O || Ю||

II II

0,05 ----P < 0,01 = = === p < 0,001 oproti kontrole se sacharózou v

СЦ

*φ co Ο rH

Q CD o

Tji tx

CD rH

O tx ^φ CM

CO tx tx co

O LD CD 'Φ

CO CO tx co

O 'Φ CM rH

O

O

CM

O od

O

CO

LD 'Φ

O CO

O o. rH rH

O *Φ CM t-H rd

OD

CO

CM Co CO rd oo oo Φ rd

O

CO

O

CM

O

CD

O

O CO

•’Φ CO O rd

CO tx CD

O O

O 1—I

O CD MH rd rd ID CM

O CD rH CO

O oo

O CM

O

CD

LD

O CO

CO O O rd

oo

oo

O tx

CM oo CO CM rd *Φ LD Co rd

CM co ČM rd

CM co o

Tabulka 10 k příkladu 18

Glukóza v krvi v mg % (střední hodnota + ls) u bdících krys v různé době po perorálním podání snkhnpózy + účinná látka z příkladu 6 in

o co lo

CH od Й Ή cd

O

Ph a e ®CO rH I ro || ® II 1Л ^{Η H} .co a -l-l-H-H . -H .. +1.. rH CM QO 1 co 1' ll CD LO CM í tH li О и

I II II

I II II CD ri cm | rH || rH || co co in σΓ +I+I-H+1 +1 xti in co I rH II ЮII ⁰⁰ ch CH i 5 ll ⁰⁵II

I IIII

II II

od

4tí

	ч I 1
LD rH rH	CO m II
-l-l+l+l	+1 11 1 1 11	H-l
31 Ν Ώ	CT5 11	CM
(O rl O	00 ||

cd ►—<

(Z)

CD LD

Ctí N Ό

U od

Cd

CD +

H ω

o o

II II

Ctí N Ό u cd 4h CD CtJ

CD + w k—< ω o o CM

CD 3

T3

Ξ

Ph od 4tí 4—· 'C2 'od a з >o &

>> N 'O оз β

o 'Cd T3

O Он o o

N od

O O)

O CD o co o

CM

CO rH in cm in

--4-1

QD co

CM co oo

CM

CO co CM ts

CO

Η'·Ί-Ι ^“ICD OD O. tH o cn o °^-o CO rH

ID

CO

CD +1+1+1 r-H 05 CD

O· 00 cd co +I co co +1 co CM

UD co

CD

CM d o N Ό

Ct!

S

O 42

Φ £

d O

N 'O u od 45 cn od

CD

Φ

CD r“H ^r“^H u +-* Ch o 4tí

O U Λ

O cu

II

II

II

II cd H

CD

U

4tí

CO. cn -H rH o

QU

O od

V

CU to o o v

Pi

JX)

Wí

S +l_o o o

CD

CD rH oti

O P Ttí o „ 45 W d T3 ó 5u 4-»

CD cd N Ό 4tí S o

od co

ID co~ CO, rH th lo lo +I+I+I o

O rH CD O

CD co

CM

CD cu ^s o '>> > O u S oo

O .21

O cd 4tí

Λ co

O

Ph >4

4—<

CH s £*> N Ό □ O Ň Ό оз N Ό od N Ό

LD CD co

N

CD 42 r-H ó ú +0 o 4tí od β

CD c0

Ό u

4-» tí Q 4tí cd s + w

Б +

Ы § o o CM cu

Tabulka 12 к příkladu 18

Glukóza v krvi v mg °/o (střední hodnota + ls) u bdících krys různou dobu po perorálním podání glukózy + účinná látka z příkladu 9, derivát aminocukru o n = 2.

o co

LD

CJ od ^£ a cd o

&

>4

4-< a Cl б

°° cd O o CO rH tx cn +I+I+I+I

S 00 oo in

M co o eo

I

I

I I

I

CO uo гЧ гЧ Lft CM +I-H-H+I 00 CM co co tx 'φ CM rH

H H rl ^CM CO CO | ^rlH rt +Ж+Ж

CM CM LO LO I

L·* Mi 00 CM t rl rH rH |

td ca Ν N Ό Ό Λ Λί я 3

60 cd cd r—H F*d O o o o

++ bo 60

S o o 00 00 rH o ©

V

I

I

I

I

LO O' o'

V íXi

Příklad 19

Příklad na kyselou desorpci sloučenin podle vynálezu.

Sloupec o průměru 1,5 cm se naplní 30 g vlhké hmotnosti přípravku Dowex^R 50 W X X 4 v H⁺-formě o rozměru zrn 200 až 400 mesh v 0,001 N HC1. Sloupcem se nechá projít 500 ml smíšeného· desorbátu o 400 000 SIE/litr při pH 2,5 s obsahem 60 % acetonu, získaného z příkladu 10. Desorbát prochází sloupcem přibližně 1 hodinu, sloupec se pak promyje 500 ml 0,001 N HC1. Za těchto podmínek se vymyjí pouze malé stopy přítomného inhibitoru. Pak se provede přímo ve slouipci desorpce 0,0125 N kyselinou solnou, přičemž se stanoví vodivost eluátu. Mimoto se v eluátu stanoví obsah SIE. Účinné frakce č. 74 až 100 se slijí a neutralizují přidáními Amberlite IRA 410 v OH‘formě, pak se odpaří na 5 ml, smísí se s 5 ml methanolu a vysráží se tak, že se roztok po kapkách přidá do 200 ml acetonu. Po promytí acetonem a etherem se roztok odpaří ve vakuu.

Výtěžek je 1 g derivátu aminocukru on — = 2 s obsahem 65 000 SIE/g.

Z aktivních předběžných frakcí je možno získat deriváty aminocukrů, v nichž n = = 3 nebo 4.

Tento postup pro kyselou desorpci umožňuje také na rozdíl od alkalické deisorpce frakcionaci jednotlivých homologů řady derivátů aminocukru.

Claims (1)

1. Způsob výroby nových derivátů aminocukrů obecného vzorce kde

R znamená oligosacharidový řetězec s 1 až 7 hexózovýml jednotkami, vyznačující se tím, že se pěstují mikrorganismy čeledi Actinoplanaceae kmen SE 50/110 ~ CBS 674.73 ve vodném živném prostředí s obsahem zdrojů uhlíku, dusíku a anorganických solí při pH 5,0 až 8,5 a teplotě 15 až 45 °C za aerobních podmínek a derivát aminocukru se po skončené fermentaci izoluje, a popřípadě se při výrobě sloučenin, v nichž R znamená 1 nebo 2 mono-sacharidové jednotky odbourávají sloučeniny, v nichž R znamená více než 2 mon-osacharidové jednotky enzymatickým způsobem inkubací s hydrolázami nebo hydrolýzou v kyselém prostředí za použití vodných roztoků anorganických kyselin.