KR790001709B1 - 아미노-슈가 화합물의 제조방법 - Google Patents

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Description

아미노-슈가 화합물의 제조방법

제 1 도 : 성분 Ⅱ의 NMR 스펙트럼.

제 2 도 : 데카아세틸 유도체의 NMR 스펙트럼.

제 3 도 : 성분 Ⅲ의 NMR 스펙트럼.

제 4 도 : 성분 Ⅳ의 NMR 스펙트럼.

본 발명은 특히 탄수화물 대사조절 및 당뇨병과 비만증 치료에 유효한 다음 구조식(I)의 아미노-슈가 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 구조식에서

R은 1 내지 3개의 포도당이다.

악티노플라나세아에(Actinoplanaceae)과에 속하는 대다수의 방사선 세균이 배당체 가수분해 효소, 특히 소화관의 탄수화물 분해 효소에 대한 저해제를 생산 한다는 것은 기지의 사실이다. 이런 저해제중 어떤 것은 비교적 열에 안정하고 또 실온에서 산이나 알카리에 안정하다. 화학적으로 이러한 저해제는 올리고 사카라이드류, 다당류 또는 이들의 유도체이다.

이러한 그룹의 저해제중 대부분은 아밀라제에 대해 아주 강력한 저해능을 나타 내지만 사카라제에 대해서는 약간 또는 중간 정도의 저해능을 나타낸다(독일 특허공보 2,064,092호 참조).

그러나 본 발명에 따른 구조식(Ⅰ)의 아미노-슈가 유도체는 놀랍게도 사카라제 또는 아밀라제에 대해 기지의 저해제 보다 강한 특수한 저해 작용을 가진다. 이 신규의 화합물 중 어떤 것은 생체 외에서의 저해능 보다 강한 처해 작용을 생체내에서 자주 가진다는 것을 특기 할만하다.

더우기 본 발명에 따라 제조된 동족체의 과당류가 생체 내에서 포도당 흡수를 저해 한다는 것은 더욱 놀라운 일이다.

본 발명에 따라 구조식(Ⅰ)의 유도체는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

가) 악티노플라나세아에 과의 세균을 호기 조건하에서 수성배지에 배양하여 화합물을 배양액으로 부터 분리해 내거나

나) 본 발명에 따른 다음 구조식(Ⅰb)의 화합물로 부터 미생물에 의하거나 또는 화학적 방법 또는 효소가수 분해에 의해 R₂로 부터 필요한 수의 단당류를 쪼개내어 본 발명에 따른 구조식(Ⅰa)의 화합물을 제조한다.

상기 구조식에서

R¹과 R²는 구조식(Ⅰ)의 R과 같으나,

단, R²는 R¹보다 많은 포도당을 함유한다.

상기 방법에서, 가)는 본 발명의 화합물을 미생물에 의해 합성하는 방법이고, 나)는 이들 화합물을 내부 전환시켜 본 발명의 화합물을 제조하는 방법이다.

상기 가)에 따른 미생물에 의한 합성에 사용 되는 균주로는 악티노플라나세아에 과(악티노마이세탈레스목에 속하는)에 속하는 균들이며, 악티노플라내스속의 균주가 적합하다.

예를 들면 악티노플나내스 종 SE 50(CBS 961.70), SE 18(CBS 957,70), SE 82(CBS 615.71)가 있다.

이들 균주는 남아프리카공화국 특허번호 71/8,677에 이미 기술 되었으며, 괄호안의 번호로 홀란드 바른에 있는 사상균 배양중앙국(Centralbureau voor Schimmelcultures)에 기탁되어 있다.

또 가) 방법에서는 이런 균주의 변이주도 사용 할수 있다. 균주 SE 50/13(CBS 614.71)과 SE 50/110(CBS 674.73)가 본 발명에 따른 아미노-슈가 유도체의 총 수율 및 또는 발효중에 생성되는 아미노-슈가 유도체 혼합물 중의 R기의 크기 면에서 볼때 특히 적합 하다는 것이 증명 되었다. 이 두 균주들의 특징은 모균주인 SE 50(CBS 971.60)의 특징과 매우 유사하다. 이런 균주들은 돌연변이원(mutagen)을 사용 않고서 균주 SE 50으로 부터 얻는다.

본 발명에 따른 가) 방법에서 배지는 고체와 액체 배지를 다 사용 할수 있지만 특히 액체배지가 사용된다. 이 배지는 탄소원, 질소원 및 염과 소포제를 통상의 농도로 함유 하는데 그 농도 범위는 매우 넓다.

탄소원으로는 보통 탄수화물, 특히 전분, 맥아당, 포도당 및 이들 둘 또는 셋의 혼합물이 사용 되며, 상품으로 나와 있는 멕아엑기스도 사용 할수 있다.

질소원으로는 아미노산 및/또는 암모늄염 뿐만 아니라 카제인 가수분해물, 효모엑기스, 펩톤, 어육, 어류가용물, 옥수수 침지액, 육즙 및 이들의 혼합물이 사용 될수 있다.

가) 방법에서는, 호기성 조건하에서 배양 시킨다. 발효에 사용되는 특수균주와 탄소원의 성질 및 농도에 따라 최종 생성물의 성질이 좌우된다. 즉, R기의 크기 및 동계열의 개개 또는 동계열의 매우 좁은 범위의 물질이 우선적으로 선택적으로 제조된다.

따라서 본 발명자들은 2%(중량비) 이상의 전분을 함유하는 영양액에서 4 내지 7개의 6탄당을 가지는 아미노-슈가 화합물이 주로 생성되며 여기에는 균주 SE 50/13(CBS 614.71)가 특히 적합 하다는 것을 발견 하였다. 그러나 어떤 조건하에서는, 4 내지 7개의 6탄당을 가지는 본 발명에 따른 화합물들의 혼합물을 얻기 위한 탄소원으로, 적합한 포도당을 함유하는 영양액에 0.1 내지 3%(0.5 내지 2%가 적당)의 전분을 가하는 것 만으로도 충분하다.

또한 특히 균주 SE 50(CBS 961.70)을 사용 할때는 전분이 없는 용액 특히 맥아당을 가한 영양 배지상에서 2 내지 3개의 6탄당을 갖는 구조식(I)의 화합물이 주로 생성 된다는 것을 발견 하였다.

탄소원으로 포도당 만을 함유하는 영양액은 R이 하나의 포도당으로 이루어진 화합물 제조에 특히 적합하다는 것이 증명 되었다.

만일 과잉의 포도당을 함유하는 영양액을 사용 한다면 발효 기간만 연장되면 긴 체인의 화합물(예를 들면 R이 4 내지 7개의 포도당을 함유)도 얻어 지는데, 이는 발효 도중 포도당의 소비와 동시에 질소원을 소비 시킴으로서 어느 정도 막을 수 있다. 만약, 포도당을 영양액에서 모두 제거하고 맥아당을 탄소원으로 가한다면 2개의 6탄당을 가지는 화합물을 주로 얻을 수 있다. 순수한 맥아당 대신 천연 맥아 엑기스인, 몰트진(Maltzin)과 같은 값싼 혼합물을 사용 할수도 있다. 맥아 3탄당의 함량에 따라 보다 큰 동족열 화합물을 동시에 얻을 수 있다.

균주 SE 50/110(CBS 674.73)은 저급 동족열 화합물(예를 들면 R이 1 내지 3)을 제조 하는데 특히 적합하다는 것이 증명 되었다. 즉 이 균주는 최적의 영양액에서는 SE 50/13(CBS 614.71)의 두 배량에 해당하는 저급 동족열 화합물을 생성한다.

가)의 발효 반응중 남아 있는 영양액의 조성,특히 질소원 및 염조성물의 농도는 그 범위가 넓다.

가)에 사용 되는 영양 배지는 통상의 방법에 의해 살균할 수 있다. 일반적으로 영양액의 pH는 5.0 내지 8.5이고, 6.0 내지 7.8이 적합하다. 배양 온도는 15°내지 45℃로 24°내지 32℃가 적합하다. 고급 동족열 화합물(예를 들면 R이 4 내지 7개의 단당류를 가지는)을 제조 하는데는 균주로 SE 50(CBS 961.70)과 SE 50/13(CBS 614.71)를 사용하여 높은 온도(예 : 28℃)에서 발효 시키는 것이 보다 좋고, 반면에 저급동족열 화합물(예 : R이 1 내지 3의 단당류를 가진)을 제조 하는데는 균주로 SE 50(CBS 961.70)과 SE 50/110(CBS 674.73)를 사용하여 낮은 온도(예 : 24℃)에서 발효 시키는 것이 적합하다. 배양 기간은 1 내지 8일 특히 2 내지 6일이 적합하며, 특히 과잉의 탄수화물을 사용할 때는 배양기간을 오래하면 고급 동족열 화합물이 잘 생성된다. 발효의 종말점은 효소 저해에 의한 저해능 측정 및 박층 크로마토그라피에 의한 조성물 측정에 의해 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물중 저급 동족열 화합물은 고급 동족열 화합물을 나)의 방법에 따라 즉 화학적 또는 효소가수 분해 또는 미생물에 의해 단당류를 쪼개어 얻을 수도 있다.

나 ) 방법에서, 화학적 가수 분해는 50°내지 100℃(특히 90°내지 100℃)에서 10 내지 180분간 1 내지 5N 무기산수용액 중에서 수행된다.

나 ) 방법에서, 효소적 가수 분해는 적합한 가수분해효소, 특히 본 발명에 따른 화합물에 의해서 저해되지 않는 β-아밀라제, α-아밀라제, 또는 바실러스 섭툴리스와 같은 균으로 부터 얻어지는 아밀로글루코시다제와 함께 배양하여 행한다.

나)의 방법은 탄소원으로 분해 될, 본 발명에 따른 화합물을 1 내지 10% 함유하는 영양 배지에서 적합한 미생물을 배양시켜 행한다. 적합한 미생물의 예를 들면 아스페르길루스 나이거(Aspergillus niger)ATTC 11, 394가 있다.

본 발명에 따른 화합물의 정제 및 분리는 미생물 배양배지(방법(가)), 또는 아미노-슈가 유도체 고급 동족열이 효소적 및/또는 미생물적으로 재구성 되거나 분해되는 배양혼합물 또는 산 가수분해물(방법(나))로 부터 수행 하는데, 분리시킬 화합물의 분자량에 따라 여러 단계의 방법을 수행할 필요가 있다.

고급 동족열 화합물(예 : R은 4 내지 7개의 단당류로 이루어 진다)은 용액을 먼저 농축한 후 바로 침전시켜 분리 시킬수 있다.

반대로 저급동족열 화합물(R=1 내지 3개의 단당류)은 중성 pH에서 활성탄에 흡착 시키고 알콜류나 아세톤 용액(50 내지 80% 아세톤이 적합하다)으로 방출시켜 분리 시킨다. 방출은 특히 산성 pH 1.5 내지 4(2 내지 3이 적당)에서 행하면 완전을 기할 수 있다.

만일 출발용액의 색이 아주 나쁘면 흡착전에 산성 pH(1-3)에서 활성탄을 사용 하거나 또는 pH 2 내지 7(2 내지 3이 적당)에서 보통의 흡착수지(예를 들면 바이엘의 Lewapol Ca 9221/0.35mm 입자크기)를 사용하여 탈색 시킨다. 활성탄은 산성에서만 색소물질과 결합하는 반면 상기 바이엘 제품의 레와폴은 중성 또는 산성 어느 쪽에서나, 저해제로 작용하는 본 발명에 따른 아미노-슈가 유도체를 흡착하지 않는다.

비활성 당류 및 저해 작용을 갖는 다른 비활성 화합물로 부터 본 발명에 따른 화합물을 분리하기 위하여 본 발명에 따른 화합물이 약염기성인 성질을 이용 할수 있다. 적합한 조건하에서(pH 1 내지 8, pH 2 내지 4가 적합함 : 10ms 이하의 전도율에 해당하는 낮은 이온 강도에서 2ms 이하가 적당하다) 본 발명에 따른 화합물은 H⁺형의 다우엑스 50W(다우 케미칼)와 같은 강산 양이온 교환수지와 결합된다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 화합물이 특히 아세톤 용액(50 내지 80%)의 아세톤, pH 1 내지 5, pH 2 내지 4가 적당)으로 부터 양이온 교환수지에 매우 성공적으로 결합될 수 있음을 발견 하였으며, 이런 조건하에서 이 교환수지는 실제로 화합물에 대한 흡착용량이 커진다. 만약 이 용액이 50% 이상의 아세톤을 함유 할 때는, 본 발명에 따른 화합물이 약산 교환수지(암바라이트 IRC-50, H⁺형)와 매우 잘 결합할 수 있다.

산 또는 염기(암모니아나 염산이 적합)의 수용액 특히 0.01 내지 1Val/L 농도의 암모니아, 또는 염산 수용액이 양이온 교환수지로 부터 본 발명에 따른 화합물을 방출 시키는데 가장 적합하다.

방출된 물질은 염기성 이온 교환 수지에서는 약산으로, 산성이온 교환 수지에서는 약염기로 중화시켜 진공하에서 이들 산 또는 염기를 제거한 다음 이 용액을 농축 시키고 친액화(lyophilisation) 시키거나 유기용매(10 내지 20 부피의 아세톤이 적합)로 침전시켜 본 발명에 따른 화합물을 얻는다.

더우기, 저분자량 화합물은 셀루로즈를 기질로 한 교환수지(포스포-셀루로즈가 적합) 상에서 크로마토그라피하여 불활성 당류로 부터 분리시킬 수 있다. pH 2.5 내지 8(pH 5 내지 6이 적합)에서 저이온강도(2 내지 100mM이 적합하고 5 내지 10mM이 특히 적합하다)의 완충액(인산염 완충액이 적당)이 용출제(running agent)로 적합하다. 효과적인 분별 증류의 필수 요건은 분별해야 할 액에서의 염 함량이 가능한 한 낮아야 한다는 것이다.

순수한 상태로 본 화합물을 제조하기 위해 상기와 같이 미리 정제된 준비액을 적합한 분자체(예를 들면 바이오-겔 P-2)를 사용하여 크로마토그라피할 수 있고, 용출물의 획분을 박층 크로마토그라피에 의해 검사할 수 있다. 순수한 본 화합물을 함유하는 획분을 모아 다시 크로마토그라피하고 농축시킨 후 친액화 시키거나 상기와 같은 유기 용매로 침전 시킨다.

본 화합물들은 화학적으로 탄수화물이다. 이들은 다음 아미노-슈가유도체 [C₁₉H₃₃O₁₃N]가 기본 물질로 되는 동족열을 형성한다.

(R⁰는 포도당을 나타낸다).

고분자량 화합물은 기본물질로 부터 하나의 단당류(6탄당 특히 포도당)를 첨가 단위로 하여 차례로 유도된다.

R이 1 내지 3개의 포도당으로 구성된 올리고사카라이드의 경우를 동족열계열 구조 원리의 예로서 들수 있다.

다음 구조식(Ⅰd)는 R이 올리고(포도당)인 본 발명에 따른 화합물을 나타낸다.

(n=1 내지 3).

이 계열의 기본물질은 n=1 이며, 여기서는 "성분 Ⅱ"로 나타낸다. 이 계열의 각 화합물은 포도당을 가감 하는데 따라 저급 또는 고급화합물로 구별된다.

여기서 "성분 Ⅱ"(n=2)은 "성분 Ⅱ" 보다 포도당이 하나 더 많고 "성분 Ⅳ"(=3)는 "성분 Ⅲ" 보다 하나 더 많은 것을 의미하고 그 이상은 이에 준한다.

"성분 Ⅱ"는 다음과 같은 물리화학적 성질, 구조 및 반응성을 가진다.

"성분 Ⅱ"는 무색, 무정형의 고체로 H₂O, DMF, DMSO, MeOH에 잘 녹는다. 또 뜨거운 에탄올에도 녹는다.

a) 박층크로마토그라피 :

용출제(RA) : 에틸아세테이트/MeOH/H₂O(V/V) (10 : 6 : 4)

I. F 1,500 실리카겔 박층크로마토그라피(TLC)

막(

)

R_f치 : Ⅱ 0.46

맥아당 : 0.50

포도당 : 0.65

Ⅱ. F 254 실리카겔 TLC판(Messrs, Merck)

R_f치 : Ⅱ 0.47

맥아당 : 0.54

포도당 : 0.66

AgNO₃/NaOH 분무제가(Ⅱ)의 발색제로 가장 잘 사용된다. 실온이나 약간 가온했을 때에도 흑갈색이 나타난다.

b) 가스 크로마토그라피 :

가스 크로마토그라피로 검사하기 위해 Ⅱ를 α-및 β-D-글루코즈 혹은 서당을 내부표준물질로 하여 피리딘(1), 트리메틸클로로실린(0.5), N-메틸-트리메틸-실릴-트리플루오로아세트아마이드(1)의 혼합물 중에서 실릴화 한다.

컬럼 : 6피트의 유리, 3% SE 30으로 크로모솔브 WAW 상에 채운다.

(SE 30=Hewlett Packard의 실리콘-탄력계)

온도 : 주입구 300℃

검측기 300℃

오븐 : α-및 β-D-글루코즈의 피크획분의 용출이 될 때까지 : 220℃로 등온, 이어서 매분당 15℃로 올려 300℃ 까지 올린다.

검측기 : FID(FID=불꽃 이온화 검측기)

가스 : 운반가스 : N₂40ml/분

연소가스 : 공기 80ml/분

지속시간 : α-D-글루코즈 3분

β-D-글루코즈 4분

서당 12-13분

Ⅱ 16-17분

c) 선광도 :

메탄올중의 Ⅱ 용액을 농축시켜 얻은 비결정성의 시료 Ⅱ를 물에 용해하여 측정한 비선광도는 [α]_D=+134.3°이었다.

d) IR 스펙트럼 :

KBr 중에서 측정한 결과 불확실한 IR 스펙트럼을 얻었다. 주흡수대는 O-H와 C-O 원자가 진동범위 사이에 나타났다.

e) NMR 스펙트럼 ; 220 MHz, C(제 1 도)

(도면에서의 횡좌표=δ(ppm))

f) Ⅱ의 아세틸화

Ⅱ를 무수아세트산과 피리딘(1 : 1) 혼합물 중에서 반응시켜 데카아세틸 유도체(분자량 : 903)를 만든다. 만일 이 반응을 1 : 1의 빙초산과 무수아세트산 중에서 촉매량의 황산과 함께 반응 시키면 운데카아세틸 유도체(분자량 : 945)가 데카아세틸 유도체와 함께 생성됨을 질량 분석기로 검출할 수 있다.

데카아세틸 유도체의 NMR 스펙트럼(제 2 도)

데카아세틸 유도체의 질량분석 :

분자피크 : 903(2.5% 상대 강도)

기본피크 : 843

상부 질량 범위에서의 중요한 피크 :

844(55% 상대강도)

784(36% 상대강도)

783(34% 상대강도)

759(35% 상대강도)

556(36% 상대강도)

496(37% 상대강도)

436(29% 상대강도)

g) Ⅱ의 메틸화

하꼬모리(Hakomori) 법에 따라 디메틸설폭사이드 중에서 CH₃I/NaH로 Ⅱ를 메틸화 하여 주생성물로 Ⅱ의 데카메틸 유도체와 소량의 운데카메틸 유도체를 얻는다.

질량분석

분자피크 : 623(6.1% 상대강도)

기본피크 : 535

둘째 분자피크 : 637(0.2% 상대강도)

분광기에 의한 데이타 및 화학적 성질에 의한 성분 Ⅱ의 구조식은 다음과 같다.

성분 Ⅱ는 특히 NMR 스펙트럼에 의해 나타난 바와 같이 α-와 β-형의 혼합물이다.

동족열의 "성분 Ⅲ"[C₂₅H₄₃O₁₈N]은 다음과 같은 물리화학적 성질 및 구조와 반응성을 가지는 것을 특징으로 한다.

"성분 Ⅲ"은 즉시 물에 용해 될수 있는 무정형의 고체이다.

a) 박층 크로마토그라피 :

용출제 : 에틸아세테이트/MeOH/H₂O, 10 : 6 : 4

I. F 1,500 실리카겔 TLC 막

R_f치 : Ⅲ : 0.35

맥아당 : 0.50

Ⅱ. F 254 실리카겔 TLC판(Merck)

R_f치 : Ⅲ : 0.33

맥아당 : 0.54

Ⅲ은 AgNO₃/NaOH 분무제에 의해 또는 실온에서나 판에 열을 약간만 가해도 흑갈색으로 발색된다.

b) IR 스펙트럼 :

KBr 중에서 IR 스펙트럼은 다소 불확실 하며 주흡수대는 O-H와 C-O 원자가 진동 범위내에 있다(각각 3,700 내지 3,100㎝^-1와 1,180 내지 950cm^-1)

c) 선광도 :

H₂O에서 [α]_D: +147.2°

d) NMR 스펙트럼 : 220MHz, D₂O 중에서(제 3 도)

e) 하꼬모리(Hakomori) 법에 의해 메틸화

디메틸설폭사이드 중에서 CH₃I와 NaH로 Ⅲ을 메틸화 하면 주생성물로 13배 메틸화 된 Ⅲ과 소량의 14배 메틸화 된 생성물을 얻는다.

f) 메틸화 생성물의 질량분석

827(1.5% 상대감도)에서의 분자피크는 실험식 C₃₈H₁₉NO₁₈에 사용한다.

(0.1%의 상대강도를 갖는 둘째 분자피크는 841에 있다)

가장 중요한 단편 피크

739(27% 상대강도)

592(3.7% 상대강도)

535(30% 상대강도)

388(9% 상대강도)

386(13% 상대강도)

284(12% 상대강도)

187(12% 상대강도)

171(40% 상대강도)

101(34% 상대강도)

88(25% 상대강도)

75 기본피크

성분 Ⅲ의 다음 구조는 모든 화학적 및 분광학적 성질과 일치한다.

성분 Ⅳ는 한층 고급의 동족열이다. 산에 의한 일부 가수분해에 의해 분리되면 1 : 2의 몰비율로 성분 Ⅱ와 포도당을 얻을 수 있다.

박층 크로마토그라피 :

용출제 : n-부탄올/에탄올/물=50 : 30 : 20

F 1,500 실리카겔 TLC판

R. 글루코즈값 : Ⅳ : 0.41 내지 0.46

고급 동족열, 특히 성분 Ⅴ 내지 Ⅷ는 저급동족열(성분 Ⅱ-Ⅳ) 보다 사카라제에 대한 저해능이 낮고 췌액으로 부터 나오는 α-아밀라제에 대한 저해능이 높다.

고급 성분을 산 가수분해 시키면 각 경우 상응하는 저급 성분을 중간 생성물로 검측할 수 있으며, 포도당과 맥아당이 가수분해 반응의 생성물로 생성된다.

박층 크로마토그라피 :

용출제 : n-부탄올/에탄올/물=50 : 30 : 20

F 1,500 실리카겔 TLC판

R 글루코즈값 : Ⅴ : 0.30-0.34

Ⅵ : 0.21-0.23

Ⅶ : 0.14-0.16

Ⅷ : 0.09-0.11

본 발명에 따른 표준 저해능은 생체의 효소 저해 시험으로 결정할 수 있다.

[아밀라제 시험]

아밀라제 저해제의 1단위(1AIU)는 두개의 아밀라제 단위에 대해 50% 정도의 저해능을 나타내는 저해제의 양으로 정의된다. 아밀라제 1단위(1 AU)는 아래와 같은 조건하에서 1분동안 전분중의 1μ 당량의 글루코사이드 결합을 분해 시키는데 요하는 효소의 양이다. μ당량의 분해 결합은 디니트로살리실산을 사용하여 비색 분석법으로 생성된 μ당량의 환원당으로 측정되며, 맥아당 점정곡선을 사용하여 맥아당 당량의 μ당량으로 표시한다. 이 시험을 행하기 위해 0.1ml의 아밀라제용액(20 내지 22Au/ml)을 pH 6.9에서 0.4ml의 0.02M 나트륨 글리세로포스페이트 완충액/0.001M CaCl₂혼액중의 0 내지 20μl의 시험 할 용액 또는 0 내지 10μg의 저해제와 혼합하고 이 혼합물을 35℃의 수욕에서 10 내지 20분간 평형시킨다. 그 다음 이 혼합물을 35℃에서 35℃로 미리 덥힌 1% 전분 용액 0.5ml와 함께 5분간 배양시킨 다음 1ml의 디니트로살리실산 시약(P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, Meth Enzymol., Vol.1, p.149)을 가한다. 발색시키기 위해, 이를 끓는 수욕상에서 5분간 가열하고 냉각시킨 다음 10ml의 중류수를 가한다. 540nm에서의 흡광도를 아밀라제를 가하지 않은 공시험과 비교 측정한다. 저해제를 가한 후 아직 효력이 남아 있는 아밀라제 역가를 미리 기록한 아밀라제 검정 곡선으로 사용된 아밀라제의 저해 %를 계산한다. 저해 %는 다음 식으로 나타내며 50% 저해점의 곡선을 읽은 후 저해제의 AIU/mg으로 전환 시킨다.

저해제의 ㎍

+ : 고체에 대한 ㎍

++ : 동계열의 대조 뱃치(batch)에서의 AU

[사카라제 시험]

사카라제저해제 1단위(1 SIU)는 2개의 사카라제 단위를 50%까지 억제하는 저해제의 양을 말한다. 사카라제 1단위(1 SU)는 특수한 시험 조건하에서 1분동안 서당 1μmol을 포도당 및 과당으로 분리 하는데 요하는 효소의 양이다. 생성된 포도당의 μmol을 사카라제에 의해 서당이 더 이상 분리되지 않는 조건하에서 포도당 산화 효소 반응에 의하여 정량적으로 측정한다. 이것을 시험하기 위하여 0.12SU로 맞춘 1) 사카라제 용액 0.05ml를 0 내지 20㎍의 저해제 또는 시험할 용액 0 내지 20㎕과 함께 혼합하고 pH 6.0인 0.1M 말레산 나트륨 완충액을 가하여 0.1ml를 만든다. 혼합물을 35℃에서 10분간 방치하고 35℃로 미리 가온한 pH 6.0인 0.1M 말레산 나트륨 완충액내 0.05M 서당 용액 0.1ml를 가한다. 혼합물을 35℃에서 20분간 배양하고 2) 포도당 산화 효소 1ml를 가하여 사카라제 반응을 중시킨 후 35℃에서 30분간 더 배양을 계속한다. 다음 50% 진한 황산 1ml를 가하고 상응하는 공시험을 대조로 하여 545nm에서 측정한다. 결과를 측정하기 위하여 사용한 사카라제의 저해 퍼센트를 포도당 검정 곡선을 이용하여 측정하고 50% 저해점으로 부터 SIU/g 또는 SIU/ℓ로 환산한다.

1) 돼지의 작은 창자의 점막으로 부터 얻은 가용성 사카라제를 pH 6.0인 0.1M 말레산 나트륨 완충액으로 적당량의 SU를 함유 하도록 희석한 것(B. Borgstrom, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958), 1997 페이지).

2) 포도당 산화효소제는 pH 7.0인 0.565M의 트리스 염산완충액 10ml에 포도당 산화효소 2mg을 녹이고 청정용액 1ml(트리톤×100 2g+95% 분석용 에탄올 8g), 디아니시딘 용액 1ml (0-디아니시딘 2HCl 260mg을 물 20ml에 녹인 것) 및 0.1% 과산화효소(peroxidase) 수용액 0.5ml를 가하여 만든다.

[말라제 시험]

말타제 저해 제1단위(1MIU)는 2개의 말타제 단위를 50%까지 저해하는 저해제의 양으로서 정의된다. 말타제 1단위(Mu)는 특수시험 조건하에서 1분동안 맥아당 1μmol을 포도당 2μmol로 분리 하는데 요하는 효소의 양이다.

생성된 포도당의 μmol은 말타제에 의하여 맥아당이 더 이상 분리되지 않는 조건하에서 포도당 산화 효소에 의해 정량적으로 측정된다. 이것을 시험하기 위하여 1) 0.060 내지 0.070Mu로 맞춤 0.05ml의 말타제 용액을 0 내지 20㎍의 저해제 또는 시험할 용액 0 내지 20㎕와 혼합하고 pH 6.9의 0.1M 말레산 나트륨 완충액으로 0.1ml으로 만든다. 혼합물을 35℃에서 10분간 방치하고 35℃로 이리 가온한 pH 6.0인 0.1M, 레산 나트륨 완충액내 0.05M 맥아당 용액 0.1ml를 가한다. 혼합물을 35℃에서 20분간 배양하고 2) 포도당 산화효소 1ml를 가하여 말타제 반응을 중단시킨 다음 35℃에서 30분간 더 배양을 계속한다. 이어서 50% 농 황산 1ml를 가하고 상응하는 공시험을 대조로 하여 545nm에서 측정한다. 결과를 측정하기 위하여, 사용된 말타제의 저해 퍼센트를 포도당 검정 곡선을 이용하여 측정하고 50% 저해점으로 부터 MIU/g 또는 MIU/ℓ로 환산한다.

1) 돼지의 작은 창자의 점막으로 부터 얻은 가용성 말타제를 pH 6.0인 0.1M 말레산 나트륨 완충액으로 적합한 Mu를 함유 하도록 희석한다(B.

A. Dahlquist, Acta Chem. Scand 12, (1958), p. 1,997).

2) 포도당 산화 효소제의 제조 : (사카라제 시험에서의 방법과 같이 만든다).

R이 포도당 잔기인 본 발명 화합물의 동족체를 각각 시험관 내에서 효소 저해 시험을 한 결과는 다음 표와 같다.

전술한 표에서 알수 있듯이 판크레아스-α-아밀라제에 대한 특수 저해제의 작용은 동족 체중에서 분자량이 증가함에 따라 증가한다 : 즉 시험관 내에서 n=5 내지 7인 화합물들은 n=1 또는 n=2인 화합물 보다도 100배의 효소 저해를 나타낸다. 반면, 사카라제 저해작용은 n=2인 유도체일 때 가장 좋으며, n=1인 유도체는 n=2인 경우의 1/2 정도의 효과를 내며 n이 더 큰 유도체들은 사카라제 억제의 특수한 작용면에서 볼 때 더 떨어진다. 서당 과식 시험에서의 생체내 작용은 시험관내 시험에서 볼수 있는 특수한 저해작용과 대략 비슷하다. 반면, 생체내 전분식사 시험에서 n=1, 2, 3인 화합물들은 시험관내 시험에서의 아밀라제 저해 효과와 비교 할때 10 내지 40배 증가된 작용을 가지고 있음을 알수 있다.

동물과 사람의 과혈당증은 탄수화물(예를 들면 곡분, 감자 전분, 과일, 과일즙, 맥주 또는 쵸크레트)을 함유하는 음식 및 음료를 섭취 시켰을 때 발생 하는데, 이는 다음과 같은 도식에 따라 배당체-가수분해 효소(타액성 아밀라제 및 췌액 아밀라제, 말타제, 사카라제)에 의하여 탄수화물이 급속히 분해되어 과혈당증이 일어나기 때문이다.

이러한 과혈당증은 특히 당뇨병의 경우 심하며 오래 지속된다. 비만증의 사람의 경우, 이러한 과혈당증은 자주 인슐린의 분비를 매우 왕성하게 하여 지방 합성을 증가시키고 지방분해를 감소 시킨다. 그러한 과혈당증에 이어 대사가 왕성하고, 지방질이 많은 사람에게 있어서는 이러한 인슐린 분비로 인한 저혈당증이 자주 발생한다.

위에 남아 있는 미즙(chyme)과 저혈당 증세는 위액의 분비를 촉진시켜 위염 또는 위궤양이나 십이지장궤양을 촉진 시킨다.

본 발명에 따른 배당체-가수분해 효소의 저해제는 쥐 및/또는 사람에게 밀전분이나 서당 또는 맥아당을 투여한 후 일어나는 과혈당증, 과인슐린증 및 저혈당증을 감소 시키며 탄수화물이 위를 쉽게 통과 하도록 촉진 시킴을 알수 있다. 또한 장에서의 포도당의 흡수를 억제함도 알수 있다. 또한 장에서의 포도당의 흡수를 억제함도 알수 있다. 더우기 탄수화물이 지방 조직의 지질(lipid)로 전환되며 음식으로 섭취한 지방이 지방 조직에 축적되는 것을 감소 시키거나 지연 시킨다.

탄수화물, 특히 서당이 입속에서 미생물에 의해 분해되어 충치의 생성을 촉진 시킨다는 사실도 잘 알려져 있는데, 배당체-가수분해 효소의 저해제는 다음과 같은 비만증, 지방과다증, 당뇨병, 당뇨병전기, 위염, 위궤양, 십이지장궤양, 충치 치료에 적합하다.

전술한 바와 같이 본 발명의 화합물들은 사람과 수의용 약제로서 사용된다.

본 발명의 화합물들을 유효 성분으로 하여 고체 또는 엑화 기체상의 희석재 또는 분자량이 200이하인 용매(계면 활성제 존재시는 예외)와 혼합하여 약학적인 조성물을 만들 수 있다. 또한 본 발명의 약학적인 조성물들은 멸균 용액이나 등장액의 형태로 만들어 질수 있다. 더우기 탄수화물을 함유하는 영양물질과 본 발명의 화합물을 함유하는 의약용 식품이나 음료를 만들 수도 있다.

본 발명의 화합물들은 정제, 당의정, 캅셀제, 환제, 앰플제 또는 좌제의 형태로 만들어 지며, 화합물자체 또는 희석제와의 혼합물을 함유할 수도 있다.

본 명세서에서의 "약제"란 의약용 투여에 적합한 것을 말하며 하루 1회 또는 수회(4회 까지)의 양을 각각 함유할 수 있다. "용량단위 형태의 약제"란 1일 용량 또는 수회(4회 까지) 또는 수분일회량(1/40까지)을 함유하는 투여에 적합한 부분을 뜻하며 본 약제가 1일량, 또는 1일량의 1/2, 1/3, 1/4을 함유함에 따라 각각 하루에 1회, 2회, 3회, 4회로 나누어서 투여한다.

본 발명에 따라 제조된 약학적인 조성물들은 겔제, 파스타제, 현탁제, 액제 및 유제, 시럽제, 과립제, 산제의 형태로 만들어 질수 있다. 정제, 드라기제, 캅셀제 및 환제 등의 약학적인 조성물에서 사용 되는 희석제는 다음과 같다.

a) 충진제 및 증량제 : 전분, 당, 만니톨 및 규산,

b) 결합제 : 카복시메틸 셀루로즈 및 다른 셀루로즈 유도체, 알기네이트, 젤라틴 및 폴리비닐 피롤리돈

c) 습윤제 : 글리세롤

d) 붕해제 : 한천, 탄산칼슘, 탄산수소 나트륨

e) 용해지연제 : 파라핀

f) 흡수촉진제 : 4급 암모늄 화합물

g) 계면활성제 : 세틸알콜, 글리세롤 모노스테아레이트

h) 흡착담체 : 카오린 및 벤토나이트

i) 활탁제 : 탈크, 칼슘 및 마그네슘 스테아레이트, 고형 폴리에틸렌 글리콜.

본 발명의 화합물의 정제, 드라기제, 캅셀제 및 환제는 유효 성분을 일정 시간에 걸쳐 장관의 특수한 부분에서 유리 시킬수 있도록 크팅, 캅셀이나 보호물질로 피복될 수 있다. 이들은 유효성분을 장관내 특정부위에 가능한한 장시간 방출 시키도록 되어 있으며, 이들은 중합물질 또는 왁스류로 만든다.

본 발명의 화합물을 좌제의 형태로 만들 때의 희석제는 보통 폴리에틸렌 글리콜이나 지방(크크아유, C₁₆-지방산과 C₁₄-알콜과의 고급 에스테르) 같은 수용성이나 수불용성 희석제 또는 그들의 혼합물이다.

파스타제나 겔제 등의 약학적인 조성물들은 통상의 희석제, 예를 들면 동식물 지방, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀루로즈 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탈크 및 산화아연 또는 그들의 혼합물을 함유할 수 있다.

산제인 약학적인 조성물들은 유당, 탈크, 규산, 수산화암모늄, 규산칼슘 및 폴리아마이드 분말 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 액제 및 유제인 약학적인 조성물들은 용매, 용제 및 유화제 같은 희석제를 함유할 수 있으며, 특수한 얘로는 물, 에틸알콜, 이소프로필알콜, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질알콜, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1, 3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아마이드, 유상물질 [콩기름], 글리셀롤, 테트라 하이드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 솔비톨의 지방산 에스테르 또는 그들의 혼합물이 있다.

비경구로 투여하기 위하여 액제 및 유제는 멸균 되어야 하며 혈액과 등장액이면 더욱 좋다. 현탁제인 약학적인 조성물들은 액체 희석제, 예를 들면 물, 에틸알콜, 프로필렌 알콜, 계면활성제(에톡실화한 이소스테아릴 알콜, 폴피옥시에틸렌솔비트 및 솔비탄 에스테르), 미세결정 셀루로즈, 알미늄메타 하이드록사이드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트 또는 그들의 혼합물을 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 모든 약학적인 조성물들은 착색제 및 방부제, 방향제, 풍미제(박하유, 정향유) 및 감미제(사카린)를 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적인 조성물들은 총 조성물의 중량당 0.1 내지 99.5%, 바람직 하게는 0.5 내지 95%의 유효 성분을 함유하는 것이 좋다. 또한 경구투여 할수 있는 당뇨증 치료제, 예를 들면 β-사이토트로픽 설포닐우레아 유도체 및 혈당량을 억제하는 비구아마이드를 함유할 수도 있다.

본 발명에 따른 의약용 식품으로서는 빵, 감자요리, 과즙, 맥주, 쵸크레트 등을 말하며 적어도 유효량의 한 화합물을 포함해야 한다. 정제, 환제, 드라기제, 캅셀제, 좌제 및 앰플제는 유효성분을 지속성인 형태로 만들어도 좋으며, 이들 약제의 1일 투여량은 150-3×10⁷AIU 또는 50-1×10⁶SIU의 유효성분이다.

전술한 약학적인 조성물 및 약제는 유효성분을 희석제와 혼합하여 약학적인 조성물(과립제)로 만든 다음 약제(정제)로 만드는 방법에 따라 제조한다.

본 발명의 유효성분들은 경구, 비경구(근육내, 복강내, 정맥내) 또는 직장 투여하며 경구투여가 좋다. 경구투여용 약제로는 현탁제, 액제, 환제, 정제, 캅셀제, 산제가 있다. 일반적으로 하루에 30-3×10^-5AIU/kg 또는 10-1×10⁴SIU/kg의 양을 투여하는 것이 좋다. 그러나 이들 투여량은 꼭 정해진 것은 아니며, 치료받는 환자 또는 동물의 체중이나 성질, 유효성분의 투여형태 및 조성물의 형태, 병의 증세의 경중에 따라 변화될 수 있다.

따라서 어떤 경우에서 상기에 언급된 양보다 적은 량으로도 소기의 효과를 볼수 있고, 또 어떤 경우에는 상기 언급된 양보다 많은 양을 사용하여야 한다. 더 많은 양을 사용할 때는 여러 차례로 나누어서 투여한다.

본 발명 화합물의 독성은 매우 적다. 실시예 4에서 제조한 화합물(26,000 SIU/g을 함유하는 제제)은 쥐나 생쥐에 경구 투여할 때 340,000 SIU/kg의 양에서 독성의 징후를 나타내지 않는다. 10,000 SIU/kg을 생쥐에 정맥내 투여 할 때에도 독성의 징후를 나타내지 않는다.

본 발명의 방법에서 사용 되는 부가제는 다음과 같다. 이온 교환제로서, 암버라이트 IRA 410 Cl^-(음이온 교환수지) 암버라이트 IRC 120(H⁺형)(강산 이온교환수지) 암버라이트(HCO₃ ^--형)(음이온 교환수지) : 암버라이트 IRA 410 OH^-(강염기 이온 교환수지) : 암버라이트 IRA 50 H⁺(약산 양이온 교환수지) 및 다우엑스 50W×4H⁺(강산이온 교환수지)이 있다.

셀루로즈-염기성 음이온 교환수지로는 DEAC-셀루로즈를 사용한다. 폴리아크릴아마이드 겔제로는 비오겔-P-2(Biogel-P-2)를 사용 할수 있다. 말트진(Maltzin)은 중성 맥아 엑기스이다. 레와폴(Lewa-pol)은 특성이 없는 흡착 수지이다.

다음 실시예 1 내지 11에서 본 발명의 대표적인 화합물들의 제법을 설명한다.

퍼센트는 별 다른 표시가 없는 한 중량 퍼센트이다. 모든 실시예에서 R은 포도당 단위로 이루어져 있다.

[실시예 1]

5.0%의 전분, 1.0%의 이스트 엑기스, 0.2% K₂HPO₄를 함유하는 영양액 8ℓ를 유리 발효관에 넣어 채우고, 3일간 진탕 플라스크에서 배양시킨 균주 SE 50/13(CBS 614.71)을 접종하고 이 혼합물을 강하게 교반하고 공기를 통해 주면서 28℃에서 3일간 배양시켜 105,000 AIU/ml를 갖는 육즙배양액을 만든다.

이 육즙배양액 6ℓ를 20℃로 냉각하고 HNO₃를 가하여 pH 2.5로 조정한 후 30g의 카보라핀(carboraffin)활성탄을 가하여 10분간 교반한다. 10,000r.p.m의 회전속도로 15분간 원심 분리하고 투명한 담황색 상등액을 NH₃로 중화한 다음 500ml로 농축 시킨다. 500ml의 농축물을 200g의 암버자이트 IRA 410Cl과 함께 45분간 교반하고 암버라이트는 여과해낸 다음 여액을 400ml의 메탄올로 처리해 고분자전분 분해산물 덩어리를 침전 시킨다(이때, 잔존하는 활성탄도 함께 침전된다). 이 혼합물을 5,000r.p.m의 회전속도로 5분간 원심분리 시키고 850ml의 상등액을 4ℓ의 무수 주정(spirit) 중에 강하게 교반 하면서 적가한다. 백색솜털 모양의 침전을 여과해 내고 무수 주정으로 3회 세척한 후 에테르로 2회 세척하여 50℃에서 진공, 건조시키면 10×10⁶AIU/g을 함유하는 백색분말 39g이 얻어진다.

본 제법은 다음에 이어지는 몇몇의 실시예의 경우에도 마찬 가지로 관계된다.

발효최종 생성물 및 최종 제제 조성물을 박충 크로마토그라피로 추적 하는데, 1㎕의 발효 영양배지 또는 1㎍의 본 제제를 실리카겔 TLC막(Messrs, Schleicher ＆

Dassel, F형 1,500)에 점적하고 n-부탄올/에탄올/물(50/30/20(V/V))로 2번 전개 시킨다.

사카라제 저해 작용을 알아 보기 위하여 전개시켜 잘 건조시킨 판에 효소겔(20ml/20×20cm판)을 분무하고 이 겔을 고화 시킨다. 이를 실온에서 습기가 있는 방에 5분간 미리 배양시킨 다음 기질겔(substrategel)을 잘 분무한다. 이 두번째 겔층이 고화한 다음, 이를 습기찬 방에 넣고 40℃로 배양하면 60 내지 90' 내에 발색(밝은 점, 주위는 적갈색)이 나타난다. 최적 발색시에 처치를 중지한 다음 따뜻한 공기를 불어 넣어 한천을 입힌 판을 건조 시킨다.

겔의 제조 :

효소 겔 : 1.5g의 아가로즈(L'Industric Biologique Francaise)를 pH 6.0의 0.2M 나트륨 말레이트완충액 100ml에 현탁 시키고 끓여서 용해 시킨다. 투명한 아가로즈용액을 50℃로 냉각시키고 250㎕의 트리톤 X-100용액(2g의 트리톤 X-100+8g의 시약급의 에탄올)과 0.5ml의 디아니시딘 용액(20mg의 디아니시딘/1ml의 아세톤)을 저어주며 가한다. 겔을 사용하기 바로 전에 1ml의 GOD/POD 시약(12.5mg의 글루코즈옥시다제, 순도 Ⅰ급(Messrs Boehringer, Order No. 15,423)과 2.5mg의 퍼옥시다제, 순도 Ⅱ급(Messrs, Boehringer, Order No. 15,302)을 5ml의 말레이트 완충액에 용해 시킨다]과 돼지 소장에서 얻은 4 내지 5개의 사카라제 단위를 가한다. 이 겔은 분무전에는 50℃에서 보관해야 하는데 그렇지 않으면, 분무공정시 노즐(nozzle)에서 고화하기 때문이다.

1) 효소의 제법은 "사카라제 시험"의 각 주 1)에서 서술된 바와 같다.

기질 겔 : 0.5g의 아가로즈를 pH 6.0의 나트륨 말레이트 완충액 100ml에 현탁 시키고 끓이면서 용해 시킨다. 이 용액을 50℃로 냉각 시키고 100μl의 트리톤(2g의 트리톤 X-100+8g의 시약급 에탄올)을 가하고 나서 1g의 서당(Serva No. 35,579)을 가한다. 서당이 용해된 후 이 겔을 바로 사용한다.

아밀라제 저해 작용을 알기 위하여 전개 건조시킨 박층 크로마토그라피 판에 아밀라제 겔(20ml/20×20cm판)을 분무 시키고 고화 되도록 방치한다. 실온에서 미리 5분간 배양한후, 이 판을 0.5% 전분용액(1g의 전분을 pH 6.9의 200ml 0.2M 글리세로포스페이트 0.01M CaCl₂완충액에 끓이면서 용해 시킨다)에 넣고 용액을 저어 주면서 40℃로 2분간 둔다. 이 판을 증류수로 잘 씻고 묽은 I₂용액(500ml의 물에 대해 4ml의 I₂저장용액 : I₂저장용액‥2.2g의 I₂+4.4g의 KI를 100ml의 물에 용해)에 넣어 분해되지 않은 전분을 발색 시킨다. 약 1분후 발색이 최적에 달하면 즉시 사진 찍는다(푸른 점이 곧 사라지기 때문).

아밀라제 겔의 제조 :

1g의 아가로즈를, pH 6.9의 0.2M 나트륨 글리세로포스페이트/0.01M CaCl₂완충액 100ml에 100℃에서 용해 시키고 50℃로 냉각시킨 후 100μl의 트리톤 X-100(2g의 트리톤 X-100+8g의 시약급 에탄올)을 가한다. 분무 바로 전에 100μl의 아밀라제 결정 현탁액(10mg의 돼지 췌장 아밀라제/포화 NH₄설페이트 용액 ml)을 가한다.

[실시예 2]

3% 포도당, 0.6%의 카제인 가수분해물, 1.6%의 이스트엑기스, 0.3% CaCO₃와 0.3% K₂HPO₄로 조성되며 살균전에 KOH를 가하여 pH를 7.8로 맞춘 120ml의 영양액을 함유하는 1ℓ 삼각플라스크에 균주 SE 50 110(CBS 674.73) 배양물을 접종시킨 후 회전 진탕기에서 24℃로 4일간 배양하여 10,800 SIU/ℓ를 갖는 배양액을 얻는데 이 배양액은 n=1인 본 발명에 따른 화합물을 주로 함유한다.

13,000r.p.m에서 균사체를 여과 제거한 배양여액 5ℓ를 HN0₃로 pH 2.5로 맞추고 55g의 활성탄 및 200g의 클라셀(clarcel)과 함께 15분간 교반한 다음 흡인 여과하여 고형물을 제거하고 여액을 농 암모니아로 pH 7로 중화 시킨다. 이 용액을 1.5ℓ로 농축하고 5배의 에탄올로 침전 시킨다. 이렇게 얻은 솜털모양의 침전을 12,000rpm으로 분리해 낸다음 황색 상등액을 150ml로 농축시키고 저속으로 원심 분리하여 극소량의 용해되지 않은 물질을 분리해 낸다. 이 용액 50ml를 암버라이트 IR-120(H⁺형)으로 채운 컬럼(30×300mm : 시간당 30ml의 물)에 넣는다. 불활성 당류와 저해작용을 갖는 비흡착 성분을 함유하는 용출물을 모두(300ml) 얻은 다음 이 교환 수지를 약 400ml의 물과 함께 비커에 옮긴다. 농 암모니아를 교반 하면서 가해 pH 11.5로 한다. 30분간 더 교반하고 나서 교환수지를 분리해 내고 여액을 1/20 양으로 농축하고 암버라이트 IRA-410(HCO₃ ^-형)을 함유하는 칼럼(20×150mm)에 통과하여 여과시킨 후 약 30ml/서간의 저속으로 500ml의 용출물을 모아 농축하고 친액화 시키면 1.3g의 조생성물이 얻어진다.

보다 더 정제하기 위해 이 조생성물을 바이오-겔 P-2, 100 내지 200메쉬(Messrs, Bio-Rad, Munich)에서 분별한다. 컬럼(50×450mm)을 사용하여 시간 40ml 유속으로 용출시켜 10ml씩 획분을 모은다. 모든 획분을 안트론(anthrone) 시험에 의해 탄수화물 시험을 하고 저해작용을 갖는 성분에 대한 사카라제 저해 시험을 한다. 사카라제 저해제를 함유하는 획분을 실시예 1에 따라 박층 크로마토그라피하여 각 성분에 대한 함량을 측정한다. n=1인 본 발명에 따른 화합물을 함유하는 분별물을 모아 농축친액화 시키면 n=1인 화합물 35mg을 얻는다(0.3×10⁶AIU/g 및 30,000 SIU/g). 생성물에는 성분 Ⅱ 58%가 함유되어 있다.

[실시예 3]

맥아당 1.3%, 포도당 3.5%, 카제인 가수분해물 0.5%, 이스트엑기스 1.3%, CaCO₃0.3%, K₂HPO₄0.3%로 구성된 영양액 120ml가 들어 있는 1ℓ 삼각 플라스크 각각에 하기 균주를 사용한 배양물 2ml를 접종 시키고 24℃의 회전진탕기 상에서 여러 균주를 4일간 배양 하였다.

상기 생성물은 주로 n=4인 화합물로 되어 있다.

[실시예 4]

포도당 3.5%, 맥아엑기스 건조분말 2.5%, 카제인 가수분해물 0.5%, 이스트엑기스 1.3%, CaCO₃0.3%, K₂HPO₄0.3%, 소포제 0.1%로 조성된 100ℓ의 영양액이 들어 있는 발효관에 상술한 실시예에 따른 5ℓ의 배양물을 접종 시키고, 교반하고 공기를 통해 주면서 24℃로 5일간 배양하여 73,000 SIU/ℓ를 갖는 배양액을 얻는다. 이것은 주로 n=2인 화합물을 함유한다.

균사체가 들어 있는 90ℓ의 발효 뱃취(batch)를 pH 측정기에서 농 HNO₃를 가하여 pH 2.5로 맞추고, 900g(=1%)의 활성탄을 교반 하면서 가해 생성된 색소물질을 흡착 시킨다. 이 혼합물을 15분간 교반하고 균사체 및 목탄을 3,000r.p.m의 회전속도를 원심분리로 분리한 후 상등액에 3kg의 클라셀(clarcel)을 가해최종적으로 압력 여과기로 여과한다. 60,000 SIU/ℓ를 갖는 황갈색의 투명여액 65ℓ를 얻는다.

이 여액에 농암모니아를 가하여 pH 7로 맞추고, 1,300g(2%)의 활성탄과 함께 30분간 교반하여 활성물질을 흡착 시킨다. 이 혼합물을 압력 여과기로 여과하고 활성탄 침전을 10ℓ의 증류수로 3회 씻는다. 목탄을 압착 건조하고 매번 15분간, pH 2.5에서 50% 아세톤 4ℓ로 3회 교반하여 목탄으로 부터 활성물질을 방출시킨다. 아세톤 방출액을 여과해서 목탄을 제거한 후 이를 모아서 회전증발기상에서 250ml로 농축하고, 250ml의 메탄올을 가한 다음 이 혼합물을 여과기로 여과한다. 여액(480ml)을 강하게 교반 하면서 5ℓ의 아세톤에 적가한다. 침전을 여과해 내고 아세톤과 에테르로 3회 세척한다. 이 여액을 35℃에서 진공, 건조시켜 8,500 SIU/g를 갖는 조생성물 230g을 얻는다.

상기 조생성물 25g을 1ℓ의 물에 용해하고 300g의 Dowex 50W×4H⁺(200 내지 400매쉬)와 함께 30분간 교반 시킨다. 수지를 여과해 내고 0.001N HCl 2ℓ로 3회 씻는다. 씻은 Dowex를 500ml의 물에 현탁 시키고 현탁액을 pH 측정기상에서 25% 암모니아를 사용하여 pH 9.0으로 맞춘다. 2번 더 0.6% 암모니아 500ml로 방출시키고 방출물을 합해 회전 증발기에서 100ml로 농축 시킨다. 이 농축물을 탈색시키기 위하여 2g의 DEAE-셀룰로즈(Messrs Schleicher ＆

No. 02035)와 5분간 교반하고 원심 분리한다. 담황색의 상등액을 동량(100ml)의 메탄올과 혼합하고 이 혼합물을 2ℓ의 아세톤에 강하게 교반 하면서 적가한다. 침전을 여과하고 아세톤과 에테르로 씻은 다음 35℃에서 진공, 건조 시킨다. 26,000 SIU/g를 갖는 배양액 4.2g을 얻는다. 더 정제하기 위해서 4.0g의 저해제를 0.5g씩 바이오겔 P-2를 통해 겔-여과 시킨다. 이 목적을 위해 0.5g의 조제물을 10ml의 물에 용해하고 이를 5×95cm의 바이오겔 P-2 컬럼(200-400메쉬)에 넣는다. 이 컬럼을 80ml/시간의 속도로 수중에서 전개 시킨다. 12ml 획분을 모아 총 탄수화물양(안스론시험, E 620에서 소멸)과 사카라제 저해제의 양 및 아밀라제 저해제의 양을 측정한다. 또 이 획분을 박층 크로마토그라피에 의해 시험한다(실시예 1에 따라 효소 저해작용 발색).

n=4 내지 6인 화합물을 함유하는 획분을 모아 진공하에서 10ml로 농축시킨 다음 200ml의 무수주정에 가해 침전 시킨다. 이 침전을 원심 분리하고, 아세톤과 에테르로 세척한 다음 진공하에서 건조 시킨다.

4.0g의 조생성물로 부터 17.5×10⁶AIU/g과 8,500 SIU/g를 갖고 n=4 내지 6인 화합물 0.2g을 얻는다. n=3의 화합물을 함유하는 획분으로 부터 위와 똑같은 방법으로(200ml의 아세톤)행해 얻은 조생성물 4.0g으로 부터 1.4×10⁶AIU/g와 21,000 SIU/g를 갖는 n=3인 본 발명에 따른 화합물 0.1g을 얻는다. n=2인 화합물을 함유하는 획분으로 부터 0.3×10⁶AIU/g과 68,000 SIU/g를 갖는 n=2인 화합물 0.9g을 분리해낸다.

생생물에는 성분 Ⅱ 5%, 성분 Ⅲ 85%, 성분 Ⅳ 3%가 함유되어 있다.

[실시예 5]

7.5%의 맥아엑기스 건조분말, 0.3%의 카제인 가수분해물, 0.7%의 이스트엑기스, 0.3%의 CaCO₃및 0.3%의 K₂HPO₄로 구성된 영양액 8ℓ가 각각 들어 있는 3개의 작은 발효관에 상술한 실시예에 따른 균주 SE 50/110(CBS 674.73) 배양물(5%)를 접종하고 24℃에서 5일간 배양하여 주로 n=2의 화합물을 함유하는 73 SIU/ml의 배양물을 얻는다. 균사체를 3,000rpm의 회전속도로 30분간 원심 분리하여 67,000 SIU/ℓ를 갖는 짙은 갈색 배양액을 얻었다. 이 용액을 HNO₃를 가하여 pH를 3.5로 맞ㅊ고 60g의 레와폴/ℓ=1.23kg을 가하여 탈색한다.

20분간 교반후 사이츠(seitz) K₃필터로 여과한 다음 이 탈색 배양액을 암모니아로 중화 시킨다(18.5ℓ, 67,000 SIU/ℓ). 20g의 활성탄/ℓ=370g을 가하고 교반하여 활성물질을 흡착 시킨다. 이 혼합물을 30분간 교반하고 나서 K₃필터로 여과한다. 여액(17.5ℓ, 3,600 SIU/ℓ)을 경사하고 활성탄 잔류물을 증류수 2ℓ로 3회 수세한다. 활성물질을 활성탄으로 부터 방출 시키기 위해 한번에 80% 아세톤 1ℓ와 함께 15분간 3회 교반하고 농염산을 가하여 pH를 2.5로 맞춘 다음 방출물을 모은다(2.4ℓ, 371,000 SIU/ℓ). 20g의 다우엑스 H⁺/ℓ(다우엑스 50W×4, H⁺형)=46g의 다우엑스를 이 방출물에 가하고 이 혼합물을 20분간 교반한다. 이 수지를 여과해 내고(다우엑스 획분 I) 약간의 75% 아세톤으로 씻는다. 여액과 세척액(3ℓ=215,000 SIU/ℓ)을 60g의 암버라이트 IRA 410(OH-형)/ℓ와 pH 7에 이를 때까지 교반한다. 이 혼합물을 여과하고 여액(2.8ℓ, 219,000 SIU/ℓ_을 72g의 다우엑스 H⁺와 혼합하고 20분간 교반한다. 교반 도중 암버라이트 410 OH^-로 채운 다공성 나일론 주머니를 이 혼합물 중에 매달아 놓아 pH를 3.0으로 유지한다. 다우엑스를 여과해 내고(다우엑스 획분 Ⅱ) 여액(2.6ℓ, 27,000 SIU/ℓ)을 경사한다.

다우엑스 획분 I과 Ⅱ를 각각 pH 3.5에서 75% 아세톤으로 각각 3회 세척하고 한번에 0.6% 암모니아 100ml로 3회 방출(다우엑스 획분 I)하거나 0.6% 암모니아 150ml로 3회 방출(다우엑스 획분 Ⅱ)시킨다. 첫번째 방출중에 (이 암모니아의 양은 다우엑스 수지를 중성화 하기에 충분치 않다). 농 NH₃를 가하여 pH를 9로 맞춘다. 다우엑스획분 I과 Ⅱ로 부터 얻은 3개의 방출물을 각각 모아 회전증발기상에서 거의 건조 되도록 농축 시키고 50ml의 물에 가한 다음 HCl을 가하여 pH 3 내지 4로 맞추고 50ml의 메탄올과 혼합한다. 이 용액을 1.5ℓ의 무수 아세톤에 교반 하면서 적가하고 침전을 여과해 낸다음 아세톤으로 3회, 에테르로 1회 세척하고 진공, 건조 시킨다.

수득량 : 획분 I 25,000 SIU/g를 갖는 물질 6.5g

획분 Ⅱ 36,000 SIU/g를 갖는 물질 12.3g

획분 I과 Ⅱ는 저해제인 n=2의 화합물과 소량의 n=3의 화합물을 함유한다.

생성물에는 성분 Ⅱ 5%, 성분 Ⅲ 85%, 성분 Ⅳ 2%가 함유되어 있다.

다음 표는 상기 제조물의 사카라제 저해능을 나타낸 것이다.

[실시예 6]

실시예 1에 따른 제조물 200g을 증류수 940ml와 60ml의 농황산에 용해하고 이 혼합물을 4시간 환류 시키면서 가온한다(내부 온도 : 98 내지 100℃, 유욕의 온도 : 140℃) 10g의 활성탄을 냉각시킨 이 흑갈색 용액에 가하고 이 혼합물을 1시간 교반 시킨다. 활성탄을 여과해 내고 물로 세척한 후 여액에 약 250ml의 10NKOH를 가하여 pH를 7 내지 8로 맞춘다. 이 용액을 50g의 활성탄과 함께 1시간 교반하고 이 목탄을 여과해낸 다음 2ℓ의 물로 세척하여 여액을 경사한다. 활성탄을 2ℓ의 30% 알콜과 밤새 침지시켜 유효화합물을 방출 시키고 마지막으로 이 목탄을 여과해낸 후 이 알콜성 용액을 회전 증발기상에서 농축시킨다. 잔류물 : 6.2g이 조생성물 6.2g을 500ml의 물에 용해하고 이 용액을 30g의 암버라이트 IR 120(H⁺형)과 1시간 약하게 교반한다. 교환수지를 여과해 내고 여액이 중성이 될 때까지 증류수로 세척하면 포도당이 유리한다. 이 교환수지를 15ml의 25% 암모니아와 함께 1,000ml의 수중에서 밤새 교반하고 분리 경사한다. 여액을 회전증발기상에서 농축 시킨다.

잔류물 : 3.7g

더 정제하기 위해서 셀루로즈상에서 크로마토 그라피 한다. 교환수지로 부터 방출시킨 4.5g의 물질을 셀루로즈로 채운 2.5cm/1m의 컬럼에 넣는다. 용출재로는 5 : 1 에탄올/물이고 3 : 1의 에탄올/물은 n=1인 화합물을 용출시킬 목적으로 처음에 사용한다. 14ml의 획분들을 분당 20방울의 속도로 모은다. 각개 획분을 박층 크로마토그라피로 검사한다. 농축후 획분 47 내지 85로 부터 n=1인 화합물 1.6g을 얻는다(엷은 갈색으로 변색)이 변색된 불순물을 정량적으로 미미하다. 만일 배취법에 의하지 않고 강산 이온 교환수지로 컬럼에서 정제하면 n=1인 화합물을 무색 수지상의 물질로 얻는다.

[실시예 7]

실시예 1에 따른 제조물 200g을 940ml의 증류수와 60ml의 농황산 중에 용해하여 이 용액을 15분간 환류 시키면서 가온한다(내부온도 : 98℃ 내지 100℃; 유욕온도 : 140℃). 10g의 활성탄을 냉각시킨 이 흑갈색 용액에 가하고 이 혼합물을 1시간 교반한다. 이 활성탄을 여과하고 물로 세척한 후 여액에 약 250ml의 10N KOH을 가하여 pH를 7 내지 8로 맞춘다. 이 용액을 50g의 활성탄과 함께 1시간 교반시킨다. 활성탄을 여과하고 2ℓ의 물로 세척하여 여액을 경사 시키고 30% 알콜 2ℓ중에서 밤새 침지 시킨다. 이 목탄을 여과하고 알콜성 용액을 회전 증발기상에서 농축시켜 8.0g의 잔류물을 얻는다.

이 잔류물을 15ml의 물에 가해 2.4×20cm의 컬럼(50g의 암버라이트 IR 120(H⁺형))에 채운다. 이 용액을 분당 3방울의 속도로 흡수 시키고 모든 비염기성 성분이 제거 될 때까지 컬럼을 물로 씻는다. 이 염기성 생성물을 0.5% 암모니아로(12방울/분) 컬럼으로 부터 용출 시키고 이 수용액을 회전 증발기상에서 증발, 건조한다.

잔류물 : 4.1g

2g의 잔류물을 소량의 물에 용해하고 세파덱스 G-15로 채운 컬럼(3.0×200cm)에 넣는다. 이 컬럼을 물로 용출 시킨다. 각 2ml의 획분들을 8ml/시간 속도로 모은다. 이 각개의 획분들을 박층 크로마토그라피에 의해 검사한다. 획분 85 내지 94로 부터 50,000 SIU/g의 효과를 갖는 n=2인 화합물 280mg을 얻는다.

[실시예 8]

실시예 1에 따른 제조물 2g을, 1mM의 CaCl₂를 함유하는 pH 6.9의 20mM 나트륨 글리세로포스페이트완충액 60ml 중에서, 아스 페르길루스종(Serva No. 13,418)으로 부터 얻은 1g의 α-아밀라제와 함께 7℃에서 계속 교반 하면서 120시간 동안 배양하고 최종 5분간은 100℃로 가열한 다음 용해되지 않은 물질을 4,000r.p.m으로 원심분리해내고 이 용액을 친액화하여 1.9g의 생성물을 얻고 이를 실시예 1에 따라 박층 크로마토그라피하고 사카라제 저해제를 발색시켜 존재하는 저해능을 가지는 화합물이 주로 n=1 내지 3의 화합물 임을 알아냈다.

[실시예 9]

실시예 1에 따른 제조물 2g을 pH 4.8의 20mM 아세테이트완충액 30ml 중에서 37℃에서 계속 흔들어주면서 120시간 감자로 부터 얻은 β-아밀라제 1.25mg과 함께 120시간 배양하고 5분간 100℃로 가열한 다음 불용성 물질을 4,000r.p.m으로 원심분리 해낸후 침액화하여 1,800 SIU/g과 3.8×10⁶AIU/g의 효과를 갖는 생성물 1.5g을 얻는다. 이 생성물을 실시예 1에 따라 박층 크로마토그라피와 사카라제 저해 발색시험을 하면 존재하는 저해능을 가지는 화합물이 주로 n=2 내지 3의 화합물임을 알수 있다.

[실시예 10]

0.1%의 K₂HPO₄, 0.2%의 (NH₄)₂SO₄, 0.05%의 MgSO₄, 0.05%의 KCl, 0.01%의 FeSO₄및 2%의 실시예 1에 따른 제조물로 구성된 25ml의 영양액이 들어 있는 200ml의 삼각 플라스크에 아스페르길루스 나이거 ATTC 11,394의 포자 현탁액을 접종하고 회전 진탕기에서 28℃로 배양하면 6일 후 AIU 농도가 210,000 AIU/ml에서 53,000 AIU/ml로 저하되고 10일 후에는 21,300 AIU/ml로 저하된다. 동시에 SIU/ml 함량이 7.0에서 72 SIU/ml로 증가된다.

10일간 포자 현탁액과 함께 배양한 20ml의 용액을 30분간 3,000r.p.m으로 원심분리 해내어 균사체를 분리 시킨다. 15ml의 상동액(72,000 SIU/ℓ)을 2g의 암버라이트 IRC 50H⁺와 1g의 암버라이트 IRA 410OH^-(전도율이 2m Siemens 이하인)와 함께 30분 교반하여 탈염(desalinate) 시킨다. 이 혼합물을 여과하고 여액을 0.001N HCl 중에서 평형시킨 다우엑스 H⁺의 컬럼(1cm×10cm)에 5ml/시간 속도로 통과시킨다. 이 컬럼을 0.001N HCl 200ml로 씻는다. 0.6% 암모니아 용액을 컬럼에 가하여 방출 시키고(10ml/시간) 5ml의 획분들을 모은다. 사카라제 저해 작용을 갖는 획분을 모아 회전 증발기상에서 2ml로 농축하고 2ml의 메탄올과 혼합한다. 이 용액을 pH 3 내지 4로 맞추고 100ml의 아세톤에 적가하여 침전 시킨다. 침전을 여과하고 아세톤과 에테르로 씻은 후 진공하에서 건조 시킨다. 28,000 SIU/g를 갖는 n=2 내지 3인 화합물로 구성된 생성물 26mg을 얻는다. 이 생성물로 부터 n=2인 화합물을 순수하게 분리하기 위해 실시에 4에 따라 바이오겔 p-2를 함유하는 컬럼으로 겔 여과한다. n=2이며, 60,000 SIU/g를 갖는 화합물 7mg을 얻는다.

[실시예 11]

실시예 2에 따라 발효 뱃취를 1,300r.p.m에서 원심 분리하여 균사체를 제거하고 13,000 SIU/g의 효과를 지니는 배양 여액 2ℓ를 2.5부의 암버라이트 IRC-50(H⁺형)과 1부의 암버라이트 IRA-410(OH형)의 혼합물 500g과 함게 환원시켜 염의 함량을 감소 시킨다(배양 여액의 전도도 : 약 10ms). 교환수지를 분리해내고 용액을 100ml 보다 약간 작게 농축시킨 다음 20,000r.p.m에서 15분간 원심 분리하여 불용성 성분을 제거한다. 상등액을 100ml로 하면 전도율은 3.5ms가 되고 이를 더 정제하기 위해 p-셀루로즈컬럼(55×400mm)에서 크로마토그라피 한다. 용출제로는 5mN 암모늄 포스페이트완충액(pH 5.5)을 사용하고 유출속도는 90ml/시간이며 18ml의 획분이 모아진다. 용출획분의 탄수화물 함량 및(안트론시험) 사카라제-저해제 성분함량을 시험한 후(사카라제 저해시험), 안트론시험에서 거의 유리 탄수화물로 증명되고 동시에 사카라제 저해 시험에서 특히 활성을 지는 것으로 입증된 획분을 모아(획분 60-170) 150ml로 농축하고 암버라이트 IRA-410(HCO₃ ^-형)을 함유하는 컬럼(50×300mm)을 통하여 여과한다. 탈이온화를 보다 잘 조절하기 위해 용출물을 모으고(20분간 1획분당 10ml) 탄수화물 시험(안트론 시험으로 : 각 경우 실제로 음성), 인산염시험(아스콜빈산 몰리브데이트시약으로 : 각 경우 음성), 사카라제 저해시험(효소 저해시험으로)을 행한다. 저해능을 갖는 획분(3-30)을 합하여 농축, 친액화, 재용해, 친액화하여 280mg의 조 저해제를 얻는다. 좀더 정제하기 위하여 실시예 2에서와 같이 바이오겔 p-2상에서 분류하고 친액화시켜 n=1인 본 발명에 따라 함유하는 획분으로 부터 0.3×10⁶AIU/g와 35,000 SIU/g를 갖는 생성물 30mg을 얻는다.

Claims (1)

1. 호기적 조건하에 악티노폴라나세아에과에 속하는 SE 50(CBS 961.70), SE 18(CBS 957.70), SE 82(CBS 615.71), SE 50/13(CBS 614.71) 혹은 SE 50/110(CBS 674.73) 중에서 선택한 하나의 균주를 액체 배지에 배양하여 얻은 배양물에서 다음 구조식(Ⅰ) 화합물을 분리 하거나 미생물에 의한 방법 또는 화학적 또는 효소적 가수 분해에 의해 다음 구조식(Ⅰb)의 R₂에서 필요한 만큼의 포도당 단위를 분해 해내어 다음 구조식(Ⅰa) 화합물로 전환시켜 구조식(Ⅰ)의 아미노 슈가 유도체의 제조방법.

   

   상기 구조식에서 R은 1 내지 3개의 포도당 단위이고, R¹및 R²는 R과 같으나, R²는 R¹보다 많은 포도당을 함유한다.

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