DE2347782C3 - Aminozuckerderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

HO

HO—<

OH CH,

OH

OH OH OH OH

CH₂OH
3. Aminoziickerderivat nach Anspruch I der Formel

HO OH CH, CH₁OH

HO—< > N < >

— O

OH

OH OH OH OH OH OH

CK,OH

4. Verfahren zur Herstellung von Aminozuckerderivaten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Gattung Actinoplanes in einem wäßrigen, stärkefreien, Glucose- und/oder Maltose-enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei pH 5,0 bis 8,5 und 15 bis 45°C züchtet und anschließend die Aminozuckerderivate durch Adsorption und Desorption an Aktivkohle isoliert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses mit dem Actinoplanes-Stamm SE 50/110(CBS 674.73) durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung inerter Saccharide von den Verbindungen gemäß Anspruch 1 an Kationenaustauschern vornimmt.

7. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Aminozuckerderivaten gemäß Anspruch Inhibitoren gehören chemisch in die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide bzw. deren Derivate.

Die meisten der Inhibitoren aus dieser Gruppe sind hochpotente Amylaseinhibitoren, aher nur mittelstarke oder schwache Saccharaseinhibitoren (siehe DE-OS 20 64 092).

Es wurde nun gefunden, daß man neue Aminozuckerderivate der allgemeinen Forme!

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Aminozuckerderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel, insbesondere Mittel gegen Diabetes und Adipositas, entsprechend den vorstehenden Patentansprüchen.

Es ist bereits bekanntgeworden, daß eine Reihe von Actinomyceten, vor allem die Actinoplanaceen, Inhibitoren für Glycosidhydrolasen, vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme des Verdauungstraktes, bilden. Eine Gruppe dieser Inhibitoren ist relativ hitzestabil und bei RaumtemDeratur saure und alkalistabil. Diese HO

OH

CH,

HO

— N

OH

OH

CH₇-C)H

in der R einen Mono-, Di- oder Trisaccharidrest mit 1 bis 3 Hexoseeinheiten bedeutet, erhält, wenn man Mikroorganismen der Gattung Actinoplanes in einem wäßrigen, stärkefreien, Glucose- und/oder Maltose-enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei pH 5,0 bis 8,5 und 15 bis 45°C züchtet und anschließend die Aminozuckerderivate durch Adsorption und Desorption an Aktivkohle isoliert.

Weiterhin wurde gefunden, daß die neuen Aminozuckerderivate starke Inhibitoren für Glycosidhydrolasen des Verdauungstraktes sind. Dabei zeigen die niederen Glieder, in denen R ein Mono- oder Disaccharidrest ist, vorwiegend starke Hemmung von Saccharase, die Verbindung, in der R ein Trisaccharidrest ist, vorwiegend starke Hemmung von Amylase.

Überraschenderweise besitzen die erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate eine höhere spezifische

Hemmaktivität gegenüber Saccharase bzw. Amylase als die bereits bekannten Inhibitoren. Dabei fällt als besonders merkwürdig auf, daß einige der neuen Aminozuckerderivate in vivo eine um ein Vielfaches höhere Hemmwirkung besitzen als ihrer in vitro-Hemmwirkung entspricht

Als besonders überraschend ist außerdem anzusehen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen die Glukoseresorption in vivo inhibieren. Auf Grund dieser überraschenden Eigenschaften stellen die neuen Amino- ι ο zuckerderivate eine Bereicherung des Arzneimittelschatzes dar. Als Beispiele der Stämme der Gattung Actinoplanes seien die Stämme Actinoplanes spec. SE 50 (CBS 961.70), SB 18 (CBS 957.70) und SE 82 (CBS 615.71) genannt Diese Mikroorganismen sind bereits im südafrikanischen Patent Nr. 71/8677 beschrieben und sind unter den in Klammern aufgeführten Nummern im Centralbureau vor Schimmelcultures in Baarn/Holland hinterlegt.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können weiterhin — wie auch schon in der südafrikanischen Patentschrift Nr. 71/8677 beschrieben — Mutanten oder Varianten aus diesen Stämmen verwendet werden. Besonders geeignet erwiesen sich im Hinblick auf die Gesamtausbeute an den erfindungsgemäßen Aminozuckerderivaten und/oder im Hinblick auf die Größe des Restes R im Gemisch der bei der Fermentation gebildeten Aminozuckerderivate die Stämme SE 50/13 (CBS 614.71) und SE 50/110 (CBS 674.73). Beide Stämme entsprechen in ihrer Beschrei- jo bung weitgehend dem Elternstamm SE 50. Diese Stämme sind ohne Anwendung von Mutagenen durch natürliche Auslese aus Stamm SE 50 gewonnen worden.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet man feste und flüssige, insbesondere flüssige, wäßrige Nährböden, die neben Kohlenstoffquellen Stickstoffquellen, Salze und Antischaummittel in den üblichen Konzentrationen enthalten. Die Konzentrationen können in weiten Grenzen schwanken.

Als Kohl^nstoffquellen dienen vorwiegend Kohlenhydrate, insbesondere Maltose, Glucose und Gemische von zweien (oder dreien) dieser Stoffe, aber auch komplexe Gemische wie z. B. Malzextrakt.

Als Stickstoffquellen können die in der Mikrobiologie üblichen komplexen Gemische wie z. B. Kaseinhydroly- 4-, sat, Hefeextrakt, Pepton, Fischmehl, Fishsolubles, Maisquellwasser, Fleischextrakt und auch Mischungen ebenso wie Aminosäuren und/oder Ammoniumsalze verwendet werden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Ver- -,<> fahrens wird aerob im allgemeinen in belüfteten Schüttelkuituren oder in Behälterkulturen gearbeitet. Die Art und die Konzentration der Kohlenstoffquelle beeinflußt in Kombination mit dem jeweiligen zur Fermentation verwendeten Stamm die Art des Endpro- v, dukts im Hinblick auf die Größe des Restes R so weit, daß man einzelne Glieder der homologen Reihe oder zumindest einen sehr engen Bereich von Homologen nahezu selektiv herstellen kann. Es hat sich dabei gezeigt, daß in stärkefreien Nährlösungen und insbeson- bo dere bei Zugabe von Maltose zur Nährlösung, insbesondere mit dem Stamm SE 50 (CBS 961.70), vorwiegend Aminozuckerderivate mit 2 bis 3 Hexoseeinheiten gewonnen werden können. Besonders geeignet zur Herstellung des erfindungsgemäßen Amino- hi zuckerderivats mit R = Glucose haben sich Nährlösungen erwiesen, die allein Glucose als Kohlenstoffquelle enthalten. Enthält die Nährlösung Glucoseüberschuß, so werden bei längerer Fermentationsdauer auch die längerkettigen Aminozuckerderivate gebildet Min kann das in gewissen Grenzen unterbinden, daß bei der Fermentation die Erschöpfung der Stickstoffquellen zeitlich mit der Erschöpfung der Glucose zusammenfällt Verzichtet man bei den Nährlösungen ganz auf Glucose und gibt als Kohlenstoffquelle Maltose, so erhält man überwiegend das Aminozuckerderivat mit 2 Hexoseeinheiten. Dabei kann man auch die reine Maltose durch billigere Gemische wie natürliche Malzextrakte ersetzen. Dem Gehalt an Maltotriose entsprechend, wird dann auch das nächsthöhere Homologe mitgebildet Besonders geeignet für die Herstellung erwies sich der Stamm SE 50/110, der in optimalen Nährlösungen etwa die doppelte Ausbeute ergibt als der Stamm SE 50/13.

Bei den Fermentationen kann die Zusammensetzung der übrigen Nährlösung, insbesondere die Konzentration der Stickstoffquellen und die Salzzusammensetzung in weiten Bereichen schwanken.

Die Nährmedien werden in des üblichen Weise sterilisiert Die pH-Werte der Nährlösung liegen zwischen 5,0 und 8,5, vorzugsweise zwischen 6,0 und 7,8. Die Bebrütungstemperaturen liegen zwischen Ϊ5 und 45⁰C, vorzugsweise zwischen 24 und 32⁰C. Die Kulturcrauer beträgt 1 bis 8 Tage, vorzugsweise 2 bis 6 Tage. Längere Kulturdauer, besonders bei Kohlenhydratüberschuß, begünstigt die Bildung höherer Homolo ger. Der Endpunkt der Fermentation wird durch Bestimmung des Gehaltes an Hemmaktivität im enzymatischen Hemmtest und durch dünnschichtchromatografische Bestimmung der Zusammensetzung bestimmt.

Die erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate lassen sich auch durch Abspaltung von Hexoseeinheiten aus höheren Homologen gewinnen. Die Abspaltung geschieht entweder mit wäßrigen Säuren, insbesondere mit 1 - bis 5normalen Mineralsäuren bei Temperaturen von 50 bis 100⁰C, insbesondere bei Temperaturen von 90 bis 100⁰C, in 10 bis 180 Minuten oder durch Ink-'bation mit Enzymen (Hydrolasen), insbesondere mit ß-Amylasen oder nichthemmbaren a-Amylasen oder Amyloglucosidasen mikrowellen Ursprungs, wie z. B. a-Amylasen aus B. substilis, oder durch Inkubation mit Mikroorganismen, die in Nährlösungen, welche die höheren Homologen der erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate in Gehalten von 1 bis 10%, vorzugsweise 2 bis 5%, inkorporiert vorzugsweise alleinige Kohlenstoffquelle enthalten, zu wachsen vermögen, wie z. B. Aspergillus niger ATCC 11394.

Die Isolierung unii Reinigung der erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate geht aus entweder von mikrobiologischen Kulturbrühen oder von sauren Hydrclysaten oJer von Inkubationsgemischen, in denen der enzymatische und/oder mikrobiologische Umbau oder Abbau höherer Homologer der Aminozuckerderivate durchgeführt wurde.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen isoliert man vorzugsweise dur-h Adsorption an Aktivkohle bei neutralem pH mit anschließender Desorption mit wäßrigen Alkoholen oder Aceton, vorzugsweise 50- bis 8O°/oigem Aceton. Besonders vollständig gelingt die Desorption bei sauren pH-Werten im Bereich von pH 1,5 bis 4, vorzugsweise pH 2 bis 3.

Wenn die Ausganjslösungen sehr dunkel gefärbt sind. werden sie vor der Adsorption der erfindungsgemäßen Substanzen mittels Aktivkohle bei sauren pH-Werten (pH 1 bis 3) oder mit einem Adsorptionsharz mit

0,35-mm-Körnung im Bereich von pH 2 bis 7, vorzugsweise bei pH 2 bis 3, entfärbt. Die Aktivkohle bindet nur im sauren Bereich bevorzugt Farbstoffe, während das Harz die inhibitorisch aktiven erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate weder im Neutralen noch im Sauren adsorbiert.

Zur Abtrennung der hemmaktiven Aminozuckerderivate von inaktiven Sacchariden und anderen hemmaktiven Verbindungen nutzt man den schwach basischen Charakter dieser Komponenten aus. Unter geeigneten Bedingungen (pH I bis 8, vorzugsweise pH 2 bis <!■; bei niedriger lonenstärke, entsprechend einer Leitfähigkeil < 1OmS, vorzugsweise < 2 mS) werden die homologen Aminozuckerderivate von stark sauren Kationenaustauschern in der H + -Form gebunden. Besonders gut lassen sich die hemmaktiven Aminozuckerderivate aus acetonischer Lösung (50 bis 80% Aceton, pH 1 bis 5, i/Ar'xirrcuinico rt I-I O K ic A\ ort bTatis~in«>naiict α t ic/"">hp»r

binden, die unter diesen Bedingungen eine wesentlich höhere Kapazität für die Substanzen zeigen. Unter der Voraussetzung, daß die Lösung mehr als 50% Aceton enthält, gelingt die Bindung auch an schwach saure Austauscher(H ⁺ -Form)recht gut.

Zur Desorption der erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate von den Kationenaustauschern verwendet man am besten wäßrige Ammoniaklösungen. Aus den Desorbaten zieht man den Ammoniak im Vakuum ab und gewinn! die inhibitorisch aktiven Aminozuckerderivate nach Einengen der Lösung durch Lyophilisation oder Fällung mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise mit 10 bis 20 Volumina Aceton.

Weiterhin gelingt es, niedermolekulare hemmaktive Aminozuckerderivate von inerten Sacchariden durch Chromatographie an Austauschern auf Cellulose-Basis, vorzugsweise Phospho-Cellulose, abzutrennen. Als Laufmittel werden dabei Puffer, vorzugsweise Phosphatpuffer, von geringer lonenstärke, vorzugsweise 2 bis 100 mM, insbesondere 5 bis 1OmM, im pH-Bereich von 2,5 bis 8, vorzugsweise bei pH 5 bis 6, verwendet. Voraussetzung für eine effektive Fraktionierung sind möglichst eerinee Salzgehalte in den zu fraktionierenden Präparaticnen, während Farbstoffe weniger stören.

Zur Remdarstellung der einzelnen Glieder aus der erfindungsgemäßen homologen Reihe inhibitorisch aktiver Aminozuckerderivate Chromatographien man die vorgereinigten Präparate über ein geeignetes Molekularsieb, z. B. ein Polyacrylamid-Gel, und untersucht die Fraktionen des Eluats dünnschichtchromatographisch. Fraktionen, welche die Aminozuckerderivate rein enthalten, werden vereinigt, rechromatographiert und schließlich nach Einengen lyophilisiert oder mittels organischer Lösungsmittel, wie oben beschrieben, gefällt.

Die erfindungsgemäßen Substanzen gehören ihrer chemischen Natur nach zur Substanzklasse der Kohlenhydrate. Sie bilden homologe Reihen, als deren Grundkörper das folgende Aminozuckerderivat

[C₁₉H₃₃O₁₃N] anzusehen ist.(R = Hexose)

HO

!1O --

(H,OH

OH

--N

OH

— R

OH

Die höheren Glieder leiten sich nun vom Grundkör per in der Weise ab, daß sie jeweils eine Einheit eine Monosaccharids, vorzugsweise einer Hexose, insbeson dere von Glucose, zusätzlich enthalten.
■> Alle Glieder solcher homologer Reihen sind weiter hin dadurch gekennzeichnet, daß sie bei saure Totalhydrolyse »Komponente I«

[CnH„,O,N]

in sowie das entsprechende Monosaccharid liefern. Fu »Komponente I« wurde nachstehende Strukltirformc hergeleitet:

OH

HO

HOII, C

OH

Il

ι OH
Il C OH

CH₁

·> Komponente

Als Beispiel für das Strukturprinzip einer homologer Reihe sei der Fall genannt, in dem die Oligosaccharid kette aus 1 bis 3 Glucoseeinhei'^n besteht. (In de Formel bedeutet R hier einen Mono-, Di- ode Trisaccharidrest mit 1 bis3Glucoseeinheiten.):

IK)
HO
HOII,C

Oll CM,

OH

OH

Der Grundkörper der Reihe liegt vor, wenn R = Glucose ist und wird als »Komponente II« bezeichne! Jedes Glied der Reihe unterscheidet sich von nächstniederen bzw. nächsthöheren durch eine fehlendi bzw. zusätzliche Glucoseeinheit.

Die im Vergleich zu »Komponente II« um eini Glucoseeinheit größere Verbindung wird dabei al »Komponente III« bezeichnet, die um 2 Glucoseeinhei ten größere Verbindung als »Komponente IV«.

Alle diese Verbindungen sind dadurch gekennz^;ch net, daß sie bei saurer Totalhydrolyse »Komponente I< und Glucose liefern.

»Komponente II« läßt sich in ihren physiko-chemi sehen Eigenschaften, ihrer Struktur und Reaktivitä folgendermaßen charakterisieren:

Komponente II ist eine farblose, amorphe Festsub stanz mit guter Löslichkeit in H2O, DMF, DMSO unc MeOH. In der Hitze ist sie auch in Äthanol löslich.

a) Dünnschichtchromatographie

Fließmittel
Essigester/MeOH/H₂O 10:6:4

I. DC-Fertigfolien F 1500 Kieselgel

Kf-Werte:

II: 0,46

Maltose: 0,50

Glucose: 0,65

II. DC-Fertigplattcn F" 254 KJesclgel

Rf-Wertc:

II: 0.47

Maltose: 0.54

Glucose: 0.66

Zum Sichtbarmachen von Il auf Kieselgelplatten benutzt man am besten das AgNO)/NaOH-Sprühreagens. [{ine braunschwarze Anfärbung erfolgt schon bei Raumtemperatur oder nach geringfügigem Erwärmen.

ο in ppm Mullipli/ilal

b) Drehwinkel

Eine durch Einengen einer methanolischen Lösung von Il gewonnene, nichtkristalline Probe von Il wurde in Wasser gelöst und die spezifische Drehung zu [λ]π + 134,3° bestimmt.

c)IR-Spektrum

Wenig aussagekräftiges, schlecht strukturiertes IR-Spektrum in KBr. Hauplabsorptionsbanden im Bereich der O - H- und C - O-Valenzschwingungen.

d) NMR-Spektrum in CD₃OD bei 220 MHz (Fig. 1)

Relative Intensität

3.¹)

4.48 u. 5.1

»Triplett«. J, u. J_, 8-10 11/. »Triplett«: J₁ u. J_; 7- ⁽)||/ Signale sind nicht ein/ein zuzuordnen! ΛΗ-Sysiem: J - 12 11/ Duhletl; J - 711/ ( Dublett: J - 2.5 II/ j Singlett

Dublett; J - 2-3 II/ (schlecht aufgelöst) Dublett; J - 3-4 II/ (schlecht aufgelöst)

e) Acetylierung von Il

Il wird in einem 1 : !-Gemisch aus Acetanhydrid und Pyridin bei Raumtemperatur zu einem Dekaacetylderivat umgesetzt (Molgewicht: 903). Wird die Reaktion in Eisessig/Acetanhydrid 1:1 mit katalytischen Mengen H2SO4 durchgeführt, so läßt sich neben dem Dekaacetylderivat auch die Bildung eines Undekaacetylderivats (Molgewich'.: 945) massenspektroskopisch nachweisen.

NMR-Spektrum des Dekaacetylderivats (Fig. 2) .

MS-Spektrum des Dekaacetylderivats

Molekelpeak: 903 (2,5% rel. Intensität) Basepeak: 843

Wichtige Fragmentpeaks im oberen Massenbereich: 844 (55% r. I.)

-JOA /ncf\L - ι \ / OT ^JU7U I . l.f

783 (34% r. I.) I Il

I Il

1211

211

1 Il

Il Il gegen Deuterium ausgetauschte Protonen I II
1 II

759 (35% r. I.) 556 (36% r. I.) 496 (37% r. I.) 436 (29% r. I.)

f) Methylierung von II

Die Methylierung von 11 mit CH₃JZNaH in Dimethylsulfoxid nach Hakomori ergibt als Hauptprodukt das

L^CiväiViCiiiyivjCriVät VOu Ii til gCinigt:! iviuugc ductl u«aa

Undekamethylderivat.

Massenspektrum

Molekelpeak: 623 (6,1 % relative Intensität)

Basepeak: 535

2. Molekelpeak: 637 (0,2% r. I.)

S-)ektroskopische Daien und chemische Eigenschaften ergeben die folgende Struktur für 11:

HO

HO —

CH,OH

OH

CH,

OH

CH₂OH

- O

O

OH

OH

OH

II liegt als Gemisch einer α- und /?-Form vor, wie insbesondere die NMR-Spektren zeigen. Das nächste Glied der homologen Reihe, »Komponente III«

[C₂₃H₄₃O₁₈N],

läßt sich in seinen physiko-chemischen Eigenschaften, seiner Struktur und Reaktivität folgendermaßen rakterisieren:

IH ist ein gut wasserlösliches amorphes Festprodukt.

a) Dünnschichtchromatographie

Fließmittel
Essigester/MeOH/H₂O 10:6:4

I. DC-Fertigfolien F 1500 Kieselgel Rf-Werte:

III: 0,35

Maltose: 0,50

II. DC-Fertigplatten F254 Kieselgel Rf-Werte:

III: 0,33

Maltose: 0,54

III gibt mit dem AgNOj/NaOH-Sprühreagens schon bei Raumtemperatur oder leichtem Anwärmen der Platten eine braunschwarze Anfärbung.

b)IR-Spektrum

Wenig aussagekräftiges, schlecht aufgelöstes IR-Spektrum in KBr. Hauptabsorptionsbanden im Bereich der O - H- und C -O-Valenzschwingungen (3700-3100 cm 'bzw. 1180-950Cm-¹).

c) Drehwinkel : +147,2°

d) NMR-Spektrum von IM in D₂O bei 220 MHz
(F-- ig- 3)

e) Methylierung nach H a k ο m ο r i

Die Methylierung von ill mit CHj] und NaH in DMSO liefert als Hauptprodukt das I3fach methylierte III, in geringer Menge auch das I4fach methylierte Produkt.

f) Massenspektrum des Methylierungsprodukts

Der Molekelpeak bei 827 (1,5% r. I.) entspricht einer Summenformel C₁₈H₆QNOi₈. (Mit 0,1% r. I. ist bei 841 ein zweiter Molekelpeak vorhanden.)

Die wichtigsten Fragmentpeaks sind:

739 (27% r. I.)
592 ( 3,7% r. I.)
515 nn<Vn r I )

388 ( 9% r. l.j

386 (13% r. I.)

284 (13% r. I.)

187 (12% r. I.)

171 (40% r. I.)

101 (34% r. i.)

88 (25% r. I.)

75 Base peak

Die folgende Struktur für III ist mit allen chemischen und spektroskopischen Eigenschaften in Einklang:

IK)
HO-/

CU,OH

OH

CH₁

OH

CIhOIl

OH

OH

CH₂OII

OH

OH
OH

Komponente IV ist das nächsthöhere Glied der homologen Reihe. Die Verbindung läßt sich bei saurer

ι Ui limn YUi \Jiy j», in ι\υι ι \\j\ji ιι~ 111\, ii uiivi v_» iuluow im Molverhältnis 1 : 2 spalten.

Dünnschichtchromatographie

Fließmittel n-Butanol/Äthanol/Wasser = 50 : 30 : 20

DC-Fertigplatten F 1500 Kieselgel

Rciucose-Werte: IV: 0,41 -0,46

Höhere Homologe vermögen Saccharose sehr viel weniger und Λ-Amylase aus Pankreas sehr viel stärker zu hemmen als die niederen Glieder der Reihe (Komponente II - IV).

Bei der sauren Hydrolyse höherer Komponenten lassen sich die jeweils niederen als Zwischenprodukte nachweisen; daneben treten als Spaltprodukte Glucose und Maltose auf.

Dünnschichtchromatographie

Fließmittel
n-Butanol/Äthanol/Wasser = 50 : 30 : 20

DC-Fertigplatten F 1500 Kieselgel

Die spezifischen Hemmaktivitäten der inhibitorisch wirksamen Aminozuckerderivate werden mittels in

VI: 0.21 -0.23 VH: 0,14-0,16 VIII: 0.09-0.11

Amylasetest

Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 μ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die uVal gespaltenen Bindungen werden als μνβΐ gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve als μνβΐ Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 mi Amylaselösung (20 bis 22 AE/ml) mit 0 bis 10 μg Inhibitor oder 0 bis 20 μ! der zu testenden Lösung in 0,4 ml 0.02m Natriumglycerophosphatpuffer/O.OOlm CaCl₂, pH 6,9, versetzt und etwa 10 bis 20 Minuten in einem Wasserbad von 35° C äquilibriert Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35° C vorgewärmten, 1% Stärkelösung (Stärke, löslich, der Firma Merck, Darmstadt, Nr. 1252) bei 35° C inkubiert und anschließend mit 1 ml Dinitrosalicyisäure-Äeagens (nach P. Bern feld in Colowick-Kaplan, Meth. EnzymoL, Band 1, Seite !49) versetzt. Zur Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit

Il

10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet. Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten

|j.g Inhibitor*)
AH**)

"ι Βινομοη am 1 rockensiibstan/.
**l ^vl im nicht inhibierten Ansät/ cIlm iilciclien Serie

aufgetragen, der 50%-Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AIE/mg Inhibitor umgerechnet.

Saccharasetest

Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die in einr Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 μΜοΙ Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die μΜοΙ gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Saccharosespaltung durch die Saccharase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,12SE eingestellten Saccharaselösung¹) mit 0 bis 20 μg Inhibitor oder 0 "bis 20 μΙ der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1m Natriummaleinatpuffer, pH 6,0, auf 0,1ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35°C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer auf 35°C vorgewärmten 0,05m Saccharoselösung in 0,1m Natriummaleinatpuffer, pH 6,0, versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35⁰C und stoppt die

VUII 1 1111

nen Testbedingungen i μΜοί Maltose in 2 μΜοΙ Glucose spaltet. Die μΜοΙ gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Maltosespaltung durch die Maltase nicht rr.chr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,060 bis 0,070 ME eingestellten Maltaselösung¹) mit

0 bis 20 μg Inhibitor oder 0 bis 20 μΐ der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1m Natriummaleinatpuffer, pH 6,0, auf 0,1 ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35°C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer auf 35°C vorgewärmten 0,05m Maltoselösung in 0,1m Natriummaleinatpuffer, pH 6,0, versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35°C und stoppt die Maltasereaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens²) ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35°C. Danach wira

1 ml 50% H2SO4 zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen.

Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Maltase berechnet und aus dem 50%-Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf MIE/g bzw. MIE/Liter umgerechnet.

') Solubilisierte Maltase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12 (1958), Seite 1997. Mit 0,1m Natriummaleinatpuffer. pH 6.0. auf entsprechenden ME-Gehalt verdünnt.

²) Bereitung des Glucoseoxidasereagens: Wie beim Saccharasetest, Sp. 11 , Fußnote ²), beschrieben.

Die Ergebnisse der in vitro Enzymhemmtests für einzelne Homologe der erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate sind in nachstehender Tabelle zusammengefaßt:

dasereagens²) ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35°C. Danach wird 1 ml 50Vo H₂SO₄ zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase berechnet und aus dem 50%-Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter umgerechnet.

') Soiubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12 (1958), Seite 1997. Mit 0,1m Natriummaleinatpuffer, pH b.Ü, auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.

²) Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2 mg Glucoseoxidase in 100 ir! 0365m Tris-HCl-Puffer. pH 7.0. und anschließenden Zusatz von 1 ml Detergenslösung (2 g Triton X 100 + 8g 95% Äthanol p.a.), 1 ml Dianisidinlösung (260mg G-L*i2rii5iciiri ■ 2 ΐ IvJ ifl 20 Uli ! liw/ üilvj w,-» ΐΤϊι *>,. /GigC" wäßriger Peroxidaselösung hergestellt.

Maltasetest

η - Zahl der Ilexose-	ΛΙ Κ/ε	SlH/c	MIE.'a
einheiten
Aminozuckerderivat	300 000	30 000	5 000
mit /) = 1
11 = 2	300 CKXl	68 000	15 000
/i = 3	1400 000	21000	5 IK)O

Eine Maltasc-Inhibitor-Einhcit (MiE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Maltaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Maltaseeinheit (ME) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebe-Wie aus der Tabelle ersichtlich, steigt die spez. Hemmaktivität gegenüber Pankreas-a-Amylase mit

so zunehmendem Molekulargewicht der homologen Reihe stark an. Andererseits ist die Saccharaseinhibition bei dem Derivat mit η — 2 am stärksten ausgeprägt, das Derivat mit η = J hemmt nur noch halb so stark und das höhere Derivat zeigt eine weiter abfallende spez.

r. Aktivität der Saccharasehernmung.

in vivo läuft die Wirksamkeit im Saccharose-Belastungstest der in vitro gefundenen spez. Hemmaktiviiäi in etwa nara]le|. Dape^en fanden wir beim Stärkcbclästungstest in vivo für die Aminozuckerderivate mit

,ο η = 1,2 und 3 eine im Vergleich zur Amylasehemmung in vitro 10- bis 40fach gesteigerte Wirksamkeit (vgl Beispiel 12, Tabellen 1,2 und 3).

Es ist bekannt daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von kohlenhydrathaltigen Nahrungs- und C-enußmittein (ζ. Β. Getreide-, Kartoffelstärke. Obst, fruchtsaft. Bier, Schokolade) Hyperglykämien auftreten, die infolge ein^ä raschen Abbaus der Kohlenhydrate durch Glykosidhydrolasen (z. B. Speichel- und Pank-

reasamylasen, Maltasen, Saccharasen) nach folgendem Schema

Λ my läse Maltase Stärke bzw. Glykogen » Maltose > Glucose

Saccharase
Saccharose ► Glucose + Fniktose

bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt Bei Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie · oftmals eine besonders starke Sekretion von Insulin, das seinerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt Im Anschluß an derartige Hyperglykämien tritt bei stoffwechselgesunden und adipösen Personen infolge der Insulinsekretion häufig eine Hypoglykämie auf. Bekannt ist, daß sowohl Hypoglykämien als auch im Magen verweilender Speisebrei die Produktion von Magensaft fördern, der seinerseits die Entstehung einer Gastritis, eines Ulcus vep.iricuü oder duodeni auslöst oder begünstigt

Es wurde nun gefunden, daß erfindungsgemäße, nach obigen Methoden gewonnene und isolierte Inhibitoren der Glykosidhydrolasen die alimentäre Hyperglykämie, Hyperinsulinämie, Hypoglykämie nach Belastung von Ratte und/oder Mensch mit Weizenstärke oder Saccharose oder Maltose erheblich vermindern und die Magenpassage dieser genannten Kohlenhydrate beschleunigen. Darüber hinaus hemmen sie die Resorption von Glucose aus dem Darm. Ferner wird die Konversion von Kohlenhydraten in Lipide des Fettgewebes und der Einbau von alimentärem Fett in die Fettgewebedepots vermindert bzw. verzögert.

Ferner ist bekannt, daß in der Mundhöhle Kohlenhydrate, besonders Saccharose, durch Mikroorganismen gespalten werden und dadurch die Kariesbildung gefördert wird.

Inhibitoren der Glykosidhydrolasen eignen sich deshalb als Tlierapeuticum für folgende Indikationen:

Adipositas, Hyperlipämie (Atherosklerose), Diabetes, Prädiabetes, Gastritis, Ulcus ventriculi, Ulcus duodeni und Karies.

Dosierung

30 bis 300 000 AIE/kg oder 1 bis 10 000 SIE/kg ein- oder mehrmals täglich vor und/oder während und/oder nach den Mahlzeiten bzw. Getränken p. os.

Zubereitungsformen

Tablette, Dragee, Kapsel, Lösung, Suspension, Granulat, Kaugummi, Zahnpasta und als Zusatz zu kohlenhydrathaltigen Lebens- und/oder Genußmitteln.

Die Toxizität dieser Inhibitoren der Glykosidhydrolasen und Glucoseresorptionshemmer ist extrem gering. Der Wirkstoff aus dem Beispiel 4 (Rohinhibitor mit 26 000 SIE/g) wird in Analogie zu den Wirkstoffen anderer Beispiele in einer Dosierung von 340 000 SIE/kg Maus und Ratte p. os. symptomlos vertragen. Auch bei intravenöser Injektion tolerieren Mäuse 10 000 SIE/kg symptomlos.

Vorteilhaft sind auch Kombinationen der erfindungsgemä'Ben Inhibitoren mit den bekannten oralen Antidiabetica (/J-cytotrope Sulfonylharnstoffderivate und/oder blutzuckerwirksame Biguanide).

Beispiel I

In einigen Beispielen wird als Ausgangsmaterial eine Zubereitung verwendet, die wie folgt hergestellt wird:

Man beimpft einen Glasfermentei mit 8 Liter

ίο Nährlösung der Zusammensetzung 5,0% Stärke, 1,0% Hefeextrakt, 0,2% K₂HPO₄ mit einem 3 Tage alter Schüttelkolben des Stammes SE 50/13 (CBS 614.71) und bebrütet unter intensiver Rührung und Belüftung 3 Tage bei 28⁰C und erhält eine Kulturbrühe mit 105 000 AIE/ml.

6 Liter dieser Fermentationsbrühe werden nach dem Abkühlen auf 20⁰C mit halbkonzentrierter HNO₃ auf pH 2,5 eingestellt, mit 30 g Aktivkohle versetzt und 10 Minuten gerührt Anschließend wird 15 Minuten bei 10 000 UpM zentrifugiert und der klare, hellgelbe Überstand nach Neutralisation mit NH₃ auf 500 m! eingeengt Die 500 ml Konzentral wurden 45 Minuten mit 200 g eines Anionenaustauschers gerührt abgenutscht und mit ⁴A Vol. = 400 ml Methanol versetzt, um die Hauptmenge der höhermolekularen Stärkeabbauprodukte (zusammen mit noch vorhandenen Aktivkohleresten) auszufällen. Es wird 5 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert Die 850 ml Überstand werden unter intensivem Rühren in 4 Liter Trockensprit

in eingetropft. Die weiße, flockige Fällung wird abgenutscht, 3mal mit Trockensprit und 2mal mit Äther gewaschen und im Vakuum bei 50⁰C getrocknet. Aasbeute: 36 g eines weißen Pulvers mit 10 χ 10* AI E/g.

^r' Beispiel 2

Zur Beurteilung des Endprodukts von Fermentationen und der Zusammensetzung von Präparaten mittels Dünnschichtchromatographie trägt man 1 μΙ der Fer-

w mentationsbrühen oder 1 μg der Präparate auf Kieselgelfertigfolien auf und entwickelt 2mal in n-Butanol/-Äthanol/Wasser - 50/30/20.

Zur Saccharaseinhibitionsfärbung besprayt man die entwickelte und gut getrocknete Platte mit Enzymgel

π (20 ml/20 χ 20cm-Platte) und läßt das Gel erstarren. Dann wird für 5' in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur vorinkubiert und anschließend satt mit Substratgel besprayt. Nach dem Erstarren dieser 2. Gelschicht bringt man die Platte in eine feuchte

-,Ii Kammer ein und inkubiert bei 40⁰C. Die Inhibitionsfärbung (helle Flecken, rotbrauner Hintergrund) entwickelt sich in 60 bis 90'. Zum Zeitpunkt der optimalen Farbentwicklung wird abgebrochen und die Platte mit den darauf befindlichen Agarschichten a;n Fön mit

v, Warmluft getrocknet.

Bereitung der Gele

Enzymgel: 1,5 g Agarose wird in 100 ml 0,2m Na-Maleinatpuffer, pH 6,0, suspendiert und anschlie-

wp ßend durch Aufkochen gelöst. Die klare Agaroselösung wird auf 50⁰C abgekühlt und mit 250 μΐ einer Lösung eines nichtionogenen Detergens (2 g nichtionogenes Detergens und 8 g Äthanol p. a.) und 0,5 ml Dianisidinlösung (20 mg Dianisidin/I ml Aceton) unter Umschwen-

h > ken versetzt. Direkt vor Gebrauch des Gels werden 1 ml GOD/POD-Reagens (12,5 mg Glucoseoxidase, Reinheitsgrad I und 2,5 mg Peroxidase, Reinheitsgrad II. gelöst in 5 ml Maleinatpuffer) und <* bis ^r> Einheiten

Saccharase aus Schweinedunndarm¹) zugesetzt. Das Gel muß bis zum Versprayen auf 50"C gehalten werden, da es sonst beim Sprayvorgang in den Düsen erstarrt.

¹J Enzympräparation wie in Sp. 12, Fußnote'), beschrieben.

Substratgel: 0,5 g Agarose wird in 100 ml Na-Maleinatpuffer, pH 6,0, suspendiert und unter Kochen gelöst. Man kühlt anschließend auf 50° C ab, versetzt mit 100 μΙ einer Lösung eines nichtionogenen Detergens (2 g nichtionogenes Detergens und 8 g Äthanol p. a.) und gibt 1 g Saccharose zu. Nach dem Lösen der Saccharose ist das Gel gebrauchsfertig.

Zur Amylaseinhibitonsfärbung besprüht man die entwickelte und getrocknete DC-Platte mit einem Amylasegel (20 ml/20 χ 20 cm-Platte) und läßt erstarren. Nach 5' Vorinkubation bei Raumtemperatur bringt man die Platte mit der Gelschicht in eine 0.5%ige Stärkelösung (1 g Stärke in 200 ml 0,2m Glycerophosphatpuffer, 0,0/mCaCb, pH 6,9, unter Kochen gelöst) ein und beiäßt sie dort für 2^: bei 4Ü°C unter Umschwenken der Lösung. Danach wird die Platte mit dest. Wasser gut abgespült und zur Anfärbung der nicht abgebauten Stärke in eine verdünnte J₂-Lösung (4 ml ^-Stammlösung auf 500 ml H₂O; J₂-Stammlösung: 22 g h + 4,4 g kj in 100 ml H₂O gelöst) eingetaucht. Nach ca. 1 Minute ist die Färbung optimal. Man photographiert sofort, da die blauen Flecken schnell verblassen.

Bereitung des Amylasegels

1 g Agarose wird in IOC' ml 0,2m Natriumglycerophosphat/0,01m CaCI₂-Puffer, pH 6,9, bei 100°C gelöst, nach dem Abkühlen auf 5O⁰C werden 100 μΙ einer Lösung eines nichtionogenen Detergens (2 g nichtionogenes Detergens und 8 g Äthanol p. a.) zugesetzt. Direkt vor dem Besprayen setzt man 100 μΙ einer Amylasekristallsuspension (10 mg Schweinepankreasamylase/ml ges. NH₄-Sulfatlösung)zu.

Beispiel 3

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, die 120 ml Nährlösung der Zusammensetzung 3% Glucose, 0,6% Kaseinhydrolysat, 1,6% Hefeextrakt, 0,3% CaCO₃,0,3% K₂HPO₄, pH vor der Sterilisation mit KOH auf pH 7,8 eingestellt, mit einer Vorkultur des Stammes SE 50/110 !n einer Nährlösung, bestehend aus 3% Sojamehl, 3% Glycerin und 0,2% CaCO₃ und bebrütet 4 Tage bei 24⁰C auf einer Rundschüttelmaschine, so erhält man eine Kulturbrühe mit 10 800 SIE/1, die überwiegend das Aminozuckerderivat mit π = I enthält.

5 1 Kulturfiltrat, bei 13 000UpM vom Mycel abgetrennt, wurden mit halbconc. HNO₃ auf pH 2,5 gestellt und für !5 min mit 55 g Aktiv-Kohle und 200 g eines Filterhilfsmittels gerührt.

Nach dem Entfernen der Feststoffe durch Absaugen neutralisierte man mit cone. Ammoniak auf pH 7, engte die Lösung auf 1,5 1 ein und fällte mit der fünffachen Menge Äthanol. Der resultierende flockige Niederschlag wurde mittels eines Durchlaufrqtors bei 12 000UpM abgetrennt und der gelbliche Überstand auf 150 ml eingeengt und zur Abtrennung geringer Anteile ungelösten Materials niedertourig zentrifugiert. 50 ml dieser Lösung wurden auf eine mit einem stark sauren Kationenaustauscher (H ⁺-Form) gefüllte Säule (30 χ 300 mm; 30 ml H₂O pro Stunde) gegeben. Nachdem man insgesamt 300 ml Eluat aufgefangen hatte, welches inerte Saccharide sowie einen Anteil nichlabsorbierlcr hemmaktiver komponenten enthält. überführte man den Austauscher mit ca. 400 ml H₂O in ein Becherglas und fügte unter Rühren so lange cone. Ammoniak zu, bis der pH einen Wert von 11,5 erreicht hatte. Nach 30 min weiterem Rühren trennte man vom Austauscher ab, engte auf V20 des Volumens ein, filtrierte über eine Säule (20 χ 150 mm) mit stark basischem Anionenaustauscher (HCO₃'-Form) und fing bei einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/Std. ca. 500 ml Eluat auf, welches eingeengt wurde und nach Lyophilisation 13 g Rohprodukt ergab.

Zur weiteren Reinigung wurde das rohe Präparat an einem Polyacrylamid-Gel, 100 bis 200 mesh, fraktioniert. Dazu diente eine Säule von 50 mm 0 und 450 mm Länge, die mit H₂O bei einer Fließgeschwindigkeit von 40 ml/Std. betrieben wurde, wobei man Fraktionen von je iOml sammelte. Alle Fraktionen wurden mittels des Anthrontestes auf Kohlenhydrate sowie mil". .-Es des . Saccharase-Hemmtestes auf inhibitorisch aktive Komponenten geprüft. Die Saccharase-Inhibitor enthaltenden Fraktionen wurden weiterhin dünnschichtchromatographisch nach Beispiel 2 auf ihren Gehalt an individuellen Komponenten untersucht. Diejenigen Fraktionen, welche das Aminozuckerderivat mit η = 1 enthielten, wurden vereinigt, eingeengt und lyophilisiert. Man erhielt 35 mg des Aminozuckerderivats mit η = 1 mitO,3 χ 10* AI E/g und 30 000 Si E/g.

Beispiel 4

Beimpft man einen Fermenter mit 100 Liter Nährlösung der Zusammensetzung 3,5% Glycose, 2,5% Malzextrakt, 03% Kaseinhydrolysat, 1,3% Hefeextrakt, 0,3% CaCO₃,0,3% K₂HPO₄ und 0,1 % Antischaummittel mit 5 1 einer Vorkultur nach Beispiel 3 und bebrütet unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei 24°C, so erhält man eine Kulturlösung mit 73 000 SIE/1, die vorwiegend das Aminozuckerderivat mit η — 2 enthält.

90 Liter Fermentationsansatz wurden mit Mycel am pH-Meter mit konz. HNO₃ auf pH 2,5 eingestellt und unter Rühren mit 900 g (= 1%) Aktivkohle zur Adsorption der Hauptmenge der gebildeten Farbstoffe versetzt. Man rührte für 15 Min., trennte über eine Zentrifuge bei 3000 UpM vom Mycel und der Hauptmenge der Kohle ab und filtriert den Überstand schließlich unter Zusatz von 3 kg Filterhilfsmittel über eine Drucknutsche. Man erhielt 65 Liter gelbbraunen, klaren Filtrats mit einem SIE-Gehalt von 60 000 SIE/Liter.

Das Filtrat wurde mit konz NHj auf pH 7 eingestellt und zur Adsorption des Wirkstoffes mit /300 g (2%) Aktivkohle für 30' gerührt. Man filtriert über eine Drucknrtsche und wusch das Aktivkohlesediment 3mal mit 10 Liter destilliertem Wasser. Anschließend wurde die Kohle gut »rocken gedrückt und 3mal in 4 Litern 50% Aceton bei pH 2,5 für jeweils 15' gerührt, um den Wirkstoff von der Kohle zu desorbieren. Die acetonischen Desorbate wurden — nach Abtrennen von der Kohle durch Filtration — vereinigt. Man engte das vereinigte Desorbat am Rotationsverdampfer auf 250 ml ein, versetzte mit einem gleichen Volumen (250 ml) Methanol und filtrierte durch ein Faltenfilter. Das Filtrat (480 ml) wurde in 5 Liter Aceton unter kräftigem Rühren eingetropft. Der ausfallende Niederschlag wurde abgenutscht und 3mal mit Aceton und Äther gewaschen. Anschließend wurde im Vakuum bei 35°C getrocknet. Ausbeute 230 g mit 8500 SIE/g.

25 g des obigim rohen Produkts wurden in 1 Liter H₂O gelöst und mit 300 g stark saurem Kationenaustauscher 4 H * (200 bis 400 mesh) 30' gerührt. Man filtrierte

das Harz ab und wusch 3mal mit 2 Liter 0,001 n-HCl nach. Der gewaschene Austauscher wurde anschließend in 500 ml HiC) suspendiert und die Suspension am pH-Meter durch Zugabe von 25% NH₃ auf pH 9,0 eingestellt Anschließend wurde noch 2mal mit je 500 ml 0,6% NH3 desorbiert, die Desorbate vereinigt und am Rotationsverdampfer auf 100 ml eingeengt Zur Entfärbung dieses Konzentrats wurde es mit 2 g eines Anionenaustauschers auf Zellulosebasis (0,6 mVal/g) für 5 min gerührt, dann zentrifugiert Der hellgelbe Überstand wurde mit einem gleichen Volumen (100 ml) Methanol versetzt und dann in 2 Liter Aceton unter intensivem Rühren eingetropft Der Niederschlag wurde abgenutscht, mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum bei 35° C getrocknet Ausbeute 4,2 g mit 26 000 SIE/g. Zur weiteren Feinreinigung wurden die 4,0 g Inhibitor in 0,5-g-Portionen über ein Acrylamid-Gel gelfiltriert Dazu wurden 0,5 g des Präparats in 10 ml H2O gelöst und auf eine Polyacrylamid-Gel-Säule (200 bis 4GO mesh) vom Durchmesser 5 cm und der Länge 95 cm aufgetragen. Man entwickelte in Wasser bei einer Fließrate von 80 ml/h. Es wurden 12 ml Fraktionen gesammelt. Von allen Fraktionen wurde der Gesamtkohlenhydrat (in Form des Anthrontestes als Extinktion bei Ee») sowie der Gehalt an Saccharase-Inhibitor und Amylase-Inhibitor ermittelt. Außerdem wurden die Fraktionen dünnschichtchromatographisch (Enzym-Inhibitionsfärbung) geprüft

Die Fraktionen, in denen die Aminozuckerderivate mit η = 4 bis 6 nachgewiesen wurden, wurden vereinigt, im Vakuum auf 10 mi eingeengt und durch Eintropfen in 200 ml Trockensprit gefällt Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, mit Aceton und /.«her gewaschen und im Vakuum getrocknet; Ausoeute aus 4,0 g Rohinhibitor: 0,2 g Aminozuckerderivat mi. π = 4 bis 6 mit 17,5 χ 10* AIE/g und 8500 SIE/g. Die das Aminozuckerderivat mit π = 3 enthaltenden Fraktionen wurden in gleicher Weise aufgearbeitet wobei die Fällung mit 200 ml Aceton erfolgte; Ausbeute aus 4,0 g Rohinhibitor: 0,1 g Aminozuckerderivat mit η = 3 mit 1,4 χ 10« AIE/g und 21 000 SIE/g. Aus den das Aminozuckerderivat mit η = 2 enthaltenden Fraktionen (Fällung mit Aceton) wurden 0,9 g Aminozuckerderivat mit η = 2 mit 0,3 χ ΙΟ⁶ AIE/g und 68 000 SIE/g isoliert.

Beispiel 5

Beimpft mar« 3 Kleinfermenter mit je 81 der Nährlösung 7,5% Malzextrakt, 0,3% Kaseinhydrolysat, 0,7% Hefeextrakt, 0,3% CaCO₃, 03% K₂HPO₄ mit 5% einer Vorkultur des Stammes SE 50/110 (gewonnen nach Beispiel 3), so erhält man nach 5tägiger Bebrütung bei 24°C eine Kulturbrühe mit 73 SIE/ml, die vorwiegend Aminozuckerderivate von η = 2 enthalten. Nach Zentrifugiition (30', 3000 UpM) zur Abtrennung

des Mycels erhielt man 20,5 Liter einer tiefbraunen Kulturlösung mit 67 000 SIE/L Man stellte mit HNO₃ auf pH 3,5 ein und setzte zur Einfärbung 60 g eines Adsorptionsharzes (0,35 mm Körnung) L= 1,23 kg zu. Nach 20' Rühren wurde über ein K-3-Filter abgenutscht Die entfärbte Kulturlösung wurde mit NH₃ neutralisiert (18,5L, 67 000 SIE/L). Man rührte anschließend zur Adsorption des Wirkstoffes 20 g Aktivkohle/L = 370 g ein und ließ 30' rühren. Anschließend wurde über ein K-3-Filter, das mit einer Schicht aus einem Filterhilfsmittel beschickt war, abfiltriert Das Filtrat (17,5 L, 3600 SIE/L) wurde verworfen. Der Kohlerückstand wurde 3mal mit 21 dest H2O gewaschen. Zur Desorption des Wirkstoffes von der Kohle wurde diese 3ma! nacheinander mit jeweils 11 80%igem Aceton für 15' gerührt, wobei das pH mit konz. HCI auf pH 2,5 eingestellt wurde. Die Desorbate wurden vereinigt (2,4 L, 371 000 SIE/L). In dieses Desorbat wurden 20 g eines stark sauren Kationenaustauschers, H+-Form, eingetragen und 20' gerührt. Anschließend wurde das Harz abfütriert (Austauschcrfraktion I) und rnii eiwas 75%igem Aceton nachgewaschen. Das Filtrat und Waschflüssigkeit (3 L = 215 000 SIE/L) wurden mit 60 g eines Anionenaustauschers (OH~-Form) gerührt, bis pH 7 erreicht war. Anschließend wurde abfiltriert, und das Filtrat (2,8 L, 219 000 SIE/L) mit 72 g Kationenaustauscher versetzt und 20' gerührt Das pH wurde dabei durch Einhängen eines mit einem Anionenaustauscher (OH--Form) gefüllten porösen Nylonbeutels auf 3,0 gehalten. Anschließend wurde vom Austauscher abfiltriert (Austauscherfraktion II), das Filtrat (2,6 L, 27 000 SIE/L) wurde verworfen.

Die Austauscherfraktionen I und II wurden jede für sich 3mal mit 75% Aceton bei pH 3,5 gewaschen und anschließend je 3mal mit je 100 ml (Austauscherfraktion I) bzw. 150 ml (Austauscherfraktion II) 0,6% NH₃ desorbiert. Bei der 1. Desorption, bei der die Ammoniakmenge zur Neutralisation des Kationenaustauscherharzes nicht ausreichte, wu..He durch Zugabe von konz. NH₃ am pH-Meter auf pH 9 eingestellt. Die 3 Desorbate der Austauscherfraktionen I und II wurden für sich vereinigt, am Rotationsverdampfer fast zur Trockne eingeengt, in 50 ml H2O aufgenommen, am pH-Meter mit HCI auf pH 3 bis 4 eingestellt und mit 50 ml Methanol versetzt. Die Lösungen wurden in 1,5 I absolutes Aceton unter Rühren eingetropft, der fallende Niederschlag abgenutscht und 3mal mit Aceton sowie 1 mal mit Äther gewaschen. Man trocknete im Vakuum.

Ausbeute:

Fraktion I 6,5 g
Fraktion II 12,3 g

25 000 SIE/g
36 000 SIE/g

Fraktion I und II enthalten als hemmaktive Bestandteile hauptsächlich das Aminozuckerderivat mit n = 2 neben geringen Anteilen des nächsthöheren Homologen (n = 3).

Ausheule

Volumen (I.I SIl-i/l.

SII: gesamt

SIIi Ausheule

1) Kulttirlösuiig 20.5

2) Nach Adso ptionshmv-Hnllarbung \'K>

3) Nach Aklivkohlcadsomtion IS.5

()7 000

67 000

3 600

I 373 500

I 306 500

66 600

i00

(4.S verworfen)

Fortsetzung

	Volumen (L)	SI 171-	SIl: gestirnt
4) 1. Desorbat	0,7	742 000	519400
5) 2. Desorbat	0.9	329 000	296 100
6) 3. Desorbat	0,8	85 000	68 000
7) Mischdesorbat (4-6)	2,4	371000	890 400
8) Nach 1. Kationen-Austauscher	3,0	215000	645(X)O
adsorption
9) Nach Neutralisation mit Anionen-	2,8	219000	613 200
austauscher
10) Naci, 2. Kationenaustauscher	2,5	27000	67 5OÜ
adsorption
!l) Vereinigte NHrDesorbate von	0,29	682 000	19 7 780
12) Vereinigte ΝΙΙ,-Desorbale von	u,45	1414 (X)O	638 550
Austauscherfraktion II
13) Fällung Fraktion I	6,5 g	25 000/g	162 500
Füllung Fraktion II	12,3 g	36 000/g	442 800

SIl: Ausheule

883 500

64-⁴

37,8

21,6

5,0

64.8

(4,9 verworfen)

14.4

₍ 6(P
46.5 j

^1L*U4-

Beis pie I 6

200 geiner Zubereitung, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in 940 ml destilliertem Wasser und 60 ml konz. H2SQ1 gelöst und 4 Stunden unter Rückfluß erwärmt (Innentemperatur: 98 bis 100⁰C; Ölbadtemperatur: 140°C). Die abgekühlte, schwarzbraune Lösung wurde mit 10 g Aktivkohle versetzt und 1 Stunde gerührt. Danach wurde die Aktivkohle abgesaugt, mit Wasser gewaschen und das Filtrat mit ca. 250 ml 10 n-KOH auf pH = 7 bis 8 eingestellt. Die Lösung wurde 1 Stunde mit 50 g Aktivkohle ausgerührt. Die Kohle wurde abgesaugt, mit 21 Wasser gewaschen und das Filtrat verworfen. Zur Desorption wurde die Kohle über Nacht mit 2 1 30%igem Alkohol digeriert. Schließlich saugte man die Kohle ab und engte die alkoholische Lösung am Rotationsverdampfer ein. Rückstand: 6,2 g. Dieses Rohproduki (6,2 g) wurde in 500 ml Wasser gelöst und mit 30 g eines stark sauren Kationenaustauschers (H^e-Form) 1 Stunde vorsichtig gerührt. Man saugte den Austauscher ab und wusch mit destilliertem Wasser, bis das Filtrat neutral und frei von Glucose war. Der Austauscher wurde dann mit 15 ml 25%igem NHj in 1000 ml H2O über Nacht ausgerührt, abgetrennt und verworfen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Rückstand: 3,7 g.

Zur weiteren Reinigung wurde eine Chromatographie an Cellulose durchgeführt. 4,5"g des vom Austauscher desorbierten Materials wurden auf eine 1 m lange und 2,5 cm weite mit Cellulose gefüllte Säule aufgetragen. Als Fließmittel wurde zunächst Äthanol/H2O 5:1, zum Eluieren des Aminozuckerderivats mit η = 1 wurde zunächst Äthanol/h^O 3:1, verwendet. Bei einer Tropfgeschwindigkeit von 20 Tropfen pro Minute wurden Fraktionen von jeweils 14 ml abgenommen. Die einzelnen Fraktionen wurden dünnschichtchromatographisch geprüft. Die Fraktionen 47 bis 85 lieferten nach dem Einengen 1,6 g schwach bräunlich verfärbtes Aminozuckerderivat mit ,7 = 1. Die färbenden Verunreinigungen spielen mengenmäßig keine Rolle. Ah farbloses Harz erhält man das Aminozuckerderivat mit η = 1. wenn man den Reinigungsscnriu mit stark in saurem Ionenaustauscher nicht im batch-Verfahren, sondern auf einer Säule durchführt.

Beispiel 7

200 g einer Zubereitung, wie in Beispiel 1 beschrieben,

jj wurden in 940 ml destilliertem Wasser und 60 ml konz. H2SO4 gelöst und '/4 Stunde unter Rückfluß erwärmt (Innentemperatur: 98 bis 100⁰C; Ölbadtemperatur: 14O⁰C). Die abgekühlte, schwarzbraune Lösung wurde mit 10 g Aktivkohle versetzt und 1 Stunde gerührt.

Danach wurde die Aktivkohle abgesaugt, mit Wasser gewaschen und das Filtrat mit ca. 250 ml 10 n-KOH auf pH = 7 bis 8 eingestellt. Die Lösung wurde 1 Stunde mit 50 g Aktivkohle ausgerührt. Die Kohle wurde abgesaugt, mit 21 Wasser gewaschen und das Filtrat

4-, verworfen. Zur Desorption wurde die Kohle über Nacht mit 2 1 30%igem Alkohol digeriert. Schließlich saugte man die Kohle ab und engte die alkoholische Lösung am Rotationsdampfer ein. Rückstand: 8,0 g.

Der Rückstand wurde in 15 ml H2O aufgenommen

jo und auf eine mit 50 g sines stark sauren Kationenaustauschers (H+-Form) gefüllte Säule (Höhe: 20 cm, 0-2,4 cm) aufgetragen. Man ließ mit 3 Tropfen/Minute einziehir und wusch mil Wasser nach (12 Tropfen/Minute), bis alle nichtbasischen Bestandteile entfernt

■-,-> waren. Dann wurden die basischen Produkte mit 0,5%igem NH3 von der Säule eluiert (12 Tropfen/Minute) und die wäßrige Lösung am Rotationsverdampfer zur Trockne gebracht. Rückstand: 4,1 g.
2 g dieses Rückstandes wurden in wenig Wasser

mi gelöst und auf eine mit einem Ionenaustauscher auf Cellulosebasis gefüllte Säule (Höhe: 200 cm; 0: J.O cm) aufgetragen. Es wurde mit Wasser eluiert. Bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/Stunde wurden Fraktionen von jeweils 2 ml abgenommen. Die einzelnen

fö Fraktionen wurden dünnschichtchromatographisch geprüft. Die Fraktionen 85 bis 94 lieferten 280 mg des Aminozuckerderivats mit η = 2 mit einer spez. Aktivität von 50 000 SIE/e

Beispiel 8

Inkubiert man 2 g einer Zubereitung, wie in Beispiel 1 beschrieben, in 60 ml 20 mM-Natriumglycerophosphatpiiffer, pH 6.9. und I mM an CaCi₂ mit I g /vAmyiase aus Aspeigillus spec, unter stetigem Rühren für 120 Stunden bei 37'¹C, erhitzt schließlich für 5 min auf 100⁰C und zentrifugiert bei 4000 UpM vom Ungelösten ab. so erhält man nach Lyophilisation der Lösung 1,9 g eines Produkts mit 3500 SIE/g und 2 χ 10* AIE/g. Prüft man dieses Produkt mittels Dünnschiehtchromatographie und Saccharase-Inhibitonsfärbung wie in Beispiel 2 beschrieben, so zeigt sich, daß an hemmaktiven Verbindungen im wesentlichen die Aminozuckcrdcrivatcmitn= I. 2 und 5 vorliegen.

Beispiel 9
Inkubiert man 2 g einer Zubereitung, wie in Beispiel I

beschrieben, in 30 m! 20 inm-ACcidipüfici" "vuf 11 [>fi 4,8 mil 1.25 mg /J-Amylasc aus sweet potato unter stetigem Rühren für 120 Stunden bei 37"C, erhitzt schließlich für 5 min auf 100'C und zentrifugiert bei 4000 UpM vom Ungelösten ab, so erhält man nach Lyophilisation der Lösung 1.5 g eines Produkts mit 1800 SIE/g und 3,8 χ 10*¹ AIE/g. Prüft man dieses Produkt mittels Dünnschiehtchromatographie und Saccharase-Inhibitionsfärbung. wie in Beispiel 2 beschrieben, so zeigt sich, daß an hemmaktiven Verbindungen im wesentlichen die Aminozuckerderivatc mit η — 2 und 3 vorliegen.

Beispiel 10

Beimpft man einen 200-mi-Erlenmeyerkolben, der 25 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 0,1% K₂HPO, 0,2% (NH₄)ASO₄, 0.05% MgSO₄, 0,05% KCI, 0,01% FeSO₄. 2% einer Zubereitung wie in Beispiel I beschrieben mit einer Sporensuspension des Stammes Asp. niger ATCC 11 394 und bebrütet bei 28"C auf einer Rundschüttelmaschine. so sinkt nach 6 Tagen der AIE-Titer von 210 000 AIE/ml auf 53 000 AIE/ml und nach 10 Tagen auf 21 300 AIE/ml. Glpirhypitiu nimmt der SIE/ml-Gehalt von 7,0 auf 72 SIE/ml zu.

20 ml einer 10 Tage mit der Sporensuspension inkubierten Lösung wurden zur Abtrennung des Mycels 30' bei 3000 UpM zentrifugiert. Die 15 ml Überstand (72 000 SIE/L) wurden durch 30minütiges Rühren mit 2 g eines schwach sauren Kationenaustauschers (H+ -Form) und 1 g eines Anionenaustauschers (OH-Form) entsalz! (Leitfähigkeit kleiner als 2 m Siemens), Man filtrierte ab ur.d ließ das Filtrat mit 5 ml/h durch eine mit einem Kationenaustauscher (H+-Form) in 0.001 n-HCl äquilibrierte Säule (0 lern χ 10cm) laufen. Anschließend wurde mit 200 ml 0,00In-HCl nachgewaschen. Zur Desorption wurde 0,6% NH3-L0-sung durch die Säule gepumpt (10 ml/h) und 5 ml Fraktionen aufgefangen. Die die saccharaseinhibitorische Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, auf 2 ml am Rotationsverdampfer einrotiert und mit 2 mi Methanol versetzt. Man stellte diese Lösung auf pH 3 bis 4 ein und brachte sie durch Eintropfen in 100 ml Aceton zur Fällung. Der Niederschlag wurde abgenutscht. mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 26 mg mit 28 000 SIE/g, bestehend aus Aminozuckerderivaten mit /7 = 2 und 3. Die Gewinnung reinen Aminozuckerderivats mit /7 = 2 aus diesem Produkt erfolgt wie in Beispiel 4 beschrieben durch Gelfiltration über eine Säule mit Polyacrylamid-

gel. Man erhall 7 mg eines Amino/iickerdcrivats mi η = 2 von 60 000 SI E/g.

Beispiel !1

2 I Ktiltiirfiltrat, welches man aus einem F'ermenta tionsansatz wie in Beispiel 3 beschrieben d'jr Ii Abschleudern des Mycels bei 13 000 UpM gewinn' und welches eine Aktivität von 13 000 SIE/g auf''eist wurden zur Reduktion des .Salzgehaltes (l.citfähigkcil des Kullurfiltrats: ca. 10 mS) mit 500 e eines Gemisches aus 2,5 Teilen eines schwach sauren Kaiionenaustauschers (H '-Form) und I Teil eines Anionenaustauschers (OH'-Form) für 1 Stunde gerührt. Der Austauscher wurde abgetrennt, die Lösung auf etwas unter 100 ml eingeengt und zur Entfernung ungelöster Bestandteile bei 20 000 UpM für 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde auf iOOini aufgefüllt; er wies nunmehr eine Leitfähigkeit von 3,5 mS auf und wurde zur weiteren Reinigung auf eine Säule (55 χ 400 mm) mit P-Cellulose nach bekannten Methoden vorbereitet und in 5 mM-Ammoniumphosphat-Puffer; pH 5,5; äquilibriert) aufgetragen. Als Laufmittcl diente genannter Phosphatpuffer; die Fließgeschwindigkeit betrug 90 ml/std und Fraktionen von 18 ml Volumen wurden gesammelt.

Nachdem man die Fraktionen des Eluats auf ihren Gehalt a:. Kohlenhydraten (mittels Anthrontest) und an Saccharase-inhibierenden Komponenten (mittels Saccharase-Inhibitionstest) geprüft halte, vereinigte man diejenigen Fraktionen, welche sich im Anthrontest als nahezu frei von Kohlenhydraten und im Saccharase-Hemmtest als besonders wirksam erwiesen hatten (Fraktionen 60 bis 170), engte auf 150 ml ein und filtrierte über eine Säule (50 χ 300 mm) mit einem Anionenaustausch^ (HCOj'-Form). Zur besseren Kontrolle der Entionisierung wurde das Eluat in Fraktionen aufgefangen (10 ml pro Fraktion in 20 min) und auf Kohlenhydrat (mittels Anthrontest: durchweg nahezu negativ), auf Phosphat (mittels Ascorbinsäure-Molybdat-Reagenz: durchweg negativ) und auf Saccharase-Inhihitinn imittplc Fn-7vmhf»mmf acM cTArn-iifl ΓΙ·*» K*»ryify»_ aktiven Fraktionen (3 bis 30) wurden vereinigt, eingeengt und lyophilisiert, erneut aufgelöst und Iyophilisiert, um 280 mg Rohinhibitor zu erhalten.

Zur weiteren Reinigung wurde der Rohinhibitor an Polyacrylamid-Gel fraktioniert, wie in Beispiel 3 beschrieben. Aus den Fraktionen, welche reines Aminozuckerderivat mit η = 1 enthielten, wurden nach Lyophilisation 30 mg eines Produkts isoliert mit OJ χ

Beispiel 12

1. Versuchsanordnungen zum Nachweis der Wirkung

von Glykosidhydrolas.eninhibitoren und der Glucoseresorptionshemmung an Ratte und Mensch

μ, Zur Erzeugung einer alimentären Hyperglykämie und Hyperinsuiinämie erhalten nüchterne Ratten (n = 6) bzw. nüchterne Versuchspersonen entweder 2,5 g Saccharose oder 2J> g Maltose oder 1 g gekochte Stärke oder 2$ g Glucose/kg p. os. bzw. 50 g Saccharose oder

_b-, 50g Maltose oder 50 g gekochte Stärke oder 50 g Glucose/Person p. os. in wäßriger Lösung oder als Suspension appliziert Andere Ratten (n = 6) erhalten die genannten Kohlenhydrate in der gleichen Menge

und zusätzlich einen der Kohlenhydrate in der gleichen Menge und zusätzlich einen der in den Beispielen genannten Wirkstoffe in der angegebenen Dosierung. Gesunden Versuchspersonen wird alternierend eines der genannten Kohlenhydrate im Abstand von 2 Tagen oder mehr einmal mit einem der genannten Wirkstoffe bzw. ohne diesen verabreicht. Die Iviiiglueose und das SerunWistilin werden vor sowie in kurzen zeitlichen Abständen von fünf Minuten bis zu drei Stunden nach Kohlenhydratbelastung ± Wirkstoff im Blut aus dem retroorbitalen Venenplexus von Ratten bzw. im Cubiialvenen- oder Kapillarblut der Versuchspersonen gemessen. Die Rliitglucuscbcstimmungen werden im Auto-Analyzer nach Hoffmann: |. biol. Chem. 120. 51 (1937), oder enzymatisch mit Glucoseoxydase und o-Dianisidinhydrochlorid, die Seruminsulinbestimmungen nach der Methode von Haies und Rändle: »löchern. |. 88. !37(I % J). ausgeführt.

lab. I zu Ueispiel 12

Ulutglucose in mg"·.. (Mittelwert ± Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler (iahe von Stärke. ± Wirkstoff aus Keispiel 4. Aniinozuckerilerivat mit // 3

II. Versiichsanordnung zum Nachweis einer

Hemmung eier Konversion von Kohlenhydraten in

Fettgewebslipide

Ratten (n ~ 6) erhalten eines der in I genannten Kohlenhydrate in inaktiver Form zusammen mit einer geeigneten Dosis desselben Kohlcnhydrats, das aber radioaktiv (¹⁴C") markiert ist, ± Wirkstoff aus den genannten Beispielen per Schlundsonde applizicrt. In kurzen zeitlichen Intervallen nach Versuchsbeginn werden die Tere getötet und epididymalcs und/oder perirenales Fettgewebe gewonnen, die l.ipide mit geeigneten Fettlösungsmitteln, z. B. Chloroform/Methanol (2:1) extrahiert und die nicht lipidhaltigen Stoffwechselmetaboliten ausgewaschen. Gemessen wird die Radioaktivität der auf diese Weise isolierten Lipide im Liquid Scintillation Counter. Die Aktivität wird in dpm/l ;i Fettgewebe angegeben.

ohne Stärke

52

I

7.3

IO

7.9

57 +

3.7

?o

M)

6.5

45 min nach

mit Stiirke

93

4

8.5

12

127 +

9.3

9.2

A PPI.

Kontrolle

+ Stärke

86

-f

14

75 +

5,0

117 +

8.7

78+ 9.6

82 +

11

70 ± 6.9

Kontrolle

+ Starke

77

+

5.6

133 ± I

9,6

94 ±

9.5

152 ± 15

I56±

8,8

124 ±7.7

750 ..IF

+ Stärke

65

X-

107 ±

3 3

82 ±

Il

121 ± 12

I26±

6,4

1 14 ±3,6

15(X) All·:

92 ±

113+ 9.7

112±

111 ±4.2

3(X)O AIF

101 +

I12± 4.5

109 ±

104 ±2.5

lab. 2 zu Beispiel 12

Blutglucose in mg"·'.· (Mittelwert ± Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Stärke ± Wirkstoff aus Beispiel 4. Aminozuckerderivat mit η ^ 2

	ohne Stärke	61	±3,7	10	15	5.3	2(1	8.7	3d	45 min	nach .1
Kontrolle	mit Stärke	85	±7.9	68 ± 3.9	83 χ	11	75 ±	12	91 ±5.2	84 ±	1.5
Kontrolle	+ Stärke	82	±7.5	120 ±7.7	132 +	6.0	140 ±	7.0	135 ±5.0	128 ±	15
150 Aiii	+ Stärke	79	±8.2	105 ±4,2	120 ±	10	124 +	6.7	134 + 6.1	Ι25±	5.2
300 A IF	+ Stärke	70	± 4,6	97±2,7	105 ±	.6,9	118±	1.6.	119 ±9.9	130 ±	5.9
600 aif;	+ Stärke	70	±7,0	80 ± 8.:-;	94 +	7,4	9.!.±	5,2	103 ±9,2	102 ±	4,2
1200 AIF	<0,05 I	!'<Ό.Ο		84 + 7,7	88 ±	mit	97 +		97 ± 5,0	100 ±	4,3
p			P < 0.Ο01 iieeei	η Kontrolle	Stiirke.

Tab. 3 zu Beispiel 12

Biutgiucose in mg¹'¹·.. (Mittelwert ± Ist von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Stärke + Wirkstoff aus Beispiel 3

	ohne Stärke mit Stärke Stärke	74 ± 101 ± ι in -+-	6.2 8.8 2 9	10	3,0 13 6.9	15	2(1	11 9.5 !!	30	5.4 18 I j	45 min nach Appl.
Kontrolle Kontrolle 75 AiE +	Stärke	98 ±	8.7	74 ± 135 ± 130±	9.0	82 ± 9.4 146 ±4,8 12° + ^ 4	71± 151± H3±	AA	76 + 148 ± [25 +	5.2	90 ± 9.2 156±19 132 ±18
150 AIE +	Stärke	87 ±	13	116±	1,8	128 + 5,8	127 +		115 +	5.3	137 ± 5,2
300 AIE +			106 ±	HO ±8,9	Iü±	108 ±	121 ± 7,2

25 2h

lab. 4 zu Uetsp öl IJ

Blutglucose in mg% (Mittelwert ± Is) von nüchternen Ratten /u verschiedenen /eilen nach oraler (iahe von Saccharose ± Wirkstoff aus Beispiel 4, Amino/.uckerdcrivat mit n - 2

15 M) M) nun nach ΛρηΙ.

Kontrolle ohne Saccharose 15 ±4,5 92 ± 8,5 95 ± 6,4

Kontrolle mit Saccharose 113+9,9 126 ±20 I27±14

25 SIl- I-Saccharose 71+3,7 100+ 7,3 107+ 2,4

100 SII^:. ' Saccharose 58 + 5,9 92 ± 4,0 98+ 5,0

!'- 0.05 - I¹· 0.01 I¹- 0,001 gegen Kontrolle mit Saccharose.

lab. 5 /u Beispiel 12

Blutglucose in mg% und Seruminsulin in μΚ/ml von 2 nüchternen Versuchspersonen nach oraler (iahe von Saccharose ± WirkstolV aus Beispiel 4, Rohinhibitor (26CCO SIIVg)

	0	15	178	30	122 14	148 18	45	SIE	132 18	ς,ρ	128 13	dt)	•Κ»	uo	180 min η. Appl.
Versuchsperson A im	Kontrollversuch mit	Saccharose		Saccharose
Blutglucose Seruminsulin	120 14	190 45	122 13	160 31	176 37	158 21	140 27	94 17	100 9	104 13
Versuchsperson A im	Versuch	mit Saccharose + 1000	nc» 4- innn
Blutglucose Seruminsuli/i	122 10	146 20	134 15	116 13	120 14	112 12	110 10
Versuchsperson B im	Kontrollversuch mit
Blutglucose Seruminsulin	108 7	140 19	100 10	96 7	104 13
VprcMi-licrturpnn U im	Uorillnl,
Blutglucose Seruminsulin	102 6	120 7	112 8	no 8	106 10

Tab. 6 zu Beispiel 12

Blutglucose in mg% (Mittelwert ± Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Saccharose ± Wirkstoff aus Beispie! 3

15 30 45 min

näCit Appi.

Kontrolle ohne Saccharose 69 ± 5.2

Kontrolle mit Saccharose 117 ± 11

50 SIE + Saccharose 105 ±11

100 SIE + Saccharose 89 ± 6,5

200 SIE + Saccharose 72 ± 4,6

84	±3,9
135	±8,1
123	±5,2
111	±4,1
95	±9,1

91 ±	5,9
152 ±	18
128 +	11
116±	3,9
104 ±	9,6

27 28

Tab. 7 /u Heispiel 12

Ulutglucosi- in mg% (Mittelwert ± Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Maltose ± Wirkstoff aus Beispiel 4, Rohinhibitor i26 000 SIE/g; 6000 MIK/g)

K) 20 30 60ΛρρΙ.

(min nach)

Kontrolle ohne Maltose 69+1,6 71 ± 4,6 91+ 3,0 90 ± 9,6 101 ±13 72 ±

Kontrolle mit Maltose 101+5,3 138+11 179+10 174 ± 7.5 186+17 148 + 21

100 MIE + Maltose 104 ± 5,1 108 ± 4.1 139 ± 7,6 135 ±13 15(1 ±1'3 132 ± 5,3

200 MIE + MjÜosc 92 ± 6,6 101 ± 9,6 128+ 8.5 128 ±11 136+ 6,6 126 ± 3,6

P < 0,05 P < 0,01 P< 0,001 gegen Kontrolle mit Saccharose h/w Maltose.

Tab. 8 zu Beispiel 12

Blutglucosc in mg% (Mittelwert ± Is) von nüchternen Ratten /u verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe voi. Glucose ± Wirkstoff aus Heispiel 4, Aminozuckerderivat mit « = 2

15 30 45 min

nach Appl.

Kontrolle ohne Glucose 72 ± 4,6 78 ± 1.3 87 ± 6.8

Kontrolle mit Glucose 142 ± 12 142 ± 12 158 ± 19

30 mg+ Glucose 135 ± 13 128 ± 5.5 132 ± 7.3

60 mg+ Glucose 125+13 118± 2.9 139 ± 9,0

I'< 0,05 I¹ < 0,01 gegen Kontrolle mit Cüucose.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Aminozuckerderivate der allgemeinen Formel

HO OH CH,

HO

CH₂OH

in der R einen Mono-, Di- oder Trisaccharidrest mit I bis 3 Hexoseeinheiten bedeutet.

2. Aminozuckerderivat nach Anspruch I der Formel