DE3046184C2

DE3046184C2 -

Info

Publication number: DE3046184C2
Application number: DE3046184A
Authority: DE
Inventors: Shingo Kyoto Jp Matsumura; Hiroshi Nagaokakyo Jp Enomoto; Yoshiaki Kyoto Jp Aoyagi; Yoji Otsu Jp Ezure; Yoshiaki Kyoto Jp Yoshikuni; Masahiro Kusatsu Shiga Jp Yagi; Nobutoshi Kyoto Jp Ojima
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1979-12-08
Filing date: 1980-12-08
Publication date: 1987-08-20
Also published as: IT8050321A1; CH649302A5; GB2064527A; IT1188970B; GB2064527B; FR2471387B1; US4338433A; IT8050321A0; FR2471387A1; DE3046184A1

Description

Die Erfindung betrifft Moranolinderivate, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie Arzneimittel mit einem Gehalt dieser Moranolinderivate gemäß den vorstehenden Patentansprüchen.

Cyclodextringlycosyltransferase (EC 2.4.1.19) hat eine lange Geschichte, und da dieses Enzym erstmals aus Bacillus macerans entdeckt wurde, wird das Enzym allgemein als Bacillus-macerans- amylase bezeichnet. Wie beispielsweise in den japanischen Patentanmeldungen No. 20373/72, No. 63189/75 und No. 88290/75, in Hans Bender: Archives of Microbiology, 3, Seiten 27-282, 1977, und in Agricultural and Biological Chemistry, 40, Seite 753, 1976, berichtet wird, ist es bekannt, daß dieses Enzym durch Bacillus macerans, Bacillus megaterium, Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Bacillus stearothermophillus, Klebsiella pneumoniae und Bacillus No. 38-2 (alkalophile Bakterien) produziert wird.

Moranolin hat die Formel

und wurde erstmals aus einem Roharzneimittel der Wurzelhaut von Morus alba (Yagi et al., Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan, 50, Seite 571, 1976, und japanische Patentanmeldung No. 83951/77) extrahiert und isoliert. Es wurde auch schon ein Verfahren zum Gewinnen der Verbindung der Formel (III) aus Mikroorganismen der Gattung Streptomyces durch das Fermentationsverfahren entwickelt (japanische Patentanmeldung No. 84094/70).

Das N-Niederalkylderivat von Moranolin wird durch Alkylieren der Verbindung der Formel (III) (japanische Patentanmeldung No. 12381/79) erhalten. Die Anwendung von Cyclodextringlycosyltransferase wird in zahlreichen Patentanmeldungen und Literaturstellen erläutert. Bei diesen Anwendungen werden die folgenden drei Charakteristiken der Cyclodextringlycosyltransferase ausgenutzt:

1) Stärke → Cyclodextrin (Cyclisierung)
2) Cyclodextrin+Glucose → Oligoglucose (Kupplung)
3) (Glucose)_n + (Glucose)_m → (Glucose)_n+m + (Glucose)_m-x
(Homologisierung, wobei in der vorstehenden Formel m, n und x ganze Zahlen sind) (vgl. Amylase Symposium, 7, Seite 61, 1972).

In neuerer Zeit wurde die Substratspezifizität von Cyclodextringlycosyltransferase bei der Kupplungsreaktion aufgeklärt (vgl. beispielsweise Agricultural and Biological Chemistry, 42, Seite 23698, 1978). Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß Moranolin und N-Niederalkylmoranolin ein Substrat von Cyclodextringlycosyltransferase bei der Kupplungsreaktion sein können.

Es ist erkannt worden, daß Moranolin und seine Derivate wertvolle Arzneimittel zum Steuern des Anstieges des Blutzuckerspiegels bei zuckerbelasteten Lebewesen sind (japanische Patentanmeldung No. 83951/77, No. 12381/79 und No. 106477/79).

Im Zuge der Entwicklung weiterer wertvoller Moranolinderivate wurde die vorliegende Erfindung konzipiert.

Cyclodextringlycosyltransferase, die erfindungsgemäß verwendet wird, kann durch Kultivieren eines Mikroorganismus, der zum Produzieren von Enzym befähigt ist, beispielsweise eines Mikroorganismus des Stammes Bacillus oder Klebsiella, in einem Nährbodenmedium erhalten werden, das eine Kohlenstoffquelle, wie Stärke oder Kleie, eine Stickstoffquelle, wie Korneinweichlauge, Polypepton, Klebereiweißbrei oder Hefeextrakt, eine anorganische Substanz, wie Ammoniumsulfat, Calciumcarbonat oder Magnesiumchlorid, und eine andere zur Produktion von Enzym geeignete Substanzen enthält, und Reinigen der gebildeten Cyclodextringlycosyltransferase durch bekannte Maßnahmen, wie Aussalzen, Dialyse, Adsorption an Stärke, Desorption, Gelfiltration oder Ionenaustauschchromatographie, erhalten werden. Ein Filtrat des Nährbodens kann als Rohenzymflüssigkeit verwendet werden, aber gewöhnlich wird das Enzym in Form eines teilweise gereinigten, hochgradig gereinigten oder stabilisierten Enzymproduktes verwendet.

Wenn die Verbindung (II) und Cyclodextrin (Stärke oder Dextrin können ebenso verwendet werden) in Gegenwart der so erhaltenen Cyclodextringlycosyltransferase umgesetzt werden, kann das gewünschte Produkt erhalten werden. Die Reaktionsbedingungen werden in Abhängigkeit von dem Ursprung der verwendeten Cyclodextringlycosyltransferase verändert, aber gewöhnlich wird das gewünschte Produkt erhalten, wenn man die Umsetzung bei einer Temperatur von etwa 40°C und einem pH-Wert von 5,0 bis 8,5 während einer Reaktionszeit von 1 bis 3 Tagen durchführt. Bekannte Trennungs- und Reinigungsmethoden können zum Isolieren des gewünschten Produktes aus dem flüssigen Reaktionsgemisch angewendet werden, beispielsweise die folgenden Verfahren:

Zunächst wird das flüssige Reaktionsgemisch durch eine Säule mit stark saurem Ionenaustauschharz geschickt, um basische Substanzen an dem Harz zu adsorbieren. Dann wird mit 0,5 n wäßrigem Ammoniak eluiert, und das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wird mittels einer Sephadex®-Säule fraktioniert, und die notwendigen Fraktionen werden gesammelt und gefriergetrocknet, wobei ein weißes Pulver erhalten wird. Die jeweiligen Fraktionen können beispielsweise durch HPLC identifiziert werden. Wenn die HPLC in einem geeigneten Chromatographen unter Anwendung einer µ-Bondapak®-NH₂-Säule durchgeführt und mit Acetonitril/Wasser (70/30) bei einer Durchflußmenge von 1,5 ml/min entwickelt wird, wie es bei den Beispielen 1, 2 und 3 (Fig. 1, 2 und 3) erläutert wird, wird festgestellt, daß die jeweiligen Komponenten folgende Verweilzeiten haben:

Tabelle 1

Elementaranalsenwerte, Molekulargewichte, spezifische Drehungen (wäßrige Lösungen) und Schmelzpunkte der gewünschten Produkte sind nachfolgend zusammengestellt. Die Molekulargewichte wurden mit einem Hitachi®-Meßgerät, Modell 115, gemessen. Die Werte in Klammern sind die theoretischen Werte bzw. zeigen die Konzentrationen an, bei denen die spezifischen Drehungen gemessen wurden.

Tabelle 2

Fortsetzung

Die so erhaltenen gewünschten Produkte sind neue Substanzen, die in der Literatur bisher nicht genannt sind. Sie haben eine ausgezeichnete Wirkung auf die Steuerung des Anstieges des Blutzuckerspiegels, wie nachstehend noch erläutert wird, so daß sie wertvolle Arzneimittel darstellen.

Steuerung des Anstieges des Blutzuckerspiegels

5 Wochen alte männliche Ratten der SD-Reihen werden in Gruppen von je vier Tieren eingeteilt, an die 2 g/kg Saccharose und 5 mg/kg der Testverbindungen peroral verabreicht werden. Zu vorbestimmten Zeitintervallen wird über einen Zeitraum von 180 Minuten vom Beginn der Verabreichung an von der Schwanzvene Blut abgenommen und die Blutspiegelwerte bestimmt. Die Fläche unterhalb der Zeit-Blutspiegelanstieg-Kurve wird bestimmt. Das Inhibionsverhältnis des Blutspiegelanstieges der Testverbindung wird aus dem Grundwert berechnet, der von der Gruppe erhalten wird, an die nur Wasser verabreicht wurde, und dem Vergleichswert, der von der Gruppe erhalten wird, an die nur Saccharose allein verabreicht wurde, gemäß der folgenden Formel:

Inhibitionsverhältnis = × 100

Die Ergebnisse der obigen Berechnung des Inhibitionsverhältnisses des Blutspiegelanstieges sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Tabelle 3

Hinsichtlich Verbindung (I), bei der n=0 ist, wurden weitere Forschungen angestellt, wobei gefunden wurde, daß durch äußerst einfache Reaktionsmaßnahmen eine gemischte Lösung, die gemäß dem Verfahren nach Anspruch 2 erhalten wurde, mit α-1,4-Glucanglucohydrolase (EC 3.2.1.3) Oligoglucosylmoranoline oder N-Niederalkylmoranolin, bei dem n=1 oder eine größere ganze Zahl ist, bei sehr guter Ausbeute in 4-(α-D-Glucosyl)-moranolin oder 4-(α-D-Glucosyl)-N-niederalkylmoranolin, bei dem n=0 ist, umgewandelt werden kann.

α-1,4-D-Glucanglucohydrolase, die bei dieser Methode verwendet wird, wird hauptsächlich durch Schimmelpilze, wie Rhizopus niveus, Rhizopus delemar, Aspergillus niger und Aspergillus awamori, produziert, und sie wird auch Glucoamylase, Amyloglucosidase, α-Amylase oder Taka-Amylase B genannt.

Bei der Durchführung dieser Methode kann dieses Enzym in Form von kristallinem Enzym oder einem dieses Enzym enthaltenden Nährboden verwendet werden, beispielsweise einer Rohenzymflüssigkeit, die durch Kultivieren von Rhizopus niveus erhalten wird. Außerdem kann ein anderes Kohlenhydrate hydrolysierendes Enzym, wie α-Amylase oder β-Amylase, in dem erfindungsgemäß zu verwendenden Enzym anwesend sein. Die α-1,4-Glucanglucohydrolase wirkt so, daß Stärke aus nicht reduzierenden Endgruppen in Glucoseeinheiten zersetzt wird. Selbstverständlich können Maltose-, Maltotriose-, Maltotetraose- und höhere Oligosaccharide von α-1,4-Bindungen durch das vorliegende Enzym in gleicher Weise zu Glucoseeinheiten zersetzt werden. Diese Reaktionen können wie folgt verdeutlicht werden:

Stärke + nH₂O → n · Glucose
G-G-G . . . . . -G + mH₂O → mG

Dabei sind n und m ganze Zahlen, G=Glucose und G-G eine α-1,4-Bindung.

Wie dem Fachmann ohne weiteres einleuchten wird, ist die Herkunft des erfindungsgemäßen Enzyms nicht auf Schimmelpilze beschränkt.

Das erste charakteristische Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die bislang unbekannte Tatsache festgestellt wurde, daß, während Maltose der Formel

durch α-1,4-Glucanglucohydrolase sofort zu Glucose zersetzt wird, 4-(α-D-Glucosyl)-moranolin in 4-(α-D-Glucosyl)-N- niederalkylmoranolin durch α-1,4-Glucanglucohydrolase kaum zersetzt werden, und Oligoglucosylmoranoline und N-Niederalkly- oligoglucosylmoranoline der Formel (I), mit Ausnahme in dem Fall, wo n=0 ist, werden durch dieses Enzym bei einer Geschwindigkeit zersetzt, die nicht höher ist als die Maltosezersetzungsgeschwindigkeit, aber praktisch ausreichend hoch ist.

Dieser Punkt wird nachstehend im einzelnen erläutert.

Die Reaktion nach der Erfindung wird allgemein wie folgt ausgedrückt:

Hierbei ist G=Glucose, M_R=Moranolin oder N-Niederalkylmoranolin, m eine ganze Zahl, G · A=α-1,4-Glucanglucohydrolase, jede Bindung bezeichnet eine α-1,4-Bindung, und k _m, k _m₁ . . . k₂ und k₁ bedeuten Reaktionsverhältniskonstanten für die jeweiligen Stufen.

In der Praxis schreiten die Reaktionen der jeweiligen Stufen bei einem Gemisch von Verbindungen ab, die sich in der Glucosezahl (m) unterscheiden. Um folglich das beabsichtigte G-M_R in dem flüssigen Reaktionsgemisch anzuhäufen, ist es unabdingbar, daß die Verhältniskonstanten k _m, k _m₁ . . . k₂ ausreichend groß, die Verhältniskonstante k₁ jedoch ausreichend klein sein sollte. Fig. 4 erläutert diesen Punkt, wie nachstehend erläutert wird. Eine vorbestimmte Menge N-Methyloligoglycosylmoranolin wird in einem Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von 125 ml an 1 g Dowex® 50W × 2 (H⁺) adsorbiert und in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert, und 10 mg α-1,4- Glucanglucohydrolase werden zu der Suspension zugesetzt. Die Inkubationstemperatur beträgt 40°C, und 500 µl der Flüssigkeit werden an vorbestimmten Intervallen als Proben abgenommen und die Glucosemenge bestimmt. Wenn Maltose als Substrat verwendet wird, wird es mit 1 g Dowex® 50W × 2 (H⁺) gemischt und in diesem Zustand bei 40°C inkubiert.

Glucosebestimmung

1 ml 0,3 n Ba(OH)₂ und 1 ml 5%iges ZnSO₄ werden zu 500 µl des flüssigen Reaktionsgemisches zugesetzt und unter einer Last von 2000 g 10 Minuten lang zentrifugiert. 30 µl der überstehenden Flüssigkeit werden abgenommen, und 3 ml handelsübliches Glucosefarbreagens werden zu der überstehenden Flüssigkeitsprobe zugesetzt. Das Gemisch wird ausreichend gerührt und bei Raumtemperatur 35 Minuten lang stehengelassen, wonach die Absorption bei 420 nm gemessen wird. Separat wird ein Glucosebezugsreagens (9,1 mg/dl) in gleicher Weise behandelt und die Absorption bei 420 nm gemessen. Auf dieser Grundlage dieser Messungen wird die Menge der in dem flüssigen Reaktionsgemisch gebildeten Glucose bestimmt.

Enzym

Etwa 22 Einheiten/mg α-1,4-Glucanglucohydrolase (kristallin), herstammend von Rhizopus niveus.

Aktivität des Enzyms

1 ml Enzymlösung werden mit 5 ml einer 1%igen Stärkelösung und 4 ml 0,05 m Essigsäurepufferlösung gemischt. Bei 40°C wird inkubiert, und die Menge des gebildeten reduzierenden Zuckers (Glucose) wird nach der Fehling-Lehman-Schoorl-Methode bestimmt.

Eine Einheit des Enzyms entspricht der Aktivität der Bildung von 10 mg Glucose in 30 Minuten.

Substrat und an Harz absorbierte Harzmenge

Maltose100 mg 4-(α-D-Glucosyl)-N-methylmoranolin100 mg 4-(α-D-Maltosyl)-N-methylmoranolin 50 mg 4-(α-D-Maltotriosyl)-N-methylmoranolin 50 mg 4-(α-D-Maltotetraosyl)-N-methylmoranolin 50 mg

Die Versuchswerte sind in Fig. 4 gezeigt. Die Reaktionszeit ist auf die Abszisse und das Verhältnis der Zersetzung, bezogen auf die vollständige Zersetzung von Glucose, auf der Ordinate aufgetragen. Da die Zersetzung von N-Methylglucosylmoranolin extrem gering ist, wie in Fig. 4 gezeigt ist, wird im Fall von N-Methyloligoglucosylmoranolinen, um die Zersetzungsgeschwindigkeit mit der von Maltose vergleichen zu können, jeder Wert ausgedrückt als ein relativer Wert, berechnet unter der Annahme, daß der Wert, der erhalten wird, wenn die Zersetzung bis zu Glucosylmoranolin oder N-Methylglucosylmoranolin fortschreitet, 100% ist. Nach Bestimmung der Glucosemenge wird die Reaktionsflüssigkeit filtriert und das Ionenaustauschharz gesammelt, ausreichend mit Wasser gewaschen und mit 0,5 n wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt. Die Feststoffe werden mit destilliertem Wasser aufgenommen und der HPLC-Chromatographie bei Verwendung einer µ-Bondapak®-NH₂-Säule, unterzogen, und das Reaktionsprodukt wird mit einem Chromatopac®-Gerät identifiziert. Die Verhältnisse der Bildung von N-Methylmoranolin sind etwa 3%, etwa 2%, etwa 2%, etwa 1% und etwa 2% im Falle von 4-(α-D-Glucolsyl)-N-methylmoranolin, 4-(α-D-Amylosyl)-N-methylmoranolin, 4-(a-D-Maltotriosyl)-N-methylmoranolin bzw. 4-(α-D-Maltotetraosyl)-N-methylmoranolin. Eine ähnliche Tendenz wird bei Oligoglucosylmoranolinen beobachtet. In diesem Fall ist die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion höher als bei N-Methyloligosylmoranolinen, und unter denselben Reaktionsbedingungen wie bei N-Methyloligoglucosylmoranolinen wird Maltose weitgehend vollständig innerhalb von einer Stunde zersetzt, jedoch die Zersetzungsverhältnisse von 4-(α-D-Glucosyl)-moranolin, 4-(α-D-Maltosyl)-moranolin und 4-(α-D- Maltotriosyl)-moranolin sind etwa 3%, etwa 53% bzw. etwa 50% (die Bedeutung des Zersetzungsverhältnisses ist dieselbe wie für N-Methyloligoglycosylmoranoline angegeben). Bei den vorstehenden Versuchen wird das Substrat an ein stark saures Ionenaustauschharz adsorbiert (Maltose wird mit dem Harz vermischt). Der Grund für die Verwendung dieser Harze wird nachstehend im einzelnen erläutert. Die Anwesenheit einer überschüssigen Menge an stark saurem Ionenaustauschharz unterdrückt die enzymatische Reaktion. Es treten jedoch keine nennenswerten Probleme auf, wenn die Harzmenge bis zu etwa 4 g in 100 ml Reaktionsflüssigkeit beträgt. Wenn das Harz mit Moranolin, N-Niederalklymoranolin, Oligoglycosylmoranolinen und N-Niederalkylmoranolinen gesättigt ist, wird die Reaktion nicht unterdrückt, selbst wenn weiteres Harz zugesetzt wird.

Gewöhnlich wird α-1,4-Glucanglucohydrolase in einer Pufferlösung verwendet, aber selbst wenn die Reaktion in destilliertem Wasser druchgeführt wird, sind praktisch keine Nachteile zu erwarten, auch wenn die Aktivität in gewissem Maße herabgesetzt ist.

Das zweite charakteristische Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Feststellung, daß, wenn das vorstehend genannte Gemisch an einen Kationenaustauscherteil adsorbiert und mit α-1,4-Glucanglucohydrolase umgesetzt wird, die Gemischkonzentration in der Reaktionsflüssigkeit beachtlich erhöht werden kann und die Reaktion nicht durch den Zustand des Gemisches beeinflußt wird, und eine Produktunterdrückung durch Moranolin oder N-Niederalkylmoranolin, das sich in winziger Menge bildet, wird nicht verursacht, was erhebliche großtechnische Vorteile bringt. Dies wird nachstehend im einzelnen erläutert.

Moranolin, N-Niederalkylmoranoline, Oligoglycosylmoranoline und N-Niederalkyloligoglucosylmoranoline hemmen die Aktivität von α-1,4-Glucanglucohydrolase. Die Intensitäten der Inhibition dieser Verbindungen sind in Tabelle 4 angegeben. Die Inhibition wird gemäß der folgenden Methode bestimmt.

Enzym

Glucoamylase (kristallin, herstammend von Rhizopus niveus) wird in destilliertem Wasser gelöst, so daß die Konzentration 50 µg/ml beträgt, und das Enzym wird in Form der so erhaltenen Lösung verwendet.

Lösliche Stärke wird in einer Pufferlösung bei hoher Temperatur gelöst, so daß die Konzentration 1,4% beträgt, und die Lösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und verwendet.

Pufferlösung

0,1 m Phosphatpufferlösung (pH-Wert 5,7)

Ausgangsflüssigkeit

Verfahren

Die Ausgangsflüssigkeit wird bei 40°C 10 Minuten lang inkubiert, und 1 ml einer 0,3 n Lösung von Ba(OH)₂ und 1 ml einer 5%igen ZnSO₄-Lösung werden zugesetzt. Es wird 10 Minuten unter einer Last von 2000 g zentrifugiert, und 30 µl der überstehenden Lösung werden als Probe benutzt und mit 3 ml eines Glucosefarbreagens versetzt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 35 Minuten lang stehengelassen, wonach die Absorption bei 420 nm gemessen wird. Die prozentuale Inhibition wird nach der folgenden Formel errechnet:

Prozentuale Inhibition =

In der Formel sind C die Absorbanz der Vergleichsprobe, T die Absorbanz der Testprobe, B′ die Absorption der Blindprobe (I) und B die Absorption der Blindprobe (II).

Die prozentuale Inhibition wird auch in bezug auf die Verdünnungen bestimmt, und die Konzentration (IC₅₀), die eine 50%ige Inhibition vorausgesetzt, wird gefunden. In Tabelle 4 ist die prozentuale Inhibition, die bei der in Klammern angegebenen Konzentration erhalten wird, in den Fällen angegeben, wenn die Inhibition niedrig ist.

Tabelle 4

Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, ist die Inhibitation von Moranolin und N-Niederalkylmoranolinen sehr groß, und die Inhibition wird gewöhnlich durch Glycosylierung herabgesetzt. Folglich wird die Reaktion bei niedriger Konzentration vorangetrieben, jedoch bei einer Konzentration von einigen zwanzig (scores) bis zu einigen hundert µg/ml wird die Reaktion weitgehend gehemmt. Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, unterscheidet sich diese kritische Konzentration entsprechend dem Mischungsverhältnis der jeweiligen Bestandteile des Gemisches und der Art der niederen Alkylgruppe. Da die Inhibition von Moranolin und N-Niederalkylmoranolinen einige hundert- bis einige tausendmal so groß ist wie die von glycosylierten Substanzen, wird die kritische Konzentration außerordentlich stark abgeändert durch die Mengen an erhaltenem Moranolin oder Niederalkylmoranolinen. Bei dem vorliegenden Vorgang jedoch wird aus der Sicht der Herstellungskosten eine höhere Konzentration bevorzugt, und die Reaktion sollte nicht durch den Zustand des Gemisches beeinflußt werden. Bei den vorliegenden Forschungen wurde dieser Punkt in Betracht gezogen, und es wurde gefunden, daß, wenn das Enzym in dem Zustand verwendet wird, in dem es an ein saures Kationenaustauscherharz adsorbiert ist, die Reaktion bei einer Konzentration vorangetrieben wird, die größer ist als einige tausend µg/ml, und die Reaktion wird nicht beeinflußt vom Zustand des Gemisches. Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Herausfinden dieser Tatsache. Nebenbei bemerkt, schritt bei den Beispielen 5, 6, 7 und 9, die nachstehend beschrieben sind, die Reaktion überhaupt nicht fort, wenn das Enzym in dem Zustand eingesetzt wird, in dem es nicht an ein stark saures Kationenaustauscherharz adsorbiert ist.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen im einzelnen erläutert. Die folgenden Beispiele 1 bis 4 erläutern dabei die erste Stufe des erfindungsgemäßen Gesamtverfahrens, d. h. Verfahrensstufe A) gemäß Patentanspruch 2.

Bei den vorstehend erläuterten Versuchen sowie bei den nachfolgenden Ausführungsbeispielen wurden folgende Geräte verwendet:

a) Für die HPLC wurde ein Chromatograph des Typs ALC/GPC-244® sowie eine µ-Bondapak®-CH- bzw. -NH₂-Säule benutzt; entwickelt wurde jeweils mit Acetonitril/Wasser (70/30, 1,5 ml/min).
b) Die Flächenverhältnisse der jeweiligen Fraktionen auf dem Differentialrefraktometer wurden unter Verwendung von Chromatopac c-R1A® ermittelt.
c) Benutzter Ionenaustauscher: Dowex® 50W × 2, H⁺-Typ.

Beispiel 1 (A) Kultivieren von Bacillus macerans

(1) Ein 500-ml-Erlenmeyerkolben wurde mit 150 ml Nährboden beschickt, der 1% Korneinweichlauge, 1% lösliche Stärke, 0,5% (NH₄)₂SO₂ und 0,5% CaCO₃ enthielt und einen pH-Wert von 7 hatte, und der Nährboden wurde 15 Minuten lang bei 120°C sterilisiert. Dann wurden vier Platinlöffel voll Zellen von Bacillus macerans IFO 3490, die sich auf einem Schrägnährboden, der 1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% Glucose, 1,5% Glycerin, 0,3% NaCl und 1,5% neutralisiertes Leberverdauungsprodukt ("OXOID®") enthielt, ausreichend ausgebreitet hatten, zugegeben, und der obige Nährboden wurde mit 1,5% Agar geimpft und drei Tage lang bei 37°C kultiviert. Dann wurden 300 ml des Nährbodens auf 9 l eines Nährbodens in einem Schüttelfermentierer geimpft, der dieselbe Zusammensetzung hatte. Es wurde drei Tage lang bei 37°C unter ausreichendem Belüften und Rühren kultiviert, wodurch eine Enzymflüssigkeit mit 130 bis 150 Einheiten des Enzyms ("Einheit" wird nachstehend noch definiert) in Form der überstehenden Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren erhalten wurde.

(2) Ein 4% Weizenkleie, 0,5% Korneinweichlauge, 0,5% lösliche Stärke, 0,5% (NH₄)₂SO₄ und 0,5% CaCO₃ enthaltender Nährboden mit einem pH-Wert von 6,7 wurde 15 Minuten lang bei 120°C sterilisiert, und 200 ml davon wurden in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben gegeben. Der Nährboden wurde mit drei Platinlöffeln voll Zellen von Bacillus macerans IFO 3490 geimpft, und es wurde 4 Tage lang bei 37°C durch Schütteln kultiviert, wobei eine Enzymflüssigkeit erhalten wurde, die etwa 90 Enzymeinheiten in Form der überstehenden Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren enthielt.

(B) Einheit der Aktivität von Cyclodextringlycosyltransferase

Lösliche Stärke (für biochemische Versuche) wurde bei einer Konzentration von 0,7% in 0,05 m Acetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 5,5 zur Bildung einer Substratlösung gelöst. 50 µl der Enzymflüssigkeit wurden zu 950 µl der so gebildeten Substratlösung zugesetzt, und es wurde 10 Minuten bei 40°C umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 0,5 ml 0,5 n Essigsäure abgebrochen. 100 µl der Reaktionsflüssigkeit wurden abgenommen und mit 3 ml Wasser und 0,8 ml Jodlösung gemischt, die durch Auflösen von Jod in 0,25 m KJ-Lösung erhalten worden war, so daß eine Jodkonzentration von 0,01 m vorlag. Das Gemisch wurde gerührt und die Absorption (A _t) bei 660 nm gemessen.

Separat wurden 50 µl Wasser und 0,5 ml 0,5 n Essigsäure zu 950 µl der obigen Substratlösung zugesetzt, und 100 µl der so gebildeten Lösung wurden abgenommen und wie vorstehend mit der Jodlösung gemischt. Die Absorption (A _r) bei 660 nm wurde gemessen. Eine Einheit des Enzyms wird durch die folgende Formel definiert:

Dieser Wert entspricht der Aktivität von 1 ml der Enzymlösung zum Herabsetzen der Absorption um 1% durch Umsetzen bei 40°C während 1 Minute.

(C) Bereitung der Rohenzymlösung

Der durch Kultivieren von Bacillus macerans IFO 3490 erhaltene Nährboden wurde zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gefriergetrocknet und das Produkt in einer kleinen Menge Wasser aufgenommen, um ein Enzymkonzentrat zu erhalten. Es wurde bei 5°C unter Verwendung von Wasser als äußere Flüssigkeit, aus dem niedere Moleküle entfernt worden waren, ausreichend dialysiert und das Produkt als Rohenzymlösung verwendet.

(D) Umsetzung

In 400 ml der Rohenzymlösung mit einer Aktivität von 870 Einheiten/ml (348 000 Einheiten insgesamt) wurden 8 g Moranolinhydrochlorid und 8 g α-Cyclodextrin gelöst, und durch Schütteln wurde drei Tage lang bei 38°C und einem pH-Wert von 5,7 kultiviert. Ein Teil der Reaktionsflüssigkeit wurde abgenommen, die Grundsubstanzen wurden daraus gesammelt, und es wurde analysiert unter Verwendung eines HPLC- Chromatographen, einer Saccharid- Analysesäule (µ-Bondapak®-CH) und Entwickeln. Die Flächenverhältnisse der jeweiligen Fraktionen auf dem Differentialrefraktometer wurden bestimmt, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:

Nichtumgesetztes Moranolin43% 4-(α-D-Glucosyl)-moranolin16% 4-(α-D-Maltosyl)-moranolin16% 4-(α-D-Maltotriosyl)-moranolin12% 4-(α-D-Maltotetraosyl)-moranolin 8%

(E) Isolierung und Reinigung

Etwa 400 ml der Reaktionsflüssigkeit wurden 10 Minuten lang auf 120°C erhitzt und mit 160 ml Trichloräthylen versetzt, und das Gemisch wurde kräftig gerührt. Die untere Schicht wurde verworfen. Die obere Schicht wurde zentrifugiert, wobei eine durchsichtige überstehende Flüssigkeit erhalten wurde. Diese wurde durch eine Säule geschickt, die mit 80 ml eines stark sauren Ionenaustauschharzes gepackt war, um die basischen Substanzen in der Säule zu adsorbieren. Es wurde mit 0,5 n wäßrigem Ammoniak eluiert und das Eluat gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wurde mit Sephadex G-25® (55 mm Durchmesser und 470 mm Höhe) und Sephadex G-10® (40 mm Durchmesser und 820 mm Höhe) behandelt, während die jeweiligen Fraktionen durch HPLC (µ-Bondapak®-CH-Säule) identifiziert wurden, um die gewünschten Oligoglycosylmoranoline zu erhalten, nämlich nachgereicht:

1,6 g 4-(α-D-Glucosyl)-moranolin,
1,6 g 4-(α-D-Maltosyl)-moranolin,
1,2 g 4-(α-D-Maltotriosyl)-moranolin und 0,8 g 4-(α-D-Maltotetraosyl)-moranolin.

Beispiel 2

5 g N-Methylmoranolin wurden in einer kleinen Menge Wasser gelöst und der pH-Wert mit 3 n Salzsäure auf 5,68 eingestellt (das Volumen der Lösung betrug nach dem Einstellen des pH-Wertes 25 ml).

80 g α-Cyclodextrin wurden in 3975 ml der Rohenzymlösung mit einer Aktivität von 250 Einheiten/ml gelöst, und die wäßrige Lösung von N-Methylmoranolin wurde zugesetzt und der pH-Wert erneut auf 5,68 eingestellt. Zum Umsetzen wurde 3 Tage lang bei 39°C unter Schütteln kultiviert. Die Reaktionsflüssigkeit wurde zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Ionenaustauschersäule (100 ml) geschickt, um die basischen Substanzen in der Säule zu adsorbieren. Es wurde mit 0,5 n wäßrigem Ammoniak eluiert und das Eluat unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt (vgl. Fig. 1). Das erhaltene Pulver wurde mit einer kleinen Menge Wasser aufgenommen und die Lösung durch Sephadex®-G-15-Säule geschickt (48 mm Durchmesser und 850 mm Länge). Es wurden Fraktionen von je 5 ml erhalten, die durch HPLC (µ-Bondapak®-NH₂-Säule) identifiziert wurden. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet, um die gewünschten Oligoglycosyl-N-methylmoranoline zu erhalten, nämlich:
0,84 g 4-(α-D-Glucosyl)-N-methylmoranolin,
0,91 g 4-(α-D-Maltosyl)-N-methylmoranolin,
0,91 g 4-(α-D-Maltotriosyl)-N-methylmoranolin,
0,84 g 4-(α-D-Maltotetraosyl)-N-methylmoranolin,
0,77 g 4-(α-D-Maltopentaosyl)-N-methylmoranolin,
0,70 g 4-(α-D-Maltohexaosyl)-N-methylmoranolin, und
0,56 g 4-(α-D-Maltoheptaosyl)-N-methylmoranolin.

Beispiel 3

500 ml N-Ethylmoranolin wurden in einer kleinen Menge Wasser gelöst und der pH-Wert mit 1 n Salzsäure auf 5,8 eingestellt (das Volumen der Lösung betrug nach dem Einstellen des pH-Wertes 20 ml).

Separat wurden 8 g α-Cyclodextrin in 380 ml Rohenzymflüssigkeit mit einer Aktivität von 260 Einheiten/ml gelöst. Beide Lösungen wurden gemischt, und der pH-Wert wurde erneut auf 5,77 eingestellt. Zum Umsetzen wurde drei Tage lang bei 39°C durch Schütteln kultiviert. Auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise wurden dann die Oligoglycosyl-N-ethylmoranoline aus der Reaktionsflüssigkeit erhalten, nämlich (nachgereicht):

113 mg (α-D-Glucosyl)-N-ethylmoranolin,
74 mg (α-D-Maltosyl)-N-ethylmoranolin,
54 mg (a-D-Maltotriosyl)-N-ethylmoranolin,
49 mg (α-D-Maltotetraosyl)-N-ethylmoranolin, und
25 mg (α-D-Maltopentaoxyl)-N-ethylmoranolin.

Beispiel 4

500 mg N-Propylmoranolin wurden in einer kleinen Menge Wasser gelöst und der pH-Wert mit 1 n Salzsäure auf 5,7 eingestellt (das Volumen der Lösung nach dem Einstellen des pH-Wertes betrug 20 ml).

Separat wurden 8 g α-Cyclodextrin in 380 ml der Rohenzymlösung mit einer Aktivität von 260 Einheiten/ml gelöst. Beide Lösungen wurden gemischt und der pH-Wert erneut auf 5,7 eingestellt. Es wurde drei Tage lang bei 39°C durch Schütteln kultiviert, wonach auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise die Oligoglycosyl- N-propylmoranoline aus der Reaktionsflüssigkeit erhalten wurden, nämlich (nachgereicht):

134 mg N-(α-D-Glucosyl)-N-propylmoranolin,
82 mg N-(α-D-Maltosyl)-N-propylmoranolin,
80 mg N-(α-D-Maltotriosyl)-N-propylmoranolin,
83 mg N-(α-D-Maltotetraosyl)-N-propylmoranolin,
79 mg N-(a-D-Maltopentaosyl)-N-propylmoranolin,
67 mg N-(α-D-Maltohexaosyl)-N-propylmoranolin,
63 mg N-(α-D-Maltoheptaosyl)-N-propylmoranolin, und
45 mg N-(α-D-Maltooctaosyl)-N-propylmoranolin,

Beispiel 5

6,5 g Moranolin wurden in einer kleinen Menge Wasser gelöst und der pH-Wert mit 3 n Salzsäure auf 5,7 eingestellt (das Volumen der Lösung betrug nach dem Einstellen des pH-Wertes 32,5 ml).

26 g α-Cyclodextrin wurden in 1300 ml der Rohenzymlösung von Cyclodextringlycosyltransferase mit einer Aktivität von 460 Einheiten/ml gelöst, und die wäßrige Moranolinlösung wurde zugesetzt und der pH-Wert erneut auf 5,67 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Tage lang bei 39°C geschüttelt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde zentrifugiert und die überstehende Lösung durch eine Ionenaustauschersäule (Harzmenge 50 ml) geschickt, um die basischen Substanzen an dem Harz zu adsorbieren. Ein Teil des ausreichend mit Wasser gewaschenen Harzes wurde mit 0,5 n wäßrigem Ammoniak eluiert und das Eluat unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt. Das erhaltene Pulver wurde in einer kleinen Menge Wasser aufgenommen und die Lösung mittels Chromatopac® nach HPLC (µ-Bondapak®-NH₂-Säule) analysiert (die Zusammensetzung des Gemisches vor der Umsetzung mit α-1,4-Glucanglucohydrolase wurde auf diese Weise bestimmt. Dann wurden etwa 48 ml des verbliebenen Harzes in 1200 ml Wasser suspendiert und mit 120 mg (etwa 22 Einheiten/mg) α-1,4-Glucanglucohydrolase, herstammend von Rhizopus niveus, versetzt. Es wurde bei 40°C inkubiert, das Reaktionsgemisch wurde in vorbestimmten Intervallen abgenommen, und die Menge an in dem Reaktionsgemisch gebildeter Glucose wurde bestimmt, um das Fortschreiten der Reaktion zu überwachen. Die Glucosemenge stieg nach Beginn der Umsetzung sprunghaft an, und das Reaktionsverhältnis erhöhte sich in 5 Stunden auf 89%. Die Reaktion wurde noch weitergeführt und 25 Stunden nach Beginn der Reaktion abgebrochen. Das Harz wurde abfiltriert, ausreichend mit Wasser gewaschen und mit 0,5 n wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt. Das erhaltene Pulver wurde der HPLC auf die vorstehend beschriebene Weise unterzogen, und das Gemisch wurde nach der Umsetzung mittels Chromatopac® analysiert. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind nachfolgend zusammengestellt.

Beispiel 6

2 g des in Fig. 5 gezeigten Gemisches wurden auf 10 ml Ionenaustauscherharz adsorbiert, und das Harz wurde in 500 ml Wasser suspendiert und die Suspension mit 50 mg (etwa 22 Einheiten/mg) α-1,4-Glucanglucosehydrolase versetzt. Es wurde 17 Stunden lang bei 40°C umgesetzt, wonach das Harz von der Reaktionsflüssigkeit abilfitriert wurde. Das Harz wurde mit 0,5 n wäßrigem Ammoniak eluiert und das Eluat unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt. Die erhaltenen Feststoffe wurden der HPLC unterzogen und mittels Chromatopac® analysiert, wobei die in Fig. 6 gezeigten Ergebnisse erhalten wurden. Die Mischungsverhältnisse der jeweiligen Komponenten in Fig. 5 und 6 sind nachstehend zusammengestellt.

Nach der Umsetzung wurde das Gemisch der Säulenchromatographie mit Sephadex® G-15 (48 mm Durchmesser × 850 mm Höhe) unterzogen, und die Säule wurde mit destilliertem Wasser entwickelt. Jede Fraktion wurde mittels HPLC geprüft, die Fraktionen, die das gewünschte 4-(α-D-Glucosyl)-moranolin enthielten, wurden vereinigt, und die vereinigten Fraktionen wurden lyophilisiert, wobei 387 mg des Produktes als farbloses Pulver erhalten wurden.

Beispiel 7

Unter den in Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen wurde 26 Stunden lang bei 40°C umgesetzt. Es wurde ein Gemisch aus 5,8% Moranolin und 93,2% 4-(a-D-Glucosyl)-moranolin erhalten. Andere Komponenten konnten nicht nachgewiesen werden.

Nach der Umsetzung wurde auf die in Beispiel 6 erläuterte Weise weiterbehandelt, wobei 394 mg des Produktes als farbloses Pulver erhalten wurden.

Beispiel 8

200 mg des in Fig. 5 gezeigten Gemisches wurden in 4 l Wasser gelöst, der pH-Wert wurde mit 0,5 n HCl auf 5,7 eingestellt, und die Lösung wurde mit 200 mg (etwa 22 Einheiten/mg) α-1,4- Glucanglucohydrolase versetzt. Es wurde 41 Stunden lang bei 40°C umgesetzt und die Reaktionsflüssigkeit durch eine Ionenaustauschersäule (10 ml Harz) geschickt. Das Harz wurde ausreichend mit Wasser gewaschen und mit 0,5 n wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt. Das erhaltene Pulver wurde in einer kleinen Menge Wasser aufgenommen und der HPLC unterzogen. Es zeigte sich, daß das Produkt ein Gemisch aus 6% Moranolin und 93,4% 4-(α-D-Glucosyl)-moranolin war. Andere Komponenten konnten nicht nachgewiesen werden.

Beispiel 9

1 g N-Methylmoranolin wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst und der pH-Wert mit 1 n Salzsäure auf 5,7 eingestellt (das Volumen betrug nach dem Einstellen des pH-Wertes 10 ml). Separat wurden 16 g α-Cyclodextrin zu 790 ml Rohenzymflüssigkeit von Cyclodextringlycosyltransferase (336 Einheiten/ml) zugesetzt. Beide Flüssigkeiten wurden vereinigt und der pH-Wert erneut auf 5,6 eingestellt. Es wurde 2 Tage lang unter Schütteln bei 39°C umgesetzt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde zentrifugiert und die überstehende Lösung durch eine Ionenaustauschersäule (Harzmenge 8 ml) geschickt, um die basischen Substanzen an dem Harz zu adsorbieren. Das Harz wurde ausreichend mit Wasser gewaschen, und ein Teil (etwa 2 ml) des Harzes wurde abgenommen und unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt, und unter den in Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen wurde das erhaltene Pulver der HPLC unterzogen und mittels Chromatopac® analysiert (die Zusammensetzung des Gemisches vor dem Umsetzen mit α-1,4-Glucanglucohydrolase wurde so ermittelt). Etwa 6 ml des verbliebenen Harzes wurden in 150 ml Wasser suspendiert, und 90 mg (etwa 22 Einheiten/mg) α-1,4- Glucanglucohydrolase wurden zu der Suspension zugesetzt und 48 Stunden lang bei 40°C umgesetzt. Das Harz wurde von der Reaktionsflüssigkeit abfiltriert und ausreichend mit Wasser gewaschen und mit 0,5 n wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt. Das erhaltene Pulver wurde der HPLC unterzogen und mittels Chromatopac® analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend zusammengefaßt.

Beispiel 10

1 g N-Propylmoranolin wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst und der pH-Wert mit 1 n Salzsäure auf 5,7 eingestellt (das Volumen betrug nach dem Einstellen des pH-Wertes 20 ml). Separat wurden 16 g α-Cyclodextrin zu 790 ml Rohenzymlösung von Cyclodextringlycosyltransferase (260 Einheiten/ml) zugesetzt. Beide Flüssigkeiten wurden vereinigt und der pH-Wert erneut auf 5,7 eingestellt. Es wurde 2 Tage lang unter Schütteln bei 39°C umgesetzt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde zentrifugiert und die überstehende Lösung durch eine Ionenaustauschersäule (Harzmenge 8 ml) geschickt, um die basischen Substanzen an dem Harz zu adsorbieren. Das Harz wurde ausreichend mit Wasser gewaschen, ein Teil (etwa 2 ml) des Harzes wurde abgenommen und unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt, und unter den in Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen wurde das erhaltene Pulver der HPLC unterzogen und mittels Chromatopac® analysiert (die Zusammensetzung des Gemisches vor der Umsetzung mit α-1,4-Glucanglucohydrolase wurde so bestimmt). Etwa 6 ml des verbliebenen Harzes wurden in 150 ml Wasser suspendiert und mit 15 mg (etwa 22 Einheiten/mg) α-1,4-Glucanglucohydrolase versetzt, wonach 26 Stunden lang bei 40°C umgesetzt wurde. Das Harz wurde aus der Reaktionsflüssigkeit abfiltriert und aureichend mit Wasser gewaschen und mit 0,5 n wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt. Das erhaltene Pulver wurde der HPLC unterzogen und mittels Chromatopac® analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachfolgend zusammengestellt.

Zeichnungsbeschreibung

Die Fig. 1, 2 und 3 zeigen die Ergebnisse der HPLC der basischen Fraktionen, die gemäß den Beispielen 1, 2 und 3 erhalten wurden. Es wurde eine µ-Bondapak®-NH₂-Säule verwendet. Analysiert wurde mit einem Chromatopac®-Gerät. In jeder Figur ist der differentiale Brechungsindex auf der Ordinate und die Entwicklungszeit auf der Abszisse aufgetragen. Die Zahlenwerte in den Figuren der Zeichnung geben die Verweilzeiten (in min) an.

Fig. 4 zeigt die Zersetzungsverhältnisse (%) der jeweiligen Verbindungen, die erhalten werden, wenn N-Methyloligoglycosyl- moranoline mit a-1,4-Glucanglucohydrolase umgesetzt werden, wobei -⚫-, -X-, -▲-, -∆- und -○- die Ergebnisse mit Maltose, 4-(α-D-Glucosyl)-N-methylmoranolin, 4-(α-D-Maltosyl)-N-methylmoranolin, 4-(α-D-Maltotriosyl)-N-methylmoranolin bzw. 4-(α-D-Maltotetraosyl)-N-methylmoranolin darstellen.

Fig. 5 und 6 zeigen die Ergebnisse der HPLC vor und nach der Umsetzung mit α-1,4-Glucanglucohydrolase in Beispiel 6, wo eine µ-Bondapak®-NH₂-Säule und ein Chromatopac®-Gerät verwendet wurden. In Fig. 5 und 6 sind die differentiale Brechung auf der Ordinate und die Entwicklungszeit auf der Abszisse aufgetragen, und die Bezugszahlen bezeichnen die Verweilzeiten (in min), S ist das Lösungsmittel, und A, B, C, D, E, F, G, H und I zeigen N-Methyloligoglycosylmoranoline.

Claims

1. Moranolinderivate der allgemeinen Formel in der n eine ganze Zahl von 0 bis 7 und R ein Wasserstoffatom, eine Methyl-, Ethyl- oder Propylgruppe ist.

2. Verfahren zur Herstellung der Moranolinderivate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in jeweils an sich bekannter Weise

A) ein N-Alkylmoranolin der allgemeinen Formel in der R die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen hat, in wäßriger Lösung mit Cyclodextrin, löslicher Stärke oder Dextrin in Gegenwart von Cyclodextringlycosyltransferase (EC 2.4.1.19) bei einem pH-Wert von 5,0 bis 8,5 umsetzt, die so erhaltenen Oligoglycosylmoranoline als Stoffgemische gewinnt und
B) auf die gemäß Verfahrensstufe A) erhaltenen Stoffgemische, gegebenenfalls nach Zugabe eines Kationaustauschers, α-1,4-Glucanglucohydrolase (EC 3.2.1.3) einwirken läßt.

3. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 1, neben den üblichen Füll- und Trägerstoffen.