CH649302A5 - Moranolin-derivate und verfahren zu deren herstellung. - Google Patents

Description

Die Erfindung sei nun anhand der folgenden Beispiele ein- Dann wurden 50 |xl der Enzymflüssigkeit zu 950 nl der Sub-gehend erläutert. (In Beispiel 1 wird nur die Herstellung der 25 stratlösung zugesetzt, und die Reaktion wurde bei einer Tem-Cyclodextrin-glucosyltransferase beschrieben, die zur Durch- peratur von 40 °C während 10 Minuten durchgeführt. Anführung des erfindungsgemässen Verfahrens benötigt wird). schliessend wurde die Reaktion unterbrochen, indem man

0,5 ml an 0,5 n Essigsäure zusetzte.

Dann wurden 0,8 ml einer Jodlösung zusammen mit 3 ml Beispiel 1 30 Wasser zu 100 jo.1 der Reaktionsflüssigkeit zugesetzt, und die

Züchtung von Bacillus macerans: Mischung wurde gerührt und die Absorption wurde bei

Ein Erlmeyer-Kolben eines Fassungsvermögens von 660 nm bestimmt, und dieser Absorptionswert wird mit At

500 ml wurde mit 150 ml eines Zuchtmediums beschickt. Das bezeichnet. Die verwendete Jodlösung war eine Lösung die verwendete Zuchtmedium hatte die folgende Zusammen- hergestellt wurde, indem man Jod in einer 0,25 molaren wäss-setzung: 35 r'2en Lösung von Kaliumjodid in einer solchen Menge löste,

dass die Konzentration 0,01 molar war.

Zuchtmedium In gleicher Weise wurden 50 jj.1 Wasser und 0,5 ml einer

0,5 n Essigsäure zu 950 |il einer Substratlösung zugesetzt, und Bestandteil Menge die oben beschriebene Jodlösung wurde zu 100 (xl der erhalte-

Maisquellwasser 1 % 40 nen Flüssigkeit zugesetzt, und auch in diesem Fall wurde die

Lösliche Stärke 1 % Absorption bei 660 nm bestimmt. Der gemessene Wert der

(NH4)2S04 0,5% Absorption wird mit Ar bezeichnet.

CaC03 0^5 % Die Aktivitätseinheit des Enzyms wird nach der folgenden

Formel berechnet:

Der pH-Wert des Zuchtmediums betrug 7, und das Zucht-45 medium wurde erhitzt und bei einer Temperatur von 120 °C

während 15 Minuten sterilisiert. Dann wurde das Zuchtmedi- Ar-At um mit drei vollen Platinlöffeln von Bacillus macerans IFO Eine Einheit — x 100 x 2

3490 beimpft. Der fragliche Stamm von Bacillus macerans Ar wurde am 18. Mai 1956 bei «Culture Collection of the Institu-50

te for Fermentation», 4-54 Juso-nishino-cho, Higashi Y odo- Diese so berechnete Aktivitätseinheit zeigt die Aktivität gawa-ku, Osaka-JA mit der Nummer IFO 3490 hinterlegt, eines Milliliters der Enzymflüssigkeit bezüglich der Vermin-und Proben dieses Mikroorganismenstammes werden jeder- derung der Absorption um 1 % während 1 Minute.

mann, der es beantragt, zur Verfügung gestellt.

Bevor die Beimpfung mit dem Mikroorganismenstamm 55 erfolgte wurde dieser Mikroorganismus in ausreichender HersteUung der rohen Enzymlösung:

Menge auf einem Schragkultumiedmm gezüchtet, welches die Dag z *chtmedium; da's bei der*Züchtung von Bacillus o gen en es an ei e en e macerans IFO 3490 gebildet wurde, wurde zentrifugiert und

,. 60 das darüber stehende Material entnommen, einer Gefrier-Medium •

trocknung unterworfen und das trockene Produkt wurde in

Bestandteil Menge einer kleinen Menge Wasser gelöst, um ein Enzymkonzentrat

Pepton 1 % herzustellen.

Hefe 0,5% Bei einer Temperatur von 5 °C wurde dieses Konzentrat

Glucose 0,3% 6s einer Dialyse gegen destilliertes Wasser unterworfen, und die

Glycerin 1,5% durch diese Dialyse gereinigte innere Lösung, aus der da-

NaCl 0,3% durch niedrig molekulare Bestandteile entfernt worden wa-

Leberpulver agar-agar 1,5% ren, wird als rohe Enzymflüssigkeit eingesetzt.

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Beispiel 2 (A) Züchtung von Bacillus macerans:

Verfahrensschritt (1)

Eine Erlmeyer-Kolben eines Fassungsvermögens von 500 ml wurde mit 150 ml eines Kulturmediums beschickt. Das verwendete Zuchtmedium hatte die folgende Zusammensetzung:

Zuchtmedium

Bestandteile

Maisquellwasser Lösliche Stärke (NH4)2S04 CaC03

Menge

1 % 1 % 0,5% 0,5%

Dieses Zuchtmedium hatte einen pH-Wert von 7, und es wurde bei einer Temperatur von 120 °C während 15 Minuten sterilisiert.

Dann wurden 4 Platinlöffel voll von Zellen des Bacillus macerans, IFO 3490, der in ausreichender Weise auf einem Schrägkulturmedium gezüchtet worden war, in das oben beschriebene Zuchtmedium eingeimpft, und man züchtete bei einer Temperatur von 37 °C während 3 Tagen.

Das Schrägkulturmedium, auf welchem die Vorzüchtung des Bacillus macerans IFO 3490 vorgenommen worden war,

hatte die folgende Zusammensetzung:

Medium:

Bestandteil

Menge

Pepton

1 %

Hefe-extrakt

0,5%

Glucose

0,3%

Glycerin

1,5%

NaCl

0,3%

Neutralisiertes Leberabbauprodukt

1,5%

Agar-agar

1,5%

Das verwendete neutralisierte Leberabbauprodukt war das Produkt, das unter dem Markennamen «OXOID» im Handel erhältlich ist.

Anschliessend an die 3 Tage dauernde Züchtung wurden dann 300 ml des Zuchtmediums in 9 Liter eines Zuchtmediums eingeimpft, welches die gleiche Zusammensetzung hatte und sich in einem krugförmigen Gärbehälter befand. Diese Züchtung wurde bei 37 °C während 3 Tagen durchgeführt, wobei man ausreichend belüftete und rührte. Dabei erhielt man eine Enzymflüssigkeit, die 130 bis 150 Enzymeinheiten enthielt, indem man zuerst zentrifugierte und dann die darüber stehende Flüssigkeit entnahm. Die Definition der Enzymeinheiten wird nachfolgend gegeben.

Verfahrensschritt (2)

Es wurde ein Zuchtmedium verwendet, welches die folgende Zusammensetzung aufwies:

Zuchtmedium

Bestandteil

Weizenkleie Maisquellwasser Lösliche Stärke (NH4)2S04 CaC03

Menge

4 % 0,5% 0,5% 0,5% 0,5%

Dieses Zuchtmedium wies einen pH-Wert von 6,7 auf,

und es wurde bei einer Temperatur von 120 °C während 15 Minuten sterilisiert.

200 ml des sterilisierten Zuchtmediums wurden in einen Erlenmeyer-Kolben eines Fassungsvermögens von 500 ml ge-s geben. Dieses Zuchtmedium wurde mit 3 vollen Platinlöffeln von Zellen des Bacillus macerans, IFO 3490 beimpft, und man schüttelte und züchtete bei einer Temperatur von 37 °C während 4 Stunden, wobei man eine Enzymflüssigkeit erhielt, indem man das Medium zentrifugierte und das darüber stelo hende Material entnahm. Diese Enzymflüssigkeit enthielt etwa 90 Enzymeinheiten.

(B) Bestimmung der Aktivitätseinheiten der Cyclodextringly-cosyltransferase:

15 Lösliche Stärke wurde in einer Konzentration von 0,7% in einer 0,05 molaren Acetatpufferlösung gelöst, die einen pH-Wert von 5,5 besass, und man erhielt so die Substratlösung. Die verwendete lösliche Stärke war ein Produkt zur Durchführung von biochemischen Tests, das von der Firma 20 Nakarai Kagaku K.K. erhältlich ist.

50 |xl der Enzymflüssigkeit wurden zu 950 nl der so hergestellten Substratlösung zugegeben und die Reaktion wurde bei einer Temperatur von 40 °C während 10 Minuten durchgeführt. Dann wurde die Reaktion unterbrochen, indem man 25 0,5 ml an 0,5 n Essigsäure zusetzte. Dann entnahm man 100 }i,l der Reaktionsflüssigkeit und vermischte sie mit 3 ml Wasser und 0,8 ml einer Jodlösung. Die Jodlösung wurde vorher hergestellt, indem man Jod in einer 0,25 molaren Kali-umjodidlösung in einer solchen Menge löste, dass die Jodkon-30 zentration 0,01 molar war. Nach der Zugabe der Jodlösung wurde die Mischung gerührt, und es wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 660 nm bestimmt. Der so erhaltene Absorptionswert wird mit At bezeichnet.

Getrennt davon wurden 50 |xl Wasserund 0,5 ml der 0,5 n 35 Essigsäure zu 950 [il der oben beschriebenen Substratlösung zugesetzt. 100 jil der so gebildeten Lösung wurden entnommen und mit der Jodlösung in der oben beschriebenen Weise vermischt. Auch bei dieser Lösung wurde die Absorption bei 660 nm bestimmt, und der erhaltene Wert wird mit Ar be-40 zeichnet.

Eine Enzymeinheit wird durch die folgende Formel definiert:

A-A

451 Einheit = ——- x 100 x 2 Ar

Dieser Wert der Enzymeinheit entspricht der Aktivität eines Milliliters der Enzymlösung bezüglich der Verminderung sc der Absorption um 1 %, wenn man die Reaktion bei 40 °C während 1 Minute laufen lässt.

(C) Herstellung der rohen Enzymlösung:

Das Kulturmedium, das man erhielt indem man den Ba-55 cillus macerans IFO 3490 züchtete, wurde zentrifugiert und das darüber stehende Material entnommen. Das darüber stehende Material wurde einer Gefriertrocknung unterworfen, und man löste das gefriergetrocknete Produkt in einer kleinen Menge an Wasser, wobei man ein Enzymkonzentrat erhielt. 60 Dieses wurde einer Dialyse bei einer Temperatur von 5 °C während ausreichend langer Zeit unterworfen, wobei bei dieser Dialyse als äussere Flüssigkeit Wasser verwendet wurde. Durch diese Dialyse wurden aus der Enzymlösung niedrig molekulare Bestandteile entfernt, und die so erhaltene Lö-65 sung wurde als rohe Enzymlösung verwendet.

(D) Durchführung der Reaktion:

In 400 ml der rohen Enzymlösung wurden 8 g Moranolin-

hydrochlorid und 8 g a-Cyclodextrin gelöst, und man schüttelte und züchtete bei einer Temperatur von 38 °C und einem pH-Wert von 5,7 während 3 Tagen. Die verwendete rohe Enzymlösung hatte eine Aktivität von 870 Einheiten, sodass in den eingesetzten 400 ml insgesamt 34800 Aktivitätseinheiten 5 vorhanden waren. Nach dieser 3 Tage dauernden Behandlung wurde ein Teil der Reaktionsflüssigkeit entnommen und die basischen Substanzen wurden daraus gewonnen. Die Analyse wurde durchgeführt, indem man einen Hochgeschwindig-keits-flüssigchromatographen mit der Bezeichnung ALC/ io GPC-244 der Firma Waters Co. verwendete. Es wurde eine Säule zur Saccharidanalyse, nämlich die (x-Bondapak-Säule, verwendet, und als Laufmittel wurde eine Mischung von Es-sigsäurenitril + Wasser im Mischungsverhältnis von 70:30 eingesetzt. Die Elutionsgeschwindigkeit betrug dabei 1,5 ml/ is Minute.

Die Flächenverhältnisse der jeweiligen Fraktionen auf dem Differentialrefraktometer wurden bestimmt, indem man das Gerät Chromatopac C-RIA verwendet, das von der Firma Shimadzu Seisakusho hergestellt wird. Man erhielt dabei 20 die folgenden Resultate:

Bestandteil

Unumgesetztes Moranolin 4-(a-Glucosyl)-moranolin 4-(a-D-Maltosyl)-moranolin 4- (a-D-Maltotriosyl)-moranolin 4-(a-D-Maltotetraosyl)-moranolin

35

Menge

43% 25 16% 16% 12% 8%

30

(E) Isolierung und Reinigung:

Etwa 400 ml der Reaktionsflüssigkeit wurden während 10 Minuten auf 120 °C erhitzt, und es wurden 160 ml Trichlor-äthylen zugesetzt und die Mischung wurde heftig gerührt. Die untere Schicht wurde verworfen. Die obere Schicht wurde zentrifugiert, wobei man ein durchsichtiges, überstehendes Material erhielt. Dieses überstehende Material wurde durch eine Säule geleitet,die mit 80 ml eines stark sauren Ionenaustauscherharzes gefüllt war, nämlich des Produktes Dowex 50W x 2, H + Typ, wobei dadurch die basischen Substanzen 40 auf der Säule adsorbiert wurden. Die Elution wurde durchgeführt, indem man eine 0,5 normale wässrige Ammoniaklösung verwendete, und das Eluat einer Gefriertrocknung unterwarf. Das dabei erhaltene Pulver wurde mit Sephadex G-15 (48 mm Durchmesser und 850 mm Höhe), Sephadex 45 G-25 (55 mm Durchmesser und 470 mm Höhe), und Sephadex G-10 (40 mm Durchmesser und 820 mm Höhe) behandelt, und die jeweiligen Fraktionen wurden identifiziert, indem man einen Hochgeschwindigkeits-flüssigchromatogra-phen, nämlich das Modell ALC/GPC-244 der Firma Waters 50 Co, verwendete, wobei diese Flüssigkeits-chromatographie auf einer |i-Bondapak-CH-Säule durchgeführt wurde, und man mit einer Mischung aus Essigsäurenitril und Wasser im Mischungsverhältnis von 70:30 mit einer Geschwindigkeit von 1,5 ml pro Minute eluierte. Man erhielt dabei die angestrebten Oligoglycosylmoranoline.

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Diese Mischung wurde bei einer Temperatur von 39 °C während 3 Tagen geschüttelt, um die Reaktion ablaufen zu lassen.

Anschliessend zentrifugierte man das Material und leitete die überstehende Flüssigkeit durch eine Säuel die mit 100 ml des sauren Austauscherharzes der Bezeichnung Dowex 50W x2(H+) gefüllt war. Dabei wurden die basischen Substanzen auf dem Austauscherharz adsorbiert. Dann eluierte man unter Verwendung einer 0,5 normalen wässrigen Ammoniaklösung, und die gewonnenen Eluate wurden unterver-mindertem Druck konzentriert und getrocknet, wobei man einen Feststoff erhielt. Das so erhaltene Pulver wurde in einer kleinen Menge an Wasser gelöst und die so erhaltene Lösung durch eine Säule geleitet, die einen Durchmesser von 48 mm und eine Länge von 850 mm besass, und die mit Sephadex G-15 gefüllt war. Es wurden einzelne Fraktionen aufgefangen, von denen jede ein Volumen von 5 ml hatte. Die in den Fraktionen enthaltenen Materialien wurden identifiziert, indem man eine Hochgeschwindigkeits-flüssigchromatographie unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Chromatographen, Modell ALC/GPC-244, durchführte. Hiezu wurde eine [i-Bondapak NH2-Säule verwendet, das Elutionsmittel war eine Mischung aus Essigsäurenitril und Wasser im Mischungsverhältnis von 70:30, und es wurde mit einer Geschwindigkeit von 1,5 ml pro Minute eluiert. Die Fraktionen welche die gewünschten Produkte enthielten wurden aufgefangen, unter vermindertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet, wobei man jeweils das erzielte Oligoglycosyl-N-methylmoranolin erhielt.

55

Beispiel 3

5 g N-Methylmoranolin wurden in einer kleinen Menge Wasser gelöst und der pH-Wert wurde unter Verwendung 60 von 3-normaler Chlorwasserstoffsäure auf 5,68 eingestellt.

Nach der Einstellung des pH-Wertes betrug das Volumen der Lösung 25 ml.

80 g a-Cyclodextrin wurden in 3975 ml der rohen Enzymlösung gelöst, wobei die verwendete Enzymlösung eine Akti- 65 vität von 250 Einheiten pro Millimeter aufwies. Dann setzte man die oben beschriebene wässrige Lösung von N-Methylmoranolin zu und stellte den pH-Wert nochmals auf 5,68 ein.

Beispiel 4

500 mg N-Äthylmoranolin wurden in einer kleinen Menge an Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wurde unter Verwendung von 1-normaler Chlorwasserstoffsäure auf 5,8 eingestellt. Nachdem der pH-Wert eingestellt worden war, be-trug das Volumen der Lösung 20 ml.

Getrennt davon wurden 8 g a-Cyclodextrin in 380 ml der rohen Enzymflüssigkeit gelöst, welche eine Aktivität von 260 Einheiten pro Milliliter aufwies. Diese Lösung wurde mit der Lösung des N-Äthylmoranolines vermischt, und der pH-Wert der Mischung wurde erneut auf 5,77 eingestellt. Dann wurde die Mischung bei einer Temperatur von 39 °C während 3 Tagen geschüttelt, um die Reaktion durchzuführen.

Die entsprechenden Oligoglycosyl-N-äthylmoranoline wurden aus der Reaktionsflüssigkeit in der gleichen Weise isoliert, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist.

In den Figuren 1,2 und 3 der Zeichnung sind die Ergebnisse einer Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie veranschaulicht, die mit demHochgeschwindigkeits-Flüssig-keitschromatographen, Modell ALC/GPC-244 der Waters Co. erhalten wurden, wenn die basischen Fraktionen untersucht wurden, die gemäss den Beispielen 2, bzw. 3, bzw. 4 erhalten wurden. Die Hochgeschwindigkeits-chromatogra-phien, die in den Figuren 1,2 und 3 dargestellt wurden, wurden mit Hilfe einer |i-Bondapak-NH2-Säule durchgeführt, und man entwickelte, indem man als Elutionsmittel eine Mischung aus Essigsäurenitril + Wasser im Mischungsverhältnis von 70:30 einsetzte. Die Analyse wurde durchgeführt, indem man das Gerät Chromatopac C-RIA der Firma Shimadzu Seisakusho verwendete.

In den Figuren 1,2 und 3 ist jeweils auf der Ordinate der différentielle Refraktionsindex aufgetragen und auf der Abszisse ist die Entwicklungszeit in Minuten aufgetragen. Ferner sind auf diesen Figuren bei jedem Peak Zahlen angegeben, welche die Retentionszeiten der jeweiligen Verbindungen in Minuten angeben.

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14

Beispiel 5

500 ml N-Propylmoranolin wurden in einer kleinen Menge Wasser gelöst, und der pH-Wert der Lösung wurde unter Verwendung von 1-normaler Chlorwasserstoffsäure auf 5,7 eingestellt. Das Volumen der Lösung betrug nach dem Einstellen des pH-Wertes 20 ml.

Getrennt davon wurden 8 g a-Cyclodextrin in 380 ml der rohen Enzymlösung gelöst, die eine Aktivität von 260 Einheiten pro Milliliter besass. Diese Lösung wurde mit der Lösung des N-Propylmoranolines vermischt, und der pH-Wert der Mischung wurde erneut auf 5,7 eingestellt. Dann wurde die Mischung bei einer Temperatur von 39 °C während 3 Tagen geschüttelt, und aus der erhaltenen Reaktionsflüssigkeit wurden die entsprechenden Oligoglycosyl-N-propylmoranoline in der gleichen Weise gewonnen, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist.

Beispiel 6 Züchtung von Bacillus macerans:

In einem Erlenmeyer-Kolben eines Rauminhaltes von 500 ml füllte man 150 ml eines Zuchtmediums. Dieses hatte die folgende Zusammensetzung:

Bestandteil

Maisquellwasser Lösliche Stärke (NH4)2S04 CaC03

Menge pH-Wert von 5,5 besass, und man erhielt so die Substratlösung. Die hier verwendete lösliche Stärke ist ein Produkt für biochemische Untersuchungen und dieses ist von der Firma Nakarai Kagaku K.K. erhältlich. Dann setzte man 50 jj.1 der 5 Enzymflüssigkeit zu 950 (il der Substratlösung zu und führte die Reaktion bei einer Temperatur von 40 °C während 10 Minuten durch. Dann wurde die Reaktion unterbrochen, indem man 0,5 ml einer 0,5 normalen Essigsäure zusetzte. Anschliessend wurden 0,8 ml einer Jodlösung zusammen mit 3 ml Was-io ser zu 100 nl der Reaktionsflüssigkeit gegeben, die erhaltene Mischung wurde gerührt und die Absorption bei einer Wellenlänge von 660 nm bestimmt, wobei man so den Wert At erhält. Die hier verwendete Jodlösung wurde erhalten, indem man Jod in einer 0,25 molaren wässrigen Kaliumjodidlösung 15 auflöste, bis eine Jodkonzentration von 0,01 molar erreicht war.

In gleicher Weise wurden 50 |xl Wasser und 0,5 ml an 0,05 normaler Essigsäure zu 950 |il der Substratlösung gegeben, und auch in diesem Fall wurde zu 100 jj.1 der so erhaltenen 20 Flüssigkeit die Jodlösung zugesetzt, und man bestimmte auch in diesem Fall die Absorption bei 660 nm, wobei man den Wert für Ar erhielt^

Die Aktivitätseinheit wurde gemäss der folgenden Formel berechnet:

1 %25 1 % 0,5% 0,5%

Eine Einheit =

Ar-At Ar x 100x2

Dieses Zuchtmedium hatte einen pH-Wert von 7, und es wurde erhitzt und bei einer Temperatur von 120 °C während 15 Minuten sterilisiert. Das Zuchtmedium wurde mit drei vollen Platinlöffeln von Bacillus macerans IFO 3490 beimpft, und man züchtete bei einer Temperatur von 37 °C während 3 Tagen. Der zur Beimpfung verwendete Bacillus macerans, IFO 3490 war vorher eine ausreichend lange Zeit auf einem Schrägkulturmedium gezüchtet worden, welches die folgenden Bestandteile enthielt:

30

35

Bestandteil

Pepton

Hefe

Glucose

Glycerin

NaCl

Leberpulver-agar-agar

Menge

1 % 0,5% 0,3% 1,5% 0,3% 1,5%

Der in diesem Kulturmedium eingesetzte Leberpulver-agar-agar ist ein neutralisiertes Leberabbau-produkt, das unter dem Markennamen «OXOID» im Handel erhältlich ist.

Nachdem die oben beschriebene Züchtung bei 37 °C während 3 Tagen durchgeführt war, wurde 300 ml des so erhaltenen Zuchtmediums zu 9 Litern eines neuen Zuchtmediums zugegeben, welches die gleiche Zusammensetzung besass wie das oben erwähnte Zuchtmedium, und welches sich in einem krugförmigen Gärbehälter mit einem inneren Fassungsvermögen von 15 Litern befand. Man führte die Züchtung bei einer Temperatur von 37 °C unter ausreichender Belüftung und unter Rühren während 10 Tagen durch. Man erhielt dabei eine Enzymflüssigkeit, welche etwa 130 bis etwa 150 Aktivitätseinheiten des Enzyms enthielt. Die Definition dieser Aktivitätseinheiten wird in der Folge erläutert.

Bestimmung der Aktivitätseinheiten der Cyclodextringlycosyl-transferase:

Lösliche Stärke wurde m einer Konzentration von 0,7% in einer 0,05 molaren Acetat-pufferlösung gelöst, die einen

Diese Einheit ist die Aktivität, welche 1 Milliliter der Enzymflüssigkeit aufweist um die Absorption innerhalb 1 Minute um 1 % zu vermindern.

Herstellung der rohen Enzymlösung:

Das Zuchtmedium in welchem der Bacillus macerans IFO 3490 gezüchtet worden war, wurde zentrifugiert, das darüber stehende Material abgetrennt, gefriergetrocknet und das getrocknete Produkt in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst, wobei man das Enzymkonzentrat erhielt. Bei einer Tempera-"0 tur von 5 °C wurde dieses Enzymkonzentrat als innere Flüssigkeit gegen destilliertes Wasser als äussere Flüssigkeit dialy-siert. Durch diese Dialyse wurden Bestandteile mit niedrigem Molekulargewicht aus der Enzymlösung entfernt, und die nach dieser Dialyse erhaltene Enzymlösung wurde als rohe « Enzymflüssigkeit verwendet.

Dann wurden 6,5 g Moranolin in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst und der pH-Wert wurde durch Verwendung von 3-normaler Chlorwasserstoffsäure auf 5,7 eingestellt. Nach der Einstellung des pH-Wertes betrug das Volumen der 5° Lösung 32,5 ml.

26 g a-Cyclodextrin wurden in 1300 ml der rohen Enzymlösung von Cyclodextrin-glycosyltransferase gelöst und die wässrige Lösung von Moranolin wurde zugesetzt, und der pH-Wert der Mischung auf 5,67 eingestellt. Die verwendete 55 rohe Enzymlösung hatte eine Aktivität von 460 Einheiten pro Milliliter. Die so erhaltene Mischung wurde bei einer Tempe-ratur von 39 °C während 3 Tagen geschüttelt.

Anschliessend wurde zentrifugiert und das überstehende Material durch eine Säule geleitet, welche mit 50 ml des stark 60 sauren Ionenaustauschers Dowex 50W x 2 (H+) gefüllt war. Dadurch wurden die basischen Substanzen auf dem Ionenaustauscherharz adsorbiert. Ein Teil des Harzes, und zwar etwa 2 ml desselben, wurde ausreichend mit Wasser gewaschen und dann eluierte man unter Verwendung einer 0,5 normalen 65 wässrigen Ammoniaklösung. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, und man trocknete wobei man einen Feststoff erhielt. Das so hergestellte Pulver wurde in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst und die Lösung zunächst ei

15

649 302

ner Hochgeschwindigkeits-flüssigchromatographie unter Verwendung des Chromatographen der Firma Waters Co., Modell ALC/GPC-244, unterworfen. Bei dieser Hochge-schwindigkeits-chromatographie wurde eine |i-Bondapak-NHi-Säule verwendet, und man eluierte mit einer Mischung aus Essigsäurenitril und Wasser im Mischungsverhältnis von 70:30 mit einer Geschwindigkeit von 1,5 ml pro Minute. Anschliessend an die Hochgeschwindigkeits-chromatographie wurde die Lösung analysiert, indem man das Gerät Chromatopac, Modell C-RIA, der Firma Shimadzu Seisakusho K.K. verwendete. Auf diese Weise wurde die Zusammensetzung der Mischung vor der Reaktion mit der a-l,4-Glucanglucohydro-lase bestimmt.

Dann wurden die restlichen, etwa 48 ml des mit dem Mo-ranolinderivat beladenen sauren Ionenaustauscherharzes in 1200 ml Wasser suspendiert, und man setzte 120 mg in einer a-l,4-Glucanglucohydrolase zu, die eine Aktivität von etwa 22 Einheiten pro Milligramm besass, und die aus Rhizopus niveus gewonnen worden war. Man bebrütete die Mischung bei 40 °C, und zu vorher bestimmten Zeitpunkten wurden Proben aus der Reaktionsmischung entnommen, und die Menge an Glucose, die sich in der Reaktionsmischung gebildet hatte, bestimmt. Diese Bestimmung der Glucose wurde vorgenommen, um das Stadium des Fortschreitens der Reaktion abschätzen zu können.

Die Menge an Glucose stieg nach dem Beginn der Reaktion plötzlich stark an, und das Umsetzungsverhältnis erhöhte sich innerhalb von 5 Stunden auf 85%. Die Reaktion lief weiter ab, und man unterbrach sie nach 25 Stunden, berechnet vom Beginn der Reaktion an. Das Harz wurde durch Filtrieren isoliert, ausreichend mit Wasser gewaschen und mit einer 0,5-normalen wässrigen Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert und getrocknet, wobei man einen Feststoff erhielt.

Das so erhaltene Pulver wurde einer Hochgeschwindig-keits-flüssigchromatographie in der gleichen Weise unterworfen, wie dies oben beschrieben ist, und die nach der Reaktion erhaltene Mischung wurde mit Hilfe des Chromatopac analysiert. Dabei erhielt man die in der folgenden Tabelle angegebenen Werte.

Bestandteile in der Reaktionsmischung vor der Reaktion und nach der Reaktion:

Bestandteil Vor der Nach der

Reaktion Reaktion

Moranolin 25,1% 31,7%

4-(a-D-Glucosyl)-moranolin 31,0% 68,3%

4-(a-D-Maltosyl)-moranolin 17,2% 0 %

4-(a-D-Maltotriosyl)-moranolin 11,2% 0 %

4-(a-D-Maltotetraosyl)-moranolin 7,8% 0 %

4-(a-D-Maltopentaosyl)-moranolin 4,9% 0 %

4-(a-D-Maltohexaosyl)-moranolin 2,0% 0 %

4-(a-D-Maltoheptaosyl)-moranolin 0,5% 0 %

4-(a-D-Maltooctanosyl)-moranolin 0,3% 0 %

Bestandteil

Moranolin

4-(a-D-Glucosyl)-moranolin

4-(a-D-Maltosyl)-moranolin

4-(a-D-Maltotriosyl)-moranolin

4-(a-D-Maltotetraosyl)-moranolin

4-(a-D-Maltopentaosyl)-moranolin

4-(a-D-Maltohexaosyl)-moranolin

4-(a-D-Maltoheptaosyl)-moranolin

4-(a-D-Maltooctanosyl)-moranolin

Beispiel 7

2 g einer Mischung, die bei der Hochgeschwindigkeits-flüssigchromatographie die in Figur 5 veranschaulichten Ergebnisse lieferte, wurde auf 10 ml des Ionenaustauscherharzes 5 Dowex 50W x 2 (H+) adsorbiert, und das Harz wurde in 500 ml Wasser suspendiert und es wurden 50 mg an a-1,4-Glucanglucohydrolase, welche eine Aktivität von etwa 22 Einheiten pro mg aufwies, zu der Suspension zugesetzt. Man führte die Reaktion bei einer Temperatur von 40 °C während io 17 Stunden durch, und die bei dieser Reaktion gewonnene Flüssigkeit wurde dann filtriert und das Harz auf dem Filter gewonnen. Das Austauscherharz wurde mit einer 0,5 normalen wässrigen Ammoniaklösung eluiert, und das Eluat unter vermindertem Druck konzentriert und getrocknet, wobei 15 man einen Feststoff erhielt. Der so gewonnene Feststoff wurde einer Hochgeschwindigkeits-flüssigchromatographie unterworfen, indem man den Flüssigchromatographen, Modell ALC/GPC-244 der Firma Waters Co. verwendete. Dann analysierte man mit Hilfe eines Chromatopac, Modell C-RIA der 2o Firma Shimadzu Seisakusho K.K. und erhielt dabei die in Figur 6 veranschaulichten Ergebnisse.

ïn den Figuren 5 und 6 sind die Ergebnisse einer Hochge-schwindigkeits-flüssigchromatographie veranschaulicht, die mit dem Hochgeschwindigkeits-chromatographen, Modell 25 ALC/GPC-244 der Firma Waters Co. durchgeführt wurden. Bei dieser Hochgeschwindigkeits-chromatographie wurde eine (x-Bondapak-NH2-Säule verwendet, und als Elutionsmittel wurde eine Mischung aus Essigsäurenitril und Wasser im Mischungsverhältnis von 70:30 verwendet. Das Elutionsmittel 30 wurde mit einer Geschwindigkeit von 1,5 ml pro Minute zugeführt, und dies war also auch die Durchflussgeschwindigkeit bei der Durchführung dieser Hochgeschwindigkeits-chromatographie. Zur Analyse der austretenden Materialien wurde das Gerät Chromatopac, Modell C-RIA der Firma 35 Shimadzu Seisakusho K.K. verwendet. In Figur 5 sind die Ergebnisse veranschaulicht, die vor der Umsetzung mit der a-1,4-Glucanhydrolase erhalten wurden, während in Figur 6 die Ergebnisse veranschaulicht sind, die nach der Umsetzung mit der a-l,4-Glucanhydrolase gemäss diesem Beispiel erhalten 40 wurden. In den Figuren 5 und 6 ist auf der Ordinate die différentielle Refraktion aufgetragen, und die Entwicklungszeit, angegeben in Minuten, ist auf der Abszisse aufgetragen. Bei den Peaks der Figur 5 und Figur 6 sind jeweils die Retentions-zeiten in Minuten angegeben. Der mit S bezeichnete Peak in 45 den Figuren 5 und 6 veranschaulicht das Lösungsmittel (Sol-vents). Der mit A bezeichnete Peak in den Figuren 5 und 6 ist der entsprechende Peak des Moranolines, während die mit B, C, D, E, F, G, H und I bezeichneten Peaks in Figur 5 und 6 diejenigen der entsprechenden Oligoglycosyl-moranoline so sind.

Bei den in Figuren 5 und 6 veranschaulichten Ergebnissen enthielten die Mischungen die angegebenen Komponenten in der Konzentration, die in der folgenden Tabelle zusammengestellt sind:

55

Bezeich

Vorder

Nach der nung in

Umsetzung

Umsetzung

Fig. 5 bzw. 6

(Fig. 5)

(Fig. 6)

A

4,6%

5,3%

B

13,2%

91,5%

C

14,0%

3,0%

D

14,9%

0 %

E

13,2%

0 %

F

13,5%

0 %

G

11,0%

0 %

H

9,0%

0 %

I

4,0%

0 %

649 302 . . 16 .

Beispiel 8 rase gegeben, die eine Aktivität von 336 Einheiten pro Millili-

Unter den gleichen Bedingungen, die in Beispiel 7 be- ter besass.

schrieben sind, wurde die Reaktion bei 40 °C während 26 Die beiden Flüssigkeiten wurden miteinander vermischt Stunden ausgeführt. Man erhielt dabei eine Mischung aus und der pH-Wert wurde auf 5,6 eingestellt. Die Reaktion 5,8% Moranolin und 93,2% 4-(a-D-Glucosyl)-moranolin. Es 5 wurde bei einer Temperatur von 39 °C während 2 Tagen un-konnten in dieser Mischung keine weiteren Komponenten ge- ter Schütteln durchgeführt. Anschliessend wurde die Reak-funden werden. tionsflüssigkeit zentrifugiert, und das darüber stehende Material entnommen und durch eine Säule geleitet, die mit 8 ml des Beispiel 9 Austauscherharzes Dowex 50W x 2 (H+) gefüllt war. Dabei 200 mg der in Figur 5 veranschaulichten Mischung wur- i0 wurden basische Substanzen auf dem Austauscherharz adsor-den in 4 Liter Wasser aufgelöst, und der pH-Wert wurde auf biert. Das Harz wurde mit einer ausreichenden Menge an 5,7 eingestellt, indem man eine 0,5 normale Chlorwasserstoff- Wasser gewaschen und ein Teil des Harzes, und zwar etwa säure zugab und dann wurden 200 mg einer a-l,4-Glucanglu- 2 ml, wurde als Probe entnommen. Dieser Teil wurde in der cohydrolase, welche eine Aktivität von etwa 22 Einheiten pro gleichen Weise aufgearbeitet wie in Beispiel 6 beschrieben, Milligramm aufwies, der Lösung zugesetzt. Die Reaktion 15 und es wurde auch in der gleichen Weise unter vermindertem wurde bei einer Temperatur von 40 °C während 41 Stunden Druck konzentriert und getrocknet bis ein Feststoff erhalten durchgeführt, und dann wurde die Reaktionsflüssigkeit durch war, wie dies in Beispiel 6 erläutert ist. Das so erhaltene Puleine Säule geleitet, die mit 10 ml des Austauscherharzes Do- ver wurde einer Flüssigchromatographie unterworfen, und wex 50W x 2 (H+) gefüllt war. Das Harz wurde mit einer aus- mit Hilfe der Apparatur Chromatopac analysiert. Auf diese reichenden Menge an Wasser gewaschen und dann mit einer 20 Weise wurde die Zusammensetzung der Mischung festgestellt 0,5 normalen wässrigen Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat ehe die Reaktion mit der a-l,4-Glucanglucohydrolase durchwurde unter vermindertem Druck konzentriert und getrock- geführt war.

net, wobei man einen Feststoff erhielt. Das so erhaltene Pul- Die restliche Menge des Austauscherharzes, die etwa 6 ml ver wurde in einer kleinen Menge an Wasser aufgelöst und die betrug, wurde in 150 ml Wasser dispergiert und es wurden

Hochgeschwindigkeitsflüssigchromatographie wurde unter 25 90 mg an der a-l,4-Glucanghicohydrolase, welche eine Akti-

den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie in Beispiel 1 be- vität von etwa 22 Einheiten pro Milligramm besass, zu der schrieben. Es zeigte sich, dass das Produkt eine Mischung aus Suspension zugesetzt und man führte die Reaktion bei einer

6% Moranolin und 93,4% 4-(a-D-Glucosyl)-moranolin war. Temperatur von 40 °C während 48 Stunden durch. Die Reak-

Die Anwesenheit von anderen Komponenten konnte nicht tionsflüssigkeit wurde filtriert und das Austauscherharz auf festgestellt werden. 30 dem Filter gesammelt. Dieses Harz wurde mit einer ausreichenden Menge an Wasser gewaschen und dann mit einer 0,5

Beispiel 10 normalen wässrigen Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat

1 g N-Methylmoranolin wurde in einer kleinen Menge wurde unter vermindertem Druck konzentriert und getrock-

Wasser gelöst und der pH-Wert wurde durch Zugabe von net, wobei man einen Feststoff erhielt. Das so erhaltene Pul-

Chlorwasserstoffsäure auf 5,7 eingestellt. Nach der Einstel- 35 ver wurde der Flüssigchromatographie unterworfen und mit lung des pH-Wertes betrug das Volumen 10 ml. dem Gerät Chromatopac analysiert. Dabei erhielt man die in

Getrennt davon wurden 16g a-Cyclodextrin zu 790 ml der folgenden Tabelle angeführten Ergebnisse.

der rohen Enzymflüssigkeit der Cyclodextrin-glycosyltransfe-

Zusammensetzung der Mischung vor der Umsetzung mit dem Enzym und nach der Umsetzung mit dem Enzym:

Bestandteil

N-Methylmoranolin 4-(a-D-Glucosyl)-N-methylmoranolin 4-(a-D-Maltosyl)-N-methylmoranolin 4-(a-D-Maltotriosyl)-N-methylmoranolin 4-(a-D-Maltotetraosyl)-N-methylmoranolin 4-(a-D-Maltopentaosyl)-N-methylmoranolin 4-(a-D-Maltohexaosyl)-N-methylmoranolin 4-(a-D-Maltoheptaosyl)-N-methylmoranolin

Beispiel 11

1 g N-Propylmoranolin wurde in einer kleinen Menge an 55 eine Säule des Ionenaustauscherharzes Dowex 50W x 2 (H+), Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wurde durch Zu- die eine Menge von 8 ml an diesem Austauscherharz enthielt, gäbe von 1 normaler Chlorwasserstoffsäure auf 5,7 einge- Dabei wurden die basischen Substanzen auf dem Austau-stellt. Nach der Einstellung des pH-Wertes betrug das Volu- scherharz adsorbiert. Das Harz wurde dann mit einer ausreimen der Lösung 20 ml. chenden Menge an Wasser gewaschen und ein Anteil des Har-

Getrennt davon wurden 16 g a-Cyclodextrin zu 790 ml ei- 60 zes, der etwa 2 ml betrug, wurde entnommen und den glei-ner rohen Enzymflüssigkeit des Enzymes Cyclodextringlyco- chen Arbeitsbedingungen unterworfen, die in Beispiel 6 be-syltransferase gegeben, welches eine Enzymaktivität von 260 schrieben sind. Es wurde auch in der gleichen Weise unter verEinheiten pro Milliliter besass. mindertem Druck konzentriert und unter Bildung eines Fest-Die beiden Flüssigkeiten wurden miteinander vermischt stoffes getrocknet, wie dies in Beispiel 6 beschrieben ist. Das und der pH-Wert wurde auf 5,7 eingestellt. Die Reaktion 65 so erhaltene Pulver wurde einer Flüssigchromatographie un-wurde bei einer Temperatur von 39 °C während 2 Tagen un- terworfen und mit der Apparatur Chromatopac analysiert, ter Schütteln durchgeführt. Anschliessend zentrifugierte man, Dadurch wurde die Zusammensetzung der Mischung vor der entnahm das darüber stehende Material und leitete es durch Umsetzung mit der a-1,4-Glucanglucohydrolase bestimmt.

Vorder

Nach der

Umsetzung

Umsetzung

19,0%

21,3%

11,9%

61,7%

13,3%

15,4%

13,1%

1,6%

11,9%

0 %

10,9%

0 %

10,4%

0 %

8,1%

0 %

17

649302

Die restliche Menge des Austauscherharzes, die etwa 6 ml eluierte es dann mit einer 0,5 normalen wässrigen Ammoniakbetrug, wurde in 150 ml Wasser suspendiert und es wurden lösung. Das so gewonnene Eluat wurde unter vermindertem 15 mg a-1,4-Glucanglucohydrolase, die eine Enzymaktivität Druck konzentriert und getrocknet, wobei man einen Fest-von etwa 22 Einheiten pro Milligramm aufwies, zu der Sus- stoff erhielt. Das so erhaltene Pulver wurde einer Flüssigchro-pension zugesetzt, und man führte die Reaktion bei einer 5 matographie unterworfen und mit Hilfe der Vorrichtung Temperatur von 40 °C während 26 Stunden durch. Chromatopac analysiert.

Anschliessend wurde die Reaktionsflüssigkeit filtriert und Dabei erhielt man die in der folgenden Tabelle angeführ-

das Austauscherharz auf dem Filter gesammelt, und man ten Ergebnisse.

wusch das Harz mit einer ausreichenden Menge Wasser, und

Zusammensetzung der Mischung vor der Umsetzung und nach der Umsetzung:

Bestandteil

N-Propylmoranolin 4-(a-D-Glucosyl)-N-propylmoranolin 4-(a-D-Maltosyl)-N-propylmoranolin 4-(a-D-Maltotriosyl)-N-propylmoranolin 4-(a-D-Maltotetraosyl)-N-propylmoranolin 4-(a-D-Maltopentaosyl)-N-propylmoranolin 4-(a-D-Maltohexaosyl)-N-propylmoranolin 4-(a-D-Maltoheptaosyl)-N-propylmoranolin 4-(a-D-Maltooctanosyl)-N-propylmoranolin

Vor der Reaktion

19,5% 16,7% 10,2% 10,0% 10,3% 9,8% 8,3% 7,8% 5,6%

Nach der Reaktion

24,2% 75,1% 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 %

C

5 Blatt Zeichnungen

Claims (11)

649302

1 ml einer 0,3 normalen Lösung von Bariumhydroxyd der

Formel Ba(OH)2 und 1 ml einer 5-%igen Lösung von Zink- In dieser Formel haben die verwendeten Symbole die fol-

sulfat der Formel ZnS04 zugegeben. gende Bedeutung:

Dann erfolgt eine Trennung mit Hilfe einer Zentrifuge, C=Absorption der Vergleichsprobe,

wobei man mit einer Zentrifugengeschwindigkeit entspre- 30 T=Absorption der Testprobe,

chend der 2000-fachen Erdbeschleunigung während 10 Minu- B'=Absorption der Bündprobe (I)

ten zentrifugiert. Anschliessend werden 30 (il der darüber ste- B=Absorption der Blindprobe (II)

henden Flüssigkeit als Probe entnommen, und es werden 3 ml Der Prozentsatz der Hemmung wird auch bezüglich der eines Farbreagenses für Glucose zu dem entnommenen dar- entsprechenden Verdünnungen bestimmt, und es wird die über stehenden Material zugesetzt. Das Farbreagens ist ein 35 Konzentration mit der Bezeichnung IC50 bestimmt, bei der ei-Material zur Durchführung eines neuen Blutzucker-testes, ne 50-%ige Hemmung festgestellt wird.

das von der Firma Ballinger Manhime Co. erhältlich ist. Man In der nachfolgenden Tabelle IV wird der Prozentsatz der lässt die Mischung bei Zimmertemperatur während 35 Minu- Hemmung bei einer jeweilig in Klammern angegebenen Konten stehen und bestimmt dann die Absorption bei einer Wel- zentration angeführt, falls die Hemmung gering ist.

lenlänge von 420 nm. 40

Der Prozentsatz der Hemmung wird nach der folgenden Formel berechnet:

TabellelV

IC50 (|ig/ml)

Moranolin 9,3

1 ml der Enzymlösung wird mit 5 ml einer 1,0-%igen Stärkelösung und 4 ml einer 0,05 molaren Essigsäurepufferlösung vermischt, und man bebrütet bei einer Temperatur von 65 40 °C. Die Menge an gebildetem reduzierenden Zucker, das ist in diesem Falle Glucose, wird nach der Methode von Fehl-ing-Lehman-Schoorl bestimmt.

Eine Enzymeinheit entspricht der Aktivität bei dem oben

beschriebenen Test innerhalb von 30 Minuten eine Menge von 10 mg an Glucose zu bilden.

In der folgenden Tabelle wird das Substrat und die Menge an Substrat, die auf dem Harz adsorbiert ist, angegeben:

Tabelle Substrat

Maltose

(1,0%)

-113

649 302

Die so erhaltenen erfindungsgemässen Verbindungen sind neue Verbindungen, die noch nirgends in der Literatur beschrieben sind. Diese Verbindungen zeigen eine hervorragend gute Wirkung bezüglich der Verminderung des Anstieges des Blutzuckerspiegels und sie können daher als wertvolle Wirkstoffe in entsprechenden pharmazeutischen Präparaten eingesetzt werden.

Bestimmung der Verminderung des Ansteigens des Blutzuckerspiegels.

Zu diesem Test wurden 5 Wochen alte männliche Ratten der SD-Reihe verwendet. Diese Ratten wurden in einzelne Gruppen aufgeteilt, wobei jede Gruppe 4 Ratten umfasste. An die Ratten wurden 2 g pro Kilogramm Körpergewicht an Saccharose und 5 mg pro Kilogramm Körpergewicht der zu testenden Verbindung oral verabreicht.

Den Ratten wurde Blut von der Schwanzvene in vorher bestimmten Zeitabschnitten während einer Gesamtzeit von 180 Minuten entnommen, und zwar gerechnet vom Zeitpunkt der Verabreichung, und in diesen Blutproben wurde der Blutzuckerspiegel bestimmt. Der Bereich unterhalb der Kurve: Zeit gegen Anstieg des Blutzuckerspiegels wird bestimmt, und dieser Bereich wird als AAUC bezeichnet.

Das Hemmverhältnis für das Ansteigen des Blutzuckerspiegels der getesteten Verbindung wird berechnet, und zwar ausgehend von einem Grundwert, der in derjenigen Gruppe erhalten wurde, an die nur Wasser verabreicht wurde, und einem anderen Vergleichswert, der bei derjenigen Gruppe erhalten wurde, an welche nur Saccharose verabreicht wurde. Das Hemmverhältnis wird nach der folgenden Formel berechnet:

N-methylmoranolin 4-(a-D-Maltopentaosyl)-N-methylmoranolin 4-(a-D-Glucosyl)-i N-äthylmoranolin 4-(cc-D-Maltosyl)-N-äthylmoranolin 4-(a-D-Glucosyl)-N-propylmoranolin

25

23 22 35

24

(1,0%)

-143

(1,0%)

~208

moranolin

(1,34)

(987,91)

1,60

939

+ 163,14°

204

osyl)-N-methyl-

•3H20

(42,65)

(1,0%)

~194

moranolin

(1,59)

(825,76)

1,87

860

+155,98°

190

osyl)-N-methyl-

•3H20

(42,32)

(1,0%)

-176

(1,98)

(663,62)

(1,0%)

—155

(1,0%)

~ 127

1 D

Schmelz formel mentaranalyse (%)

largew.

punkt ( °C)

C

H

N

(1,63)

(811,73)

(0,5%)

Tabelle II (Forts.)

24

Verbindung

Summen

Ergebnisse der Ele

Moleku

M

1,99

800

167,1°

osyl)-moranolin

(42,05)

(1,0%)

(1) Umwandlung von Stärke in Cyclodextrin, bei der also eine Cyclisierungsreaktion abläuft.

(2,54)

(515,51)

2,61

525

+ 116°

138

N-äthylmoranolin

•2H20

(43,55)

2,06

650

+152,02°

174

-N-methylmoranolin

•2V2H2O

(42,37)

(2,56)

(501,48)

2,73

508

+130,45°

153

N-methylmoranolin

•2i/2H20

(41,76)

(2,04)

(649,59)

(0,5%)

2,28

620

161,9°

osyl)-moranolin

(42,04)

(2,77)

(487,45)

(0,8%)

2,94

477

143,9°

syl)-moranolin

(42,77)

2,9

(2) Umsetzung von Cyclodextrin mit Glucose unter Bildung von Oligoglucose, wobei bei dieser Reaktion eine Kupplungsreaktion abläuft.

2 JB.

W

(II)

(III)

in welcher

R die gleiche Bedeutung aufweist wie in Formel I, enthält, mit einer a-l,4-Glucanglucohydrolase direkt oder nach der Zugabe eines Ionenaustauschers umsetzt, wobei Verbindungen der Formel I mit n=0 nur im Gemisch mit anderen Verbindungen der allgemeinen Formel I eingesetzt werden dürfen.

Das Enzym Cyclodextrin-glycosyltransferase, und zwar das Enzym. E.C.-2,4,1,19- Cyclodextrin- glycosyltransferase, ist schon lange bekannt, und seit dieses Enzym das erste Mal ausgehend von dem Bacillus macerans entdeckt wurde, wird dieses Enzym im allgemeinen als Bacillus macerans-Amylase bezeichnet. Wie beispielsweise in den offengelegten japanischen Patentanmeldungen Nr. 20373/72, Nr. 63189/75 und Nr. 88290/75 sowie von Hans Bender in «Archives of Micro-biology» 3, Seiten 27-282,1977 und in «Agricultural and Bio-logical Chemistry», 40, Seite 753,1976, beschrieben wird, ist es bekannt, dass dieses Enzym durch die folgenden Mikroor-

Moranolin wurde zuerst aus einem rohen pharmazeutischen Präparat, das aus der Wurzelhaut von Morus alba stammte, extrahiert und isoliert. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Yagi et al., im Journal of so Japanese Association of Agricultural Chemistry, 50, Seite 571, 1976 und auf die japanische Patentveröffentlichung Nr. 83951/77 verwiesen.

Bereits früher wurde ein Verfahren zur Herstellung des Moranolines der Formel III entwickelt, und zwar ausgehend 55 von einem Mikroorganismus der zur Gattung Streptomyces gehört, indem man ein Gärverfahren, also eine Fermentation, durchführt. Es sei in diesem Zusammenhang auf die japanische Veröffentlichung Nr. 84094/79 verwiesen.

Die N-Niederalkyl-derivate des Moranolines der oben an-6o gegebenen Strukturformel können erhalten werden, indem man das Moranolin der Formel III einer Alkylierung unterwirft. Es sei in diesem Zusammenhang auf die japanische Patentveröffentlichung Nr. 12381/79 verwiesen.

Anwendungen der Cyclodextrin-glycosyltransferase wer-65 den in verschiedenen Patentveröffentlichungen und auch in anderen wissenschaftlichen Veröffentlichungen beschrieben. Als Beispiel seien die folgenden Arbeitsverfahren erwähnt: (a) die Herstellung von Hesperetin-dihydrochalcon-7-

649302

maltooligosiden, die als Süssungsmittel dienen (siehe die Veröffentlichung in Amylase Symposidum, 4, Seite 61,1972).

(b) die Herstellung von Oligosacchariden, die Fructose-einheiten an die Endstellungen gebunden haben. (Es sei in diesem Zusammenhang auf die japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 20373/72 und Nr. 119092/79 verwiesen).

(c) die Herstellung von Nojirimycin-glucose-obligomeren. (Es sei in diesem Zusammenhang auf die japanische Patentveröffentlichung Nr. 23976/78 verwiesen).

(d) die Herstellung von cyclischen Dextrinen. (Es sei in diesem Zusammenhang auf die japanische Patentveröffentlichung Nr. 88290/75 verwiesen).

(e) die Herstellung von a-Glycosylsteviosiden, die als Süssungsmittel Verwendung finden. (Es sei in diesem Zusammenhang auf die japanische Patentveröffentlichung Nr. 5070/79 verwiesen.

Bei den erwähnten Verfahren werden die drei folgenden charakteristischen Eigenschaften verwendet, welche die Cy-clodextrin-glycosyltransferase besitzt:

2. Verfahren zur Herstellung von Moranolin-derivaten der Formel I

ch£oh

-x-

ch20h

(I)

in welcher

R Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe und 55 dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Lösung, die n O oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 7 bedeuten, Moranolin der Formel II

CHpOH

(II)

2

PATENTANSPRÜCHE 1. Moraiiolin-derivate, dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgende Formel I

ch2oh ch2oh

0.

*

oh / n ch£oh aufweisen, in welcher n 0 oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 7 ist und R Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten.

(I)

h ho ch2oh h oh

\ H

H OH

(3,63)

(367,40)

3,81

358

+70,4°

109

N-propylmoranolin

•h2o

(46,75)

(3,77)

(353,37)

(0,62%)

~ 126

3,93

343

+ 76,2°

122

N-äthylmoranolin

•2H20

(45,28)

(3,73)

(339,34)

3,93

351

+ 95,2°

124

N-methylmoranolin

•2H20

(41,60)

3,4

3,5

(3) Durchführung einer Homologisierungsreaktion nach dem Schema:

(Glucose)n + (Glucose)m -* (Glucose)n+x + (Glucose)m.x

In diesem Reaktionsschema bedeuten in den Formeln n, m und x ganze Zahlen. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung im Amylase Symposium, 7, Seite 61, 1972 verwiesen.

3. Verfahren zur Herstellung von Glucosylmoranolin-de-rivaten der folgenden allgemeinen Formel IV

ch2oh

H

oh ho

H

(IV)

in welcher Mischung, welche eine oder mehrere Verbindungen, die durch

R ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe be- die folgende allgemeine Formel I deutet, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Lösung einer ch2oh ch2oh ch2oh

(I)

in welcher

R für ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe steht und n 0 oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 7 ist, veranschaulicht wird, und eine Verbindung der folgenden Formel

(ii)

ch2oh ho

P/h

Nl

H

30 ganismen: Bacillus macerans, Bacillus megaterium, Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Bacillus stearothermophillus, Klebsiella pneumoniae und Bacillus Nr. 38-2 (alkalophile Bakterien) gebildet wird.

Moranolin besitzt die folgende Strukturformel III

cho0h

3

649 302

enthält und Cyclodextrin oder eine lösliche Stärke zusammen mei I enthält, und aus dieser Mischung die Moranolin-deriva-mit Cyclodextrin-glycosyltransferase umsetzt, wobei man ei- te der Formel 1 abtrennt.

ne Mischung erhält, welche die Moranolin-derivate der For-

ch2oh

4-(a-D-Glucosyl)-N-äthylmoranolin 38% (>800 ng/ml)

N-Propylmoranolin 56

Wie man aus der Tabelle IV sieht, ist die Hemmung von Hg/ml wird die Reaktion wesentlich gehindert. Man sieht aus

Moranolin und N-Niederalkylmoranolinen sehr stark, und der Tabelle, dass diese kritische Konzentration sich mit dem diese Hemmung wird üblicherweise durch eine Glucosylie- 65 Mischungsverhältnis der jeweiligen Komponenten in der Mi-

rung vermindert. Dementsprechend läuft die Reaktion bei ei- schung hindert, und auch von der Art der niederen Alkyl-

ner sehr niedrigen Konzentration ab, jedoch bei einer Kon- gruppe abhängig ist. Da die Hemmung von Moranolin und zentration von einigen Jig/ml bis zu mehreren Hundert von Niederalkylmoranolinen mehrere Hundert Mal bis mehrere

4-(a-F-Maltopentaosyl)- N-methylmoranolin 120

N-Äthylmoranolin 6,9

4-(a-D-Maltotetraosyl)- N-methylmoranolin 180

4-(a-D-Maltotriosyl)-N-methylmoranolin 160

4-(a-D-Maltosyl)-N-methylmoranolin 1150

4-(a-D-Glucosyl)-N-methylmoranolin 125

4-(a-D-Maltotetraosyl)-moranolin 0% ( > 200 ng/ml)

N-Methylmoranolin 1,6

4-(a-D-Maltotriosyl)-moranolin 0% (> 200 ng/ml)

4-(a-D-Maltosyl)-moranolin 0% ( > 200 ng/ml

• 4-(a-D-Glucosyl)-moranolin 15% (>200 Hg/ml)

4-(a-D-Glucosyl)-N-methylmoranolin 4-(a-D-Maltosyl)-N-methylmoranolin 4-(a-D-Maltotriosyl)-N-methylmoranolin 4-(a-D-Maltotetraosyl)-N-methylmo-ranolin

Die in der Figur 4 veranschaulichten Prozentsätze des Abbaues der jeweiligen Verbindungen wurden also erhalten, wenn man die entsprechenden N-Methyloligoglycosylmora-noline mit a-l,4-Glucanhydrolase umsetzte.

Da die Zersetzung des N-Methylglucosylmoranolines ausserordentlich gering ist, wie man das in Figur 4 auf der entsprechenden Kurve ersieht, wird im Fall der entsprechenden N-Methyloligoglucosylmoranoline jeder Wert als relativer Wert ausgedrückt, um die Zersetzungsgeschwindigkeit dieser Verbindungen mit derjenigen von Maltose zu vergleichen. Jeder Wert wird dabei als relativer Wert berechnet, und zwar wird dabei die Voraussetzung gemacht, dass der Wert 100% ist wenn der Abbau unter Bildung von Glucosylmora-nolin oder von N-Methylglucosylmoranolin vollständig abgelaufen ist.

Nach der Bestimmung der Menge an Glucose wird die Reaktionsflüssigkeit filtriert und das Ionenaustauscherharz Dowex 50W x 2, das dabei auf dem Filter zurückbleibt, wird mit einer ausreichenden Menge an Wasser gewaschen und mit einer 0,5 normalen wässrigen Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck konzentriert und bis zur Erreichung eines Feststoffes getrocknet.

Der so erhaltene Feststoff wird in destilliertem Wasser aufgelöst und einer Hochgeschwindigkeits-Flüssigchroma-tographie unterworfen. Diese wird mit einem Hochgeschwin-digkeits-Flüssigchromatographen der Firma Waters & Co.,

4-(a-D-Maltotetraosyl)-

N-methylmoranolin

Adsorbierte Menge in mg

100 100 50 50 50

Die bei diesen Versuchen gewonnenen Ergebnisse sind in der Figur 4 veranschaulicht. Wie bereits erwähnt wurde, ist dort auf der Abszisse die Reaktionszeit in Stunden aufgetragen und auf der Ordinate ist das Verhältnis des Abbaues in %, bezogen auf den vollständigen Abbau, unter Bildung von Glucose aufgetragen.

In dieser Figur 4 sind die für die einzelnen Substrate bestimmten Werte aufgetragen, wobei die Messpunkte der einzelnen Kurven unterschiedlich gezeichnet sind. In der folgenden Tabelle werden die Messkurven der Figur 4 veranschaulicht.

Messkurve mit

Messpunkten

-X--A--A--O-

Substrat

Maltose

4-(a-D-MaltotriosyI)-

N-methylmoranolin

4-(a-D-Maltosyl)-

N-methylmoranolin

4-(a-D-Glucosyl)-

N-methylmoranolin

4-(a-D-Maltotetraosyl)-

Hemmverhältnis in % des Blutzuckeranstieges

19 44 35 31 56 56 62 29

Bezüglich derjenigen Verbindungen der Formel I, in welchen n= 1 ist, wurden andere Untersuchungen unternommen, und es zeigte sich, dass durch den sehr einfachen Arbeitsvorgang, gemäss dem eine gemischte Lösung, die nach dem Verls fahren gemäss Patentanspruch 2 erhalten wurde, mit a-1,4-Glucanglucohydrolase, nämlich der E.C.-3,2,l,3a-l,4-Glu-canglucohydrolase, angesetzt wird, entweder ein Oligoluco-sylmoranolin, in welchem n = 1 ist oder eine grössere ganze Zahl bedeutet, oder ein N-Niederalkylmoranolin, in einer 20 sehr guten Ausbeute in das 4-(a-D-Glucosyl)-moranolin oder ein 4-(a-D-Glucosyl)-N- niederalkylmoranolin umgewandelt werden kann, in welchen N=0 ist.

Die a-l,4-Glucanglucohydrolase, die bei dem oben beschriebenen Arbeitsverfahren verwendet wird, wird vorzugs-25 weise hauptsächlich durch Schimmelpilze gebildet, wie zum Beispiel durch Rhizopus niveus, Rhizopus delemar, Aspergillus niger und Aspergillus awamori, und dieses Produkt wird auch Glucoamylase, Amylglucosidase, y-Amylase oder Taka-amylase B genannt.

3o Bei der Durchführung dieses Verfahrens kann das fragliche Enzym in Form von Enzymkristallen verwendet werden, oder es kann ein Zuchtmedium, welches das Enzym enthält, beispielsweise eine rohes Enzym enthaltende Flüssigkeit, die erhalten wird, indem man Rhizopus niveus züchtet, verwen-35 det werden. Ausserdem können auch andere Kohlehydrate zersetzende Enzyme, wie zum Beispiel a-Amylase oder ß-Amylase in dem Enzym anwesend sein, das bei dem erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt wird. Die Wirkung der a-l,4-Glucanglucohydrolase besteht darin, dass sie Stärke, 40 ausgehend von den nicht reduzierenden Endgruppen, zu Glucoseeinheiten abbaut. Natürlich können auch Maltose, Maltotriose, Maltotetraose und höhere Oligosaccharide mit a-1,4-Bindungen in gleicher Weise in Glucoseeinheiten durch das erwähnte Enzym abgebaut werden. Diese Abbaureaktio-« nen können durch das folgende Reaktionsschema veranschaulicht werden:

Stärke + nHzO -» n-Glucose so In gleicher Weise kann dieses Reaktionsschema auch durch die folgende Schreibweise wiedergegeben werden:

G-G-G.. -G+mH20 -► mG

55 wobei in diesem Schema n und m ganze Zahlen sind G Glucose bedeutet, und

G-G anzeigt, dass eine a-l,4-Verknüpfung der einzelnen Glucoseeinheiten vorhanden ist.

60 Natürlich ist es für einen Fachmann auf diesem Gebiet völlig klar, dass die Quelle aus der das Enzym stammt, das zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens herangezogen wird, in keiner Weise auf Schimmelpilze beschränkt ist.

65 Das erste charakteristische Merkmal des erfindungsgemässen Verfahrens beruht darauf, dass völlig überraschenderweise gefunden wurde, dass Maltose, trotz der Tatsache, dass sie die folgende Formel

649302

ch oh ch2oh aufweist, rasch durch a-l,4-Glucanglucohydrolase zu Glucose abgebaut wird, während andererseits 4-a-D-Glucosyl)-mo-ranolin und 4-(a-D-Glucosyl)-N-niederalkylmoranolin kaum durch die a-l,4-Glucanglucohydrolase abgebaut werden, und dass ferner Oligoglucosylmoranoline und N-Niederalkyloli-goglucosylmoranoline der Strukturformel I, mit Ausnahme derjenigen, in welchen n=0 ist, durch das angeführte Enzym mit einer Geschwindigkeit abgebaut, bzw. zersetzt werden, die nicht höher ist als die Geschwindigkeit für den Maltoseabbau, die jedoch für praktische Zwecke ausreichend hoch ist.

Diese überraschenden Ergebnisse bezüglich des enzymati-schen Abbaus werden in der Folge noch eingehend erläutert.

Das erfmdungsgemässe Verfahren kann allgemein anhand des folgenden Reaktionsschemas erläutert werden.

GA

(m-1)

GA

... —> G—G—G-G—Mr > G-G-G—MR

k4

GA GA GA

> G-G-Mr » G-Mr * G+MR

k3 k2 k.

In diesem Reaktionsschema haben die verwendeten Symbole die folgenden Bedeutungen:

G bedeutet Glucose,

Mr bedeutet Moranolin oder N-Niederalkylmoranolin, m ist eine ganze Zahl,

GA bedeutet a-1,4-Glucanglucohydrolase,

jede Bindimg, die in dem Reaktionsschema vorliegt, bedeutet eine a-l,4-Verknüpfung, und die Symbole km, km-1, .. .k2 und kl bedeuten Geschwindigkeitskonstanten der Reaktionen der jeweils angegebenen Stufe.

Bei der praktischen Durchführung dieses Verfahrens werden bevorzugt die Reaktionen der jeweiligen Stufen an einer Mischung von Verbindungen ausgeführt, die sich voneinander in der Anzahl der Glucosegruppen, also in dem Wert m, unterscheiden. Um daher zu erreichen, dass sich das angestrebte Produkt der Formel G-Mr in der flüssigen Reaktionsmischung ansammelt, ist es unumgänglich, dass die Ge-schwindigkeitskonstanten km, km-1, .. .k2 ausreichend hoch sind, dass jedoch die Geschwindigkeitskonstante kl ausreichend tiefliegt.

Die oben erläuterten Verhältnisse werden anhand der Figur 4 der Zeichnung näher erläutert.

In Figur 4 ist auf der Abszisse die Reaktionszeit in Stunden aufgetragen, und auf der Ordinate sind die Prozente des Abbaus, bzw. die Prozente der Zersetzung aufgetragen. 15 Bei den in Figur 4 veranschaulichten Abbaureaktionen wurde eine vorher bestimmte Menge an N-Methyloligoglyco-sylmoranolin auf einem Gramm der Wasserstoff-form eines Ionenaustauschers, nämlich Dowex 50W x 2 (H+) in einem Erlenmeyer-kolben adsorbiert, wobei der Kolben ein Fas-20 sungsvermögen von 125 ml besitzt. Die Materialien werden in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert, und es werden 10 ml an a-l,4-Glucanglucohydrolase zu der Suspension zugesetzt. Man bebrütet bei 40 °C, und es werden Proben von je 500 [d der Flüssigkeit nach vorher bestimmten Zeitintervallen ent-25 nommen, und die Menge an Glucose in diesen Proben wird bestimmt. Wenn man bei diesem Verfahren als Substrat Maltose verwendet, dann wird sie mit 1 g des Ionenaustauschers Dowex 50W x 2 (H+) vermischt und in diesem Stadium wird die Bebrütung bei einer Temperatur von 40 °C durchgeführt.

30

Bestimmung der Glucose:

Es wird 1 ml an 0,3n Bariumhydroxyd der Formel Ba-(OH)2 und 1 ml an 5%igem Zinksulfat der Formel ZnS04 zu 35 den 500 |il der Flüssigkeit zugesetzt, die von der Reaktionsmischung abgezogen wurden, und man zentrifugiert dann mit einer Zentrifugengeschwindigkeit, die eine 2000-fache Erdbeschleunigung erzeugt, also mit einer Belastung von 2000 g, während 10 Minuten. 30 jj.1 der darüber stehenden Flüssigkeit 40 werden entnommen, und 3 ml eines käuflich erhältichen Farbreagenses auf Glucose werden zu der entnommenen Probe zugesetzt. Das käuflich erhältliche Farbreagens auf Glucose ist das Reagens eines neuen Tests auf Blutzucker, und dieses wird von der Firma Baiinger Manhime Co. hergestellt. 45 Die Mischung wird ausreichend lang gerührt, und man lässt sie dann bei Zimmertemperatur während 35 Minuten stehen und die Absorption bei einer Wellenlänge von 420 nm wird bestimmt.

Getrennt davon wird ein Glucose-Vergleichsreagens mit so einem Glucosereagens von 9,1 mg/dl in gleicher Weise behandelt, und die Absorption bei 420 nm wird bestimmt. Basierend auf diesen Messungen wird so die Menge an Glucose, die sich in der flüssigen Phase der Reaktionsmischung gebildet . hat, bestimmt.

55 Das verwendete Enzym war das folgende:

Etwa 22 Einheiten pro mg von in Form von Kristallen vorliegender a-l,4-Glucanglucohydrolase, die unter Verwendung von Rhizopus niveus gewonnen wurde. Dieses Produkt ist von der Firma Seikagaku Kogyo K.K. erhältlich.

60

Bestimmung der Aktivität des Enzymes:

4-(a-D-Maltotriosyl)-

N-methylmoranolin

4-(a-D-Maltosyl)-

N-methylmoranolin

4-(a-D-Glucosyl)-

N-methylmoranolin

4-(a-D-Maltotetraosyl)-

moranolin

4-(a-D-Maltotriosyl)-moranolin

4-(a-D-Maltosyl)-

moranolin

4-(a-D-Glucosyl)-

moranolin

4-(a-D-Glucosyl)-

C15H29O9N

46,86

4-(a-D-Maltosyl)-

c20h37o14n

43,51

4-(a-D-Glucosyl)-

Ci4H27014N

45,44

4-(a-D-Maltopenta-

C37H65O29N

42,39

4-(a-D-Maltotetra-

C31H55O24N

42,01

4-(a-D-Maltotriosyl)

C25H45O19N

42,64

4-(a-D-Maltosyl)-

C19H35014N

41,67

4-(a-D-Glucosyl)-

Q3H25O9N

41,67

4-(a-D-Maltotetra-

C3oh53024N-21 / 2H2O

41,97

4-(a-D-Maltotri-

c24h43019n-2h20

42,44

4-(a-D-Malto-

c18h33o14nh2o

42,63

(4,19)

(325,31)

4,04

330

121,6°

syl)-moranolin

(43,10)

4-(a-D-Gluco-

C12H2309N-1/2H20

43,14

4-(a-D-Maltooctanosyl)- N-propylmoranolin

22,1

Die Werte der Elementaranalyse, die Molekulargewichte und die spezifische Drehung in wässrigen Lösungen sowie die Schmelzpunkte der herzustellenden Produkte sind in der fol-15 genden Tabelle II zusammengestellt.

Dabei wurden die Molekulargewichte bestimmt, indem man die Vorrichtung zur Bestimmung des Molekulargewichtes der Firma Hitachi, Modell 115, verwendete. In der Tabelle II sind sowohl beim Molekulargewicht als auch bei den Wer-20 ten der Elementaranalyse jeweils zunächst die bestimmten Werte angeführt und dann darunter in Klammer die theoretisch berechneten Werte. Bei der optischen Drehung sind unterhalb des Wertes in Klammer die Konzentrationen der wässrigen Lösungen angeführt, mit deren Hilfe die optische 2« Drehung bestimmt wurde.

Tabelle II Verbindung

Summenformel

Ergebnisse der Elementaranalyse (%)

Molekulargew.

[a]

24 D

c h

n

4-(a-D-Maltoheptaosyl)-N-propylmoranolin

17,2

4-(a-D-Maltohexaosyl)-N- N-propylmoranolin

13,2

4-(a-D-Maltopentaosyl)- N-propylmoranolin

4-(a-D-Maltotetraosyl)- N-propylmoranolin

4-(a-D-Maltotriosyl)- N-propylmoranolin

4-(a-D-Maltosyl)- N-propylmoranolin

4-(a-D-Glucosyl)- N-propylmoranolin

4-(a-D-Maltoheptaosyl)- N-äthylmoranolin 20,2

N-Propylmoranolin

4-(a-D-Maltohexaosyl)- N-äthylmoranolin 15,8

4-(a-D-Maltopentaosyl)- N-äthylmoranolin 12,1

4-(a-D-Maltotetraosyl)- N-äthylmoranoün 9,0

4-(a-D-Maltotriosyl)- N-äthylmoranolin 6,8

4-(a-D-Maltosyl)- N-äthylmoranolin 5,1

4-(a-D-Glucosyl)- N-äthylmoranolin 3,9

4-(a-D-Maltooctanosyl)- N-methylmoranolin 25,1

N-Äthylmoranolin 3,3

4-(a-D-Maltoheptaosyl)- N-methylmoranolin 19,5

4-(a-D-Maltohexaosyl)- N-methylmoranolin 15,2

4-(a-D-Maltopentaosyl)- N-methylmoranolin 11,9

4-(a-D-Maltotetraosyl)- N-methylmoranoUn 9,1

4-(a-D-Maltotriosyl)- N-methylmoranolin 6,9

4-(a-D-Maltosyl)- N-methylmoranolin 5,3

4-(a-D-Glucosyl)- N-methylmoranolin 4,1

4-(a-D-Maltotetraosyl)-moranolin 11,5

N-Methylmoranolin 3,5

4-(a-D-Maltotriosyl)-moranolin 9,8

4-(a-D-Maltosyl)-moranolin 6,6

4-(a-D-Glucosyl)-moranolin 5,3

5,7

5 649 302

enthält und Cyclodextrin oder eine lösliche Stärke zusammen 1 Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur mit Cyclodextrin-glycosyltransferase umsetzt, wobei man ei- Herstellung von Glucosylmoranolin-derivaten der folgenden ne Mischung erhält, welche die Moranolin-derivate der For- allgemeinen Formel IV mei I enthält, und aus dieser Mischung die Moranolin-deriva-te der Formel I abtrennt.

ch-oh

\ oh ho \j- -

H

in welcher ein gereinigtes Enzympräparat zu verwenden, sondern es

R ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe be- 20 kann auch ein Filtrat des Zuchtmediums als rohe, Enzym entdeutet, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Lösung haltende Flüssigkeit eingesetzt werden. Im allgemeinen wird einer Mischung, die eine oder mehrere erfindungsgemässe jedoch das Enzym in Form eines teilweise gereinigten, eines Verbindungen der Formel I sowie eine Verbindung der fol- hoch gereinigten oder eines stabilisierten Enzymproduktes eingesetzt.

25 Wenn man die Verbindung der Formel II mit Cyclodextrin in Anwesenheit der so erhaltenen Cyclodextrin-glycosyl-transferase umsetzt,dann erhält man das gewünschte Produkt. Es sei daraufhingewiesen, dass bei dieser Reaktion als Ausgangsmaterial statt des Cyclodextrines auch Stärke oder (II) 30 Dextrin eingesetzt werden kann. Bei dieser Umsetzung werden die Reaktionsbedingungen je nach dem Ursprung der verwendeten Cyclodextrin-glycosyltransferase gewählt, im allgemeinen erhält man jedoch das gewünschte Produkt, indem man die Reaktion bei einer Temperatur von etwa 40 °C 35 und einem pH-Wert, der im Bereich von 5,0 bis 8,5 liegt, ablaufen lässt, wobei die Reaktionszeit im allgemeinen im Bereich von 1-3 Tagen liegt. An sich bekannte Verfahren der enthält, mit einer a-1,4-Glucanglucohydrolase direkt oder Abtrennung und der Reinigung können angewandt werden, nach der Zugabe eines Ionenaustauschers umsetzt, wobei um das gewünschte Produkt aus der flüssigen Reaktionsmi-

Verbindungen der Formel I mit n=0 nur im Gemisch mit an- 40 schung zu isolieren. Beispielsweise kann das folgende Arbeits-deren Verbindungen der allgemeinen Formel I eingesetzt wer- verfahren durchgeführt werden:

den dürfen. Zuerst wird eine flüssige Reaktionsmischung durch eine

Die Cyclodextrin-glycosyltransferase, die zur Durchfüh- Säule geleitet, die ein stark saures Ionenaustauschermaterial rung des erfindungsgemässen Verfahrens eingesetzt wird, enthält, wobei dadurch die basischen Substanzen auf dem kann erhalten werden, indem man einen Mikroorganismus, 45 Harz absorbiert werden, und die Elution wird durchgeführt, der in der Lage ist, dieses Enzym zu bilden, in einem Nährme- indem man eine 0,5-normale wässrige Ammoniaklösung ver-dium züchtet, welches ein Kohlenstoff lieferndes Material, ein wendet und das Eluat wird unter vermindertem Druck kon-Stickstoff lieferndes Material und anorganische Bestandteile zentriert. Das so gewonnene Konzentrat wird einer Fraktio-enthält, und gegebenenfalls weitere Bestandteile, die zur Bil- nierung unterworfen, indem man eine Sephadex-Säule ver-dung des Enzymes gut geeignet sind, und dann die so gebilde- so wendet, und die notwendigen Fraktionen werden aufgefan-te Cyclodextrin-glycosyltransferase nach an sich bekannten gen und einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei man ein Reinigungsverfahren reinigt, wobei als Beispiele für derartige weisses Pulver erhält. Die Identifizierung der jeweiligen Frak-Reinigungsverfahren genannt seien: ein Aussalzen, eine Dia- tionen kann erreicht werden, indem man beispielsweise eine lyse, eine Adsorption auf Stärke, eine Desorption, eine Gelfil- Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie durchführt, tration und eine Ionenaustausch-chromatographie. Als Bei- 55 Wenn man eine Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatogra-spiele für Mikroorganismen, die zur Bildung des gewünschten phie durchführt, dann wird diese auf einem Hochgeschwin-Enzyms geeignet sind, seien Mikroorganismen der Gattung digkeits-Flüssigchromatographen durchgeführt, beispielswei-Bacillus oder Klebsiella genannt. Das Nährmedium, in wel- se dem Modell mit der Bezeichnung ALC/GPC-244, das von chem die fraglichen Mikroorganismen bevorzugt gezüchtet der Firma Waters Co. erhältlich ist. Bei dieser Hochgeschwin-werden, kann als Kohlenstoff lieferndes Material beispiels- 60 digkeits-Flüssigchromatographie verwendet man eine ji-Bon-weise Stärke oder Kleie enthalten, und als Beispiel für Stick- dapak NH2-Säule und entwickelt mit einer Mischung aus Es-stoff liefernde Materialien seien Maisquellwasser, Polypepto- sigsäurenitril + Wasser im Mischungsverhältnis von 70:30 ne, gemahlener Kleber von Getreidearten, beispielsweise ge- mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,5 ml pro Minute, mahlener Maiskleber, und Hefeextrakt genannt. Als Beispiele Dieses Verfahren wird anhand der Beispiele 2,3 und 4, und für anorganische Substanzen, die in dem Nährmedium ent- 65 mit Hilfe der Figuren 1,2 und 3 noch näher erläutert. Dabei halten sein können, seien Ammoniumsulfat, Calciumcarbo- zeigt es sich, dass die in der folgenden Tabelle I angegebenen nat, Magnesiumchlorid und andere Substanzen, die zur Bil- Verbindungen bei dieser Chromatographie die in der Tabelle dung des Enzyms vorteilhaft sind, erwähnt. Es ist nicht nötig I angegebenen Retentionszeiten besitzen.

genden Formel (II)

649 302

Tabelle I

Verbindung Retentionszeit in Minuten

Moranolin 4,3

5 In jüngster Zeit wurde die Substrat-spezifität von Cyclo-dextrin-glycosyltransferase bei Kupplungsreaktionen erläutert, und es sei in diesem Zusammenhang beispielsweise auf die Veröffentlichung in Agricultural and Biological Chemistry, 42, Seite 2369,1978, verwiesen.

xo Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass Moranolin und N-Niederalkyl-moranoline als Substrat bei einer mit Cyclodextrin-glycosyltransferase durchgeführten Kupplungsreaktion eingesetzt werden können.

Es wurde festgestellt, dass Moranolin und seine Derivate 15 als Wirkstoffe in pharmazeutischen Präparaten gut geeignet sind, die ein Ansteigen des Blutzuckerspiegels bei mit Zucker belasteten Tieren vermindern oder verhindern. Es sei in diesem Zusammenhang auf die japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 83951/77, Nr. 12381/79 und Nr. 106477/79 ver-20 wiesen.

Es wurden nun eingehende Untersuchungen durchgeführt, mit dem Ziel, noch besser geeignete und stärker wirksame Moranolin-Derivate zu entwickeln und ebenfalls ein Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen. 25 Die erfmdungsgemässen Verbindungen weisen die folgende Formel auf

CH20H

ch2oh oh / n ch2oh

(I)

in welcher 55 Das Verfahren zu ihrer Herstellung ist dadurch gekenn-

n 0 oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 7 ist und zeichnet, dass man eine wässrige Lösung, die Moranolin der

R Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten. Formel II

CH20H

(II)

(6,87)

6,98

(6,99)

(6,82)

6,80

(6,91)

6,95

(6,98)

(7,49)

7,61

(7,87)

7,94

7,01

(7,11)

7,44

(7,38)

7,66

(7,79)

7,98

7,35

(7,24)

7,56

7,6

(8,11)

8,19

9 649 302

Modell ALC/GPC-244 unter Verwendung einer n-Bondapak NH2-Säule durchgeführt, wobei als Laufmittel eine Mischung aus Essigsäurenitril + Wasser im Mischungsverhältnis von 70:30 eingesetzt wird, und die Durchflussgeschwindigkeit 51,5 ml pro Minute beträgt. Das Reaktionsprodukt wird mit Hilfe eines Gerätes mit der Bezeichnung Chromatopac, Modell C-RIA der Firma Shimadzu Seisakusho K.K. identifiziert. Die Bildungsgeschwindigkeiten von N-Methylmorano-lin betragen etwa 3% im Falle von 4-(a-D-Glucosyl)- N-

10 methylmoranolin, etwa 2% im Falle von 4-(a-D-Maltosyl)-N- methylmoranolin, etwa 1% im Falle von 4-(a-D-Maltotri-osyl)- N-methylmoranolin, und etwa 2% im Falle von 4-(a-D-Maltotetraosyl)-N-methylmoranolin.

Eine ähnliche Tendenz ist bei den Oligoglucosylmoranoli-i5 nen zu beobachten. In diesem Fall ist die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion grösser als bei den entsprechenden N-Methyloligosylmoranolinen wenn man die gleichen Reak-tionsbedingungen anwendet, wie diejnigen die bei den N-Methyloligoglucosylmoranolinen verwendet wurden. Im 20 Falle der Oligoglucosylmoranoline ist Maltose im wesentlichen vollständig innerhalb einer Stunde abgebaut, jedoch betragen die Zersetzungsgeschwindigkeiten für 4-(a-D-Glu-cosyl)-moranolin, bzw. 4-(a-D-Maltosyl)- moranolin, bzw. 4-(a-D-Maltotriosyl)-moranolin jeweils etwa 3%, bzw. etwa 25 53%, bzw. etwa 50%. In diesem Falle ist die Bedeutung der Zersetzungsgeschwindigkeiten die gleiche, wie diejenige die weiter oben im Zusammenhang mit den entsprechenden N-Methyloligoglycosylmoranolinen erläutert wurde.

In den vorhin beschriebenen Versuchen ist das Substrat 3o auf einem stark sauren Ionenaustauscherharz adsorbiert, nämlich auf Dowex 50W x 2. Maltose wird mit dem Harz vermischt. Die Gründe für die Verwendung dieses speziellen Harzes werden in der Folge im einzelnen erläutert. Die Anwesenheit einer zu grossen Menge des stark sauren Ionenaus-35 tauscherharzes hemmt die enzymatische Reaktion. Es treten jedoch keine wesentlichen Probleme auf, wenn die Menge an Austauscherharz bis zu etwa 4 g in 100 ml der Reaktionsflüssigkeit beträgt. Wenn das Harz mit den Substraten Moranolin, bzw. N-Niederalkylmoranoline, bzw. Oligoglycosylmora-40 noline, bzw. Oligoglycosyl-N-niederalkylmoranolinen gesättigt ist, dann wird die Reaktion nicht gehemmt, selbst wenn weitere Mengen an Harz zugesetzt werden.

Üblicherweise wird die a-l,4-Glucanglucohydrolase in einer Pufferlösung verwendet. Jedoch selbst dann, wenn die Re-45 aktion in destilliertem Wasser ausgeführt wird, treten keine praktischen Nachteile auf, obwohl die Aktivität des Enzymes bis zu einem gewissen Ausmass vermindert ist.

Das zweite charakteristische Merkmal des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass daraus gefunden wur-50 de, dass dann, wenn die oben erwähnte Mischung auf einem kationischen Austauscherharz adsorbiert wird und mit a-1,4-Glucanglucohydrolase umgesetzt wird, die Konzentration der Mischung in der Reaktionsflüssigkeit wesentlich erhöht werden kann und die Reaktion durch den Zustand der Mi-55 schung nicht beeinflusst wird, und ferner die Hemmung durch gebildetes Produkt, nämlich durch gebildetes Moranolin oder durch gebildetes N-Niederalkylmoranolin, nicht hervorgerufen wird. Diese genannten Produkte, von denen angenommen wurde dass sie eine Hemmung hervorrufen könnten, werden 60 nämlich in sehr kleinen Mengen gebildet. Die genannten charakteristischen Merkmale des erfindungsgemässen Verfahrens führen dazu, dass es bei der industriellen Durchführung zu grossen Vorteilen führt. Dies wird nun in der Folge noch im einzelnen näher erläutert.

65

Moranolin, N-Niederalkylmoranoline, Oligoglycosylmo-ranoline und N-Niederalkyloligoglucosylmoranoline hemmen die Aktivität der a-l,4-Glucanglucohydrolase. Die In

649302

tensitäten der Hemmung dieser Verbindungen sind in der Tabelle IV zusammengestellt.

Die Bestimmung der Hemmung erfolgt nach dem jetzt beschriebenen Arbeitsverfahren:

Das verwendete Enzym ist Glucoamylase in Form von Kristallen die unter Verwendung des Mikroorganismus Rhizopus niveus gewonnen wurde. Dieses Enzym ist von der Firma Seikagaku Kogyo K.K. erhältlich. Die Glucoamylase wird in destilliértem Wasser in einer solchen Menge gelöst, dass die Enzymkonzentration 50 jag pro ml beträgt, und das Enzym wird in Form dieser Lösung eingesetzt.

Herstellung des Substrates:

Lösliche Stärke wird in einer Pufferlösung bei einer hohen Temperatur gelöst, sodass die Konzentration der Stärke in der Lösung 1,4% beträgt. Anschliessend wird dann die Lö-5 sung auf Zimmertemperatur abgekühlt und in dieser Form verwendet.

Als Pufferlösung wird eine 0,1 molare Phosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 5,7 verwendet.

Es wurden die folgenden Ausgangsflüssigkeiten ver-io wendet:

Ausgangs

Blind

Blind

Vergleichs

Test flüssigkeit:

probe (I)

probe (II)

probe probe

Enzym

-

-

150 nl

150 jxl

Substrat

250 nl

25011I

250 nl

250 fil

Inhibitor

100 |il

-

-

100 nl

Destilliertes

Wasser 150 |il 250 nl 100 jxl -

Beschreibung des Arbeitsverfahrens: (C-B) - (T'-B')

Die jeweilige Ausgangsflüssigkeit wird bei einer Tempera- Prozent Hemmung = ——"— x 100

tur von 40 °C während 10 Minuten bebrütet, und es werden 25 (C-B)

10

Hemmverhältnis

V T

V-G

•x 100

In dieser Formel bedeutet:

V = AAUC der Vergleichsgruppe, also derjenigen Gruppe an welche nur Saccharose verabreicht wurde,

T = AAUC der Testgruppe, also derjenigen Gruppe an die sowohl Saccharose als auch die zu testende Verbindung verabreicht wurde,

G = AAUC der Grundgruppe, also derjenigen Gruppe an die nur Wasser verabreicht wurde.

Die Ergebnisse der obigen Berechnungen bezüglich des Hemmverhältnisses betreffend den Anstieg des Blutzuckers sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III Verbindung

Moranolin

10,1

11

649302

Tausend Mal so hoch ist wie die der entsprechenden glycosy- Der in dem Schrägkulturmedium verwendete Leberpulver

Herten Substanzen, wird die kritische Konzentration extrem agar-agar war ein neutralisiertes Leberabbauprodukt, das unstark verändert, durch diejenigen Mengen an Moranolin, ter dem Markennamen «OXOID®» erhältlich ist. Man züch-bzw. Niederalkylmoranolinen, die in dem System anwesend tete bei einer Temperatur von 37 °C während 3 Tagen. Dann sind. Bei der tatsächlichen Durchführung dieses Verfahrens 5 wurden 300 ml des erhaltenen Kulturmediums zu 9 Litern ei-ist jedoch eine höhere Konzentration vom Gesichtspunkt der nes Kulturmediums zugesetzt, welches die gleiche Zusam-Herstellungskosten bevorzugt, und die Reaktion sollte nicht mensetzung besass, wie oben beschrieben, und welches sich in durch den jeweiligen Zustand der Mischung beeinflusst wer- einem krugförmigen Gärbehälter befand, welcher ein inneres den. Es wurden ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt, Fassungsvermögen von 15 Litern besass. Diese Züchtung wobei diesen Umständen Rechnung getragen wurde, und es i0 wurde bei einer Temperatur von 37 °C während 10 Tagen unzeigte sich dabei, dass dann wenn das Enzym in dem Zustand ter ausreichender Belüftung und unter Rühren durchgeführt, verwendet wird, wo es auf einem sauren Kationenaustau- Man erhielt so eine Enzymflüssigkeit, die etwa 130 bis et-

scherharz adsorbiert ist, die Reaktion bei einer Konzentration wa 150 Enzymeinheiten enthielt. Die Definition der Enzymfortschreitet, die höher als mehrere Tausend p.g/ml liegt, und einheiten wird in der Folge gegeben.

die Reaktion in diesem Falle auch nicht durch den Zustand 15

der Mischung beeinflusst wird. Diese neue Tatsache, die bei Bestimmung der Aktivitätseinheiten von Cyclodextrin-glyco-der Ausarbeitung des erfindungsgemässen Verfahrens heraus- syltransferase:

gefunden wurde, ist für die industrielle Anwendung von gros- Lösliche Stärke wurde in einer Konzentration von 0,7% ser Bedeutung. Übrigens lief die Reaktion bei den nachfol- in einer 0,05 molaren Acetatpufferlösung, die einen pH-Wert gend gezeigten Beispielen 6,7,8 und 10 überhaupt nicht ab, 20 von 5,5 aufwies, gelöst, und man erhielt so die Substratlö-wenn das Enzym in demjenigen Zustand verwendet wird wo sung. Die verwendete lösliche Stärke war ein zur Durchfüh-es nicht auf einem stark sauren Kationenaustauscherharz ad- rung von biochemischen Untersuchungen geeignetes Pro-sorbiert ist. dukt, das von der Firma Nakarai Kagaku K.K. erhältlich ist.