DE3706838A1 - Neue, physiologisch aktive substanz "aldostatin" und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue, physiologisch aktive Substanz "Aldostatin", welche einen Aldose- Reduktaseinhibitor darstellt. Die Erfindung betrifft ferner ihre Salze sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Das mit der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellte Aldostatin ist brauchbar zur Behandlung bestimmter chronischer Komplikationen, welche durch Diabetes renalis verursacht werden, wie Cataracta diabetica, Retinopathie und Neuropathie.

Gegenstand der meisten Versuche, welche bisher mit dem Ziel durchgeführt wurden, antidiabetische Arzneimittel zu erhalten, ist eine Verringerung des Blutzuckerspiegels. Bisher sind fast überhaupt keine Maßnahmen bekannt, um chronische diabetogene Komplikationen zu verhindern oder zu lindern, wie Cataracta diabetica, Retinopathie und Neuropathie.

Gemäß Sakamoto et al. [Pharmacia, 19, 43, (1983)] wird der Metabolismus des Polyol-Systems aktiviert durch eine geringfügige Verstärkung einer Aldose- Reduktase im Zustand eines hohen Blutzuckerspiegels, wie bei Diabetes. Das führt zu einer weiteren Förderung der abnormen Ansammlung von Sorbit, Galactit und Fructose. Sorbit, Galactit und Fructose sind innerhalb der Zellen relativ stabil. Wenn sie sich dort einmal gebildet haben, wird ihr Austritt aus den Zellen kaum beobachtet. Diese Störung einer ausgewogenen Erzeugung und Exkretion führt zu der intrazellularen Akkumulation dieser Zuckeralkohole. Diese Erscheinung wird wiederum als verantwortlich dafür angesehen, daß es zu einer Akkumulation von Wasser in den Zellen kommt, so daß die Zellen ihre normale Funktion nicht länger aufrechterhalten können. Das führt zu einem istionischen Problem. Man kann daher davon ausgehen, daß die abnormale, intrazellulare Akkumulation von Sorbit, Galactit und Fructose vermieden werden kann und die zellulare Funktion normal gehalten werden kann, falls die Aktivitäten der Aldose-Reduktase inhibiert werden.

Es besteht daher seit langem ein Bedarf für die Schaffung eines neuen Aldose-Reduktaseinhibitors, der bei der Verhinderung oder Behandlung chronischer, diabetogener Komplikationen brauchbar ist.

Mit Blick auf das Ziel der Schaffung eines neuen Aldose- Reduktaseinhibitors haben die Erfinder eine Anzahl von Mikroorganismen aus Bodenproben isoliert und die von den Mikroorganismen erzeugten Substanzen hinsichtlich ihrer Aldose-Reduktaseinhibitor-Aktivität untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß bestimmte Mikroorganismen von Pseudoeurotium einen neuen Aldose-Reduktaseinhibitor erzeugen.

Aufgrund verschiedener physiochemischer und biologischer Eigenschaften des Inhibitors wurde festgestellt, daß es sich dabei um einen neuen Aldose-Reduktaseinhibitor handelt, der nunmehr mit "Aldostatin" bezeichnet wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Schaffung einer physiologisch aktiven Substanz "Aldostatin" mit folgenden Eigenschaften:

• (a) Unterscheidung von sauren, neutralen oder basischen Eigenschaften: saure Substanz;
• (b) Elementaranalyse:
  C = 57,20 ± 2,0
  H =  4,70 ± 1,0
  N =  6,97 - 1,5;
• (c) gemessenes Molekulargewicht: (M + H)⁺ 417 (mit der FAB_mass-Methode);
• (d) vermutete Molekülformel: C₂₀H₂₀N₂O₈;
• (e) UV-Absorptionsspektrum:
  • (1) wäßrige, neutrale Lösung:
    λ _max 285 ± 2 nm (E 135 ± 20) (Fig. 1)
    (2) wäßrige, saure Lösung:
    λ _max 285 ± 2 nm (E 135 ± 20) (Fig. 2)
    (3) wäßrige, alkalische Lösung:
    λ _max 230 ± 4 nm Sch, 257 ± 4 nm Sch,316 ± 2 nm (E 195 ± 20) (Fig. 3);
• (f) IR-Absorptionsspektrum (KBr; cm^-1): 3300, 3030, 2920, 1720, 1650, 1495, 1410, 1370, 1335, 1220 (Fig. 4);
• (g) ¹³C-NMR-Spektrum (d₆-DMSO, 100 MHz, interner Standard DMSO=39,5 TpM; δ TpM): 171,7 (s), 160,1 (d), 152,1 (s), 131,7 (d), 128,2 (d), 127,1 (s), 125,1 (s), 115,3 (d), 52,1 (d), 35,9 (t) (Fig. 5);
• (h) Löslichkeit:
  löslich in Wasser, Methanol und dimethylsulfoxid, geringfügig löslich in Aceton, Ethylacetat und Chloroform,
  unlöslich in Benzol, Hexan und Petrolether;
• (i) Farbreaktion:
  positiv: KMnO₄ und FeCl₃
  negativ: Nihydrin, Molisch und Fehling.

Es ist ferner Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer physiologisch aktiven, neuen Substanz Aldostatin zu schaffen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Aldostatin erzeugenden Mikroorganismus von Pseudeurotium in einem Kulturmedium kultiviert und anschließend Aldostatin aus der Kulturbrühe isoliert.

Das Aldostatin der vorliegenden Erfindung inhibiert die Aldose-Reduktaseaktivität und verhindert folglich eine abnorme Akkumulation von Sorbit, Galactit, usw. Die Substanz ist daher wirksam bei der Behandlung chronischer Komplikationen, wie Cataracta, Retinopathie und Neuropathie, welche durch diabetes renalis verursacht werden.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Zeichnungen erläutert; es zeigen:

Fig. 1 ein UV-Absorptionsspektrum der physiologisch aktiven Substanz der vorliegenden Erfindung, Aldostatin, in neutraler Lösung;

Fig. 2 ein UV-Absorptionsspektrum von Aldostatin in einer sauren Lösung;

Fig. 3 ein UV-Absorptionsspektrum von Aldostatin in einer alkalischen Lösung;

Fig. 4 ein IR-Absorptionsspektrum von Aldostatin;

Fig. 5 ein ¹³C-NMR-Spektrum von Aldostatin; und

Fig. 6 ein ¹H-NMR-Spektrum von Aldostatin.

Als ein praktisches Beispiel für einen Mirkoorganismus, welcher sich für die Herstellung der physiologisch aktiven Substanz Aldostatin der vorliegenden Erfindung eignet, sei der M4109-Stamm von Pseudeurotium erwähnt, der von den Erfindern aus einer Bodenprobe eines Ackers in Kannami, Tagata-gun, Shizuoka, Japan, isoliert wurde. Seine mycologischen Eigenschaften sind wie folgt.

(A) Wachstum auf verschiedenen Kulturmedien

• (1) Czapek′s Agar:
  Bei 26°C ist das Wachstum ziemlich langsam. Der Mikroorganismus wächst bis zu einem Durchmesser von 16 bis 17 mm in 7 Tagen Kultivierung und bis 28 bis 29 mm in 14 Tagen Kultivierung. Der Rasen ist dünn, flach und samtartig. Es wachsen nur weiße Hyphen. Es bildet sich kein Ascocarp. Die Ränder sind glatt. Es tritt weder Exsudat noch diffusionsfähiges Pigment auf. Die Rückseite ist weiß bis gelblichweiß (1A2). Kein Wachstum bei 37°C.
• (2) Malzextrakt-Agar:
  Bei 26°C ist das Wachstum ziemlich langsam. Der Mikroorganismus wächst bis zu einem Durchmesser von 21 bis 22 mm in 7 Tagen Kultivierung und bis zu 30 bis 31 mm in 14 Tagen Kultivierung. Der Rasen ist dünn und flach, jedoch im zentralen Bereich geringfügig gequollen. Weiße Hyphen wachsen zu Beginn, jedoch bildet sich eine Anzahl von Ascocarps unter einem weißen Luftmycel, so daß die Farbe sich nach Hellgrau (1C1) bis Mittelgrau (1E1) ändert. Die Ränder sind glatt. Es tritt weder Exsudat noch diffusionsfähiges Pigment auf. Die Rückseite ist gelblichweiß (4A1) bis blaßgelb (4A2) in einem Bereich, der Hyphen trägt, und olivgrau (1E2) in einem anderen Bereich, in dem sich Ascocarps gebildet haben. Kein Wachstum bei 37°C.
• (3) Kartoffeldextrose-Agar:
  Bei 26°C ist das Wachstum ziemlich langsam. Der Mikroorganismus wächst bis zu einem Durchmesser von 19 bis 20 mm in 7 Tagen Kultivierung und bis zu 30 bis 31 mm in 14 Tagen Kultivierung. Der Rasen ist dünn und flach, jedoch im zentralen Bereich geringfügig gequollen. Weiße Hyphen wachsen zu Beginn, jedoch mit fortschreitender Kultivierung bildet sich eine Anzahl von Ascocarps unter weißem Luftmycel, so daß die Farbe sich zu Mittelgrau (1E1) ändert. Die Ränder sind glatt. Ein farbloses Exsudat wird in geringem Maße abgegeben, es tritt jedoch kein diffusionsfähiges Pigment auf. Die Rückseite ist olivgrau (1F2). Kein Wachstum bei 37°C.

Die Farbnamen und -bezeichnungen folgen dem von A. Kormerup und J.h.Wanscher in "Methuen Handbook of Color", 3. Auflage, Eyre Methuen, London, 1978, beschriebenen Verfahren.

(B) Verschiedene physiologische Eigenschaften:

Wachstum bei pH 3,2 bis 9,6
optimaler pH für das Wachstum: 3,5 bis 6,4
Wachstum bei einer Temperatur von 19 bis 30°C
optimale Wachstumstemperatur: 22 bis 26°C.

(C) Mikroskopische, morphologische Eigenschaften:

Bildung von geschlossenen Ascocarps. Die geschlossenen Ascocarps sind schwärzlichbraun, sphärisch, 80 bis 180 µm im Durchmesser und haben die Form nackter Asci. Die Ascocarpwände sind von einer etwas hautartigen Natur und dunkelbraun. Sie sind aus einer einzigen Schicht aufgebaut und enthalten keinerlei speziellen Naht- oder Verschlußmechanismus. Die die Ascocarpwände aufbauenden Zellen haben unregelmäßige polygonale Formen, deren Durchmesser im Bereich von 5 bis 15 µm liegen. Asci sind in den geschlossenen Ascocarps nach dem Zufallsprinzip verstreut und haben eiartige, perlartige oder ovale Formen, enthalten 8 Sporen und haben eine Größe von 8 bis 11 × 7 bis 9 µm. Die Ascosporen sind sphärisch und werden jeweils von einer einzigen Zelle gebildet. Ihre Wände sind dick und dunkelbraun. Durchmesser: 3 bis 4 µm. Es sind weder Keimporen noch -schlitze enthalten. Im Konidienstadium sehen sie aus wie Sporothrix. Kondien werden in Form des Sympodiosporen- Typs gebildet, und zwar an kleinen, zahnartigen Spitzen der kondidiumbildenden Zellen. Die Konidien sind farblos, werden jeweils von einer einzigen Zelle gebildet, haben eine Größe von 5 bis 7,5 × 2,5 bis 3,5 µm, haben entweder ovale Formen oder die Form eines umgedrehten (auf der Spizte stehenden) Eis und an ihren Basalabschnitten sind sie geringfügig dünner. Die Wände sind glatt. Konidiumbildende Zellen treten vertikal von Lufthyphen auf, sind 8 bis 40 × 3 bis 5 µm groß, nicht verzweigt, im zentralen Bereich geringfügig gequollen und zu ihren freien Enden hin abgeschrägt. Die konidiumbildenden Teile verlängern neu wachsende Punkte einen nach dem anderen.

Vorstehend wurden die mycologischen Eigenschaften des obigen Mikroorganismus beschrieben. Da das Wachstum des Mikroorganismus das ascigene Stadium einschließt (vollständiges Stadium), wird der obige Mikroorganismus als der Gattung Ascomycetes zugehörig betrachtet. Aufgrund solcher charakteristischen Eigenschaften, daß sich geschlossene Ascocarps bilden, die Ascocarps unregelmäßig verstreut vorliegen und Ascosporen aus einzelnen Zellen gebildet sind und keine Keimporen oder -schlitze enthalten, wird der obige Mikroorganismus unter die Ordnung der Eurotiales klassifiziert. Unter der Ordnung der Eurotiales gibt es etwa 50 Gattungen. Der obige Mikroorganismus wurde der Gattung Pseudeurotium zugeordnet aufgrund solcher charakteristischen Eigenschaften, daß seine geschlossenen Ascocarps dunkelbraun sind, aus polygonalen Zellen gebildet sind und keinen Nahtmechanismus aufweisen und die Ascosporen klein, braun und glatt sind und die konidialen Stufen Sporothrixartig sind. Bisher sind drei Species der Gattung Pseudeurotium bekannt, nämlich Pseudeurotium ovalis, Pseudoortium punktatum und Pseudeurotium zonatum. Wenn auch die Ascosporen von Pseudeurotium ovalis und Pseudeurotium punctatum ovale bis eiähnliche Formen haben, so enthält doch der vorliegende Mikroorganismus M4109 sphärische Ascosporen, welche für Pseudeurotium zonatum charakteristisch sind. Aufgrund eingehender Beobachtungen wurde der vorliegende Stamm M4109 identifiziert als ein Pseudeurotium zonatum und folglich als "Pseudeurotium zonatum M4109" bezeichnet. Dieser Mikroorganismus wurde unter der FRI-Hinterlegungsnummer FERM P-8614 bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, the Japanese Government, hinterlegt.

Bei Kultivierung eines derarigen Mikroorganismus von Pseudeurotium, welcher die physiologisch aktive Substanz Aldostatin erzeugt, kann man als eine Kohlenstoffquelle für ein Kulturmedium ein Material verwenden, welches der Mikroorganismus metabolisieren kann, wie Glucose, Stärke, Saccharose, Dextrin, Melassen, Glycerin, Öl oder Fett, eine organische Säure oder dergl. Als Stickstoffquelle kann man eine organische oder anorganische, stickstoffhaltige Verbindung, wie Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, CSL, Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Keime (germ), Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat, Ammoniumchlorid oder dergl., einsetzen. Darüber hinaus können anorganische Salze, wie NaCl, KCl, CaCO₃, MgSO₄, KH₂PO₄, Na₂HPO₄, FeSO₄, MnCl₂, CoCl₂, ZnSo₄ und CaSO₄, ebenfalls in zweckentsprechender Weise entweder einzeln oder in Kombination verwendet werden. Vitamine, wie Vitamin B₁ und Biotin, ein Entschäumungsmittel, wie Siliconöl, und/oder ein Surfaktans, wie Polyalkylenglykolether, können ebenfalls dem Kulturmedium je nach Bedarf zugesetzt werden. Darüber hinaus kann man eine oder mehrere organische und/oder anorganische Substanzen zusetzen, welche das Wachstum des Mikroorganismus fördern und die Produktion von Aldostatin stimulieren.

Für die Kultivierung des obigen Mikroorganismus kommen beliebige, herkömmliche Kultivierungsverfahren für Mikroorganismen in Betracht. Wenn man auch sowohl feste Kulturen als auch flüssige Kulturen verwenden kann, so ist doch die belüftete, gerührte Kultur bevorzugt. Eine zweckentsprechende Kultivierungstemperatur kann in einem beliebigen Temperaturbereich gewählt werden, in dem der Mikroorganismus wächst und Aldostatin erzeugt. Die Kultivierungstemperatur beträgt vorzugsweise 19 bis 30°C, insbesondere 22 bis 26°C. Die Kultivierung kann beendet werden nach Maßgabe des Zeitpunkts, zu dem das Aldostatin seine Maximalpotenz erreicht hat. Wenn auch die Anzahl der Tage, welche im aktuellen Fall für die Kultivierung erforderlich sind, in gewissem Maße variiert, abhängig von den Reaktionsbedingungen, so sind doch im allgemeinen 2 bis 7 Tage, insbesondere 3 bis 5 Tage, bevorzugt.

Die Sammlung der physiologisch aktiven Substanz Aldostatin aus einer auf die oben beschriebenen Weise erhaltenen Kulturbrühe erfolgt nach geeigneten Separationsverfahren, wie sie routinemäßig bei der Sammlung von Zwischenprodukten aus der Kulturbrühe von herkömmlichen Mikroorganismen angewandt werden. Beispielsweise werden die Zellen aus einer Kulturbrühe entweder durch Filtration oder durch Zentrifugieren entfernt, da Aldostatin die Eigenschaften von wasserlöslichen, sauren Substanzen zeigt und in erster Linie in dem Filtrat der Kulturbrühe enthalten ist. Das so erhaltene Filtrat der Kulturbrühe wird auf einem geeigneten Träger adsorbiert, gefolgt von einer selektiven Desorption der wirksamen Substanz mit einem geeigneten Lösungsmittel. Als geeignetes Trägermaterial für eine Chromatographie unter Anwendung der Desorption kommen Materialien in Frage, welche den Unterschied bei der Adsorptionsfähigkeit ausnutzen, wie Aktivkohle, Silikagel, Aluminiumoxid, Cellulosepulver oder ein synthetisches Adsorptionsharz, ein Material, welches die Unterschiede bei funktionellen Gruppen nutzt, wie ein Anionenaustauscherharz oder Anionenaustauschcellulose, oder ein Material, das auf Unterschiede beim Molekulargewicht abstellt, wie ein Molekularsieb-Trägermaterial. Diese Materialien können mit Vorteil verwendet werden. um die Zielverbindung "Aldostatin" aus einem derartigen Trägermaterial zu eluieren, kommen wasserhaltige, organische Lösungsmittel in Betracht, insbesondere wasserhaltiges Aceton, wasserhaltiges Methanol und wasserhaltiges Acetonitril, Säuren, Basen und Puffer, wäßrige Lösungen mit einem Gehalt an anorganischen oder organischen Salzen, usw. Diese können in geeigneter Kombination verwendet werden, wenn auch ihre Kombination von der Art und den Eigenschaften des Trägermaterials abhängig ist.

Der erfindungsgemäße Inhibitor, welcher durch die oben erwähnte Chromatographie in einer rohen Form erhalten wird, kann zum Zwecke einer weiteren Reinigung einer präparativen Hochleistungs-Füssigkeitschromatographie (HPLC) unterworfen werden. Dazu wird der pH des Filtrats auf etwa 4 eingestellt. Dann wird das Filrat durch eine Säule geleitet, welche mit einem synthetischen Adsorptionsharz als Trägermaterial gepackt ist, z. B. "Diaion HP-20" (Warenbezeichnung; Produkt der Mitsubishi chemical Industries, Ltd.), "amberlite XAD-II" (Warenbezeichnung; Rohm and Haas Company) oder dergl. Dabei wird der in dem Filtrat enthaltene, erfindungsgemäße Inhibitor adsorbiert. Der adsorbierte, erfindungsgemäße Inhibitor wird anschließend mit einem wasserhaltigen Alkohol oder mit wasserhaltigem Aceton eluiert. Fraktionen, welche den eluierten Inhibitor enthalten, werden konzentriert und dann auf Aluminiumoxid (Alumina) oder Silikagel adsorbiert. Danach kann mit eine Lösung von wäßrigem Ammonikak in Acetonitril oder mit einer wasserhaltigen Alkohollösung eluiert werden. Die so erhaltenen Eluatfraktionen werden zu Pulvern verarbeitet, und zwar durch Verfahrensstufen, wie Konzentrierung und Gefriertrocknung.

Falls die Reinheit des so erhaltenen Pulvers gering ist, kann eine HPLC mit Vorteil für eine weitere Reinigung angewendet werden. Als geeignetes Trägermaterial sei "Lichtroprep RP-18 Gel" (Warenbezeichnung; Merck & Co. Inc.) oder "YMC Gel ODS 30/60 (Warenbezeichnung; Yamamura Chemical Laboratories, Inc.) als Beispiel erwähnt. Als mobile Phase kann man ein Gemisch von Methanol oder Acetonitril und einer wäßrigen Lösung eines Salzes oder dergl. verwenden. Das auf die obige Weise erhaltene Aldostatin enthält im allgemeinen ein oder mehrere Salze, die zu seiner Reinigung eingesetzt wurden. Die Entsalzung wird vorteilhaft durchgeführt unter Anwendung eines Chromatographieverfahrens, bei dem ein synthetisches Adsorptionsmittel eingesetzt wird. Genauer gesagt wird eine wäßrige Aldostatinlösung mit einem Gehalt der Salze auf etwa pH 4,0 mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure eingestellt und dann wird eine Chromatographie auf "Diaion HP-20" durchgeführt. Nach dem Waschen des Trägermaterials mit Wasser werden aktive Fraktionen eluiert mit einem wasserhaltigen Alkohol. Nach Konzentration und Gefriertrocknung des Eluats erhält man Aldostatin in seiner freien Form.

Das so erhaltene Aldostatin der vorliegenden Erfindung besitzt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften. Aufgrund dieser Eigenschaften wird angenommen, daß es sich dabei um eine Verbindung handelt, die durch die folgende vermutete Strukturformel dargestellt wird:

Physiochemischen Eigenschaften:

• (1) Aussehen: weißes Pulver.
• (2) Unterscheidung der sauren, neutralen oder basischen Eigenschaften: saure Substanz.
• (3) Schmelzpunkt: 144 bis 146°C.
• (4) Elementaranalyse:
  C = 57,20 ± 2,0
  H =  4,70 ± 1,0
  N =  6,97 ± 1,5.
• (5) Gemessenes Molekulargewicht: (M + H)⁺ 417 (nach der FAB_mass-Methode).
• (6) Vermutete Molekularformel: C₂₀H₂₀N₂O₈.
• (7) Spezifische Drehung [a]:
  +59,0° ± 10° (c = 0,50, H₂).
• (8) UV-Absorptionsspektrum:
  • (1) wäßrige, neutrale Lösung:
    λ _max 285 ± 2 nm (E 135 ± 20) (Fig. 1)
    (2) wäßrige, saure Lösung:
    λ _max 285 ± 2 nm (E 135 ± 20) (Fig. 2)
    (3) wäßrige, alkalische Lösung:
    λ _max 230± 4 nm Sch, 257 + 4 nm Sch,316 ± 2 nm (E 195 ± 20) (Fig. 3).
• (9) IR-Absorptionsspektrum (KBr; cm^-1): 3300, 3030, 2920, 1720, 1650, 1495, 1410, 1370, 1335, 1220 (Fig. 4).
• (10) ¹³C-NMR-Spektrum (d₆-DMSO, 100 MHz, interner Standard DMSO=39,5 TpM; w TpM): 171,7 (s), 160,12 (d), 152,1 (s), 131,7 (d), 128,2 (d), 127,1 (s), 125,1 (s), 115,3 (d), 52,1 (d), 35,9 (t) (Fig. 5).
• (11) ¹H-NMR-Spektrum (d₆-DMSO, 400 MHz, interner Standard TMS; δ TpM): 8,02 (1H, s), 7,98 (1H, d), 7,05 (1H, s), 6,97 (1H, d), 6,80 (1H, d), 4,50(1H, q), 2,96 (2H, m) (Fig. 6).
• (12) Dünnschichtchromatographie (TLC): Fleckenfilm, "Silica Gel f" (Warenbezeichnugn; Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) LösungsmittelsystemRf-WertBuOH/AcoH/H₂O (4/1/1)0,63 CHCl₃/MeOH/H₂O (5/5/1)0,31 EtOAc/MeOH/H₂o(5/5/1)0,27 CHCl₃/MeOH/AcOH/H₂O (10/5/1/1)0,36 PrOH/H₂O (4/1)0,25
• (13) Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC):
  Träger: "Hitachi Gel Nr. 3056" (Warenbezeichnung; Hitachi Ltd.)
  mobile Phase: 8% Methanol mit 1% Ammoniumacetat 0,8 ml/min, Rt = 4,2(min).
• (14) Löslichkeit:
  löslich in Wasser, Methanol und Dimethylsulfoxid geringfügig löslich in Aceton, Ethylacetat und Chloroform unlöslich in Benzol, Hexan und Petrolether.
• (15) Farbreaktion:
  positiv: KMnO₄ und FeCl₃
  negativ: Ninhydrin, Molisch und Fehling.

Biologische Eigenschaften

• (1) Aldose-Reduktase-Inhibitoraktivität:
  Die Präparation einer Aldose-Reduktase und die quantitative Analyse seiner enzymatischen Aktivität wurden gemäß dem von Hayman et al. in "Journal of biological Chemistry" 240, 877 (1965), beschriebenen Verfahren durchgeführt. Es wurde eine teilweise gereinigt Aldose- Reduktase, die aus Rinderlinsen stammte, als Enzym eingesetzt. In eine Quarzzelle in einem Spektrophotometer wurden 2,4 ml einer 5 × 10^-5 M NADPH-Lösung, gelöst in 2/15 M Phosphatpuffer (pH 6,0), 0,4 ml einer 15 mE/ml Lösung des Enzyms und 0,1 ml eines wäßrigen Aldostatins mit unterschiedlicher Konzentration eingefüllt. Der Inhalt wird 4 min bei 37°C prä-inkubiert. Die Reaktion wird gestartet, indem man 0,1 ml 0,015 M D,L-Glyceraldehyd in die Quarzzelle gibt. Die Verringerung der Absorption bei 340 nm wird 4 min bei 37°C verfolgt. Zu diesem Zeitpunkt bestimmt man den Wert (B) von tan R. In ähnlicher Weise wird die Verringerung der Absorption bei 340 nm ohne Zugabe des Inhibitors Aldostatin verfolgt. Zu diesem Zeitpunkt wird der Wert (A) von tan R bestimmt. Die prozentuale Inhibierung (%) wird folgendermaßen berechnet:
• Die Menge an Inhibitor für 50%ige Inhibierung wird als IC₅₀-Wert ausgedrückt.
• Die auf die oben beschriebene Weise betimmte Aldose- Reduktase-Inhibitoraktivität von Aldostatin ist wie folgt. Substrat (Substratkonzentration)IC₅₀(µg/ml)Glyceraldehyd (5,0 × 10^-4M)0,5 Glucose (5,0 × 10^-2M)1,1.
• (2) Akute Toxizität:
  Aldostatin zeigt keinen Toxizitätseffekt, wenn es Mäusen in einer Dosis von 200 mg/kg i. v. verabreicht wird.
• Das erfindungsgemäße Aldostatin kann auch in seine Metallsalze bzw. sein Ammoniumsalz umgewandelt werden, sofern erforderlich. Die Metallsalze umfassen beispielsweise sein Natriumsalz, Kaliumalz, Lithiumsalz, Calciumsalz, usw.
• Ein Arzneimittel mit einem Gehalt an Aldostatin der vorliegenden Erfindung kann zu dosierbaren Präparationen formuliert werden, wie zu Mitteln für die Injektion, Nasentropfen, Suppositorien und dergl. Diese Präparationen seien zusätzlich zu den oral verabreichbaren Präparationen und Augentropfen genannt. Das Arzneimittel kann auf beliebige, an sich bekannte Weise hergestellt werden, wobei man Aldostatin oder ein Salz desselben zweckmäßigerweise in einer Menge von 100 µg bis 500 mg pro Verabreichung einverleibt.

• Im folgenden wird die Erfindung anhand eines Beispiels erläutert, ohne daß damit eine Beschränkung verbunden ist. Beispiel 1
• (i) Der Stamm Pseudeurotium zonatum M4109 (FRI-Hinterlegung FERM P-8614), der auf einer geneigten Kultur auf Nähragar gewachsen ist, wird zur Beimpfung eines 500 ml Erlenmeyerkolbens, enthaltend 100 ml einer sterilisierten Kulturmediums von 2% Glucose, 2%Stärke, 2% Sojabohnenmehl, 0,25% NaCl, 0,5% Hefeextrakt und 0,35% CaCO₃ (pH 6,5), verwendet. Das Ganze wird 3 Tage bei 26°C einer Schüttelkultivierung unterworfen. Die resultierende Kulturbrühe wird als Saatkultur verwendet.
• (ii) Zunächst werden 20 l eines Kulturmediums, enthaltend 2% Glucose, 1%Pepton, 1% CSL, 0,2% KH₂PO₄ und 0,1% MgSO₄ · 7H₂O (pH 6,5) 100 ml-weise in 500 ml Erlenmeyerkolben gegossen. Nach der Sterilisation des Kolbeninhalts bei 120°C während 20 min wird jeder Kolben mit 4 ml der Saatkultur beimpft. Anschließend wird 4 Tage eine Schüttelkultur bei 26°C durchgeführt.
• (iii) Die Kulturbrühe (20 l), die bei dem obigen Verfahren (ii) erhalten wurde, wird auf pH 4 eingestellt und dann filtriert. Man erhält 17 l eines Kulturbrühefiltrats. Eine Hauptmenge an Aldostatin ist in dem Filtrat enthalten. Das Kulturbrühefiltrat wird chromatographiert, und zwar auf "Diaion HP-20" (1,6 l). Nach Waschen der Säule mit 8 l Wasser werden aktive Fraktionen mit 50%igem wäßrigen Methanol eluiert. Die aktiven Eluate (4 l) werden unter verringertem Druck auf 1 l konzentriert. Nach Einstellen des pH-Wertes mit wäßrigem Ammoniak auf 6,5 wird die resultierende Lösung auf eine Säule von 500 ml Diaion HP-20 gegeben. nach Elution mit Wasser ist eine Hauptmenge der Aktivität sowohl in dem Eluat (1 l) als auch in den mit Wasser eluierten Fraktionen (1,3 l) enthalten.
• (iv) Unter verringertem Druck werden 2,3 l dieser aktiven Fraktionen auf etwa 20 ml konzentriert, gefolgt von einer Zugabe von 200 ml Methanol. Das resultierende Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt, so daß man einen Zentrifugenüberstand erhält. Der Überstand wird auf eine Aluminiumoxidsäule (200 ml) gegeben, die zuvor mit Methanol gefüllt wurde. Nach dem Waschen der Säule mit 1 l Methanol und 1 l Acetonitril wird die Säule mit einem 2/1 gemischten Lösungsmittel von Acetonitril und 1N wäßrigem Ammoniak entwickelt. Das Eluat wird fraktionsweise zu jeweils 18 g-Portionen aufgefangen. Die erfindungsgemäße aktive Substanz wird in den Fraktionen Nr. 61 bis 190 eluiert. Diese Fraktionen werden gesammelt und dann unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird auf eine Sephadex G-15-Säule (1650 ml) gegeben und dann mit Wasser entwickelt. Das Eluat wird fraktionsweise in Portionen von jeweils 15 g aufgefangen. Die aktive Substanz wird in den Fraktionen Nr. 65 bis 80 eluiert. Diese Fraktionen werden gesammelt und unter verringertem Druck konzentriert. Anschließend wird eine Gefriertrocknung durchgeführt, wobei man 350 mg eines weißen Pulvers erhält.
• (v) Das nach dem obigen Verfahren (iv) erhaltene, weiße Pulver wird einer präparativen HPLC auf einer Säule von "Lichroprep RP-18" (Warenbezeichnung, merck & co., Inc.) als Träger unterzogen, dessen Teilchengröße im Bereich von 25 bis 40 µm liegt. Die Säule wird dann eluiert und fraktioniert mit einer 3%igen wäßrigen Lösung von Methanol, welche 0,5% Ammoniumacetat enthält. Die resultierenden Fraktionen werden jeweils mittels Flüssigkeitschromatographie analysiert. Diejenigen Fraktionen, welche ein einziges Signal aufweisen, das für Aldostatin charakteristisch ist, werden gesammelt. Die so gesammelte, aktive Fraktion wird mit 0,5 N Chlorwasserstoffsäure auf pH 4,0 eingestellt. Anschließend wird die Fraktion durch eine Säule geleitet, die mit 50 ml Diaion HP-20 gepackt ist. Nach dem Waschen der Säule mit 250 ml Wasser wird die Säule mit 150 ml einer 50%igen wäßrigen Methanollösung eluiert. Das Eluat wird konzentriert und dann gefriergetrocknet. Man erhält 75 mg Aldostatin als weißer Pulver in seiner (salz)freien Form.

Claims (4)

1. Physiologisch aktive Substanz "Aldostatin" mit den folgenden Eigenschaften:

• (a) Unterscheidung von sauren, neutralen oder basischen Eigenschaften: saure Substanz;
  (b) Elementaranalyse:
  C = 57,20 ± 2,0
  H =  4,70 ± 1,0
  N =  6,97 - 1,5;
  (c) gemessenes Molekulargewicht: (M + H)⁺ 417 (mit der FAB_mass-Methode);
  (d) vermutete Molekülformel: C₂₀H₂₀N₂O₈;
  (e) UV-Absorptionsspektrum:
  • (1) wäßrige, neutrale Lösung:
    λ _max 285 ± 2 nm (E 135 ± 20) (Fig. 1)
    (2) wäßrige, saure Lösung:
    λ _max 285 ± 2 nm (E 135 ± 20) (Fig. 2)
    (3) wäßrige, alkalische Lösung:
    λ _max 230 ± 4 nm Sch, 257 ± 4 nm Sch,316 ± 2 nm (E 195 ± 20) (Fig. 3);
• (f) IR-Absorptionsspektrum (KBr; cm^-1): 3300, 3030, 2920, 1720, 1650, 1495, 1410, 1370, 1335, 1220 (Fig. 4);
  (g) ¹³C-NMR-Spektrum (d₆-DMSO, 100 MHz, interner Standard DMSO=39,5 Tpm; δ TpM): 171,7 (s), 160,1 (d), 152,1 (s), 131,7 (d), 128,2 (d), 127,1 (s), 125,1 (s), 115,3 (d), 52,1 (d), 35,9 (t) (Fig. 5);
  (h) Löslichkeit:
  löslich in Wasser, Methanol und Dimethylsulfoxid mäßig löslich in Aceton, Ethylacetat und Chloroform unlöslich in Benzol, Hexan und Petrolether;
  (i) Farbreaktion.
  positiv: KMnO₄ und FeCl₃
  negativ: Ninhydrin, Molisch und Fehling.

2. Verfahren zur Herstellung einer physiologisch aktiven, neuen Substanz "Aldostatin", dadurch gekennzeichnet, daß man einen Aldostatin erzeugenden Mikroorganismus von Pseudoeurotium in einem Kulturmedium kultiviert und anschließend Aldostatin aus der Kulturbrühe isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Aldostatin erzeugende Mikroorganismus der Pseudeurotium zonatum M4109-Stamm ist.

4. Verwendung der physiologisch aktiven Substanz "Aldostatin" gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Mittels für die Behandlung chronischer Komplikationen, welche durch Diabetes renalis verursacht werden.