DE68910213T2

DE68910213T2 - Antibiotikum R106.

Info

Publication number: DE68910213T2
Application number: DE89307315T
Authority: DE
Inventors: Fumiyo Haruna; Katsushige Ikai; Teruya Nakamura; Kazuo Shimanaka; Kazutoh Takesako; Katsuhisa Uchida; Hideyo Yamaguchi; Junko Yamamoto
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1988-07-19
Filing date: 1989-07-19
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2009-07-20
Also published as: US5158876A; DE68910213D1; MX9203153A; EP0352092A2; US5057493A; EP0352092A3; AR241941A1; KR960014103B1; KR910002901A; EP0352092B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue, als Medikamente zur Therapie von Pilzinfektionen brauchbare Antibiotika mit der Bezeichnung R106, sowie Verfahren zur ihrer Herstellung und ihre Verwendung.
Als Stoffe mit therapeutischer Wirkung hei Pilzinfektionen (antimykotisch wirksame Pharmaka) sind derzeit etwa zwanzig Antibiotika bekannt, darunter Amphotericin B, Nystatin, Trichomycin, Griseofulvin, Pyrrolnitrin, Clotrimazol, Miconazolnitrat usw.. Fraglich sind jedoch Wirksamkeit und Toxizität dieser Antibiotika.
Bei der Suche nach neuen Antibiotika wurde eine Anzahl von Mikroorganismen von pflanzlichen Blattoberflächen und aus dem Boden isoliert, von diesen Mikroorganismen produzierte Antibiotika wurden gereinigt und ihre biologischen Eigenschaften untersucht. Als Ergebnis wurde gefunden, daß durch Fermentation von Mikroorganismen, die zur Gattung Aureobasidium gehören, eine Reihe von Antibiotika hergestellt werben können, die antimikrobielle Wirkung gegen pathogene Pilze wie Candida albicans, Cryptococcus neoformans usw. zeigen.
Die Prüfung der physiko-chemischen Eigenschaften dieser aus Kulturbrühe isolierten Antibiotika hat bestätigt, daß es sich dabei um neuartige, in der Literatur bisher nicht vorhandene Verbindungen handelt, für welche die Bezeichnung R106 gewählt wurde.
Die vorliegende Erfindung liefert antibiotisch wirksame Stoffe des Typs R106 (R106-Antibiotika) mit der folgenden Strukturformel:
worin bedeuten:
R Methyl oder Ethyl;
X&sub1; MePhe, β-HOMePhe oder Phe;
X&sub2; allo-Ile, Val oder Leu;
X&sub3; MeVal oder Val;
X&sub4; β-HOMeVal, g-HOMeVal, MeVal, Val, N,β-MeAsp, β-HOMePhe, MePhe, MeDH2,3Val oder MeDH3,4Val
Die Bedeutung der oben verwendeten Abkürzungen für die Aminosäuren ist in der Tabelle 9 weiter unten erläutert.
Mikroorganismen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind solche der Gattung Aureobasidium, die zur Bildung von R106-Antibiotika nach der Formel (I) fähig sind. Eine neue Art, die zur Herstellung von R106- Antibiotika verwendet werden kann, ist Aureobasidium pullulans Nr. R106. Ein Beispiel dieser Art ist der Musterstamm (im Folgenden als Stamm oder Musterstamm Nr. R106 bezeichnet), welcher aus einer in Kamitushima-cho, Kamiagata-gun, Nagasaki-ken, Japan, gesammelten Bodenprobe isoliert und ans 8. Juli 1988 unter der Registrier-Nummer FERM BP-1938 hinterlegt wurde. Die neue Art schließt den hinterlegten Musterstamm Nr. R106, Derivate, natürliche und künstliche erzeugte Mutanten davon, sowie andere Stämme ein die R106-Antibiotika produzieren und die nachfolgend beschriebenen kennzeichnenden Eigenschaften des Musterstamms Nr. R106 teilen. Organismen der Gattung Aureobasidium, die zur Produktion der R106-Antibiotika der vorliegenden Erfindung fähig sind, können im Verfahren gemäß dieser Erfindung verwendet werden.
Der Musterstamm Nr. R106 hat die folgenden mykologischen Charakteristika:

I. Wachstum auf verschiedenen Nährmedien:

Die folgende Tabelle zeigt die Kultureigenschaften von Musterstamm Nr. R106 auf verschiedenen Agar-Nährmedien nach Inkubation bei 25ºC über vier, sieben und vierzehn Tage.
Musterstamm Nr. R106 zeigt gutes Wachstum auf Kartoffeldextrose-Agar-, Czapek-Agar- und Malzextrakt-Agar-Medien. Die von dem Stamm gebildeten Kolonien sind normalerweise mukoid, teigig oder selten auch samtig und werden mit der Zeit ledrig. Die Kolonien sind von weiß bis cremefarben oder hellrosa und ändern mit der Zeit ihre Farbe nach olivgrün bis hellbraun oder braun und werden gelegentlich schließlich schwarz unter Bildung eines dunkelbraunen, unlöslichen Pigments. Um die Kolonier werden häufig Rhizoidartige Strukturen ausgebildet. Hyphen wachsen auf einen Durchmesser von 2 bis 15 um in das Agarmedium aus, ohne daß Luftmyzelien gebildet werden. Blastische Conidien in der Größe von 1-5 x 2-10 um werden oft interkaliert oder terminal auf den Hyphen die Fingerspitzen gebildet und bilden manchmal kugelige Haufen. Vegetative Zellen in frühen Wachstumsstadien sind hefeartig und von ellipsoider oder zitronenartiger Form mit einer Größe von 3-5 x 8-15 um, und sie vermehren sich durch polyblastische Knospung. Der Stamm bildet Arthrosporen mit einer Größe von 4-10 x 8-20 um und Chlamydosporen mit einer Größe von 5-25 x 10-25 um. Es werden keine Ascosporen beobachtet. Kulturmedium Farbe der Kolonien nach 4 - 7- 14 tägiger Kultivierung Wachstumscharakteristike Malzextrakt-Agar Kartoffeldextrose-Agar Czapek-Agar Sabouraud-Agar Hafermehl-Agar YpSs-Agar cremefarben-olivgrün-hellbraun cremefarben-braun-schwarz cremefarben-olivgrün-dunkelgrün cremegrau-hellbraun-dunkelbraun cremefarben-hellolivgrün-olivgrün gutes Wachstum; Ausbildung von Chlamydosporen; gutes Wachstum; zahlreiche blastische Conidien, die kugelige Haufen bilden; gutes Wachstum; zahlreiche, häufig dickwandige Hyphen; gutes Wachstum; Chlamydosporen werden beobachtet; maßiges Wachstum; zahlreiche Hyphen gutes Wachstum; dünne Hyphen; zahlreiche, blastische Conidien, die kugelige Haufen bilden

2. Physiologische Eigenschaften:

1. Temperaturbereich, in dem Wachstum möglich ist:
Temperatur, bei der Wachstum möglich ist: 12.5 bis 29.0ºC
optimale Wachstumstemperatur: : 23.0 bis 20.0ºC
2. Vitaminbedarf:
Wachstum in vitaminfreiem Medium: gutes Wachstum
3. Pigmentbildung:
unlösliches, dunkelbraunes Pigment wird gebildet.
Aufgrund der oben beschriebenen mykologischen Charakteristika wird der Musterstamm Nr. R106 der Gattung Aureobasidium zugerechnet. Nach den in der Literatur, so bei W.B. Cooke: Mycopathologia et Mycologia Applirata, 17, 1- 43 (1962), bei J.A. von Arx: The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture, J. Cramer, Lehre (1970), bei G.S. de Hoog und E.J. Hermanides- Hijhoff: Studies in Mycology, Nr. 15, S. 141-166, CBS, Baarn (1977) und anderen aufgeführten, bekannten Angehörigen der Gattung Aureobasidium wurde der Musterstamm Nr. R106 A. pullulans zugerechnet, mit der Ausnahme, daß bekannte A. pullulans kein R106-Antibiotikum produzieren. Die neue Art wurde demgemäß mit Aureobasidium pullulans Nr. R106 bezeichnet, und der Musterstamm wurde am 8.7.1988 unter der Registrier-Nummer FEPM BP-1338 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt
Die erfindungsgemäßen R106-Antibiotika können durch Inokulieren und Kultur der neuen Art in einem Nährmedium hergestellt werden.
Bei der Kultur der R106-produzierenden Organismen können als Kohlenstoffquellen beispielsweise Glukose, Fruktose, Saccharose, Stärke, Dextrin, Glyzerin, Molasse, dicker Malzsirup, Öle urd Fette, organische Säuren usw., als Stickstoffquellen organische oder anorganische Stickstoffverbindungen wie Soyamehl, Baumwollsamenmehl, Maismaische, Kasein, Pepton, Kasaminosäurer, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Gärrückstand, Harnstoff, Aminosäuren, Ammoniumsalze usw., als Salze anorganische Salze wie Natriumsalze, Kaliumsalze, Calziumsalze, Magnesiumsalze, Phosphate usw. einzeln oder in geeigneter Kombination verwendet werden. Falls nötig und gewünscht können Schwermetallsalze, z.B. Eisensalze, Kupfersalze, Zinksalze, Cobaltsalze usw., Vitamine wie Biotin, Vitamin B&sub1; usw., sowie andere organische oder anorganische Verbindungen zugesetzt werden, die geeignet sind, das Wachstum der produzierenden Organismen zu fördern und die Bildung von R106 zu beschleunigen. Außerdem können dem Medium auch entschäumende oder oberflächenaktive Stoffe wie Silikonöl, Polyalkylenglykolether und dergleichen zugesetzt weiden.
Für die Herstellung von Antibiotika durch Fermentation von Mikroorganismen gebräuchliche Techniken können für die Kultur eingesetzt werden, wobei Flüssigkulturtechniken, speziell Schüttel- oder Tankfermentation unter Belüftung und Rühren, am besten geeignet sind. Darüberhinaus kann durch geeigneten Zusatz von Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Spurenelementen und dergleichen im Verlauf der Inkubation die Menge der produzierten R106-Antibiotika erhöht werden. Die für die Kultur bevorzugte Temperatur beträgt 15 bis 30ºC, der pH-Wert liegt vorzugsweise bei 2 bis 8, die Dauer der Fermentation kann je nach Kulturbedingungen variieren, beträgt im allgemeinen jedoch 1 bis 14 Tage.
Das auf diese Weise in der Fermentationsbrühe sich ansammelnde R106 kann daraus unter Ausnutzung der physiko-chemischen Eigenschaften der Antibiotika isoliert werden.
R106-Antibiotika sind in der Fermenterbrühe und im Myzelkuchen enthalten und können daher durch Extrahieren der gesamten Fernenterbrühe mit einem hydrophoben organischen Lösungsmittel, z.B. einem organischen Lösungsmitte wie Ethylazetat, Butylazetat, Chloroform, Butanol, Methylisobutylketon und dergleichen gewonnen werden. Darüberhinaus können die R106-Antibiotika auch nach Auftrennen des Fermenteransatzes durch Filtration oder Zentrifugation in Kulturfiltrat und Myzelkuchen gewonnen werden. Zur Isolierung von R106 aus dem Kulturfiltrat wird dieses mit den vorgenannten hydrophoben organischen Lösungsmitteln extrahiert. Alternativ hierzu kann das Kulturfiltrat zur Adsorption von R106 aus dem Filtrat in Kontakt mit einem geeigneten trägerförmigen Adsorbens gebracht und danach mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert werden. Hierfür können trägerförmige Adsorbentien wie Aktivkohle, Zellulosepulver, adsorbierende Kunstharze und dergleichen verwendet werden, die Stoffe nach ihren verschiedenen Adsorptionseigenschaften auftrennen. Zur Elution von R106-Antibiotika daraus können wäßrige, hydrophile organische Lösungsmittel, z.B. wäßriges Azeton, wäßriger Alkohol und dergleichen in geeigneter Kombination verwendet werden, obwohl die Kombination je nach Art und Eigenschaft des Harzes variiert. R106-Antibiotika können aus Myzelkuchen durch Extrahieren mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel wie Azeton oder dergleichen gewonnen werden.
Auf diese Weise gewonnene, rohe R106-Antibiotika können durch Verfahren, wie sie für lipophile Antibiotika gebräuchlich sind, weiter gereinigt werden, z.B. durch Säulenchromatographie mit Säulenmaterialien wie Silikagel, aktivierter Tonerde, Aktivkohle oder adsorbierfähigen Kunstharzen.
Bei der Säulenchromatographie mit Silikagel können R106-Antibiotika mit Chloroform, Ethylazetat, Methanol, Azeton, Wasser und dergleichen allein oder in geeigneter Kombination eluiert werden.
Zur Isolierung und Reinigung kann auch die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) eingesetzt werden. Zu den hierbei verwendbaren Trägern gehören beispielsweise Silikagel, Silikagel mit chemisch gebundenen Gruppen wie Oktadecyl-, Oktyl- oder Aminogruppen, oder poröses Polymergel vom Polystyroltyp und dergleichen.
Als mobile Phase kann ein Lösungsmittelgemisch aus Hexan, Isopropylalkohol und Chloroform und dergleichen, wäßriges Methanol oder wäßriges Azetonitril und dergleichen eingesetzt werden.
Die Gegenstromchromatographie, eine Reinigungsmethode auf der Grundlage von Unterschieden in der Verteilung von Stoffen zwischen zwei flüssigen Phasen kann ebenfalls eingesetzt werden. Als Verteilungslösungsmittelsystem kann ein Lösungsmittelgemisch Hexan-Ethylazetat-Azetonitril, Chloroform- Methanol-Wasser oder dergleichen verwendet werden.
Die physiko-chemischen und biologischen Eigenschaften der neuen R106- Antibiotika werden nachfolgend erklärt. Dabei wird Bezug genommen auf die beiliegenden Anbildungen:
Abbildung 1: ist eine Kurve, die das UV-Absorptionsspektrum der Verbindung 1 zeigt;
Abbildung 2: ist eine Kurve, die das IR-Absorptionsspektrum derselben Verbindung zeigt.
Die Strukturen der gemäß der vorliegenden Erfindung gewonnenen R106- Antibiotika sind in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Verbindung Nr.
Die für die Aminosäurereste in der Tabelle 1 verwendeten Ankürzungen werder in der nachfolgenden Tabelle 9 erläutert.
Die Verbindung 1 besitzt die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften:
1. Summenformel: C&sub6;&sub0;H&sub9;&sub2;N&sub8;O&sub1;&sub1;
2. Elementaranalyse:
gefunden: C 65.0%, H 8.5%, N 9.9%
berechnet: C 65.45%, H 8.36% N 10.18%
3. Schmelzpunkt 138 - 140ºC
4. spez. opt. Drehung: [a]20D -254.3 (C 1.0, Methanol)
5. Molekulargewicht: FAB-MS m/z 1101 (M+H) ; 1123 (M+Na)
6. UV-Absorptionsspektrum (in Methanol) : siehe Abbildung 1
7. IR-Absorptionsspektrum (KBr-Methode) : siehe Abbildung 2
8. Aminosäureanalyse:
Nachweis von Prolin, allo-Isoleucin, Leucin und Phenylalanin (Apparatur: JCL-300, hergestellt durch JEOL Co., Ltd., Nachweis durch Ninhydrinreaktion)
9. Farbreaktionen:
positiv in 50% Schwefelsäure und Kaliumpermanganat;
negativ in Ninhydrin und Eisen(II)chlorid;
10. Löslichkeit:
löslich in Chloroform, Methanol, Ethanol, N,N-Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid; gering löslich in Wasser;
11. Säure-Basen-Eigenschaften: neutraler Stoff
12. Farbe: weiß
Die physiko-chemischen Eigenschaften der Verbindungen 2 bis 18 sind in der Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Verb. Nr. Elementaranalyse Molekulargewicht Summenformel spez. opt. Drehung [a]D20 IR-Absorption (KBr) cm&supmin;¹ Aminosäreanalyse C1.0, Methanol Prolin. allo-Isoleucin Leucin. Phenylalanin Proin. Valin. Leucin. Phenylalanin Prolin. Valin. allo-Isoleucin Prolin. Leucin. Phenylalanin Prolin. allo-Isoleucin. Leucin * Nachweis durch Ninhydrinreaktion, JCL-300, JEOL Co., Ltd.

2 Biologische Eigenschaften:

Die R106-Antibiotika der vorliegenden Erfindung sind gegen verschiedene Pilze, einschließlich pathogener Pilze, wirksam. Die minimale Hemmkonzentration (MHK) jedes der Antibiotika gegen verschiedene Pilze wurde durch Agarverdünnung unter Verwendung von Casitone-Agarmedium (2.0% Glukose, 0.9% Bacto-Casitone, 1.0% Hefeextrakt, 0.1% KH&sub2;PO&sub4;, 0.1% Na&sub2;HPO&sub4;, 1.0% Natriumcitrat, 2.0% Agar; alle Konzentrationsangaben in Gew./Vol.) ermittelt. Die für die Verbinnung 1 ermittelten Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4, diejenigen für die Verbindungen 2 bis 18 in der Tabelle 5 zusammengestellt. Tabelle 3 Stamm TIMM-Nr. Minimale Hemmkonzentration (MHK) (ug/ml) Candida albicans Candida albicans var. stellatoidia Candida tropicalis Candida kefyr Candida parapsilosis Candida crusei Candida guilliermondii Candida glabrata Cryptococcus neoformans Cryptccoccus laurentii Crvptccoccus terreus Rhodotorula rubra
Die minimale Henmkonzentration wurde jeweils nach Kultur bei 27ºC über vier Tage bestimmt. Tabelle 4 Stamm TIMM-Nr. Minimale Hemmkonzentration (MHK) (ug/ml) Aspergillus clavatus Aspergillus flavus Aspergillus nidulans Aspergillus niger Aspergillus terreus Aspergillus citrinum Aspergillus commune Aspergillus crustorum Trichophyton mentagrophytes Trichophytum rubrum Microsporum canis Epidermophyton floccosum Fonsecaea pedrosoi Phialophora verrucosa Exophiala werneckii Cladosporium bantianum Cladosporium carrionii Sporothrix schenckii Histoplasma capsulatum Paracoccidioides brasiliensis Geotrichum candidum Trichosporon cutanum Blastomyces dermatidis
Die minimale Hemmkonzentration wurde jeweils nach Kultur bei 27ºC über sieben Tage bestimmt. Tabelle 5 Stamm TIMM-Nr Verbindung Nr Candida albicans Candida kefyr Candida glabrata Cryptococcus neoformans Tabelle 5 (Fortsetzung) Stamm TIMM-Nr. Verbindung Nr. Candida albicans Candida kefyr Candida glabrata Cryptococcus neoformans
Im systemischen Candidiasis-Modell bei Mäusen, die durch i.v. Injektion vor Candida albicans präpariert wurden, weisen R106-Antibiotika eine potente therapeutische Wirksamkeit auf Candida albicans TIMM 1768 wurde in Sabouraud-Dextroseboullion bei 37ºC über Nacht gezüchtet, die Zellen wurder geerntet und in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Eine Zellsuspension mit 1 x 10&sup6; Zeiten wurde Mäusen vom Stamm ICR (5 Wochen alt, weiblich) i.v. injiziert. Nach 3 Stunden wurde eine Lösung eines R106- Antibiotikums in Tween 80/Ethanol/physiologischer Kochsalzlösung (1:9:90, Vol./Vol.) s.c., i.v. oder p.o in verschiedenen Konzentrationen verabreicht. Die Verabreichung erfolgte einmal täglich über vier Tage.
Zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit wurde 30 Tage nach der Infektion die Sterblichkeit ermittelt. Die für die Verbindung 1 erhaltener Ergebnisse sind in der Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Verabreichung Dosis (mg/kg) mittl. Überleben (Tag) Anzahl überlebende Tiere/Anzahl getestete Tiere Kontrolle Der Wert T/C beschreibt das mittlere Überleben in Tagen in der Gruppe der behandelten (T) Tieie bezogen auf das mittlere Überleben in Tagen in der unbehandelten Kontrollgruppe (C) in %.
Alle R106-Antibiotika zeigen eine geringe Toxizität. Die 50% Letaldosis (LD&sub5;&sub0;) für typische erfindungsgemäße Verbindungen nach Verabreichnung i.v., i.p. und p.o. an Mäuse ist in der Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 Verbindung Nr. LD&sub5;&sub0; (mg/kg)
Aus den vorgenannten biologischen Eigenschaften ist ersichtlich, daß die R106-Antibiotika als therapeutisch wirksame Substanzen für verschiedene Pilzinfektionen wie Candidiasis, Histoplasmose, Blastomykose und dergleichen brauchbar sind.
Bei der medikamentösen Anwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen könne diese an Tiere einschließlich Menschen als solche oder als pharmazeutische Zubereitungen verabreicht werden, die z.B. 0.1 bis 99.5%, vorzugsweise 0.5 bis 90% des Medikamentes in einem pharmazeutisch verträglichen, ungiftigen inerten Trager enthalten.
Als Träger können feste, halbfeste oder flüssige Diluentien, Füllstoffe und ein oder mehrere andere galenische Hilfsstoffe verwendet werden. Die pharmazeutische Zubereitung wird vorzugsweise in Form einer Einzeldosis verabreicht. Pharmazeutische Zubereitungen gemäß dei vorliegenden Erfindung können oral, in das Gewebe, topisch (percutan) oder rektal verabreicht werden, wobei die Zubereitungen zur Gabe per os und per injectionem bevorzugt werden.
Die Dosis der antimykotischen Substanz kann variiert werden, wobei die Gegebenheiten von Seiten des Patienten wie Alter, Gewicht usw., Art der Verabreichung, Zustand und Ausmaß der Erkrankung und dergleichen berücksichtigt werden müssen. Im allgemeinen wird die erfindungsgemäße Verbindung, berechnet als wirksamer Bestandteil, geeigneterweise in einem Bereich von 10 bis 2000 ug pro Tag verabreicht, jedoch kann den Erfordernissen entsprechend auch eine geringere oder höhere Dosis gegeben werden. Ist die Gabe einer hoLen Gesamttagesdosis erforderlich, so kann diese auf mehrere Einzeldosen über den Tag verteilt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Eine Platinöse mit einer Schräg-Kultur des Musterstamms Nr. R106 (hinterlegt unter der Registrier-Nummer FEPM-BP-1938 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology) wurde in 100 ml Flüssigmedium (0.67% (Gew./Vol.) Difco Hefe/Stickstoff-Basis, 2% (Gew./Vol.) Glukose) in einem 500 ml Erlenmeyerkolben inokuliert und zur Herstellung einer Impfkultur zwei Tage bei 27ºC geschüttelt. Die Impfkultuin einem Volumen von 1400 ml wurde in einen 200 l Fermenter überführt, der 140 l des oben genannten Flüssigmediums enthielt, und danach über 63 Stunden bei 25ºC unter Belüftung (100 l/Min.) und Rühren (150 Upm) kultiviert. Die Fermenterbrühe wurde zentrifugiert, um Überstand und Myzelkuchen voneinander zu trennen. Der Myzelkuchen wurde mit 8 l Azeton versetzt. Nach gründlichem Mischen erhielt man einen Azetonextrakt des Myzelkuchens. Dieser Azetonextrakt wurde unter vermindertem Druck auf 81.5 g Rückstand konzentriert. Dem Rückstand wurde Methanol zugesetzt, um einen aktiven Extrakt zu erhalten. Der Methanolextrakt wurde unter vermindertem Druck auf 65.4 g Rückstand eingeengt, der auf eine Silikagelsäule (Merck) (9 cm x 35 cm) aufgetragen wurde. Die Säule wurde mit 7 l Chloroform/Methanol (49:1) eluiert und man erhielt auf diese Weise eine aktive Fraktion, die unter vermindertem Druck auf 10.6 g Rückstand eingeengt wurde. Der erhaltene Rückstand wurde einer präparativen HPLC (Säule: PrepPak-500/C&sub1;&sub8; (5.7 cm x 30 cm), Waters; mobile Phase: 70% (Vol./Vol.) Azetonitril/Wasser) unterzogen und ergab eine aktive Fraktion, die unter vermindertem Druck auf 1.5 g R106-Rohprodukt eingeengt wurde. Das Rohprodukt, 475 g, wurde erneut einer präparativen HPLC (Säule: Capcell Pak-500/C&sub1;&sub8; (1 cm x 25 cm), Shiseido Co., Ltd.; mobile Phase: 70% (Vol./Vol.) Azetonitril/Wasser) unterzogen, um die aktive Fraktion mit dem größten Peak zu erhalten. Diese Fraktion wurde unter vermindertem Druck eingeengt und ergab 370 mg der Verbindung 1 als weißes Pulver. Die Aktivität wurde durch Bestimmung der antimykotischen Wirksamkeit gegen Candida albicans TIMM 0136 nach der Papierplättchen-Diffusionsmethode auf einer Casitone-Agarplatte bestimmt. Der in der HPLC auftretende Peak wurde durch Messung der UV-Absorption bei 230 nm ermittelt.

Beispiel 2

Eine auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben zubereitete Impfkultur, 1000 ml, von Musterstamm Nr. R106 wurde in 100 l Flüssigmedium (2% Glukose, 0.5% Ammoniumsullat, 0.15% KH&sub2;PO&sub4;, 0.05% MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0.01% CaCl&sub2;, 0.01% NaCl (alle Konzentrationsangaben in Gew.7Vol.) 0.5 ug/ml FeCl&sub2;, 0.5 ug/ml ZnSO&sub4;) in einem 200 l Fermenter inokuliert, danach wurde über 72 Stunden bei 25ºC untei Belüftung (100 l/Min.) und Rühren (100 Upm) fermentiert. Der Kultur wurder 20 l Flüssigmedium (10% Glukose, 2.5% Ammoniumsulfat, 5% Polypepton, 0.75% KH&sub2;PO&sub4;, 0.25% MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,05% CaCl&sub2;, 0.05% NaCl (alle Konzentrationsangaben in Gew./Vol.; 2.5 ug/ml FeCl&sub2;, 2.5 ug/ml ZnSO&sub4;) zugesetzt und die Fermentation wurde bei 25ºC über 65 Stunden mit Belüftung (120 l/Minute) und Rühren (100 Upm) fortgesetzt.
Die so erhaltene Fermenterbrühe wurde zur Trennung von Überstand und Myzelkuchen zentrifugiert. Dem erhaltenen Myzelkuchen wurden zur Extraktion von R106 10 l Ethanol zugesetzt. Der Ethanolextrakt wurde unter vermindertem Druck zur Entfernung von Ethanol konzentriert und der Rückstand zweimal mit einem Liter Ethylazetat extrakiert. Der Ethylazetatextrakt wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und der Rückstand dann in Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wurde auf eine 1.5 Liter-Silikagelsäule aufgetragen, die mit Hexan vorgesättigt war. Nach Waschen mit 3 l Hexan wuide die Säule entwickelt und mit 6 l Hexan/Isopropanol (7:3) eluiert. Die aktive Fraktion wurde unter vermindertem Druck eingeengt und ergab 15 g Rückstand. Dieser wurde in 100 ml Azetonitril gelöst und die Lösung wurde in 30 Teile portioniert und einer präparativen HPLC (Säule: Soken Pak/C&sub1;&sub8; (5 cm x 50 cm) Soken Chemica Co., Ltd.; mobile Phase: 70% (Vol./Vol.) Azetonitril/Wasser) unterzogen. Die 18 aktiven, mit den in dei Tabelle 8 gezeigten Retentionszeiten eluierenden Fraktionen wurden jeweils gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt und ergaben die in der Tabelle 8 gezeigten Verbindungen 1 bis 18 als weißes Pulver in der jeweils angegebenen Menge. Die Bestimmung der Aktivität und die HPLC-Peakdetektion erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Tabelle 8 Verbindung Nr. Retentionszeit (Min.) Ausbeute (mg) Tabelle 9 Val: Valin MeVal: N-Methylvalin β-HOMeVal: β-Hydroxy-N-methylvalin γ-HOMeVal: γ-Hydroxy-N-methylvalin MeDH2,3Val: N-Methyl-2,3-didehydrovalin MeDH3,4Val: N-Methyl-3,4-didehydrovalin Phe: Phenylalanin MePhe: N-Methylphenylalanin β-HOMePhe: β-Hydroxy-N-methylphenylalanin allo-Ile: allo-Isoleucin Leu: Leucin Pro: Prolin N,β-MeAsp: N,β-Dimethylasparaginsäure
Die R106-Antibiotika der vorliegenden Erfindung sind neue, von Mikroorganismen der Gattung Aureobasidium produzierte Antibiotika mit geringer Toxizität und hoher antimykotischer Wirksamkeit gegen pathogene Pilze wie Candida albicans, Cryptococcus neoformans und dergleichen. Diese Antibiotika sind daher als Medikamente zum klinischen Einsatz z.B. zur Therapie von Pilzinfektionen brauchbar.

Claims

1. Ein Antibiotikum R106 der allgemeinen Formel I

worin:

MeVal = N-Methylvalin;

Phe = Phenylalanin;

Pro = Prolin;

Leu = Leucin;

R = Methyl oder Ethyl;

X&sub1; = N-Methylphenylalanin, β-Hydroxy-N-methylphenylalanin oder Phenylalanin;

X&sub2; = Alloisoleucin, Valin oder Leucin;

X&sub3; = N-Methylvalin oder Valin; und

X&sub4; = β-Hydroxy-N-methylvalin, α-Hydroxy-N- methylvalin, N-Methylvalin, Valin, N,β-Dimethylasparaginsaure, β-Hydroxy-N- methylphenylalanin, β-Methylphenylalanin, N-Methyl-2,3-didehydrovalin oder N-Methyl-3,4-didehydrovalin sind.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums R106 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen das Antibiotikum R106 produzierenden Mikroorganismus der Genus Aureobasidium züchtet und dieses Antibiotikum aus der Fermentationsbrühe gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus einer der Spezies Aureobasidium pullulans Nr. R106 ist, wie er durch das Beispiel des Typenstammes gezeigt wird, der unter der Hinterlegungsnr. FERM BP-1938 hinterlegt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus derjenige ist, der unter der Hinterlegungsnr. FERM BP-1938 hinterlegt ist oder eine Ableitung oder eine Mutante davon.

5. Mikroorganismen der Spezies Aureobasidium pullulans Nr. R106, gezeigt durch das Beispiel des Stamms der unter der Hinterlegungsnr. FERM BP-1938 hinterlegt ist.

6. Mikroorganismen des Typenstammes der unter der Hinterlegungsnr. FERM BP-1938 hinterlegt ist und das Antibiotikum R106 erzeugende Ableitungen und Mutanten davon.

7. Mikroorganismen der Genus Aureobasidium, die zur Erzeugung des Antibiotikums R106 nach Anspruch 1 befähigt sind.