DE69718141T2

DE69718141T2 - Fungizid

Info

Publication number: DE69718141T2
Application number: DE69718141T
Authority: DE
Inventors: F. Bills; Angeles Cabello; Teresa Diez; A. Giacobbe; S. Horn; M. Liesch; Isabella Martin; S. Meinz; A. Morris; C. Onishi; Fernando Pelaez; E. Schwartz; Francisca Vicente; L. Zink
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1996-01-31
Filing date: 1997-01-27
Publication date: 2003-08-21
Anticipated expiration: 2017-01-28
Also published as: WO1997027860A1; CA2244142C; DE69718141D1; AU2252997A; EP0877618B1; EP0877618A4; AU703925B2; ES2188899T3; JP2000504563A; ATE230268T1; EP0877618A1; CA2244142A1; JP3834062B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue antifungale Verbindung, Zusammensetzungen, die diese Verbindung enthalten, und Anwendungsverfahren. Die Verbindung und die Zusammensetzungen weisen ein breites Spektrum an antifungaler Wirkung gegen fungale Krankheitserreger des Menschen auf.
Die klinische Behandlung von Pilzinfektionen des Menschen stützte sich hauptsächlich auf zwei Arten von antifungalen Mitteln. Diese Mittel sind Amphotericin B (siehe das US-Patent Nr. 2 908 611 und I. M. Asher et al. in Analytical Profiles of Drug Substances, Band 6, K. Florey, Hrsg., Academic Press, New York 1977, Seiten 1- 42), Flucytosin (siehe die US-Patente Nr. 2 802 005, 2 945 038, 3 040 026 und 3 368 938 und E. H. Waysek et al. in Analytical Profiles of Drug Substances, Band 5, K. Florey, Hrsg., Academic Press, New York 1976, Seiten 115-138) und Nystatin (US-Patent Nr. 3 517 100 und G. W. Michel in Analytical Profiles of Drug Substances, Band 6, K. Florey, Hrsg., Academic Press, New York 1977, Seiten 341-421), die fungizid und in der Lage sind, Pilzinfektionen auf Kosten von schweren Nebenwirkungen für den Patienten zu heilen, und Fluconazol (siehe US-Patent Nr. 4 404 216 und International Telesymposium on Recent Trends in the Discovery, Development and Evaluation of Antifungal Agens, Section 2, R. A. Fromtling, Hrsg., J. R. Prous Science Publ., Barcelona, 1987) und andere Azol-Mittel, die geringere Nebenwirkungen besitzen, jedoch nur fungistatisch sind.
Ferner offenbart das US-Patent Nr. 4 870 165 polysubstituierte antifungale antibiotische Dihydrobenz[a]naphthacenchinon-Verbindungen, die durch Fermentation von zwei Actinmadura-hibisca-Stämmen, Stamm Nr. P157-2 und Nr. Q278-4, mit den ATCC-Nummern 53557 bzw. 53646, erzeugt werden.
Es besteht daher ein Bedarf an neuen antifungalen Mitteln für den Menschen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Verbindung der Erfindung ist ein Gemisch aus zwei Diastereomeren, welche trennbar sind, sich bei normalen Temperaturen jedoch wieder äquilibrieren. Das Gemisch wird nachstehend als Verbindung I gezeigt:
Die Strukturen der zwei Formen (Ia) und (Ib) sind nachstehend gezeigt:
Die Verbindung hat antimikrobielle und fungizide Eigenschaften und kann zur Bekämpfung systemischer und oberflächlicher Pilzinfektionen bei Menschen mit geringeren Nebenwirkungen als antifungale Standard-Mittel, wie z. B. Amphotericin B oder Fluconazol, geeignet sein.
Die Verbindung wird durch Kultivierung eines Stamms eines endophytischen Pilzes, Hormonema sp., MF 6176 in der Kulturensammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, N. J., erhalten.
Die Charakterisierung der Verbindung umfaßt die NMR-Daten für jede Form, wohingegen die biologische Aktivität die Ergebnisse für das Diastereomerengemisch zeigt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. I ist ein magnetisches Protonenkernresonanzspektrum für Verbindung I. Die Verbindung existiert natürlich als zwei, sich ineinander umwandelnde Diastereomere. Der bei etwa 3,30 ppm gezeigte Peak stellt das Lösungsmittel, CD&sub3;OD, dar.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Verbindung ist weiß und durch die folgenden Spektraleigenschaften gekennzeichnet.

INFRAROTSPEKTROSKOPISCHE DATEN

Aufgenommen als ein dünner Film auf ZnSe: 3406 br., 1708 cm&supmin;¹.

MASSENSPEKTROSKOPISCHE DATEN

Massenspektren wurden an einem JEOL-HX110-(Fast Atom Bombardment, FAB)-Massenspektrometer unter Verwendung einer Dithiothreit-Dithioerythrit(20/80)-Matrix aufgenommen. Die exakten Massenbestimmungen wurden bei hoher Auflösung mit UltramarkTM 1960 (Fomblin) als Eichverbindung durchgeführt.
HR FAB-MS Gefunden für C&sub3;&sub8;H&sub6;&sub0;O&sub1;&sub2; + Na: 731,4083
Berechnet für C&sub3;&sub8;H&sub6;&sub0;O&sub1;&sub2; + Na: 731,3982

NMR-SPEKTRALDATEN

Die NMR-Spektren wurden in CD&sub3;OD bei 500 MHz (¹H) oder 125 MHz (¹³C) aufgezeichnet. Die chemischen Verschiebungen sind feldabwärts von TMS (Tetramethylsilan) angegeben, und die Spektren wurden auf den Lösungsmittelpeak (3,30 ppm bei ¹H-Spektren und 49,0 ppm bei ¹³C-Spektren) geeicht.

¹NMR-SPEKTREN

Das ¹H-NMR-Spektrum der Verbindungen Ia und Ib ist in Fig. I gezeigt. Das ¹H-NMR-Spektrum wurde in CD&sub3;OD (0,15 ml) bei 500 MHz an einem Varian-Unity-500-Spektrometer bei 25ºC aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm relativ zu Tetramethylsilan (TMS) bei null ppm angegeben und sind auf den internen Lösungsmittelpeak bei 3,30 ppm geeicht.

¹³C-NMR-SPEKTREN

(Hauptdiastereomer)

¹³C: δ 8,4(q), 16,1(q), 17,2(q), 17,5(q), 18,9(q), 19,4(q), 20,9(t), 21,2(q), 21,7(q), 25,3(q), 27,7(d), 29,0(t), 30,0(t), 38,5(s), 38,6(t), 39,0(s), 39,8(t), 41,2(d), 41,3(s), 41,5(d), 41,7(s), 45,3(s), 49,1(d), 53,4(d), 62,9(t), 66,1(t), 71,8(d), 74,4(d), 75,7(d), 77,8(d), 78,1(d), 87,8(d), 97,2(d), 105,3(d), 125,1(d), 140,3(s), 173,3(s), 177,6(s) ppm.

(Nebendiastereomer)

¹³C: δ 8,4(q), 16,5(q), 17,0(q), 18,2(q), 18,9(q), 18,8(t), 21,5(t), 21,2(q), 21,6(q), 25,3(q), 27,7(d), 29,3(t), 30,0(t), 38,5(s), 39,0(t), 38,8(s), 45,4(t), 38,8(d), 40,9(s), 40,1(d), 41,7(s), 43,5(s), 49,1(d), 53,6(d), 62,8(t), 59,7(t), 71,7(d), 74,8(d), 75,8(d), 77,7(d), 78,2(d), 88,0(d), 98,8(d), 105,3(d), 120,0(d), 144,1(s), 173,2(s), 177,7(s) ppm.
Die Verbindung dieser Erfindung besitzt antimikrobielle Eigenschaften und eignet sich speziell als ein antifungales Mittel sowohl gegen filamentöse Pilze als auch gegen Hefen. Sie eignet sich gegen Organismen, die systemische pathogene mykotische Infektionen beim Menschen hervorrufen, wie z. B. Candida albicans, Candida tropicalis, Candida guillermondii, Candida glabrata, Aspergillus fumigatus, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus flavus et al. Sie eignet sich auch gegen Organismen, die oberflächliche Pilzinfektionen hervorrufen, wie z. B. Trichoderma sp. und Candida sp. Diese Eigenschaften können bei der Verabreichung von Zusammensetzungen, die eine antifungale Menge der Verbindung enthalten, an eine Fläche, ein Objekt oder ein Subjekt, auf oder in der/dem Pilze bekämpft werden sollen, wirksam eingesetzt werden. Daher sind Zusammensetzungen, die eine antifungal wirksame Menge der Verbindung enthalten, und deren Verwendung zur Pilzbekämpfung Aspekte der vorliegenden Erfindung. Ein besonders bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Zusammensetzungen in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und deren Verwendung zur Bekämpfung mykotischer Infektionen durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist ein Naturprodukt, das von einem Hormonema-Stamm, MF 6176 in der Kulturensammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, der in der Kulturensammlung der American Type Culture Collection in 12301 Parklawn, Drive, Rockville, Md. 20852, am 23. Januar 1996 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt wurde und dem die Zugangsnummer ATCC 74360 zugewiesen wurde, erzeugt wird.
Der erzeugende Pilz ist ein Hormonema sp. (MF 6176, ATCC 74360), der aus lebenden Blättern eines nichtidentifizierten Strauchs isoliert wurde, welche in Navalquejigo in der Provinz Madrid, Spanien, gesammelt wurden.
In Agarkultur zeigen die Kolonien des Pilzes die folgende Morphologie:
Kolonien auf YM-Agar (Difco) bei 25ºC, 12-Stunden-Photoperiode, langsamwachsend, nach 21 Tagen 20-24 mm erreichend, angehoben, feucht, schleimig bis wachsig in der Mitte, jedoch zum Rand hin samtartig werdend, mit untergetauchtem Rand, gerade bis gewellt, mit einigen strahlenförmigen Falten oder strahlenförmigen Sektoren, die Sektoren können zwischen vorwiegend myzelartigen oder hefeartigen Konidien wechseln, nicht zoniert, transluzent am Rand, jedoch bald dunkelolivegrau bis fast schwarz, Dark Olive Gray, Olivaceous Black, Blackish Green Gray (Farbnamen in Großbuchstaben von Ridgway, R., 1912, Color Standards and Nomenclature, veröffentlicht vom Autor, Washington, D. C.), entgegengesetzt ähnlich in der Färbung, ohne Gerüche oder Exsudate. Kein Wachstum auf YM bei 37ºC.
Kolonien auf Spezieller-Nährstoffarmer-Agar (D. Brayford. 1992. In Methods for Research on Soilborne Phytopathogenic Fungi. Herausgegeben von L. L. Singleton, J. D. Mihail & C. M. Rush. American Phytopathological Society Press, St. Paul, Minnesota, Seiten 103-106) bei 25ºC, 12-Stunden-Photoperiode, sehr langsam wachsend, nach 21 Tagen 17-18 mm erreichend, mit vordringendem Bereich untergetaucht bis angedrückt, gewellt, Luftmyzel fehlt, nicht zoniert, aufgrund der Vorherrschaft von hefeartigen Konidien anfänglich eingeschränkte schwarz bis dunkelolivegraue schleimige strahlenförmige Stränge bildend, bei der Reifung wird die Kolonie jedoch überwiegend myzelartig, mit Myzelbereichen blaßolivegrau, Storm Gray, Light Olive-Gray bis transluzent beim Annähern an den Rand, entgegengesetzt ähnlich in der Färbung, Exsudate und Gerüche fehlen.
Kolonien auf Maismehlagar (Difco) bei 25ºC, 12-Stunden- Photoperiode, langsamwachsend, nach 21 Tagen 10-17 mm erreichend, untergetaucht bis angedrückt am Rand, angehoben und schleimig zur Mitte hin, Luftmyzel fehlt, transluzent oliveartig schwarz bis schwarz, entgegengesetzt ähnlich in der Färbung.
Konidiophoren fehlen. Konidiogene Zellen holoblastisch, ganzheitlich, interkalar, üblicherweise von den Hauptachsen des vegetativen Myzels nicht differenziert, gelegentlich von einer/- einem undifferenzierten lateralen Zelle oder Filament hervorgehend. Konidien bis zu 14,5 um lang, bis zu 3,5 um breit, unseptiert, üblicherweise ellipsenförmig mit kegelförmiger Spitze und Basis, jedoch ziemlich variabel, gelegentlich birnenförmig oder subglobos, glatt, oft mit einer oder mehreren knospenden Narben, hyalin bis blaßolivegrau, oft knospend, um 1 oder 2 sekundäre Konidien zu bilden, die sich in hefeartigen Massen entlang der strahlenförmigen Achsen der Vegetativen Hyphen ansammeln. Das Myzel besteht aus gewundenen breiten, oft dickwandigen hyalinen bis dunkelfarbigen kurzzylindrischen bis subglobosen Zellen, oft mit länglich septierten Hyphenzellen, wobei die einzelnen Zellen einen Durchmesser von bis zu 18 um erreichen.
MF 6176 wird der Anamorphgattung Hormonema zugewiesen, basierend auf filamentösem Myzel, bestehend aus breiten dunkelfarbigen Hyphen, die sich nicht in Arthrosporen auftrennen, undifferenzierte Konidiophoren fehlen, konidiogene Zellen mit basipetaler Konidiogenese und Konidien, die reichlich sekundäre Knospen erzeugen (G. S. De Hoog & E. J. Hermanides-Nijhof. 1977. Survey of the black yeasts and allied fungi. Centraalbureau voor Schimmelcultures Studies in Mycology 15: 178-222). MF 6176 mit seinem langsamen strahlenförmigen Wuchs und seinen großen Konidien ist sehr ähnlich zu einer Gruppe unbenannter Hormonema-Arten, die Anamorphe von planzenbewohnenden Loculoascomyceten sind (E. J. Hermanides-Nijhof. 1977. Auerobasidium and allied genera. Centraalbureau voor Schimmelcultures Studies in Mycology 15: 141-177).
Obwohl die Erfindung hauptsächlich in bezug auf den speziellen Stamm erörtert wird, ist im Stand der Technik gut bekannt, daß die Eigenschaften von Mikroorganismen natürlich und künstlich variiert werden können. Daher sollen alle von Hormonema sp. MF 6176, ATCC 74360, abgeleiteten Stämme, einschließlich Varietäten und Mutanten, egal ob durch natürliche Auswahl, durch die Wirkung von Mutationsmitteln, wie z. B. ionisierender Strahlung oder Ultraviolettstrahlung, erzeugt oder durch die Wirkung chemischer Mutagene, wie z. B. Nitrosoguanidin, erzeugt, vom Umfang dieser Erfindung umfaßt sein.
Die Herstellung der Verbindung kann durch Kultivieren des Hormonema sp. MF 6176, ATCC 74360, in einem geeigneten Nährmedium unter hierin beschriebenen Bedingungen, bis eine bedeutende Menge an antifungaler Wirkung in der Fermentationsbrühe nachgewiesen wird, Ernten der wirksamen Komponenten durch Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel aus dem Myzelwuchs, Einengen der Lösung, die die erwünschte Komponente enthält, und anschließende Durchführung einer chromatographischen Trennung, um die Verbindung von anderen, ebenfalls in dem Kulturmedium vorhandenen Metaboliten zu isolieren, durchgeführt werden.
Allgemein sind die Kohlenstoffquellen u. a. Glucose, Fructose, Mannose, Maltose, Galactose, Mannit und Glycerin, andere Zucker und Zuckeralkohole, Stärken und andere Kohlenhydrate oder Kohlenhydratderivate, wie z. B. Dextran, Cerelose, sowie komplexe Nährstoffe, wie z. B. Reis, Hafermehl, Maismehl, Hirse und Mais. Die genaue Menge der Kohlenstoffquelle, die in dem. Medium verwendet wird, wird zum Teil von den anderen Bestandteilen in dem Medium abhängen, üblicherweise wird jedoch festgestellt, daß eine Kohlenhydratmenge zwischen 0,5 und 15 Gewichtprozent des Mediums ausreichend ist. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden, oder mehrere solche Kohlenstoffquellen können kombiniert sein. Wie nachstehend angegeben, sind bestimmte Kohlenstoffquellen bevorzugt.
Die Stickstoffquellen sind u. a. Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Arginin, Threonin, Methionin und dergleichen, Ammoniumsalze sowie komplexe Strukturen, wie z. B. Hefehydrolysate, Hefeautolysate, Hefezellen, Tomatenpaste, Sojabohnenmehl, Kaseinhydrolysate, Hefeextrakt, Maisquellwasser, lösliche Schlempeanteile, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt und dergleichen. Die verschiedenen Stickstoffquellen können alleine oder in Kombination in Mengen, die von 0,05 bis 5 Gew.-% des Mediums reichen, verwendet werden.
Unter den anorganischen Nährstoffsalzen, die in das Kulturmedium eingebaut werden können, sind die üblichen Salze, die in der Lage sind, Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Carbonat- und ähnliche Ionen zu bilden. Ebenfalls enthalten sind Spurenmetalle, wie z. B. Cobalt, Mangan, Eisen, Molybdän, Zink, Cadmium und dergleichen.
Repräsentative geeignete feste und flüssige Produktionsmedien sind den folgenden Tabellen zu entnehmen. Ebenfalls enthalten ist ein repräsentatives Impfmedium. Diese sind jedoch lediglich beispielhaft für die große Vielfalt an Medien, die verwendet werden können, und sollen nicht als einschränkend aufgefaßt werden. TABELLE 1

TABELLE 2

FESTES PRODUKTIONSMEDIUM

Komponente pro 250-ml-Kolben
Brauner Reis 10 g
Hefeextrakt 20 mg
Natriumtartrat 10 mg
KH&sub2;PO&sub4; 10 mg
Destilliertes Wasser 20 ml
Der pH-Wert wurde vor der 20minütigen Behandlung im Autoklaven nicht eingestellt. Unmittelbar vor der Verwendung wurde das Medium mit 15 ml destilliertem Wasser angefeuchtet und erneut 20 Minuten lang im Autoklaven behandelt.

TABELLE 3

FLÜSSIGES PRODUKTIONSMEDIUM

Komponente pro Liter
Glucose 50 g
Tryptophan 1 g
Fidco-Hefe-Extrakt 10 g
NZ-Amin (Typ E) 33 g
Ammoniumsulfat 5 g
KH&sub2;PO&sub4; 9 g
Der pH-Wert wurde vor der Autoklavenbehandlung mit NaOH auf 6,2 eingestellt.
Es wurde gefunden, daß von den obigen Medien das feste Produktionsmedium die beste Ausbeute an der Verbindung ergibt. Bei der Produktion der Verbindung wird im allgemeinen die Kultur zuerst in einem Impfmedium kultiviert und der Kulturwuchs dann verwendet, um ein Produktionsmedium zu beimpfen. Das Produktionsmedium kann ein festes Medium oder ein flüssiges Medium sein.
Bei der Durchführung der Produktion von Verbindung 1 wurden vegetative Myzelien der Kultur durch Beimpfen von 54 ml Impfmedium (Tabelle 1) in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben ohne Schikanen mit 2 ml Myzelien in 10%igem Glycerin, die bei -80ºC gelagert worden waren, hergestellt. Die Impfkulturen wurden 3 Tage lang bei 25ºC und 85%iger relativer Feuchtigkeit auf einem Rotationsschüttler mit einem 5-cm-Hub bei 220 U/Minute in einem Raum mit konstantem Fluoreszenzlicht inkubiert. 2-ml-Portionen der Kultur wurden verwendet, um eine Impfkultur im zweiten Stadium zu beimpfen, und man inkubierte 3 weitere Tage unter den oben angegebenen Bedingungen. 2-ml-Portionen dieser 3-Tage-Kultur wurden verwendet, um 50- ml-Portionen des flüssigen Produktionsmediums (Tabelle 3) oder des festen Produktionsmediums auf Reisbasis (Tabelle 2) in 250-ml- Erlenmeyerkolben ohne Schikanen zu beimpfen.
Die Eignung der Verbindung als ein antifungales Mittel, insbesondere als ein antimykotisches Mittel, kann mit der Verbindung in einem Microbroth-Verdünnungsassay zur Ermittlung der minimalen inhibierend wirkenden Konzentration (MIC) und der minimalen fungizid wirkenden Konzentration (MFC) gegen Pilze gezeigt werden. Es wird gefunden, daß die Verbindung in dem Assay gegen eine Reihe von Pilzen, die aufgrund ihrer Resistenz/Suszeptibilität gegenüber bekannten Verbindungen, ihrer Tiervirulenz, ihres Ursprungs und ihrer klinischen Bedeutung ausgewählt werden, bei Konzentrationen, die mit einem bewährten antifungalen Mittel, Amphotericin B, vergleichbar sind, wirksam sind.
Bei dem Microbroth-Verdünnungsversuch wurden die Mikroorganismen durch Ausstreichen einer Hefekultur auf Sabouraud-Dextrose- Agar (SDA) und 24-48 Stunden langes Inkubieren bei 35-37ºC ausgewählt. Drei bis fünf charakteristische Kolonien wurden ausgewählt und auf eine frische Platte überführt und unter ähnlichen Bedingungen inkubiert. Aus dem erneuten Wuchs wurden 3 bis 5 Kolonien ausgewählt und in 10 Milliliter YM-Brühe (Difco) suspendiert und 4 Stunden lang bei 35-37 C unter Schütteln bei 225 U/Minute inkubiert. Die 4-Stunden-Brühekulturen wurden optisch auf eine 86%ige Transmission eingestellt, was zu einer Konzentration von 1-5 · 10&sup6; cfu/ml führte, welche weiter in YNBD (Hefe-Stickstoff-Basis mit 1% Dextrose) 1 : 100 verdünnt wurden, um eine Konzentration von 1-5 · 10&sup4; cfu/ml zur Verwendung als Inokula zu erhalten.
Die Testverbindung wurde auf 256 ug/ml in 10% DMSO gelöst und in der ersten Vertiefung 2fach verdünnt, um in der ersten Vertiefung eine Konzentration von 256 ug/ml bei 5% DMSO zu ergeben. Die Verbindungen wurden anschließend 2fach reihenverdünnt, und die Zellsuspension wird zu jeder Vertiefung hinzugegeben, was zu einer weiteren 2fachen Verdünnung der Verbindung führt. In jede Vertiefung in Reihe 1 einer Platte mit 96 Vertiefungen und U-förmigem Boden werden 75 ul der genannten Lösung gegeben. Die Verbindungen in Reihe 1 wurden dann zweifach reihenverdünnt, um Konzentrationen von 128 ug/ml bis 0,03 ug/ml zu ergeben.
Amphotericin B, die Kontrollverbindung, wurde als eine Stammlösung mit 256 ug/ml in 10%igem DMSO hergestellt, und 75 ul der Lösung wurde zu Reihe 1 einer Platte mit 96 Vertiefungen und U- förmigem Boden hinzugegeben. Die Verbindungen in Reihe 1 wurden dann zweifach reihenverdünnt, um Konzentrationen von 128 ug/ml bis 0,06 ug/ml zu ergeben.
Die Platten, die die verdünnten Verbindungen enthielten, wurden anschließend mit 75 ul/Vertiefung des passenden Mikroorganismus beimpft und 48 Stunden lang bei 35-37ºC inkubiert, wobei die MIC(minimale inhibierend wirkende Konzentration)-Bestimmungen 24 Stunden nach der Inkubation durchgeführt wurden (außer bei Cryptococcus-Stämmen, die nach 48 Stunden abgelesen werden). Wuchs- und Sterilitätskontrollen für jeden Organismus und Sterilitätsprüfungen für die Verbindungen wurden ebenfalls durchgeführt.
Nach der Aufzeichnung der MIC-Werte nach 24 Stunden wurden die Mikrotiterplatten leicht geschüttelt, um die Zellen wieder zu suspendieren. Eine 1,5-ul-Probe wurde von jeder Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen in eine Impfplatte mit einem einzigen Reservoir, das SDA enthielt, überführt. Das beimpfte SDA und die entsprechenden Mikrotiterplatten wurden 24 Stunden lang bei 35-37ºC inkubiert. Für Cryptococcus neoformans wurden die SDA-Platten 48 Stunden nach der Aufzeichnung der MIC-Werte beimpft und vor der Ablesung des MFC-Werts 48 Stunden lang inkubiert. Die MFC ist die niedrigste Konzentration der Verbindung, bei der entweder kein Wuchs oder ein Wuchs von 54 Kolonien stattfindet.
Für Aspergillus fumigatus sind keine MFC-Werte angegeben, da die Kolonienzahlen bei filamentösen Spezies unzuverlässig sind. Statt dessen ist eine minimale wirksame Konzentration (MEC) angegeben. Die MEC ist definiert als die niedrigste Arzneistoff konzentration, die eine deutliche Morphologieänderung in den Zellen bewirkt. Die MEC wird makroskopisch durch direkte Beobachtung der Plattenvertiefungen nach 24 Stunden ermittelt und spiegelt die mikroskopischen Änderungen der Zellmorphologie wieder (Kurtz et al., AAC 1994 38: 1480-1489). Minimale fungizid wirkende Konzentration (MFC) Minimale inhibierend wirkende Konzentration (MIC) ug/ml
Die Verbindung eignet sich auch zur Inhibierung des Wuchses von filamentösen Pilzen. Eine solche Verwendung kann durch die folgenden Tests mit Aspergillus flavus, Fusarium oxysporum und Ustilago zeae veranschaulicht werden.
Inokula für filamentöse Pilze werden hergestellt, indem die Oberfläche von auf Kartoffel-Dextrose-Agar gehaltenen Stamm-Platten mit einem angefeuchteten sterilen Dacron-Schrubber abgeschabt wird. Die Sporen und Myzelien werden dann in 10 Milliliter steriler Kartoffel-Dextrose-Brühe suspendiert und auf eine 70prozentige Transmission bei 660 nm eingestellt.
Die Proben, die auf die Produktion von antifungalem Mittel getestet werden sollen, werden direkt als Methanollösungen auf die Agarplatten aufgetragen. Wenn die zu testende Probe rohe Brühe ist, kann sie vor dem Auftrag zentrifugiert werden. Die Assayplatten werden dann entweder bei 28ºC oder bei 37ºC 24 Stunden lang inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation werden die Inhibierungsbereiche gemessen. Auswirkungen auf den Wuchs werden ebenfalls notiert, soweit man sie erkennen kann. Es zeigt sich, daß die Verbindung den Wuchs der Pilzorganismen wirksam inhibiert.
Angesichts des breiten Wirkungsspektrums kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung entweder alleine oder als eine Mischung für die Verwendung bei verschiedenen Anwendungen von antifungalen Zusammensetzungen angepaßt werden. In einem solchen Fall können die Verbindungen mit einem biologisch inerten Träger im allgemeinen mit der Hilfe eines oberflächenaktiven Dispersionsmittels, dessen Beschaffenheit variieren würde, je nachdem, ob die Verwendung der Bekämpfung von Mensch oder Tiere infizierenden Pathogenen oder der Bekämpfung von Pilzen in der Landwirtschaft, wie z. B. Boden- oder Pflanzenteilen, oder der Bekämpfung von Pilzen in unbelebten Objekten dient, vermischt werden.
Bei Zusammensetzungen für medizinische Anwendungen kann die Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vermischt werden, dessen Beschaffenheit variieren wird, jenachdem, ob die Zusammensetzung topisch, parenteral oder oral sein soll.
Wenn die Anwendung topisch erfolgen soll, kann der Arzneistoff in herkömmlichen Cremes und Salben, wie z. B. Alvolen, wasserfreies Lanolin, Cetylalkohol, Frostsalbe, Glycerylmonostearat, Rosenwasser und dergleichen, formuliert werden.
Für parenterale Anwendungen können die Verbindungen in herkömmlichen parenteralen Lösungen, wie z. B. 0,85 Prozent Natriumchlorid oder 5 Prozent Dextrose in Wasser, oder in anderen pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzungen formuliert werden.
Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können durch Vermischen der Arzneistoffkomponenten mit irgendwelchen der üblichen pharmazeutischen Mitteln, einschließlich flüssiger Träger wie Wasser, Glycole, Öle und Alkohole für Flüssigpräparate und fester Träger wie Stärken, Zucker, Kaolin, Ethylcellulose, oberflächenaktiven Dispersionsmitteln, im allgemeinen mit Gleitmitteln, wie z. B. Calciumstearat, zusammen mit Bindemitteln und Sprengmitteln für feste Präparate wie Kapseln und Tabletten, hergestellt werden. Wasser ist der bevorzugte flüssige Träger für die erfindungsgemäße Verbindung.
Diese Zusammensetzungen werden dann in Mengen verabreicht, die ausreichen, um die erwünschte antifungale Wirkung zu erzielen. Für medizinische Anwendungen umfaßt das Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen antifungalen Menge der Verbindungen an ein Subjekt, das eine solche Behandlung benötigt. Die geeignete Dosis wird in Abhängigkeit vom Alter, von der Schwere, dem Körpergewicht und von anderen Zuständen variieren. Für die topische Anwendung werden die Zusammensetzungen direkt auf den Bereich, wo eine Bekämpfung erwünscht ist, aufgetragen. Für die innere Verabreichung kann die Zusammensetzung durch Injektion angewandt oder oral verabreicht werden.
Für die nichtmedizinische Anwendung kann das Produkt der vorliegenden Erfindung, entweder alleine oder als ein Gemisch, in Zusammensetzungen in einem inerten Träger, der feinteilige trockene oder flüssige Verdünnungsmittel, Streckmittel, Füllstoffe, Konditionierungsmittel und Hilfsstoffe umfaßt, einschließlich verschiedener Tone, Diatomeenerde, Talk oder Wasser und verschiedener organischer Flüssigkeiten, wie z. B. Niedrigalkanole, wie z. B. Ethanol und Isopropanol, eingesetzt werden.
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung, es soll jedoch nicht als die hierin offenbarte Erfindung einschränkend betrachtet werden. BEISPIEL I

ISOLIERUNG

Ein Methylethylketon(MEK)-Extrakt (3,4 l) wurde bis auf 110 ml eingeengt, getrocknet und mit 800 ml Hexan, 600 ml Methanol und 100 ml 1,1%iger wäßr. TFA aufgetrennt. Die untere Schicht wurde anschließend zur Trockene eingedampft und mit 50 ml Methanol, 10 ml H&sub2;O und 50 ml Hexan aufgetrennt. Die wirksame Komponente befand sich bei beiden Auftrennungen in der unteren Schicht.
Eine LH-20-Trennung wurde entwickelt [CH&sub2;Cl&sub2;/Hexane/MeOH (10 : 10 : 3)] und auf einen 940-ml-Gesamtbrüheextraktionsteil der aktiven unteren Schicht der Auftrennungen angewandt. Der reiche Schnitt wurde getrocknet, in CH&sub3;CN 0,1% TFA/H&sub2;O 0,1% TFA (1 : 1) wieder gelöst und auf einer 250 · 9,4-mm-Zorbax-RXC8-Säule mit 2 ml/Minute unter Verwendung der in der folgenden Tabelle beschriebenen Bedingungen chromatographiert:
Die Aktivität wurde in den Fraktionen 24-30 entdeckt. 1,95 mg der Verbindung wurden mit einem isolierten Titer von etwa 2 mg/l erhalten.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen repräsentative Zusammensetzungen, die Verbindung I enthalten.

BEISPIEL A

1000 Preßtabletten, die jeweils 500 Milligramm Verbindung I enthalten, werden aus der folgenden Formulierung hergestellt:
Gramm
Verbindung I 500
Stärke 750
Zweibasisches wäßriges Calciumphosphat 5000
Calciumstearat 2,5
Die feinpulvrigen Bestandteile werden gut vermischt und mit 10 Prozent Stärkepaste granuliert. Die Granulierung wird getrocknet und zu Tabletten verpreßt.

BEISPIEL B

1000 Hartgelatinekapseln, die jeweils 500 Milligramm Verbindung I enthalten, werden aus der folgenden Formulierung hergestellt:
Verbindung I 500
Stärke 250
Lactose 750
Talk 250
Calciumstearat 10
Ein einheitliches Gemisch wird aus den Bestandteilen hergestellt und zur Befüllung von zweiteiligen Hartgelatinekapseln verwendet.

BEISPIEL C

250 Milliliter einer injizierbaren Lösung werden durch herkömmliche Verfahren aus der folgenden Formulierung hergestellt:
Dextrose 12,5 Gramm
Wasser 250 Milliliter
Verbindung I 400 Milligramm
Die Bestandteile werden vermischt und zur Verwendung sterilisiert.

BEISPIEL D

Eine zur topischen Verwendung geeignete Salbe kann durch inniges Dispergieren von 13 mg Verbindung I in 1 g im Handel erhältlichem Polyethylen/Kohlenwasserstoff-Gel hergestellt werden.

BEISPIEL E

Eine Aerosol-Zusammensetzung kann mit der folgenden Formulierung (pro Kanister) hergestellt werden:
Verbindung I 24 mg
Lecithin NF, Flüssigkonzentrat 1,2 mg
Trichlorfluormethan 4,025 g
Dichlordifluormethan 12,15 g

Claims

1. Eine Verbindung mit der Struktur:

2. Eine antifungale Zusammensetzung, die eine antifungal wirksame Menge der Verbindung nach Anspruch 1 im Gemisch mit einem biologisch inerten Träger oder Verdünnungsmittel enthält.

3. Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei der Träger ein pharmazeutisch annehmbarer Träger ist.

4. Ein Verfahren zur Bekämpfung von Pilzwachstum bei unbelebten Objekten, das das Ausbringen einer antifungal wirksamen Menge der Verbindung nach Anspruch 1 an dem Ort, an dem Wachstum bekämpft werden soll, umfaßt.

5. Ein Verfahren zur Bekämpfung von Pilzinfektionen in der Landwirtschaft, das das Ausbringen einer antifungal wirksamen Menge der Verbindung nach Anspruch 1 an dem Ort, an dem Wachstum bekämpft werden soll, umfaßt.

6. Die Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Pilzinfektionen.

7. Ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, das die aerobe Kultivierung einer Kultur von Hormonema sp. MF6176, Hinterlegungsnummer ATCC 74360, in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, und die Isolierung der Verbindung daraus umfaßt.

8. Eine biologisch reine Kultur von Hormonema sp. MF6176 (Hinterlegungsnummer ATCC 74360), die in der Lage ist, die Verbindung nach Anspruch 1 in gewinnbaren Mengen zu erzeugen.