DE69913369T2

DE69913369T2 - Mikrobielle transformationsprodukte

Info

Publication number: DE69913369T2
Application number: DE69913369T
Authority: DE
Inventors: G. Michael STURR; M. Michel CHARTRAIN; H. Guy HARRIS; Jennifer Nielsen-Kahn; Brian Heimbuch
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1998-10-26
Filing date: 1999-10-22
Publication date: 2004-10-14
Anticipated expiration: 2019-10-23
Also published as: ES2211191T3; ATE255572T1; DE69913369D1; JP2002528444A; EP1124813A1; AU760975B2; US6228622B1; WO2000024728A1; AU1132000A; CA2347803A1; EP1124813B1; EP1124813A4

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Synthese eines neuen antimykotischen Mittels, welches durch Biotransformation einer bekannten Verbindung, Sordarin, hergestellt wird.
Sordarin ist ein antimykotisches Antibiotikum, das aus dem Ascomyceten Sordaria araneosa isoliert wurde (siehe GB 1,162,027 und Helvetica Chimica Acta, 1971, 51:119–20). Andere Verbindungen mit dem Sordarin-Gerüst wurden ebenfalls als antimykotische Mittel genannt. Die japanische offengelegte Patentanmeldung J62040292 offenbart die Verbindung Zofimarin, isoliert aus Zopfiela marina sp., die japanische offengelegte Patentanmeldung J06157582 offenbart die Verbindung BE-31405, isoliert aus Penicillium sp., und SCH57404 wird in J. Antibiotics, 1995, 48:1171–1172 angegeben. Über halbsynthetische Sordarin-Derivate wird in den PCT-Anmeldungen WO96/14326 und WO96/14327 berichtet. Die Verbindungen zeigen antimykotische Aktivität gegenüber Pilzen, einschließlich Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, C. glabrata und C. tropicalis.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Synthese der neuen antimykotischen Verbindung der Formel
Diese Verbindung wird durch Biotransformation von Sordarin hergestellt. Die Verbindung besitzt antimykotische Aktivität gegenüber einer Reihe von pathogenen Pilzen, einschließlich Candida spp., ist jedoch von Bedeutung, da sie den Zugang zu einer Reihe von Sordarin-Derivaten erlaubt, welche chemisch nicht zugänglich sind.
Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung durch Fermentation von Acfinomyces spp. MA7235, ATCC Nr. 202103, in Gegenwart der Substratverbindung Sordarin.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge an Verbindung I in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Exzipienten enthalten.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Pilzinfektionen in der Landwirtschaft und die Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Pilzinfektionen bei einem Säuger.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Offenbart wird eine Verbindung I der Formel
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Hydrat davon, welches) mit einem Biotransformationsverfahren hergestellt werden kann. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung wird hergestellt durch Fermentation des Mikroorganismus Actinomyces spp. MA7235, ATCC Nr. 202103, in Gegenwart der Substratverbindung, Sordarin, der Formel:
unter geeigneten Bedingungen.
Eine Probe des Mikroorganismus Actinomyces sp. wurde gemäß dem Budapester Vertrag in der Kultursammlung der American Type Culture Collection am 1. April 1998 am 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer ATCC 202103.
MA7235 kann allgemein wie folgt beschrieben werden. Beobachtungen des Wachstums und allgemeiner Kultureigenschaften erfolgten entsprechend den Verfahren von Shirling und Gottleib (International J. System. Bacteriol. 16:313–340): Die chemische Zusammensetzung der Zellen wurde unter Anwendung der Verfahren von Lechevalier und Lechevalier (in Actinomycete Taxonomy, A. Dietz und D. W. Thayer, Hrsg., Society for Industrial Microbiology, 1980) bestimmt. Ganzzellfettsäuren wurden derivatisiert und als Methylester (FAMEs) durch Gaschromatographie nach dem Verfahren von Miller und Berger unter Verwendung eines MIDI Mikrobial Identification Systems (Microbial Identification Systems, Newark, Delaware) analysiert. Die Färbung der Kultur wurde durch Vergleich mit Farbstandards in den Munsell-Farbkarten (Macbeth Division of Kollmorgen Instruments Corp., P.O. Box 230 Newburgh, NY 12551-0230) bestimmt.
Analyse von Ganzzellextrakten – Peptidoglycan enthält meso-Diaminopimelinsäure und Ganzzellextrakte enthalten Arabinose, Galactose und Rhamnose.
Allgemeine Wachstumseigenschaften – Gutes Wachstum auf Hefe-Malzextrakt-Agar (YME) und Czapeks-Agar (CZ). Mäßiges Wachstum auf Hafermehl-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar (Gas). Schlechtes Wachstum auf Agar mit anorganischem Salz und Stärke (ISS) und Wasser-Agar, ergänzt mit NZ-Amin A (Tabelle 1).
Kolonie-Morphologie (Hafermehl-Agar nach 21 Tagen) – Kein Luftmyzel. Das Substratmyzel hat eine orange Farbe (7,5YR/7/8) und eine ledrige Textur.
Mikromorphologie – Stark verzweigte vegetative Hyphen. Es wurden keine Lufthyphen beobachtet und keine Sporenstrukturen beobachtet.
Ganzzellfettsäuren-Analyse – Die FAME-Analyse offenbarte, daß die Ganzzellextrakte größere Mengen an 16 : 0 ISO-, 16 : 0 ISO 2 OH- und 17 : 1 Cis-9-Fettsäuren enthielten (Tabelle 2).
Schlussfolgerungen – Die Ganzzellanalyse oftenbart, daß MA7235 eine Zellwand vom Typ IV aufweist. Mikroskopische Beobachtungen offenbaren, daß MA7235 filamentös ist, jedoch keine unterscheidenden Merkmale ausbildet. Diejenigen Stämme, die eine Zellwandung vom Typ IV aufweisen, werden als zu den Nocaridaceae- und Nocardioform-Bakterien gehörig angegeben (7). MA7235 enthält keine Tuberkulasterinsäure und kann somit nicht als Mitglied der Nocardiaceae angesehen werden. MA7235 hat keinerlei phänotypische Eigenschaften mit den Nocardioformen gemeinsam und bildet gemäß Fettsäure-Analyse keine Gruppe mit diesen. Deshalb wird MA7235 als Actinomycetes sp. identifiziert. Tabelle 1: Kultureigenschaften von MA7235 nach 21 Tagen

NB: keine Farben zu berichten

Tabelle 2 – Prozentsatz von Fettsäuren in Ganzzellextrakten
Die vorliegende Erfindung kann mit irgendeinem Stamm von Actinomycetes sp. ausgeführt werden, welcher zur Bildung der Verbindung I in der Lage ist, und besonders bevorzugt ist der Stamm ATCC Nr. 202103.
Im allgemeinen kann die Verbindung I hergestellt werden durch Kultivierung des oben beschriebenen Mikroorganismus in Gegenwart einer geeigneten Konzentration der Substratverbindung Sordarin in einem wässerigen Nährmedium, das Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff enthält.
Die Substratverbindung Sordarin kann wie bereits beschrieben oder durch synthetische organische Verfahren erhalten werden.
Die Verbindung besitzt antimykotische Eigenschaften und kann zur Bekämpfung systemischer und oberflächlicher Pilzinfektionen bei Menschen von Nutzen sein. Ferner zeigt die Verbindung Aktivität gegen bestimmte pilzliche Pflanzenpathogene und kann als Antimykotikum für ein breites Spektrum von Erntepflanzen von Nutzen sein.
Die Verbindung dieser Erfindung hat antimikrobielle Eigenschaften und eignet sich besonders als neue Plattform für Antimykotika und Organismen, welche systemische humanpathogene Pilzinfektionen verursachen, wie Candida sp. und Cryptococcus neoformans. Diese Eigenschaften können effektiv genutzt werden, indem Zusammensetzungen, die eine antimykotische Menge der Verbindung enthalten, einem Areal, Gegenstand oder Individuum, auf oder bei dem Pilze bekämpft werden sollen, verabreicht werden. Somit sind Zusammensetzungen, die eine antimykotisch wirksame Menge der Verbindung enthalten, und deren Verwendung zur Bekämpfung von Pilzen Aspekte der vorliegenden Erfindung. Ein besonders bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Zusammensetzungen in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und deren Verwendung zur Bekämpfung von Pilzinfektionen durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung.
Die Verbindung I kann als Mittel gegen Pilze, insbesondere als ein antimykotisches Mittel, von Nutzen sein, was mit der Verbindung in einem Kulturbouillon-Mikroverdünnungs-Assay zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIK) demonstriert werden kann. Die Verbindung wird in dem Assay gegen Pilze, die wegen ihrer Resistenz/Sensitivität gegenüber bekannten Verbindungen, Virulenz für Lebewesen, Herkunft und klinischen Bedeutung ausgewählt wurden, in Konzentrationen, die mit einem etablierten Antimykotikum, Amphotericin B, vergleichbar sind wird, als wirksam befunden.
Bei dem Mikrobouillon-Verdünnungs-Assay wurden Mikroorganismen durch Animpfen von 5 ml YNBD-Bouillon (Hefe-Stickstoff-Base mit 2% Dextrose; Difco) mit 50 μl Hefekultur, als 20 %ige Glycerinstammlösung bei –76°C gelagert, oder durch Ausstreichen einer Hefekultur auf Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) und Inkubation für 24–48 Stunden bei 35–37°C selektioniert. Drei bis fünf charakteristische Kolonien wurden selektioniert und auf eine frische Platte überführt und unter ähnlichen Bedingungen inkubiert. Für die erneute Züchtung wurden 3 bis 5 Kolonien selektioniert und in 5 ml YNBD-Bouillon suspendiert. Die Flüssigkulturen wurden 16 Stunden lang bei 35–37°C in einer Rolltrommel, die sich mit 56 UpM drehte, inkubiert. Die 16-Stunden-Bouillon-Kulturen wurden optisch auf eine OD₆₀₀ von 0,01 durch Verdünnung in YNBD eingestellt und 5 Stunden lang bei 35–37°C in einer sich mit 56 UpM drehenden Rolltrommel inkubiert. Die Kulturen wurden weiter in YNBD auf eine OD₆₀₀ von 0,0014 verdünnt, was eine Konzentration von 1,5 × 10⁴ cfu/ml ergab, welche als Impfgut verwendet wurde.
Die Testverbindung wurde mit 128 μg/ml in 20%igem Methanol gelöst und zweifach in YNBD verdünnt, um eine Konzentration von 64 μg/ml mit 10% Methanol in der ersten Mulde einer 96-Mulden-U-Boden-Platte zu erzielen. Die Verbindungen in der Vertikalreihe 1 wurden anschließend zweifach reihenverdünnt und 75 ml Zellsuspension wurden jeder Mulde zugegeben, was zu einer zusätzlichen zweifachen Verdünnung der Verbindung führte, um Konzentrationen von 32 mg/ml bis 0,0075 mg/ml zu ergeben.
Sordarin, die Kontrollverbindung, wurde wie oben für Verbindung I beschrieben hergestellt.
Die Platten, welche die verdünnten Verbindungen und Zell-Impfgüter enthielten, wurden 48 Stunden lang bei 35–37°C inkubiert, wobei Bestimmungen der MIC (minimalen Hemmkonzentration nach 24 Stunden und 48 Stunden Inkubation vorgenommen wurden. Wachstums- und Sterilitätskontrollen für jeden Organismus und Sterilitätsüberprüfungen für die Verbindungen wurden ebenfalls durchgeführt.
In Anbetracht der Aktivität ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung, entweder allein oder als Mischung, adaptierbar, um in verschiedenen Anwendungen von antimykotischen Zusammensetzungen eingesetzt zu werden. In einem solchen Fall können die Verbindungen mit einem biologisch inerten Träger gemischt werden, gewöhnlich unter Zuhilfenahme eines oberflächenaktiven Dispergiermittels, dessen Natur in Abhängigkeit davon, ob der Einsatz zur Bekämpfung von Pathogenen ist, die den Menschen oder Tiere infizieren, oder zur Bekämpfung von Pilzen in der Landwirtschaft, wie z. B. im Boden oder Pflanzenteilen, oder zur Bekämpfung von Pilzen bei unbelebten Gegenständen, variieren würde.
In Zusammensetzungen für medizinische Anwendungen kann die Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger gemischt sein, dessen Natur davon abhängen wird, ob die Zusammensetzung topisch, parenteral oder oral sein soll.
Falls die Anwendung topisch sein soll, kann der Arzneiwirkstoff in herkömmlichen Cremes und Salben, wie z. B. Alvolen, wasserfreiem Lanolin, Cetylalkohol, Cold Cream, Glycerinmonostearat, Rosenwasser und dgl., formuliert werden Für parenterale Anwendungen können die Verbindungen in herkömmlichen parenteralen Lösungen, wie z. B. 0,85%igem Natriumchlorid oder 5%iger Dextrose in Wasser, oder anderen pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzungen formuliert werden.
Verbindungen zur oralen Verabreichung können hergestellt werden durch Mischen der Arzneiwirkstoffbestandteile mit irgendeinem der gewöhnlichen pharmazeutischen Medien, einschließlich, für flüssige Präparate, flüssiger Träger wie Wasser, Glycole, Öle, Alkohole und dgl., und für feste Präparate wie Kapseln und Tabletten, fester Träger wie Stärken, Zucker, Kaolin, Ethylcellulose, oberflächenaktiver Dispergiermittel, gewöhnlich mit Gleitmitteln wie Calciumstearat, zusammen mit Bindemitteln, Desintegrationsmitteln und dgl. Wasser ist der bevorzugte flüssige Träger für die Verbindung der Erfindung.
Diese Zusammensetzungen können dann in ausreichenden Mengen verabreicht werden, um die gewünschte antimykotische Wirkung zu erzielen. Für medizinische Anwendungen umfaßt das Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen antimykotischen Menge der Verbindungen an ein Individuum, das einer Behandlung bedarf. Die geeignete Dosis wird in Abhängigkeit vom Alter, Krankheitsgrad, Körpergewicht und anderen Bedingungen variieren. Für die topische Anwendung werden die Zusammensetzungen direkt auf das Gebiet aufgebracht, wo die Kontrolle erwünscht ist. Für die innere Verabreichung kann die Zusammensetzung durch Injektion appliziert werden oder kann oral verabreicht werden.
Für eine nicht-medizinische Anwendung kann das Produkt der vorliegenden Erfindung, entweder allein oder als Mischung, in Zusammensetzungen in einem inerten Träger eingesetzt werden, welcher feinteilige trockene oder flüssige Verdünnungsmittel, Streckungsmittel, Füller, Conditioner und Exzipienten, einschließlich verschiedener Tonarten, Diatomeenerde, Talkum und dgl., oder Wasser und verschiedene organische Flüssigkeiten wie niedere Alkanole, z. B. Ethanol und Isopropanol, einschließt.
Zusammensetzungen zur Injektion, ein bevorzugter Verabreichungsweg, können in Dosierungseinheitsform in Ampullen oder in Mehrfachdosis-Behältern zubereitet werden. Die injizierbaren Zusammensetzungen können solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässerigen Vehikeln annehmen und können verschiedene Formulierungsmittel enthalten. Alternativ kann der aktive Bestandteil in Pulverform (lyophilisiert oder nicht-lyophilisiert) für die Rekonstitution zum Zeitpunkt der Verabreichung mit einem geeigneten Vehikel, z. B. sterilem Wasser, vorliegen. In injizierbaren Zusammensetzungen umfaßt der Träger typischerweise steriles Wasser, Salzlösung oder eine andere injizierbare Flüssigkeit, z. B. Erdnussöl, für intramuskuläre Injektionen. Auch können verschiedene Puffermittel, Konservierungsstoffe und dgl. eingeschlossen sein.
Topische Anwendungen können in Trägern wie hydrophoben oder hydrophilen Basen zur Bildung von Salben, Cremes, Lotionen in wässerigen, ölhaltigen oder alkoholischen Flüssigkeiten zur Bildung von Anstrichen oder in trockenen Verdünnungsmitteln zur Bildung von Pulvern formuliert werden.
Orale Zusammensetzungen können solche Formen wie Tabletten, Kapseln, orale Suspensionen und orale Lösungen annehmen. Die oralen Zusammensetzungen können Träger, wie z. B. herkömmliche Formulierungsmittel, verwenden und können Eigenschaften der verzögerten Freisetzung ebenso wie schnelle Abgabeformen einschließen.
Die zu verabreichende Dosis hängt weitgehend von dem Zustand und der Größe des zu behandelnden Individuums, dem Weg und der Häufigkeit der Verabreichung, der Sensitivität des Pathogens für die spezielle ausgewählte Verbindung, der Virulenz der Infektion und anderen Faktoren ab. Solche Punkte sind jedoch dem routinemäßigen Ermessen des Arztes gemäß wohlbekannten Behandlungsprinzipien auf dem Gebiet der antibakteriellen Medizin überlassen. Ein weiterer Faktor, welcher den präzisen Dosierungsplan beeinflußt, abgesehen von der Art der Infektion und der speziellen Identität des behandelten Individuums, ist das Molekulargewicht der Verbindung.
Die Zusammensetzungen für die Abgabe an Menschen pro Dosierungseinheit, flüssig oder fest, können von etwa 0,01% bis zu etwa 99% aktives Material enthalten, wobei der bevorzugte Bereich etwa 10–60% ist. Die Zusammensetzung wird im allgemeinen etwa 15 mg bis etwa 2,5 g des aktiven Bestandteils enthalten, jedoch ist es im allgemeinen bevorzugt, Dosismengen im Bereich von etwa 250 mg bis 1000 mg einzusetzen. Bei der parenteralen Verabreichung wird die Einheitsdosis typischerweise die reine Verbindung in einer sterilen Wasserlösung oder in Form eines zur Lösung bestimmten löslichen Pulvers, welches auf neutralen pH-Wert und Isotonie eingestellt werden kann, einschließen.
Die bevorzugten Verabreichungsverfahren der antimykotischen Verbindungen umfassen oral und parenteral, z. B. intravenöse Infusion, intravenöser Bolus und intramuskuläre Injektion.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
BEISPIEL 1
Kolben-Biokonversion von Sordarin
Eine eingefrorene Glycerinsuspension von Actinomyces spp. MA7235 wurde in 25 ml des bevorzugten Produktionsmediums (BASA 10 g/l Glucose, 20 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Hycase, 2,0 g/l KNO₃, 0,5 g/l NaCl, 0,5 g/l MgSO₄, 0,02 g/l CuCl, 0,025 g/l FeSO₄, 0,01 g/l ZnSO₄, 0,005 g/l MnSO₄, pH auf 7,0 mit HCl) in einem 250-ml-Kolben angeimpft, aerob drei Tage lang bei 29°C auf einem mit 200 UpM betriebenen Rotationsschüttler inkubiert. Ein Milliliter der Drei-Tage-Impfkultur wurde zu 25 ml frischem Produktionsmedium überführt und die Kultur unter denselben Bedingungen 20–28 Stunden lang auf einen Kultur-pH-Wert zwischen 7,2 und 8,0 gezüchtet. Sordarin, in 80% gelöst, wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 g/l zugegeben. Die eingetragene Bouillon wurde 1 : 1 mit Methanol extrahiert und zentrifugiert, um Zelltrümmer vor der HPLC-Analyse zu entfernen. Die Anwesenheit des Peaks der Verbindung I, 11-Hydroxysordarin, wurde 24 Stunden nach Eintrag der Bouillon durch Umkehrphasen-HPLC-Auftrennung der Bouillon nachgewiesen. Eine Phenomenex Primesphere-Säule wurde eingesetzt, um die Auftrennung zu erreichen, welche mit einem Spectraphysics-HPLC-System unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril und angesäuertem Wasser (0,1% HP₃O₄) durchgeführt wurde. Der eingesetzte Gradient war 10 bis 60% Acetonitril und der Detektor wurde auf 220 nm eingestellt.
Verbindung I

¹³C-NMR (CD₃OD): 14,2, 18,4, 21,5, 23,0, 28,9, 30,1, 30,2, 38,02, 40,1, 41,9, 43,6, 47,5, 57,1, 59,8, 68,1, 69,9, 72,2, 73,6, 75,9, 81,1, 81,2, 100,1, 132,1, 149,9, 175,3, 205,9.
¹H-NMR (CD₃OD): 0,856 (d, 6,5, H-20), 0,979 (d, 6,5, H-15), 1,044 (d, 7,0, H-16), 1,248 (d, 6,0, H-6'), 1,25 (mult, H-4a), ~1,75 (mult, H-8a), 1,848 (mult, H-10), 2,000 (dd, 4,5, 12,5, H-4b), 2,05–2,113 (3H mult, H-8b, 9, 13) 2,330 (mult, H-14), 2,384 (mult, H-12), 2,835 (dd, 4,0, 4,0, H-3), 3,132 (dd, 3,0, 9,5, H-4'), 3,376 (s, H-7'), 3,69–3,75 (3H mult, H-2', 5', 19a), 3,838 (ddd, < 1, 5,5, 5,5, H-11), 3,914 (d, 9,5, H-19b), 4,115 (dd, 4,0, 4,0, H-3'), 4,587 (d, 1,0, H-1'), 6,127 (dd, 1,0, 3,0, H-2), 9,636 (s, H-17).

Die Massenspektren wurden auf Jeol SX-102A (Elektronenstoß, EI, 90 eV)- und TSQ700 (LC-MS-ESI, Flüssigchromatographie-Elektrosprayionisation)-Massenspektrometern aufgezeichnet. Exakte Massenmessungen erfolgten bei hoher Auflösung (HR-EI) unter Verwendung von Perfluorkerosin (PFK) als interner Standard. Das Molekülion der Verbindung I wurde bei m/z 380 beobachtet. Scanning-Hochauflösungs-EI-Massenmessungen legten eine Molekülformel von C₂₁H₃₂O₆ nahe; gefunden 380,2187, berechnet 380,2199.
¹H- und ¹³C-NMR-Spektren wurden bei 500 MHz bzw. 125 MHz bei 25°C mit einem Varian Unity 500-Spektrometer, ausgerüstet mit einer Nalorac-Mikroinversions-Nachweissonde, aufgezeichnet. Chemische Verschiebungen werden in ppm stromabwärts von TMS (Tetramethylsilan) angezeigt und die Spektren wurden auf den Lösungsmittel-Peak (3,30/49,0 ppm, ¹H/¹³C) bezogen.
BEISPIEL 2
Fermenter-Biokonversion von Sordarin
Eine eingefrorene Glycerinsuspension von Actinomyces spp. MA7235 wurde in 25 ml des bevorzugten Produktionsmediums (BASA, pH 7,0) in einem 250-ml-Kolben angeimpft, aerob drei Tage lang bei 29°C auf einem Rotationsschüttler, der bei 200 UpM betrieben wurde, inkubiert. Die 25 ml der dreitägigen Primärimpfkultur wurden in 600 ml frisches Produktionsmedium überführt und einen weiteren Tag lang wachsen gelassen, um eine Impfkultur zweiter Stufe zu erzeugen. Mit der Impfkultur zweiter Stufe wurde ein 23-l-Chemap-Fermenter angeimpft, der mit 15 l Produktionsmedium (BASA) zu dem 1 g/l Polyethylenglycol P2000 als Antischaummittel zugesetzt worden war, beschickt war. Die Temperatur des Fermenters wurde auf 29° C eingestellt und die Kultur mit 400 UpM mechanisch bewegt. Sordarin wurde in 80%igem Ethanol gelöst und dem Fermenter in Konzentrationen von entweder 0,25 g/l oder 0,5 g/l zugegeben. Der Lauf mit 0,25 g/l wurde mit Substrat 22 Stunden nach der Animpfung beschickt und der Lauf mit 0,50 g/l wurde 20 Stunden nach der Animpfung beschickt. Die Ansätze wurden mit einem gleichen Volumen Methanol gemischt und bei 4°C gelagert. Der pH-Wert der Kultur zum Zeitpunkt der Zugabe lag zwischen 7,2 und 8,0 und Verbindung I wurde während des Zeitraums von 12 Stunden nach der Beschickung gebildet, wie bestimmt anhand derselben HPLC-Kriterien wie in Beispiel 1 detailliert angegeben.
BEISPIEL 3
Isolierung der Verbindung I
Bouillon aus zwei 23-l-Fermentern, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde mit einem gleichen Volumen an Methanol extrahiert. Der Extrakt wurde mit H₂O verdünnt und mit konzentrierter HP₃O₄ auf pH 3 eingestellt. Die Lösung wurde auf eine 2-Liter-Säule von Mitsubishi SP207 in Aufstrommodus bei einer Strömungsrate von 400 ml/Min. adsorbiert. Nach der Adsorption wurde die Säule mit 20 Liter einer Lösung von Methanol/H₂O (1 : 4) gewaschen. Rohe Verbindung I wurde von dem Harz mit einer Lösung von Methanol/H₂O (4 : 1) eluiert. Die Fraktionen 2–5, jeweils 1 Liter, enthielten die Verbindung I. Die Fraktionen 2–5 wurden vereinigt und im Vakuum auf 1 Liter konzentriert. Die Lösung wurde mit 1 Liter H₂O verdünnt und durch Zugabe von 40 ml 5,0 N NaOH auf einen pH-Wert von etwa 11 eingestellt. Diese Lösung wurde zweimal mit einem gleichen Volumen EtOAc extrahiert. Der pH-Wert der wässerigen Schicht wurde mit konz. H₂SO₄ auf pH 2,5 eingestellt und zweimal mit einem gleichen Volumen an EtOAc extrahiert. Die EtOAc-Schichten wurden vereinigt und einmal mit H₂O, einmal mit Salzlösung, gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Das Na₂SO₄ wurde durch Filtration entfernt und die Lösung im Vakuum konzentriert.
Die rohe Verbindung I von oben wurde weiter durch Säulenchromatographie auf Silicagel 60 (E. Merck, 230–400 Mesh, 750 ml) gereinigt. Die Säule wurde mit einer Lösung von EtOAc, enthaltend 1% Eisessig, äquilibriert und mit 25 ml/Min. eluiert. Fraktionen, jeweils 25 ml, wurden gesammelt und die Verbindung I wurde in 87–133 gewonnen. Die Endreinigung der Verbindung I konnte durch präparative RP-HPLC auf Phenomenex Primesphere C8 unter Verwendung einer mobilen Phase, die aus Methanol/H₂O (1 : 1) mit 0,1% HP₃O₄ bestand, erreicht werden. Die Endreinigung der Verbindung I als Kaliumsalz erfolgte durch Überführung in das Kaliumsalz und Kristallisation aus einer Mischung von Isopropanol : Acetonitril (1 : 2).
Die folgenden Beispiele erläutern repräsentative Zusammensetzungen, welche die Verbindung I enthalten.
BEISPIEL A
1000 gepreßte Tabletten, jeweils 500 mg Verbindung I enthaltend, werden aus der folgenden Formulierung hergestellt:

Gramm

Verbindung I 500

Stärke 750

hydratisiertes Calciumhydrogenphosphat 5000

Calciumstearat 2,5
Die fein gepulverten Bestandteile werden gut gemischt und mit 10% Stärkepaste granuliert. Das Granulat wird getrocknet und zu Tabletten gepreßt.
BEISPIEL B
1000 Hartgelatinekapseln, jeweils 500 mg Verbindung I enthaltend, werden aus der folgenden Formulierung hergestellt:

Gramm

Verbindung I 500

Stärke 250

Lactose 750

Talkum 250

Calciumstearat 10
Eine gleichmäßige Mischung der Bestandteile wird durch Mischen hergestellt und zur Füllung von zweiteiligen Hartgelatinekapseln verwendet.
BEISPIEL C
250 ml einer injizierbaren Lösung werden nach herkömmlichen Verfahren aus der folgenden Formulierung hergestellt:

Dextrose 12,5 g

Wasser 400 mg

Verbindung I 250 ml
Die Bestandteile werden gemischt und für die Anwendung sterilisiert.
BEISPIEL D
Eine zur topischen Anwendung geeignete Salbe kann hergestellt werden durch innige Dispersion von 13 mg Verbindung I in 1 g im Handel erhältlichem Polyethylen/Kohlenwasserstoff-Gel.
BEISPIEL E
Eine Aerosol-Zusammensetzung mit der folgenden Zusammensetzung (pro Kanister) kann hergestellt werden:

Verbindung I 24 mg

Lecithin NF, flüssiges Konzentrat 1,2 mg

Trichlorfluormethan 4,025 g

Dichlordifluormethan 12,15 g
Obwohl die vorstehende Patentbeschreibung die Prinzipien der vorliegenden Erfindung lehrt, versteht es sich, daß die Ausführung der Erfindung alle zufälligen Variationen, Adaptionen, Modifizierungen, Deletionen oder Additionen von Verfahren und Protokollen umfaßt, die vom Umfang der folgenden Ansprüche und deren Äquivalenten umfaßt werden.

Claims

Verbindung der Formel
Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, welches umfaßt a) Kontaktieren einer Verbindung der Formel
mit Actinomyces spp. MA7235, ATCC Nr. 202103 oder einer Mutante davon, und b) Isolieren der Verbindung nach Anspruch 1.
Antimykotische Zusammensetzung, umfassend eine antimykotische Menge der Verbindung nach Anspruch 1 und einen biologisch inerten Träger oder ein biologisch inertes Verdünnungsmittel dafür.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei der Träger ein pharmazeutisch annehmbarer Träger ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Pilzinfektionen bei einem Säuger.
Verfahren zur Behandlung von Pilzinfektionen in der Landwirtschaft, welches das Verabreichen einer wirksamen Menge der Verbindung nach Anspruch 1 an der Stelle, an der das Wachstum behandelt werden soll, umfaßt.
Biologisch reine Bakterienkolonie (ATCC 202103), welche zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1 in der Lage ist.