DE2738656C2

DE2738656C2 -

Info

Publication number: DE2738656C2
Application number: DE19772738656
Authority: DE
Inventors: Hamao Umezawa; Tomio Tokio/Tokyo Jp Takeuchi; Masa Hoya Tokio/Tokyo Jp Hamada; Masaaki Ishizuka; Hiroshi Tokio/Tokyo Jp Naganawa; Toshikazu Kamakura Kanagawa Jp Oki; Taiji Chigasaki Kanagawa Jp Inui
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1977-08-26
Filing date: 1977-08-26
Publication date: 1989-08-31
Also published as: DE2738656A1

Description

Die Erfindung betrifft neue Anthracyclin-Antibiotika mit Antitumorwirkung, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, pharmazeutische Mittel, die diese Verbindung enthalten und den Stamm Streptomyces sp. ATCC 31 273 (vgl. hierzu die Patentansprüche).

Die Erfindung betrifft also Anthracyclinglycosid-Antibiotika, die hier als Rhodirubin A und B bezeichnet werden. Diese Antibiotika erhält man durch Kultivierung eines Rhodirubin A und B erzeugenden Streptomyces-Stammes in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen, bis eine wesentliche Menge Rhodirubin durch diesen Mikroorganismus in dem Kulturmedium gebildet worden ist. Dann wird das Rhodirubin aus dem Kulturmedium gewonnen. Rhodirubin A und B können aus dem Kulturmedim gewonnen und abgetrennt werden, z. B. durch Extraktion der Kulturbrühe, mit oder ohne vorherige Abtrennung des Mycels, oder durch Extraktion aus dem Mycel und anschließende Trennung und Reinigung der einzelnen Antibiotika nach Standardverfahren, die für die Isolierung und Reinigung anderer wasserunlöslicher Antibiotika verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen Rhodirubin A und B haben die folgenden Strukturformeln:

und

Die nicht-toxischen Säureadditionssalze dieser Verbindungen gehören zum Gegenstand der Erfindung.

Es wurde gefunden, daß Rhodirubin A und B sowohl antimikrobielle als auch Antitumor-Wirksamkeit besitzen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen insbesondere antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber gram-positiven Bakterien, hemmen das Wachstum von festen und aszitischen Formen bösartiger Tumore bei Säugetieren, z. B Mäuseleukämie L-1210, besitzen hohe Cytotoxizität und hemmen daher das Wachstum von Säugetier-Tumorzellen in Kulturen, haben aber eine geringe Toxizität.

Die hier verwendete Bezeichnung Rhodirubin bezieht sich auf das Antibiotikum, das wenigstens eines der beiden Antibiotika Rhodirubin A oder B enhält.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden durch einen Streptomyces-Stamm der von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung aus einer Bodenprobe isoliert worden, die auf dem Grundstück des Institutes of Microbial Chemistry von Osaki, Shinagawa-ku, Tokio, Japan genommen wurde, gebildet, und Kulturen dieses Stammes mit der Stammbezeichnung ME 505-HEI sind bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt worden und in deren ständige Mikroorganismensammlung als ATCC 31 273 aufgenommen worden.

Beim derzeitigen Stand der Untersuchungen läßt sich der Stamm Nr. ME 505-HEI wie folgt charakterisieren: Unter dem Mikroskop hat das Luftmycel keine wirtelig angeordnete bzw. quirlständige Verzweigungen und keine Spiralstruktur. Das Wachstum auf den verschiedenen Medien ist farblos, blaß rötlich braun bis dunkelbräunlich purpurfarben und Luftmycel wird nicht gebildet oder nur schwach gebildet mit weißer bis rosa-weißer Farbe. Schwach rotes, lösliches Pigment wird in geringem Umfange gebildet. Die Melaninbildung ist positiv. Aufgrund der obigen Charakteristika gehört der Stamm ME 505-HEI zum Genus Streptomyces.

Da Streptomyces leicht auf natürliche Weise mutiert, umfaßt Streptomyces ME 505-HEI der vorliegenden Erfindung den oben beschriebenen typischen Stamm und selbstverständlich alle natürlichen Rhodirubin-erzeugenden Varianten und Mutanten dieses Stammes.

Die Erzeugung der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt durch Kultivierung des Rhodirubin-erzeugenden Streptomyces-Stammes ATCC 31 273 in einem üblichen wäßrigen Nährmedium, das bekannte Nährstoffquellen für Actinomyceten enthält, nämlich assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff plus gegebenenfalls anorganische Salze und andere bekannte Wachstumsfaktoren. Man verwendet vorzugsweise submerse aerobe Kulturen für die Erzeugung großer Antibiotikamengen, für die Erzeugung begrenzter Mengen können natürlich auch Oberflächenkulturen und Flaschenkulturen verwendet werden. Geeignet sind Medien, die aus bekannten Arten von Nährstoffquellen für Actinomyceten bestehen und es können die allgemeinen Verfahren für die Kultivierung anderer Actinomyceten im Rahmen der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Das Medium enthält vorzugsweise handelsübliche Produkte, wie Glukose, Glycerin, Stärke, Dextrin, Saccharose oder Maltose, als Kohlenstoffquelle, wobei andere Kohlenhydrate, Alkohole, organische Säuren, Öle und Fette, entweder im gereinigten oder rohen Zustand für, diese Zwecke verwendbar sind, je nach der Assimilierbarkeit des Stammes. Handelsübliche Produkte, wie Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakte, Peptone, getrocknete Hefe, Hefeextrakte und Maisquellwasser, werden vorzugsweise als organische Stickstoffquellen verwendet, und anorganische Salze, wie (NH₄)₂SO₄, NaNO₃ und NH₄Cl, benutzt man als anorganische Stickstoffquellen. Falls erforderlich, kann man auch anorganische Salze, wie Chloride (NaCl oder KCl) oder Phosphate, Spurenmetalle (z. B Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen) oder Entschäumer, wie Adekanol®, Silikon®, flüssiges Paraffin, Sojabohnenöl oder Fett zugeben. Die Temperatur der Kultur sollte im Bereich von etwa 20°C bis 37°C, vorzugsweise bei etwa 25°C bis 30°C, liegen. Der pH des Kulturmediums liegt üblicherweise im Bereich von etwa 5 bis 8. Die Rhodirubin-Erzeugung der Kulturbrühe erreicht gewöhnlich etwa 3 bis 7 Tage nach dem Animpfen ein Maximum.

Für die Isolierung aus dem Fermentationsmedium und die Reinigung der Rhodirubinverbindungen kann man die verschiedensten bekannten Verfahren verwenden, z. B Extraktion mit Lösungsmittel, Ausfällung mit Lösungsmittel, Einengung, Gelfiltration, Gegenstromverteilung, Chelierung mit Metallionen, Adsorption und anschließendes Eluieren aus einem Ionenaustauscherharz, einem adsorbierenden Kieselerdematerial oder einem synthetischen Adsorptionsmittel, oder man kombiniert verschiedene der oben beschriebenen Verfahren.

Ein bevorzugtes Gewinnungsverfahren bedient sich der Extraktion von Rhodirubin A und B aus dem Kulturmedium mit Lösungsmittel. Die Rhodirubin-Antibiotika existieren sowohl intrazellulär als auch extrazellulär, man findet sie jedoch hauptsächlich im Mycel. Man trennt daher vorteilhafterweise zuerst das Mycel vom Filtrat der Kulturbrühe in an sich bekannter Weise, z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, ab. Die Antibiotika können jedoch auch direkt aus der Kulturbrühe - ohne vorherige Abtrennung des Mycels - extrahiert werden, z. B. mit Hilfe der unten diskutierten Verfahren. Rhodirubin A und B können aus dem Filtrat bei neutralem oder schwach basischem pH (z. B. 7 bis 9) mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Äthylacetat, Butylacetat, Chloroform, n-Butanol, extrahiert werden. Rhodirubin A und B im Mycel können mit einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Äthylacetat, n-Butanol, Methanol, Aceton oder Methyl-äthylketon, oder mit einer wäßrigen Lösung einer organischen oder anorganischen Säure, z. B. Chlorwasserstoffsäure oder Essigsäure, extrahiert werden. Die aktiven Rhodirubin-Extrakte werden dann eingeengt und im Vakuum getrocknet; dabei erhält man ein rötliches oder rötlich-purpurfarbenes Pulver, das ein Gemisch aus rohem Rhodirubin A und B ist.

Die Abtrennung der einzelnen Rhodirubin A- und B-Komponenten aus dem rohen Gemisch erfolgt mit Hilfe von weiteren Reinigungs- und Trennungstechniken, z. B. mit Hilfe von Säulenchromatographie, mit Adsorbentien, wie Kieselgel, modifizierten Dextranen (z. B. Sephadex® LH-20), mit schwach sauren Ionenaustauscherharzen, Aktivkohle oder Aluminiumoxyd, durch Gegenstromverteilung oder Flüssigkeitschromatographie mit geeigneten organischen Lösungsmitteln. Ein geeignetes Trennverfahren ist z. B. folgendes: Rohes Rhodirubinpulver (ein Gemisch der Komponenten A und B) kann in Toluol/Methanol gelöst werden, an Kieselgel in einer Säule chromatographiert werden und mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Toluol/Methanol eluiert werden; dabei erhält man die einzelnen Rhodirubin-Komponenten A und B. Die aktiven Eluate, die das Rhodirubin A und B enthalten, werden unter vermindertem Druck eingeengt, dann werden die einzelnen Komponenten durch Chromatographie an Sephadex® LH-20 weiter gereinigt.

Die Lösungen von gereinigten Rhodirubin A und B können auch nach Zugabe von einer oder mehreren Substanzen, wie Deoxyribonucleinsäure, Glycerin, Zuckern, Aminosäuren und organischen oder anorganischen Säuren, lyophilisiert werden.

Die physikochemischen Eigenschaften von Rhodirubin A und B sind folgende:

Rhodirubin A:
Rotes Pulver mit einem Schmelzpunkt von 141 bis 143°C.

Elementaranalyse (C₄₂H₅₅NO₁₆):
berechnet:
C 60,77; H 6,68; O 30,81; N 1,69%;
gefunden:
C 60,39; H 6,63; O 30,72; N 1,71%;

Molekulargewicht: 829,9

Spezifische Drehung: [α] + 120 (C = 0,1, CHCl₃)

Löslichkeit:
Rhodirubin A ist löslich in Methanol, n-Butanol, Aceton, Äthylacetat, Chloroform, Toluol, Benzol und Dimethylsulfoxyd, unlöslich in Wasser, n-Hexan und Petroläther und schwach löslich in Diäthyläther.

Farbe und Reaktion:
Die Methanollösung von Rhodirubin A ist rot gefärbt, verfärbt sich jedoch im alkalischen Zustand nach rötlich-purpurfarben. Die Ninhydrin-Reaktion ist negativ, Fehlingsche Lösung wird nicht reduziert.

Absorptionsspektrum:
UV und sichtbarer Bereich:
Absorptionsmaxima bei

Absorptionsspektrum: Infrarot
Das IR-Spektrum in KBr zeigt Peaks bei den folgenden Wellenlängen in cm^-1: 3430, 2950, 2930, 2810, 2750, 1735, 1640, 1600, 1450, 1320, 1300, 1220, 1160, 1120, 1040, 1000, 970, 960, 920, 800 und 760.

NMR-Spektrum:
Das PMR-Spektrum von Rhodirubin A in CDCl₃ (100 MHz) zeigt die folgenden chemischen Verschiebungen (ppm): 7,6, s; 7,24 s; 5,50, m; 5,62, m; 5,02, m; 4,84, m; 4,52, q; 4,7∼3,90, überlagert m; 3,72, s; 3,60∼0,09, überlagert m und 2,18.

Rhodirubin B:
Rotes Pulver mit einem Schmelzpunkt von 135 bis 137°C.

Elementaranalyse (C₄₂H₅₅NO₁₅):
berechnet:
C 61,99; H 6,77; O 29,52; N 1,72%;
gefunden:
C 61,23; H 6,80; O 28,77; N 1,94%;

Molekulargewicht = 813,9;

Spezifische Drehung: [α] + 190 (C = 0,1, CHCl₃)

Löslichkeit:
Rhodirubin B ist löslich in Methanol, n-Butanol, Aceton, Chloroform, Äthylacetat, Toluol, Benzol und Dimethylsulfoxyd, unlöslich in Wasser, Petroläther und n-Hexan und schwach löslich in Diäthyläther.

Farbe und Reaktion:
Die Methanollösung von Rhodirubin B ist rot gefärbt, im alkalischen Zustand verfärbt sie sich jedoch nach rötlich-purpurfarben. Die Ninhydrin-Reaktion ist negativ und Fehlingsche Lösung wird nicht reduziert.

Absorptionsspektrum:
UV und sichtbares Spektrum, Absorptionsmaxima findet man bei:

Absorptionsspektrum: Infrarot
Das IR-Spektrum in KBr zeigt Peaks bei den folgenden Wellenlängen in cm^-1: 3470, 2960, 2940, 2820, 2790, 1740, 1640, 1600, 1450, 1300, 1220, 1160, 1120, 1040, 1000, 980, 960, 920, 800, 790 und 760.

NMR:
Das PMR-Spektrum von Rhodirubin B in CDCl₃ (100 MHz) zeigt die folgenden chemischen Verschiebungen (ppm): 7,6, s; 7,24, s; 5,50, m; 5,02, m; 4,84, m; 4,52, q; 4,7∼3,90, überlagert m; 3,72, s; 3,6∼0,90, überlagert m und 2,18, s.

Rhodirubin A und B haben die folgenden R_f-Werte auf Kiesel-Dünnschichtchromatogrammen bei Verwendung der angegebenen Lösungsmittelsysteme:

Die Strukturen von Rhodirubin A und B wurden wie folgt bestimmt:
Aglykone von Rhodirubin A und B erhielt man durch saure Hydrolyse mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure (0,1 n) bie 85°C und 30 Minuten Dauer. Die physikochemischen Eigenschaften, z. B. die IR-, UV- und NMR-Spektren, der Schmelzpunkt und die R_f-Werte der Dünnschichtchromatogramme der erhaltenen Aglykone stimmten vollständig mit denjenigen von ε-Pyrromycinon überein, das in der Literatur beschrieben ist [Chem. Ber., 92, 1904 (1959)].

Nach Neutralisierung und Konzentrierung der wäßrigen Schicht der Rhodirubin A und B-Hydrolysate wurde der Zuckerteil entwickelt und dünnschichtchromatographisch abgetrennt (Kieselgel, TLC, Merck F₂₅₄; Lösungsmittel zu Butanol zu Essigsäure zu Wasser = 4 : 1 : 1) (Vol./Vol.). Drei Zuckerreste (R_f = 0,14 : 0,53 : 0,67) wurden aus Rhodirubin A erhalten und zwei Zuckerreste (R_f = 0,14 : 0,67) aus Rhodirubin B. Durch Vergleich dieser Zucker mit den aus Aclacinomycin [J. Antibiotics, 28, 830 bis 834 (1975)] und Streptolydizin [ J. Am. Chem. Soc., 86, 3592 bis 3594 (1964)], erhaltenen Zuckern anhand der verschiedenen Farbreaktionen [Pharmazie, 27, H₁₂, 782 bis 789 (1972)], der spezifischen Drehung und dem NMR-Spektrum wurden die Zucker mit R_f-Werten von 0,14, 0,53 und 0,67 als Rhodosamin, 2-Desoxyfucose bzw. Rhodinose identifiziert.

Methanolyse von Rhodirubin A oder B ergab Pyrromycin (Rhodosaminyl)-ε-pyrromycinon). Außerdem wurde aus Rhodirubin A oder B durch milde Hydrolyse (0,5% HCl, 20°C, 10 Minuten) Rhodinose freigesetzt, gemäß dem in Naturwissenschaften, 50, 43 bis 44 (1963) beschriebenen Verfahren.

Aufgrund der oben beschriebenen Ergebnisse wurden folgende Strukturformeln für die erfindungsgemäßen Rhodirubin-Verbindungen A und B ermittelt:

worin R die beiden folgenden Bedeutungen hat:

Von den in der Literatur beschriebenen Anthracyclin-Antibiotika ist bekannt, daß Cinerubin, Aclacinomycin, Violamycin und Rhodomycin aus einem Aglykon und drei Zuckerresten bestehen. Ihre Bestandteile sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:

Man sieht, daß die Rhodirubin-Antibiotika sich leicht von den obigen Anthracyclinen unterscheiden lassen.

Rhodirubin A und B besitzen antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber zahlreichen Mikroorganismen. Die minimalen Hemmkonzentrationen von Rhodirubin A und B, bestimmt mit Hilfe der Verdünnungsmethode, sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt:

Minimale Hemmkonzentrationen von Rhodirubin A und B

Wie oben gezeigt, besitzen Rhodirubin A und B antimikrobielle Wirksamkeit insbesondere gegenüber gram-positiven Bakterien. Sie sind daher therapeutisch brauchbar für die Behandlung von Lebewesen, einschließlich Menschen, bei infektiösen Erkrankungen, die durch derartige Mikroorganismen verursacht sind.

Im Tierversuch haben Rhodirubin A und B eine ausgeprägte Antitumor-Wirksamkeit bei niedriger Toxizität gezeigt. Sie eignen sich daher für die Therapie und Hemmung des Wachstums von Säugetier-Tumoren. Rhodirubin A und B besitzen insbesondere eine ausgeprägte Hemmwirkung gegenüber Mäuse L1210-Leukämie. Beispielsweise wurden CDF₁-Mäuse intraperitoneal mit 1 × 10⁶ L1210-Zellen/Maus beimpft, dann wurden 0,1 bis 0,2 ml Wirkstofflösung intraperitoneal an 10 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. Die Tiere wurden 30 Tage lang beobachtet. Die prozentuale Verlängerung der Überlebenszeit im Vergleich zu den Kontrollmäusen, denen intraperitoneal physiologische Kochsalzlösung verabreicht worden war, ist aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich:

Verlängerung der Überlebenszeit T/C (%)

Akute Toxizität

Rhodirubin A und B haben folgende LD₅₀-Werte, ermittelt bei Mäusen bei intraperitonealer Injektion:


LD₅₀ (mg/kg)
Rhodirubin A
7,5-10
Rhodirubin B	10-12,5

Wie bereits gesagt sind die erfindungsgemäßen Verbindungen, Rhodirubin A und B, neue Antibiotika, die sich sowohl für die Humanmedizin als auch für die Veterinärmedizin eignen. Sie sind Arzneimittel mit Antitumor-Wirkung, die ausgeprägte Hemmwirkung gegenüber bösartigen Säugetier-Tumoren, einschließlich aszitischen und festen Arten, besitzen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen bilden nicht-toxische Säureadditionssalze mit einer Vielzahl organischer und anorganischer salzbildender Reagentien. Man kann daher Säureadditionssalze, die mit derartigen pharmazeutisch verträglichen Säuren gebildet worden sind, z. B. Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure, Propionsäure, Ölsäure, Palmitinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Glutaminsäure, Pantothensäure, in gleicher Weise verwenden wie die Rhodirubin-Verbindungen selbst. Die Salze werden nach den allgemein für die Salzbildung von Antibiotika benutzten Verfahren hergestellt, isoliert, gereinigt und formuliert.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind Rhodirubin-Verbindungen in Form ihrer freien Base und ihren nicht-toxischen Säureadditionssalzen äquivalent.

Zur therapeutischen Behandlung eines Säugetieres, das unter einer Infektion durch gram-positive Bakterien leidet oder von einem bösartigen Tumor befallen ist (nämlich einem festen oder aszitischen Tumortyp, wie L1210-Leukämie), verabreicht man dem befallenen Lebewesen eine wirksame antibakterielle oder tumorhemmende Rhodirubin A- oder B-Dosis oder ein Gemisch der beiden oder ein nicht-toxisches Säureadditionssalz.

Weiterhin betrifft die Erfindung pharmazeutische Mittel, die eine antibakteriell wirksame oder tumorhemmende Menge Rhodirubin A oder B oder ein Gemisch dieser beiden, oder ein nichttoxisches Säureadditionssalz dieser Verbindungen in Kombination mit einem inerten pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten. Diese Mittel können in beliebige pharmazeutische Formen gebracht werden, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind.

Erfindungsgemäße Präparate für die parenterale Verabreichung sind z. B. sterile wäßrige oder nicht wäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie können auch in Form von sterilen festen Mitteln vorliegen, die in sterilem Wasser, physiologischer Salzlösung oder anderen sterilen injizierbaren Medien unmittelbar vor der Verwendung aufgelöst werden können.

Es ist klar, daß die tatsächlich bevorzugten Mengen an verwendetem Rhodirubin-Antibiotikum je nach der speziell verwendeten Verbindung, dem speziellen Präparat, der Art der Verabreichung und der besonderen Lage sowie in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Patienten und dem zu behandelnden Leiden variiert werden. Im allgemeinen werden die Rhodirubin-Antibiotika intraperitoneal, intravenös, subkutan oder lokal Tieren injiziert und beim Menschen intravenös oder lokal injiziert. Viele die Wirkung des Arzneimittels modifzierende Faktoren werden vom Fachmann berücksichtigt, z. B. das Alter, Körpergewicht, Geschlecht, die Ernährung, die Zeit der Verabreichung, die Art der Verabreichung, die Ausscheidungsrate, der Zustand des Patienten, Arzneimittelkombinationen, Reaktions-Empfindlichkeiten und die Schwere des Leidens. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch innerhalb der maximal tolerierten Dosis erfolgen. Der Fachmann kann die optimalen Anwendungsmengen für vorgegebene Bedingungen mit Hilfe üblicher Dosis-Bestimmungstests und unter Berücksichtigung der obigen Richtlinien ermitteln.

Bei der Verwendung als antibakterielle Mittel werden die Rhodirubin-Präparate im allgemeinen so verabreicht, daß die Konzentration an Wirkstoff größer ist als die minimale Hemmkonzentration für den speziellen, zu behandelnden Organismus.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Veranschaulichung der Erfindung:

Beispiel 1

Man stellt ein Nährmedium folgender Zusammensetzung her:

50 ml dieses Mediums wurden in einem 500-ml-Kolben sterilisiert, mit einer Probe aus der Agar-Schrägkultur von Streptomyces galilaeus (ATCC 31 273) angeimpft und bei 28°C 48 Stunden lang auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung (230 Upm) bebrütet, wobei man die Saatkultur erhielt.

Dann wurde das folgende Medium hergestellt:

Zwei ml dieser Saatkultur wurde dann zu 100 ml des zuvor sterilisierten und unmittelbar oben beschriebenen Mediums in einen 500-ml-Kolben gegeben. Die Fermentation wurde bei 28°C in einer rotierenden Schüttelvorrichtung (230 Upm) durchgeführt und die Produktion an Rhodirubin erreichte nach 4 Tagen ein Maximum. Die Brühe wurde filtriert, um Mycelkuchen und Filtrat zu trennen. Zu dem Filtrat gab man ein halbes Volumen Chloroform, diese Extraktion wurde zweimal durchgeführt. Der Mycelkuchen wurde mit Aceton versetzt (2 Liter Aceton/1 kg feuchter Kuchen), auch diese Extraktion wurde zweimal durchgeführt. Danach wurde das Aceton unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde mit 1/2 Volumen Chloroform versetzt und zweimal extrahiert. Die erhaltenen Chloroformextrakte wurde mit den Chloroformextrakten des Filtrates vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt, dabei erhielt man eine teerartige Substanz. Diese Substanz wurde in einer kleinen Menge Äthylacetat gelöst und durch trofpenweise Zugabe dieser Lösung zu 10 Volumina n-Hexan wurde ein Niederschlag gebildet (man erhielt 4,5 g rotes rohes Pulver). Dieses rohe Pulver wurde in 30 ml einer Mischung aus Toluol und Methanol (50 : 1) (Vol./Vol.) gelöst, auf eine mit 100 g Silikagel gefüllte Kolonne (3 × 50 cm), die mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch ins Gleichgewicht gebracht worden war, gegeben, dann wurden Rhodirubin B und danach Rhodirubin A eluiert. Jedes Eluat wurde unter vermindertem Druck getrocknet, dabei erhielt man 21 mg rohes Rhodirubin A und 48 mg rohes Rhodirubin B.

Beispiel 2

Rohes, gemäß Beispiel 1 erhaltenes Rhodirubin A (27 mg) wurde an einer Dünnschichtplatte (Merck F₂₅₄, Lösungsmittel zu Chloroform zu Methanol - 10 : 1 (Vol./Vol.) chromatographiert, um Verunreinigungen, einschließlich Rhodirubin B, zu entfernen. Nach Auflösen in 2 ml Methanol wurde die aktive Fraktion an einer Sephadex LH-20-Kolonne (1 × 70 cm) chromatographiert. Das so erhaltene Eluat wurde eingeengt und mit n-Hexan wurden 16,5 mg gereinigtes Rhodirubin A als rotes Pulver ausgefällt. 10 mg dieses roten Pulvers wurden in einem Gemisch aus 200 µl trockenem Aceton und 70 µl trockenem Methanol gelöst, dann wurden 10 µl einer 3 n HCl-Methanollösung zugegeben. Nach 1minütigem Rühren wurde durch Zugabe von 10 Volumina Triäthyläther ein Niederschlag gebildet. Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, dies ergab 7,2 mg Rhodirubin A-HCl-Salz.

Beispiel 3

80 mg rohes, gemäß Beispiel 1 erhaltenes Rhodirubin B, gereinigt nach dem oben in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren, ergaben 63,4 mg Rhodirubin B als rotes Pulver.

Claims

1. Rhodirubin-erzeugender Stamm Streptomyces sp. ATCC 31 273.

2. Anthracyclinglycoside der allgemeinen Formel I: worin R für einen der beiden folgenden Reste steht: sowie die nicht-toxischen Säureadditionssalze davon.

3. Verfahren zur Herstellung von Rhodirubin A und Rhodirubin B gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Rhodirubin A- und Rhodirubin B-erzeugenden Stamm Streptomyces sp. ATCC 31 273 in jeweils an sich bekannter Weise in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert, bis dieser Organismus in dem Kulturmedium eine wesentliche Menge Rhodirubin A erzeugt hat und Rhodirubin A oder B aus dem Kulturmedium gewinnt.

4. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge Rhodirubin A oder B gemäß Anspruch 2 oder ein Gemisch davon oder ein nicht-toxisches Säureadditionssalz dieser Verbindungen in einem inerten, pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.