DE3407979A1

DE3407979A1 - Spicamycin sowie verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE3407979A1
Application number: DE19843407979
Authority: DE
Inventors: Yoichi Tokio/Tokyo Hayakawa; Hiroyuki Urawa Saitama Kawai; Junichiro Takasaki Gunma Mochizuki; Masaya Ichikawa Chiba Nakagawa; Noboru Yokohama Kanagawa Otake; Kozo Tanabe
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1983-03-04
Filing date: 1984-03-03
Publication date: 1984-09-06
Also published as: US4565781A; JPH0367077B2; DE3407979C2; JPS59161396A

Description

KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA, Tokio, Japan

Spicamycin sowie Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein carcinostatisches Antibiotikum, das Spicamycin, sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Carcinostatische Antibiotika besitzen in der Medizin eine große Bedeutung, und es sind verschiedene Arten derartiger Antibiotika bisher bekannt.

Im allgemeinen hängen die physiologischen Wirksamkeiten von Antibiotika weitgehend von der chemischen Struktur oder den physicochemischen Eigenschaften dieser Antibiotika ab, und es wurden kontinuierlich Antibiotika mit den verschiedensten Eigenschaften gesucht. Daher bestand auch ein konstanter Bedarf an carcinostatischen Antibiotika, die chemische Substanzen darstellen, die von herkömmlichen Substanzen abweichen oder die physicochemische Eigenschaften besitzen, die von denen bekannter Antibiotika abweichen.

Die vorliegende Erfindung trägt zur Befriedigung des genannten Bedarfs bei.

Gegenstand der Erfindung sind das in Anspruch 1 definierte Antibiotikum Spicamycin sowie das in Anspruch 2 angegebene Verfahren zu seiner Herstellung. 30

Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Zeichnungen näher erläutert, worin

F I G . 1 das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Spieamycin in Methanol,

P I G . 2 das Infrarotabsorptionsspektrum von Spieamycin und

1
P I G . 3 das H-NMR-Spektrum von Spieamycin

darstellen.

Das Antibiotikum Spieamycin gemäß der Erfindung ist ein Gemisch von Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel (I)

R₁-NHCH₀CONH

OH OH

^N-^N'

(D

worin R₁ eine (CH₃)₂CH(CH₂)_nC0- Gruppe mit η » 8 bis

14 oder eine CH^ ₂(OH

^_2m
R₂ eine CH₂(OH)CH(OH)-Gruppe bedeuten

_2n
)_mCO-Gruppe mit m = 10 bis 16 sowie

Die chemische Struktur von Spieamycin wurde wie folgt bestimmt:

Nach der Analyse des NMR-Spektrums von Spieamycin (FIG. 3) kann angenommen werden, daß dieses Antibiotikum einen Fettsäurerest vom Iso-Typ, einen Heptoserest,

" · 34Q7979

-5-

eine heteroaromatische Gruppe sowie eine nicht näher zu bezeichnende, einen Methylenrest enthaltende Gruppe enthält.

Durch Hydrolyse von Spicamycin in 1N HCl bei 100⁰C während einer Stunde können Adenin sowie ein unbekannter Aminozucker und eine saure Substanz erhalten werden. Durch weitere Hydrolyse dieser sauren Substanz in 6N HCl bei 110⁰C während 48 h können Glycin und ein Gemisch aus gesättigten Fettsäuren erhalten werden. Das Gemisch aus gesättigten Fettsäuren wurde mit Diazomethan metyliert und mit Hilfe von Gaschromatographie und Massenspektrometrie (1,5% Silicone-OV-1/Shimalite ¥ 170°C) analysiert, worauf es sich erwies, daß das

15 Gemisch Fettsäuren enthielt, die den Formeln

(CH₃)₂CH(CH₂)_nCOOH (n = 8 - 14) oder CH₃(CH₂)_mCOOH (m = 10 - 16) entsprachen, typischerweise Isopalmitin-

säure und Margarinsäure.

Somit konnten die Heptose, der heteroaromatische Rest und der eine Methylengruppe enthaltende Rest des Spicamycins, wie sie durch das NMR-Spektrum festgestellt worden waren, als Aminoheptose, Adenin bzw. Glycin näher bestimmt werden. Diese Ergebnisse legen ferner nahe, daß die Fettsäure an das Glycin über eine Amidbindung gebunden ist.

Weiter wurde Spicamycin mit Acetanhydrid in Pyridin in Gegenwart von 4-Dimethylaminopyridin acetyl!ert, um den Zuckerrest zu analysieren, wobei das Spicamycin Tetraacetat erhalten wurde. Nach Analyse des NMR-Spektrums ( H-NMR) des Spicamycintetraacetats zur Bestimmung seiner Struktur wurde eine Kopplung des Protons der Aminogruppe in der 6-Stellung des Adenins mit den Protonen in den 1« bis 7'-Stellungen der Heptose beobachtet, woraus sich ergibt, daß die Aminoheptose von Spicamycin

an die Aminogruppe in 6-Stellung des Adenins über eine N-Glycosidbindung gebunden ist. Ferner ergab sich, daß angesichts der Tatsache, daß die Kopplungskonstante zwischen der 5'-Stellung und der 4»-Stellung und zwischen der 4'-Stellung und 3'-Stellung jeweils etwa 10 Hz betrug, während die Kopplungskonstante zwischen der 3'-Stellung und der 2'-Stellung etwa 3 Hz betrug, das Proton in 2'-Stellung äquatorial ist, während sämtliche Protonen in den Stellungen 3* bis 5' axial sind.

Ferner ergab sich angesichts der Tatsache, daß keine durch Acetylgruppen hervorgerufene chemische Verschiebung (shift of acetyl groups) in 4'- und 5'-Stellung beobachtet wurde, während zwischen dem Proton in der 4'-Stellung und dem an Stickstoff gebundenen Proton Kopplung beobachtet wurde, der Zucker vom Pyranosetyp ist, an dessen 4'-Stellung das N-Acylglycin über eine Amidbindung gebunden ist. Außerdem wurde zwischen dem Proton in der 1'-Stellung und denjenigen in der 2'-, 3'- und 5'-Stellung ein Overhauser-Effekt (NOE) beobachtet, so daß das Proton in der 1'-Stellung des Zuckers sich als axial orientiert erweist.

Insgesamt wurde Spicamycin als ein Gemisch von Verbindungen identifiziert, das durch die oben angegebene Formel (1) wiedergegeben wird.

Das FD-Massenspektrum von Spicamycin lieferte Peaks bei m/z 644, 658 und 672 (M⁺ + Na), die die Peaks für das Molekülion der Verbindungen gemäß Formel (I) darstellen, worin R₁ (CH₃)₂CH(CH₂)_nCO- (n = 12 - 14) oder CH₃(CH₂)_mC0- (m = 14 - 16) bedeutet.

Phvsicochemische Eigenschaften

Die physicochemischen Eigenschaften des Antibiotikums Spicamycin sind die folgenden:

(1) Farbe und Eigenschaften:

Schwachsaures weißes Pulver

(2) Schmelzpunkt:

215 bis 220⁰C (Zers.)

(3) Spezifische Drehung:

[d,] ψ β +15° (C: 0,15, in Methanol) (4) Elementaranalyse (gefunden): C: 57,4% H: 8,3%
N: 15,7% 0: 18,6%
(5) Ultraviolettabsorptionsspektrum (maxima):

CH₃OH 264 nm (E-Jg_1n 257)

0,01N NaOH + CH₃OH 272 nm (E^_m 226) 0,01 N HCl + CH₃OH 273 nm (E^ 258)

(6) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr): Siehe FIG. 2.
(7) Löslichkeiten:

Löslich in basisch gemachten Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol, Ethanol, n-Propanol und

n-Butanol.

Schwachlöslich in Wasser, Aceton, Essigester und 25 Chloroform.

Unlöslich in Benzol, Ether und Hexan.

(8) Dünnschichtchromatographie (Silicagel-öOFp,-.-Platte von Merck & Co., Inc.):

Entwicklungsmittel RF-Wert

30 Chloroform:Methanol (1:1) 0,34

(9) NMR-Spektrum (400 MHz in Deuteromethanol): Siehe FIG. 3.

Herstellung von Spicamycin

Das Antibiotikum Spicamycin ist bisher lediglich durch Züchtung von Mikroorganismen erhalten worden. Es ist jedoch möglich, daß dieses Antibiotikum durch synthetische chemische oder mikrobiologische Modifizierung von verwandten Verbindungen oder durch chemische Totalsynthese erzeugt werden kann.

Die technische Züchtung verwendet Streptomycesstämme, die zur Erzeugung von Spicamycin in der Lage sind. Im einzelnen ist ein Stamm isoliert worden, der Streptomycesalanosinicus 879-MT, (H79) genannt worden ist, von dem sich gezeigt hat, daß er Spicamycin produziert. Andere geeignete Stämme, die Spicamycin produzieren, können aus der natürlichen Umgebung mit Hilfe herkömmlicher Verfahren zur Isolierung von Antibiotika erzeugenden Mikroorganismen isoliert werden. Es ist außerdem möglich, die Spicamycinproduktion dadurch zu erhöhen, daß man Spicamycin erzeugende Mikroorganismen einschließlich Streptomycesalanosinicus 879-MT^ (H79) der Bestrahlung durch radioaktive Strahlen oder andere Behandlungen unterzieht. Der Stamm H79 wird im folgenden näher beschrieben.

(1) Herkunft und Zugangsnummer.

H79 ist ein Streptomyces-Stamm, der aus dem Erdboden aus einem Blumengarten in Ichiki-cho,Hioki-gun, Kagoshima-ken, Japan isoliert worden ist. Dieser Stamm wurde am 19. Juli 1982 bei den Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan hinterlegt, wo er die Zugangsnummer FERM P-6636 erhielt. Dieser Stamm trägt nunmehr die Zugangsnummer PERM BP-449 gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale An-

erkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren.

(2) Mycologische und physiologische Eigenschaften (a) Morphologie

Lufthyphen erstrecken ihre Hauptachse weit, wobei unregelmäßig monopodische Verzweigungen auftreten. Die äußersten Enden der Verzweigungen bilden lange spiralige Sporenketten aus 10 bis 50 oder mehr Sporen (in der Form von Schlangen mit 20 bis 30/um Durchmesser und 3 bis 6 Windungen). Die Sporen besitzen stachlige Oberflächen und sind von elliptischer Form mit 0,3 bis 0,4 /um Breite und 0,5 bis 0,7/um Länge. Keine besonderen Formen, wie Sclerotien, Geißelsporen oder Sporangien

15 wurden beobachtet.

(b) Züchtungseigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien

Die Züchtungseigenschaften für H79, der bei 37°C gezüchtet wurde, wurden gemäß dem "Manual of Method (1941 )ⁿ, das durch die ISP angenommen worden ist, beobachtet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt.

(c) Physiologische Eigenschaften und Kohlenstoffverwertung

Die physiologischen Eigenschaften und die Kohlenstoffverwertung von H79 sind in den folgenden Tabellen II und III zusammengefaßt.

Tabelle I
Züchtungseigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien

Medium	Massenfarbe der Koloni eoberflache	Oberflächen- und RUckselten- pigmente des Substratmycels	In das Medium diffundier fähiges Pigment
Saccharose/Nitrat- Agar	Weißes (a) Luftmycel, das sich sehr schwach entwickelt	Weißliches Braun (3ca) Hell Orange (4ea)	keines
Glucose/Asparagin- Agar	Samtartige rote Farbe Serie (4ec bis 5ec)	Helles Gelb (2fb), dunkles gelbliches Orange (3nc)	keines
Glycerin/Asparagin- Agar	Pulverförmiges Luft mycel, das sich schwach entwickelt, rote Farb serie (5ec bis 5cb)	Schwaches Gelb (2ca)	keines
Anorganische Salze/ Stärke-Agar	Samtartige rote Farbe der Serie (4ec bis 5ec)	Blaß-Gelb (2ca); Dunkles, gelbliches Orange (3nc)	keines
Tyrosin-Agar	Keine Entwicklung von Luftmycel	Blasses Gelb (2ca)	keines
Nähr-Agar	Keine Entwicklung eines Luftmycels	Weißliches Braun (3ca)	keines
Hefeextrakt/MaIz- extrakt-Agar	Weißes (a) Luftmycel, das sich sehr schwach entwickelt	Helles Gelb (2ea)	keines
Hafermehl-Agar	Pulverförmiges Luftmy cel, das sich schwach entwickelt, rote Farb serie (5eb bis 5ec)	Schwaches Gelb (2fb)	keines

Anmerkung: Die Farbbezeichnungen erfolgten nach dem Color Harmony Manual, 4th Ed.,
der Container Corporation of America (1950).

CjJ -F-O

CD --J CD

Tabelle II Physiologische Eigenschaften

Wachstumstemperaturbereich 20 bis 45⁰C

Optimale Wachstumstemperatur 27 bis 37⁰C

Gelatineverflüssigung

Stärkehydrolyse +

Coagulierung von Magermilch +

Peptonisierung von Magermilch + Produktion von Melanoidpigment

Tyrosin-Agar +

Pepton/Hefeextrakt/Eisen-Agar + Trypton/Hef e extr akt-Kulturbrühe

Anmerkung: + = positiv
- = negativ

W * * ■

-12-

Tabelle III KohlenstoffVerwertung

L-Arabinose

D-Xylose

D-Glucose

D-Fructose

Saccharose

Inosit

L-Rhamnose

Raffinose

D-Mannit

Es wurde das Grundmedium nach Pridham und Gottlieb verwendet.

Anmerkung:

+ = Verwertung

- = keine Verwertung

(d) Erörterung

Aufgrund der Feststellungen wurde 879-MT, als Actinomycet der Gattung Streptomyces mit folgenden Eigenschaften identifiziert: (a) die Sporenkette liegt spiralig vor, (b) die Spore besitzt eine stachlige Oberfläche, (c) die Luftmycelmasse ist von roter Färbung, (d) die Rückseite der Kolonie besitzt eine schwache Färbung, (e) die Melanoidpigmentproduktion ist positiv und (f) Rhamnose als Kohlenstoffquelle wird nicht verwertet.

Angesichts dieser sechs grundlegenden Eigenschaften, die aufgrund von Bergey*s Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed. (1974) und der ISP-

Classifikation festgestellt wurden, erwiesen sich die charakteristischen Eigenschaften von 879-MT* als praktisch gleich mit denjenigen von S. alanosinicus. Demzufolge wurde der Stamm als einer der S. alanosinicus-Stämme klassifiziert und als Streptomyces alanosinicus, Thiemann und Beretta, Stamm 879-MT, bezeichnet.

(3) Züchtung zur Herstellung von Spicamycin

Das Antibiotikum Spicamycin kann durch Züchten eines Spicamycin erzeugenden Streptomyces-Stammes aerob in einem geeigneten Medium sowie Gewinnen des Zielproduktes aus der Kultur hergestellt werden.

Kulturmedien können jede beliebige Nährstoffquelle enthalten, die von Spicamycin erzeugenden Organismen verwertet werden kann. Beispielsweise sind als Kohlenstoff quellen Glucose, Saccharose, Maltose, Stärke, Öle und Fette geeignet. Beispiele für Stickstoffquellen sind organische Materialien, wie Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, trockene Hefe, Hefeextrakt und Maiseinweichflüssigkeit, sowie anorganische Materialien, wie Ammoniumsalze und Nitrate, wie beispielsweise Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und Ammoniumchlorid. Nötigenfalls können auch anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphate und Salze von Schwermetallen, zugesetzt werden. Um während der Fermentierung ein Schäumen zu verhindern, können geeignete Antischaummittel, wie Silicon, nach herkömmlichen Verfahren zugesetzt werden.

Die geeignetste Methode der Züchtung ist das aerobe Submersverfahren, das zur Herstellung von Antibiotika weitverbreitet ist. Eine geeignete Züchtungstemperatur liegt bei 27 bis 37⁰C, vorzugsweise bei

bis 37⁰C. Gemäß diesem Verfahren erreicht der Ausstoß von Spicamycin sein Maximum nach vier bis fünf Tagen

Züchten unter Schütteln oder unter Belüften und Rühren.

Eine Kulturbrühe, in der Spicamycin angereichert ist, kann auf diese Weise erhalten werden. In dieser Brühe ist Spicamycin zum Teil im Filtrat enthalten, während ein größerer Teil in dem Mycelkuchen vorhanden ist.

Spicamycin kann aus der Kulturbrühe durch jedes beliebiges Verfahren, das sich zu der Gewinnung eignet, erhalten werden. Eines dieser Verfahren beruht auf der Extraktion. Beispielsweise kann das im Filtrat der Kulturbrühe enthaltene Spicamycin durch Extrahieren mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für Spicamycin, wie beispielsweise Butanol, gewonnen werden. Spicamycin im Mycelkuchen kann durch Extraktion mit Butanol, Methanol, Ethanol oder Aceton aus dem Mycelkuchen erhalten werden, der nach Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen worden ist. Ebenfalls ist es möglich, die Kulturbrühe als solche den erwähnten Extraktionsverfahren ohne vorherige Isolierung des Mycelkuchens zu unterwerfen. In die Extraktionsverfahren kann auch die Gegenstromverteilung unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels eingeschlossen werden.

Ein weiteres Verfahren zur Gewinnung von Spicamycin aus der Kulturbrühe beruht auf Adsorption. Ein Spicamycin enthaltendes flüssiges Material, wie beispielsweise das Filtrat einer Kulturbrühe oder ein Extrakt, der nach den oben beschriebenen Extraktionsverfahren erhalten worden ist, wird beispielsweise unter Verwendung eines geeigneten Adsorbens oder Gelfilters chromatographiert, wie beispielsweise an einer Säule von Silicagel oder Sephadex LH2O der Pharmacia Fine Chemical AB oder mittels hochwirksamer Flüssigkeits-

chromatographie unter Verwendung von Nucleosil 5C^g der Nahgel AG. Das gewünschte Spicamycin, das auf dem Adsorbens oder dem Gelfilter adsorbiert ist, wird danach daraus eluiert. Die erhaltene Spicamycinlösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, und man erhält ein rohes Spicamycin.

Das rohe Spicamycin kann gereinigt werden, indem man die oben genannten Extraktions- oder Adsorptionsverfahren, nötigenfalls in Kombination, so lange durchführt, wie nötig ist. Beispielsweise kann die Reinigung durch eine geeignete Kombination von Säulenchromatographie unter Verwendung eines Adsorptionsmittels oder Gelfilters, wie beispielsweise Silicagel oder Sephadex LH20, hochwirksame Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung von Nucleosil 5C^q unter gleichen sowie Gegenstromverteilung durchgeführt werden. Ein spezifisches Beispiel für die Reinigungsmethode besteht darin, daß man das rohe Spicamycin in einer geringen Menge Methanol löst, die Lösung auf eine Säule aufbringt, die mit Sephadex LH20 gepackt ist, und die Säule mit einem geeigneten Lösungsmittel entwickelt, um die aktive Komponente von Spicamycin zu eluieren. Das Eluat wird im Vakuum eingedampft und weiter mit Methanol mittels hochwirksamer Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung von Nucleosil 5C₁O eluiert, um die aktive Fraktion zu isolieren. Die aktive Fraktion, die auf diese Yfeise isoliert worden ist, wird zur Trockne eingedampft, und man erhält ein

30 weißes Pulver aus Spicamycin.

Verwendung von Spicamycin

Das Antibiotikum Spicamycin gemäß der Erfindung besitzt carcinostatische Wirkung sowie antimikrobieile Wirkung und läßt sich daher als Arzenimittel verwenden

Physiologi.sche Wirkungen

(1) Antitumorwirkung

Spicamycin besitzt bemerkenswerte Antitumorwirkung gegenüber Leukämie von Tieren. Beispielsweise wurden in CDF₁ Mäuse intraperitoneal 1 χ 10⁶ P 338-Leukämie-Zellen' je Maus in Form einer Suspension transplantiert, und Spicamycin wurde den Mäusen während neun aufeinanderfolgenden Tagen vom ersten Tag nach der Transplantation an verabreicht. Die Erhöhung der Lebensspanne in . Prozent, verglichen mit der Kontrollgruppe aus Mäusen, die mit physiologischer Kochsalzlösung anstelle der wirksamen Verbindung behandelt worden waren, wurde aufgrund der folgenden Gleichung erreichnet:

Zahl der Überlebenstage für die Testgruppe _χ Zahl der Überlebenstage für die Kontrollgruppe

Die Ergebnisse sind wie folgt:

Dosis	Erhöhung der Lebensspanne
(mg/kg/Tag)	Testgruppe/Kontrollgruppe (#)
20 0,125	129
0,25	140
0,5	153
1,0	154
2,0	154
25 Anmerkung:	Die Dosis von 2 mg/kg/Tag wirkt bereits
	leicht schädigend.

(2) Antimikrobielle Wirkung

Die minimale Inhibitorkonzentration (MIC) von Spicamycin für verschiedene Mikroorganismen wurde mit Hilfe der Agar-Verdünnungsmethode festgestellt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV Minimale Inhibitor-Konzentration von Spicamycin

Microorganismen	MIC (/ug/ml)
Bacillus subtilis PCI 219	>1OO
Staphylococcus aureus FDA 209P	>100
Micrococcus luteus ATCC 9341	>100
Pseudomonas aeruginosa NCTC 10490	>100
Salmonella typhymurium IFO 12529	>100
Escherichia coli NIHJ JC-2 . Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763	*100 25
Candida albicans No. Yu 1200	>100
Candida utilis IFO 0396	25
Aspergillus fumigatus IFO 4400	>100
Penicillium chrysqgenum ATCC 10002	>100
Trichophyton mentagrophytes	1,56

Wie sich aus den obigen Daten ergibt, besitzt das Spicamycin gemäß der Erfindung antimikrobielle Wirkung insbesondere gegenüber Sycose (Bartflechte) induzierenden Trichophytonen und kann daher als Antibiotikum verwendet werden, das gegenüber Infektionen wirksam ist, die durch derartige Organismen hervorgerufen werden.

(3) Akute Toxizität (LD₅₀)

Der LDcQ-Wert von Spicamycin, durch intraperitoneale Injektion an Mäuse verabfolgt, betrug 40 mg/kg.

(4) Antibiotikum

Wie oben erwähnt, ist das Spicamycin gemäß der Erfindung gegenüber Tumoren und Mikroorganismen wirksam und kann entsprechend eingesetzt werden.

Es kann auf jede Weise, die sich für den gewünschten Zweck eignet, verabfolgt werden, wobei sich die Dosierungsform aus der Verabfolgungsweise ergibt. Normalerweise wird Spicamycin mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht.

Eine typische Methode der Verabfolgung von Spicamycin als Antitumormittel besteht in der Injektion seiner Lösung in destilliertem Wasser für Injektionszwecke oder in physiologischer Kochsalzlösung. Beispiele für Injektionsarten sind intraperitoneale, subcutane, intravenöse oder intraarterielle Injektion sowie die örtliche Verabfolgung bei Tieren, während bei Menschen die intravenöse oder intraarterielle Injektion und die örtliche Verabfolgung in Frage kommen.

Die Dosierung von Spicamycin wird gemäß den Ergebnissen von Tierexperimenten und je nach den sich ändernden Bedingungen in einer derartigen Weise vorgenommen, daß die Gesamtmenge der Dosis, die kontinuierlich oder intermittierend verabfolgt wird, in jedem Falle einen spezifischen Grenzwert nicht überschreitet. Selbstverständlich variieren die einzelnen Dosen jeweile in Abhängigkeit von der Verabfolgungsart, dem Zustand der Patienten oder der zu behandelnden Tiere, wie beispielsweise Alter, Körpergewicht, Geschlecht . und Empfindlichkeit, der Nahrung, der Zahl der Verabfolgungen, den gleichzeitig verabfolgten Arzneimitteln sowie der Schwere der Krankheit. Die optimalen Dosierungen und die Häufigkeit der Verabfolgung unter bestimmten Bedingungen müssen auf der Grundlage der erwähnten Faktoren durch Fachleute bestimmt werden.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen näher erläutert, worin sich Prozentangaben auf das Verhältnis Gewicht/Volumen beziehen, sofern nicht anders angegeben.

Beispiel 1

(1) Herstellung des Inoculums

Ein Medium, das zur Erzeugung eines primären Inoculums verwendet wird, wurde durch Lösen der folgenden Bestandteile in einem Liter Wasser und Einstellen des pH-Wertes der erhaltenen Lösung auf 7,0 hergestellt.

Glucose 0,496 Malzextrakt 1,096 ' 15 Hefeextrakt 0,4%

15 ml des auf diese Weise hergestellten Mediums wurden jeweils in einem großformatigen 50-ml-Reagenzglas sterilisiert und anschließend mit einem Ring voll Sporen beimpft, die aus einer Schräg-Agar-Kultür von Streptomyces alanosinicus 879-MT, gesammelt worden waren. Jede Charge des geimpften Mediums wurde 48 h lang bei 37°C unter Schütteln gezüchtet.

25 (2) Züchtung

Ein Fermentationsmedium wurde hergestellt, indem man die folgenden Bestandteile in 1 1 Wasser löste und den pH-Wert der erhaltenen Lösung auf 7,0 einstellte.

Glucose 2,5%

30 Sojabohnenmehl 1,5%

Trockene Hefe 0,2% Calciumcarbonat 0,4%

100 ml des Fermentationsmediums wurden jeweils in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben sterilisiert und mit 2 ml des, wie oben beschrieben, hergestellten Inoculums ver-

setzt. Danach wurde in einem Rotationsschütteier die Fermentation bei 37⁰C durchgeführt. Nach vier Tagen wurde die Fermentation beendet und der Mycelkuchen, der durch Abfiltrieren abgetrennt worden war, zweimal mit 500 ml n-Butanol extrahiert.

Der Extrakt wurde zur Trockne eingedampft, mit Aceton und Wasser gewaschen, in Methanol gelöst und über eine Säule mit Sephadex LH20, die im Gleichgewicht mit Methanol gehalten wurde, gegeben. Die aktive Fraktion, die auf diese Weise erhalten wurde, wurde zur Trockne eingedampft, in Methanol gelöst und der hochwirksamen Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Säule (8 mm Durchmesser, 250 mm Länge), die mit Nucleosil 5C-JQ gepackt war, unterworfen, wobei als Eluiermittel Methanol verwendet und eine Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min sowie eine Verweilzeit von 5,9 min angewandt wurden. Die Fraktion, deren Aktivitätsmaximum durch Ultraviolettabsorption bei 264 nm bestimmt wurde, wurde isoliert und zur Trockne eingedampft, und man erhielt 80 mg eines weißen Pulvers von Spicamycin.

Claims

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KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA, Tokio, Japan

Patentansprüche

/M.) Antibiotikum Spicamycin mit folgenden physicochemischen Eigenschaften: (1) Farbe und Eigenschaften:

Schwach saures weißes Pulver (2) Schmelzpunkt:

215 bis 220⁰C (Zers.)

(3) Spezifische Drehung:

|ά] ψ" +15° (C: 0,15, in Methanol)

(4) Elementaranalyse (gefunden): C: 57,4% H: 8,3%

N: 15,7% 0: 18,6%

(5) Ultraviolettabsorptionsspektrum (maxima):

CH^OH 264 mn (E^_n, 257)

0 ' cm

0,01N NaOH + CH₃OH 272 nm (E^_m 226) 0,01 N HCl + CH₃OH 273 nm (E^_ffi 258)

(6) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr): Wie in FIG. 2 dargestellt.

(7) Löslichkeitseigenschaften:

Löslich in basisch gemachtem Wasser, Dimethylsulfoxid, Methanol, Ethanol, n-Propanol und

n-Butanol.

Schwachlöslich in Wasser, Aceton, Essigester und 25 Chloroform.

Unlöslich in Benzol, Ether und Hexan.

(8) Dünnschichtchromatographie (SiIicagel-öOFpc/,-Platte von Merck & Co., Ine.):

Entwi cklungsmittel RF-Wert

Chloroform:Methanol (1:1) 0,34

(9) NMR-Spektrum (400 MHz in Deuteromethanol): Siehe FIG. 3.
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Spicamycin,

dadurch gekennzeichnet, daß man einen Spicamycin erzeugenden Streptomycesstamm in einem geeigneten Kulturmedium aerob züchtet und das Antibiotikum Spicamycin mit den im Anspruch 1 angegebenen Eigenschaften gewinnt.